DE102006002427A1 - Neue Lysolipin Derivate - Google Patents

Neue Lysolipin Derivate Download PDF

Info

Publication number
DE102006002427A1
DE102006002427A1 DE102006002427A DE102006002427A DE102006002427A1 DE 102006002427 A1 DE102006002427 A1 DE 102006002427A1 DE 102006002427 A DE102006002427 A DE 102006002427A DE 102006002427 A DE102006002427 A DE 102006002427A DE 102006002427 A1 DE102006002427 A1 DE 102006002427A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
lysolipin
och3
acid
acetyl
single bond
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE102006002427A
Other languages
English (en)
Inventor
Carsten Dr. Fischer
Andreas Dr. Hornung
Meike Dr. Holzenkämpfer
Stefan Dr. Pelzer
Horst Dr. Priefert
Ulf-Dietrich Dr. Renner
Silke Dr. Vierling
Sven-Eric Dr. Wohlert
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Combinature Biopharm AG
Original Assignee
Combinature Biopharm AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Combinature Biopharm AG filed Critical Combinature Biopharm AG
Priority to DE102006002427A priority Critical patent/DE102006002427A1/de
Priority to DE112006003804T priority patent/DE112006003804A5/de
Priority to PCT/DE2006/002324 priority patent/WO2007079715A2/de
Publication of DE102006002427A1 publication Critical patent/DE102006002427A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D491/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00
    • C07D491/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D491/04—Ortho-condensed systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
    • C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D493/04—Ortho-condensed systems

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft neue Lysolipin-Derivate, Verwendungen solcher Lysolipin-Derivate, pharmazeutische Zusammensetzungen mit solchen Lysolipin-Derivaten, Verfahren zur Herstellung solcher Lysolipin-Derivate und Zwischenprodukte der Herstellung der Lysolipin-Derivate.

Description

  • Gebiet der Erfindung:
  • Die Erfindung betrifft neue Lysolipin Derivate, Verwendungen solcher Lysolipin Derivate, pharmazeutische Zusammensetzungen mit solchen Lysolipin Derivaten, Verfahren zur Herstellung solcher Lysolipin Derivate und Zwischenprodukte der Herstellung modifizierter Lysolipin Derivate.
  • Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik:
  • Der Bakterienstamm Streptomyces tendae Tü4042 (CB28) produziert das Polyketid-Antibiotikum Lysolipin (1), das zur Gruppe der polyzyklischen Xanthone gehört. 1975 wurde Lysolipin, erstmals als ein Metabolit des Stammes Streptomyces violaceoniger Tü96 beschrieben (Drautz et al., 1975, Arch Microbiol. 106, 175–190). Lysolipin I, das durch Umlagerung des primär vom Produzentenstamm ausgeschiedenen Lysolipin X entsteht, wirkt sehr effizient gegen ein breites Spektrum Gram-positiver (MIC 0,001 μg/ml), sowie gegen einige Gram-negative Bakterien. Desweiteren konnte eine starke tumorstatische Wirkung gegen verschiedene Tumorzelllinien (IC50 0,001 μg/ml) nachgewiesen werden (Pultar, 1988, Disseration Uni Tübingen).
  • Einbaustudien haben gezeigt, dass die Biosynthese des Lysolipin-Rückgrats aus 12 Malonyl-CoA-Einheiten nach einem typischen Polyketidsyntheseschema des Typs II erfolgt (Bockholt et al. 1994, J. Org. Chem. 59, 2064–2069). Nach der Biosynthese des Grundgerüstes müssen zahlreiche Modifikationen stattfinden, um das Endprodukt Lysolipin X bzw. I zu erzeugen. Dazu zählen eine Zyklisierung und Aromatisierung, Einführen von Sauerstoffatomen (9 der 12 Sauerstoffatome in Lysolipin X werden aus molekularem Sauerstoff vermutlich durch Oxygenasen eingeführt), Chlorierung vermutlich durch eine Halogenase, und Einführung von Methylgruppen an den Hydroxygruppen (C6, C16, C24), der Methylengruppe C28 und am Stickstoff vermutlich durch Methyltransferasen.
  • Der pharmazeutische Einsatz von Lysolipin als neues Antiinfektivum wurde bisher durch die schlechte Wasserlöslichkeit und vor allem durch eine starke Cytotoxizität verhindert. Der Einsatz als Antibiotikum erfordert allerdings eine signifikante Senkung der Cytotoxizität. Somit sind gegenüber der insofern bekannten Substanz verbesserte physikochemische und pharmakologische Eigenschaften, insbesondere auch verringerte Toxizität, wünschenswert. Veränderungen von toxischen aber auch physikochemischen Eigenschaften von Substanzen werden in der Regel durch Substanz-Derivatisierungen erreicht. Eine Totalsynthese von neuen Derivaten dieser komplexen Substanzklasse ist bisher nicht beschrieben und damit, wenn überhaupt, nur mit extrem großen Aufwand durchführbar. Die Möglichkeiten der chemischen Variation sind durch das Vorhandensein „natürlicher Schutzgruppen", auf bestimmte Funktionen beschränkt.
  • Im übrigen ist es auf Grund auftretender Resistenzen besonders wünschenswert, neue Lysolipin Derivate zur Verfügung zu stellen, die in solchen Resistenzfällen eine Therapie überhaupt erst möglich machen.
    •
  • Technisches Problem der Erfindung:
  • Der Erfindung liegt daher das technische Problem zu Grunde, neue Lysolipin-Derivate zur Verfügung zu stellen, mit welchen Infektionen behandelbar werden, die auf grund auftretender Resistenzen nicht mehr oder nur schwer therapierbar sind. Des Weiteren liegt der Erfindung das technische Problem zu Grunde, neue Lysolipin Derivate zur Verfügung zu stellen, welche verbesserte pharmakologische Eigenschaften, insbesondere verringerte Cytotoxizität bei gleichzeitig guter antibakterieller Aktivität, aufweisen.
  • Grundzüge der Erfindung und Ausführungsformen:
  • Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung Lysolipin Derivate gemäß Formel I
    Figure 00030001
    Formel I wobei R1 bis R11 gleich oder verschieden und unabhängig voneinander sein können:
    R1 = H, F, Cl, Br, oder I, R2 = H oder C1-12 Alkyl, Alkenyl und Alkinyl, linear oder verzweigt, gesättigt oder ungesättigt, C3-6 Aryl oder Heteroaryl, jeweils ggf. substituiert, R3 = H, OH, OR11, oder über O oder direkt gebundenes Pentenoyl, Allyl, oder C1-20 Acyl, ggf. substituiert, R4 = H, OH, oder OR11, R5 = H, OH, oder OR11, R6 = H, OH, oder OR11, R7 = H, C1-12 Alkyl, Alkenyl und Alkinyl, linear oder verzweigt, gesättigt oder ungesättigt, C3-6 Aryl oder Heteroaryl, Allyl, oder C1-20 Acyl, jeweils ggf. substituiert, R8 = H, OH, OR11, C1-12 Alkyl, Alkenyl und Alkinyl, linear oder verzweigt, gesättigt oder ungesättigt, C3-6 Aryl oder Heteroaryl, oder O-CO-O-R11, jeweils ggf. substituiert, R9 = OR11, C1-12 Alkyl, Alkenyl und Alkinyl, linear oder verzweigt, gesättigt oder ungesättigt, C3-6 Aryl oder Heteroaryl, jeweils ggf. substituiert, H, oder OH,
    R10 = H, C1-12 Alkyl, Alkenyl und Alkinyl, linear oder verzweigt, gesättigt oder ungesättigt, C3-6 Aryl oder Heteroaryl, oder Allyl, jeweils ggf. substituiert, R11 = C1-12 Alkyl, Alkenyl und Alkinyl, linear oder verzweigt, gesättigt oder ungesättigt, C3-6 Aryl oder Heteroaryl, jeweils ggf. substituiert,
    wobei R4 und R5 alternativ zusammen einen Ring bildend -O-CH2-O- sein können, wobei X1 und X2 durch eine Einfachbindung oder eine Doppelbindung miteinander verbunden sein können, wobei X3 ein C-Atom, ein N-Atom, oder, in Abwesenheit von R10, ein O-Atom sein kann, wobei X4 -O- oder -CO- sein kann, wobei alle freien Valenzen mit H gebunden sind, wobei jedoch H an C12 durch OH ersetzt sein kann, wobei eine OH Gruppe oder mehrere OH Gruppen unabhängig voneinander mit einer C1-16 gesättigten oder ungesättigten aliphatischen, aromatischen oder aliphatisch/aromatischen Carbonsäure, einer Sulfonsäure, oder einer Phosphorsäure, ggf. substituiert, verestert sein können, und wobei eine OH Gruppe oder mehrere OH Gruppen unabhängig voneinander mit einem C1-16 gesättigten oder ungesättigten aliphatischen, aromatischen oder aliphatisch/aromatischen ein- oder mehrwertigem Alkohol, ggf. substituiert, verethert sein können, sowie Isomere, Diastereomere, Enantiomere und Salze solcher Verbindungen,
    wobei die folgenden Kombinationen ausgenommen sind:
    • i) R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = OH, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 = OCH3, R7 = H, R8 = OH, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O; wobei jedoch H an C12 durch OH ersetzt sein kann
    • ii) optional, R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = O-Acetyl, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 = OCH3, R7 = H, R8 = OH, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O
    • iii) optional, R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = OH, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 = OCH3, R7 = Acetyl, R8 = OH, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O
    • iv) optional, R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = O-Acetyl, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 = OCH3, R7 = Acetyl, R8 = OH, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O,
    • v) R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = O-Acetyl, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 = OCH3, R7 = Acetyl, R8 = Acetyl, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O,
    • vi) R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = O-Acetyl, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 = OCH3, R7 = H, R8 = Acetyl, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O,
    • vii) R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = OH, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 = OCH3, R7 = H, R8 = Acetyl, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O,
    • viii) R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = OH, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 = OCH3, R7 = H, R8 = H, R9 = OCH3, R10 = CH3, Doppelbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O,
    • ix) R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = OH, R4 = OH, R5 = OH, R6 = OCH3, R7 = H, R8 = OH, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, sowie X3 = N, sowie X4 = O,
    • x) R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = OH, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 = OCH3, R7 = H, R8 = 2-Phenylbutyrat, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O,
    • xi) optional, R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = O-Acetyl, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 = OCH3, R7 = Acetyl, R8 = 2-Phenylbutyrat, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O,
    • xii) optional, R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = OH, R4 = OH, R5 = OH, R6 = OCH3, R7 = H, R8= =O, R9 = =O, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, sowie X3 = N, sowie X4 = O.
  • Vorzugsweise ist: R1 = H, Cl, oder Br, R2 = H oder CH3, R3 = OH, OCH3, Pentenoyl, Allyl, oder Acetyl, R4 = H, OH, oder OCH3, R5 = H, oder OH, R6 = H, OH, oder OCH3, R7 = H, CH3, Allyl, oder Acetyl, R8 = H, OH, Propyl, oder O-CO-O-CH3, R9 = OCH3, CH3, H, oder OH, R10 = H, CH3, oder Allyl, wobei R4 und R5 alternativ zusammen einen Ring bildend -O-CH2-O- sein können, wobei X1 und X2 durch eine Einfachbindung oder eine Doppelbindung miteinander verbunden sein können, wobei X3 ein C-Atom, ein N-Atom, oder, in Abwesenheit von R10, ein O-Atom sein kann, wobei X4 -O- oder -CO- sein kann, wobei alle freien Valenzen mit H gebunden sind, wobei eine OH Gruppe oder mehrere OH Gruppen unabhängig voneinander mit einer aliphatischen Carbonsäure, insbesondere Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Pentansäure, einer gesättigten oder ungesättigten Fettsäure, einer Hydroxysäure (z.B. Milchsäure), einer α-, β-, und ω-Ketocarbonsäure (z.B. Brenztraubensäure), einer Aminosäure, einer Sulfonsäure, oder einer Phosphorsäure verestert sein können.
  • Höchstvorzugsweise ist R1 = H, Cl, oder Br, R2 = H oder CH3, R3 = OH, OCH3, Pentenoyl, oder Allyl, R4 = H, oder OCH3, R5 = H, oder OH, R6 = H, OH, oder OCH3, R7 = H, CH3, oder Allyl, R8 = H, OH, Propyl, oder O-CO-O-CH3, R9 = OCH3, oder CH3, R10 = H, CH3, oder Allyl, wobei R4 und R5 alternativ zusammen einen Ring bildend -O-CH2-O- sein können, wobei X1 und X2 durch eine Einfachbindung oder eine Doppelbindung miteinander verbunden sein können, wobei X3 ein C-Atom, ein N-Atom, oder, in Abwesenheit von R10, ein O-Atom sein kann, wobei X4 -O- oder -CO- sein kann, wobei alle freien Valenzen mit H gebunden sind, wobei eine OH Gruppe oder mehrere OH Gruppen unabhängig voneinander mit einer aliphatischen Carbonsäure, insbesondere Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Pentansäure, einer gesättigten oder ungesättigten Fettsäure, einer Hydroxysäure (z.B. Milchsäure), einer α-, β-, und ω-Ketocarbonsäure (z.B. Brenztraubensäure), einer Aminosäure, einer Sulfonsäure, oder einer Phosphorsäure verestert sein können.
  • Weiterhin bevorzugt sind Lysolipin Derivate gemäß einer der folgenden Formeln, optional an einer oder mehreren OH Funktionalitäten verestert oder verethert, oder Isomere, Diastereomere, Enantiomere oder Salze solcher Verbindungen:
    Figure 00070001
    Figure 00080001
    Figure 00090001
    Figure 00100001
    Figure 00110001
    Figure 00120001
    Figure 00130001
  • Bei einem erfindungsgemäßen Lysolipin Derivat ist zunächst von erheblichem Vorteil, dass es als Ersatztherapie bei Resistenz gegen einen bekannten Wirkstoff Verwendung findet. Mittels des erfindungsgemäßen Wirkstoffes ist in einem solchen Fall überhaupt erst wieder eine Therapie möglich. Eine Reihe der neuen Lysolipin Derivat weisen aber auch zudem eine verbesserte Wirksamkeit gegenüber bekannten Wirkstoffen auf. Hinzu kommt, dass zumindest einige der neuen Lysolipinderivate des Weiteren reduzierte Nebenwirkungen haben können, und veränderte physikochemischen und/oder pharmakologische Eigenschaften aufweisen.
  • Als C1-12 Alkyl, Alkenyl und Alkinyl kommen beispielsweise in Frage Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sek. Butyl, tert. Butyl, Pentyl, Isopentyl, Neopentyl, Hexyl, Vinyl, Propen-1-yl, Propen-2-yl, But-1-en-1-yl, But-1-en-2-yl, But-2-en-1-yl, But-2-en-2-yl, 2-Methyl-prop-2-en-1-yl, 2-Methyl-prop-1-en-1-yl, But-1-en-3-yl, But-3-en-1-yl, Allyl, Acetylenyl, Propin-1-yl, Propargyl, But-1-in-1-yl, But-1-in-4-yl, But-2-in-1-yl, But-1-in-3-yl, 3-Methyl-but-1-in-3-yl, Isoprenyl, Terpene, cyclische Terpene, monozyklische Alkylringe, wie Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, oder Cycloheptyl, mit Alkyl substituierte zyklische Alkylringe, mit Alkyl substituierte Heteroalicyclen (z.B. Morpholinoethyl, 2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol, Pyrrolidin-N-alkyl), Acetale (z.B.: Zucker: Pyranosen, Furanosen, z.B. Glucosyl, Mannosyl, Ribosyl, Arabinosyl; Zucker mit geschützten OH-Gruppen) Disaccharide, Oligosaccharide, Glucuronsäuren.
  • Als C1-20 Acyl kommen beispielsweise in Frage Acetyl, Propanoyl, n-Butanoyl, iso-Butanoyl, n-Pentanoyl, 2-Methyl-Butanoyl, 3-Methyl-Butanoyl, n- und iso-Formen der Alkansäuren CnH2n+1COOH (n = 5 bis 19) (z.B. Fettsäuren), ungesättigte Fettsäuren, Aminosäuren, Dipeptide, Oligopeptide, Glykolsäure.
  • Zur Veresterung von OH-Gruppen geeignete Säuren sind beispielsweise: Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Pentansäure, gesättigte und ungesättigte Fettsäuren, Hydroxysäuren (z.B. Milchsäure), α-, β-, und ω-Ketocarbonsäuren (z.B. Brenztraubensäure), Aminosäuren. Hierbei ist mit dem Begriff der Veresterung gemeint, dass in dem Derivat eine Esterstruktur eingerichtet ist, die von besagter Säure abgeleitet ist. Es muss nicht notwendigerweise eine Veresterungsreaktion durchgeführt werden, die Funktionalität kann auch auf anderem Wege eingerichtet sein.
  • Zur Veretherung von OH-Gruppen geeignete Alkohole sind beispielsweise: Methanol, Ethanol, 1,2-Ethandiol, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol, tert-Butanol, Glycerin, 1,2-Propandiol, 1,3-Propadiol, 1,2-Butandiol, 1,3-Butandiol, 1,4-Butandiol, n-Pentanol, iso-Pentanol, Methoxyethanol, Polyalkohole (z.B. Zucker). Hierbei ist mit dem Begriff der Veretherung gemeint, dass in dem Derivat eine Etherstruktur eingerichtet ist, die von besagtem Alkohol abgeleitet ist. Es muss nicht notwendigerweise eine Veretherungsreaktion durchgeführt werden, die Funktionalität kann auch auf anderem Wege eingerichtet sein.
  • Als Heteroaryl kommen beispielsweise in Frage: Thiophen, Furanyl, Oxazolyl, Thiazolyl, Imidazolyl, Pyridinyl, Pyrimidinyl, Triazinyl, Chinolinyl, Isochinolinyl, Indolyl, Pyrrolyl, Pyrazolyl, Pyrazinyl.
  • Unter Isomeren sind chemische Verbindungen der gleichen Summenformel aber unterschiedlicher chemischer Struktur zu verstehen. Man unterscheidet im Allgemeinen Konstitutionsisomere und Stereoisomere. Konstitutionsisomere besitzen die gleiche Summenformel, unterscheiden sich jedoch durch die Verknüpfungsweise ihrer Atome oder Atomgruppen. Hierzu zählen funktionelle Isomere, Stellungsisomere, Tautomere oder Valenzisomere. Stereoisomere haben grundsätzlich die gleiche Struktur (Konstitution) – und damit auch die gleiche Summenformel – unterscheiden sich aber durch die räumliche Anordnung der Atome. Man unterscheidet im allgemeinen Konfigurationsisomere und Konformationsisomere. Konfigurationsisomere sind Stereoisomere, die sich nur durch Bindungsbruch ineinander überführen lassen. Hierzu zählen Enantiomere, Diastereomere und E/Z (cis/trans) Isomere. Enantiomere sind Stereoisomere, die sich wie Bild und Spiegelbild zueinander verhalten und keine Symmetrieebene aufweisen. Alle Stereoisomere, die keine Enantiomere sind, bezeichnet man als Diastereomere. Ein Spezialfall sind E/Z (cis/trans) Isomere an Doppelbindungen. Konformationsisomere sind Stereoisomere, die sich durch die Drehung von Einfachbindungen ineinander überführen lassen. Zur Abgrenzung der Isomerie-Arten voneinander siehe auch die IUPAC Regeln Sektion E (Pure Appl. Chem. 1976, 45, 11–30.).
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I beinhalten auch die möglichen tautomeren Formen und umfassen die E- oder Z-Isomeren oder, falls ein chirales Zentrum vorhanden ist, auch die Racemate und Enantiomeren. Hierunter sind auch Doppelbindungsisomeren zu verstehen.
  • Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Lysolipin Derivats zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, insbesondere zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer bakteriellen oder viralen Infektion oder einer Pilzerkrankung. Eine solche pharmazeutische Zusammensetzung läßt sich herstellen, indem eine physiologisch wirksame Dosis des erfindungsgemäßen Lysolipin Derivates mit zumindest einem galenischen Hilsstoff gemischt und zu einer Darreichungsform, vorzugsweise einer oralen oder parenteralen (z.B. i.v., i.m. oder subkutane Injektion) Darreichungsform, hergerichtet wird.
  • Die galenische Herrichtung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung kann in fachüblicher Weise erfolgen. Als Gegenionen für ionische Verbindungen kommen beispielsweise Na+, K+, Li+ oder Cyclohexylammonium in Frage. Geeignete feste oder flüssige galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Dragees, Tabletten, (Mikro-) Kapseln, Suppositorien, Sirupe, Säfte, Suspensionen, Emulsionen, Salben, Tropfen oder Lösungen zur Injektion (i.v., i.p., i.m., s.c.) oder Vernebelung (Aerosole), transdermale Systeme oder sonstige topische Applikation, sowie Präparate mit protrahierter Wirkstoff-Freigabe, bei deren Herstellung übliche Hilfsmittel wie Trägerstoffe, Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit- oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel und Lösungsvermittler, Verwendung finden. Als Hilfsstoffe sei Magnesiumcarbonat, Titandioxid, Lactose, Mannit und andere Zucker, Talcum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke, Zellulose und ihre Derivate, tierische und pflanzliche Öle wie Lebertran, Sonnenblumen-, Erdnuss- oder Sesamöl, Polyethylenglycole und Lösungsmittel, wie etwa steriles Wasser und ein- oder mehrwertige Alkohole, beispielsweise Glycerin, genannt. Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ist dadurch herstellbar, dass mindestens ein erfindungsgemäß verwendeter Wirkstoff in definierter Dosis mit einem pharmazeutisch geeigneten und physiologisch verträglichen Träger und ggf. weiteren geeigneten Wirk-, Zusatz- oder Hilfsstoffen mit definierter Dosis gemischt und zu der gewünschten Darreichungsform hergerichtet ist. Vorzugsweise ist eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung galenisch hergerichtet zur oralen, parenteralen oder topischen Gabe.
  • Als Dosierungen kommen für einen 75 kg Erwachsenen 0,01 bis 25 mg/kg/Tag, 0,01 bis 10 mg/kg/Tag, 0,01 bis 5,0 mg/kg/Tag, insbesondere 0,01 bis 1,0 mg/kg/Tag, (oral), oder 0,001 bis 25 mg/kg/Tag, 0,001 bis 10 mg/kg/Tag, 0,001 bis 2,5 mg/kg/Tag, insbesondere 0,005 bis 1,0 mg/kg/Tag, (parenteral) in Frage. Im Falle der topischen Anwendung kann die Wirkstoffkonzentration 0,001 bis 10 Gew.-%, 0,001 bis 1,0 Gew.-%, insbesondere 0,01 bis 0,1 Gew.-%, derfertigen Salbe betragen.
  • Insofern betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Behandlung oder Prophylaxe einer bakteriellen oder viralen Infektion oder einer Pilzerkrankung, wobei eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend eine physiologisch wirksame Dosis eine erfindungsgemäßen Lysolipin Derivates einer Person verabreicht wird, welche an der Infektion oder Erkrankung erkrankt ist oder zu erkranken droht, vorzugsweise in einer der o.g. Darreichungsformen und einer der genannten Dosen.
  • Viele der erfindungsgemäßen Lysolipin Derivate sind totalsynthetisch, wenn überhaupt, nur sehr schwer darstellbar. Sie können dagegen nach gezielter molekulargenetischer Manipulation des Lysolipin-Biosynthesegenclusters in den die Biosynthese ausführenden Mutanten exprimiert werden.
  • Die Inaktivierung bestimmter Modifikationsgene und die Analyse der von den jeweiligen Mutanten erzeugten Strukturen, erlaubt eine Funktionszuweisung für viele der inaktivierten Gene. So ist es z.B. durch ein Inaktivierungsexperiment und die Strukturaufklärung der von der Mutante CB3818LlpMVI_A synthetisierten Substanz gelungen, der Methyltransferase LlpMVI die spezifische Funktion der Methylierung der Hydroxylgruppe am C16 (1) zuzuweisen.
  • Generell kann eine gewünschte Derivatisierung eines natürlicherweise von der Zelle synthetisierten Wirkstoffs dadurch erreicht werden, dass in eine Wirkstoff produzierende Zelle an Stelle oder zusätzlich zu einem natürlichen korrespondierenden Gen für einen definierten Teilsyntheseschritt ein hiervon verschiedenes fremdes Gen für einen von dem definierten Teilsyntheseschritt verschiedenen anderen definierten Teilsyntheseschritt eingeführt ist. Dies kann durch Konstruktion und Einführung des gesamten fremden bzw. mutierten Wirkstoff-Biosynthesegenclusters oder Teilen hiervon erfolgen. Es wird gleichsam eine mutierte Biosynthese maßgeschneidert nach Maßgabe der gewünschten Derivatisierung. Es ist gleichzeitig möglich, ein natürlicherweise in der Zelle enthaltenes Gen codierend für ein Protein oder Peptid, welches für einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese des Wirkstoffs oder eines Wirkstoffderivates funktional ist, zu inhibieren oder zu mutieren, insbesondere ganz oder teilweise zu deletieren. Dies kann auch für mehrere natürlicherweise in der Zelle enthaltene solche Gene erfolgen.
  • Geeignete Zellen sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe der Actinomyceten, wie z.B. die Streptomyceten, oder Enterobakterien, wie z.B. E. coli. Es versteht sich, dass eine erfindungsgemäße Zelle eine mit einem erfindungsgemäßen Transformationsvehikel erzeugte Mutante bzw. Rekombinante bekannter Stämme ist, und dass der damit erzeugbare Wirkstoff gegenüber bekannten Verbindungen derivatisiert ist.
  • Daher lehrt die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Lysolipin Derivates mit den folgenden Verfahrensschritten: a) es wird eine gewünschte Modifikation gegenüber Lysolipin I oder Lysolipin X definiert, b) es wird ein Gen oder werden mehrere der Gene gemäß Seq.-ID 47 bis 92 anhand ihrer Funktionalitätszuordung mit der Maßgabe ausgewählt, dass das Gen, dessen Mutation und/oder dessen Inhibierung, insbesondere teilweise oder totale Deletion, für die Synthese der Modifikation funktional ist, c) es wird eine Zelle durch Transformation erzeugt, welche das Gen oder die Gene gemäß Stufe b), ggf. mutiert und/oder inhibiert, enthält, wobei das Gen bzw. die Gene in funktionalem Zusammenhang des Lysolipin Biosyntheseclusters der Zelle angeordnet sind, d) die Zelle wird kultiviert, e) das Lysolipin Derivat wird aus der Zelle oder dem Kulturüberstand isoliert, f) optional erfolgt eine chemisch synthetische Derivatisierung des Produktes aus der Stufe e).
  • Erfindungsgemäße Lysolipin Derivate müssen nicht notwendigerweise per se die gewünschten pharmakologischen Eigenschaften aufweisen bzw. sind möglicherweise in Hinblick auf die pharmakologischen Eigenschaften noch nicht optimiert. Um die gewünschten pharmakologischen Eigenschaften zu erhalten, kann es ausreichend sein, eine chemisch synthetische Modifikation des Derivates durchzuführen. Daher betrifft die Erfindung auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Lysolipin Derivates als Zwischenprodukt für die chemisch synthetische Herstellung von modifizierten Lysolipin Derivaten.
  • Schließlich ist es möglich, die im Rahmen der Erfindung charakterisierten und eingesetzten Proteine bzw. Enzyme für eine biokatalytische Derivatisierungsreaktion einzusetzen. Daher lehrt die Erfindung auch die Verwendung eines Proteins oder mehrere der Proteine gemäß der Sequenzen Seq.-ID 1 bis 46 zur enzymatisch katalytischen Derivatisierung von Lysolipin, wobei das Protein mit einem Lysolipinvorläufer oder einem Lysolipinderivat sowie mit allen für die mit dem Protein enzymatisch katalysierte Derivatisierung notwendigen Metaboliten kontaktiert wird und wobei das erhaltene Lysolipin Derivat isoliert wird. Geeignete Proteine bzw. Gene sind auch in der Dissertation P. Lopez, 2005, beschrieben.
  • Im Folgenden wird die Erfindung durch Beschreibung der Herstellung der neuen Lysolipin-Derivate, ihre Strukturaufklärung und die biologische Charakterisierung näher erläutert. Die beschriebenen besonderen Ausführungsformen dienen lediglich zur Erläuterung und zum besseren Verständnis der Erfindung und sind in keinster Weise beschränkend zu verstehen.
    •
  • Beispiel 1: Identifizierung und Charakterisierung des Lysolipin Biosyntheseclusters
  • Mit Hilfe von Gensonden konnte in Hybridisierungen das gesamte Gencluster wie folgt identifiziert werden [s. auch DE 10 2004 047 269.6 , DE 10 2005 026 103.5 , und PCT/DE2005/001494, hiermit „incorporated by reference"]:
    Die chemische Struktur von Lysolipin und Fütterungsexperimente führten zu der Vermutung, dass Lysolipin aus 12 Malonyl-CoA-Einheiten nach einem typischen Polyketidsyntheseschema des Typs II synthetisiert wird. Die Biosynthese des Rückgrats aromatischer Polyketide erfolgt iterativ mit Hilfe der so genannten Minimal PKSII, die aus 3 separaten Enzymen besteht: 2β-Ketoacylsynthase Untereinheiten KSα und KSß und dem „Acyl Carrier Protein" (ACP).
  • Vergleicht man die drei Minimal-PKS kodierenden Gene unterschiedlicher PKSII-Biosynthesen untereinander, so fällt auf, dass diese hochkonserviert sind und meist die charakteristische Organisation KSα-KSβ-ACP aufweisen. KSα bzw. KSβ sind somit geeignete Markergene für aromatische Polyketide (Metsä-Ketelä et al., 2002, Appl. Environ. Micorbiol., 68, 4472–4479) und der Einsatz abgeleiteter Gensonden führte daher auch im Falle des Lysolipin-Produzenten, zur Identifizierung von PKSII-Clustern.
  • Da Lysolipin ein halogenierter Naturstoff darstellt, der an C1 einen Cl-Substituenten trägt, sollte innerhalb des Lysolipin Biosynthesegenlusters auch ein Gen für eine NADH/FAD abhängige Halogenase (van Pée, 2001, Arch. Microbiol. 175, 250–258) vorhanden sein. Auch von Halogenasegenen abgeleitete Primer lassen sich zur Identifikation von Halogenasegenen und dazugehöriger Biosynthesegencluster einsetzen (Piraee and Vining, 2002, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 29, 1–5).
  • Entsprechend erfolgte die Identifizierung des Lysolipin-Biosynthesegenclusters unter Verwendung von PKSII- und Halogenase-spezifischen Gensonden gegen gespottete Klone einer Cosmid-Genbank des Stammes CB28.
  • Dazu wurde ein Genbank von CB28 wie folgt hergestellt: Homogenisierte Bakterienkulturen wurden in 0.5% "low melting point agarose" (SeaPlaque GTG, Biozym) eingebettet und anschließend mit 2 mg/ml HEW-Lysozym (Roth) für 14 h bei Raumtemperatur und mit 1 mg/ml Proteinase K (Merck) für 24 h bei 50°C inkubiert. Die eingebettete DNA wurde partiell mit Sau3AI gespalten, mit Gelase (Epicentre) extrahiert und nach beschriebenen Methoden dephosphoryliert. Die genomische DNA wurde mit 750 ng BamHI gespaltenen Cosmidvektor pOJ436 (Kieser et al., 2000, Practical Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation, Norwich, England.) ligiert, entsalzt, verpackt (Gigapack III Gold Packaging Extract, Stratagene) und in DH5α (Invitrogen) transfiziert.
  • Cosmidklone wurden in 384 MTP gepickt und anschließend auf Nylonfilter (Amersham) gespottet. Nachdem die Kolonien auf den Membranen gewachsen waren, wurden diese nach Nizetic et al., 1991, PNAS 88: 3233–7 prozessiert und unter Verwendung der Standard-Methoden nicht-radioaktiv hybridisiert (Roche). Zur Identifizierung von PKSII-kodierenden Cosmiden wurde zunächst eine homologe Sonde mit Hilfe der genomischen DNA aus CB28 hergestellt (PCR-Primer s. Metsä-Ketelä et al., Appl. Environ. Micorbiol., 68, 4472–4479). Der PCR-Ansatz hatte folgende Zusammensetzung: 1,0 μl genomische DNA von CB28 (ca. 0,2 μg), 2,5 μl 10 × Puffer, 2,5 μl PCR-DIG probe Synthesis Mix (Roche), 5,0 μl Q-Solution, 0,5 μl PKSII-FOR-Primer (50 pmol), 0,5 μl PKSII-REV-Primer (50 pmol), 0,5 μl Qiagen-Taq-Polymerase (2,5 u), 14,5 μl H2O. Die PCR wurde in einem PCR-Gerät von MJ Research (PTC-225) unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 1 × (2 min, 95°C), 30 × (95°C, 1 min; 72°C, 2 min; 72°C, 1.30 min), 1 × (72°C, 5 min). Ein Einsatz der so amplifizierten homologen PKSII-Sonde in einer Hybridisierung gegen die CB28 Cosmidbibliothek ergab 13 hybridisierende Cosmidklone. Um aus diesen Cosmiden solche auszuwählen, die mit hoher Wahrscheinlichkeit Teile des oder das gesamte Lysolipin-Biosynthesegencluster kodieren, wurde eine weitere Sonde, die gegen Halogenasegene gerichtet war, eingesetzt. Dazu wurde ebenfalls mit Hilfe der genomischen DNA von CB28 folgende konservierte Primer eingesetzt: Halo-For: GCG GCT GCA G(GC)T GG(AGT)(AT)(GC)A T(CT)C CG(CT) T Halo-Rev: CC(GC) (GC)TG GAT CC(GC) CGGGTC (GC)A(GCT) GAA GC (s. auch: van Pée, Zehner, S., 2003. Enzymology and molecular genetics of biological halogenation. In: Gribble, G. (Ed.), The Handbook of Environmental Chemistry, Part P Natural Production of Organohalogen Compounds. Springer Verlag, Heidelberg, Vol. 3). Die PCR wurde mit Hilfe des PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche) durchgeführt und hatte folgende Zusammensetzung: 1,0 μl genomische DNA von CB28 (ca. 0,2 μg), 5 μl 10 × Puffer, 5 μl PCR DIG Labeling Mix, je 1 μl Halo-For- und Halo-Rev-Primer (50 pmol), 0,75 μl Enzym-Mix, 36,25 μl H2O. Die PCR wurde in einem PCR-Gerät von MJ Research (PTC-100) unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 1 × (2 min, 94°C), 25 × (94°C, 1 min; 61°C, 1 min; 72°C, 1 min), 1 × (72°C, 10 min). Ein Einsatz der so amplifizierten homologen Halogenase-Sonde in einer Hybridisierung gegen die CB28 Cosmidbibliothek ergab 11 hybridisierende Cosmidklone, die sich durch eine Kontroll-Hybridisierung bestätigen ließen. Insgesamt 3 Cosmidklone (28-4H04, 28-4O22 und 28-3J01) zeigten eine Cohybridisierung gegen PKSII- und Halogenase-Sonde, so dass diese mit einer großen Wahrscheinlichkeit Teile bzw. das vollständige Lysolipin Biosynthesegencluster kodieren sollten.
  • Durch heterologe Expression von Lysolipin in S. albus konnte wie folgt der Nachweis erbracht werden, dass das identifizierte cohybridisierende Cosmid 28-4H04 alle für die Biosynthese von Lysolipin notwendigen Gene kodiert:
    Das cohybridisierende Cosmid 28-4H04 wurde nach S. albus J1074 transferiert, der u.a. erfolgreich als heterologer Wirt zur Produktion von Rebeccamycin eingesetzt wurde (Sanchez et al. 2002, Chem Biol. 9(4): 519–31). Der Cosmidvektor 28-4H04 verfügt neben einen origin of transfer (oriT) auch über eine Integrationsfunktion des Actinomycetenphagen PhiC31. Dies stellte die Voraussetzung dafür dar, dass das Cosmid von E. coli nach S. albus intergenerisch konjugiert werden konnte (Standard-Methode siehe Kieser et al., 2000, Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation, Norwich, England) und anschließend über die Integrationsfunktion in das Chromosom von S. albus integrierte. Ein erfolgreicher Transfer und Integration der Cosmide konnte durch Selektion auf den Apramycin-Resistenzgenmarkers aacC4 (Selektion durch Überschichtung mit 1 mg Apramycin) nachgewiesen werden. Zur Abtötung der E. coli Donoren wurde zusätzlich mit 1 mg Phosphomycin überschichtet. Nach 4– 6 Tagen Inkubation bei 28°C wurden mehrere Transkonjuganden sichtbar, deren Apramycin-Resistenz erfolgreich verifiziert werden konnte.
  • Um eine potentielle heterologe Lysolipin-Produktion im Transkonjuganten S. albus/28-4H04 (CB3818) nachzuweisen, wurde dieser unter Produktionsbedingungen fermentiert und nach Extraktion mit Hilfe der LC(DAD)-MS analysiert. Als Negativ-Kontrolle diente eine S. albus Kultur ohne Cosmid, die unter identischen Bedingungen kultiviert und extrahiert wurde.
  • Die Anzucht erfolgte mit folgenden Kulturen. Vorkultur: 50 ml R5-Medium mit 25 μg/ml Apramycin [Zusammensetzung R5 (s. Kieser et al., 2000) pH 7,2] wurden mit der Transkonjugante CB3818 angeimpft und für 48 h bei 28°C und 160 rpm inkubiert; Hauptkultur: 100 ml R5-Medium mit 25 μg/ml Apramycin [Zusammensetzung R5 s.o.] wurden mit 1 ml der Vorkultur beimpft und für 120 h bei 28°C und 160 rpm inkubiert. Die Kontrollkultur (S. albus) wurde ohne Zugabe von Apramycin kultiviert.
  • Die Extraktion wurde wie folgt durchgeführt: i) jeweils 1 ml der Hauptkultur wurde nach Zugabe von 50 μl 1N HCl mit 1 ml Essigsäureethylester extrahiert und die organische Phase zur Trockne eingeengt, ii) der Rückstand wurde in 100 μl Methanol aufgenommen und die Produktion von Lysolipin mittels LC(DAD)-MS untersucht. Das Injektionsvolumen betrug 20 μl.
  • Gerätespezifikation HPLC:
  • Waters Alliance 2790; Säule: Grom Sil 120 ODS-4 HE, 3 μm, Dim. 40 mm L × 4.0 mm ID; Vorsäule: Phenomenex C18 ODS, 4.0 mm L × 3.0 mm ID;
  • Gerätespezifikation MS:
  • Micromass Q-TOF 2; verwendet wurde die ESI Technik; Scan-Bereich m/z im positiven Modus: 100–1700; für die Quasimolekülionen [M+H]+ und Fragmentionen wurde eine Kapillarspannung von 2,70 kV, eine Cone-Spannung von 33 V und eine Ionenquellen-Temperatur von 120°C angewandt. Der N2-Desolvationsgasfluß betrug 600 l/h bei 250°C
  • Die LC(DAD)-MS-Analyse wurde mit folgendem Gradientensystem durchgeführt (Eluent A: Reinstwasser mit 0.1% (v/v) Ameisensäure, Eluent B: Acetonitril):
  • Figure 00240001
  • Die LC(DAD)-MS-Analyse des Transkonjuganten S. albus/28-4H04 (CB3818) zeigt deutlich, dass diese im Gegensatz zur Negativkontrolle (S. albus) eine Substanz synthetisiert, deren Retentionszeit, UV/Vis-Spektrum sowie Masse der des Lysolipin I entspricht. Hierzu sind in 2 bis 4 die fokussierten Ionenchromatogramme (positiver Modus, fokussiert zwischen m/z 597 bis 599 (Lysolipin I [M+H]+: 598); 2), die UV/Vis(DAD)-Chromatogramme (Base Peak Index (BPI); 3) sowie die auf den Bereich von 260 bis 280 nm (BPI) fokussierten UV(DAD)-Chromatogramme (4) des Transkonjuganten CB3818 (oben) im Vergleich zur Negativkontrolle S. albus (mitte) und Lysolipin I (unten; reines Lysolipin I aus einem Biokatalyse-Ansatz) abgebildet. Das Transkonjuganten Chromatogramm zeigt einen zusätzlichen Peak, der eine Retentionszeit von ca. 4,6 min aufweist. Die diesem Peak entsprechende Substanz zeigt ein UV/Vis-Spektrum (5, oben), das dem UV/Vis-Spektrum von Lysolipin I (reines Lysolipin I aus einem Biokatalyse-Ansatz; 5, unten) entspricht. Ein massenspektrometrischer Vergleich dieser heterolog synthetisierten Substanz (Retentionszeit: 4,7 min; 6, oben) mit Lysolipin I (Retentionszeit des reinen Lysolipin I aus einem Biokatalyse-Ansatz: 4.7 min; 6, unten) zeigt, dass im Transkonjuganten CB3818 eine Substanz gebildet wurde, deren Masse und Isotopenverteilungsmuster der des einfach chlorierten Lysolipin I entspricht.
  • Da die erfolgreiche heterologe Expression von Lysolipin in CB3818 gezeigt hat, dass das Cosmid 28-4H04 alle zur Synthese von Lysolipin notwendigen Gene trägt, konnte das Gencluster durch Sequenzierung identifiziert und wie folgt annotiert werden.
  • Durch Shotgunsequenzierung wurde die Sequenz des Inserts mit 43.202 bp doppelsträngig ermittelt, wozu auf das Sequenzprotokoll verwiesen wird (SEQ.-ID 93). Der GC-Gehalt des gesamten sequenzierten Bereiches wurde mit für Actinomyceten typischen 72,2% bestimmt. Zur Identifizierung potentieller Lysolipin-Biosynthesegene wurden umfassende ORF (Open Reading Frame Analysen unter Verwendung des ORF-Finders "zCurve" (Guo et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31(6): 1780–9) und BlastP-Analysen durchgeführt. Insgesamt konnten 46 putative ORFs identifiziert werden, wobei 'ORF46 unvollständig ist (die Charakteristika und Bezeichnungen der ORFs sind in 7 zusammengefasst). Diese ORFs sind in 9 Gruppen unterschiedlicher Transkriptionsrichtung organisiert (8). Aufgrund der Annotation umfasst das Lysolipin-Biosynthesegencluster 44 ORFs (Llp-Gene) mit einem Kodierbereich von ca. 38,6 kb. Das Genprodukt des im 5'-Bereich, vermutlich außerhalb des Cluster lokalisierten ORFs 1 zeigt höchste Homologie zu einem konservierten hypothetischen Protein aus S. coelicolor (75% Identität), während im 3'-Bereich des Clusters der unvollständige 'ORF46 höchste Ähnlichkeit (86% Identität) zu dem terminalen Protein TpgR2 aus Streptomyces rochei zeigt. Generell ist auffallend, dass die Produkte von insgesamt 16 Lysolipin-Biosynthesegenen (LlpOII, LlpOIII, LlpZI, LlpB, LlpCI, LlpD, LlpE, LlpF, LlpCII, LlpClll, LlpOVI, LlpMI, LlpMII, LlpQ, LlpZIII, LlpRIV, s. 7) höchste Homologien zu Genprodukten der Biosynthesen von Pradimicin, Rubromycin bzw. Griseorhodin aufweisen (Pradimicin-Typ-Antibiotika). Diese drei Substanzen stellen ebenfalls durch eine TypII-PKS synthetisierte, polyzyklische Polyketide dar. Eine weitere Auffälligkeit besteht darin, dass aufgrund der Annotation 16 Llp-Genprodukte höchste Ähnlichkeit zu Enzymen aufweisen, die an Redoxprozessen beteiligt sind. Diese Tatsache erklärt den hoch oxidierten Charakter von Lysolipin. Derzeit ist kein anderes Cluster bekannt, das mehr Enzyme dieser Klasse aufweist.
  • Die aufgrund des Proteinsequenzvergleichs zu postulierenden Funktionen der einzelnen Lysolipin-Biosynthesegene bzw. Genprodukte legen nahe, dass die Biosynthese von Lysolipin wie folgt abläuft: Innerhalb des Clusters ist mit llpA ein Gen zu finden, dessen Genprodukt höchste Ähnlichkeit zu Asparaginsynthasen/Glutaminamidotransferasen aufweist. Diese Enzyme übertragen Aminogruppen von Glutamin auf Aspartat, was die Synthese von Asparagin und Glutamat zur Folge hat. In ähnlicher Weise könnte LlpA die Aminogruppe von Glutamin auf Malonyl-CoA übertragen, was die Bildung von Malonamid-CoA zur Folge hätte.
  • Die Kondensation der putativen Malonamid-Einheit mit 11 weiteren Malonat-Einheiten wird durch die Minimal-PKS katalysiert. Diese wird durch die drei Gene llpD, llpE und llpF kodiert. Die abgeleiteten Genprodukte zeigen höchste Ähnlichkeiten (52, 69 und 78%) zum ACP und zu den β-Ketoacylsynthase Untereinheiten KSβ und KSα des Rubromycin-Biosynthesegenclusters.
  • Die Biosynthese von Lysolipin erfordert mehrere präaromatische Deoxygenierungen, die eventuell schon während der Bildung des Polyketids initiiert werden (Bockholt et al. 1994, J. Org. Chem. 59, 2064–2069). Im Lysolipin-Biosynthesegencluster sind mit llpZI, llpZIII und llpZIV drei Gene vorhanden, deren Genprodukte höchste Identität zu 3-oxoacyl-ACP Reduktasen aufweisen. Diese Enzyme könnten für die in Bockholt et al., 1994 beschriebenen Reduktionen verantwortlich sein, die die Voraussetzung für die Deoxygenierung der entsprechenden Ketogruppen darstellt.
  • Die Biosynthese eines aromatischen Backbones wird meist mit Hilfe von Cyclasen bzw. Aromatasen abgeschlossen, wobei mindestens 2 Cyclasen benötigt werden. Im Lysolipin-Biosynthesegencluster sind mit den Genen IIpCI-III drei Gene vorhanden, deren Genprodukte höchste Identität zu Cyclasen der Griseorhodin/Rubromycin-Biosynthese zeigen.
  • Da 9 der 12 in Lysolipin X (Bockholt et al., 1994) vorhandenen Sauerstoffatome aus molekularem Sauerstoff stammen, ist das Vorhandensein einer großen Anzahl von Sauerstoff-einführenden Oxidoreduktasen nicht verwunderlich. Die zu den Oxidoreduktasen gehörenden Oxygenasen katalysieren die Einführung von einem (Monooxygenase) oder zwei Sauerstoffatomen (Dioxygenasen) in das entsprechende Substrat. Im Lysolipin-Biosynthesegencluster sind aufgrund der Sequenzannotation 3 Gene vorhanden, die für drei FAD-abhängige Mono- oder Dioxygenasen (LlpOI, LlpOV und LlpOVIII) kodieren. Die abgeleiteten Genprodukte weisen eine Größe von 461, 397 und 541 Aminosäuren (AS) auf. Aufgrund der Proteinsequenz und Homologie, lässt sich nicht vorhersagen, an welcher konkreten Oxygenierung die jeweilige FAD-abhängige Oxygenase beteiligt ist. Dennoch erscheint es wahrscheinlich, dass eines dieser Enzyme an der Bildung des Xanthons bzw. an der oxidativen Ringspaltung beteiligt ist, da eine solche Baeyer-Villiger Oxidation in der Mithramycin-Biosynthese durch die FAD abhängige Monooxygenase MtmOIV katalysiert wird (Rodriguez et al. 2003, J Bacteriol. 185(13): 3962–5). Interessant ist allerdings die Tatsache, dass LlpOVIII höchste Ähnlichkeit (47% Identität) zur Tetracenomycin-Hydroxylase TcmG aufweist, die für eine 3-fach Hydroxylierung verantwortlich ist (Rafanan et al., 2000, Org Lett. 5; 2(20): 3225–7).
  • Darüber hinaus befinden sich im Cluster 3 Gene llpOIV, llpOVI und llpOVII, deren abgeleitete Genprodukte höchste Identität zu Cytochrom P450-abhängigen Monooxygenasen (CYP450) aufweisen. LlpOIV zeigt höchste Ähnlichkeit zu MycG (48% Identität), eine CYP450, die im Verlauf der Mycinamycin-Biosynthese sowohl für eine Hydroxylierung als auch Epoxidierung verantwortlich ist (Inouye et al., 1994 Mol Gen Genet. 245(4): 456–64). Wie bei einigen anderen CYP450, die an der Biosynthese von Sekundärmetaboliten beteiligt sind, befindet sich auch stromabwärts von llpOIV mit llpK ein Gen, das für ein Ferrodoxin kodiert. LlpOVI zeigt größte Ähnlichkeit zu einer CYP450 aus dem Pradimicin-Biosynthesegencluster. Die abgeleiteten Genprodukte LlpOII und LlpOIII zeigen ebenfalls höchste Ähnlichkeit zu Genen der Pradimicingruppe (RubT, GrhV, GrhU), für die keine Funktion beschrieben ist. Eine Motivsuche (Pfam-Analyse) ergibt jedoch für beide Enzyme ein eindeutiges „Antibiotic biosynthesis monooxygenase"-Motiv, so dass auch diese beiden Enzyme an Oxygenierungsreaktionen beteiligt sein sollten. Weiterhin kodiert IIpL für ein Genprodukt, das höchste Homologie zu dem als Hydroxylase annotierten Enzym SnoaW aufweist. Die genaue Funktion dieses Enzyms innerhalb der Lysolipin-Biosynthese bleibt ebenso wie die Funktion aller übrigen Lysolipin Oxygenasen zu klären.
  • Darüber hinaus sind im Cluster noch folgende weitere Gene lokalisiert, deren Genprodukte höchste Ähnlichkeiten zu Oxidoreduktasen zeigen:
    LlpU: Genprodukt weist „alcohol dehydrogenase" Motiv auf und zeigt höchste Ähnlichkeit zu Dehydrogenasen.
    LlpZII: Genprodukt zeigt höchste Identität (42%) zu MmcJ, einer F420 abhängigen Tetrahydromethanopterin (H4MPT)-Reduktase der Mitomycin-Biosynthese. Dieses Enzym katalysiert eine Carbonyl-Reduktion und könnte eventuell an der Biosynthese des Lysolipinstarters beteiligt sein.
    LlpS: Genprodukt zeigt höchste Identität (37%) zu 3-Hydroxybutyrat-Dehydrogenasen, die im Lipidstoffwechsel involviert sind.
  • Eine mögliche Funktion der beiden Dehydrogenasen, LlpU oder LlpS könnte in der Oxidation einer Lysolipin-Vorstufe bestehen, die zur Einführung der Methylengruppe notwendig sein könnte.
  • Das Gen llpH kodiert ein Genprodukt, das höchste Ähnlichkeiten zu NADH/FAD-abhängige Halogenasen (37–39%) zeigt. Somit wird LlpH für die Halogenierung an C1 verantwortlich sein.
  • Für die Biosynthese von Lysolipin sind 4 O-Methylierungen und eine N-Methylierung notwendig. Im Cluster können 6 Gene identifiziert werden (llpMI bis llpMVI), deren Genprodukte höchste Ähnlichkeiten zu O-Methyltransferasen unterschiedlicher Antibiotika-Biosynthesen, wie Tetracenomycin, Griseorhodin und Enterocin aufweisen. Auffallend ist, dass das Cluster für 6 O-Methyltransferasen kodiert, obwohl nur 5 benötigt werden.
  • Im Cluster befinden sich 4 Regulatorgene (llpRI-llpRIV). LlpRIV weist hohe Homologie (39%) zu dem Regulator RubS der Rubromycin-Biosynthese auf, der zu den sog. SARPs („Streptomyces antibiotic regulatory protein") gehört. SARP-Regulatoren stellen Biosynthese-spezifische Transkriptionsaktivatoren dar. Vor einigen Lysolipin-Genen können dementsprechend typische SARP-spezifische Erkennungssequenzen gefunden werden. LlpRI zeigt Homologie zu einem Transkriptionsregulator (vermutlich einem Repressor) und könnte den Beginn des Clusters markieren. LlpRII und LlpRIII zeigen höchste Ähnlichkeit zu Transkriptionsaktivatoren (s. Tabelle 1).
  • Das Cluster beherbergt mit llpN ein Gen, dessen abgeleitetes Genprodukt höchste Identität (30%) zu einem „multidrug transporter" aus Lactococcus lactis zeigt. Dieses Protein ist wahrscheinlich an der Resistenzvermittlung beteiligt. Darüber hinaus kodiert das Lysolipin-Biosynthesegencluster mit LlpB und LlpQ, 2 Genprodukte, die die höchste Identität (40–50%) zu den Membranproteinen RubQ und GrhM der Rubromycin- bzw. Griseorhodin-Synthese zeigen. Eine Funktion dieser Proteine ist bisher nicht beschrieben. Dennoch könnten beide Membranproteine ebenfalls zur Resistenzvermittlung beitragen. Überraschenderweise ist im Lysolipin-Gencluster mit llpG ein Gen lokalisiert, dessen abgeleitetes Genprodukt signifikante Identität (42%) zu Glykosyltransferasen zeigt. Es gibt mit Kigamycin sehr wohl glykosylierte Lysolipin-ähnliche Xanthone (Kunimoto et al., 2003, 56, 1012–1017), allerdings sind glykosylierte Lysolipin-Derivate bisher nicht bekannt. Ob wie bei Makroliden eine evtl. intermediäre Glykosylierung ein Resistenzmechanismus darstellt, bleibt zu prüfen.
  • Im Cluster befinden sich mit llpT und llpV weiterhin 2 Gene, deren Genprodukte höchste Homologie zu einer als Polyketidsynthase CurD annotierten Sequenz bzw. zu WhiE aufweisen. Die Funktion innerhalb der Synthese ist aufgrund dieser Homologien jedoch nicht vorhersagbar. Weitere Gene/ORFs unbekannter Funktion sind llpJ und llpW.
  • Im Cluster befinden sich mit llpT und llpV weiterhin 2 Gene, deren Genprodukte höchste Homologie zu einer als Polyketidsynthase CurD annotierten Sequenz bzw. zu WhiE aufweisen. Die Funktion innerhalb der Synthese ist aufgrund dieser Homologien jedoch nicht vorhersagbar. Weitere Gene/ORFs unbekannter Funktion sind llpX, llpY, llpP und llpJ.
  • Für die Funktionalitäten bzw. Zuordnungen wird auf die 7 und 8 verwiesen. Für das Sequenzprotokoll ergibt sich die folgende Genliste (ID Nukleinsäure/ID Protein):
    ORF1 47/1; llpX 48/2; llpY 49/3; llpP 50/4; llpRI 51/5; llpOI 52/6; llpJ 53/7; llpOII 54/8; llpOIII 55/9; llpZI 56/10; llpB 57/11; llpCI 58/12; llpD 59/13; llpE 60/14; llpF 61/15; llpCII 62/16; llpCIII 63/17; llpU 64/18; llpG 65/19; llpA 66/20; llpRII 67/21; llpOIV 68/22; llpK 69/23; llpT 70/24; llpL 71/25; llpOV 72/26; llpN 73/27; llpRIII 74/28; llpOVI 75/29; llpMI 76/30; llpOVII 77/31; llpMII 78/32; llpOVIII 79/33; llpMIII 80/34; llpQ 81/35; llpZII 82/36; llpMIV 83/37; llpS 84/38; llpV 85/39; llpZIII 86/40; llpH 87/41; llpRIV 88/42; llpZIV 89/43; llpMV 90/44; llpMVI 91/45; und ORF46 92/46.
  • SEQ.-ID 93 ist die Gesamtnukleinsäuresequenz.
  • Beispiel 2: Beschreibung der Darstellung neuer Lysolipin-Derivate
  • Zur Synthese neuer Lysolipinderivate wurden die drei folgenden Strategien zum Teil auch in Kombination eingesetzt:
  • 2.1 Gezielte Fermentation zur Erzeugung von unchlorierten und bromierten Lysolipin-Derivaten
  • Lysolipin trägt an Position 1 einen Cl-Rest, der durch die NADH/FAD-abhängige Halogenase LlpH eingeführt wird. Einige Halogenasen besitzen eine erstaunliche Flexibilität hinsichtlich des Halogenidions, so dass durch einen Austausch von Chloridionen gegen Bromidionen im Fermentationsansatz, wie am Beispiel der Glykopeptid-Antibiotika beschrieben (Bister, B. et al., 2003 ChemBioChem. 4(7): 658–662), die Biosynthese von bromierten Derivaten möglich sein könnte. Da bei strukturverwandten Xanthonen, wie Actinoplanon die Anwesenheit des Cl-Restes die Cytotoxizität der Substanz erhöht, erscheinen Modifikationen des Halogenierungsstatus von Lysolipin sinnvoll.
  • Aus diesem Grund wurde der Lysolipin heterolog produzierende S. albus Stamm CB3818 unter Zugabe von NaBr fermentiert (Produktion wie unter 2. beschrieben, zum Vorkultur Medium und Hauptkultur-Medium wurde 5 g NaBr anstelle von NaCl zugegeben).
  • Im Überstand konnte nach Extraktion durch LC-DAD-MS (s. 2.) das dechlorierte Lysolipinderivat CBS44 und das bromierte Lysolipinderivat CBS49 nachgewiesen werden (Beschreibung der Isolierung und Strukturaufklärung s. 3).
  • Die erfolgreiche fermentative Herstellung eines Lysolipin Dechloro- und Brom-Derivates in einem Medium, das NaBr aber kein NaCl enthält, eröffnet die Möglichkeit, aus allen Lysolipin-Derivat produzierenden Geninaktivierungsmutanten (s. 2.2) nach NaBr-Fermentation entsprechende Dechloro- bzw. Brom-Derivate biosynthetisch zu erzeugen. So konnte z.B. durch gezielte Fermentation (Zugabe von NaBr, s.o.) der Apramycin-Insertionsmutante CB3919LlpOI_A ein neues dechloriertes CBS40 gewonnen werden, das mit CBS48 bezeichnet wurde (s. 3.).
  • 2.2 Inaktivierung von Lysolipinbiosynthesegenen
  • Die Biosynthese von Lysolipin ist durch eine Vielzahl von Post-PKS Modifikationsreaktionen gekennzeichnet. Diese Reaktionen werden durch „Tailoring"-Enzyme wie Sauerstoff-einführende Oxidoreduktasen, Methyltransferasen und einer Halogenase katalysiert.
  • Mit Hilfe der Inaktivierung von Tailoring-Enzymen können Mutanten generiert werden, die bestimmte Vorstufen bzw. Zwischenprodukte anhäufen. Diese Derivate können per se interessante, neue pharmakologische und physikochemische Eigenschaften aufweisen bzw. als Ausgangsmaterial für weitere chemische Derivatisierungen eingesetzt werden.
  • Die gezielte Inaktivierung von ausgewählten Biosynthesegenen kann prinzipiell durch unterschiedliche Methoden erreicht werden. Da im Falle des Lysolipins eine heterologe Expression des gesamten Clusters durch Cosmid 28-4H04 möglich ist, besteht die Möglichkeit, bestimmte Gene in E. coli zu inaktivieren und anschließend das modifizierte Cosmid nach S. albus zur heterologen Expression des entsprechenden Derivats zu transferieren. Zur Inaktivierung der auf dem Cosmid lokalisierten Lysolipin-Biosynthesegene in E. coli sind folgende Methoden denkbar: i. die ortsspezifische Mutagenese von Genen eventuell kombiniert mit einer „long range PCR"; ii. das Auffüllen von Schnittstellen in den zu inaktivierenden Genen, das die Einführung von frame shift Mutationen zur Folge hätte; iii. die Inaktivierung von Genen nach Anwendung der in vivo Rekombination (s. z.B. Gust et al., 2004, Adv Appl Microbiol. 2004; 54: 107–28). Alternativ ist es ebenfalls möglich, Biosynthesegene nach Transfer und Integration des gesamten Lysolipingenclusters ins Chromosom traditionell durch homologe Rekombination zu inaktivieren. Bei dieser Methode wird das zu inaktivierende Zielgen gegen eine Resistenzgenkassette oder ein „in frame" deletiertes Allel mit Hilfe der homologen Rekombination im heterologen Produzentenstamm ausgetauscht („gene replacement").
  • Zur Inaktivierung von Lysolipin-Biosynthesegenen bietet sich die klassische Methode der „gene replacement" Mutagenese im heterologen Lysolipin- Produktionsstamm S. albus an, der über eine sehr gute genetische Handhabbarkeit verfügt.
  • Die Durchführung dieses Ansatzes für das Lysolipin-Biosynthesegencluster erfordert folgende Schritte:
    • • Austausch des Cosmid-Resistenzmarkers aac(C3(IV) gegen das Kanamycin-Resistenzgen aphII
    • • Inaktivierung einer singulären SpeI site des Lysolipingenclusterkodierenden Cosmids 28-4H04-aphII durch Insertion einer Ampicillin-Resistenzgenkassette
    • • Transfer des modifizierten Cosmids 28-4H04-aphII-bla nach S. albus
    • • Konstruktion von Inaktivierungsplasmiden und Generierung von gezielten Insertions- und in frame Deletionsmutanten in Genen des Lysolipinbiosynthesegenclusters in S. albus 28-4H04-aphII-bla (CB3919)
  • Übertragen auf das Lysolipin-Biosynthesegen-tragende Cosmid können die einzelnen Schritte wie folgt durchgeführt werden:
  • Austausch des Cosmid-Resistenzmarkers aac(C3(IV) gegen das Kanamycin-Resistenzgen aphII:
  • Zur Inaktivierung von Biosynthesegenen des Lysolipin-Genclusters bietet sich die Apramycin-Resistenzgenkassette aac(3)IV an, da die Apramycin-Resistenz in Streptomyceten und E. coli sehr zuverlässig ist. Da diese Resistenz bereits im Grundvektoranteil pOJ436 des Lysolipingencluster tragenden Cosmids 28-4H04 vorhanden ist, muss dieser Marker zunächst z.B. gegen das Kanamycin-Resistenzgen ausgetauscht werden. Das Kanamycin-Resistenzgen kann nicht als Inaktivierungsmarker eingesetzt werden, da das Apramycin-Resistenzgen aac(3)IV gleichzeitig Resistenz gegen Apramycin und Kanamycin vermittelt, während das Kanamycin-Resistenzgen als Vektormarker keine Kreuzresistenz gegen Apramycin zeigt. Der Austausch des Apramycin-Resistenzgens aac(3)IV gegen das Kanamycin-Resistenzgen aphII kann mit Hilfe einer „überlappenden PCR"-basierte Strategie durchgeführt werden, da im Hybridcosmid 28-4H04 keine geeigneten Restriktionsenzymschnittstellen vorhanden sind. Dazu wird ausgehend vom Hybridcosmid 28-4H04 ein ca. 3450 bp Bereich, der stromaufwärts und ein 4520 bp Bereich der stromabwärts von aac(3)IV lokalisiert ist, mit den Primern aac-upA und aac-upB, bzw. aac-downA und aac-downB in getrennten PCR-Reaktionen amplifiziert. Primer zur Amplifikation des stromaufwärts von aac(3)IV gelegen DNA-Bereichs sind:
    Figure 00340001
  • Primer zur Amplifikation des stromabwärts von aac(3)IV gelegen DNA-Bereichs sind:
    Figure 00340002
  • Der Primer aac-upA weist eine XbaI-Schnittstelle und Primer aac-downB eine SpeI-Schnittstelle am 5'-Ende auf (fett hervorgehoben). Primer aac-upB weist ein 20 bp umfassendes überhängendes 5'-Ende auf, das homolog zu dem stromaufwärts gelegenen DNA-Bereichen des aphII-Gens ist. Primer aac-downA weist dementsprechend ein 20 bp umfassendes überhängendes 5'-Ende auf, das homolog zu dem stromabwärts gelegenen DNA-Bereichen des aphII-Gens ist.
  • PCR-Reaktion:
  • Als Template wird isolierte DNA des Hybridcosmids 28-4H04 eingesetzt. Zur Amplifikation kann der ProofStart DNA-Polymerase Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) nach Beschreibung des Herstellers eingesetzt werden. Folgendes PCR-Programm ist für die Amplifikation der ca. 3450 bzw. 4520 bp großen PCR-Fragmente einzusetzen:
    Programm: Schritt 1: 5 min 95°C,
    Schritt 2: 1 min 94°C
    Schritt 3: 1 min 50–70°C
    Schritt 4: 10 min 72°C
    Schritt 5: 5 min 72°C
    Schritte 2 bis 4 wurden 35 mal wiederholt
  • Das eigentliche aphII-Gen wird als 1165 bp DNA-Fragment mit den Primern aphII-up und aphII-down amplifiziert:
    Figure 00350001
  • Als Template wird das Streptomycetenplasmid pGM9 eingesetzt (Muth et al. 1989, Mol. Gen. Genet. 219, 341–348). Die PCR-Reaktion erfolgt wie oben beschrieben, wobei die Zeit für Schritt 4 jedoch 1,5 min beträgt.
  • Die drei erhaltenen PCR-Produkte werden aufgereinigt und in einer PCR-Reaktion eingesetzt (Bedingungen wie zur Amplifikation des aphII-Gens), bei der jedoch kein Primer zugesetzt wird. Anschließend wird das erhaltene Produkt als Template-DNA in einer PCR-Reaktion eingesetzt (Bedingungen wie oben, wobei die Zeit für Schritt 4 20 min beträgt), bei als Primer aac-upA und aac-downB dienen. Das ca. 9 kb große Fragment wird zunächst in einem Vektor mit blunt end Schnittstelle, wie z.B. pBluescript II KS (-) nach EcoRV-Spaltung, zwischen kloniert. Alle Klonierungen und DNA-Modifikationen werden wie unter Sambrook et al., 1989 (Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) beschrieben, durchgeführt.
  • Abschließend wird das in pBluescript klonierte PCR-Produkt (ca. 9 kb) mit XbaI und SpeI verdaut und mit XbaI-SpeI verdauter 28-4H04-DNA ligiert. E. coli XL1-blue wird mit dem Ligationsansatz transformiert und auf LB-Platten mit Kanamycin (50 μg/ml) selektioniert. Kanamycin-resistente und Apramycin-sensitive Klone enthalten das Hybridcosmid 28-4H04-aphII.
  • Inaktivierung einer singulären SpeI site des Lysolipingencluster-kodierenden Cosmids 28-4H04-aphII durch Insertion einer Ampicillin-Resistenzgenkassette
  • Apramycin-Insertionsmutanten können über homologe Rekombination durch Plasmidkonstrukte generiert werden, die anstelle des zu inaktivierenden Gens die Apramycin-Resistenzgenkassette aac(3)IV aufweisen und flankierende homologe Genregionen aufweisen. Die zur Insertionsmutagenese einzusetzenden Plasmidkonstrukte kann man auch zur Herstellung von Hybridplamiden nutzen, die für eine in-frame Deletionsmutagenese geeignet sind. Dazu wird die inserierte Apramycin-Resistenzgenkassette durch PCR mit singulären, kompatiblen SpeI und NheI Schnittstellen versehen. Die Schnittstellen können so konzipiert werden, dass nach SpeI und NheI-Verdau und Religation eine in frame Deletion im zu inaktivierenden Gen entsteht. Die entsprechenden Hybridplasmide sind zur Generierung von in frame Deletonsmutanten geeignet. Um diese Strategie für alle zu inaktivierenden Lysolipin-Biosynthesegene einzusetzen, muss zuvor die in 28-4H04-aphII vorhandene singuläre SpeI-Schnittstelle, die sich angrenzend zum Cosmidinsert befindet, eliminiert werden. Dies ist durch Integration einer Ampicillin-Resistenzgenkassette (bla) in diese SpeI-Schnittstelle möglich und aufgrund der zusätzlichen Resistenz in E. coli selektionierbar
  • Daher wird das bla-Gen mit folgenden Primern amplifiziert, wodurch ein 939 bp DNA-Fragment erhalten wird, das nach Aufreinigung mit XbaI-verdautem pK18 (Schäfer et al., 1994, Gene, 145, 69–73) ligiert wird:
    Bla_xba_For:
    5'-CCGCTCTCTAGACAATAACCCTGATAAATG-3'
    Bla_xba_Rev
    5'-TGAGTATCTAGAGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATC-3'
  • Als Template dient das isolierte Plasmid pBluescript II KS (-). Zur Amplifikation wurde die Taq DNA-Polymerase (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) nach Beschreibung des Herstellers eingesetzt.
    Programm: Schritt 1: 5 min 95°C,
    Schritt 2: 1 min 94°C
    Schritt 3: 1 min 50–70°C
    Schritt 4: 1 min 72°C
    Schritt 5: 5 min 72°C
    Schritte 2 bis 4 wurden 29 mal wiederholt.
  • Das PCR-Produkt wird mit dem GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Biosciences UK Limited, Little Chalfont Buckinghamshire, UK) isoliert.
  • Das isolierte DNA-Fragment wird mit XbaI verdaut und anschließend mit XbaI-linearisierter pK18-DNA ligiert. Mit dem Ligationsansatz wird E. coli XL1-blue transformiert und Transformanden auf Carbenicilin-haltigem (50 μg/ml) LB-Medium selektiert. Aus dem so erhaltenen Hybridplasmid pK18-bla wird die bla-Resistenzgenkassette nach Verdauung mit XbaI präparativ isoliert, und mit SpeI verdauter 28-4H04-aphII-DNA ligiert. Anschließend wird E. coli XL1-blue mit dem Ligationsansatz transformiert und Selektion erfolgt auf LB-Platten mit Carbenicillin (50 μg/ml) und Kanamycin (50 μg/ml).
  • Die Cosmide werden aus den erhaltenen Transformanden isoliert und die Integration des bla-Gens in die SpeI-Schnittstelle mittels Spaltung mit SpeI und XbaI bestätigt. Das entsprechende Hybridcosmid erhält die Bezeichnung 28-4H04-aphII-bla.
  • Transfer des modifizierten Cosmids 28-4H04-aphII-bla nach S. albus
  • Durch intergenerische Konjugation kann das modifzierte 28-4H04-aphII-bla Cosmid nach S. albus gebracht und die Lysolipin-Produktion wie oben beschrieben überprüft werden. Die S. albus Rekombinante, die das modifizierte Cosmid 28-4H04-aphII-bla trägt, bekommt die Bezeichnung CB3919.
  • Konstruktion von Inaktivierungsplasmiden und Generierung von gezielten Insertions- und in frame Deletionsmutanten in Genen des Lysolipinbiosynthesegenclusters in S. albus 28-4H04-aphII-bla (CB3919)
  • Zur gezielten Erzeugung von Mutanten in ausgewählten Genen des Lysolipin-Biosynthesegenclusters wird einerseits die Apramycin-Resistenzgenkassette (aac(3)IV) ins Zielgen integriert (Insertionsmutante) und andererseits an gleicher Stelle eine „in frame"-Deletion erzeugt (in frame Deletionsmutante). Die Erzeugung von in frame Deletionsmutanten hat neben der Vermeidung polarer Effekte den Vorteil, dass ausgehend von entsprechenden Deletionsmutanten die Apramycinkassette erneut als Marker auf dem Weg zur Herstellung von Doppel- bzw. Mehrfachmutanten eingesetzt werden kann.
  • Die generelle Strategie zur Mutagenese der Zielgene kann wie folgt beschrieben werden (s. 9 und 10):
    Zunächst wird das Apramycin-Resistenzgen mit Primern amplifiziert, die eine anschließende Klonierung als SpeI-NheI-Fragment zulassen. Darüber hinaus werden zwei weitere PCR-Fragmente (jeweils ca. 2000 bp) erzeugt, die von DNA-Bereichen stromaufwärts („upstream") und stromabwärts („downstream") des zu inaktivierenden Gens durch PCR amplifiziert werden und ebenfalls mit einer SpeI bzw. NheI Schnittstelle versehen sind. Alle 3 PCR-Fragmente werden in den in Streptomyceten nicht replikativen Inaktivierungsvektor pDH5 (Hillemann et al., 1991 Nucleic Acids Res. 19(4): 727–31) kloniert. Nach erfolgreicher Klonierung tragen die entsprechenden Inaktivierungsplamide ein Insert, in dem der Upstream-Bereich des zu inaktivierenden Zielgens über eine SpeI-Schnittstelle mit der Apramycin-Resistenzgenkassette fusioniert ist und diese wiederum über eine NheI-Schnittstelle vom Downstream-Bereich des Zielgens flankiert ist (s. 9).
  • Entsprechende Hybridplasmide werden durch eine PEG-induzierte Protoplastentransformation (Kieser et al., 2000, Practical Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation, Norwich, England) in den S. albus Stamm CB3919 übertragen, der bereits das Lysolipin-Biosynthesegenclustertragende Cosmid 28-4H04-aphII-bla enthält. Durch Selektion auf Apramycin können Klone selektiert werden, bei denen entweder das pDH5-Hybridplasmid durch homologe Rekombination über den Upstream- oder Downstream-Bereich ins Chromsom integriert sind (einfaches cross over) oder es bereits durch ein doppeltes cross-over zu einem Genaustausch des Zielgens gegen die Apramycin-Kassette gekommen ist (s. 10, oberer Teil). Durch Selektion auf Thiostrepton haltigem Medium kann eine Plasmidintegrationen (Thiostrepton resistent) von Apramycin-Insertionsmutanten (Thiostrepton-sensitiv) unterschieden werden.
  • Zur Erzeugung der „in-frame"-Deletionsmutanten, werden die zur Generierung der entsprechenden Apramycin-Insertionsmutanten verwendeten pDH5-Hybridplasmide einer Doppelverdauung mit NheI und SpeI unterzogen. Anschließend erfolgt eine Ligation über die von beiden Enzymen erzeugten kompatiblen Einzelstrang-Enden. Auf diese Weise wird das Apramycin-Resistenzgens eliminiert (s. 10). Hybridplasmide zur Generierung von Deletionsmutanten werden ebenfalls durch PEG-induzierte Protoplastentransformation in den S. albus Stamm CB3919 übertragen. Durch Selektion auf Thiostrepton-haltigem Medium können Klone selektiert werden, bei denen es zu einer Integration des pDH5-Hybridplasmids über den Upstream- oder Downstream-Bereich gekommen ist.
  • Um nun aus der entsprechenden Plasmid-Integrationsmutante eine in frame-Deletionsmutante zu erzeugen, muss das integrierte Plasmid über ein 2. cross-over derart aus dem Chromosom desintgrieren, dass das zu inaktivierende Zielgen gegen die in frame deletierte Genkopie ausgetauscht wird (s. 10). Bei dieser über homologe Rekombination vermittelten Desintegration besteht allerdings auch die Möglichkeit, dass das integrierte Hybridplasmid über das Fragment rekombiniert, über das es ursprünglich integrierte. Ein solches Ereignis hätte die unerwünschte Widerherstellung des Wildtyps zur Folge.
  • Untersuchungen haben gezeigt, dass ein solches Desintegrationsereignis durch Stressfaktoren wie Hitze und Ultraschall forciert werden kann. Aus diesem Grund wurden die Integrationsmutanten einem Stressprotokoll unterzogen, das im Detail in Puk et al. 2002 beschrieben ist (Chem. & Biol. 9, 225–235). Die nach dem Stressprotokoll unter nichtselektiven Bedingungen erhaltenen Klone werden parallel auf HA-Agar (20 g Agar, 4 g Bacto Yeast Extrakt, 10 g Malz Extrakt, 4 g Glucose, pH 7,3; nach dem Autoklavieren 1 ml 1 M CaCl2 zugeben) und HA-Agar mit 25 μg/ml Thiostrepton gepickt und 3–4 d bei 28°C inkubiert. Klone, die die Thiostrepton-Resistenz verloren haben, sind entweder gewünschte in frame Deletionsmutanten oder zum Wildtyp revertiert. Mit Hilfe eines PCR-Experimentes, das so konzipiert ist, eine potentielle Deletion des Zielgens nachzuweisen, kann zwischen Wildtyp und Deletionsmutante unterschieden werden.
  • Im Folgenden wird die Herstellung von Apramycin-Insertionsmutanten und in frame Deletionsmutanten in den Lysolipin-Biosynthesegene llpH, llpMI, llpMIII, llpMVI, llpOI, llpOIV, llpOVI, und llpZIII detailliert beschrieben:
    Zur Generierung der Mutanten muss zunächst wie in 9 dargestellt das Apramycin-Resistenzgen amplifiziert werden. Dazu wird das aac(3)IV-Gen als 1325 bp DNA-Fragment mit den Primern aac(3)IV-up und aac(3)IV-down amplifiziert.
    aac(3)IV-up(SpeI):
    5'-AAAACTAGTCTGCTCGCGCAGGCTGGGTG-3'
    aac(3)IV-down(NheI):
    5'-AAAGCTAGCGGCTGTGAGCAATTATGTGC-3'
  • Primer aac(3)IV-up weist eine SpeI-Schnittstelle und Primer aac(3)IV-down eine NheI-Schnittstelle am 5'-Ende auf (fett markiert). Als Template für die PCR-Reaktion dient das Plasmid pHP45Ωaac (Blondelet-Rouault et al., 1997, 190, 315–317). Zur Amplifikation wird der ProofStart DNA-Polymerase Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) nach Beschreibung des Herstellers eingesetzt. Folgendes PCR-Programm ist für die Amplifikation des 1325 bp großen PCR-Fragments einzusetzen:
    Programm: Schritt 1: 5 min 95°C,
    Schritt 2: 1 min 94°C
    Schritt 3: 1 min 50–70°C
    Schritt 4: 1,5 min 72°C
    Schritt 5: 5 min 72°C
    Schritte 2 bis 4 wurden 35 mal wiederholt
  • Das PCR-Fragment wird zunächst in einem Vektor mit blunt end Schnittstelle, wie z.B. pBluescript II KS (-) nach EcoRV-Spaltung, zwischen kloniert und kann anschließend in großer Konzentration aus diesem Vektor als SpeI/NheI Fragment isoliert werden.
  • Die zur Erzeugung der Hybridplasmide notwendigen „Upstream" und „Downstream" Bereiche (s. 9) der zu inaktivierenden Biosynthesegene llpH, llpMI, llpMII1, llpMVI, llpOI, llpOIV, llpOVI, und llpZIII wurden wie folgt amplifiziert und anschließend kloniert:
    Für den Austausch durch homologe Rekombination werden für jedes zu inaktivierende Gen ein „Upstream"- und ein „Downstream"-Bereich von ca. 2000 bp (ca. 1000 bp im Falle von llpMVI) durch PCR amplifiziert.
  • Für die Erzeugung von Mutanten in den Genen llpMIII, llpOI, llpOIV weist der jeweilige „A"-Primer für den „Upstream"-Bereich eine EcoRI Schnittstelle, die kompatibel zur multiple cloning site (MCS) von pDH5 ist, auf und der „B"-Primer für den „Upstream"-Bereich des Zielgens eine SpeI-Schnittstelle. Der jeweilige „A"-Primer für den „Downstream"-Bereich des Zielgens weist eine NheI-Schnittstelle auf und der jeweilige „B"-Primer für den „Downstream"-Bereich weist eine zur MCS von pDHS kompatible HindIII Schnittstelle auf.
  • Für die Erzeugung von Mutanten in den Genen llpH, llpMI, llpMVI, llpMVI, und llpZIII weist der jeweilige „A"-Primer für den „Upstream"-Bereich eine EcoRI Schnittstelle, die kompatibel zur MCS von pDH5 ist, auf und der „B"-Primer für den „Upstream"-Bereich des Zielgens eine NheI-Schnittstelle. Der jeweilige „A"-Primer für den „Downstream"-Bereich des Zielgens weist eine SpeI-Schnittstelle auf und der jeweilige „B"-Primer für den „Downstream"-Bereich eine zur MCS von pDH5 kompatible HindIII Schnittstelle auf (führt in diesen Genen nach Ligation mit dem amplifizierten aac(3)IV-Gen zu einer zum Zielgen entgegengesetzten Orientierung der Apramycin-Resistenzgenkassette).
  • Alle Primersequenzen, die zur Amplifikation des „Upstream"- bzw. „Downstream"-Bereichs der Zielgene eingesetzt werden können, sind in 11 aufgelistet. Als Template in den PCR-Reaktionen dient jeweils DNA des Lysolipin-Biosynthesegencluster-tragenden Cosmids 28-4H04.
  • Zur Amplifikation wird der ProofStart DNA-Polymerase Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) nach Beschreibung des Herstellers eingesetzt. Folgendes PCR-Programm wird für die Amplifikation der 1000 bis 2000 bp großen PCR-Fragmente eingesetzt:
    Programm: Schritt 1: 5 min 95°C,
    Schritt 2: 1 min 94°C
    Schritt 3: 1 min 50–70°C
    Schritt 4: 2,5 min 72°C
    Schritt 5: 5 min 72°C
    Schritte 2 bis 4 wurden 35 mal wiederholt
  • Alle PCR-Fragmente werden ebenfalls in einem Vektor mit blunt end Schnittstelle, wie z.B. pBluescript II KS (-) nach EcoRV-Spaltung, zwischen kloniert, um diese anschließend in großer Konzentration aus diesem Vektor nach Spaltung mit den jeweils flankierenden Restriktionsschnittstellen (s. 11) zu isolieren.
  • Die jeweiligen PCR-Fragmente (Downstream und Upstream-Bereich des Zielgens und das Apramycin-Resistenzgen) wurden anschließend in den Vektor pDHS kloniert (s. 9). Für jedes zu inaktivierende Zielgen entsteht somit ein pDH5-Derivat, das zur Herstellung von Apramycin Insertionsmutanten geeignet ist. Durch SpeI/NheI Spaltung kann darüber hinaus aus allen pDHS Hybridplamiden die Apramycin-Resistentkassette entfernt und das jeweilige Hybridplasmid religiert werden. So entsteht für jedes zu inaktivierende Zielgen ein weiteres pDH5-Hybridplamid, das zur Generierung von in frame Deletionsmutanten eingesetzt werden kann.
  • Nach Transfer der jeweiligen Apramycin Insertions- und Deletions-Hybridplasmide und Selektion der entsprechenden Klone können, wie oben beschrieben, Apramycin-Insertionsmutanten und in frame Deletionsmutanten eines jeden zu inaktivierende Zielgens erzeugt werden. Alle Mutanten werden durch PCR-Experimente verifiziert.
  • Folgende Mutanten wurden durch Geninaktivierung erzeugt (die Bezeichnung _A symbolisiert eine Apramycin-Insertion im entsprechenden Zielgen, während _D eine in frame Deletion im Zielgen markiert):
    Gen: Mutante:
    llpOI CB3919LlpOI_A
    llpOIV CB3919LlpOIV_D
    llpOVI CB3919LlpOVI_A
    llpMI CB3919LlpMI_A
    llpMIII CB3919LlpMIII_A
    llpMVI CB3919LlpMVI_A
    llpZIII CB3919LlpZIII_D
  • Zusätzlich konnte folgende Doppelmutante erzeugt werden:
    Gen: Mutante:
    llpOIV/llpH CB3919LlpOIV_D/LlpH_A
  • Diese Mutanten wurden wie unter 3. beschrieben durch LC-DAD-MS Analytik analysiert und evtl. neu gebildete Lysolipin-Derivate aufgereinigt.
  • 2.3 Chemische Modifikation von Lysolipin
  • Durch den Lysolipin-Geninaktivierungsansatz (2.2) wurden in erster Linie Substanzen generiert, die im Vergleich zum Lysolipin Idurch den Verlust bestimmter dekorativer Gruppen gekennzeichnet sind. Durch chemische Modifikation wurden darüber hinaus Lysolipin-Derivate erzeugt werden, die an den der Modifikation zugänglichen Gruppen neue Substituenten aufweisen.
  • In einem ersten Ansatz wurden Lysolipin I Derivate nach der Einführung selektiver Schutzgruppen wie folgt dargestellt: Bis-TBS-Lysolipin (2)
    Figure 00440001
  • 41 mg Lysolipin I (1) (69 μmol) 40 mg Imidazol, 78 mg DMAP und 120 mg TBSCI wurden in 2 mL trockenem DMF 24 h bei RT gerührt. Es wurde mit Ether/Pentan 1:1 wässrig aufgearbeitet und über MgSO4 getrocknet.
  • Chromatographie erfolgte an Kieselgel mit Ether/Pentan 1:2. Ansatz lieferte als 2. Fraktion 56 mg (68 μmol; 98%) die Titelverbindung (2). Mono-TBS-Lysolipin (3)
    Figure 00440002
  • 47 mg Bis-TBS-Lysolipin (2) wurden in 2.4 ml DMSO gelöst. Nach Zugabe von 0.6 ml Wasser wurde der Ansatz auf 80°C erwärmt. Die klare Lösung wurde nicht gerührt. Das Produkt kristallisierte bereits während der Reaktion. Nach 2 h ließ man den Ansatz auf RT abkühlen und filtrierte die gelben Nadeln. Waschen mit Wasser und trocknen lieferte 31 mg (3) (77%). Bisacetyl-mono-TBS-Lysolipin (4)
    Figure 00450001
  • 20 mg (3) wurden in 1 ml trockenem THF gelöst. Nach Zugabe von 1 ml NEt3, 0.5 ml Acetanhydrid und 20 mg DMAP wurde der Ansatz 48 h bei RT gerührt.
  • Wässrige Aufarbeitung mit Ether lieferte nach Chromatographie an Kieselgel mit Ether 14 mg (4) (17.6 μmol; 63%). Bisacetyl-Lysolipin (5)
    Figure 00450002
  • 14 mg (4) (17.6 μmol) wurden in 10 ml trockenem THF bei –78°C vorgelegt. 23 μL einer 1 M TBAF-Lösung in trockenem THF wurden zugetropft. Der Ansatz wurde auf 0°C aufgetaut (ca. 1 h). Wässrige Aufarbeitung mit Ether lieferte nach Chromatographie an Kieselgel mit Ethylacetat 10 mg (5) (14.7 μmol; 83%). Die Substanz (5) wurde als CBS53 bezeichnet und die Struktur wie unter 3. beschrieben bestätigt.
  • Diallyl-mono-TBS-Lysolipin (6)
    Figure 00460001
  • 9.6 mg (3) (13.5 μmol), 14 mg Kaliumcarbonat und 30 μL Allylbromid wurden in 1 ml trockenem DMF bei RT unter Stickstoff intensiv gerührt. Nach 6 h wurden weitere 50 μL Allylbromid zugegeben. Der Ansatz wurde noch 16 h gerührt und wässrig mit Ether/Pentan 1:1 aufgearbeitet. Chromatographie mit Ether an Kieselgel lieferte 10 mg (12.6 μmol; 88%) (6).
  • Diallyl-Lysolipin (7)
    Figure 00460002
  • 10 mg (12.6 μmol) (6) wurden bei –78°C in 5 mL trockenem THF vorgelegt. 16 μl einer 1M-TBAF-Lösung in trockenem THF wurden zugetropft und langsam auf RT auftauen lassen (ca. 1 h). Wässrige Aufarbeitung mit Ether lieferte nach Chromatographie an Kieselgel mit Ethylacetat 5 mg (7) (7.4 μmol; 59%) als 2. Fraktion. Die Substanz (7) wurde als CBS64 bezeichnet und die Struktur wie unter 3. beschrieben bestätigt.
  • Bisacetyl-monoallyl-Lysolipin (8)
    Figure 00470001
  • 9 mg (5) (13 μmol) wurden mit 0.1 ml Allylbromid, 0.1 g Silber-I-oxid und 10 mg MgSO4 14 Tage in 1 mL trockenem Ether unter Lichtausschluß gerührt. Der Ansatz wurde filtriert. Der feste Rückstand wurde 3 × mit Dichlormethan/Methanol 10:1 gewaschen. Die vereinigten organischen Phasen wurden eingedampft und mit Etylacetat/Hexan 2:1 an Kieselgel chromatographiert. Man erhielt 8 mg (11 μmol; 85%) (8).
  • Monopropyl-Lysolipin (9)
    Figure 00470002
  • 8 mg (11 μmol) (8) wurden in 0.2 ml Dichlormethan gelöst und zu 0.3 ml Methanol und 0.1 ml Hydrazinhydrat gegeben. Es wurde 2 h bei RT gerührt und ohne Wärmezufuhr zur Trockne evaporiert. Der Rückstand wurde mit Dichlormethan/Methanol 10:1 an Kieselgel chromatographiert. Man erhielt 4 mg (6.3 μmol; 57%) (9). Die Substanz (9) wurde als CBS63 bezeichnet und die Struktur wie unter 3. beschrieben bestätigt.
  • Bispentenoyl-mono-TBS-Lysolipin (10)
    Figure 00480001
  • 10 mg (3) (14 μmol) wurden in 1 ml trockenem THF gelöst. Nach Zugabe von 0.28 ml (2 mmol; 202 mg) Triethylamin wurde der Ansatz auf –5°C abgekühlt. 50 μL Pentenoylchlorid in 0.5 ml trockenem THF wurden langsam zugetropft. Der Ansatz wurde 2 h bei RT gerührt und wieder auf –5°C abgekühlt. Es wurden weitere 50 μL Pentenoylchlorid in 0.5 ml THF zugetropft. Nach einer 2 h Inkubation bei RT und wurde der Ansatz wässrig aufgearbeitet.
  • Chromatographie an Kieselgel mit Ether/Pentan 2:1 lieferte 6.9 mg (7.9 μmol; 56%) (10).
  • Monopentenoyl-Lysolipin (11)
    Figure 00480002
  • 6.9 mg (7.9 μmol) (10) wurden in 6 mL trockenem THF bei –78°C vorgelegt. 10μL einer 1M TBAF-Lösung in trockenem THF wurden langsam zugetropft. Der Ansatz wurde innerhalb 1 h auf 0°C aufgetaut. Nach wässriger Aufarbeitung wurde mit Dichlormethan/Ether 4:1 an Kieselgel chromatographiert. Man erhielt 2.6 mg (3.8 μmol; 48%) (11). Die Substanz (11) wurde als CBS56 bezeichnet und die Struktur, wie unter 3. beschrieben, bestätigt.
  • In einem weiteren Ansatz wurde Lysolipin I direkt ohne Schutzgruppenmodifikation wie folgt derivatisiert: 11-Monoallyl-Lysolipin (12)
    Figure 00490001
  • 15 mg Lysolipin I (1) wurden mit 10 Äquivalenten Allylbromid und 10 Äquivalenten K2CO3 in trockenem DMF für 20 h bei RT gerührt. Nach wässriger Aufarbeitung wurde der Ansatz mittels präparativer LC (Bed. s.u.) aufgearbeitet. Aus dem Produktgemisch konnten ca. 3 mg 11-Monoallyl-Lysolipin (12) aufgereinigt werden. Die Substanz (12) wurde als CBS90 bezeichnet und die Struktur, wie unter 3. beschrieben, bestätigt.
  • 11,19-Bismethoxy-23-Acetoxy-Lysolipin (13)
    Figure 00490002
  • 15 mg Lysolipin I (1) wurden mit 10 Äquivalenten Methyljodid und 10 Äquivalenten KzCO3 in trockenem DMF bei RT gerührt. Nach wässriger Aufarbeitung wurde der Ansatz mittels präparativer LC (Bed. s. 2.) aufgearbeitet. Aus dem Produktgemisch konnten ca. 4 mg 11,19-Bismethoxy-23Acetoxy-Lysolipin (13) aufgereinigt werden. Die Substanz (13) wurde als CBS76 bezeichnet und die Struktur, wie unter 3. beschrieben, bestätigt.
  • Zusätzlich wurde die nach Geninaktivierung von llpOI in der Mutante CB3919LlpOI_A generierte Substanz CBS40 zur chemischen Derivatisierung (Allylierung) wie folgt eingesetzt: 11,25-Diallyl-CBS40 (15)
    Figure 00500001
  • 20 mg CBS40 (14) wurden mit 10 Äquivalenten Allylbromid und 5 Äquivalenten K2CO3 in trockenem DMF 2 Tage bei RT gerührt. DMF wurde im Hochvakuum abdestilliert, der Rückstand in Wasser aufgenommen und mit Ether extrahiert. Die weitere Aufreinigung erfolgte mit Hilfe von Säulenchromatographie und mittels präparativer HPLC (Bed. s. 2.). Aus dem Produktgemisch konnten 3,7 mg 11, 25-Diallyl-CBS40 (15) aufgereinigt werden. Die Substanz (15) wurde als CBS89 bezeichnet und die Struktur, wie unter 3. beschrieben, bestätigt.
  • Beispiel 3: Identifizierung und Strukturaufklärung neuer Derivate
  • Zur Identifizierung neuer Substanzen wurden die unter 2.1. beschriebenen gezielten Fermentationsansätze bzw. die Fermentationsüberstände der unter 2.2 beschriebenen Mutanten einer LC-DAD-MS-Analyse unterzogen.
  • Die Anzucht der Kulturen erfolgte im analytischen Maßstab wie folgt. Vorkultur: 50 ml TSB-Medium [Tryptic Soy Broth, Beckton Dickinson] wurden mit den zu analysierenden Rekombinanten/Mutanten angeimpft und für 48 h bei 28°C und 160 rpm inkubiert; Hauptkultur: 100 ml E1-Medium [20 g Glucose, 20 g lösliche Stärke, 5 g Hefeextrakt, 2,5 g Pharmamedia (Traders Protein, Southern Cotton Oil Company, Memphis, USA), 1 g MgSO4 × 7 H2O, 1,3 g KH2PO4 × 3H2O, 3 g NaCl, 3 g CaCO3 mit Leitungswasser auf 1 l auffüllen, pH 7,5] wurden mit 1 ml der Vorkultur beimpft und für 168 h bei 28°C und 160 rpm inkubiert. In den gezielten Fermentationen wurde 5 g/l NaBr zum Vorkulturmedium bzw. 5 g/l NaBr anstelle von NaCl ins Hauptkulturmedium gegeben. Je nach Mutante wurden zur Selektion während der Anzucht folgende Antibiotika zugegeben: 25 μg/ml Apramycin zu CB3818 (S. albus plus Lysolipingenclustercosmid 28-4H04) und allen CB3919 Apramycin-Insertionsmutanten und zur Doppelmutante; 50 μg/ml Kanamycin zur CB3919-Deletionsmutante.
  • Die Extraktion und die LC(DAD)-MS-Analyse der Überstände wurde wie vorstehend beschrieben durchgeführt.
  • Die LC(DAD)-MS-Analyse der oben beschriebenen Rekombinanten und Mutanten ergab, dass diese im Gegensatz zur Lysolipin-produzierenden Kontrolle (CB3818, 2-6) folgende neuartige Substanzen synthetisieren:
    Rekombinante/Mutante Neue Substanzen
    CB3818 (S. albus + 28-4H04) + NaBr CBS44, CBS49
    CB3919LlpOI_A CBS40
    CB3919LlpOI_A + NaBr CBS48
    CB3919LlpOIV_D CBS62, CBS68
    CB3919LlpOVI_A CBS61, CBS84
    CB3919LlpMI_A CBS60
    CB3919LlpMIII_A CBS68, CBS73
    CB3919LlpMVI_A CBS70, CBS72
    CB3919LlpZIII_D CBS66
    CB3919LlpOIV_D/LIpH_A CBS86, CBS87
  • Um die Struktur der neuen Substanzen aufzuklären, wurden die entsprechenden Mutanten/Rekombinanten im 10–20 l Maßstab (jeweils in 250 ml Glaskolben mit 3 Schikanen und Cellulose Stopfen mit je 100 ml Kulturlösung) angezogen:
  • Vorkulturmedium: TSB (s.o.), 28°C, 160 rpm, 72h
    Hauptkulturmedium: E1 (s.o.), 28°C, 160 rpm, 120h–168h
  • Nach der Inkubation wurde das Kulturmedium bei 4000 rpm (15°C) abzentrifugiert. Der klare Überstand wurde mit 1 N HCl auf pH 4 eingestellt. Der dabei ausfallende flockige Niederschlag enthält die Hauptmenge an Lysolipinderivaten und wurde bei 4500 rpm, 15°C abzentrifugiert, mit Ethylacetat versetzt und im Ultraschallbad für 15 min belassen. Anschließend wurde über einen Büchnertrichter filtriert. Dieser Vorgang wurde so lange wiederholt bis das Ethylacetat fast farblos blieb. Das klare Filtrat wurde ebenfalls mit Ethylacetat ausgeschüttelt bis die organische Phase fast farblos blieb.
  • Die vereinigten organischen Phasen wurden bis zur Trockne eingeengt.
  • Die Aufreinigung des Rohextrakts der Lysolipin-Derivate erfolgte in folgenden 3 Schritten:
    • 1 Schritt: Rohprodukt wurde an einer Kieselgelsäule (400 × 50 mm, Bettvolumen: 800 ml, Kieselgel 60; 0,063–0,200 mm) mit CH2Cl2/MeOH 9:1 chomatographiert.
    • 2 Schritt: Sephadex LH20 (MeOH oder MeOH + 0,01% TFA)
    • 3 Schritt: Semipräparative HPLC (XTerra PrepMSC18, 10 μm, 19 × 300mm) Laufmittel: Acetonitril/Wasser (mit TFA 0%–0.05%). Die Gradienten wurden so eingestellt, dass eine gute Trennung der einzelnen Derivate möglich war.
  • Je nach Rekombinante/Mutante konnten zwischen 0.5 mg und 30 mg der einzelnen Lysolipin-Derivate einer Reinheit > 90% aufgereinigt werden. Mittels NMR-Analyse wurde die Struktur der neuen Derivate aufgeklärt und auch die Struktur der chemischen Derivate aus 1.3 bestätigt:
    Die Strukturaufklärung der einzelnen Lysolipinderivate wurde mit Hilfe hochaufgelöster 1D- und 2D-NMR-Spektroskopie (1H, 13C, H,H-COSY (Long Range-Correlation Spectroscopy), HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence), HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity)) in Kombination mit UV, ESI- und HR-Massenspektoskopie durchgeführt. Alle Spektren wurden mit XWIN-NMR Software Bruker prozessiert. Chemische Verschiebungen wurden in δ-Werten (ppm) relativ zum jeweiligen Lösungsmittel als internen Standard angegeben. Kopplungskonstanten (J) in [Hz].
    • Verwendete Abkürzungen: s = Singulett, d = Dublett, t = Triplett, q = Quartett, m = Multiplett, br = breit, ESI = Electron Impact Ionization, HRMS = High Resolution Mass Spectrometry.
    • Gerätespezifikationen: Bruker Avance 600 (600 MHz) und 400 MHz Spektrometer.
  • Die NMR-Daten und die daraus für die einzelnen neuartigen Lysolipin-Derivate resultierenden Strukturen sind in folgenden Abbildungen zusammengefasst:
    Derivate aus der „biologischen" Modifikation:
    CBS40 – Beispiel 5
    CBS44 – Beispiel 6
    CBS48 – Beispiel 7
    CBS49 – Beispiel 8
    CBS60 – Beispiel 9
    CBS61 – Beispiel 10
    CBS62 – Beispiel 11
    CBS66 – Beispiel 12
    CBS68 – Beispiel 13
    CBS70 – Beispiel 14
    CBS72 – Beispiel 15
    CBS73 – Beispiel 16
    CBS84 – Beispiel 17
    CBS86 – Beispiel 18
    CBS87 – Beispiel 19
  • Derivate der „chemischen" Derivatisierung (s. 2.3):
    CBS53 – Beispiel 20
    CBS56 – Beispiel 21
    CBS63 – Beispiel 22
    CBS64 – Beispiel 23
    CBS76 – Beispiel 24
    CBS89 – Beispiel 25
    CBS90 – Beispiel 26
  • Die Struktur der von den Mutanten generierten Lysolipin-Derivate legt nahe, dass die Produkte der inaktivierten Zielgene für folgende Funktionen verantwortlich sind (Zuordnung s. 1):
    LlpOI: Oxygenierung am A-Ring
    LlpOIV: Oxygenierung an C15
    LlpOVI: Oxygenierung an C16
    LlpMI: Methyltransfer am C24 Sauerstoff
    LlpMIII: Methyltransfer am C6 Sauerstoff
    LlpMVI: Methyltransfer am C16 Sauerstoff
    LlpH: Halogenase am C1
  • Beispiel 4: Biologische Charakterisierung neuer Derivate
  • Alle neuartigen Lysolipin-Derivate wurden einer biologischen Charakterisierung unterzogen. Dabei wurde zum einen die in vitro efficacy (Minimale Hemmkonzentration = MIC) gegen 5 Testkeime und zum anderen die in vitro Cytotoxizität gegen 3 Zelllinien im Vergleich zur Ausgangssubstanz Lysolipin I (CBS42) bestimmt.
  • In vitro efficacy:
  • Von einigen Substanzen wurde der MIC Wert mit Hilfe des Makrodilutionsverfahren (Testvolumen 1 ml) bestimmt mit den folgenden Ergebnissen.
    Figure 00550001
    • nd = nicht bestimmt
  • Folgende Medien wurden für die Testkeime eingesetzt:
    E. faecalis VRE ATCC51575: TSB plus 7% Fetales Rinderserum
    S. aureus Me/GM/TC ATCC33592: Müller Hinton Broth (3,7 mg Ca++/l)
    S. epidermidis ATCC12228: Müller Hinton Broth (3,7 mg Ca++/l)
    S. pneumoniae EM & AM: TSB plus 7% Fetales Rinderserum
    E. coli ATCC10536: Müller Hinton Broth (3,7 mg Ca++/l)
  • Die Inkubation erfolgte für 20 h bei 37°. Die MIC-Werte wurden durch Trübungsmessung bestimmt.
  • Weitere Lysolipin-Derivate wurden mit Hilfe des "Broth-Mikrodilutionsverfahrens" nach den Richtlinien der CLSI (ehemals NCCLS) getestet (National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2003. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; approved standard – 6th ed. Document M7-A6. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA, USA) mit den folgenden Ergebnissen.
  • Figure 00560001
  • In vitro Cytotoxizität:
  • Die Cytotoxizität der neuen Lysolipinderivate wurde in vitro durch die Bestimmung der IC50 Werte gegen definierte Zelllinien im sogenannten Resazurin-Test (Zugabe eines Vitalitätsfarbstoffes) untersucht. Folgende Zellinien wurden eingesetzt:
    • • humane Leberzelllinie Huh-7
    • • Mauszellinie J774a.1
    • • humane Lymphoblastenzelllinie THP-1
  • Die Ergebnisse sind folgend dargestellt.
  • Figure 00570001
  • Der eigentliche Test wurde wie folgt durchgeführt:
  • • Vorbereitung der Zellen
  • Definierte Kryokonserven der Testzellen wurden aufgetaut und die Zellen unter den für sie optimalen Bedingungen expandiert. Adherente Zellen wurden für das Passagieren trypsiniert. Nach Erreichen einer ausreichenden Zellzahl wurden die Zellen mit 100 μl Medium je Well in 96 well Platten eingesäht. Die Vitalität der Zellen war > 95%. Die Zellen wurden im Anschluss für 24 Stunden bei 37°C und 5% CO2 in feuchter Atmosphäre inkubiert.
  • • Inkubation mit den Testsubstanzen
  • 100 μl jeder Verdünnungsstufe der Substanzen wurde zu den Zellen in die Wells gegeben. Hierbei wurden je Stufe drei Wells verwendet. Als Lösungsmittelkontrolle wurde Medium mit der höchsten im Assay befindlichen Konzentration an DMSO verwendet. Hier wurde eine Vierfachbestimmung vorgenommen (100% Wert). Als Positivkontrolle wurde Cycloheximid in einer Konzentration von 20 μg/ml eingesetzt (0% Wert). Die Zellen wurden im Anschluß für 48 Stunden bei 37°C und 5% CO2 in feuchter Atmosphäre inkubiert.
  • • Durchführung des Resazurin-Assays
  • Resazurin wird durch die Mitochondrien lebender Zellen reduziert. Hierbei entsteht die fluoreszenzaktive Form Resofurin. Die Menge an entstandenem Resofurin kann über einen Fluoreszenzreader quantifiziert werden und steht in direktem Zusammenhang mit der Anzahl an lebenden Zellen. Zu den Zellen werden 100 μl einer 50 μM Resazurinlösung (Sigma-Aldrich) gegeben. Diese Lösung wurde zuvor angesetzt, über 0,2 μm Filter steril filtriert und aliquotiert. Die Aliquots wurden bei –20°C gelagert. Die Platten wurden im Anschluß für 4 Stunden bei 37°C und 5% CO2 in feuchter Atmosphäre inkubiert. Die Entwicklung der fluoreszierenden Verbindung kann optisch durch eine Verfärbung der Testlösung von blau nach pink verfolgt werden. Zur Auswertung wurden die Platten in einem Fluoreszenzreader (Genios, Tecan) ausgelesen. Hierfür wurde eine Anregungswellenlänge von 560 nm und ein Emissionsfilter von 590 nm gewählt. Die Daten wurden über Microsoft Excel und eine Anwenderapplikation (XFluor4, Tecan) ermittelt.
  • • Auswertung
  • Die Rohdaten wurden normalisiert. Hierbei gab die Positivkontrolle den Wert für die Wells mit den toten Zellen (0% Wert) und die Negativ-/Lösungsmittelkontrolle den 100% Wert. Die erhaltenen Mittelwerte wurden zur Berechnung des IC50 Wertes herangezogen. Die Berechnung wurde mit Hilfe des Analyseprogramms Graph Pad Prism 4.0 durchgeführt.
  • Die biologische Validierung der generierten Lysolipinderivate und ein Vergleich der zur Ausgangssubstanz Lysolipin I erzeugten strukturellen Veränderungen führen zu folgenden überraschenden Erkenntnissen:
    • • die durch biologische Modifikation erzeugten Lysolipin-Derivate sind weiterhin antibakteriell aktiv
    • • das Halogen beeinflusst die Cytotoxizität (Br anstelle von Cl => 30 fache Reduktion der Cytotoxizität gegen THP-1 bei unveränderter in vitro efficacy)
    • • die Methylendioxybrücke ist für in vitro efficacy entbehrlich
    • • Folgende Substanzen sind deutlich weniger cytotoxisch aber weiterhin antibiotisch aktiv: biologisch generiert: CBS70 [30 fach weniger cytotoxisch bei unveränderter antibiotischer Aktivität] CBS73 [700 fach weniger cytotoxisch bei moderatem Aktivitätsverlust (15 fach geringer: z.B. S. aureus MIC 0.5)] chemisch modifiziert: Lysolipinderivate CBS64 und CBS90 (Diallyl- und Monoallylderivat) zeigt starke Verringerung der Cytotoxizität (100 x) bei moderatem Aktivitätsverlust
  • Die Generierung und Validierung neuer Lysolipinderivate hat somit überraschenderweise gezeigt, dass die Cytotoxizität und die antibiotische Aktivität strukturell zu trennen sind.
  • Beispiel 5: CBS40
    • Molekulare Formel: C28H20ClNO9
    • UV/Vis (Maxima): 252 nm; 273 nm; 301 nm; 327 nm; 363 nm; 378 nm
    • ESI-MS: m/z = 550.10 [M+H], 1121.39 [2M+Na]
    • HRMS C28H21ClNO9 ber. 550.0905, gef. 550.0901
  • Figure 00600001
  • 1H-NMR (600 MHz, CDCl3), 13C-NMR (150.9 MHz, CDCl3)
    Figure 00600002
    • 1)Zuordnung vertauschbar
  • Beispiel 6: CBS44
    • Molekulare Formel: C29H25NO11
    • UV/Vis (Maxima): 237 nm; 262 nm; 320 nm; 349 nm; 363 nm; 395 nm
    • ESI-MS: m/z = 564.21 [M+H], 1149.50 [2M+Na]
    • HRMS C29H25NO11: ber. 563.1428, gef. 563.1421
  • Figure 00610001
  • 1H-NMR (600 MHz, d6-DMSO), 13C-NMR (150.9 MHz, d6-DMSO)
    Figure 00610002
  • Figure 00620001
    • 1)Signale überlappen
  • Beispiel 7: CBS48
    • Molekulare Formel: C28H21NO9
    • UV/Vis (Maxima): 254 nm; 301 nm; 325 nm; 378 nm
    • ESI-MS: m/z = 516.19 [M+H], 1053.41 [2M+Na]
    • HRMS C28H22NO9: ber. 516.1295, gef. 516.1311
  • Figure 00620002
  • 1H-NMR (600 MHz, CDCl3) 13C-NMR (150.9 MHz, CDCl3)
    Figure 00620003
  • Figure 00630001
    • 1,2)Zuordnungen vertauschbar
  • Beispiel 8: CBS49
    • Molekulare Formel: C29H24BrNO11
    • UV/Vis (Maxima): 241 nm; 256 nm; 274 nm; 304 nm; 348 nm; 397 nm;
    • ESI-MS: m/z = 642.12 [M+H], 1307.27 [2M+Na]
    • HRMS C29H25BrNO11: ber. 642.0611, gef. 642.0589
  • Figure 00630002
  • 1H-NMR (600 MHz, d6-DMSO), 13C-NMR (150.9 MHz, d6-DMSO)
    Figure 00630003
  • Figure 00640001
    • 1)Signale überlappen
    • 2)Signale kollabieren zu einem Singulett
  • Beispiel 9: CBS60
    • Molekulare Formel: C29H22ClNO9
    • UV/Vis (Maxima): 253 nm; 273 nm; 303 nm; 329 nm; 364 nm; 379 nm
    • ESI-MS: m/z = 564.09 [M+H], 1149.29 [2M+Na]
    • HRMS C29H23ClNO9: ber. 564.1061, gef. 564.1071
  • Figure 00640002
  • 1H-NMR (600 MHz, CD2Cl2), 13C-NMR (150.9 MHz, CD2Cl2)
    Figure 00640003
  • Figure 00650001
    • 1)Zuordnungen vertauschbar
  • Beispiel 10: CBS61
    • Molekulare Formel: C28H20ClNO8
    • UV/Vis (Maxima): 253 nm; 302 nm; 329 nm; 356 nm; 369 nm
    • ESI-MS: m/z = 534.10 [M+H], 1089.24 [2M+Na]
    • HRMS C28H20ClNO8: ber. 533.0877, gef. 533.0881
  • Figure 00650002
  • 1H-NMR (600 MHz, CD2Cl2), 13C-NMR (150.9 MHz, CD2Cl2)
    Figure 00650003
  • Figure 00660001
  • Beispiel 11: CBS62
    • Molekulare Formel: C29H26ClNO10
    • UV/Vis (Maxima): 245 nm; 272 nm
    • ESI-MS: m/z = 584.06 [M+H], 1189.27 [2M+Na]
    • HRMS C29H26ClNO10: ber. 583.1245, gef. 583.1271
  • Figure 00660002
  • 1H-NMR (600 MHz, d6-DMSO), 13C-NMR (150.9 MHz, d6-DMSO)
    Figure 00660003
  • Figure 00670001
  • Beispiel 12: CBS66
    • Molekulare Formel: C28H22ClNO9
    • UV/Vis (Maxima): 250 nm; 298 nm; 323 nm; 354 nm; 367 nm
    • ESI-MS: m/z = 552.06 [M+H], 1125.18 [2M+Na]
    • HRMS C28H22ClNO9: ber. 551.0983, gef. 551.0964
  • Figure 00670002
  • 1H-NMR (600 MHz, d6-DMSO), 13C-NMR (150.9 MHz, d6-DMSO)
    Figure 00680001
    • 1)Signale überlappen
  • Beispiel 13: CBS68
    • Molekulare Formel: C27H20ClNO8
    • UV/Vis (Maxima): 256 nm; 323 nm; 359 nm
    • ESI-MS: m/z = 522.08 [M+H], 1065.29 [2M+Na]
    • HRMS C27H21ClNO8: ber. 522.0956, gef. 522.0960
  • Figure 00690001
  • 1H-NMR (600 MHz, d6-DMSO) 13C-NMR (150.9 MHz, d6-DMSO)
    Figure 00690002
  • Beispiel 14: CBS70
    • Molekulare Formel: C26H18ClNO8
    • UV/Vis (Maxima): 257 nm; 323 nm; 354 nm; 366 nm
    • ESI-MS: m/z = 508.11 [M+H], 1037.24 [2M+Na]
    • HRMS C26H18ClNO8Na: ber. 530.0619, gef. 530.0618
  • Figure 00700001
  • 1H-NMR (600 MHz, d6-DMSO, 13C-NMR (150.9 MHz, d6-DMSO)
    Figure 00700002
    • 1)überlagert von Wassersignal
  • Beispiel 15: CBS72
    • Molekulare Formel: C27H20ClNO9
    • UV/Vis (Maxima): 251 nm; 299 nm; 323 nm; 353 nm; 368 nm
    • ESI-MS: m/z = 538.07 [M+H], 1097.16 [2M+Na]
    • HRMS C27H20ClNO9: ber. 537.0827, gef. 537.0821
  • Figure 00710001
  • 1H-NMR (600 MHz, d6-DMSO), 13C-NMR (150.9 MHz, d6-DMSO)
    Figure 00710002
  • Figure 00720001
  • Beispiel 16: CBS73
    • Molekulare Formel: C27H20ClNO9
    • UV/Vis (Maxima): 257 nm; 299 nm; 324 nm; 354 nm; 368 nm
    • ESI-MS: m/z = 538.12 [M+H], 1097.28 [2M+Na]
    • HRMS C27H21ClNO9: ber. 538.0905, gef. 538.0919
  • Figure 00720002
  • 1H-NMR (600 MHz, d6-DMSO), 13C-NMR (150,9 MHz, d6-DMSO)
    Figure 00720003
    Figure 00730001
    • 1)Signale überlappen
  • Beispiel 17: CBS84
    • Molekulare Formel: C27H20ClNO8
    • UV/Vis (Maxima): 251 nm; 324 nm; 352 nm; 366 nm
    • ESI-MS: m/z = 522.04 [M+H], 1065.18 [2M+Na]
    • HRMS C27H20ClNO8Na: ber. 544.0775, gef. 544.0790
  • Figure 00730002
  • 1H-NMR (600 MHz, d6-DMSO), 13C-NMR (150.9 MHz, d6-DMSO)
    Figure 00730003
  • Figure 00740001
  • Beispiel 18: CBS86
    • Molekulare Formel: C27H21NO8
    • UV/Vis (Maxima): 256 nm; 321 nm; 360 nm
    • ESI-MS: m/z = 488.11 [M+H]
    • HRMS C27H21NO8Na: ber. 510.1165, gef. 510.1155
  • Figure 00740002
  • 1H-NMR (600 MHz, d6-DMSO), 13C-NMR (150.9 MHz, d6-DMSO)
    Figure 00740003
  • Figure 00750001
    • 1,2)Zuordnungen vertauschbar
  • Beispiel 19: CBS87
    • Molekulare Formel: C28H23NO8
    • UV/Vis (Maxima): 254 nm; 320 nm; 360 nm
    • ESI-MS: m/z = 502.09 [M+H]
    • HRMS C28H23NO8Na: ber. 524.1321, gef. 524.1308
  • Figure 00750002
  • 1H-NMR (600 MHz, d6-DMSO), 13C-NMR (150.9 MHz, d6-DMSO)
    Figure 00750003
  • Figure 00760001
    • n.o. nicht beobachtet
  • Beispiel 20: CBS53
    • Molekulare Formel: C33H28ClNO13
    • UV/Vis (Maxima): 237 nm; 280 nm; 354 nm
    • ESI-MS: m/z = 640.19 [M-acetyl+H], 682.25 [M+H], 1385.50 [2M+Na]
  • Figure 00760002
  • 1H-NMR (400 MHz, CDCl3)
    Figure 00760003
  • Figure 00770001
    • 1,2,3)Zuordnungen vertauschbar
  • Beispiel 21: CBS56
    • Molekulare Formel: C34H30ClNO12
    • UV/Vis (Maxima): 267 nm; 340 nm
    • ESI-MS: m/z = 680.28 [M+H]
  • Figure 00770002
  • 1H-NMR (600 MHz, CDCl3)
    Figure 00770003
    • 1)Signale uberlappen
  • Beispiel 22: CBS63
    • Molekulare Formel: C32H30ClNO11
    • UV/Vis (Maxima): 245 nm; 273 nm; 305 nm; 349 nm; 400 nm
    • ESI-MS: m/z = 640.19 [M+H], 1301.47 [2M+Na]
  • Figure 00780001
  • 1H-NMR (400 MHz, CDCl3)
    Figure 00780002
  • Beispiel 23: CBS64
    • Molekulare Formel: C35H32ClNO11
    • UV/Vis (Maxima): 239 nm; 270 nm; 281 nm; 363 nm
    • ESI-MS: m/z = 678.10 [M+H], 1377.32 [2M+Na]
  • Figure 00790001
  • 1H-NMR (400 MHz, CDCl3)
    Figure 00790002
    • 1,2,3)Signale überlappen
    • Die Zuordnungen für die Allylreste C-11 und C-19 basieren nur auf 1H-Daten und können deshalb auch vertauscht sein
  • Beispiel 24: CBS76
    • Molekulare Formel: C33H30ClNO13
    • UV/Vis (Maxima): 268 nm; 323 nm
    • ESI-MS: m/z = 684.04 [M+H], 1389.23 [2M+Na]
  • Figure 00800001
  • 1H-NMR (600 MHz, d6-DMSO) 13C-NMR (150.9 MHz, d6-DMSO)
    Figure 00800002
    • 1)Signale überlappen
    • 2)Signale kollabieren zu einem Singulett
  • Beispiel 25: CBS89
    • Molekulare Formel: C34H28ClNO9
    • UV/Vis (Maxima): 258 nm; 310 nm; 363 nm; 382 nm
    • ESI-MS: m/z = 588.84 [M-allyl], 630.05 [M+H], 1281.15 [2M+Na]
    • HRMS C34H28ClNO9Na: ber. 652.1350, gef. 652.1354
  • Figure 00810001
  • 1H-NMR (600 MHz, d6-DMSO), 13C-NMR (150.9 MHz, d6-DMSO)
    Figure 00810002
  • Figure 00820001
    • 1)Signale überlappen
  • Beispiel 26: CBS90
    • Molekulare Formel: C32H28ClNO11
    • UV/Vis (Maxima): 243 nm; 269 nm; 344 nm
    • ESI-MS: m/z = 638.08 [M+H], 1297.31 [2M+Na]
    • HRMS C32H28ClNO11Na: ber. 660.1249, gef. 660.1240
  • Figure 00820002
  • 1H-NMR (600 MHz, d6-DMSO, 13C-NMR (150.9 MHz, d6-DMSO)
    Figure 00820003
  • Figure 00830001
    • 1)Signale überlappen
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims (12)

  1. Lysolipin Derivat gemäß Formel I
    Figure 00840001
    Formel I wobei R1 bis R11 gleich oder verschieden und unabhängig voneinander sein können: R1 = H, F, Cl, Br, oder I, R2 = H oder C1-12 Alkyl, Alkenyl und Alkinyl, linear oder verzweigt, gesättigt oder ungesättigt, C3-6 Aryl oder Heteroaryl, jeweils ggf. substituiert, R3 = N, OH, OR11, oder über O oder direkt gebundenes Pentenoyl, Allyl, oder C1-12 Acyl, ggf. substituiert, R4 = H, OH, oder OR11, R5 = H, OH, oder OR11, R6 = H, OH, oder OR11, R7 = H, C1-12 Alkyl, Alkenyl und Alkinyl, linear oder verzweigt, gesättigt oder ungesättigt, C3-6 Aryl oder Heteroaryl, Allyl, oder C1-20 Acyl, jeweils ggf. substituiert, R8 = H, OH, OR11, C1-12 Alkyl, Alkenyl und Alkinyl, linear oder verzweigt, gesättigt oder ungesättigt, C3-6 Aryl oder Heteroaryl, oder O-CO-O-R11, jeweils ggf. substituiert, R9 = OR11, C1-12 Alkyl, Alkenyl und Alkinyl, linear oder verzweigt, gesättigt oder ungesättigt, C3-6 Aryl oder Heteroaryl, jeweils ggf. substituiert, H, oder OH, R10 = H, C1-12 Alkyl, Alkenyl und Alkinyl, linear oder verzweigt, gesättigt oder ungesättigt, C3-6 Aryl oder Heteroaryl, oder Allyl, jeweils ggf. substituiert, R11 = C1-12 Alkyl, Alkenyl und Alkinyl, linear oder verzweigt, gesättigt oder ungesättigt, C3-6 Aryl oder Heteroaryl, jeweils ggf. substituiert, wobei R4 und R5 alternativ zusammen einen Ring bildend -O-CH2-O- sein können, wobei X1 und X2 durch eine Einfachbindung oder eine Doppelbindung miteinander verbunden sein können, wobei X3 ein C-Atom, ein N-Atom, oder, in Abwesenheit von R10, ein O-Atom sein kann, wobei X4 -O- oder -CO- sein kann, wobei alle freien Valenzen mit H gebunden sind, wobei jedoch H an C12 durch OH ersetzt sein kann, wobei eine OH Gruppe oder mehrere OH Gruppen unabhängig voneinander mit einer C1-16 gesättigten oder ungesättigten aliphatischen, aromatischen oder aliphatisch/aromatischen Carbonsäure, einer Sulfonsäure, oder einer Phosphorsäure, ggf. substituiert, verestert sein können, und wobei eine OH Gruppe oder mehrere OH Gruppen unabhängig voneinander mit einem C1-16 gesättigten oder ungesättigten aliphatischen, aromatischen oder aliphatisch/aromatischen ein- oder mehrwertigem Alkohol, ggf. substituiert, verethert sein können sowie Isomere, Diastereomere, Enantiomere und Salze solcher Verbindungen, wobei die folgenden Kombinationen ausgenommen sind: i) R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = OH, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 = OCH3, R7 = H, R8 = OH, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O; wobei jedoch H an C12 optional durch OH ersetzt sein kann ii) optional, R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = O-Acetyl, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 = OCH3, R7 = H, R8 = OH, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O iii) optional, R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = OH, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 = OCH3, R7 = Acetyl, R8 = OH, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O iv) optional, R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = O-Acetyl, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 = OCH3, R7 = Acetyl, R8 = OH, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O, v) R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = O-Acetyl, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 = OCH3, R7 = Acetyl, R8 = Acetyl, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O, vi) R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = O-Acetyl, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 = OCH3, R7 = H, R8 = Acetyl, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O, vii) R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = OH, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 = OCH3, R7 = H, R8 = Acetyl, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O, viii) R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = OH, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 = OCH3, R7 = H, R8 = H, R9 = OCH3, R10 = CH3, Doppelbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O, ix) R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = OH, R4 = OH, R5 = OH, R6 = OCH3, R7 = H, R8 = OH, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, sowie X3 = N, sowie X4 = O, x) R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = OH, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 = OCH3, R7 = H, R8 = 2-Phenylbutyrat, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O, xi) optional, R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = O-Acetyl, R4 und R5 = -O-CH2-O-, R6 = OCH3, R7 = Acetyl, R8 = 2-Phenylbutyrat, R9 = OCH3, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, X3 = N, sowie X4 = O, xii) optional, R1 = Cl, R2 = CH3, R3 = OH, R4 = OH, R5 = OH, R6 = OCH3, R7 = H, R8 = =O, R9 = =O, R10 = CH3, Einfachbindung zwischen X1 und X2, sowie X3 = N, sowie X4 = O.
  2. Lysolipin nach Anspruch 1, wobei R1 = H, Cl, oder Br, R2 = H oder CH3, R3 = OH, OCH3, Pentenoyl, Allyl, oder Acetyl, R4 = H, OH, oder OCH3 R5 = H, oder OH, R6 = H, OH, oder OCH3, R7 = H, CH3, Allyl, oder Acetyl, R8 = H, OH, Proypl, oder O-CO-O-CH3, R9 = OCH3, CH3, H, oder OH, R10 = H, CH3, oder Allyl, wobei R4 und R5 alternativ zusammen einen Ring bildend -O-CH2-O- sein können, wobei X1 und X2 durch eine Einfachbindung oder eine Doppelbindung miteinander verbunden sein können, wobei X3 ein C-Atom, ein N-Atom, oder, in Abwesenheit von R10, ein O-Atom sein kann, wobei X4 -O- oder -CO- sein kann, wobei alle freien Valenzen mit H gebunden sind, wobei eine OH Gruppe oder mehrere OH Gruppen unabhängig voneinander mit einer aliphatischen Carbonsäure, insbesondere Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Pentansäure, einer gesättigten oder ungesättigten Fettsäure, einer Hydroxysäure (z.B. Milchsäure), einer α-, β-, und ω-Ketocarbonsäure (z.B. Brenztraubensäure), einer Aminosäure, einer Sulfonsäure, oder einer Phosphorsäure verestert sein können.
  3. Lysolipin Derivat nach Anspruch 1 oder 2, wobei R1 = H, Cl, oder Br, R2 = H oder CH3, R3 = OH, OCH3, Pentenoyl, oder Allyl, R4 = H, oder OCH3 R5 = H, oder OH, R6 = H, OH, oder OCH3, R7 = H, CH3, oder Allyl, R8 = H, OH, Proypl, oder O-CO-O-CH3, R9 = OCH3, oder CH3, R10 = H, CH3, oder Allyl, wobei R4 und R5 alternativ zusammen einen Ring bildend -O-CH2-O- sein können, wobei X1 und X2 durch eine Einfachbindung oder eine Doppelbindung miteinander verbunden sein können, wobei X3 ein C-Atom, ein N-Atom, oder, in Abwesenheit von R10, ein O-Atom sein kann, wobei X4 -O- oder -CO- sein kann, wobei alle freien Valenzen mit H gebunden sind, wobei eine OH Gruppe oder mehrere OH Gruppen unabhängig voneinander mit einer aliphatischen Carbonsäure, insbesondere Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Pentansäure, einer gesättigten oder ungesättigten Fettsäure, einer Hydroxysäure (z.B. Milchsäure), einer α-, β-, und ω-Ketocarbonsäure (z.B. Brenztraubensäure), einer Aminosäure, einer Sulfonsäure, oder einer Phosphorsäure verestert sein können.
  4. Lysolipin Derivat gemäß einer der folgenden Formeln, optional an einer oder mehreren OH Funktionalitäten verestert oder verethert, oder Isomere, Diastereomere, Enantiomere oder Salze solcher Verbindungen:
    Figure 00890001
    Figure 00900001
    Figure 00910001
    Figure 00920001
    Figure 00930001
    Figure 00940001
    Figure 00950001
  5. Verwendung eines Lysolipin Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung.
  6. Verwendung eines Lysolipin Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Inhibierung von Bakterien, Viren oder Pilzen.
  7. Verwendung eines Lysolipin Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer bakteriellen oder viralen Infektion oder einer Pilzerkrankung.
  8. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wobei eine physiologisch wirksame Dosis eines Lysolipin Derivates nach einem der Ansprüche 1 bis 4 mit zumindest einem galenischen Hilsstoff gemischt und zu einer Darreichungsform, vorzugsweise einer oralen oder parenteralen Darreichungsform, hergerichtet wird.
  9. Verfahren zur Behandlung oder Prophylaxe einer bakteriellen oder viralen Infektion oder einer Pilzerkrankung, wobei eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend eine physiologisch wirksame Dosis eine Lysolipin Derivates nach einem der Ansprüche 1 bis 4 einer Person verabreicht wird, welche an der Infektion oder Erkrankung erkrankt ist oder zu erkranken droht.
  10. Verfahren zur Herstellung eines Lysolipin Derivates nach einem der Ansprüche 1 bis 4, mit den folgenden Verfahrensschritten: a) es wird eine gewünschte Modifikation gegenüber Lysolipin I oder Lysolipin X definiert, b) es wird eine oder mehrere der Gene gemäß Seq.-ID 47 bis 92 anhand ihrer Funktionalitätszuordung mit der Maßgabe ausgewählt, dass das Gen, dessen Mutation und/oder dessen Inhibierung, insbesondere teilweise oder totale Inhibierung, für die Synthese der Modifikation funktional ist, c) es wird eine Zelle erzeugt, welche das Gen oder die Gene gemäß Stufe b), ggf. mutiert und/oder inhibiert, enthält, wobei das Gen bzw. die Gene in funktionalem Zusammenhang des Lysolipin Biosyntheseclusters angeordnet sind, d) die Zelle wird kultiviert, e) das Lysolipin Derivat wird aus der Zelle oder dem Kulturüberstand isoliert, f) optional erfolgt eine chemisch synthetische Derivatisierung des Produktes aus der Stufe e).
  11. Verwendung eines Lysolipin Derivates nach einem der Ansprüche 1 bis 4 als Zwischenprodukt für die chemisch synthetische Herstellung von modifizierten Lysolipin Derivaten.
  12. Verwendung eines Proteins oder mehrere der Proteine gemäß der Sequenzen Seq.-ID 1 bis 46 zur enzymatisch katalytischen Derivatisierung von Lysolipin, wobei das Protein mit einem Lysolipinvorläufer oder einem Lysolipinderivat sowie mit allen für die mit dem Protein enzymatisch katalysierte Derivatisierung notwendigen Metaboliten kontaktiert wird und wobei das erhaltene Lysolipin Derivat isoliert wird.
DE102006002427A 2006-01-09 2006-01-09 Neue Lysolipin Derivate Withdrawn DE102006002427A1 (de)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102006002427A DE102006002427A1 (de) 2006-01-09 2006-01-09 Neue Lysolipin Derivate
DE112006003804T DE112006003804A5 (de) 2006-01-09 2006-12-21 Neue Lysolipin Derivate
PCT/DE2006/002324 WO2007079715A2 (de) 2006-01-09 2006-12-21 Neue lysolipin derivate

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102006002427A DE102006002427A1 (de) 2006-01-09 2006-01-09 Neue Lysolipin Derivate

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE102006002427A1 true DE102006002427A1 (de) 2007-07-12

Family

ID=38162240

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE102006002427A Withdrawn DE102006002427A1 (de) 2006-01-09 2006-01-09 Neue Lysolipin Derivate
DE112006003804T Ceased DE112006003804A5 (de) 2006-01-09 2006-12-21 Neue Lysolipin Derivate

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE112006003804T Ceased DE112006003804A5 (de) 2006-01-09 2006-12-21 Neue Lysolipin Derivate

Country Status (2)

Country Link
DE (2) DE102006002427A1 (de)
WO (1) WO2007079715A2 (de)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013193965A (ja) * 2012-03-16 2013-09-30 Sumitomo Chemical Co Ltd 化合物および高分子化合物、並びに該高分子化合物を含む有機薄膜および有機半導体素子
NO20160680A1 (en) * 2016-04-22 2017-10-23 Marbileads New antimicrobial compound, a method of producing it, pharmaceutical compositions and uses in therapy

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2621690A1 (de) * 1975-05-20 1976-12-09 Ciba Geigy Ag Neues antibiotikum und verfahren zu seiner herstellung
JPH08333232A (ja) * 1995-06-07 1996-12-17 Kao Corp 美白剤
DE19635642A1 (de) * 1996-09-03 1998-03-05 Knoell Hans Forschung Ev Neue Dihydrobenzo[a]naphthacenchinone, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung derselben

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE112005002934A5 (de) * 2004-09-24 2007-08-30 Combinature Biopharm Ag Neuer Lysolipin Biosynthesegencluster

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2621690A1 (de) * 1975-05-20 1976-12-09 Ciba Geigy Ag Neues antibiotikum und verfahren zu seiner herstellung
JPH08333232A (ja) * 1995-06-07 1996-12-17 Kao Corp 美白剤
DE19635642A1 (de) * 1996-09-03 1998-03-05 Knoell Hans Forschung Ev Neue Dihydrobenzo[a]naphthacenchinone, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung derselben

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
dto. 47/6, (1994), S. 619-630
Pat. Abstr. of Jp. & JP 08333232 A *
Pat. Abstr. of Jp., 08333232 A
The Journal of Antibiotics 47/6, (1994), S. 619-630 *
The Journal of Antibiotics 50/9, (1997), S. 791- 793 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013193965A (ja) * 2012-03-16 2013-09-30 Sumitomo Chemical Co Ltd 化合物および高分子化合物、並びに該高分子化合物を含む有機薄膜および有機半導体素子
NO20160680A1 (en) * 2016-04-22 2017-10-23 Marbileads New antimicrobial compound, a method of producing it, pharmaceutical compositions and uses in therapy
WO2017182632A1 (en) * 2016-04-22 2017-10-26 Marbileads As New antimicrobial compound
NO341815B1 (en) * 2016-04-22 2018-01-29 Marbileads New antimicrobial compound, a method of producing it, pharmaceutical compositions and uses in therapy
US10494375B2 (en) 2016-04-22 2019-12-03 Sintef Tto As Antimicrobial compound

Also Published As

Publication number Publication date
WO2007079715A3 (de) 2007-09-20
DE112006003804A5 (de) 2008-12-18
WO2007079715A2 (de) 2007-07-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100851418B1 (ko) 에포틸론 및 에포틸론 유도체의 생산을 위한 재조합 방법 및 물질
DE69934242T2 (de) Polyketid synthase enzyme und rekombinante dna konstrukte dafür, zur herstellung von mit fk-506 und fk-520 verwandten verbindungen
DE69733416T2 (de) Erythromycine und verfahren zu ihrer herstellung
DE60033965T2 (de) Rapamycin analoge
DE60114865T2 (de) Heterologe herstellung von polyketiden
DE69635489T2 (de) Rekombinante produktion von neuen polyketiden
DE60313659T2 (de) Borrelidin-derivate und ihre medizinische anwendung
DE69930510T2 (de) Polyketide und ihre herstellung
JP2001510038A (ja) 新規ポリケチドを生成する方法
KR101285695B1 (ko) 신규한 생리 활성 물질
JP4765032B2 (ja) 新規スピノシンを産生するポリケチド合成酵素
DE69930515T2 (de) Polyketide, ihre herstellung, und darin benutzte materialien
Power et al. Engineered synthesis of 7-oxo-and 15-deoxy-15-oxo-amphotericins: insights into structure-activity relationships in polyene antibiotics
Lee et al. Engineered biosynthesis of aklanonic acid analogues
ZA200106057B (en) Process for the isolation of pseudomonic acid A from pseudomonic acid complex-containing culture broth.
DE102006002427A1 (de) Neue Lysolipin Derivate
DE10109166A1 (de) Avilamycin-Derivate
DE60127948T2 (de) Verfahren zur herstellung von avermectinderivaten
WO2006032232A2 (de) Neuer lysolipin biosynthesegencluster
DE60130394T2 (de) Gene, die im Zusammenhang mit der Biosynthese von ML-236B stehen
KR20130097538A (ko) 해양 미생물 하헬라 제주엔시스의 제주엔올라이드 생합성 유전자 클러스터
Khokhlov et al. Autoregulator from Streptomyces griseus
Shafiee et al. Microbial hydroxylation of rustmicin (galbonolide A) and galbonolide B, two antifungal products produced by Micromonospora sp.
DE102004047269A1 (de) Neue Lysolipin Biosynthesegencluster
WO2015145152A1 (en) Antimicrobial agents

Legal Events

Date Code Title Description
OP8 Request for examination as to paragraph 44 patent law
8143 Lapsed due to claiming internal priority