DE69733416T2

DE69733416T2 - Erythromycine und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE69733416T2
Application number: DE69733416T
Authority: DE
Inventors: Francis Peter LEADLAY; James Staunton; Jesus Cortes; Michael Stephen Broadstairs PACEY
Original assignee: Biotica Technology Ltd; Pfizer Inc
Current assignee: Biotica Technology Ltd; Pfizer Inc
Priority date: 1996-07-05
Filing date: 1997-07-04
Publication date: 2006-04-27
Anticipated expiration: 2017-07-05
Also published as: AP9901444A0; KR20000023579A; JP2000511063A; PL331285A1; AU731654B2; EA001744B1; JP2000516450A; BR9710209A; EP2182067A2; AU3451497A; EP0910633A2; DK0909327T3; EA199900087A1; WO1998001571A3; NO990012L; DE69733416D1; CN1229438A; BG103133A; EP2182067A3; NZ333861A

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Polyketide und Verfahren und Mittel zur Herstellung dieser sowie insbesondere auf neue Erythromycine, die als antibakterielle und antiprotozoische Mittel verwendet werden können, und auf andere Anwendungen (z.B. zur Bekämpfung von Krebs und Atherosklerose, Reduktion der gastrischen Beweglichkeit etc.) bei Säugetieren, einschließlich Mensch, sowie bei Fischen und Vögeln. Diese Erfindung bezieht sich auch auf pharmazeutische Zusammensetzungen, welche die neuen Verbindungen enthalten, und auf Verfahren zur Behandlung von bakteriellen und protozoischen Infektionen bei Säugetieren, Fischen und Vögeln durch die Verabreichung der neuen Verbindungen an Säugetiere, Fische und Vögel, die eine solche benötigen.
Biosynthetische Polyketidgene oder Abschnitte dieser, die von verschiedenen biosynthetischen Polyketidgenclustern stammen können, werden manipuliert, um die Erzeugung neuer Erythromycine zu ermöglichen.
Polyketide sind eine große und strukturell unterschiedliche Klasse von Naturprodukten, die viele Verbindungen umfassen, die antiobiotische oder andere pharmakologische Merkmale besitzen, so etwa Erythromycin, Tetracycline, Rapamycin, Avermectin, Polyetherinophore und FK506. Insbesondere werden Polyketide in übermäßig großer Menge von Streptomyces und damit verwandten Actinomycet-Bakterien erzeugt. Sie werden durch die wiederholte schrittweise Kondensation von Acylthioestern in einer analogen Weise zu jener der Fettsäurebiosynthese synthetisiert. Die größere strukturelle Unterschiedlichkeit unter natürlichen Polyketiden geht auf die Wahl von (gewöhnlich) Acetat oder Propionat als "Starter-" oder "Verlängerereinheiten" zurück; und auf die unterschiedlichen Verarbeitungsgrade der β-Keto-Gruppe, die nach jeder Kondensation beobachtet wurde. Beispiele für Verarbeitungsschritte umfassen die Reduktion zu β-Hydroxyacyl-, die Reduktion gefolgt von der Dehydration zu 2-Enoyl- und die vollständige Reduktion zum gesättigten Acylthioester. Das stereochemische Ergebnis dieser Verarbeitungsschritte wird auch für jeden Zyklus der Kettenverlängerung spezifiziert. Die Biosynthese von Polyketiden wird durch eine Gruppe von kettenbildenden Enzymen, die als Polyketidsynthasen bekannt sind, ausgelöst. Zwei Klassen von Polyketidsynthasen (PKS) wurden in Actinomyceten beschrieben. Die neuen Polyketide und Verfahren, die Gegenstand dieser Erfindung sind, werden durch PKS vom Typ I synthetisiert, die durch die PKSs für die Makrolide Erythromycin, Avermectin und Rapamycin (1) dargestellt: sind und aus einem verschiedenen Satz oder "Modul" aus Enzymen für jeden Zyklus der Polyketidkettenverlängerung (2A) bestehen (Cortes, J., et al., Nature 348, 176-178 (1990); Danadio, S., et al., Science 252, 675-679 (1991); MacNeil, D.J., et al., Gene 115, 119-125 (1992); Schwecke, T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,. 7839-7843 (1995)). Anmerkung: Die Bezeichnung "natürliches Modul", wie sie hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Satz aus zusammenhängenden Domänen vom α,β-Ketoacylsynthase- ("KS")-Gen zum nächsten Acrylträgerprotein- ("ACP"-) Gen, das einen Zyklus der Polyketidkettenverlängerung bewirkt. Die Bezeichnung "kombinatorisches Modul" wird verwendet, um sich auf eine beliebige Gruppe von zusammenhängenden Domänen (und Domänenteile) zu beziehen, die sich von einem ersten Punkt in einem ersten natürlichen Modul zu einem zweiten äquivalenten Punkt in einem zweiten natürlichen Modul erstrecken. Die ersten und zweiten Punkte liegen im Allgemeinen in Kerndomänen, die in allen Modulen vorhanden sind, d.h. beide an äquivalenten Punkten der jeweiligen KS-, AT- (Acyltransferase-), ACP-Domänen oder in Linker-Regionen zwischen den Domänen.
2a zeigt die Organisation der Erythromycin erzeugenden PKS-Gene, die auch als 6-Desoxyerythronolid-B-Synthase, DEBS, bekannt sind. Drei offene Leseraster kodieren für die DEBS-Polypeptide. Die Gene sind in sechs wiederholten Einheiten organisiert, die als Module bezeichnet werden. Der erste offene Leseraster kodiert für das erste Multi-Enzym oder die erste Kassette (DEBS1), das/die aus drei Modulen besteht: das Beladungsmodul (ery-Beladung) und die zwei Verlängerungsmodule (Module 1 und 2). Das Beladungsmodul umfasst eine Acyltransferase und ein Acylträgerprotein. Dies kann im Gegensatz zur 1 von WO 93/13663 (auf die weiter unten Bezug genommen wird) stehen. Dies zeigt, dass ORF1 aus nur zwei Modu len besteht, wobei das erste tatsächlich sowohl das Beladungsmodul als auch das erste Verlängerungsmodul ist.
Es wurde gezeigt, dass die In-Rahmen-Deletion der DNA, die für einen Teil der Ketoreduktasedomäne des Moduls 5 in DEBS kodiert, zur Bildung von Erythromycin-Analoga 5,6-Didesoxy-3-mycarosyl-5-oxoerythronolid B, 5,6-Didesoxy-5-oxoerythronolid B und 5,6-Didesoxy-6,6-epoxy-5-oxoerythronolid B führt (Donadio, S., et al., Science 252, 675-679 (1991)). Ähnlich führte auch die Änderung der Reste des aktiven Orts in der Enoylreduktasedomäne des Moduls 4 in DEBS durch genetische Manipulation der entsprechenden PKS-kodierenden DNA und ihre Einführung in Saccharopolyspora erythraea zur Produktion von 6,7-Anhydroerythromycin C (Donadio, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7119-7123 (1993)).
Die internationale Patentanmeldung Nr. WO 93/13663, die hierin durch Verweis vollsfändig aufgenommen ist, beschreibt zusätzliche Typen der genetischen Manipulation der DEBS-Gene, die geänderte Polyketide erzeugen können. Es wurde aber von vielen solchen Versuchen berichtet, die sich als unproduktiv erwiesen haben (Hutchinson, C. R., und Fujii, I., Annu. Rev. Microbiol. 49, 201-238, auf Seite 231 (1995)). Es wurde die komplette DNA-Sequez der Gene von Streptomyces hygroscopicus, die für PKS vom Typ 1 kodieren, welche die Biosynthese des makrozyklischen Immunsuppressor-Palyketids Rapamycin lenken; offenbart (Schwecke, T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7839-7843 (1995)) (3). Die DNA-Sequenz ist in der EMBL/Genbank-Datenbibliothek unter der Zugriffsnummer X86780 hinterlegt.
Obwohl eine große Anzahl von therapeutisch wichtigen Polyketiden identifiziert wurde, besteht immer nach ein Bedarf dafür, neue Polyketide zu erhalten, die über verbesserte Eigenschaften oder eine vollständig neue Bioaktivität verfügen. Die durch modulare PKSs vom Typ I produzierten komplexen Polyketide sind insbesondere wertvoll, als sie Verbindungen mit bekannten Nutzbarkeiten als Anthelminthika, Insektizide, Immunsuppressoren, pilzbekämpfende und/oder antibakterielle Mittel umfassen. Aufgrund ihrer strukturellen Komplexität können solche neuen Polyketide nicht leicht durch chemische Totalsynthese oder durch chemische Modifikationen bekannter Polyketide erhalten werden. Ein Aspekt der Erfindung ergibt sich aus der Annahme der Erfinder der vorliegenden Erfindung, dass eine Genanordnung von PKS Typ I für ein Beladungsmodul kodiert, dem Verlängerungsmodule folgen. Es ist insbesondere zweckdienlich, eine hybride PKS-Genanordnung bereitzustellen, in welcher das Beladungsmodul heterolog zu den Verlängerungsmodulen und ein solches ist, das einem Polyketid mit einer geänderten Startereinheit vorangeht. Dieses Konzept ist im Stand der Technik- noch ziemlich unbekannt, da dieser die Existenz von Beladungsmodulen nicht anerkennt. WO 93/13663 bezieht sich auf das Ändern von PKS-Genen durch die Inaktivierung einer einzelnen Funktion (z.B. eines einzelnen Enzyms) oder durch die Beeinflussung eines "gesamten Moduls" durch Deletion, Insertion oder Ersetzung dieses. Die Beladungsanordnung ist in ihrem Begriff kein Modul.
Ist das Beladungsmodul ein solches, das viele verschiedene Carbonsäureeinheiten annimmt, so kann die Hybrid-Genanordnung dazu verwendet werden, viele verschiedene Polyketide zu erzeugen. So kann z.B. eine Hybrid-Genanordnung Nukleinsäure verwenden, die für ein avr-Beladungsmodul mit ery-Verlängerermodulen kodiert. Ein Beladungsmodul kann unnatürliche Säureeinheiten und Derivate davon annehmen; das avr-Beladungsmodul ist in dieser Hinsicht besonders nützlich (Dutton et al., J. Antibiot. 44, 357-365 (1991)). Zusätzlich dazu ist es möglich, die Spezifität des natürlichen Beladungsmoduls für unnatürliche Startereinheiten zu bestimmen und die relaxierte Spezifität des Beladungsmoduls zu verwenden, um neue Polyketide zu erzeugen. Somit besteht ein weiterer Aspekt dieser Erfindung in der unerwarteten Fähigkeit des ery-Beladungsmoduls, unnatürliche Carbonsäuren und Derivate davon zu integrieren, um neue Erythromycine in Eryhromycin-erzeugenden Stämmen, die nur DEBS-Gene enthalten, zu erzeugen. Natürlich kann man auch innerhalb eines Polyketidprodukts Änderungen erzielen, indem ein Verlängerungsmodul durch eines ersetzt wird, dass eine Ketideinheit in einem anderen Oxidationszustand und/oder mit einer anderen Stereochemie ergibt. Es wurde allgemein angenommen, dass die Stereochemie der Methylgruppen in der Polyketidkette durch die Acyltransferase bestimmt wird, tatsächlich ist dies aber ein Merkmal anderer Domänen der PKS und kann somit nur durch das Ersetzen dieser Domänen, einzeln oder durch Ersetzen der Module, verändert werden. Methyl und andere Substituenten können durch Ersetzen der Acyltransferase-Domäne oder Ersetzen des gesamten Moduls addiert oder entfernt werden. Als Ergebnis wird für Fachleute auf dem Gebiet der Technik ersichtlich, dass es möglich ist, die Verwendung der relaxierten Substratspezifität des Erythromycin-Beladungsmoduls mit dem Ersetzen des Verlängerungsmoduls und die Substitution des hybriden Beladungsmoduls mit dem Ersetzen des Verlängerungsmoduls als einen Mechanismus zu kombinieren, um eine große Vielfalt an neuen Erythromycinen zu erzeugen. Somit beschreibt diese Erfindung die Erzeugung von neuen Erythromycinen durch nicht-transformierte Organismen und auch durch solche Genanordnungen, Vektoren, die solche Genanordnungen enthalten, sowie Transformantenorganismen, die diese exprimieren können, um neue Erythromycine in transformierten Organismen zu produzieren. Transformantenorganismen können rekombinante Plasmide aufweisen, oder die Plasmide können sich integrieren. Ein Plasmid mit einer int-Sequenz integriert sich in einen spezifischen Bindungsort (att) eines Chromosoms eines Wirts. Transformatenorganismen können dazu fähig sein, die Ausgangsprodukte z.B. dadurch zu modifizieren, dass sie die gesamte oder einen Teil der biosynthetischen Modifikationen durchführen, die für die Produktion von Erythromycinen normal sind (wie in 2B veranschaulicht). Es können aber auch mutierte Organismen verwendet werden, sodass die normalen Wege blockiert sind, um z.B. Produkte ohne eine oder mehrere "natürliche" Hydroxygruppen oder Zuckergruppen zu erzeugen, wie dies z.B. in WO 91/16334 oder bei Weber et al., J. Bacteriol. 164, 425-433 (1985), beschrieben ist, welche hierin vollständig durch Verweis aufgenommen sind. Alternativ dazu können auch Organismen verwendet werden, in welchen einige der normalen Wege überexprimiert werden, um die potentiellen geschwindigkeitsbestimmenden Schritte bei der Herstellung des erwünschten Produkts zu vermeiden, wie dies z.B. in WO 97/06266 beschrieben ist, welche hierin vollständig durch Verweis aufgenommen ist.
Dieser Aspekt des Verfahrens bezieht sich vorrangig auf die Behandlung der PKS-Genmodule als Baublöcke, die zur Konstruktion von Enzymsystemen und somit neuen Erythromycinprodukten der erwünschten Typen verwendet werden können. Dies umfasst im Allgemeinen das Herausschneiden und Anordnen von Modulen und Gruppierungen aus zahlreichen Modulen. Logische Orte für die Erzeugung und Brechnung von intermodularen Verbindungen liegen in den Verbindungsregionen zwischen den Modulen. Es kann aber auch bevorzugt sein, tatsächlich innerhalb der Domäne (d.h. den Enzym-kodierenden Abschnitten) nahe an den Kanten davon Schnitte und Verbindungen zu machen. Die DNA ist hier zwischen allen modularen PKSs stark konserviert, und dies kann die Konstruktion von Hybriden, die transkribiert werden können, unterstützen. Es kann auch dabei helfen, den Abstand der aktiven Orte der kodierten Enzyme beizubehalten, was ebenfalls von Wichtigkeit sein kann. So wurde z.B. bei der Herstellung eines Hybridgens durch das Ersetzen des ery-Beladungsmoduls durch ein avr-Beladungsmodul das ey-Modul gemeinsam mit einer kleinen Menge der folgenden Ketosynthase- (KS-) Domäne entfernt. Der Beginn der KS-Domäne (vom aktiven Ort ausreichend beabstandet) ist stark konserviert und stellt somit eine geeignete Spleißstelle als Alternative zur Linker-Region zwischen der Beladungsdomäne und dem Beginn der KS-Domäne bereit. Das entfernte ery-Modul wurde daraufhin durch ein avr-Beladungsmodul ersetzt.
Tatsächlich kann, wenn ein Beladungsmodul ersetzt wird, es erwünscht sein, nicht nur die Beladungsmoduldomänen (im Allgemeinen Acyltransferse (AT) und Acylträgerprotein (ACP)), sondern auch die KS am Beginn des folgenden Verlängerungsmoduls zu ersetzen. Gewöhnlich hätte das entfernte Beladungsmodul einen Propionat-Starter bereitgestellt, und das Ersetzen dient dazu, einen oder mehrere verschiedene Starter bereitzustellen. Propionat kann aber in die KS des Verlängerungsmoduls von einem Propionat-Pool in der Wirtszelle zugeführt werden, was zur Verdünnung der erwünschten Produkte führt. Dies kann im Großen und Ganzen dadurch verhindert werden, dass ein verlängertes Beladungsmodul, das die gesamte oder den größten Teil der KS-Domäne umfasst, substituiert wird. (Die Spleißstelle kann in der Endregion des KS-Gens oder früh im folgenden AT-Gen oder in der Linker-Region zwischen diesen liegen.)
Werden "Module" ersetzt, so ist man dabei nicht nur auf "natürliche" Module beschränkt. So kann z.B. ein "kombinatorisches Modul", das entfernt und/oder ersetzt und/oder insertiert werden soll, sich von der entsprechenden Domäne der zwei Mo dule vom natürlichen Typ erstrecken, z.B. von der AT des einen Moduls zur AT des nächsten oder von KS zu KS. Die Spleißstellen liegen in entsprechenden konservierten Randregionen oder in Linker-Regionen. Ein kombinatorisches Modul kann auch ein "doppeltes" oder ein höheres Vielfaches sein, um 2 oder mehr Module gleichzeitig zu addieren.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung neue Erythromycine bereit, die durch Mittel der vorangegangenen Aspekte erhalten werden. Diese umfassen die Folgenden:

(i) Ein Erythromycin-Analogon (das eine Makrolid-Verbindung mit einem 14-gliedrigen Ring ist), in welchem C-13 eine andere Seitenkette als Ethyl trägt, im Allgemeinen eine unverzweigte C₃-C₆-Alkylgruppe, eine verzweigte C₃-C₈-Alkylgruppe, eine C₃-C₈-Cycloalkyl- oder -Cycloalkenylgruppe (gegebenenfalls z.B. mit einer oder mehreren Hydroxy-, C_1-4-Alkyl- oder -Alkoxygruppen oder Halogenatomen substuiert) oder einen 3-6-gliedrigen heterozyklischen Ring, der O oder S enthält und gesättigt oder vollständig oder teilweise ungesättigt ist, der gegebenenfalls (wie bei Cycloalkyl) substituiert ist, oder R₁ ist Phenyl, das gegebenenfalls mit zumindest einem Substituenten, der aus C₁-C₄-Alkyl-, C₁-C₄-Alkoxy- und C₁-C₄-Alkylthiogruppen, Halogenatomen, Trifluormethyl und Cyan ausgewählt ist, substituiert ist; oder R₁ kann eine Gruppe mit einer wie nachfolgend dargestellten Formel (a) sein:
worin X = O, S oder -CH₂- ist, a, b, c und d jeweils unabhängig voneinander 0-2 sind und a+b+c+d ≤ 5. Bevorzugte Kandidaten für den C-13-Substituenten R sind die Gruppen der Carboxylateinheiten RCOOR', die als Substrate von einem avr-Startermodul oder Rapamycin-Startervarianten verwendet werden können. Bevorzugte Substrate sind die Carbonsäuren RCOOH. Alternative Substrate, die wirksam verwendet werden können; sind Carbonsäuresalze, Carbonsäureester oder -amide.

Bevorzugte Ester sind N-Acetylcysteaminthioester, die einfach als Substrate durch das avr-Startermodul verwendet werden können, wie dies von Dutton et al. in EP 0350187 veranschaulicht ist, das hierin vollständig durch Verweis aufgenommen ist. Bevorzugte Amide sind N-Acylimidazole. Andere alternative Substrate, die verwendet werden können, sind Derivate, die oxidative Vorläufer der Carbonsäuren sind; somit wären geeignete Substrate z.B. Aminosäuren der Formel RCH(NH₂)COOH, Glykolsäuren der Formel RCOCOOH, Methylamin-Derivate der Formel RCH₂NH₂, Methanol-Derivate der Formel RCH₂OH, Aldehyde der Formel RCNO oder substituierte Alkansäuren der Formel R(CH₂)_nCOOH, worin n = 2, 4 oder 6 ist. Somit umfassen Beispiele für bevorzugte Substrate Isobutyrat (R = i-Pr) und 2-Methylbutyrat (R = 1-Methylpropyl). Andere Möglichkeiten umfassen n-Butyrat, Cyclopropylcarboxylat, Cyclobutylcarboxylat, Cyclopentylcarboxylat, Cyclohexylcarboxylat, Cycloheptanylcarboxylat, Cyclohexenylcarboxylate, Cycloheptenylcarboxylate und ring-methylierte Varianten der zyklischen Carboxylate und der zuvor erwähnten Derivate davon.
Das Erythromycin-Analogon kann dem Ausgangsprodukt einer PKS (6-Desoxyerythronolid) oder dem Produkt nach einem oder mehreren der normalen biosynthetischen Schritte entsprechen. Wie in 2b dargestellt, umfassen diese: 6-Hydroxylierung, 3-O-Glykosylierung, 5-O-Glykosylierung, 12-Hydroxylierung; und spezifische Zuckermethylierung.
Somit können die Analoga jene umfassen, die 6-Desoxyerythronolid B, Erythromycin A und den verschiedenen Zwischenprodukten und Alternativen (obwohl nicht darauf beschränkt) entsprechen, welche in 2b dargestellt sind.

(ii) Erythromycin-Analoga, die sich von der entsprechenden "natürlichen" Verbindung (2b) im Oxidationszustand einer oder mehrerer der Ketideinheiten unterscheiden (d.h. eine Auswahl aus Alternativen der Gruppe: -CO-, -CH(OH)-, =CH- und -CH₂-). Die Stereochemie jedes -CN(OH)- kann ebenfalls unabhängig ausgewählt werden.
(iii) Erythromycin-Analoga, die sich von der entsprechenden "natürlichen" Verbindung durch Abwesenheit einer "natürlichen" Methylseitenkette unterscheiden. (Dies kann durch die Verwendung einer Variante AT erreicht werden.) Normale Verlängerungsmodule verwenden entweder C₂- oder C₃-Einheiten, um unmethylierte und methylierte Ketideinheiten bereitzustellen. Es können unmethylierte Einheiten bereitgestellt werden, wenn methylierte Einheiten natürlich sind (und vice versa, in Systemen wo es natürlich unmethlyierte Einheiten gibt), und auch größere Einheiten bereitgestellt werden, z.B. C₄, um Ethyl-Substituenten bereitzustellen.
(iv) Erythromycin-Analoga, die sich von der entsprechenden "natürlichen" Verbindung in der Stereochemie des "natürlichen" Methyls unterscheiden; und/oder durch andere Ring-Substituenten als Methyl.
(v) Erythromycin-Analoga mit den Merkmalen von zwei oder mehr der Abschnitte (i) bis (iv).
(vi) Beliebige Derivate der obigen, die einer Weiterverarbeitung durch nicht-PKS-Enzyme unterzogen wurden, z.B. eine oder mehrere aus Hydroxylierung, Epoxidierung, Glykolisierung und Methylierung.

Die Verfahren für die Herstellung der neuen Erythromycine der vorliegenden Erfindung sind beschrieben. Im einfachsten Verfahren werden unnatürliche Startereinheiten (vorzugsweise; aber nicht beschränkt auf, die Carbonsäuren-Analoga der unnatürlichen Startereinheiten) in die nicht-transformierten Organismen, die Erythromycine erzeugen können, eingeführt. Ein bevorzugter Ansatz umfasst die Einführung der Startereinheiten in die Fermentierungsnährlösungen des Erythromycin erzeugenden Organismus, ein Ansatz, der für transformierte Organismen, die Erythromycine produzieren können, effektiver ist. Das Startereinheit-Analogon kann jedoch auch in alternative Präparate der Erythromycin erzeugenden Organismen eingeführt werden, so z.B. in fraktionierte oder nicht-fraktionierte Bruchzellenpräparate. Auch dieser Ansatz ist für transformierte Organismen, die Erythromycine erzeugen können, ebenfalls zweckdienlich. In einem anderen Verfahren wurden ein oder mehrere Segmente der DNA, die für einzelne Module oder Domänen innerhalb einer heterologen PKS vom Typ I (die "Spender"-PKS) kodieren, verwendet, um die DNA, die jeweils für einzelne Module oder Domänen innerhalb der DEBS-Gene eines Erythromycin erzeugenden Organismus kodiert, zu ersetzen. Beladungsmodule und Verlängerungsmodule, die aus einer natürlichen oder nicht-natürlichen PKS vom Typ I erhalten werden, sind für diese "Spender"-PKS geeignet, aber insbesondere für diesen Zweck sind die Komponenten der PKSs vom Typ I für die Biosynthese von Erythromycin, Rapamycin, Avermectin, Tetronasin, Oelandomycin, Monensin, Amphotericin und Rifamycin geeignet, von welchen die Gen- und Modulorganisation durch die Gensequenzanalyse zumindest teilweise bekannt ist. Besonders bevorzugte Beispiele für die Beladungsmodule der Spender-PKS sind jene Beladungsmodule, die eine relaxierte Spezifität zeigen, so z.B. das Beladungsmodul der Avermectin (avr) erzeugenden PKS der Streptomyces avermitilis; oder jene Beladungsmodule, die eine ungewöhnliche Spezifität besitzen, so z.B. die Beladungsmodule der Rapamycin, FK506 und Ascomycin erzeugenden PKSs, von welchen alle natürlich eine Shikimatabgeleitete Startereinheit annehmen. Unerwarteterweise wurde herausgefunden, dass sowohl die nicht-transformierten als auch die genetisch manipulierten, Erythromycin erzeugenden Organismen, wenn sie unter geeigneten Bedingungen gezüchtet werden, nicht-natürliche Erythromycine erzeugen, und es wurde herausgefunden, dass, wo dies passend ist, die Produkte dieselbe Verarbeitung wie das natürliche Erythromycin erfahren.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein "Spender"-PKS-DNA enthaltendes Plasmid in eine Wirtszelle unter Bedingungen eingeführt, worin das Plasmid in die DEBS-Gene auf dem Chromosom des Erythromycin erzeugenden Stammes mittels homologer Rekombination integriert wird, um eine hybride PKS zu erzeugen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Spender-PKS-DNA ein Segment, das für ein Beladungsmodul in einer solchen Weise kodiert, dass dieses Beladungsmodul sich mit den DEBS-Genen auf dem Chromosom verbindet. Eine solche hybride PKS erzeugt wertvolle und neue Erythromycin-Produkte, wenn sie unter geeigneten Bedingungen wie hierin beschrieben gezüchtet wird. Insbesondere wenn das Beladungsmodul der DEBS-Gene durch das Beladungsmodul der Aver mectin erzeugenden (avr) PKS ersetzt wird, enthalten die neuen Erythromycin-Produkte eine Startereinheit, die für die von der avr-PKS verwendete Startereinheiten typisch ist. Somit wurde herausgefunden, dass, wenn das Beladungsmodul der ery-PKS durch das avr-Beladungsmodul ersetzt wird, solche hybriden PKS enthaltende Saccharopolyspora erythraea 14-gliedrige Makrolide erzeugen, die Startereinheiten enthalten, die gewöhnlich von der avr-PKS verwendet werden.
Es wird nicht erwartet, dass man herausfindet, dass die 14-gliedrigen Makrolid-Polyketide, die durch solche rekombinante Zellen der S. erythraea produziert werden, Derivate von Erythromycin A umfassen, was zeigt, dass die verschiedenen Verarbeitungsschritte, die für die Transformation der Produkte der hybriden PKS in neue und therapeutisch wertvolle Erythromycin-A-Derivate erforderlich sind, korrekt durchgeführt werden. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht im unerwarteten und überraschenden Ergebnis, dass die Transkription eines beliebigen der hybriden Erythromycin-Gene spezifisch erhöht werden kann, wenn die Hybridgene unter die Kontrolle eines Promotors für PKS-Gene vom Typ II, die mit einem spezifischen Aktivatorgen für diesen Promotor verbunden sind, gestellt werden. Es ist insbesondere bemerkenswert, dass signifikant gesteigerte Mengen des neuen Erythromycins produziert werden, wenn eine genetisch manipulierte Zelle, die hybride Erythromycingene unter einer solchen Kontrolle umfasst, unter Bedingungen gezüchtet wird, die für die Produktion von Erythromycin geeignet sind. Solche spezifischen Erhöhungen der Ausbeute eines wertvollen Erythromycin-Produkts sind auch für natürliche Erythromycin-PKS erkennbar, wenn diese unter die Kontrolle eines PKS-Promotors vom Typ II und eines Aktivatorgens gestellt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die erwünschten Gene, die auf einem von SCP2* stammenden Plasmid vorhanden sind, unter die Kontrolle des bidirektionellen actI-Promotors gestellt, der vom biosynthetischen Actinorhodin-Gen-Cluster der Streptomyces coelicolor stammt, und in welchen der Vektor auch die Strukturgene enthält, die für das spezifische Aktivatorprotein Act II-orf 4 kodieren. Das rekombinante Plasmid wird in die Saccharopolyspora erythraea unter Bedingungen eingeführt, in welchen entweder die eingeführten PKS-Gene oder die PKS-Gene, die bereits im Wirtstamm vorhanden sind, unter der Kontrolle des actI-Promotors exprimiert werden.
Solche Stämme erzeugen das erwünschte Erythromycin-Produkt, und das Aktivatorgen erfordert nur die Gegenwart des spezifischen Promotors, um die Transkriptionseffizienz vom Promotor zu verbessern. Dies ist insbesondere insofern überraschend, als Aktivatoren der actII-orf4-Familie nicht zu einer anerkannten Klasse von DNA-Bindungsproteinen gehören. Somit würde eigentlich erwartet, dass zusätzliche Proteine oder andere Kontrollelemente erforderlich sind, damit die Aktivierung in einem heterologen Wirt, von dem nicht bekannt ist, dass er Actinorhodin oder ein damit verwandtes Isochromanchinon-Pigment produziert, stattfindet. Es ist ebenfalls überraschend und auch nützlich, dass die rekombinanten Stämme mehr als das zehnfache Erythromycin-Produkt produzieren können als wenn sich dieselben PKS-Gene unter der Kontrolle des natürlichen Promotors befinden, und das spezifische Erythromycin-Produkt wird auch vielmehr frühzeitig in wachsender Kultur als nur während des Übergangs von der Wachstums- zur stationären Phase erzeugt. Solche Erythromycine sind als Antibiotika und für viele andere Zwecke in der Human- und Tiermedizin einsetzbar. Somit kann, wenn die genetisch manipulierte Zelle Saccharopolyspora erythraea ist, der Aktivator und Promotor aus dem Actinorhodin-PKS-Gen-Cluster stammen und sich der actI/actII-orf4-regulierte ery-PKS-Gen-Cluster im Chromosom befindet, nach der ortspezifischen Integration eines Plasmidvektors mit niedriger Kopienzahl, die Kultivierung dieser Zellen unter geeigneten Bedingungen mehr als das 10-fache des 14-gliedrigen Makrolidprodukts ingesamt als in einem vergleichbaren Stamm nicht unter einer solchen heterologen Kontrolle erzeugen. Sind in einer solchen genetisch manipulierten Zelle der S. erythraea die PKS-Gene unter dieser heterologoen Kontrolle hybride PKS-Gene vom Typ I, deren Konstruktion hierin beschrieben ist, so kann ein mehr als Zehnfache des hybriden Polyketid-Produkts im Vergleich zu denselben PKS-Genen vom Typ I, die sich nicht unter einer solchen Kontrolle befinden, erhalten werden. Insbesondere wenn die hybriden PKS-Gene vom Typ I die ery-PKS-Gene sind, in welchen das Beladungsmodul durch das avr-Beladungsmodul ersetzt ist, so findet man einen zehnfachen Anstieg der Gesamtmenge an neuen 14-gliedrigen Makroliden, die durch genetisch manipulierte Zellen erzeugt werden, wenn diese unter geeigneten Bedingungen, wie hierin beschrieben, kultiviert werden.
Das geeignete und bevorzugte Mittel zum Züchten der nicht-transformierten und genetisch manipulierten, Erythromycin erzeugenden Zellen sowie geeignete und bevorzugte Mittel zur Isolierung, Identifizierung und praktische Nützung der neuen Erythromycine sind in den Beispielen vollständiger beschrieben.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verbindungen der Formel 1:
und auf pharmazeutisch annehmbare Salze davon, worin:
R₁ eine α-verzweigte C₃-C₈-Alkyl-, -Alkenyl-, -Alkinyl-, -Alkoxyalkyl- oder -Alkylthioalkylgruppe ist, die gegebenenfalls mit einer oder mehreren Hydroxylgruppen substituiert ist; eine C₅-C₈-Cycloalkylalkylgruppe, worin die Alkylgruppe eine α-verzweigte C₂-C₅-Alkylgruppe ist; eine C₃-C₈-Cycloalkyl- oder C₅-C₈-Cycloalkenylgruppe ist, die gegebenenfalls mit Methyl- oder einer oder mehr Hydro xyl- oder einer oder mehreren C₁-C₄-Alkylgruppen oder Halogenatomen substituiert sein kann; oder ein 3-6-gliedriger Sauerstoff oder Schwefel enthaltender heterozyklischer Ring ist, der gesättigt oder vollständig oder teilweise ungesättigt sein kann und gegebenenfalls mit einer oder mehreren C₁-C₄-Alkylgruppen oder Halogenatomen substituiert ist; oder R₁ ist Phenyl, das gegebenenfalls mit zumindest einem Substituenten substituiert ist, der aus C₁-C₄-Alkyl-, C₁-C₄-Alkoxy- und C₁-C₄-Alkylthiogruppen, Halogenatomen, Trilfuormethyl und Cyan ausgewählt ist, oder R₁ kann eine Gruppe mit einer wie nachfolgend dargestellten Formel (a) sein:
worin X O, S oder -CH₂- ist und worin a, b, c und d unabhängig voneinander 0-2 und a+b+c+d≤5 sind.
R₂ ist H oder OH, R₃-R₅ sind jeweils unabhängig voneinander H, CH₃ oder CH₂CH₃; R₆ ist H oder OH; und R₇ ist H, CH₃ oder CH₂CH₃; R₈ ist H oder Desosamin; R₉ ist H, CH₃ oder CH₂CH₃; Rio ist OH, Mycarose (R₁₃ ist H) oder Cladinose (R₁₃ ist CH₃); R₁₁ ist H; oder R₁₀ = R₁₁ = O; und R₁₂ ist H, CH₃ oder CH₂CH₃.
In der obigen Definition können die 3 oder mehr Kohlenstoffatome enthaltenden Alkylgruppen unverzweigte oder verzweigte Ketten sein. Halogen bezeichnet Fluor, Chlor, Brom oder Iod. α-verzweigt bedeutet, dass der an der C-13-Position gebundene Kohlenstoff ein sekundäres Kohlenstoffatom ist, das an zwei weitere Kohlenstoffatome gebunden ist, wobei der Rest der Alkylkette verzweigt oder unverzweigt sein kann.
Bevorzugte Verbindungen der Formel 1 sind jene, worin R₃-R₅, R₇, R₉ und R₁₂ CH₃ sind und worin R₁ iso-Propyl oder sec-Butyl, 2-Buten-2-yl, 2-Penten-2-yl oder 4-Methyl-2-penten-2-yl, gegebenenfalls substituiert mit einer oder mehreren Hydro xylgruppen, ist. Ebenso bevorzugt sind Verbindungen der Formel 1, worin R₃-R₅, R₇, R₉ und R₁₂ CH₃ sind und R₁ C₃-C₆-Cycloalkyl oder -Cycloalkenyl ist, das gegebenenfalls mit einer oder mehreren Hydroxylgruppen oder einer oder mehreren C₁-C₄-Alkylgruppen substituiert sein kann. In einer weiteren Gruppe der bevorzugten Verbindungen ist R₁ ein 5- oder 6-gliedriger heterozyklischer Ring, der Sauerstoff oder Schwefel enthält, insbesondere ein 3-Thienyl- oder 3-Furyl-Ring, der gegebenenfalls mit einer oder mehreren Hydroxylgruppen oder einer oder mehreren C₁-C₄-Alkylgruppen oder Halogenatomen substituiert sein kann. In einer anderen Gruppe der bevorzugten Verbindungen ist R₁ eine C₃-C₈-Alkylthioalkylgruppe, insbesondere eine 1-Methylthioethylgruppe.
Andere spezifische Ausführungsformen dieser Erfindung umfassen Verbindungen der Formel 2:
sowie pharmazeutisch annehmbare Salze davon, worin:
R₁ H, C₁-C₈-Alkyl, C₂-C₈-Alkenyl, C₂-C₈-Alkinyl, Alkoxyalkyl oder Alkylthioalkyl ist, das 1 bis 6 Kohlenstoffatome in jeder Alkyl- oder Alkoxygruppe enthält, worin jede der Alkyl-, Alkoxy-, Alkenyl- oder Alkinylgruppen mit einer oder mehreren Hydroxylgruppen oder mit einem oder mehreren Halogenatomen substituiert sein kann; oder ein C₃-C₈- Cycloalkyl oder C₅-C₈-Cycloalkenyl, die jeweils gegebenenfalls mit Methyl oder einer oder mehreren C₁-C₄-Alkylgruppen oder Halogenatomen substituiert sein können; oder ein 3- bis 6-gliedriger heterozyklischer Ring, der Sauerstoff oder Schwefel enthält, der gesättigt oder vollständig oder teilweise ungesättigt sein kann und gegebenenfalls mit einer oder mehreren C₁-C₄-Alkylgruppen oder Halogenatomen substituiert sein kann; oder eine Gruppe der Formel SR₁₄, worin R₁₄ C₁-C₈-Alkyl, C₂-C₈-Alkenyl, C₂-C₈-Alkinyl, C₃-C₈-Cycloalkyl, C₅-C₈-Cycloalkenyl, Phenyl oder substituiertes Phenyl ist, worin der Substituent C₁-C₄-Alkyl, C₁-C₄-Alkoxy oder Halogen ist, oder ein 3- bis 6-gliedriger, Sauerstoff oder Schwefel enthaltender heterozyklischer Ring sein, der gesättigt oder vollständig oder teilweise ungesättigt sein kann und gegebenenfalls mit einer oder mehreren C₁-C₄-Alkylgruppen oder Halogenatomen substituiert sein kann.
R₂ ist H oder OH; R₃-R₅ sind jeweils unabhängig voneinander H, CH₃ oder CH₂CH₃; R₆ ist H oder OH; und R₇ ist H, CH₃ oder CH₂CH₃; R₈ ist H oder Desosamin; R₉ ist H, CH₃ oder CH₂CH₃; R₁₀ ist OH, Mycarose (R₁₃ ist H) oder Cladinose (R₁₃ ist CH₃); R₁₁ ist H; oder R₁₀ = R₁₁ = O; und R₁₂ ist H, CH₃ oder CH₂CH₃, mit der folgenden Bedingung: wenn R₃-R₅ CH₃, R₇ CH₃, R₉ CH₃ und R₁₂ CH₃ sind, dann ist R₁ nicht H oder C₁-Alkyl.
In der obigen Definition können die drei oder mehr Kohlenstoffatome enthaltenden Alkylgruppen unverzweigte oder verzweigte Ketten sein. Halogen bezeichnet Fluor, Chlor, Brom oder Iod.
Bevorzugte Verbindungen der Formel 2 sind jene, worin R₃-R₅ CH₃ sind, R₇ CH₃ ist, R₉ CH₃ ist und R₁₂ CH₃ ist und R₁ SR₁₄ ist, worin R₁₄ Methyl oder Ethyl ist. In einer anderen Gruppe der bevorzugten Verbindungen ist R₁ Methyl, Isopropyl oder sec-Butyl, welche gegebenenfalls mit einer oder mehreren Hydroxylgruppen substituiert sein können. In einer weiteren Gruppe der bevorzugten Verbindungen ist R₁ eine verzweigte C₃-C₈-Alkylgruppe, die mit einer oder mehreren Hydroxylgruppen oder einem oder mehreren Halogenatomen substituiert ist, insbesondere 1-(Trifluormethyl)ethyl.
Die Erfindung bezieht sich auch auf eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung einer bakteriellen Infektion oder einer protozoischen Infektion bei einem Säugetier, Fisch oder Vogel, die eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung der Formel 1 oder Formel 2 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Behandlung einer bakteriellen Infektion oder einer protozoischen Infektion bei einem Säugetier, Fisch oder Vogel, welche die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung der Formel 1 oder Formel 2 oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon an das Säugetier, den Fisch oder Vogel umfasst.
Die Bezeichnung "Behandlung" umfasst, wie sie hierin verwendet wird, sofern nicht anders angegeben, die Behandlung von oder Vorbeugung gegen eine bakterielle Infektion oder eine protozoische Infektion, wie sie im Verfahren der vorliegenden Erfindung bereitgestellt ist.
Wie hierin verwendet umfassen, sofern nicht anders angegeben, die Bezeichnungen "bakterielle Infektion(en)" und "protozoische Infektion(en)" bakterielle und protozoische Infektionen, die bei Säugetieren, Fischen und Vögeln auftreten können, wie auch Leiden, die mit bakteriellen und protozoischen Infektionen in Zusammenhang stehen, die durch das Verabreichen von Antiobiotika wie den Verbindungen der vorliegenden Erfindung behandelt werden können oder gegen die dadurch vorgebeugt werden kann. Solche bakteriellen und protozoischen Infektionen und mit solchen Infektionen in Zusammenhang stehende Leiden umfassen wie folgt: Lungenentzündung, Otitis Media, Sinusitus, Bronchitis, Mandelentzündung und Mastoiditis, die mit der Infektion durch Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Staphylococcus aureus oder Peptostreptococcus spp. in Zusammenhang stehen; Pharyngitis, rheumatisches Fieber und Glomerulonephritis, die mit der Infektion durch Streptococcus pyogenes, Streptococci der Gruppe C und G, Chlostridium diphtheriae oder Actinobacillus haemolyticum in Zusammenhang stehen; Atemwegerkrankungen, die mit der Infektion durch Mycoplasma pneumoniae, Legionella pneumophila, Streptococcus pneumoniae; Haemophilus influenzae oder Chlamydia pneumoniae in Zusammenhang stehen; unkomplizierte Infektionen der Haut und der Weichteile, Abszesse und Osteomyelitis, Kindbettfieber, die mit der Infektion durch Staphylococcus aureus, Coagulase-positiven Staphylococci (d.h. S. epidermis, S. hemolyticus etc.), Streptococcus pyogenes, Streoptococcus agalactiae, Streptococcus-Gruppen C-F (Kleinkolonie-Streptococci), Viridans Streptococci, Corynebacterium minutissimum, Clostridium spp. oder Bartonella henselae in Zusammenhang stehen; unkomplizierte akute Harnröhrenentzündungen, die mit der Infektion durch Staphylococcus saprophyticus oder Enterococcus spp. in Zusammenhang stehen; Urethritis und Cervicitis; sowie sexuell übertragene Krankheiten, die mit der Infektion durch Chlamydia trachomatis, Heomophilus ducreyi, Treponema pallidum, Ureaplasma urealyticum oder Neiserria gonorrheae in Zusammenhang stehen; Toxin-Leiden, die mit der Infektion durch S. aureus (Lebensmittelvergiftung und Symptom des toxischen Schocks) oder Streptococci der Gruppen A, B und C in Zusammenhang stehen; Geschwüre, die mit der Infektion durch Heliobacter pylori in Zusammenhang stehen; systemische fiebrige Syndrome, die mit der Infektion durch Borrelia recurrentis in Zusammenhang stehen; die Lyme-Krankheit, die mit der Infektion durch Borrelia burgdorferi in Zusammenhang steht; Bindehautentzündung, Keratitis und Dacrocystitis, die mit der Infektion durch Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, S. aureus, S. pneumoniae, S. pyogenes, H. influenzae oder Listeria spp. in Zusammenhang stehen; verbreitete MAC-Krankheit (Mycobacterium avium-Komplex), die mit der Infektion durch Mycobacterium avium oder Mycobacterium intracellulare in Zusammenhang steht; Gastroenteritis, die mit der Infektion durch Campylobacter jejuni in Zusammenhang steht; Darmprotozoen, die mit der Infektion durch Cryptosporidium spp. in Zusammenhang stehen; odontogene Infektion, die mit der Infektion durch viridans Streptococci in Zusammenhang steht; hartnäckiger Husten, der mit der Infektion durch Bordetella pertussis in Zusammenhang steht; Gasbrand, der mit der Infektion durch Clostridium perfringens oder Bacteroides ssp. in Zusammenhang steht; und Atherosklerose, die mit der Infektion durch Helicobacter pylori oder Chlamydia pneumoniae in Zusammenhang steht. Bakterielle Infektionen und protozoische Infektionen sowie mit solchen Infektionen in Zusammenhang stehende Leiden, die bei Tieren behandelt werden können oder gegen die vorgebeugt werden kann, umfassen wie folgt: Atemwegserkrankungen beim Rind, die mit der Infektion durch P. haem., P. multocida, Mycoplasma bovis oder Bordetella spp. in Zusammenhang stehen; Darmerkrankungen bei der Kuh, die mit der Infektion durch E. coli oder Protozoen (z.B. Coccida, Cryptosporidia etc.) in Zusammenhang stehen; Milchkuh-Mastitis, die mit der Infektion durch Staph. aureus, Strep. uberis, Strep. agalactiae, Strep. dysgalactiae, Klebsiella spp., Corynebacterium oder Enterococcus spp. in Zusammenhang steht; Atemwegserkrankungen beim Schwein, die mit der Infektion durch A. pleuro., P. multocida oder Mycoplasma spp. in Zusammenhang stehen; Darmerkrankungen beim Schwein, die mit der Infektion durch E. coli, Lawsonia intracellularis, Salmonella oder Serpulina hyodyisinteriae in Zusammenhang stehen; Fußfäule bei der Kuh, die mit der Infektion durch Fusobacterium spp. in Zusammenhang steht; Kuh-Metritis, die mit der Infektion durch E. coli in Zusammenhang steht; haarige Warzen bei der Kuh, die mit der Infektion durch Fusobacterium necrophorum oder Bacteroides nodosus in Zusammenhang stehen; Rote-Augen-Symptom bei der Kuh, das mit der Infektion durch Moraxella bovis in Zusammenhang steht; Frühgeburt bei der Kuh, ein Symptom, das mit der Infektion durch Protozoen (z.B. Neosporium) in Zusammenhang steht; Harntraktinfektion bei Hunden und Katzen, die mit der Infektion durch E. coli in Zusammenhang steht; Infektionen der Haut und Weichteile bei Hunden und Katzen, die mit der Infektion durch Staph. epidermidis, Staph. intermedius, coagulase neg. Staph. oder P. multocida in Zusammenhang stehen; und Zahn- oder Maulentzündungen bei Hunden und Katzen, die mit der Infektion durch Alcaligenes spp., Bacteroides spp., Clostridium spp., Enterobacter spp., Eubacterium, Peptostreptococcus, Porphyromonas oder Prevotella in Zusammenhang stehen. Andere bakterielle Infektionen und protozoische Infektionen sowie mit solchen Infektionen in Zusammenhang stehende Leiden, die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt werden können oder denen vorgebeugt werden kann, sind in J. P. Sanford et al., "The Sanford Guide To Antimicrobial Therapy", 26. Auflage (Antimicrobial Therapy, Inc., 1996) zu finden. Es wird auch immer offensichtlicher, dass Verbindungen dieser Erfindung eine bedeutende Zweckdienlichkeit für die Behandlung von Krankheitszuständen (z.B. Krebs, AIDS und Atherosklerose) haben können, die gewöhnlich mit bakteriellen oder protozoischen Infektionen nicht in Zusammenhang gebracht werden.
Wird sie zur Behandlung einer bakteriellen Infektion oder eines mit einer bakteriellen Infektion in Zusammenhang stehenden Leidens oder von Krebs bei einem Säuger, wie etwa dem Menschen, oder einem Fisch oder Vogel verwendet, so kann eine Verbindung der Formel 1 oder der Formel 2 allein oder in der Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung, welche die Verbindung und ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel oder einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst, verabreicht werden. Solche Zusammensetzungen können oral, z.B. als Tabletten oder Kapseln, oder parenteral, das die subkutane und intramuskuläre Injektion umfasst, verabreicht werden. Die Verbindungen der Formel 1 oder der Formel 2 können auch rektal, so etwa durch die Verwendung eines Suppositoriums, verabreicht werden. Der pharmazeutisch annehmbare Träger hängt vom erwünschten Modus der Verabreichung ab. So können z.B. Lactose, Natriumcitrat und Salze der Phosphorsäure gemeinsam mit auflösenden Mitteln (wie Stärke) und Gleitmitteln (wie Magnesiumstearat, Natriumlaurylsulfat und Talk) als pharmazeutisch annehmbarer Träger in Tabletten verwendet werden. Für eine Verwendung in Kapseln sind Lactose und Polyethylenglykole mit hohem Molekulargewicht (d.h. einem Molekulargewicht von 2.000 bis 4.000) zweckdienliche pharmazeutisch annehmbare Träger. Für die parenterale Verwendung können sterile Lösungen oder Suspensionen hergestellt werden, worin der pharmazeutisch annehmbare Träger wässrig (z.B. Wasser, isotonische Kochsalzlösung oder isotonische Dextrose) oder nicht-wässrig (z.B. Fettöle pflanzlichen Ursprungs, so z.B. Baumwollsamenöl oder Erdnussöl, der Polyole wie Glycerin oder Propylenglykol) ist.
Bei der In-vivo-Behandlung einer bakteriellen Infektion oder eines mit einer bakteriellen Infektion in Zusammenhang stehenden Leidens bei einem Säuger oder bei der Behandlung von verschiedenen Krebsarten beim Menschen (insbesondere nicht-kleinzelliger Lungenkrebs) und anderen Säugetieren wie Hunden liegt bei einer oralen oder parenteralen Verabreichung die gewöhnliche Tagesdosis im Bereich von 0,1 – 100 mg/kg Körpergewicht, insbesondere von 0,5 – 25 mg/kg Körpergewicht, in einzelnen oder geteilten Dosen.
Die Bezeichnung "pharmazeutisch annehmbares Salz/annehmbare Salze", wie sie hierin verwendet wird, umfasst, falls nicht anders angegeben, Salze von sauren oder basischen Gruppen, die in den Verbindungen der vorliegenden Erfindung vorhanden sein können. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung, die in ihrer Natur basisch sind, können eine große Vielzahl an Salzen mit verschiedenen anorganischen und organischen Säuren bilden. Die Säuren, die zur Herstellung von pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalzen solcher basischen Verbindungen fähig sind, sind jene; die nicht-toxische Säureadditionssalze bilden können, d.h. Salze, die pharmakologisch annehmbare Anionen enthalten, so etwa. Hydrochlorid-, Hydrobromid-, Hydroiodid-, Nitrat-, Sulfat-, Bisulfat-, Phosphat-, Säurephosphat-, Isonicotinat-, Acetat-, Lactat-, Salicylat-, Citrat-, Säurecitrat-, Tartrat-, Pantothenat-, Bitartrat-, Ascorbat-, Succinat-, Maleat-, Gentisinat-, Fumarat-, Gluconat-, Glucaronat-, Saccharat-, Formiat-, Benzoat-, Glutamat-, Methansulfonat-, Ethansulfonat-, Benzolsulfonat-, p-Toluolsulfonat-, und Pamoatsalze [d.h. 1,1'-Methylenbis(2-hydroxy-3-naphthoat)].
Diese Verbindungen der vorliegenden Erfindung, die in ihrer Natur sauer sind, können basische Salze mit verschiedenen pharmakologisch annehmbaren Kationen bilden. Beispiele für solche Salze umfassen die Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalze und insbesondere dabei die Kalzium-, Magnesium-, Natrium- und Kaliumsalze der Verbindungen der vorliegenden Erfindung.
Bestimmte Verbindungen der vorliegenden Erfindung können asymmetrische Zentren aufweisen und kommen somit in verschiedenen enantiomeren und diastereomeren Formen vor. Diese Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von optischen Isomeren und Stereoisomeren der Verbindungen der vorliegenden Erfindung sowie von Gemischen davon und auf alle pharmazeutischen Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung, die diese verwenden oder enthalten können.
Die vorliegende Erfindung umfasst die Verbindungen der vorliegenden Erfindung und die pharmazeutisch annehmbaren Salze davon, worin ein oder mehrere Wasserstoff-, Kohlenstoff- oder andere Atome durch Isotope davon ersetzt sind. Solche Ver bindungen können als Untersuchungs- und Diagnosewerkzeuge in pharmakokinetischen Stoffwechselstudien und Bindungsuntersuchungen zweckdienlich sein.
Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden durch die Fermentierung eines nicht-transformierten oder transformierten Organismus erzeugt, der Erythromycine erzeugen kann, umfassend dabei, aber nicht darauf beschränkt: Saccharopolyspora species, Streptomyces griseoplanus, Nocardia sp., Micromonospora sp., Arthobacter. sp. und Streptomyces antibioticus, mit Ausnahme von S. coelicolor. Insbesondere geeignet in dieser Hinsicht sind nicht-transformierte und transformierte Stämme der Saccaropolyspora erythraea, z.B. NRRL 2338, 18643, 21484. Insbesondere bevorzugte transformierte Stämme sind jene, in welchen das Erythromycin-Beladungsmodul durch das Beladungsmodul aus dem Avermectin-Produzenten ersetzt wurde, Streptomyces avermitilis, oder dem Rapamycin-Produzenten, Streptomyces hygroscopicus. Das bevorzugte Verfahren zur Erzeugung von Verbindungen der vorliegenden Erfindung besteht in der Fermentierung des geeigneten Organismus in Gegenwart der geeigneten Carbonsäure der Formel R₁COOH, worin R₁ wie zuvor in der Formel 1 oder 2 definiert ist, oder ein Salz, Ester (insbesondere bevorzugt der N-Acetylcysteaminthioester) oder Amid davon oder der oxidative Vorläufer davon. Die Säure oder das Derivat davon werden zum Fermentierungsvorgang entweder zum Zeitpunkt der Beimpfung oder in Abständen während der Fermentierung zugegeben. Die Herstellung der Verbindungen dieser Erfindung kann dadurch überwacht werden, dass Proben aus der Fermentation entnommen, mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert werden und das Auftreten der Verbindungen dieser Erfindung mittels Chromatographie verfolgt wird, indem z.B. Hochdruck-Flüssigchromatographie verwendet wird. Die Inkubation wird fortgesetzt, bis die Ausbeute der Verbindung der Formeln 1 oder 2 ihren maximalen Wert erreicht hat, im Allgemeinen über einen Zeitrahmen von 4 bis 10 Tagen. Eine bevorzugte Menge jeder Zugabe von Carbonsäure oder einem Derivat davon liegt zwischen 0,05 und 4,0 g/l. Die besten Ausbeuten der Verbindungen der Formeln 1 oder 2 werden im Allgemeinen erreicht, indem schrittweise die Säure oder das Derivat zur Fermentierung, z.B. täglich über einen Zeitraum von mehreren Tagen, zugegeben wird. Das für die Fermentierung verwendete Medium kann ein herkömmliches komplexes Medium sein, das assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff, und Spurenelementen enthält.
Das geeignete und bevorzugte Mittel zum Züchten von nicht-transformierten und genetisch manipulierten, Erythromycin erzeugenden Zellen sowie das geeignete und bevorzugte Mittel zur Isolierung, Indentifizierung und praktischen Nutzung der Verbindungen der Formeln 1 und 2 sind umfangreicher in den Beispielen beschrieben.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Einige Ausführungsformen der Erfindung sind nunmehr mit Bezug auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben, worin:
1 die chemischen Formeln der drei bekannten Polyketide zeigt;
2a eine Darstellung der Funktion der 6-Desoxyerythronolid-Synthase B (DEBS), einem PKS erzeugenden 6-Desoxyerythronolid B (6-DEB), einem Vorläufer von Erythromycin A ist;
2b die post-PKS-Biosynthese von Erythromycinen veranschaulicht, einschließlich dabei die Umwandlung von 6-DEB in Erythromycin A;
die 3a und 3b Darstellungen der Bildung von Plasmid pIG1 sind;
die 4a, 4b und 4c Darstellungen der Bildung von Plasmid pND30 sind;
5 eine Darstellung der Konstruktion von Plasmid pAVLD ist;
6 die Integration von pAVLD in das Genom von S. erythraea NRRL2338 zeigt;
7 eine Darstellung der Biosynthese von Rapamycin ist;
8 eine Darstellung der Bildung von Plasmid pMO6 ist;
9 eine Darstellung der Konstruktion von Plamid pCJR26 ist;
10 eine Darstellung der Bildung von Plasmid pC-ATX ist;
11 eine Darstellung der Bildung von Plasmid pC-AT12 ist;
12 eine Darstellung der Bildung von Plasmid pCJR49 ist.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die große Reihe an Startereinheiten, die vom avr-Beladungsmodul angenommen werden, wurde in früheren Studien umfassend etabliert (z.B. die europäischen Patentanmeldungen 0 214 731, 0 350 187, O 317 148, die hierin durch Verweis vollständig aufgenommen werden). Deshalb ist zu verstehen, dass die Erfindung nicht auf das spezifische Detail dieser Beispiele eingeschränkt ist und dass diese einfach dazu dienen, die Wirksamkeit des avr-Beladungsmoduls zu bestätigen. Weiters veranschaulichen die Beispiele, die das pIG1- oder pND30-Konstrukt verwenden, sehr deutlich die Fähigkeit des actI-Promotors und seines zugehörigen Aktivatorgens actII-orf4, die Expression der neuen Verbindungen dieser Erfindung zu verstärken, wenn sie mit dem avr-Beladungsmodul verbunden sind. Aus den Beispielen ist auch ersichtlich, dass die nicht-transformierten Stämme von Saccharopolyspora erythraea auch leicht exogen zugeführte Substrate integrieren können, um neue Erythromycin-Polyketide zu erzeugen. Somit ist für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung ebenfalls ersichtlich, dass spezifische neue Verbindungen dieser Erfindung leicht durch die Wahl des geeigneten Erythromycin produzierenden Stammes (gegebenenfalls durch die Integration des pIG1- oder pND30-Plasmids in den erwünschten Stamm) erzeugt werden können und indem die Fermentation mit der geeigneten Startereinheit ergänzt wird. Somit können die 6-Desoxyerythromycin- und 6,12-Didesoxyerythromycin-Derivate der vorliegenden Erfindung einfach unter Verwendung von Saccharopolyspora erythraea NRRL 18643 oder NRRL 21484 erzeugt werden, wie dies in US-5.141.926 und WO 97/06266 beschrieben ist. Ähnlich können auch Saccharopolyspora-erythraea-Stämme, wie von Weber et al. in J. Bacteriol. 164, 425-433 (1991), beschrieben, verwendet werden, um die erwünschten neuen Analoga der vorliegenden Erfindung zu erhalten. So kann z.B. der Stamm UW24 verwendet werden (gegebenenfalls mit pIG1 oder pND30 transformiert), um die neuen Analoga von Erythronolid B zu erhalten.

Unter Verwendung eines Diodenanordnung-Spektralphotometers 1090M von Hewlett-Packard wurden UV-Spektren aufgezeichnet. Alle NMR-Spektren wurden in CDCl₃ an einem Varian Unity 500 MHz Spektrometer gemessen, sofern dies nicht anders angegeben wird, und die Peak-Positionen sind in Teilen pro Million (ppm) Tieffeld von Tetramethylsilan ausgedrückt. Die Peak-Formen werden wie folgt bezeichnet: s, Singulett; d, Dublett; t, Triplett; q, Quartett; m, Multiplett; b, breit. Die in den NMR-Strukturen dargestellte Atomanzahl ist für die Standard-Nomenklatur nicht repräsentativ, korreliert aber mit NMR-Daten zu diesem bestimmten Beispiel. HPLC-MS-Daten wurden erhalten, indem ein Flüssigchromatograph 1090M von Hewlett-Packard verwendet wurde, der mit einem VG Platform II Massenspektrometer, das mit einer APCI-Quelle ausgerüstet war, an der Schnittstelle verbunden war (Verfahren A), oder indem ein Flüssigchromatograph 1050 von Hewlett-Packard verwendet wurde, der mit einem VG Platform II Massenspektrometer, das mit einer APCI-Quelle ausgerüstet war, an der Schnittstelle verbunden war (Verfahren B und Verfahren C). HPLC Verfahren A:

Säule	Beckman Ultrasphere 5 μm ODS 4 mm × 25 cm
Durchfluss	0,85 ml/min
Mobile Phase	Gradient: Acetonitril:0,05 M Ammoniumacetat (28:72) bis Acetonitril:0,05 M Ammoniumacetat (50:50) über 22 Minuten, Beibehalten von Acetonitril:0,05 M Ammoniumacetat (50:50) 22-25 Minuten; Rückkehr zu Ausgangsbedingungen 25-30 Minuten.

HPLC Verfahren B:

Säule	MetaChem Inertsil 5 μm C8 3 mm × 150 mm
Durchfluss	0,5 ml/min
Mobile Phase	Isokratisch: Methanol:0,05 M Ammoniumacetat mit 0,1 % Trifluoressigsäure (60:40)

HPLC Verfahren C:

Säule	Waters Symmetry 5 μm C18 2,1 mm × 150 mm
Durchfluss	0,22 ml/min
Mobile Phase	Gradient: Acetonitril:0,05 M Ammoniumacetat (30:70) bis Acetonitril:0,05 M Ammoniumacetat (50:50) über 30 Minuten

Es werden dabei die folgenden Medien und Lösungen verwendet: Saccharose-Succinct-definiertes Medium

Saccharose	69 g
KNO₃	10 g
Bernsteinsäure	2,36 g
KH₂PO₄	2,7 g
MgSO₄·7H₂O	1,2 g
ZnCl₂	10 mg
MnCl₂·4H₂O	6,2 g
CuCl₂·2H₂O	0,53 mg
CoCl₂	0,55 mg
FeSO₄·7H₂O	2,5 mg
CaCl₂·2H₂O	38 mg
Milli-Q-Wasser	auf 1,0 l
KOH	bis pH 6-6,4

Leitungswassermedium

Glucose	5 g
Trypton	5 g
Hefeextrakt	2,5 g
EDTA	36 mg
Leitungswasser	auf 1,0 l
KOH	bis pH 7,1

ERY-P-Medium

Dextrose	50 g/l
Nutrisoy^TM-Mehl	30 g/l
(NH₄)₂SO₄	3 g/l
NaCl	5 g/l
CaCO₃	6 g/l
ph-Wert auf 7,0 eingestellt

Nutrisoy^TM-Mehl wird von der British Arkady Group, Skerton Road, Manchester, UK, gekauft.
Die Vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht:
Beispiel 1a – Bildung von Plasmid pIG1
Das Plasmid pIG1 besteht aus einem von SCP2* stammenden Plasmid, das ein hybrides PKS-Gen vom Typ I enthält, umfassend das avr-Beladungsmodul anstelle des ery-Beladungsmoduls, die ersten zwei Verlängerungsmodule der ery-PKS und die Thioesterase der ery-PKS. Dieses wird über einige Zwischenplasmide wie folgt gebildet (3).
(i) Bildung von Plasmid pVE3.4
Plasmid pVE1446, das einen Abschnitt der Avermectin- (avr-) PKS-Gene enthielt, wurde vom E.-coli-Stamm ATCC 68250 (MacNeil, D. J., et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 721, 123-132 (1994)) erhalten. Plasmid pVE1446 wurde mit BamHI verdaut, und das 7,6-kbp-Fragment zwischen den Koordinaten 32,15 und 3,40 (MacNeil, D. J., et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 721, 123-132 (1994)) wurde mittels Gelelektrophorese gereinigt und wieder zirkularisiert. Das Gemisch enthielt das erwünschte Plasmid pVE3.4, das nach der Transformation des E.-coli-Stamms TG1recO (gebildet von Dr. P. Oliver, Dept. Genetics, U. Cambridge; Kolodner, R., et al., J. Bacteriol. 163, 1060-1066 (1985); T. Gibson, Ph. D. Thesis, U. Cambridge (1985)) isoliert wurde.
(ii) Bildung von Plasmid pNCO12
Plasmid pBK25 (Bevitt, D.J., et al., Eur. J. Biochem. 204, 39-49 (1992)) wurde mit Ncol verdaut, und das 12-kbp-Fragment wurde end-repariert und in das Plasmid pUC18, das mit Smal linearisiert worden war, ligiert. Das Ligationsgemisch wurde in E. coli TG1 recO transformiert, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt untersucht. Das erwünschte Plasmid pNCO12 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
(iii) Bildung von Plasmid pCRabc
Plasmid pCRabc (3) wurde wie folgt gebildet. Drei getrennte PCR-Reaktionen wurden durchgeführt: Zuerst wurden 20 pmol jedes der synthetischen Oligonukleotide A1 (5'-CTCGTCGGTGGCTTTGOG-3') und A2 (5'-CCCGGGAAAAACGAAGACTAGTGGCGCGGACGGCCG-3') verwendet, um ein 1,0-kbp-Produkt aus 100 ng pNCO12-Templat zu amplifizieren. Das PCR-Produkt wurde end-repariert, phosphoryliert und in Smal-geschnittenes pU18 kloniert, um Plasmid pCRa zu erhalten. Zweitens wurden jeweils 20 pmol der synthetischen Oligonukleotide C1 (5'-CACGCGCAGCGCGGCGGA-3') und C2 (5'-CGAACCGCTAGCGGTCGTCGCGATGGCCT-3') verwendet, um ein 1,5-kbp-Produkt aus 100 ng pNCO12-Templat zu amplifizieren. Das Produkt wurde endrepariert, phosphoryliert und in Smal-geschnittenes pUC18 kloniert, um Plasmid pCRc zu erhalten. Drittens wurden jeweils 20 pmol der synthetischen Oligonukleotide B1 (5'-GTGGCCCGGCCGTCCGCGCCACTAGTCTTCGTTTTT-3') und B2 (5'-AACAGCTAGCGGTTCGTCCGCCGCTGCCGTGCC-3') verwendet, um ein 1,4-kbp-Produkt aus 100 ng pVE3.4-Templat zu amplifizieren. Das Produkt wurde endrepariert, phosphoryliert und in Smal-geschnittenes pUC18 kloniert, um Plasmid pCRb zu erhalten.
Plasmid pCRa wurde mit HindIII und SepI verdaut, und das 1,0-kbp-Insert wurde mit zuvor mit HindIII und SpeI verdautem Plasmid pCRb ligiert, um Plasmid pCRab zu erhalten. Plasmid pCRc wurde mit NheI und EcoR1 verdaut, und das 1,5-kbp-Insert wurde mit zuvor mit NheI und EcoR1 verdautem Plasmid pCRab ligiert, um Plasmid pCRabc zu erhalten.
(iv) Bildung von Plasmid pNEWAVETE
Plasmid pCRabc wurde mit MfeI und SfiI verdaut, und das DNA-Fragment, das die Beladungsdomäne der avr-PKS enthielt, wurde mittels Gelelektrophorese gereinigt und mit dem Plasmid pNTEP2 ligiert, das mit MfeI und SfiI verdaut worden war und dessen größeres Fragment mittels Geleelektrophorese gereinigt worden war. Das Ligationsgemisch wurde in E. coli TG1 recO transformiert, und einzelne Kolonien wur den auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pNEWAVETE (13,7 kbp) wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
(v) Bildung von Plasmid pRM52
Plasmid pRM52 ist ein Derivat von Plasmid pRM5 (McDaniel, R., et al., Science 262, 1546-1550 (1993)). pRM5 wurde zuerst mittels Verdau mit NdeI linearisiert, endrepariert und danach wieder ligiert, um pRM51 zu erzeugen. pRM51 wurde mit PacI und NsiI geschnitten, und das große PacI-NsiI-Fragment wurde isoliert und an einen kurzen, doppelsträngigen Oligonukleotid-Linker ligiert, der eine NdeI-Stelle enthielt und aus den synthetischen Oligonukleotiden 5'-TAAGGAGGACACATATGCA-3' und 5'-TAATTCCTCCTGTGTAT-3', die gemeinsam einen Doppelstrang ausbildeten, gebildet wurde. Das Ligationsgemisch wurde in E. coli TGIrecO transformiert, und isolierte Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt gescreent. Das erwünschte Plasmid (19,6 kbp) wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert und mit pRM52 bezeichnet.
(vi) Bildung von Plasmid pIG1
Das Plasmid pNEWAVETE wurde mit NdeI und XbaI verdaut, und das Insert wurde durch Sedimentation auf einem Saccharose-Gradienten gereinigt. Das gereinigte Insert wurde in Plasmid pRM52 (19,6 kbp), das mit NdeI und XbaI verdaut worden war, ligiert, und der Vektor wurde durch Sedimentation auf einem Saccharose-Gradienten gereinigt. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um E. coli zu transformieren, und die einzelnen Kolonien wurde auf ihren Plasmidgehalt untersucht. Das erwünschte Plasmid pIG1 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
Beispiel 1b – Bildung von Plasmid pND30
Pasmid pND30 besteht aus einem von SCP2* stammenden Plasmid, das ein hybrides PKS-Gen vom Typ I enthält, welches das avr-Beladungsmodul anstelle des ery-Beladungsmoduls, die ersten zwei Verlängerungsmodule der ery-PKS und die Thioesterase der ery-PKS umfasst. Dieses wird über einige Zwischenplasmide wie folgt gebildet (4).
(i) Bildung des rekombinanten Vektors pCJR101
pCJR101 (4) ist ein Shuttle-Plasmid, das gebildet wird, um für die Expression von PKS-Genen in Actinomyceten verwendet zu werden. Es umfasst ein ColE1-Replikon, um Replikation in E. coli zu ermöglichen, ein SCP2*-Streptomyces-Replikon mit niedriger Kopienzahl (Bibb, M. J., und Hopwood, D. A., J. Gen. Microbiol. 126, 427 (1981)) und das actII-orf4-Aktivatorgen vom act-Cluster, das die Transkription vom act-Promoter während des Übergangs von der Wachstumsphase zur stationären Phase im vegetativen Mycelium aktiviert. Es wird wie folgt gebildet: ein etwa 970-bp-DNA-Fragment von pMF1015 (enthält das actII-orf4-Aktivatorgen) (Fernandez-Moreno, M. A., et al., Cell 66, 769-780 (1991)) wird mittels PCR amplifiziert, wobei als Primer die synthetischen Oligonukleotide 5'-ACT AGT CCA CTG CCT CTC GGT AAA ATC CAG C-3' und 5'-CTT AAG AGG GGC TCC ACC GCG TTC ACG GAC-3' verwendet werden, das auch die flankierenden SpeI- und AflII-Restriktionsstellen einführt. Dieses Fragment wird in die end-reparierte AatII-Stelle des Plasmids pUC19 kloniert, um das Plasmid pCJR18 zu ergeben. Ein etwa 215-bp-DNA-Fragment wird von pMV400, welches das bi-direktionale Promoterpaar PactIII/PactI) enthält, amplifiziert (Parro, V., et al., Nucl. Acids Res. 19, 2623-2627 (1991)), wobei als Primer die synthetischen Oligonukleotide 5'-ACA TTC TCT ACG CCT AAG TGT TCC CCT CCC TGC CTC-3' und 5'-GTG ATG TAT GCT CAT ATG TGT CCT CCT TAA TTA ATC GAT GCG TTC GTC CGG TG-3' verwendet werden, das auch die flankierenden NdeI- und AflII-Stellen einführt. Das PCR-Produkt wird mit NdeI und AflII verdaut und mit dem Plasmid pCJR18, das zuvor mt NdeI und AflII geschnitten wurde, ligiert, um das Plasmid pCJR 19 zu erzeugen. Ein 1,1-kbp-HindIII-SphI-Fragment, welches das tsr-Gen enthält, das Thiostrepton-Resistenz verleiht, wird durch PCR vom Plasmid pIJ922 (Lydiate, D. J., et al., Gene 35, 223-235 (1985)) als Templat erhalten, wobei als Primer die Oligonukleotide 5'-TGA ACA CCA AGC TTG CCA GAG AGC GAC GAC TTC CCC-3' und 5'-GAC AGA TTG CAT GCC CTT CGA GGA GTG CCC GCC CGG-3' verwendet werden, das auch die flankierenden HindIII- und SphI-Stellen einführt. Das PCR-Produkt wird mit HindIII und SphI verdaut und mit Plasmid pCJR19, das mit HindIII und SphI geschnitten wurde, ligiert, um Plasmid pCJR24 zu erhalten. Das Plasmid pIJ922 wird mit BamHI und SstI verdaut, und das Fragment, das einen Abschnitt der Fertilitätsstelle und den Replikati onsursprung enthält (Lydiate, D. J., et al., Gene 35, 223-235 (1985)), wird in mit BamHI und SstI verdautes pUC19 ligiert, um das bifunktionelle Plasmid pCJR16 (14,7 kbp) zu erzeugen. Das Plasmid pCJR24 wird mit SalI und SphI verdaut, die zwei größeren Fragment vom Verdau werden mittels Gelelektrophorese gereinigt und in eine Ligation aus vier Komponenten mit Plasmid pCJR16 kombiniert, das mit XhoI und SphI verdaut wurde. Das Ligationsgemisch wird verwendet, um Streptomyces lividans zu transformieren, und es werden Kolonien in Gegenwart von Thiostrepton ausgewählt. Es wird gezeigt, dass eine solche Kolonie das erwünschte Plasmid pCJR101 (etwa 12,4 kbp) enthält, das durch sein Restriktionsmuster identifiziert wird.
(ii) Bildung von Plasmid pCJR29
Die Bildung des Plasmids pCJR29 ist in 4 veranschaulicht. Ein 1,1-kbp-HindIII-XhoI-Fragment, welches das tsr-Gen enthält, das Resistenz gegen Thiostrepton verleiht, wird mittels PCR vom Plasmid pIJ922 als Templat erhalten, wobei als Primer die Oligonukleotide 5'-TGA ACA CCA AGC TTG CCA GAG AGC GAC GAC TTC CCC-3' und 5'-GAC AGA TTC TCG AGC CTT CGA GGA GTG CCC GCC CGG-3' verwendet werden, das auch die flankierenden HindIII- und XhoI-Stellen einführt. Das PCR-Produkt wird mit HindIII und XhoI verdaut und mit Plasmid pCJR16 ligiert, das mit HindIII und XhoI verdaut wurde, um Plasmid pCJR25 zu erzeugen. Plasmid pCJR25 wird mit HindIII und SphI verdaut und mit Plasmid pCJR19, das mit HindIII und SphI verdaut wurde, ligiert; um das erwünschte Plasmid pCJR29 (etwa 12,4 kbp) zu erzeugen, das durch sein Restriktionsmuster identifiziert wird. Das Plasmid pCJR29 unterscheidet sich von pCJR101 in der Ausrichtung des tsr-Gens, des actII-orf4-Gens und des actI/actIII-Promotors in Bezug auf den von SCP2* stammenden Replikationsursprung.
(iii) Bildung von Plasmid pND30
Plasmid pNEWAVETE wurde mit NdeI und XbaI verdaut, und das Insert wurde durch Sedimentation auf einem Saccharose-Gradienten gereinigt. Das gereinigte Insert wurde in das Plasmid pCJR29 (etwa 12,4 kbp) ligiert, das mit NdeI und XbaI verdaut worden war, und der Vektor wurde durch Sedimentation auf einem Saccharose-Gradienten gereinigt. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um E. coli zu trans formieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt untersucht. Das erwünschte Plasmid pND30 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
Beispiel 1c – Bildung von Plasmid pCJR26
Plasmid pMO6 (8) wurde zuerst in verschiedenen Schritten gebildet:
(i) Bildung von Plasmid pMO1
Das etwa 1,3-kbp-DNA-Segment des eryAI-Gens von S. erythraea, das sich vom Nukleotid 1948 zum Nukleotid 3273 von eryAI erstreckt (Donadio, S., et al., Science 252, 675-679 (1991)), wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Primer synthetische Oligonukleotide verwendet wurden: 5'-CAT GCT CGA GCT CTC CTG GGA AGT-3' und 5'-CAA CCC TGG CCA GGG AAG ACG AAG ACG G-3' und das Plasmid pNTEP2 als Templat. Das PCR-Produkt wurde end-repariert und mit Plasmid pUC18, das mittels Verdau mit Smal linearisiert und danach mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war, ligiert. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um E. coli TG1 recO zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt untersucht. Das erwünschte Plasmid pMO1 (3,9 kbp), in welchem die StuI-Stelle, die an das Insert angrenzt, neben der HindIII-Stelle im Poly-Linker liegt, wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
(ii) Bildung von Plasmid pMO2
Das etwa 0,85-kbp-DNA-Segment des rapA-Gens von Streptomyces hygroscopicus, das sich vom Nukleotid 1643 zum Nukleotid 2486 von rapA erstreckt, wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Primer die folgenden Oligonukleotide verwendet wurden: 5'-TTC CCT GGC CAG GGG TCG CAG CGT G-3' und 5'-CAC CTA GGA CCG CGG ACC ACT CGA C-3' und die DNA vom rekombinanten Bacteriophagen λ-1E (Schwecke, T., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7839-7843 (1995)) als Templat. Das PCR-Produkt wurde end-repariert und mit Plasmid pUC19 ligiert, das mittels Verdau mit Smal linearisiert und danach mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um E. coli TGI recO zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt untersucht. Das erwünschte Plasmid pMO2 (3,5 kbp) wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
(iii) Bildung von Plasmid pMO3
Das etwa 1,7-kbp-DNA-Segment des eryAI-Gens von S. erythraea, das sich vom Nukleotid 4128 zum Nukleotid 5928 von eryAI erstreckt, wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Primer die synthetische Oligonukleotide verwendet wurden: 5'-TGG CCA GGG AGT CGG TGC ACC TAG GCA-3' und 5'-GCC GAC AGC GAG TCG ACG CCG AGT T-3' und das Plasmid pNTEP2 als Templat. Das PCR-Produkt wurde end-repariert und mit Plasmid pUC18 ligiert, das mittels Verdau mit Smal linearisiert und danach mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um E. coli TG1 recO zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt untersucht. Das erwünschte Plasmid pMO3 (4,4 kbp), in welchem die BalI- und AvrII-Stellen an die HindIII-Stelle des Poly-Linkers angrenzen, wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
(iv) Bildung von Plasmid pMO4
Plasmid pMO1 wurde mit HindIII und BalI verdaut, und das 1,3-kbp-Insert wurde mit Plasmid pMO3, das mit HindIII und BalI verdaut worden war, ligiert. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um E. coli TG1 recO zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt untersucht. Das erwünschte Plasmid pMO4 (5,6 kbp) wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
(v) Bildung von Plasmid pMO5
Plasmid pMO4 wurde mit StuI verdaut, und das 3,0-kbp-Insert wurde mit Plasmid pNTEP2, das mit StuI verdaut worden war, ligiert und mittels Gelelektrophorese gereinigt, um das 3,8-kbp-Insert zu entfernen. Das Ligationsgemisch wurde in E. coli TG1 recO transformiert, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt untersucht. Das Plasmid pMO5 (12,8 kbp) wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
(vi) Bildung von Plasmid pMO6
Plasmid pMO2 wurde mit BalI und AvrII verdaut, und das Insert wurde mit Plasmid pMO5 ligiert, das mit BalI und AvrII verdaut worden war. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um E. coli TG1 recO zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt untersucht. Das erwünschte Plasmid pMO6 (13,5 kbp) wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
(vii) Bildung von Plamid pCJR26
Plasmid pCJR26 ist ein Plasmid auf SCP2*-Basis, das ein PKS-Gen enthält, welches das ery-Beladungsmodul, das erste und das zweite Verlängerungsmodul der ery-PKS und die ery-Ketten terminierende Thioesterase umfasst, mit der Ausnahme, dass das DNA-Segment, das für die Methylmalonyl-CoA:ACP-Acyltransferase innerhalb des ersten Verlängerungsmoduls kodiert, spezifisch mit der DNA substituiert wurde, die für die Malonyl-CoA:ACP-Acyltransferase des Moduls 2 der rap-PKS kodiert. Es wurde wie folgt gebildet (9): Plasmid pMO6 wurde mit NdeI und XbaI verdaut, und das Insert wurde mit Plasmid pCJR24 ligiert; das mit NdeI und XbaI verdaut und mittels Gelelektrophorese gereinigt worden war. Das Ligationsgemisch wurde in E. coli TG1 recO transformiert, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt untersucht. Das erwünschte Plasmid pCJR26 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
Beispiel 1d – Bildung von S. erythraea JC2/pCJR26 und Herstellung von TKL-Derivaten
Plasmid pCJR26 wurde verwendet, um S.-erythraea-JC2-Protoplasten zu transformieren. Thiostrepton-resistente Kolonien wurden auf R2T20-Medium, das 10 μg/ml Thiostrepton enthielt, ausgewählt. Es wurden einige Klone auf die Gegenwart von pCJR26, das in das Chromosom integriert war, mittels Southern-Blot-Hybridisierung ihrer genomischen DNA mit DIG-markiertem DEBSI-TE-Gen untersucht.
Ein Klon mit einer integrierten Kopie von pCJR26 wurde in SSM-Medium gezüchtet, das 5 μg/ml Thiostrepton enthielt, und sieben Tage lang bei 28-30°C wachsen gelassen. Danach wurde die Kulturlösung filtriert, um Myzelien zu entfernen, und der pH-Wert wurde 3 eingestellt. Die Kulturlösung wurde zwei Mal mit zwei Volumina Ethylacetat extrahiert, und die vereinigten Ethylacetat-Extrakte wurden mit einem gleichen Volumen an gesättigtem Natriumchlorid gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, und das Ethylacetat wurde unter reduziertem Druck entfernt, um etwa 500 mg des Rohprodukts zu ergeben. Es wurde gezeigt, dass die Produkte δ-Lactone waren, die von 2-Methyl-3,5-dihydroxy-n-hexansäure und (2S,3R,5R)-2-Methyl-3,5-dihydroxy-n-heptansäure abstammen:
Beispiel 1e – Bildung von S. erythraea NRRL 2338/pCJR26 und seine Verwendung bei der Herstellung von 14-gliedrigen Makroliden
Etwa 5 mg pCJR49-DNA wurden verwendet, um S.-erythraea-NRRL2338-Protoplasten zu transformieren, um einen Stamm zu ergeben, in welchem das Plasmid in das Chromosom integriert ist. Aus einigen Kolonien wurde die Gesamt-DNA erhalten und mittels Southern-Hybridisierung analysiert, um zu bestätigen, dass das Plasmid sich in das Modul 2 von EryAI integriert hatte, um einen neuen biosynthetischen Makrolidweg zu ergeben. Es sind weitere Integrationen erfolgt, um wiederholte Plasmidsequezen zu ergeben. S. erythraea NRRL 2338/pCRJ49 wurde in eine triptische Sojakulturlösung, die 5 mg/l Thiostrepton enthielt, inokuliert und drei Tage lang bei 30 °C inkubiert. 100 ml dieser Impfkultur wurden verwendet, um 2 l Saccharosesuccinat-definiertes Medium, das 5 mg/l Thiostrepton enthielt, in 5 × 2-I-Kolben, die jeweils 500 ml Medium mit zwei Federn enthielten, um die Dispersion zu unterstützen, zu beimpfen, und bei 300 U/min geschüttelt. Nach weiteren 5 Tagen des Wachstums wurden die Kulturen zentrifugiert, und der pH des Überstands wurde auf einen pH-Wert von 9 eingestellt. Der Überstand wurde drei Mal mit einem gleichen Volumen an Ethylacetat extrahiert; und das Lösungsmittel wurde mittels Verdampfung entfernt. Die Produkte wurden mittels HPLC/MS analysiert, und es wurden zwei Makrolide als Erythromycin-Analoga identifiziert:
Beispiel 1f – Bildung von Plasmid pC-ATX
Plasmid pC-ATX ist ein Plasmid auf SCP2*-Basis, das ein PKS-Gen enthält, welches das ery-Beladungsmodul, das erste und das zweite Verlängerungsmodul der ery-PKS und die ery-Kette terminierende Thioesterase umfasst, mit der Ausnahme, dass das DNA-Segment, das für die Methylmalonyl-CoA:ACP-Acyltransferase innerhalb des ersten Verlängerungsmoduls kodiert, spezifisch mit der DNA substituiert wurde, die für die Malonyl-CoA:ACP-Acyltransferase von einem mutmaßlichen PKS-Gen-Cluster vom Typ I kodiert, der von Streptomyces cinnamonensins ATCC 14513 (Produzent des Polyetherpolyketids Monensin) kloniert wurde. Es wurde über verschiedene Zwischenplasmide wie folgt gebildet (10).
(i) Isolierung von Plasmid pSCIN02
Die genomische Bibliothek von Streptomyces cinnamonensis ATCC 14513 (der Monensin-Produzent) wurde aus Sau3A-Fragmenten, die auf eine Größe von 35-45 kbp fraktioniert worden waren, aus chromosomaler DNA, die in den BamHI-linearisierten und mit alkalischer Phosphatase behandelten Cosmid-Vektor pWE15 ligiert wurde, gebildet. Das Ligationsgemisch wurde in λ-Teilchen unter Verwendung von Gigapack-Packungsextrakten gepackt und in E. coli NM1blue transfiziert. Etwa 600 Kolonien der Bibliothek wurden auf der Oberfläche einer Nylonmembram gezüchtet, lysiert, und ihre DNA wurde mit der Membran mittels UV-Bestrahlung vernetzt. Die Membran wurde nachfolgend für das Screening-Verfahren verwendet. Das Insert aus pMO8, der die Ketosynthase-Domäne vom Modul 2 des DEBS umfasst, wurde mit tels zufälligem Primen in Gegenwart von ³³P-αATP markiert und als eine Sonde für die DNA-Hybridisierung verwendet. Die Sonde wurde 16 Stunden lang bei 68 °C in 4,0 × SSC-Puffer hybridisiert und anschließend 1 Stunde lang bei 68 °C in 0,8 × SSC-Puffer abgewaschen. Es wurden drei positive Klone isoliert. Die DNA der Inserts aller drei Klone wurde von den im Vektor pWE15 vorhandenen Priming-Stellen T3 und T7 end-sequenziert. Eine Region, die homolog zur den Domänen der Ketosynthase vom Typ I und der Malonyl-CoA:ACP-Acyltransferase ist, wurde in der DNA-Sequenz von der T7-Primingstelle unter Verwendung des Klons 2 (mit der Bezeichnung pSCIN02) als Templat entdeckt. Eine teilweise DNA-Sequenzierung der Malonyl-CoA:ACP-Acyltransferasedomäne (mit der Bezeichnung ATX) zeigte ein ungewöhnliches Sequenzmotiv im mutmaßlichen Substraterkennungsteil der Domäne, das sich wesentlich von den zuvor beschriebenen Malonat- oder Methylmalonatspezifischen CoA:ACP-Acyltransferasen unterschied (Haydock, S. F., et al, FEBS 374, 246-248 (1995)).
(ii) Bildung von Plasmid pMO38
Das etwa 0,9-kbp-DNA-Segment der ATX-Domäne wurde mittels PCR amplifiziert, wobei die folgenden Oligonukleotide als Primer verwendet wurden: 5'-CTG GCC AGG GCG CGC AAT GGC CGA GCA T-3' und 5'-CCC TAG GAG TCG CCG GCA GTC CAG CGC GGC GCC C-3', wobei die DNA vom Cosmid pSCIN02 als das Templat verwendet wurde. Das PCR-Produkt wurde end-repariert und mit Plasmid pUC18 ligiert, das mittels Verdau mit Smal linearisiert wurde, und danach mit alkalischer Phosphatase behandelt. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um E. coli TGI recO zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pMO38 (3,5 kbp) wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
(iii) Bildung von Plasmid pMO34
Plasmid pMO34 ist ein Derivat von pMO6 mit einer Polyklonierungsstelle, die nach dem Stop-Codon des insertierten D1-AT2-Gens insertiert ist. Plasmid pMO6 wurde mit EcoRI und HindIII verdaut und mit zwei Oligonukleotiden anelliert, wobei die doppelsträngige Region der Polyklonierungsstelle ausgebildet wurde: 5'-AAT TCA TAA CTA GTA GGA GGT CTG GCC ATC TAG A-3' und 5'-TCG AAG ATC TAC CGG TCT GGA GGA TGA TCA ATA C-3'. Das Gemisch wurde ligiert und in E. coli TGI recO transformiert. Einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt untersucht. Das erwünschte Plasmid pMO34 (13,5 kbp) wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
(iv) Bildung von Plasmid pMO35
Plasmid pMO35 ist ein Derivat von pMO34, welches das TKLS-AT2-Gen und ein translational gekoppeltes Crotonyl-CoA-Reduktasegen von Streptomyces collinus enthält (Wallace et al., E. J. Biochem. 233, 954-962 (1995)). Das Crotonyl-CoA-Reduktasegen wurde aus dem Plasmid pZYB3 (ein Geschenk von Prof. K. Reynolds) als ein NdeI-BamHI-Fragment ausgeschnitten, das mit Mungbohnen-Nuklease behandelt worden war, um stumpfe Enden zu erzeugen, und in pMO34 ligiert, das zuvor mit Spel geschnitten worden war, und ähnlich unter Verwendung einer Mungbohnen-Nuklease mit stumpfen Enden versehen. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um E. coli TG1 recO zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt untersucht. Das erwünschte Plasmid pMO35 (14,2 kbp) wurde mit der korrekten Ausrichtung des Crotonyl-CoA-Ketoreduktasegens durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
(v) Bildung von Plasmid pMO36
Plasmid pMO38 wurde mit BalI und AvrII verdaut, und das Insert wurde mit Plasmid pMO35, das mit BalI und AvrII verdaut worden war, ligiert. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um E. coli TG1 recO zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt untersucht. Das erwünschte Plasmid pMO36 (13,5 kbp) wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
(vi) Bildung von Plasmid pC-ATX
Plasmid pMO36 wurde mit NdeI und XbaI verdaut, und das Insert wurde mit Plasmid pCJR29, das mit NdeI und XbaI verdaut worden war, ligiert und mittels Gelelektrophorese gereinigt. Das Ligationsgemisch wurde in E. coli TG1 recO transfomiert, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt untersucht. Das erwünschte Plasmid pC-ATX wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
Beispiel 1g – Bildung von S. erythraea JC2/pC-ATX und Herstellung von TKL-Derivaten
Plasmid pC-ATX wurde verwendet, um S.-erythraea-JC2-Protoplasten zu transformieren. Thiostrepton-resistente Kolonien wurde auf R2T20-Medium ausgewählt, das 10 μg/ml Thiostrepton enthielt. Einige Klone wurden mittels Southern-Blot-Hybridisierung ihrer genomischen DNA mit DIG-markierter DNA, die für das DEBS1-TE-Gen kodiert, auf Gegenwart von pC-ATX untersucht, das in das Chromosom integriert worden war.
Ein Klon mit einer integrierten Kopie von pC-ATX wurde in SSM-Medium gezüchtet, das 5 μg/ml Thiostrepton enthielt, und sieben Tage lang bei 28-30 °C wachsen gelassen. Danach wurde die Kulturlösung filtriert, um Myzelien zu entfernen, und der pH-Wert wurde auf pH 3 eingestellt. Die Kulturlösung wurde zweimal mit zwei Volumina Ethylacetat extrahiert, und die vereinigten Ethylacetat-Extrakte wurde mit einem gleichen Volumen gesättigtem Natriumchlorid gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, und das Ethylacetat wurde unter reduziertem Druck entfernt, um etwa 500 mg des Rohprodukts zu ergeben. Die Produkte wurden mittels Gaschromatographie, Massenspektrometrie und NMR charakterisiert, und es wurde gezeigt, dass sie die δ-Lactone der 2-Methyl-4-ethyl-3,5-dihydroxy-n-hexansäure und 2-Methyl-4-ethyl-3,5-dihydroxy-n-heptansäure waren.
Beispiel 1 h – Bildung von S erythraea NRRL 2338/pC-ATX und dessen Verwendung für die Herstellung von 14-gliedrigen Makroliden
Etwa 5 μg pC-ATX-DNA wurde verwendet, um S.-erythraea-NRRL-2338-Protoplasten zu transformieren, um einen Stamm zu ergeben, in welchem das Plasmid im Chromosom integriert ist. Aus einigen Kolonien wurde die Gesamt-DNA erhalten und mittels Southern-Hybridisierung analysiert, um zu bestätigen, dass das Plasmid im Modul 2 von EryAI integriert war, um einen neuen biosynthetischen Makrolidweg zu ergeben. Es waren weitere Integrationen erfolgt, um wiederholte Plasmidsquenzen zu ergeben. S. erythraea NRRL 2338/pC-ATX wurde in tryptische Soja-Kulturlösung inokuliert, die 5 mg/l Thiostrepton enthielt, und bei 30 °C drei Tage lang inkubiert. 100 ml dieser Impflösung wurden verwendet, um 2 l Saccharosesuccinat-definiertes Medium, das 5 mg/ml Thiostrepton in 5 × 2-I-Kolben mit 2 Federn enthielt, um die Dispersion zu unterstützen, die jeweils 500 ml Medium enthielten, zu beimpfen, und bei 300 U/min geschüttelt. Nach weiteren 5 Tagen Wachstum wurden die Kulturen zentrifugiert, und der pH des Überstands wurde auf pH 9 eingestellt. Der Überstand wurde drei Mal mit einem gleichen Volumen an Ethylacetat extrahiert, und das Lösungsmittel wurde mittels Verdampfung entfernt. Die Produkte wurden mit HPLC-MS analysiert, und es wurden zwei Makrolidprodukte identifiziert:
Beispiel 1 i – Bildung von Plasmid pC-AT12
Plasmid pC-AT12 ist ein Plasmid auf SCP2*-Basis, das ein PKS-Gen enthält, welches das ery-Beladungsmodul und das erste und das zweite Verlängerungsmodul der ery-PKS sowie die ery-Ketten terminierende Thioesterase umfasst, mit der Ausnahme, dass das DNA-Segment, das für die Methylmalonyl-CoA:ACP-Acyltransfera se innerhalb des zweiten Verlängerungsmoduls kodiert, spezifisch mit der DNA substituiert wurde, die für die Malonyl-CoA:ACP-Acyltransferase des Moduls 2 der rap-PKS kodiert. Es wurde über einige Zwischenplasmide wie folgt gebildet (11).
(i) Bildung von Plasmid pMO25
Das etwa 1,0-kbp-DNA-Segment des eryAI-Gens von S. erythraea, das sich vom Nukleotid 6696 zum Nukleotid 7707 von eryAI (Donadio, S., et al., Science 252, 675-679 (1991)) erstreckt, wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Primer synthetische Oligonukleotide verwendet wurden: 5'-GGC GGG TCC GGA GGT GTT CAC CGA GTT-3' und 5'-ACC TTG GCC AGG GAA GAC GAA CAC TGA-3' und das Plasmid pNTEp2 als Templat. Das PCR-Produkt wurde end-repariert und mit Plasmid pUC18, das mittels Verdau mit Smal linearisiert und danach mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war, ligiert. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um E. coli TG1 recO zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt untersucht. Das erwünschte Plasmid pMO25 (3,6 kbp), in welchem die StuI-Stelle, die an das Insert angrenzt, neben der HindIII-Stelle im Poly-Linker liegt, wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
(ii) Bildung von Plasmid pMO26
Das etwa 0,6-kbp-DNA-Segment des eryAI-Gens von S. erythraea, das sich vom Nukleotid 8660 zum Nukleotid 9258 von eryAI erstreckt, wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Primer synthetische Oligonukleotide verwendet wurden: 5'-TCC TAG GCC GGG CCG GAC TGG TCG ACC TGC CGG GTT-3' und 5'-AAA CAC CGC GAC CTG GTC CTC CGA GC-3' und das Plasmid pNTEP2 als Templat. Das PCR-Produkt wurde end-repariert und mit Plasmid pUC18, das mittels Verdau mit Smal linearisiert und danach mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war, ligiert. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um E. coli TG1 recO zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt hin untersucht. Das erwünschte Plasmid pMO26 (3,2 kbp), in welchem die AvrII-Stelle neben der HindIII-Stelle des Poly-Linkers liegt, wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
(iii) Bildung von Plasmid pMO27
Plasmid pMO25 wurde mit EcoRI und BalI verdaut, und das 1,0-kbp-Insert wurde mit Plasmid pMO2 ligiert, das mit EcoRI und BalI verdaut worden war. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um E. coli TG1 recO zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt untersucht. Das erwünschte Plasmid pMO27 (4,4 kbp) wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
(iv) Bildung von Plasmid pMO32
Plasmid pMO26 wurde mit AvrII und HindIII verdaut, und das 0,6-kbp-Insert wurde mit Plasmid pMO27 ligiert, das mit AvrII und HindIII verdaut worden war. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um E. coli TG1recO zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt untersucht. Das erwünschte Plasmid pMO32 (5,1 kbp) wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
(v) Bildung von Plasmid pMO33
Plasmid pMO32 wurde mit BspEI und SexAI verdaut, und das 2,7-kbp-Insert wurde mit Plasmid pNTEP2 ligiert, das mit denselben zwei Enzymen verdaut und mittels Gelelektrophorese gereinigt worden war, um das 2,8-kbp-Insert zu entfernen. Das Ligationsgemisch wurde in E. coli TG1recO transformiert, und es wurden einzelne Kolonien auf ihren Plasmidgehalt untersucht. Das Plasmid pMO33 (12,8 kbp) wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
(vi) Bildung von Plasmid pC-AT12
Plasmid pMO33 wurde mit NdeI und XbaI verdaut, und das Insert wurde mit Plasmid pCJR29 ligiert, das mit NdeI und XbaI verdaut worden war, und mittels Gelelektrophorese gereinigt. Das Ligationsgemisch wurde in E. coli TG1 recO transformiert, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt untersucht. Das erwünschte Plasmid pC-AT12 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
Beispiel 1j – Bildung von S. erythraea JC2/pC-AT12 und Herstellung von TKL-Derivaten
Plasmid pC-AT12 wurde verwendet, um S.-erythraea-JC2-Protoplasten zu transformieren. Thiostrepton-resistente Kolonien wurden aus R2T20-Medium ausgewählt, das 10 μg/ml Thiostrepton enthielt.
Ein Klon mit einer integrierten Kopie von pC-AT12 wurde in SSM-Medium gezüchtet, das 5 μg/ml Thiostrepton enthielt, und sieben Tage lang bei 28-30 °C wachsen. gelassen. Danach wurde die Kulturlösung filtriert, um Myzelien zu entfernen, und der pH-Wert wurde auf pH 3 eingestellt. Die Kulturlösung wurde zweimal mit zwei Volumina Ethylacetat extrahiert, und die vereinigten Ethylacetatextrakte wurden mit einem gleichen Volumen an gesättigtem Natriumchlorid gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, und das Ethylacetat wurde unter reduziertem Druck entfernt, um etwa 500 mg des Rohprodukts zu ergeben. Es wurde gezeigt, dass die Produkte δ-Laktone der 4-Methyl-3,5-dihydroxy-n-hexansäure und der 4-Methyl-3,5-dihydroxy-n-heptansäure waren.
Beispiel 1k – Bildung von S. erythraea NRRL 2338/pC-AT12 und dessen Verwendung bei der Herstellung von 14-gliedrigen Makroliden
Etwa 5 μg pC-AT12-DNA wurden verwendet, um S.-erythraea-NRRL-2338-Protoplasten zu transformieren, um einen Stamm zu ergeben, in welchem das Plasmid in das Chromosom integriert ist. Aus einigen Kolonien wurde die Gesamt-DNA erhalten und mittels Southern-Hybridisierung analysiert, um zu bestätigen, dass das Plasmid 3' des Moduls 2 von EryAI integriert hatte, um einen neuen biosynthetischen Makrolidweg zu ergeben. Es erfolgten noch weitere Integrationen, um wiederholte Plasmidsequenzen zu ergeben. S. erythraea NRRL 2338/pC-AT12 wurde in tryptischer Soja-Kulturlösung inokuliert, die 5 mg/ml Thiostrepton enthielt, und bei 30 °C drei Tage lang inkubiert. 100 ml dieser Impflösung wurden verwendet, um 2 l Saccharosesuccinat-definiertes Medium, das 5 μg/ml Thiostrepton in 5 × 2-I-Kolben, die jeweils 500 ml Medium mit 2 Federn, um die Dispersion zu unterstützen, enthielten, zu beimpfen, und bei 300 U/min geschüttelt. Nach weiteren 5 Tagen Wachstum wurden die Kulturen zentrifugiert, und der pH des Überstands auf einen pH 9 eingestellt. Der Überstand wurde daraufhin drei Mal mit einem gleichen Volumen an Ethylacetat extrahiert, und das Lösungsmittel wurde durch Verdampfen entfernt. Die Produkte wurden mit HPLC-MS analysiert, und es wurden zwei Makrolid-Produkte indentifiziert.
Beispiel 1l – Bildung von Plasmid pCJR49
pCJR49 ist ein Plasmid auf pCJR24-Basis, das ein mutiertes DEBS1-TE-Gen enthält, das in Modul 2 keine Ketoreduktase aufweist, und worin die AT-Domäne im Modul 2 durch RAPS AT2 ersetzt wurde, um einen Malonyl-Verlängerer anstelle des Methylmalonyl-Verlängerers im zweiten Modul aufzunehmen (12).
pMO32 wurde mit BspEI und SexAI verdaut, und das Fragment, das AT vom RAP-Modul 2 enthielt, wurde in pUC1-0 kloniert, das zuvor mit BspEI und SexAI verdaut worden war, um das Plasmid pCJR43 zu ergeben.
pCJR43 wurde mit NdeI und XbaI verdaut, und das Fragment, welches das mutierte DEBS1-TE-Gen enthielt, wurde in pCJR24 kloniert, das zuvor mit NdeI und XbaI ver daut worden war, um das Plasmid pCJR49 zu ergeben. pCJR49 wurde mittels Restriktionsenzym-Kartierung bestätigt.
Beispiel 1m – Bildung von S. erythraea JC2/pCJR49 und Herstellung von TKL-Derivaten
Etwa 5 μg pCJR49-DNA wurden verwendet, um S.-erythraea-JC2-Protoplasten zu transformieren, um einen Stamm zu ergeben, in welchem das Plasmid in das Chromosom integriert ist. Aus einigen Klonen wurde die Gesamt-DNA erhalten und mittels Southern-Hybridisierung analysiert, um zu bestätigen, dass das Plasmid im eryTE integriert wurde. S. erythraea JC2/pCJR49 wird in tryptische Sojakulturlösung, die 5 μg/ml Thiostrepton enthält, inokuliert und bei 30 °C drei Tage lang inkubiert. 100 ml dieser Impflösung wurden verwendet, um 2 l Saccharosesuccinat-definiertes Medium, das 5 μg/ml Thiostrepton enthielt, in 5 × 2-I-Kolben, die jeweils 500 ml Medium mit 2 Federn, um die Dispersion zu unterstützen, enthielten, zu beimpfen, und bei 300 U/min geschüttelt. Nach weiteren 5 Tagen Wachstum wurden die Kulturen zentrifugiert, und der pH-Wert des Überstands wurde auf pH 3 eingestellt. Der Überstand wurde daraufhin drei Mal mit einem gleichen Volumen Ethylacetat extrahiert, und das Lösungsmittel wurde mittels Verdampfung entfernt. Die Produkte wurden in Methanol aufgelöst und mittels GCMS auf einem Finnegan-MAT-GCQ-System analysiert. Diese Analyse zeigte, dass im Vergleich zu synthetischen Standards zwei neue Lactone vorhanden waren. Diese Produkte waren die δ-Lactone von 4-Methyl-3-keto-5-hydroxyhexansäure und 4-Methyl-3-keto-5-hydroxyheptansäure.
Beispiel 1n – Bildung von S. erythraea NRRL 2338/pCJR49 und seine Verwendung für die Herstellung von 14-gliedrigen Makroliden
5 μg pCJR49-DNA wurden verwendet, um S.-erythraea-NRRL-2338-Protoplasten zu transformieren, um einen Stamm zu ergeben, in welchem das Plasmid im Chromo som integriert ist. Von einigen Kolonien wurde die Gesamt-DNA erhalten, und sie wurde mittels Southern-Hybridisierung analysiert, um zu bestätigen, dass das Plasmid im Modul 2 von EryAI integriert worden war, um einen neuen biosynthetischen Makrolidweg zu ergeben. Es sind noch weitere Integrationen erfolgt, um wiederholte Plasmidsequenzen zu ergeben. S. erythraea/pCJR49 wird in tryptische Sojakulturlösung, die 5 μg/ml Thiostrepton enthält, inokuliert und bei 30 °C drei Tage lang inkubiert. 100 ml dieser Impflösung wurden verwendet, um 2 l Saccharosesuccinatdefiniertes Medium, das 5 μg/ml Thiostrepton enthielt, in 5 × 2-I-Kolben, die jeweils 500 ml Medium mit 2 Federn, um die Dispersion zu unterstützen, enthielten, zu beimpfen, und bei 300 U/min geschüttelt. Nach weiteren 5 Tagen Wachstum wurden die Kulturen zentrifugiert, und der pH-Wert des Überstands wurde auf pH 9 eingestellt. Der Überstand wurde daraufhin drei Mal mit einem gleichen Volumen Ethylacetat extrahiert, und das Lösungsmittel wurde mittels Verdampfung entfernt. Die Produkte wurden mittels HPLC-MS analysiert, und es wurden zwei Makrolide identifiziert:
Beispiel 2 – Bildung von S. erythraea ERMD1 das ein hybrides PKS-Gen trägt in welchem die avr-Beladungsdidomäne für die ery-Beladungsdidomäne von S erythraea NRRL 2338 substituiert wird
(i) Bildung von Plasmid pAVLD
Plasmid pCRabc (Beispiel 1) wurde mit BamHI linearisiert und mit zuvor mit BglII verdautem pIJ702 ligiert. Das Gemisch enthielt das erwünschte Plamid pAVLD (5). Das Ligationsgemisch wurde in E. coli TG1 recO transformiert, und einzelne Kolo nien wurden auf ihren Plasmidgehalt untersucht. Das erwünschte Plasmid pAVLD wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert (5).
(ii) Bildung von S. erythraea ERMD1
Etwa 5-10 μg pAVLD, das von E. coli TG1 recO (pAVLD) isoliert worden war, wurden in S. erythraea NRRL 2338 transformiert, und stabile, Thiostrepton-resistente Kolonien wurden isoliert. Eine dieser Kolonien wurde ausgewählt, und die Gesamt-DNA wurde mit PstI verdaut und mittels Southern-Hybridisierung analysiert, wobei als Sonde das Insert vom Plasmid pCRc verwendet wurde, der das Fragment des ery AI-Gens, das für die Ketosynthasedomäne KS1 kodiert, enthielt. Die Analyse zeigte positiv hybridisierende PstI-Fragmente von 8,5 kbp, 4,8 kbp und 33 kbp, was auf die Gegenwart von zwei tandemartig integrierten Kopien von pAVLD hinweist (6).
Beispiel 3 – Herstellung von Isopropyl- und sec-Butyl-Erythromycinen unter Verwendung von S. erythraea ERMD1
Eine 50-ml-Fermentation von S. erythraea ERMD1 wurde auf einem Leitungswassermedium durchgeführt, und nach 4 Tagen bei 30 °C wurde das Myzelium geerntet und verwendet, um 1,5 l Saccharosesuccinat-Medium, das Thiostrepton enthielt (5 μg/ml), zu beimpfen. Nach vier Tagen Wachstum bei 30 °C wurde die gesamte Kulturlösung zweimal mit gleichen Volumina Ethylacetat extrahiert.
Die vereinigten Extrakte wurden unter reduziertem Druck eingeengt und zweimal präparativer Dünnschichtchromotographie auf Kieselgelplatten (20 × 20 cm), die mit Chloroform/Methanol/0,88 Ammoniak 8:2:0,01 (Vol.) eluiert wurden, unterzogen. Die Produkte wurden weiters mittels HPLC auf einer basendeaktivierter PhaseSep-C18-Umkehrphasen-Säule S5 ODS (Octadecylsilan) 6 (4,6 mm × 25 cm), die mit Methanol/0,5 % Ammoniumacetat (70:30 (Vol./Vol.)) eluiert wurde, bei 1 ml/min getrennt. Es wurden zwischen 7 und 11 Minuten von drei getrennten Injektionen Fraktionen gesammelt, und die gepoolten Injektionen wurden erneut in zehn getrennte Injektionen re-injiziert. Die Analoga, die eine Isopropyl-Seitenkette (Isopropyl an R₁ der Formel 1) enthielten, stammten von der Aufnahme einer 4-Kohlenstoff (C-4-; Isobutyryl-) Startereinheit, die vorher eluiert worden war, und die Analoga, die eine sec-Butyl- Seitenkette (sec-Butyl an R₁ der Formel 1) enthielten; stammten von der Aufnahme einer 5-Kohlenstoff (C-5-; 2-Methylbutyryl-) Startereinheit, die einige Minuten später auftrat. Hochauflösungs-MS ergab Ergebnisse für C-4-eryA-, -eryB- und -eryD-Analoga und für C-5-eryA- und -eryB-Analoga, die sehr genau den Berechnungen entsprachen:
In diesen Versuchen waren natürliche Erythromycine nur in geringen oder nicht nachweisbaren Mengen vorhanden, und es gab keine nachweisbaren Mengen an eryC-Analoga. Das Konzentrationsverhältnis-insgesamt der C-4/C-S-Verbindungen in der Fermentationskulturlösung, das mittels ESMS der Ethylacetat-Extrakte der Kulturlösungen bemessen wurde, betrug zwischen 4:1 und 6:1 für die C-4-Verbindungen: Das Verhältnis von A:B:D Analoga ist variabel, etwa 15:60:25, wobei aber der Anteil an A-Analoga mit der weiteren Fermentation zunimmt. Die Gesamtausbeute an Erythromycinen beträgt etwa 400 μg/l. Es wurde keine Ergänzung mit weder Isobuttersäure noch mit 2-Methyl-Buttersäure durchgeführt. Somit scheint es, als ob die Isobutyryl- und 2-Methylbutyryl-Startereinheiten von den endogen zugeführten Vorläufern stammen, analog zur Synthese von natürlichen Avermectinen (z.B. Hafner et al., J. Antibiot. 44, 349-356 (1991)).
Beispiel 4a – Bildung von S. erythraea NRRL 2338/pIG1
Etwa 5 μg Plasmid pIG1 wurden in Protoplasten von S. erythraea NRRL 2338 transformiert, und es wurden stabile Thiostrepton-resistente Kolonien isoliert. Es wurde von einigen solchen Kolonien die Gesamt-DNA erhalten und mittels Southern-Hybridisierung analysiert, um zu bestätigen, dass das Plasmid spezifisch in eryAI integriert worden war, und die Southern-Analyse zeigte auch, dass die Integrationsstel le dazu geeignet war, einen Mutanten zu erzeugen, der geänderte Makrolide über das ave-Beladungsmodul erzeugen konnte.
Beispiel 4b – Bildung von S. erythraea NRRL 2338/pND30
Etwa 5 μg Plasmid pND30 wurden in Protoplasten von S. erythraea NRRL 2338 transformiert, und es wurden stabile Thiostrepton-resistente Kolonien isoliert. Es wurde von einigen solchen Kolonien die Gesamt-DNA erhalten und mittels Southern-Hybridisierung analysiert, um zu bestätigen, dass das Plasmid spezifisch in eryAI integriert worden war, und die Southern-Analyse zeigte auch, dass die Integrationsstelle dazu geeignet war, einen Mutanten zu erzeugen, der geänderte Makrolide über das ave-Beladungsmodul erzeugen konnte.
Beispiel 5a – Herstellung von 13-Isopropyl- und 13-sec-Butyl-Erythromycinen unter Verwendung von S. erythraea NRRL 2338/pIG1
S. erythraea NRRL 2338/pIG1 wurde in ein Leitungswassermedium, das 50 μg/ml Thiostrepton enthielt, inokuliert und vier Tage lang bei 30 °C wachsen gelassen. Danach wurden 20 ml des Myzeliums verwendet, um 500 ml Saccharosesuccinat-Medium, das 5 μg/ml Thiostrepton enthielt, in einem 2-I-Kolben mit einer einzelnen Feder zu beimpfen, um das Verklumpen zu verringern, wobei dies bei 280 U/min geschüttelt wurde. Nach zwischen 3,5 und 6 Tagen wurde die Kulturlösung filtriert, um Myzelien zu entfernen, und danach dreimal mit einem Viertel Volumen Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Ethylacetat-Extrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde mittels Verdampfung entfernt. Eine Analyse des Produktgemisches unter Verwendung von GC und Elektrospray-MS zeigte, dass von 5-6 mg/l des 14-gliedrigen Makrolidprodukts die Hauptkomponente sec-Butyl-Erythromycin D (etwa 1,5 mg/ml) war, wobei andere Komponenten dabei sec-Butyl-Erythromycin B und sec-Butyl-Erythromycin A; Isopropyl-Erythromycine A, B und D; und geringe Mengen an natürlichen Erythromycinen A, B und D vorhanden waren. S. erythraea NRRL 2338/pIG1 erzeugte etwa 10- bis 15-mal mehr neue Isopropyl- und sec-Butyl-Erythromycine im Vergleich zum äquivalenten S.-erythraea-ERMD1-Konstrukt (siehe Beispiel 2), was sehr deutlich die Fähigkeit des actI-Promotors und seines zugehörigen Aktivatorgens actII-orf4 zeigt, die Expression von PKSs vom Typ I zu verstärken. Erneut wurde keine Ergänzung mit weder Isobuttersäure noch 2-Methyl-Buttersäure durchgeführt. Somit scheint, dass die Isobutyryl- und 2-Methylbutyryl-Startereinheiten von endogen zugeführten Vorläufern abstammen.
Beispiel 5b – Herstellung von 13-Isopropyl- und 13-sec-Butyl-Erythromycinen unter Verwendung von S. erythraea NRRL 2338/pND30
S. erythraea NRRL 2338/pND30 wurde in Leitungswassermedium, das 50 μg/ml Thiostrepton enthielt, inokuliert und vier Tage lang bei 30 °C wachsen gelassen. Danach wurden 20 ml Myzelium verwendet, um 500 ml des Saccharosesuccinat-Mediums, das 5 μg/ml Thiostrepton enthielt, in einem 2-I-Kolben mit einer einzelnen Feder zu beimpfen, um Verklumpung zu verringern, danach wurden sie bei 280 U/min geschüttelt. Nach zwischen 3,5 und 6 Tagen wurde die Kulturlösung filtriert, um Myzelien zu entfernen, und danach dreimal mit einem Viertel Volumen Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Ethylacetat-Extrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde mittels Verdampfung entfernt. Eine Analyse des Produktgemisches unter Verwendung von GC und Elektrospray-MS zeigte, dass von 5-6 mg/l des 14-gliedrigen Makrolidprodukts die Hauptkomponente sec-Butyl-Erythromycin D (etwa 1,5 mg/ml) war, wobei andere Komponenten dabei sec-Butyl-Erythromycin B und sec-Butyl-Erythromycin A; Isopropyl-Erythromycine A, B und D; und geringe Mengen an natürlichen Erythromycinen A, B und D vorhanden waren. S. erythraea NRRL 2338/pND30 erzeugte etwa 10- bis 15-mal mehr neue Isopropyl- und sec-Butyl-Erythromycine im Vergleich zum äquivalenten S.-erythraea-ERMD1-Konstrukt (siehe Beispiel 2), was sehr deutlich die Fähigkeit des actI-Promotors und seines zugehörigen Aktivatorgens actII-orf4 zeigt, die Expression von PKSs vom Typ I zu verstärken. Erneut wurde keine Ergänzung mit weder Isobuttersäure noch 2-Methyl-Buttersäure durchgeführt. Somit scheint, dass die Isobutyryl- und 2-Methylbutyryl-Startereinheiten von endogen zugeführten Vorläufern abstammen.
Beispiel 6a – Herstellung von 13-Cyclopentyl-Erythromycin B unter Verwendung von S. erythraea NRRL 2338/pIG1
Die Kultur S. erythraea NRRL 2338/pIG1 wurde in 50 ml Leitungswassermedium in einem 300-ml-Erlenmeyer-Kolben inokuliert. Nach einer 36-stündigen Inkubation bei 28 °C wurde dieser Kolben verwendet, um 3,5 l ERY-P-Medium in einem 5-I-Miniglasgefäß zu inokulieren. Die Kulturlösung wurde bei 28 °C mit einer Belüftungsrate von 1,75 l/min inkubiert. Cyclopentancarbonsäure (1,4 ml) wurde nach 24 Stunden zugegeben, und die Fermentierung wurde 168 Stunden lang fortgesetzt. Danach wurde die gesamte Kulturlösung auf einen pH-Wert von pH 8,5 mit wässrigem Natriumhydroxid eingestellt und mit Ethylacetat (10 l) extrahiert. Der Ethylacetat-Extrakt wurde bis zur Trockene eingeengt und ergab das Rohprodukt als Gummi (4,2 g). 1 g dieses Extrakts wurde in Ethylacetat (5 ml) aufgelöst und zu einer zuvor gepackten Kieselgel-Kassette (10 g; International Sorbent Technology) zugegeben, die zuvor mit Ethylacetat (10 ml) konditioniert worden war. Die Säule wurde sequentiell mit Ethylacetat (4 × 10 ml); Dichlormethan:Methanol (1:1) (2 × 10 ml); Dichlormethan:Methanol:Ammoniak (90:9:1) (1 × 10 ml); Dichlormethan:Methanol:Ammoniak (80:19:1) (1 × 10 ml); Methanol (2 × 10 ml) eluiert. Die Fraktionen 7-10 wurden vereinigt und zur Trockene eingedampft. Diese Fraktionierung wurde auf den verbleibenden 3,2 g des Gummis wiederholt. Dieser Anreicherungsschritt ergab ca. 920 mg eines gummiartigen Feststoffs, der das erwünschte Produkt enthielt. Dieses wurde weiters mittels präparativer Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer Zorbax-7-μm-ODS-Säule (21,2 mm × 25 cm) unter Verwendung einer mobilen Phase aus Acetonitril:0,05 M Ammoniumacetat (7:3) mit 8 ml/min gereinigt. Fraktionen, die das Produkt von Interesse enthielten, aus vier getrennten Injektionen wurden vereinigt und zur Trockene eingedampft, bevor die präparative Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer Beckman-5-μm-Ultrasphere-ODS-Säule (10 mm × 25 cm) unter Verwendung eines Gradienten der mobilen Phase aus Acetonitril:0,05 M Ammoniumacetat (28:72) bis Acetonitril:0,05 M Ammoniumacetat (50:50) über 18 Minuten (Durchflussrate 4 ml/min) wiederholt wurde. Fraktionen, die das Produkt von Interesse beinhalten, von fünf getrennten Injektionen wurden vereinigt und zur Trockene eingedampft, um einen reinen weißen Feststoff (7 mg) zu ergeben. Die Struktur des Produkts wurde mittels Massenspektrometrie (MS) und Kernresonanzspektrometrie (NMR) wie folgt bestätigt:
HPLC-Retentionszeit – Verfahren A – 26,0 Minuten
APCI-MS – (M+H)⁺ beobachtet bei m/e 758, erforderlich für C₄₀H₇₂NO₁₂ – 758
NMR-Daten:
Beispiel 6b – Herstellung von 13-Cyclopentyl-Erythromycin B unter Verwendung von S: erythraea NRRL 2338/pND30
Ein ähnliches Experiment wie Beispiel 6a, wobei die Kultur S. erythraea NRRL 2338/pND30 verwendet wird, erzeugt die im Beispiel 6a veranschaulichte Verbindung.
Beispiel 7a – Herstellung von 13-Cyclobutyl-Erythromycin B unter Verwendung von S erythraea NRRL 2338/pIG1
Die Kultur S. erythraea NRRL 2338/pIG1 wurde in 50 ml Leitungswassermedium in 3 × 300-ml-Erlenmeyer-Kolben inokuliert. Nach einer 72-stündigen Inkubation bei 28 °C wurde dieser Kolben verwendet, um 3,5 l ERY-P-Medium in 3 × 5-I-Miniglasgefäßen zu inokulieren. Die Kulturlösung wurde bei 28 °C mit einer Belüftungsrate von 2,0 l/min inkubiert und mit 500 U/min gerührt. Zwei Gaben von Cyclobutancarbonsäure (1,4 ml) wurden nach 24 Stunden und nach 48 Stunden zugegeben, und die Fermentierung wurde 168 Stunden lang fortgesetzt. Danach wurde die gesamte Kulturlösung auf einen pH-Wert von pH 8,5 mit wässrigem Natriumhydroxid eingestellt und dann mit Ethylacetat (20 l) extrahiert. Der Ethylacetat-Extrakt wurde bis zur Trockene eingeengt und ergab das Rohprodukt als Gummi (9,2 g). Ein Teil (2,3 g) dieses Extrakts wurde in Ethylacetat (12,5 ml) aufgelöst und zu einer zuvor gepackten Kieselgel-Kassette (10 g; International Sorbent Technology) zugegeben, die zuvor mit Ethylacetat (10 ml) konditioniert worden war. Die Säule wurde sequentiell mit Ethylacetat (4 × 24 ml); Dichlormethan:Methanol (9:1) (1 × 24 ml); Dichlormethan:Methanol (8:2) (2 × 24 ml), Dichlormethan:Methanol:Ammoniak (80:19:1) (1 × 24 ml); Methanol (1 × 24 ml) eluiert. Die Fraktionen 6-8 wurden vereinigt und zur Trockene eingedampft. Diese Fraktionierung wurde auf der verbleibenden Probe des Gummis (4,7 g) wiederholt. Dieser Anreicherungsschritt ergab ca. 415 mg eines Feststoffs, der das erwünschte Produkt enthielt. Dieses wurde weiters mittels präparativer Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer Zorbax-7-μm-ODS-Säule (21,2 mm × 25 cm) unter Verwendung einer mobilen Phase aus Acetonitril:0,05 M Ammoniumacetat (3:1) mit 8 ml/min gereinigt. Fraktionen, die das Produkt von Interesse enthielten, aus fünf getrennten Injektionen wurden vereinigt und zur Trockene eingedampft, bevor die präparative Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer Beckman-5-μm-Ultrasphere-ODS-Säule (10 mm × 25 cm) unter Verwendung eines Gradienten einer mobilen Phase aus Acetonitril:0,05 M Ammoniumacetat (28:72) bis Acetonitril:0,05 M Ammoniumacetat (50:50) über 18 Minuten (Durchflussrate 4 ml/min) wiederholt wurde. Fraktionen, die das Produkt von Interesse beinhalten, wurden vereinigt und zur Trockene eingedampft, um einen reinen weißen Feststoff (27 mg) zu ergeben. Die Struktur des Produkts wurde mittels MS und NMR wie folgt bestätigt:
HPLC-Retentionszeit – Verfahren A – 22,3 Minuten
APCI-MS – M+H)⁺ beobachtet bei m/e 744, erforderlich für C₃₉H₇₀NO₁₂ – 744
NMR-Daten:
Beispiel 7b – Herstellung von 13-Cyclobutyl-Erythromycin B unter Verwendung von S erythraea NRRL 2338/pND30
Ein ähnliches Experiment wie Beispiel 7a, wobei die Kultur S. erythraea NRRL 2338/pND30 verwendet wird, erzeugt die im Beispiel 7a veranschaulichte Verbindung.
Beispiel 8a – Herstellung von 13-(3-Furanyl)-Erythromycin B unter Verwendung von S. erythraea NRRL 2338/pIG1
Die Kultur S. erythraea NRRL 2338/pIG1 wurde in 50 ml Leitungswassermedium in einem 300-ml-Erlenmeyer-Kolben inokuliert. Nach einer 72-stündigen Inkubation bei 28 °C wurde dieser Kolben verwendet, um 3,5 l ERY-P-Medium in einem 5-I-Miniglasgefäß zu inokulieren. Die Kulturlösung wurde bei 28 °C mit einer Belüftungsrate von 1,75 l/min inkubiert. 3-Brenzschleimsäure (1 ,4 g in 6 ml Methanol) wurde filtersterilisiert nach 24 Stunden zugegeben, und die Fermentierung wurde 138 Stunden lang fortgesetzt. Danach wurde die gesamte Kulturlösung auf einen pH-Wert von pH 8,5 mit wässrigem Natriumhydroxid eingestellt und mit Ethylacetat (10 l) extra hiert. Der Ethylacetat-Extrakt wurde bis zur Trockene eingeengt und ergab das Rohprodukt als Gummi (3,8 g). Ein Teil (1,9 g) dieses Extrakts wurde in Ethylacetat (10 ml) aufgelöst und zu einer zuvor gepackten Kieselgel-Kassette (10 g; International Sorbent Technology) zugegeben, die zuvor mit Ethylacetat (10 ml) konditioniert worden war. Die Säule wurde sequentiell mit Ethylacetat (4 × 24 ml); Dichlormethan:Methanol (9:1) (1 × 24 ml); Dichlormethan:Methanol (8:2) (2 × 24 ml), Dichlormethan:Methanol:Ammoniak (80:19:1) (1 × 36 ml); Methanol (1 × 24 ml) eluiert. Die Fraktionen 8 und 9 wurden vereinigt und zur Trockene eingedampft. Diese Fraktionierung wurde auf den verbleibenden 1,9 g des Gummis wiederholt. Dieser Anreicherungsschritt ergab einen Feststoff, der das erwünschte Produkt enthielt. Dieses wurde weiters mittels präparativer Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer Zorbax-7-μm-ODS-Säule (21,2 mm × 25 cm) unter Verwendung einer mobilen Phase aus Acetonitril:0,05 M Ammoniumacetat (3:1) mit 8 ml/min gereinigt. Fraktionen, die das Produkt von Interesse enthielten, aus drei getrennten Injektionen wurden vereinigt und zur Trockene eingedampft, bevor die präparative Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer Beckman-5-μm-Ultrasphere-ODS-Säule (10 mm × 25 cm) unter Verwendung eines Gradienten der mobilen Phase aus Acetonitril:0,05 M Ammoniumacetat (28:72) bis Acetonitril:0,05 M Ammoniumacetat (50:50) über 18 Minuten (Durchflussrate 4 ml/min) wiederholt wurde. Fraktionen, die das Produkt von Interesse beinhalten, aus drei getrennten Injektionen wurden vereinigt und zur Trockene eingedampft, um reines 13-(3-Furanyl)-Erythromycin B als weißen Feststoff (9 mg) zu ergeben. Die Struktur des Produkts wurde mittels MS bestätigt.
HPLC-Retentionszeit – Verfahren A – 17,0 Minuten
APCI-MS – (M+H)⁺ beobachtet bei m/e 756, erforderlich für C₃₉H₆₆NO₁₃ – 756
NMR-Daten:
Beispiel 8b – Herstellung von 13-(3-Furanyl)-Erythromycin B unter Verwendung von S. erythraea 2338/pND30
Ein ähnliches Experiment wie Beispiel 8a, wobei die Kultur S. erythraea NRRL 2338/pND30 verwendet wird, erzeugt die im Beispiel 8a veranschaulichte Verbindung.
Beispiel 9a – Herstellung von 13-Cyclopropyl-Erythromycin B unter Verwendung von S. erythraea NRRL 2338/pIG1
Die Kultur S. erythraea NRRL 2338/pIG1 wurde in 50 ml Leitungswassermedium in einem 300-ml-Erlenmeyer-Kolben inokuliert. Nach einer 72-stündigen Inkubation bei 28 °C wurde dieser Kolben verwendet, um 3,5 l ERY-P-Medium zu inokulieren. Thiostrepton (105 mg) wurde unmittelbar nach der Sterilisation zugegeben. Die Kulturlösung wurde bei 28 °C mit einer Belüftungsrate von 2 l/min inkubiert und mit 500 U/min gerührt. Cyclopropancarbonsäure (1,2 ml) wurde nach 24 Stunden zugegeben, und die Fermentierung wurde 144 Stunden lang fortgesetzt. Danach wurde die gesamte Kulturlösung auf einen pH-Wert von pH 8,5 mit wässrigem Natriumhydroxid eingestellt und dann mit Ethylacetat (3 l) extrahiert. Der Ethylacetat-Extrakt wurde bis zur Trockene eingeengt und ergab das Rohprodukt als Gummi (1,7 g). Dieser Extrakt (0,85 g) wurde in Ethylacetat (10 ml) aufgelöst und zu einer zuvor gepackten Kieselgel-Kassette (10 g; International Sorbent Technology) zugegeben, die zuvor mit Ethylacetat (20 ml) konditioniert worden war. Die Säule wurde sequentiell mit Ethylacetat (4 × 24 ml); Dichlormethan:Methanol (9:1) (1 × 24 ml); Dichlormethan:Methanol (8:2) (1 × 24 ml), Dichlormethan:Methanol:Ammoniak (80:19:1) (3 × 24 ml); Methanol (1 × 24 ml) eluiert. Die Fraktionen 6-9 wurden vereinigt und zur Trockene eingedampft. Diese Fraktionierung wurde auf den verbleibenden 0,85 g des Gummis wiederholt. Dieser Anreicherungsschritt ergab einen Feststoff, der das erwünschte Produkt enthielt. Dieses wurde weiters mittels präparativer Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer Zorbax-7-μm-ODS-Säule (21,2 mm × 25 cm) unter Verwendung einer mobilen Phase aus Acetonitril:0,05 M Ammoniumacetat (3:1) mit 8 ml/min gereinigt. Fraktionen, die das Produkt von Interesse enthielten, aus vier getrennten Injektionen wurden vereinigt und zur Trockene eingedampft, bevor die präparative Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer Beckman-5-μm-Ultrasphere- ODS-Säule (10 mm × 25 cm) unter Verwendung eines Gradienten einer mobilen Phasen aus Acetonitril:0,05 M Ammoniumacetat (28:72) bis Acetonitril:0,05 M Ammoniumacetat (50:50) über 18 Minuten (Durchflussrate 4 ml/min) wiederholt wurde. Fraktionen, die das Produkt von Interesse beinhalten, aus drei getrennten Injektionen wurden vereinigt und zur Trockene eingedampft, um reines 13-Cyclopropyl-Erythromycin B als weißen Feststoff (9 mg) zu ergeben. Die Struktur des Produkts wurde mittels Massenspektrometrie bestätigt.
HPLC-Retentionszeit – Verfahren A – 17,9 Minuten
APCI-MS – (M+H)⁺ beobachtet bei m/e 730, erforderlich für C₃₈H₆₈NO₁₂ – 730
NMM-Daten:
Beispiel 9b – Herstellung von 13-Cyclopropyl-Erythromycin B unter Verwendung von S. erythraea 2338/pND30
Ein ähnliches Experiment wie Beispiel 9a, wobei die Kultur S. erythraea NRRL 2338/pND30 verwendet wird, erzeugt die im Beispiel 9a veranschaulichte Verbindung.
Beispiel 10a – Herstellung von 13-(1-Methylthio-ethyl)-Erythromycin B unter Verwendung von S. erythraea NRRL 2338/pIG1
Die Kultur S. erythraea NRRL 2338/pIG1 wurde in 1 l Leitungswassermedium in einem 2,8-I-Fernbach-Kolben inokuliert. Thiostrepton (50 mg) wurde unmittelbar nach dem Beimpfen zugegeben. Nach 84-stündiger Inkubation bei 29 °C wurde dieser Kolben verwendet, um 8 l des ergänzten ERY-P-Mediums (50 g/l Dextrose, 30 g/l Nutrisoy-MehI, 3 g/l Ammoniumsulfat, 5 g/l NaCl, 6 g/l CaCO₃, 10 g/l Saccharose, 5 g/l Cornsteep-Feststoffe, 0,5 g/l MgSO₄ und 1ml/l P2000) in einem 14-I-Fermentorglasgefäß zu inokulieren. Die Kulturlösung wurde bei 28 °C mit einer Belüftungsrate von 8 l/min inkubiert, mit 800 U/min gerührt und auf einem pH-Wert zwischen 6,9 und 7,3 mit NaOH oder H₂SO₄ (15 %) gehalten. Nach 24 und 48 Stunden wurde Methylthiomilchsäure (3,2 ml) zugegeben. Zusätzliche Methylthiomilchsäure (1,6 ml) wurde nach 120 Stunden zugegeben. Die Fermentation wurde 142 Stunden lang fortgesetzt. Danach wurde die gesamte Kulturlösung zentrifugiert, um ein Zentrat (34 l) zu ergeben, das auf eine XAD-16-Harzsäule (600 ml; Rohm und Haas) aufgebracht wurde. Die Harzsäule wurde draufhin mit Wasser (1,8 l) gewaschen und mit Ethylacetat (2,5 l) eluiert. Das Ethylacetat wurde teilweise eingeengt (auf 250 ml), und danach wurde das Produkt von Interesse in 100 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 3,5 (1,3 l), extrahiert. Das Produkt wurde wieder in Ethylacetat zurücktransferiert, indem das Wasser mit Natriumhydroxid auf einen pH von 9 eingestellt und danach mit Ethylacetat (450 ml) vermischt wurde. Die Erythromycin-reiche Ethylacetat-Phase wurde abgetrennt, zu einem Gummi (5,0 g) eingedampft und danach erneut in 20 % Methanol (120 ml) resuspendiert, das auf eine CG-161-Harzsäule (100 ml; Toso Haas) aufgebracht wurde. Die Harzsäule wurde nacheinander mit 20 % Methanol (3 × 100 ml), 40 % Methanol (3 × 100 ml), 60 % Methanol (3 × 100 ml), 80 % Methanol (3 × 100 ml) und unverdünntem Methanol (4 × 100 ml) eluiert. Die unverdünnten Methanolfraktionen 2 und 3, die das Produkt von Interesse enthielten, wurden zu einem Feststoff (220 mg) eingedampt und danach weiter über eine 10-μm-Umkehrphasen-HPLC-Säule Kromasil C18 (75 mm × 25 cm) unter Verwendung eines Gradienten der mobilen Phase aus Acetonitril:0,05 M Ammoniumacetat mit 0,1 % Trifluoressigsäure (32:68) bis (38:62) über 60 Minuten mit einer Durchflussrate von 215 ml/min gereinigt. Fraktionen, die das Produkt von Interesse enthielten, wurden vereinigt (1 ,7 l), auf einem pH von 9 mit Natriumhydroxid eingestellt und in Methylenchlorid (300 ml) extrahiert. Die Methylenchloridschicht wurde getrennt und zur Trockene eingedampft, um ein teilweise reines Produkt zu erhalten. Der präparative HPLC-Schritt und der Extraktionsschritt wurden wiederholt, um reines 13-(1-Methylthioethyl)-Erythromycin B (31 mg) zu erhalten. Die Struktur des Produkts wurde mittels MS- und NMR-Spektroskopie (Bruker DMX 500 MHz Spektrometer) wie folgt bestätigt:
HPLC-Retentionszeit – Verfahren B – 14,9 Minuten
APCI-MS – (M+H)⁺ beobachtet bei m/e 764, erforderlich für C₃₈H₇₀NO₁₂S – 764
NMR-Daten:
Beispiel 10b – Herstellung von 13-(1-Methylthioethyl)-Erythromycin B unter Verwendung von S. erythraea NRRL 2338/pND30
Ein ähnliches Experiment wie Beispiel 10a, wobei die Kultur S. erythraea NRRL 2338/pND30 verwendet wird, erzeugt die im Beispiel 10a veranschaulichte Verbindung.
Beispiel 11 – Herstellung von 13-Cyclobutyl-Erythromycin B unter Verwendung von S. erythraea NRRL 2338
Die Kultur S. erythraea NRRL 2338 wurde in 50 ml Leitungswassermedium in einem 300-ml-Erlenmeyer-Kolben inokuliert. Nach einer 48-stündigen Inkubation bei 28 °C wurde dieser Kolben verwendet, um 50 ml des ERY-P-Mediums in einem 300-ml-Erlenmeyer-Kolben zu inokulieren. Die Kulturlösung wurde bei 28 °C inkubiert. Nach 24 Stunden wurde Cyclobutancarbonsäure (20 ml) zugegeben, und die Fermentation wurde 168 Stunden lang fortgesetzt. Danach wurde die gesamte Kulturlösung auf einen pH von 8,5 mit wässrigem Natriumhydroxid eingestellt und danach mit Ethylacetat (50 ml) extrahiert. Das Ethylacetat wurde abgetrennt und bis zur Trockene eingeengt. Die Probe wurde wieder in Methanol (1 ml) für eine HPLC-MS-Analyse aufgelöst. Dies bestätigte die Produktion von 13-Cyclobutyl-Erythromycin B durch nicht-transformierte, nicht-rekombinante NRRL 2338, wie dies im Beispiel 7 für den genetisch manipulierten Stamm, der das avr-Beladungsmodul (NRRL 2338/pIG1-Konstrukt) enthält, beschrieben ist.
HPLC-Retentionszeit – Verfahren A – 22,3 Minuten
APCI-MS – (M+H)⁺ beobachtet bei m/e 744, erforderlich für C₃₉H₇₀NO₁₂ – 744
Beispiel 12 – Herstellung von 13-Cyclopropyl-Erythromycin B unter Verwendung von S. erythraea NRRL 2338
Die Kultur S. erythraea NRRL 2338 wurde in 50 ml Leitungswassermedium in einem 300-ml-Erlenmeyer-Kolben inokuliert. Nach einer 48-stündigen Inkubation bei 28 °C wurde dieser Kolben verwendet, um 50 ml des ERY-P-Mediums in einem 300-ml-Erlenmeyer-Kolben zu inokulieren. Die Kulturlösung wurde bei 28 °C inkubiert. Nach 24 Stunden wurde Cyclopropancarbonsäure (20 ml) zugegeben, und die Fermentation wurde 168 Stunden lang fortgesetzt. Danach wurde die gesamte Kulturlösung auf einen pH von 8,5 mit wässrigem Natriumhydroxid eingestellt und danach mit Ethylacetat (50 ml) extrahiert. Das Ethylacetat wurde abgetrennt und bis zur Trockene eingeengt. Die Probe wurde wieder in Methanol (1 ml) für eine HPLC-MS-Analyse aufgelöst. Dies bestätigte die Produktion von 13-Cyclopropyl-Erythromycin B durch nicht-transformierte, nicht-rekombinante NRRL 2338, wie dies im Beispiel 9 für den genetisch manipulierten Stamm, der das avr-Beladungsmodul (NRRL 2338/pIG1-Konstrukt) enthält, beschrieben ist.
HPLC-Retentionszeit – Verfahren A – 17,9 Minuten
APCI-MS – (M+H)⁺ beobachtet bei m/e 730, erforderlich für C₃₈H₆₈NO₁₂ – 730
Beispiel 13a – Herstellung von 13-Cyclobutyl-Erythromycin A unter Verwendung von S. erythraea 2338/pIG1
Die Kultur S. erythraea NRRL 2338/pIG1 wurde in 50 ml Leitungswassermedium in 3 × 300-ml-Erlenmeyer-Kolben inokuliert. Nach einer 72-stündigen Inkubation bei 28 °C wurde jeder Kolben verwendet, um 3,5 l ERY-P-Medium in 3 × 5-I-Miniglasgefäßen zu inokulieren. Die Kulturlösung wurde bei 28 °C mit einer Belüftungsrate von 2,0 l/min inkubiert und mit 500 U/min gerührt. Zwei Gaben von Cyclobutancarbonsäure (1,4 ml) wurden nach 24 Stunden und nach 48 Stunden zugegeben, und die Fermentierung wurde 168 Stunden lang fortgesetzt. Danach wurde die gesamte Kulturlösung auf einen pH-Wert von pH 8,5 mit wässrigem Natriumhydroxid eingestellt und danach mit Ethylacetat (20 l) extrahiert. Der Ethylacetat-Extrakt wurde bis zur Trockene eingeengt und ergab das Rohprodukt als Gummi (9,2 g). Ein Teil (2,3 g) dieses Extrakts wurde in Ethylacetat (12,5 ml) aufgelöst und zu einer zuvor gepackten Kieselgel-Kassette (10 g; International Sorbent Technology) zugegeben, die zuvor mit Ethylacetat (10 ml) konditioniert worden war. Die Säule wurde sequentiell mit Ethylacetat (4 × 24 ml); Dichlormethan:Methanol (9:1) (1 × 24 ml); Dichlormethan:Methanol (8:2) (2 × 24 ml), Dichlormethan:Methanol:Ammoniak (80:19:1) (1 × 24 ml); Methanol (1 × 24 ml) eluiert. Die Fraktionen 6-8 wurden vereinigt und zur Trockene eingedampft.
Diese Fraktionierung wurde auf den verbleibenden 4,7 g des Gummis wiederholt. Dieser Anreicherungsschritt ergab 415 mg eines Feststoffs, der das erwünschte Produkt enthielt. Dieses wurde weiters mittels präparativer Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer Zorbax-7-μm-ODS-Säule (21,2 mm × 25 cm) unter Verwendung einer mobilen Phase aus Acetonitril:0,05 M Ammoniumacetat (3:1) mit 8 ml/min gereinigt. Fraktionen, die das Produkt von Interesse enthielten, aus fünf getrennten Injektionen wurden vereinigt und zur Trockene eingedampft, bevor die präparative Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer Beckman-5-μm-Ultrasphere-ODS-Säule (10 mm × 25 cm) unter Verwendung eines Gradienten der mobilen Phase aus Acetonitril:0,05 M Ammoniumacetat (28:72) bis Acetonitril:0,05 M Ammoniumacetat (50:50) über 18 Minuten (Durchflussrate 4 ml/min) wiederholt wurde. Fraktionen, die das Produkt von Interesse enthielten, wurden vereinigt und zur Trockene eingedampft, um einen reinen weißen Feststoff (4 mg) zu ergeben. Die Struktur des Produkts wurde mittels MS und NMR-Spektroskopie wie folgt bestätigt:
HPLC-Retentionszeit – Verfahren A – 17,5 Minuten
APCI-MS – (M+H)⁺ beobachtet bei m/e 760, erforderlich für C₃₉H₇₀NO₁₃ – 760
NMR-Daten:
Beispiel 13b – Herstellung von 13-Cyclobutyl-Erythromycin A unter Verwendung von S. erythraea 2338/pND30
Ein ähnliches Experiment wie Beispiel 13a, wobei die Kultur S. erythraea NRRL 2338/pND30 verwendet wird, erzeugt die im Beispiel 13a veranschaulichte Verbindung.
Beispiel 14a – Herstellung von 13-Cyclopropyl-Erythromycin A unter Verwendung von S. erythraea NRRL 2338/pIG1
Sechs 2.800-ml-Fernbach-Kolben wurden mit S. erythraea NRRL 2338/pIG1 inokuliert. Jeder Kolben enthielt 1 l Leitungswassermedium mit 50 mg Thiostrepton, die je dem Kolben zugegeben wurden. Nach 24-stündiger Inkubation bei 28 °C wurden 200 ppm Cyclopropancarbonsäure zu jedem Kolben zugegeben. Die Kolben wurden 90 Stunden lang inkubiert und in einer sterilen 8-I-Aspiratorflasche zusammengefügt. Die Aspiratorflasche wurde verwendet, um 314 Gallonen ERY-P-Mediium in einem 500 Gallonen fassenden Pilotgefäß zu inokulieren. Die Kulturlösung wurde inkubiert, bei 27 bis 29 °C laufen gelassen, wobei der pH in einem Bereich von 6,7 bis 7,4 lag, mit einer Belüftungsrate von 20 Standard-ft³/min und Rühren mit 175 U/min. Cyclopropancarbonsäure (200 mg/l) wurde nach 33 Stunden, 81 Stunden und 117 Stunden zugegeben. Die Fermentation wurde 198 Stunden lang fortgesetzt. Danach wurde die gesamte Kulturlösung über ein 0,2-μm-Keramikfilter (30 ft², U.S. Filter) filtriert. Das Filtrat wurde auf einer XAD-16-Harzsäule (12 l; Rohm und Haas) aufgebracht. Die Harzsäule wurde danach mit Ethylacetat (60 l) eluiert. Das Ethylacetat wurde zu einem Gummi (302 g) eingeengt, wozu 2 l Methylenchlorid zugegeben wurden. Die resultierende Methylenchloridlösung wurde mit 8 l 250 mM Natriumbicarbonat-Puffer, pH 9, gewaschen. Die Erythromycin-reiche Methylenchlorid-Schicht wurde getrennt, zu einem Gummi (200 g) eingedampft und danach in 40 % Methanol (10 l) resuspendiert, das auf eine CG-161-Harzsäule (9 l; Toso Haas) aufgebracht wurde. Die Harzsäule wurde daraufhin mit 40 % Methanol (30 l) gewaschen und nachfolgend mit 75 % Methanol (8 × 10 l) und unverdünntem Methanol (3 × 10 l) eluiert. Die 75-%-Methanolfraktionen 5 bis 8, die das Produkt von Interesse enthielten, wurden vereinigt und zu 3,2 l eingedampft. Das Konzentrat wurde auf einen pH von 9 eingestellt und zu 0,95 l Methylenchlorid zugegeben. Die Methylenchlorid-Phase wurde abgetrennt und eingedampft, um 12,4 g eines Gummis zu ergeben. Ein Teil des Gummis (6 g) wurde weiter mittels präparativer Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer 10-μm-Kromasil-C18-HPLC-Säule (75 mm × 25 cm) unter Verwendung einer mobilen Phase aus Methanol:0,05 M Ammoniumacetat mit isokratischer 0,1 % Trifluoressigsäure (50:50) mit einer Durchflussrate von 215 ml/min gereinigt. Die Fraktionen, die das Produkt von Interesse enthielten, wurden vereinigt (230 ml), zu einem Konzentrat (110 ml) eingedampft, mit Natriumhydroxid auf einen pH von 9 eingestellt und in Methylenchlorid (50 ml) extrahiert. Die Methylenchlorid-Phase wurde abgetrennt und bis zur Trockene eingedampft, um 630 mg eines teilweise reinen Produkts zu ergeben. Ein anderer Teil des Gummis (1 g) wurde weiter mittels präpa rativer Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer 10-μm-MetaChem-Inertsil-C8-Säule (50 mm × 25 cm) unter Verwendung einer mobilen Phase aus Acetonitril:0,05 M Ammoniumacetat mit 0,1 % Trifluoressigsäuregradienten (20:80) bis (25:75) über 50 Minuten mit einer Durchflussrate von 125 ml/min gereinigt. Fraktionen, welche die Verbindung von Interesse enthielten (28-46 Minuten), wurden vereinigt, mit Natriumbicarbonat gesättigt und mit Methylenchlorid extrahiert. Das Methylenchlorid wurde abgetrennt und bis zur Trockene eingedampft, um 361 mg eines teilweise reinen Produkts zu ergeben. Ein Teil dieser teilweise reinen Materialien wurde weiters mittels Umkehrphasen-HPLC gereinigt, wie z.B. mittels 10-μm-Phenomenex-Prodigy-C18-Säule (50 × 250 mm) unter Verwendung einer mobilen Phase aus Methanol:0,05 M Ammoniumacetat mit isokratischer 0,1 % Trifluoressigsäure (50:50) mit einer Durchflussrate von 100 ml/min. Fraktionen, die das Produkt von Interesse (27-31 Minuten) enthielten, wurden vereinigt, mit Natriumbicarbonat gesättigt und mit Methylenchlorid extrahiert. Das Methylenchlorid wurde abgetrennt und bis zur Trockene eingedampft, um ein teilweise reines Produkt zu ergeben. Das Material wurde weiter mittels präparativer Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung von 10-μm-Phenomenex-Prodigy-C18-Säule (50 mm × 25 cm) unter Verwendung einer mobilen Phase aus Methanol:0,05 M Ammoniumacetat mit isokratischer 0,1 % Trifluoressigsäure (48:52) mit einer Durchflussrate von 100 ml/min gereinigt. Die Fraktionen, die das Produkt von Interesse (41-45 min) enthielten, wurden vereinigt, mit Natriumbicarbonat gesättigt und mit Methylenchlorid extrahiert. Das Methylenchlorid wurde abgetrennt und bis zur Trockene eingedampft, um 13-Cyclopropyl-Erythromycin A als einen Feststoff (20 mg) zu ergeben. Die Struktur des Produkts wurde mittels MS und NMR-Spektroskopie (Bruker DMX 500 MHz Spektrometer) wie folgt bestätigt:
HPLC-Retentionszeit – Verfahren B – 5,6 Minuten
APCI-MS – (M+H)⁺ beobachtet bei m/e 746, erforderlich für C₃₈H₇₀NO₁₃ – 746
NMR-Daten:
Beispiel 14b – Herstellung von 13-Cyclopropyl-Erythromycin A unter Verwendung von S. erythraea NRRL 2338/pND30
Ein ähnliches Experiment wie Beispiel 14a, wobei die Kultur S. erythraea NRRL 2338/pND30 verwendet wurde, erzeugt die im Beispiel 14a veranschaulichte Verbindung.
Beispiel 15a – Herstellung von 13-(3-Thienyl)-Erythromycin B unter Verwendung von S. erythraea NRRL 2338/pIG1
Die Kultur S. erythraea NRRL 2338/pIG1 wurde in 50 ml Leitungswassermedium in einem 300-ml-Erlenmeyer-Kolben inokuliert. Nach einer 48-stündigen Inkubation bei 28 °C wurden 5 ml dieses Impfmaterials verwendet, um 50 ml des ERY-P-Mediums in einem 300-ml-Erlenmeyer-Kolben zu inokulieren. Die Kulturlösung wurde bei 28 °C inkubiert. Nach 24 Stunden wurde N-Acetylcysteaminthioester der 3-Thiophencarbonsäure (20 mg in 0,5 ml Methanol) filtersterilisiert zugegeben, und die Fermentation wurde 168 Stunden lang fortgesetzt. Danach wurde die gesamte Kulturlösung auf einen pH von 8,5 mit wässrigem Natriumhydroxid eingestellt und danach mit Ethylacetat (50 ml) extrahiert. Das Ethylacetat wurde abgetrennt und bis zur Trockene eingeengt. Die Probe wurde wieder in Methanol (1 ml) für eine HPLC-MS-Analyse aufgelöst. Dies bestätigte die Produktion von 13-(3-Thienyl)-Erythromycin B.
HPLC-Retentionszeit – Verfahren A – 20,0 Minuten
APCI-MS – (M+H)⁺ beobachtet bei m/e 772, erforderlich für C₃₉H₆₆NO₁₂S – 772
Beispiel 15b – Herstellung von 13-(3-Thienyl)-Erythromycin B unter Verwendung von S. erythraea NRRL 2338/pND30
Ein ähnliches Experiment wie Beispiel 15a, wobei die Kultur S. erythraea NRRL 2338/pND30 verwendet wurde, erzeugt die im Beispiel 15a veranschaulichte Verbindung
Beispiel 16 – Herstellung von 6-Desoxy-13-cyclopropyl-Erythromycin B unter Verwendung von S. erythraea NRRL 18643
Die Kultur S. erythraea NRRL 18643, eine eryF-Mutante von S. erythraea (Science 252, 114, 5. April 1991), wurde in 1 l Leitungswassermedium in einem 2,8-I-Fernbach-Kolben inokuliert. Cyclopropancarbonsäure (200 ml) wurde nach 24-stündiger Inkubation bei 29 °C unter Rühren mit 200 U/min zugegeben. Nach insgesamt dreitägiger Inkubation wurde ein Kolben verwendet, um 8 l des ergänzten ERY-P-Mediums (60 g/l Cerelose, 30 g/l Nutrisoy-MehI, 3 g/l (NH₄)₂SO₄, 5 g/l NaCl, 6 g/l Cornsteep-Feststoffe, 0,5 g/l MgSO₄ und 1 ml/l P2000) in 14-I-Fermentorglasbehältern zu inokulieren. Die Kulturlösung wurde bei 28 °C mit einer Belüftungsrate von 8 l/min inkubiert, mit 800 U/min gerührt und auf einem pH-Wert zwischen 6,9 und 7,3 mit NaOH oder H₂SO₄ (15 %) gehalten. Cyclopropancarbonsäure (1,6 ml) wurde nach 24 und 48 Stunden zugegeben. Die Fermentation, die zweifach durchgeführt wurde, wurde nach einer Inkubationszeit von insgesamt 163 Stunden geerntet. Der pH der gesamten Kulturlösung wurde mit Natriumhydroxid auf 9 eingestellt, und die Kulturlösung wurde mit Ethylacetat (16 l) extrahiert. Das Ethylacetat wurde in einer 20-I-Buchi-Rotationsverdampfungseinheit zu einem Öl eingeengt. Das Öl wurde wieder in 500 ml Methylenchlorid aufgelöst. 500 ml Wasser wurden zu dieser Flüssigkeit zugegeben, und der pH der wässrigen Phase wurde mit 10 % Ammoniumhydroxid auf 9 eingestellt. Nachdem kräftig geschüttelt worden war, wurde die Methylenchlorid-Phase gesammelt und in einem 1-I-Rotationsverdampfungskolben eingedampft, um 11,0 g eines öligen Rests zu ergeben. Dieses Material wurde mit 250 ml einer Lösung aus Methanol:Wasser 4:6 aufgelöst und auf eine 80-ml-CG-161-Harzsäule (Toso Haas) aufgebracht. Die Säule wurde mit 350 ml einer Lösung aus Methanol:Wasser 4:6 gewaschen. Die Säule wurde daraufhin kurz mit 8 ml/min mit einer Lösung aus Methanol:Wasser 7:3 gewaschen, bis die farbigen Unreinheiten sich aus der Säule zu eluieren begannen (etwa 2 Bettvolumina). Danach wurde ein einstündiger Gradientenlauf initiiert, wobei die Konzentration des Methanols von 70 % zu 100 % über einen Zeitrahmen von 1 Stunde mit einer Durchflussrate von 8 ml/min geändert wurde. Die Fraktion, die das Produkt von Interesse enthielt, wurde bis zur Trockene eingedampft und weiters auf einer 10-μm-Kromasil-C18-Umkehrphasen-HPLC-Säule (50 mm × 25 cm) unter Verwendung einer mobilen Phase aus Aceto nitril:Puffer, der aus 0,01 M Ammoniumacetat, 0,02 % Trifluoressigsäure und 26 % Acetonitril besteht, (5:95) für 50 Minuten mit einer Durchflussrate von 120 ml/min gereinigt. Diesem folgte ein linearer Gradient von (5:95) bis (33:67) über die nächsten 40 Minuten. Fraktionen, die das Produkt von Interesse enthielten, wurden vereinigt (530 ml), auf einen pH von 9 mit 10 % Ammoniumhydroxid eingestellt und in Methylenchlorid (400 ml) extrahiert. Die Methylenchlorid-Phase wurde abgetrennt und bis zur Trockene eingedampft, um gereinigtes 6-Desoxy-13-cyclopropyl-Erythromycin B (12 mg) zu ergeben. Die Struktur des Produkts wurde mittels MS bestätigt.
HPLC-Retentionszeit – Verfahren B – 21,4 Minuten
APCI-MS – (M+H)⁺ beobachtet bei m/e 714, erforderlich für C₃₈H₆₈NO₁₂ – 714
Beispiel 17 – Herstellung von 6-Desoxy-13-propyl-Erythromycin B unter Verwendung von S. erythraea NRRL 18643
S. erythraea NRRL 18643 wurde von einem 3-Tage-Patch auf _YPD-Agar (0,5 Difco Hefeextrakt, 0,5 % Difco Bacto Pepton, 0,25 % Dextrose, 0,5 % MOPS, 1,7 Difco Basto Agar, pH eingestellt auf 7,0) in 25 ml _YPD-Kulturlösung (0,5 % Difco Hefeextrakt, 0,5 % Difco Bacto Pepton, 0,25 % Dextrose, 0,5 % MOPS, pH auf 7,0 eingestellt) in einem 250-ml-Erlenmeyer-Kolben inokuliert. Der Kolben wurde mit 225 U/min und bei 29 °C 48 Stunden lang inkubiert. 2,5 ml wurden in 25 ml ERY-P-Medium (5 % Dextrose, 3 % Nutrisoy-Mehl, 0,3 % (NH₄)₂SO₄, 0,5 % NaCl, 0,6 % CaCO₃, pH auf 7,0 eingestellt) inokuliert und bei 225 U/min und 29 °C insgesamt 6 Tage lang inkubiert. Nach 24, 72 bzw. 120 Stunden wurde zum Kolben Buttersäure (400 ppm, 400 ppm bzw. 200 ppm) zugegeben. Der pH der gesamten Kulturlösung wurde daraufhin unter Verwendung von 1N NaOH auf 9,1 eingestellt. Die Probe wurde zweimal mit einem gleichen Volumen Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatphasen wurden unter Stickstoff (50 °C Wasserbad) bis zur Trockene eingeengt, danach in 1,0 ml Methanol für die HPLC-MS-Analyse resuspendiert. Dies bestätigte die Produktion von 6-Desoxy-13-propyl-Erythromycin B.
HPLC-Retentionszeit – Verfahren C – 23,5 Minuten
APCI-MS – (M+H)⁺ beobachtet bei m/e 716, erforderlich für C₃₈H₇₀NO₁₁ – 716
Beispiel 18 – Evaluierung der antibakteriellen Aktivität
Es wurde eine antibakterielle In-Vitro-Untersuchung in Mikrotiter durchgeführt und gemäß Richtlinien der Performance Standards for Antimicrobial Disk Suceptibility Tests (6. Ausgabe, angenommener Standard), veröffentlicht von The National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), interpretiert. Es wurden minimale hemmende Konzentrationen (MICs) gegenüber verschiedenen Bakterien erhalten. So lieferte z.B. Staphylococcus aureus 80CR5 (Makrolid-empfänglicher Stamm) Werte, die im Allgemeinen im Bereich von ≤ 0,1 bis 1,56 μg/ml lagen.

Claims

Verbindung der Formel 1:
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon , worin: R₁ (i) eine α-verzweigte C₃-C₈-Alkyl-, -Alkenyl-, -Alkinyl-, -Alkoxyalkyl- oder -Alkylthioalkylgruppe ist, die gegebenenfalls mit einer oder mehreren Hydroxylgruppen substituiert ist; (ii) eine C₅-C₈-Cycloalkylgruppe ist, worin die Alkylgruppe eine α-verzweigte C₂-C₅-Alkylgruppe ist; (iii) ein C₃-C₈-Cycloalkyl- oder C₅-C₈-Cycloalkenylgruppe ist, die gegebenenfalls mit einer Hydroxyl- oder einer oder mehreren C₁-C₄-Alkylgruppen oder Halogenatomen substituiert ist; (iv) ein 3- bis 6-gliedriger, Sauerstoff oder Schwefel enthaltender heterozyklischer Ring ist, der gesättigt oder vollständig oder teilweise ungesättigt sein kann und gegebenenfalls mit einer oder mehreren C₁-C₄-Alkylgruppen oder Halogenatomen substituiert ist; (v) Phenyl ist, das gegebenenfalls mit zumindest einem Substituenten substituiert ist, der aus C₁-C₄-Alkyl-, C₁-C₄-Alkoxy- und C₁-C₄-Alkylthiogruppen, Halogenatomen, Hydroxylgruppen, Trilfuormethyl und Cyano ausgewählt ist; oder (vi) eine Gruppe der nachstehenden Formel (a) ist:
worin X = O, S oder -CH₂- ist, a, b, c und d jeweils unabhängig voneinander O bis 2 sind und a+b+c+d ≤ 5 ist; R₂ = H oder OH ist; R₃ bis R₅ jeweils unabhängig voneinander H, CH₃ oder CH₂CH₃ sind; R₆ = H oder OH ist; und R₇ = H, CH₃ oder CH₂CH₃ ist; R₈ = H oder Desosamin ist; R₉ = H, CH₃ oder CH₂CH₃ ist; R₁₀ = OH, Mycarose (R₁₃ = H) oder Cladinose (R₁₃ = CH₃) ist; R₁₁ = H ist; oder R₁₀ = R₁₁ = O ist; und R₁₂ = H, CH₃ oder CH₂CH₃ ist; oder eine beliebige der oben definierten Verbindungen, die modifiziert ist, indem eine oder mehrere der Gruppen an den Ringpositionen 3, 5, 7, 9 und 11 durch eine andere Gruppe ersetzt ist bzw. sind, die aus >C=O, >CHON, =CH- und -CH₂- ausgewählt ist.
Verbindung der Formel 1 nach Anspruch 1, worin R₁ eine C₃-C₆-Cycloalkyl- oder -Cycloalkenylgruppe ist, die gegebenenfalls mit einer oder mehreren Hydroxylgruppen oder einer oder mehreren C₁-C₄-Alkylgruppen substituiert ist.
Verbindung nach Anspruch 2, worin R₁ Cyclopropyl ist.
Verbindung nach Anspruch 2, worin R₁ Cyclobutyl ist.
Verbindung nach Anspruch 2, worin R₁ Cyclopentyl ist.
Verbindung nach Anspruch 2, worin R₁ Cyclohexyl ist.
Verbindung nach Anspruch 1, worin R₁ eine α-verzweigte C₃-C₈-Alkyl-, -Alkenyl-, -Alkinyl-, -Alkoxyalkyl- oder -Alkylthioalkylgruppe ist.
Verbindung nach Anspruch 7, worin R₁ Isopropyl ist.
Verbindung nach Anspruch 7, worin R₁ sec-Butyl ist.
Verbindung nach Anspruch 7, worin R₁ 2-Buten-2-yl, 2-Penten-2-yl oder 4-Methyl-2-penten-2-yl ist.
Verbindung nach Anspruch 7, worin R₁ 1-Methylthioethyl ist.
Verbindung nach Anspruch 1, worin R₁ ein 5- oder 6-gliedriger, Sauerstoff oder Schwefel enthaltender heterozyklischer Ring ist, der gegebenenfalls mit einer oder mehreren Hydroxylgruppen oder C₁-C₄-Alkylgruppen oder Halogenatomen substituiert ist.
Verbindung nach Anspruch 12, worin R₁ 3-Thienyl ist.
Verbindung nach Anspruch 12, worin R₁ 3-Furanyl ist.
Verbindung nach Anspruch 12, worin R₁ Phenyl ist.
Verbindung nach Anspruch 1, worin R₁ eine Gruppe der Formel (a) ist, worin a und b = 0 sind, c und d = 1 sind und X = -CH₂- ist.
Verbindung nach Anspruch 1, worin R₁ eine Gruppe der Formel (a) ist, worin a und b = 0 sind, c = 1 ist, d = 2 ist und X = -CH₂- ist.
Verbindung nach Anspruch 1, worin R₁ eine Gruppe der Formel (a) ist, worin a und b = 0 sind, c und d = 1 sind und X = 0 ist.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel 1 nach Anspruch 1, umfassend das Fermentieren eines Organismus, der aufgrund der Tatsache, dass er eine Hybrid-Polyketid-Synthase ("PKS") enthält, worin das Beladungsmolekül das Beladungsmodul der Avermectin produzierenden PKS von Streptomyces avermitilis ist, zur Produktion von Erythromycin fähig ist, in Gegenwart einer Carbonsäure der Formel R₁CO₂H, worin R₁ wie in Anspruch 1 definiert ist, oder eines Salzes, Esters oder Amids davon oder eines oxidativen Vorläufers davon sowie das Isolieren der Verbindung der Formel 1.
Verfahren nach Anspruch 19, worin der Organismus Saccharopolyspora erythraea ist, der gegebenenfalls ein wirksam integriertes Plasmid enthält, das zum Dirigieren der Biosynthese von Verbindungen der Formel 1 fähig ist.
Verfahren nach Anspruch 20, worin der Organismus ein solches Plasmid enthält, das ein Typ-II-PKS-Promotor/Aktivator-Gen enthält.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel 1 nach Anspruch 1, umfassend das Fermentieren von Saccharopolyspora erythraea, ausgewählt aus den Stämmen NRLL 2338, 18643 und 21484, in Gegenwart einer Carbonsäure der Formel R₁CO₂H, worin R₁ wie in Anspruch 1 definiert ist, oder eines Salzes, Esters oder Amids davon oder eines oxidativen Vorläufers davon, sowie das Isolieren der Verbindung der Formel 1.
Verfahren nach Anspruch 22, worin der Organismus ein wirksam integriertes Plasmid enthält, das zum Dirigieren der Biosynthese von Verbindungen der Formel 1 fähig ist, wobei das Plasmid den actI-Promotor und sein zugehöriges Aktivatorgen actII-orf4 enthält.
Verfahren nach Anspruch 22, worin der Organismus ein solches wirksam integriertes Plasmid enthält, das aus pAVLD, pIG1, pND30, pCJR26, pCJR49, pC-AT12 und pc-ATX ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 22, worin der Organismus S. erythraea ERMD1, S. erythraea NRRL 2338/pIG1 oder S. erythraea NRRL 2338/pND30 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung nach Anspruch 1 in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 18 bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung einer bakteriellen Infektion oder eines Leidens in Zusammenhang mit einer bakteriellen Infektion oder einer protozoischen Infektion bei einem Säugetier, Fisch oder Vogel.
Verwendung nach Anspruch 27, worin das Medikament zur Behandlung einer bakteriellen Infektion bei einem Säugetier, Fisch oder Vogel dient.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 zur Verbesserung eines Leistungseffekts, ausgewählt aus der Gewichtszunahme oder Futterverwertung bei einem Säugetier, Fisch oder Vogel oder der Milchleistung bei einem Säugetier.