KR20240014756A - 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자 및 그 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 닭뼈를 증류수로 가열하고, 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 건조하여 얻어진 닭뼈유래 수산화인회석을, 증류수에 용해하여, 얻어진 닭뼈유래 수산화인회석 용해액과; 키토산을 아세트산에 녹여 얻어진 아세트산 용액;을 서로 혼합하고 교반하여 얻어진 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액;에 에리트로마이신(Ery)을 가하고 트리폴리포스페이트(TPP)를 첨가하여 교반하고, 원심분리하여 수집하고 동결건조하여 얻어진 것을 특징으로 하는 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자에 관한 것이다.
Description
본 발명은 나노입자에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 닭뼈를 증류수로 가열하고, 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 건조하여 얻어진 닭뼈유래 수산화인회석을, 증류수에 용해하여, 얻어진 닭뼈유래 수산화인회석 용해액과; 키토산을 아세트산에 녹여 얻어진 아세트산 용액;을 서로 혼합하고 교반하여 얻어진 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액;에 에리트로마이신(Ery)을 가하고 트리폴리포스페이트(TPP)를 첨가하여 교반하고, 원심분리하여 수집하고 동결건조하여 얻어진 것을 특징으로 하는 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자에 관한 것이다.
골수염은 미생물 감염에 의해 발생하는 급성 또는 만성 염증으로 뼈, 관절 및 뼈 퇴행에 심한 통증을 유발한다. 말초혈관질환, 당뇨병, 열악한 치열, 면역저하 등 관련 질환이 있는 고령자는 미생물 감염과 관련된 빈번한 외과적 시술로 인해 골수염의 위험이 높다. 특히 이식편의 증가로 임플란트 관련 감염이 증가하고 있다. 전 세계적으로 매년 100만 건 이상의 인공 삽입물이 시행되어 골수염을 유발할 수 있는 미생물 감염이 발생한다. 세균, 마이코박테리아, 진균과 같은 병원성 미생물은 세균의 부착소 상호작용을 통해 집락체를 통해 감염을 일으키고 뼈와 그 대체물(콜라겐, 라미닌, 뼈 시알로당단백질, 피브로넥틴)으로 퍼질 수 있다. 특히, 노년층의 만성 골수염의 3분의 2가 황색포도상구균 감염에 의해 발생한다. 또한 carbapenemase를 생성하는 Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa 등의 병원성 미생물이 골 감염의 주요 원인균이다. 골수염의 치료를 위해서는 외과적 괴사조직 절제술과 항균제 요법, 보조 요법(고압산소 요법)이 권장된다. 급성 골수염의 치료에는 정맥내 항생제 치료가 적절하다. 그러나, 정맥 내 및 경구 투여와 같은 항생제의 통상적인 전신 전달은 신장 및 간 합병증을 유발할 수 있다. 따라서 다른 합성 및/또는 생체 물질을 사용하여 전신 독성을 초과하지 않고 장기간 항생제의 서방성을 유지할 수 있는 전달 시스템을 통해 항생제를 투여하는 방법에 대한 선행 연구가 연구되어 왔다. 또한 골수염으로 인한 퇴행성 골의 치료는 골 재생 물질(고분자, 세라믹, 금속, 복합재)과 항생제 치료를 병행하여 치료하는 것이 누적적 접근법으로 고려되고 있다.
수산화인회석(Ca10(PO4)6(OH)2)은 칼슘, 인산염 및 인회석 계열의 분자 중 하나로 구성된 천연 광물이다. 수산화인회석(Hydroxyapatite, HAP)은 뼈와 치아 무척추동물의 주성분으로 생체적합성이 우수하고 골 재생 촉진 능력이 탁월하다. 따라서 HAP는 약물 전달 시스템(DDS) 개발에 활용할 수 있는 잠재적인 후보다. HAP는 화학적으로 합성되거나 천연 자원(포유류, 수생 및 해양 생물, 식물 및 조류)에서 추출될 수 있다. 합성 HAP와 비교하여 천연 HAP는 인간 뼈의 화학적 조성을 모방하는 Na+, Zn2+, Mg2+, K+, Si2+, Ba2+, F- 및 CO32와 같은 풍부한 미량 원소를 포함한다. 이러한 천연 HAP의 미량 원소는 뼈 재생에 필수적이며 뼈 형성 과정을 가속화한다.
HAP의 생물학적 기능은 다른 복합 재료와의 혼합을 통해 뼈 조직 공학에서 향상되었다. 이 중 키토산은 근골격계 질환, 골수염 및 탈회 치료를 위한 HAP 복합 재료 제조에 유망하다. 키토산은 생분해성, 소수성 및 생체 적합성으로 인해 조직 공학 응용 분야에서 더 많은 관심을 받았다. 뼈 감염을 실질적으로 치료하기 위해 다른 유형의 항생제가 단독으로 사용되거나 다른 고분자 치료제와 함께 사용된다.
치료 방법은 감염의 유형과 원인 유기체에 따라 다르다. 항생제 중 에리트로마이신(Erythromycin, Ery)은 세균의 단백질 합성 억제 활성이 높아 증식을 억제하여 각종 세균 감염의 치료에 널리 사용되고 있다. 동물 연구에 따르면 에리트로마이신과 커큐민 병용 치료는 S. aureus를 실질적으로 억제하고 전염증성 사이토카인(TNF- 및 IL-6)을 하향 조절한다.
종래의 기술들은 골수염 등, 뼈 관련 질환에 있어서, 에리트로마이신(Erythromycin, Ery)을 사용하였으나, 약물 방출 시간이 최적화되지 못하였으며, 항균 활성이 부족하여, 골수염 치료에 불리하다는 문제점이 있었다. 따라서, 표적 부위에 대한 약물 전달 시스템에 대한 필요성이 커지고 있는 추세다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 닭뼈를 증류수로 가열하고, 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 건조하여 얻어진 닭뼈유래 수산화인회석을, 증류수에 용해하여, 얻어진 닭뼈유래 수산화인회석 용해액과; 키토산을 아세트산에 녹여 얻어진 아세트산 용액;을 서로 혼합하고 교반하여 얻어진 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액;에 에리트로마이신(Ery)을 가하고 트리폴리포스페이트(TPP)를 첨가하여 교반하고, 원심분리하여 수집하고 동결건조하여 얻어진 것을 특징으로 하는 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자를 제공하는데 목적이 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 닭뼈를 증류수로 가열하고, 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 건조하여 얻어진 닭뼈유래 수산화인회석을, 증류수에 용해하여, 얻어진 닭뼈유래 수산화인회석 용해액과; 키토산을 아세트산에 녹여 얻어진 아세트산 용액;을 서로 혼합하고 교반하여 얻어진 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액;에 에리트로마이신(Ery)을 가하고 트리폴리포스페이트(TPP)를 첨가하여 교반하고, 원심분리하여 수집하고 동결건조하여 얻어진 것을 특징으로 하는 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs)를 제공한다.
또한, 상기 닭뼈는 1N HCl용액에 12 ~ 36시간 담궈 증류수로 세척하고, 1M NaOH 용액에 12 ~ 36시간 담궈 증류수로 세척하여 전처리된 것을 이용하며, 상기 닭뼈유래 수산화인회석은, 전처리된 닭뼈를 60 ~ 100℃의 온도로 30분 ~ 2시간 동안 증류수에서 가열하여 추출하고, 10000 ~ 14000rpm의 속도로 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 12 ~ 36시간 건조하고, 400 ~ 800℃ 머플로에서 3 ~ 7시간 동안 5℃/min의 상승 가열 속도로 가열하여 얻어진 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 닭뼈유래 수산화인회석 용해액은 상기 닭뼈유래 수산화인회석을 1 ~ 3 mg/mL의 농도가 되도록 증류수에 용해하여 제조된 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 아세트산 용액은 키토산을 1 ~ 3 mg/mL의 농도가 되도록 0.1 ~ 2% 아세트산 용액에 용해하여 제조된 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액은 상기 닭뼈유래 수산화인회석 용해액과, 상기 아세트산 용액을 혼합하고 자기교반기를 이용하여 1 ~ 3시간 동안 교반하여 제조된 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs)는 상기 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액에 에리트로마이신(Ery)을 가하고 1mL의 트리폴리포스페이트(TPP)를 첨가하고 1 ~ 3시간 동안 교반하여 형성되며, 13000 ~ 17000rpm의 속도로 원심분리하여 수집하고 -50℃의 온도에서 1 ~ 3일간 동결건조한 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 닭뼈를 증류수로 가열하고, 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 건조하여 닭뼈유래 수산화인회석을 얻는 닭뼈유래 수산화인회석 제조단계(S10); 상기 닭뼈유래 수산화인회석 제조단계(S10)에서 얻어진 닭뼈유래 수산화인회석을 증류수에 용해하여 닭뼈유래 수산화인회석 용해액을 제조하는 닭뼈유래 수산화인회석 용해액 제조단계(S20); 키토산을 아세트산에 녹여 아세트산 용액을 제조하는 아세트산 용액 제조단계(S30); 상기 닭뼈유래 수산화인회석 용해액 제조단계(S20)에서 제조된 닭뼈유래 수산화인회석 용해액과, 상기 아세트산 용액 제조단계(S30)에서 제조된 아세트산 용액을 혼합하고 교반하여 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액을 제조하는 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액 제조단계(S40); 및, 상기 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액 제조단계(S40)에서 제조된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액에 에리트로마이신(Ery)을 가하고 트리폴리포스페이트(TPP)를 첨가하고 교반하여, 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs)를 형성하고, 원심분리하여 수집하고 동결건조하는, 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs) 제조단계(S50);를 포함하는 것을 특징으로 하는 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs)의 제조방법을 제공한다.
또한, 상기 닭뼈유래 수산화인회석 제조단계(S10)에서는, 닭뼈를 1N HCl용액에 12 ~ 36시간 담궈 증류수로 세척하고, 1M NaOH 용액에 12 ~ 36시간 담궈 증류수로 세척하는 전처리 과정을 거치며, 전처리된 닭뼈를 60 ~ 100℃의 온도로 30분 ~ 2시간 동안 증류수에서 가열하여 추출하고, 10000 ~ 14000rpm의 속도로 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 12 ~ 26시간 건조하고, 400 ~ 800℃ 머플로에서 3 ~ 7시간 동안 5℃/min의 상승 가열 속도로 가열하여 닭뼈유래 수산화인회석을 얻는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 닭뼈유래 수산화인회석 용해액 제조단계(S20)에서는, 상기 닭뼈유래 수산화인회석 제조단계(S10)에서 얻어진 닭뼈유래 수산화인회석을 1 ~ 3 mg/mL의 농도가 되도록 증류수에 용해하여 닭뼈유래 수산화인회석 용해액을 제조하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 아세트산 용액 제조단계(S30)에서는, 키토산을 1 ~ 3 mg/mL의 농도가 되도록 0.1 ~ 2% 아세트산 용액에 용해하여 아세트산 용액을 제조하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액 제조단계(S40)에서는, 닭뼈유래 수산화인회석 용해액 제조단계(S20)에서 제조된 닭뼈유래 수산화인회석 용해액과, 상기 아세트산 용액 제조단계(S30)에서 제조된 아세트산 용액을 혼합하고 자기교반기를 이용하여 1 ~ 3시간 동안 교반하여 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액을 제조하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs) 제조단계(S50)에서는, 상기 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액 제조단계(S40)에서 제조된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액에 에리트로마이신(Ery)을 가하고 1mL의 트리폴리포스페이트(TPP)를 첨가하고 1 ~ 3시간 동안 교반하여, 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs)를 형성하고, 13000 ~ 17000rpm의 속도로 원심분리하여 수집하고 -50℃의 온도에서 1 ~ 3일간 동결건조하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자는 닭뼈를 증류수로 가열하고, 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 건조하여 얻어진 닭뼈유래 수산화인회석을, 증류수에 용해하여, 얻어진 닭뼈유래 수산화인회석 용해액과; 키토산을 아세트산에 녹여 얻어진 아세트산 용액;을 서로 혼합하고 교반하여 얻어진 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액;에 에리트로마이신(Ery)을 가하고 트리폴리포스페이트(TPP)를 첨가하여 교반하고, 원심분리하여 수집하고 동결건조하여 얻어진 것으로, 항균 활성을 갖지며, 에리트로마이신(Ery)의 방출 시간 조절 등이 최적화되어, 뼈 관련 질환의 치료에 용이하다.
도 1은 닭 뼈에서 추출한 HAP의 FTIR 스펙트럼 그래프(a); 키토산(CS), 에리트로마이신(Ery) 및 CS-HAP-Ery(Ery-loaded CS-HAP NPs)의 FTIR 스펙트럼 그래프(b); 및, 닭 뼈에서 추출한 HAP, 키토산(CS) 및 CS-HAP-Ery(Ery-loaded CS-HAP NPs)의 XRD spectrum 그래프(c).
도 2는 Ery-loaded CS-HAP NPs의 TEM 현미경 사진(200nm)(a); Ery-loaded CS-HAP NPs의 TEM 현미경 사진(100nm)(b); Ery-loaded CS-HAP NPs의 원소 스펙트럼 그래프(c); 및, Ery-loaded CS-HAP NPs의 제타 크기 및 포텐셜 그래프(d, e).
도 3은 다양한 pH에서 Ery-loaded CS-HAP NPs로부터 에리트로마이신(Ery)의 누적 방출을 나타낸 그래프.
도 4는 상이한 농도의 Ery-loaded CS-HAP NPs(a는 Ery-loaded CS-HAP NPs 12.5㎍/mL, b는 Ery-loaded CS-HAP NPs 25㎍/mL, c는 Ery-loaded CS-HAP NPs 50㎍/mL) 및 Ery(d는 Ery 3025㎍/mL)의 다양한 박테리아에 대한 항균활성을 나타낸 사진.
도 5는 B. cereus 및 S. enterica에 의한 생물막 형성 억제에 대한 Ery-loaded CS-HAP NPs 및 Ery의 효과를 나타낸 사진(이때, (a) 및 (d)는 Control이고; (b) 및 (e)는 Ery-loaded CS-HAP NPs 처리; (c) 및 (f) ery 처리된 실험군며, 위쪽 화살표는 왼쪽에서 오른쪽으로 동일한 대상에 대한 더 높은 배율을 나타냄).
도 6은 용혈에 의한 나노입자의 생체적합성 측정 그래프(a) 및, egg CAM assay 사진(b).
도 7은 미세역가 분석에서 B. cereus(a) 및 S. enterica(b) 세포에 대한, 상이한 농도를 갖는 Ery-loaded CS-HAP NPs의 박테리아 성장 억제 활성을 나타낸 그래프.
도 2는 Ery-loaded CS-HAP NPs의 TEM 현미경 사진(200nm)(a); Ery-loaded CS-HAP NPs의 TEM 현미경 사진(100nm)(b); Ery-loaded CS-HAP NPs의 원소 스펙트럼 그래프(c); 및, Ery-loaded CS-HAP NPs의 제타 크기 및 포텐셜 그래프(d, e).
도 3은 다양한 pH에서 Ery-loaded CS-HAP NPs로부터 에리트로마이신(Ery)의 누적 방출을 나타낸 그래프.
도 4는 상이한 농도의 Ery-loaded CS-HAP NPs(a는 Ery-loaded CS-HAP NPs 12.5㎍/mL, b는 Ery-loaded CS-HAP NPs 25㎍/mL, c는 Ery-loaded CS-HAP NPs 50㎍/mL) 및 Ery(d는 Ery 3025㎍/mL)의 다양한 박테리아에 대한 항균활성을 나타낸 사진.
도 5는 B. cereus 및 S. enterica에 의한 생물막 형성 억제에 대한 Ery-loaded CS-HAP NPs 및 Ery의 효과를 나타낸 사진(이때, (a) 및 (d)는 Control이고; (b) 및 (e)는 Ery-loaded CS-HAP NPs 처리; (c) 및 (f) ery 처리된 실험군며, 위쪽 화살표는 왼쪽에서 오른쪽으로 동일한 대상에 대한 더 높은 배율을 나타냄).
도 6은 용혈에 의한 나노입자의 생체적합성 측정 그래프(a) 및, egg CAM assay 사진(b).
도 7은 미세역가 분석에서 B. cereus(a) 및 S. enterica(b) 세포에 대한, 상이한 농도를 갖는 Ery-loaded CS-HAP NPs의 박테리아 성장 억제 활성을 나타낸 그래프.
이하의 본 발명에 관한 상세한 설명들은 본 발명이 실시될 수 있는 실시 예이고 해당 실시 예의 예시로써 도시된 첨부 도면을 참조한다. 이들 실시 예는 당 업자가 본 발명의 실시에 충분하도록 상세히 설명된다. 본 발명의 다양한 실시 예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 여기에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 일 실시 예에 관련하여 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 다른 실시 예로 구현될 수 있다. 또한, 각각의 기재된 실시 예 내의 개별 구성요소의 위치 또는 배치는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 변경될 수 있음이 이해되어야 한다.
따라서 후술되는 상세한 설명은 한정적인 의미로서 취하려는 것이 아니며, 본 발명의 범위는 적절하게 설명된다면 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다. 도면에서 유사한 참조부호는 여러 측면에 걸쳐서 동일하거나 유사한 기능을 지칭한다.
본 발명에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
본 발명에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한, 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.
본 발명은 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs)를 제공한다.
본 발명에 따른 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs)는 닭뼈를 증류수로 가열하고, 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 건조하여 얻어진 닭뼈유래 수산화인회석을, 증류수에 용해하여, 얻어진 닭뼈유래 수산화인회석 용해액과; 키토산을 아세트산에 녹여 얻어진 아세트산 용액;을 서로 혼합하고 교반하여 얻어진 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액;에 에리트로마이신(Ery)을 가하고 트리폴리포스페이트(TPP)를 첨가하여 교반하고, 원심분리하여 수집하고 동결건조하여 얻어진 것을 특징으로 한다.
상기 닭뼈는 1N HCl용액에 12 ~ 36시간 담궈 증류수로 세척하고, 1M NaOH 용액에 12 ~ 36시간 담궈 증류수로 세척하여 전처리된 것을 이용하며, 상기 닭뼈유래 수산화인회석은, 전처리된 닭뼈를 60 ~ 100℃의 온도로 30분 ~ 2시간 동안 증류수에서 가열하여 추출하고, 10000 ~ 14000rpm의 속도로 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 12 ~ 36시간 건조하고, 400 ~ 800℃ 머플로에서 3 ~ 7시간 동안 5℃/min의 상승 가열 속도로 가열하여 얻어진 것이 적절하다.
보다 구체적으로, 상기 닭뼈는 1N HCl용액에 24시간 담궈 증류수로 세척하고, 1M NaOH 용액에 24시간 담궈 증류수로 세척하여 전처리된 것을 이용하며, 상기 닭뼈유래 수산화인회석은, 전처리된 닭뼈를 80℃의 온도로 1시간 동안 증류수에서 가열하여 추출하고, 12000rpm의 속도로 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 24시간 건조하고, 600℃ 머플로에서 4시간 동안 5℃/min의 상승 가열 속도로 가열하여 얻어진 것이 바람직하다.
상기 닭뼈유래 수산화인회석 용해액은 상기 닭뼈유래 수산화인회석을 1 ~ 3 mg/mL의 농도가 되도록 증류수에 용해하여 제조된 것이 적절하다.
보다 구체적으로, 상기 닭뼈유래 수산화인회석 용해액은 상기 닭뼈유래 수산화인회석을 2 mg/mL의 농도가 되도록 증류수에 용해하여 제조된 것이 바람직하다.
상기 아세트산 용액은 키토산을 1 ~ 3 mg/mL의 농도가 되도록 0.1 ~ 2% 아세트산 용액에 용해하여 제조된 것이 적절하다.
보다 구체적으로, 상기 아세트산 용액은 키토산을 2 mg/mL의 농도가 되도록 1% 아세트산 용액에 용해하여 제조된 것이 바람직하다.
상기 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액은 상기 닭뼈유래 수산화인회석 용해액과, 상기 아세트산 용액을 혼합하고 자기교반기를 이용하여 1 ~ 3시간 동안 교반하여 제조된 것이 적절하다.
보다 구체적으로, 상기 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액은 상기 닭뼈유래 수산화인회석 용해액과, 상기 아세트산 용액을 혼합하고 자기교반기를 이용하여 2시간 동안 교반하여 제조된 것이 바람직하다.
상기 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs)는 상기 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액에 에리트로마이신(Ery)을 가하고 1mL의 트리폴리포스페이트(TPP)를 첨가하고 1 ~ 3시간 동안 교반하여 형성되며, 13000 ~ 17000rpm의 속도로 원심분리하여 수집하고 -50℃의 온도에서 1 ~ 3일간 동결건조한 것이 적절하다.
보다 구체적으로, 상기 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs)는 상기 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액에 에리트로마이신(Ery)을 가하고 1mL의 트리폴리포스페이트(TPP)를 첨가하고 2시간 동안 교반하여 형성되며, 14000rpm의 속도로 원심분리하여 수집하고 -50℃의 온도에서 2일간 동결건조한 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs)의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs)의 제조방법은 닭뼈를 증류수로 가열하고, 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 건조하여 닭뼈유래 수산화인회석을 얻는 닭뼈유래 수산화인회석 제조단계(S10); 상기 닭뼈유래 수산화인회석 제조단계(S10)에서 얻어진 닭뼈유래 수산화인회석을 증류수에 용해하여 닭뼈유래 수산화인회석 용해액을 제조하는 닭뼈유래 수산화인회석 용해액 제조단계(S20); 키토산을 아세트산에 녹여 아세트산 용액을 제조하는 아세트산 용액 제조단계(S30); 상기 닭뼈유래 수산화인회석 용해액 제조단계(S20)에서 제조된 닭뼈유래 수산화인회석 용해액과, 상기 아세트산 용액 제조단계(S30)에서 제조된 아세트산 용액을 혼합하고 교반하여 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액을 제조하는 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액 제조단계(S40); 및, 상기 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액 제조단계(S40)에서 제조된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액에 에리트로마이신(Ery)을 가하고 트리폴리포스페이트(TPP)를 첨가하고 교반하여, 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs)를 형성하고, 원심분리하여 수집하고 동결건조하는, 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs) 제조단계(S50);를 포함한다.
상기 닭뼈유래 수산화인회석 제조단계(S10)에서는, 닭뼈를 1N HCl용액에 12 ~ 36시간 담궈 증류수로 세척하고, 1M NaOH 용액에 12 ~ 36시간 담궈 증류수로 세척하는 전처리 과정을 거치며, 전처리된 닭뼈를 60 ~ 100℃의 온도로 30분 ~ 2시간 동안 증류수에서 가열하여 추출하고, 10000 ~ 14000rpm의 속도로 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 12 ~ 26시간 건조하고, 400 ~ 800℃ 머플로에서 3 ~ 7시간 동안 5℃/min의 상승 가열 속도로 가열하여 닭뼈유래 수산화인회석을 얻는다.
보다 구체적으로, 상기 닭뼈유래 수산화인회석 제조단계(S10)에서는, 닭뼈를 1N HCl용액에 24시간 담궈 증류수로 세척하고, 1M NaOH 용액에 24시간 담궈 증류수로 세척하는 전처리 과정을 거치며, 전처리된 닭뼈를 80℃의 온도로 1시간 동안 증류수에서 가열하여 추출하고, 12000rpm의 속도로 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 24시간 건조하고, 600℃ 머플로에서 5시간 동안 5℃/min의 상승 가열 속도로 가열하여 닭뼈유래 수산화인회석을 얻는 것이 바람직하다.
또한, 상기 닭뼈유래 수산화인회석 용해액 제조단계(S20)에서는, 상기 닭뼈유래 수산화인회석 제조단계(S10)에서 얻어진 닭뼈유래 수산화인회석을 1 ~ 3 mg/mL의 농도가 되도록 증류수에 용해하여 닭뼈유래 수산화인회석 용해액을 제조한다.
보다 구체적으로, 상기 닭뼈유래 수산화인회석 용해액 제조단계(S20)에서는, 상기 닭뼈유래 수산화인회석 제조단계(S10)에서 얻어진 닭뼈유래 수산화인회석을 2 mg/mL의 농도가 되도록 증류수에 용해하여 닭뼈유래 수산화인회석 용해액을 제조하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 아세트산 용액 제조단계(S30)에서는, 키토산을 1 ~ 3 mg/mL의 농도가 되도록 0.1 ~ 2% 아세트산 용액에 용해하여 아세트산 용액을 제조한다.
보다 구체적으로, 상기 아세트산 용액 제조단계(S30)에서는, 키토산을 2 mg/mL의 농도가 되도록 1% 아세트산 용액에 용해하여 아세트산 용액을 제조하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액 제조단계(S40)에서는, 닭뼈유래 수산화인회석 용해액 제조단계(S20)에서 제조된 닭뼈유래 수산화인회석 용해액과, 상기 아세트산 용액 제조단계(S30)에서 제조된 아세트산 용액을 혼합하고 자기교반기를 이용하여 1 ~ 3시간 동안 교반하여 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액을 제조한다.
보다 구체적으로, 상기 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액 제조단계(S40)에서는, 닭뼈유래 수산화인회석 용해액 제조단계(S20)에서 제조된 닭뼈유래 수산화인회석 용해액과, 상기 아세트산 용액 제조단계(S30)에서 제조된 아세트산 용액을 혼합하고 자기교반기를 이용하여 2시간 동안 교반하여 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액을 제조하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs) 제조단계(S50)에서는, 상기 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액 제조단계(S40)에서 제조된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액에 에리트로마이신(Ery)을 가하고 1mL의 트리폴리포스페이트(TPP)를 첨가하고 1 ~ 3시간 동안 교반하여, 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs)를 형성하고, 13000 ~ 17000rpm의 속도로 원심분리하여 수집하고 -50℃의 온도에서 1 ~ 3일간 동결건조한다.
보다 구체적으로, 상기 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs) 제조단계(S50)에서는, 상기 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액 제조단계(S40)에서 제조된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액에 에리트로마이신(Ery)을 가하고 1mL의 트리폴리포스페이트(TPP)를 첨가하고 2시간 동안 교반하여, 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs)를 형성하고, 14000rpm의 속도로 원심분리하여 수집하고 -50℃의 온도에서 2일간 동결건조하는 것이 바람직하다.
이하, 하기 실시예, 비교예 및 실험예를 통하여, 본 발명에 따른 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs)가 갖는 효과에 대하여 확인한다. 하기 실시예 비교예 및 실험예에서 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs)는 CS-HAP-Ery로 표기될 수도 있다.
1. 재료 및 방법
1.1. 재료
닭뼈는 대한민국 춘천의 국내 닭장에서 채취했다. 수산화인회석, 수산화나트륨(NaOH), 저분자량 키토산(DDA, 75-85%; Mw, 50-190kDa), 삼인산나트륨(TPP), 에리트로마이신, 트리톤 X-100은 Sigma-Aldrich(St. Louis)에서 구입했다. 염산(HCl), 한천은 대한민국 시흥시에 있는 대중화학금속(주)에서 구입했다. Muller-Hinton 한천(MHA) 및 영양액(NB)은 대한민국 Thermo Fisher Scientific의 BD DifcoTM에서 구입했다. Sheep Blood는 대한민국 Carlina에서 구입했다.
1.2.
실시예
1. 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs)의 제조
하기 제조공정에 따라, 실시예 1의 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs)를 제조하였다.
닭뼈유래 수산화인회석 제조단계(S10): 닭뼈를 1N HCl용액에 24시간 담궈 증류수로 세척하고, 1M NaOH 용액에 24시간 담궈 증류수로 세척하는 전처리 과정을 거치며, 전처리된 닭뼈를 80℃의 온도로 1시간 동안 증류수에서 가열하여 추출하고, 12000rpm의 속도로 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 24시간 건조하고, 600℃ 머플로에서 5시간 동안 5℃/min의 상승 가열 속도로 가열하여 닭뼈유래 수산화인회석을 얻었다.
닭뼈유래 수산화인회석 용해액 제조단계(S20): 상기 닭뼈유래 수산화인회석 제조단계(S10)에서 얻어진 닭뼈유래 수산화인회석을 2 mg/mL의 농도가 되도록 증류수에 용해하여 닭뼈유래 수산화인회석 용해액을 제조하였다.
아세트산 용액 제조단계(S30): 키토산을 2 mg/mL의 농도가 되도록 1% 아세트산 용액에 용해하여 아세트산 용액을 제조하였다.
키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액 제조단계(S40): 상기 닭뼈유래 수산화인회석 용해액 제조단계(S20)에서 제조된 닭뼈유래 수산화인회석 용해액과, 상기 아세트산 용액 제조단계(S30)에서 제조된 아세트산 용액을 혼합하고 자기교반기를 이용하여 2시간 동안 교반하여 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액을 제조하였다.
에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs) 제조단계(S50): 상기 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액 제조단계(S40)에서 제조된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액에 에리트로마이신(Ery)을 각각 125㎍/mL(실시예 1), 250㎍/mL(실시예 2), 500㎍/mL(실시예 3), 1000㎍/mL(실시예 4)의 농도가 되도록 가하고 1mL의 트리폴리포스페이트(TPP)를 첨가하고 2시간 동안 교반하여, 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs)를 형성하고, 14000rpm의 속도로 원심분리하여 수집하고 -50℃의 온도에서 2일간 동결건조하였다.
1.3.
비교예
1. 키토산 결합
닭뼈유래
수산화인회석(CS-HAP)의
제조
하기 제조공정에 따라, 비교예 1의 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP)를 제조하였다.
닭뼈유래 수산화인회석 제조단계(S10): 닭뼈를 1N HCl용액에 24시간 담궈 증류수로 세척하고, 1M NaOH 용액에 24시간 담궈 증류수로 세척하는 전처리 과정을 거치며, 전처리된 닭뼈를 80℃의 온도로 1시간 동안 증류수에서 가열하여 추출하고, 12000rpm의 속도로 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 24시간 건조하고, 600℃ 머플로에서 5시간 동안 5℃/min의 상승 가열 속도로 가열하여 닭뼈유래 수산화인회석을 얻었다.
닭뼈유래 수산화인회석 용해액 제조단계(S20): 상기 닭뼈유래 수산화인회석 제조단계(S10)에서 얻어진 닭뼈유래 수산화인회석을 2 mg/mL의 농도가 되도록 증류수에 용해하여 닭뼈유래 수산화인회석 용해액을 제조하였다.
아세트산 용액 제조단계(S30): 키토산을 2 mg/mL의 농도가 되도록 1% 아세트산 용액에 용해하여 아세트산 용액을 제조하였다.
키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액 제조단계(S40): 상기 닭뼈유래 수산화인회석 용해액 제조단계(S20)에서 제조된 닭뼈유래 수산화인회석 용해액과, 상기 아세트산 용액 제조단계(S30)에서 제조된 아세트산 용액을 혼합하고 자기교반기를 이용하여 2시간 동안 교반하여 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액을 제조하였다.
이때, 상기 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액은 10분동안 원심부리하여 수집하고 -50℃의 온도에서 2일간 동결건조하여, 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 분말로 보관하였다.
1.4.
비교예
2.
닭뼈유래
수산화인회석(HAP)의
제조
하기 제조공정에 따라, 비교예 2의 닭뼈유래 수산화인회석(HAP)을 제조하였다.
닭뼈유래 수산화인회석 제조단계(S10): 닭뼈를 1N HCl용액에 24시간 담궈 증류수로 세척하고, 1M NaOH 용액에 24시간 담궈 증류수로 세척하는 전처리 과정을 거치며, 전처리된 닭뼈를 80℃의 온도로 1시간 동안 증류수에서 가열하여 추출하고, 12000rpm의 속도로 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 24시간 건조하고, 600℃ 머플로에서 5시간 동안 5℃/min의 상승 가열 속도로 가열하여 닭뼈유래 수산화인회석(HAP)을 얻었다.
2. 실험방법
2.1. 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(
Ery
-
loaded
CS-HAP
NPs
), 키토산 결합
닭뼈유래
수산화인회석
(
CS
-
HAP
),
닭뼈유래
수산화인회
석(HAP)의 특성 확인
HAP, CS 및 Ery-loaded CS-HAP NPs의 기능적 특성은 FTIR 분광광도계(PerkinElmer Paragon 500(USA))를 사용하여 관찰되었다.
HAP, CS 및 Ery-loaded CS-HAP NPs의 결정상 조성은 10° - 80°에서 2θ의 스캔 범위로 XRD 분석(X'per-pro MPDPANalytical Netherland)에 의해 측정되었다.
그런 다음 Ery-loaded CS-HAP NPs의 크기와 모양은 EDS 분석(JEM-2100F, JEOL, Japan)과 결합된 TEM(Transmission Electron Microscopy)으로 측정되었다.
또한, 동적 광산란(DLS: Malvern PANalytical Netherland)을 사용하여 제타 전위 및 입자 분포 크기를 측정하여 나노입자 현탁액 안정성을 조사하였다.
2.2. 에리스로마이신 Ery-loaded CS-HAP NPs
의
시험관내
방출 확인
Ery-loaded CS-HAP NPs로부터 Ery의 시험관 내 방출은 종래 공지된 방법에 따라 포스페이트 완충액(pH 7.4) 및 아세테이트 완충액(pH 5.4)에서 측정되었다.
요약하면, 20mg의 최적화된 농도의 Ery-loaded CS-HAP NPs를 10mL의 증류수에 현탁시키고, 투석 백(10kDa, MWCO)으로 옮겼다. 그런 다음, 100mL가 포함된 각 완충액에 투석 백을 실온에서 교반(100rpm) 하에 침지시켰다. 각 시간 간격에서 4mL의 용해 매체를 취하고 용해 매체의 평형을 유지하기 위해 동일한 양의 완충 용액을 첨가했다.
2.3. 항균 분석
Bacillus cereus, S. aureus, Escherichia coli 및 Salmonella enterica에 대한 Ery-loaded CS-HAP NPs 및 Ery의 항균 활성을 선행 방법에 따른 웰 확산법으로 분석하였다. 각 박테리아 균주는 영양 브로쓰에서 배양되고 MHA 플레이트에 페인팅되었으며 무균 조건에서 코르크 천공기를 사용하여 웰을 만들었다. 그런 다음, 50 μL의 다양한 농도의 Ery-loaded CS-HAP NPs(12.5, 25, 50 및 100 μg/mL)를 각 웰에 첨가한 다음 플레이트를 37℃에서 12시간 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 기간 후 억제 영역을 관찰하고 측정했다.
2.4.
생물막
제거 분석
Ery-loaded CS-HAP NPs 및 Ery의 생물막 억제 능력은 생물막 제거 분석에 의해 측정되었다. 각 박테리아 균주(B. Cereus 및 E. coli)를 뇌 심장 주입(BHI) 브로쓰에 접종하고 24시간 동안 인큐베이션했다. 그런 다음 각 배양 접종물 10μL를 Metal 토큰이 있는 500μL BHI 브로쓰가 포함된 24웰 플레이트에 첨가하고 24시간 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, BHI 브로쓰를 10㎍/mL의 Ery-loaded CS-HAP NPs 및 Ery를 함유하는 신선한 배지로 교체하고 12시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후 BHI 배지와 금속 토큰을 빼고 PBS로 3회 세척했다. TEM의 전처리를 위해 금속 토큰에 있는 박테리아 균주를 4℃에서 4시간 동안 인산염 완충액(pH 7.2)을 함유하는 글루타르알데히드(2%) 및 파라포름알데히드(2%)로 고정하였다. 고정액을 제거한 후, 샘플을 실온(RT)에서 10분마다 3회 증류수로 헹구었다. 샘플 탈수는 4℃에서 20분 동안 에탄올 용액(50%, 60%, 70%, 80%, 90%)에 점진적으로 침지하고 최종적으로 4℃에서 무수 에탄올(100%)에 침지함으로써 달성되었다. 하룻밤 동안. 샘플을 실온에서 각각 20분 동안 에탄올:이소아밀 아세테이트 및 100% 이소아밀 아세테이트의 2:1, 1:1 및 1:2 분획으로 침투시켰다. 그런 다음 샘플을 40분 동안 헥사메틸디실란으로 완전히 대체했다. 샘플을 실온에서 충분히 건조시킨 후 E-1010 이온 스퍼터(HITACHI, Japan)를 사용하여 30초 동안 금으로 코팅하였다. 이러한 코팅된 샘플은 3kV에서 SUPRA 55VP 주사 전자 현미경(ZEISS, Germany)을 사용하여 관찰하고 획득했다.
2.5. 용혈 분석
용혈 분석은 에리트로마이신이 로딩된 CS-HAP NP의 잠재적인 시험관 내 용혈 활성을 확인하기 위해 수행되었다. Sheep Blood(Carlina, Korea) 1mL를 PBS(pH 7.2) 10mL에 용해시켰다. 그런 다음, 4℃에서 2000rpm으로 10분간 원심분리하여 적혈구(RBC)를 수집하고 PBS 용액으로 세척하였다. 4%의 RBC 200μL를 다양한 농도의 CS-CHAP-Ery 200μL와 함께 인큐베이션했다. Triton X-100(1%) 및 PBS는 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용되었다. 그런 다음, 이들을 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 이어서, 2000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 RBC를 수집하였다. 용혈 활성은 UV-vis 분광광도계(SpectraMax®Plus 384 Microplate Reader, Molecular Devices)를 사용하여 545 nm에서 상청액을 측정하여 결정했다. 흡광도를 통해 농도에 따른 시료의 용혈을 확인하였다.
2.6.
CAM
분석
대한민국 춘천에 있는 양계장에서 총 7일간의 부화 수정란을 구입했다. 그 다음 계란을 표면 살균한 후 계란의 기포 부분을 동그랗게 자르고 내각막을 조심스럽게 제거하였다. 또한, HAP, CS-HAP, Ery, Ery-loaded CS-HAP NPs 200μL(31.25μg/mL)과 1N NaOH, PBS를 상온에서 10분간 처리하였다. 처리 후, 계란 독성학적 상태가 기록되었다.
2.7. 통계 분석
통계 분석은 일원 분산 분석(ANOVA)에 의해 수행되었다. 결과는 평균 ± SD로 표시되었습니다. p < 0.05는 통계적으로 유의했다.
3. 결과 및 논의
3.1. 합성 및 특성화
Ery
-
loaded
CS
-
HAP
NPs
3.1.1. Ery-loaded CS-HAP NPs 복합 나노입자의
FTIR
분석
HAP, CS, Ery 및 Ery-loaded CS-HAP NPs의 작용기 변화에 대한 FTIR 분석은 도 1a-b에 나와있다. HAP는 O-H 스트레칭에 해당하는 3571 cm-1에서 중간 및 날카로운 특성 피크를 보였고, 1456 cm-1, 1411 cm-1 및 874 cm-1에서 CO3-의 비대칭 스트레칭에 해당하는 피크를 나타내어, HAP의 카보네이트 그룹의 존재를 나타냈다. 1022 cm-1 및 562 cm-1에서의 날카로운 피크는 HAP의 포스페이트 그룹에 해당하는 PO4 3-의 대칭 스트레칭에 기인한다. 닭 뼈 추출 HAP에서 발견된 피크는 표준 HAP와 유사했다(도 1a). Ery-loaded CS-HAP의 합성을 확인하기 위해 추가 FTIR 분석을 수행했다(도 1b). 이에 CS는 3291 cm-1, 2873 cm-1, 1647 cm-1, 1576 cm-1에서 히드록실, 아세틸 및 아미노기(1차 및 2차)의 해당 작용기를 보였다. Ery는 O-H와 NH 스트레칭의 병합으로 인해 3515cm-1 및 3463cm-1에서 주요 피크를 보여주었다(도 1b). 1713 cm-1의 강한 피크는 C=O 스트레칭에 해당한다. 또한, Ery-loaded CS-HAP는 CS의 주요 banding인 3227 cm-1 및 2880 cm-1에서 피크를 보여 HAP 및 Ery 스펙트럼과 비교하였다. 피크 이동은 CS 스펙트럼과 비교하여 1647 cm-1 ~ 1631 cm-1 및 1576 cm-1 ~ 1541 cm-1과 같은 아미노 그룹에서 발견되었다. 또한, HAP와 관련된 피크는 Ery-loaded CS-HAP NPs에서 1087 cm-1, 962 cm-1과 같이 발견되었으며, CS 존재로 인해 피크가 1022 cm-1에서 1027 cm-1로 이동하였다(도 1b). Ery가 CS-HAP NP에 로드되었음을 나타내는 Ery-loaded CS-HAP NPs 스펙트럼에서 Ery 관련 피크가 발견되지 않았다.
3.1.1. Ery-loaded CS-HAP NPs
의
XRD
분석
XRD 스펙트럼에서 결정된 HAP, CS 및 Ery-loaded CS-HAP NPs의 결정화 정도를 확인하였다(도 1c). HAP의 육각형 구조의 회절 패턴은 10.86, 28.88°, 28.96°, 31.79°, 32.20°, 32.93°, 34.09°, 39.84°, 46.749.5, 46.749.5 및 49에 대응하는 결정에서 2θ피크를 나타냈다. 002, 210, 211, 300, 202, 310, 222, 312, 213의 평면. 이러한 결정질 회절 패턴은 Ca5(PO4)3(OH)의 회절 패턴에 가깝다(International Centre for Diffraction Data, File no. 00-009-0432). HAP의 XRD 분석 결과, 31.79°와 32.93°에서 더 높은 세기의 피크를 보였고, HAP-CS-Ery도 31.79°와 32.92°에서 더 높은 세기의 피크 2θ를 보였다(도. 1c). 유사하게, 이전 연구에서는 수산화인회석이 2θ각도의 30°와 33° 사이에서 더 높은 강도 피크를 나타낸다고 보고한 바 있다. 이러한 피크는 Sigma-Aldrich의 표준 HAP와 관련이 있고 일치했다. CS의 XRD 스펙트럼은 수화된 결정면으로 인한 9.9°와 19.8°에서 2θ피크를 나타냈다. HAP-CS-Ery는 또한, 9.9°에서 10.8° 및 19.8°에서 21.8°로 CS 2θ피크에서 약간의 이동을 보여 CS-HAP 복합물 형성의 형성을 확인시켜주었다.
3.1.2. Ery-loaded CS-HAP NPs
의
TEM
및 제타 전위 분석
HAP-CS-Ery NP의 크기, 모양 및 원소 분석을 이해하기 위해 EDS 결합 TEM으로 분석했다(도 2a-c). 형태학적으로 Ery-loaded CS-HAP NPs는 원, 타원 및 타원형 모양을 갖는 것으로 나타났다. 또한, Ery-loaded CS-HAP NPs는 100 - 200 nm 크기로 확인되었다. HAP-CS-Ery의 EDS 결과는 Ca(칼슘), O(산소), P(인) 및 C(탄소)의 존재를 보여주었다. 도 2d-e는 Ery-loaded CS-HAP NPs의 평균 유체 역학 입자 크기, 다분산 지수(PDI) 및 ζ전위를 보여준다. Ery-loaded CS-HAP NPs는 0.359 PDI에서 259.9(d. nm)의 평균 유체역학적 입자 크기를 나타냈다. Ery-loaded CS-HAP NPs를 수성 시스템에 도입할 때 크기 증가가 관찰되었으며, 여기서 CS-HAP는 수분 흡수로 인해 팽창했다. 또한, Ery-loaded CS-HAP NPs는 양이온성 CS의 존재로 인해 18.4(mV)의 양의 ζ전위를 가졌다. 나노복합 나노입자의 크기와 더 높은 안정성은 약물 전달 효과를 높이는 데 효과적일 것이다.
3.2. 캡슐화, 로딩 효율성 및 릴리스 프로필
약물 캡슐화(DEE) 및 로딩 효율(DLE)은 효율적인 나노 약물 전달 시스템을 위한 중요한 요소다. CS-HAP NP 시스템에서 Ery 로딩 및 캡슐화 효율을 평가하기 위해 다양한 농도의 Ery가 CS-HAP에 로딩되었다(표 1).
| The drug encapsulation and drug loading efficiency of Ery loaded CS-HAP NPs. | ||
| CS-HAP:Ery (W/W) | % of DEE | % of DLE |
| 2:0.125 | 78.83 ± 0.73 | 7.58 ± 0.09 |
| 2:0.25 | 64.53 ± 0.90 | 8.03 ± 0.06 |
| 2:0.5 | 69.28 ± 0.77 | 16.07 ± 0.10 |
| 2:1 | 62.17 ± 0.33 | 29.48 ± 0.17 |
결과는 Ery의 농도 증가(125μg에서 1000μg)가 DEE의 %(78.83%에서 62.17%)를 감소시키는 반면 DLE의 %(7.58에서 29.48%)를 증가시키는 것으로 나타났다. 따라서 본 연구에서는 CS-HAP:Ery(2:0.5)의 중량비가 각각 69.28 ± 0.77% 및 16.07 ± 0.10%에서 최대 DEE 및 DLE를 가짐을 발견했다. 또한, 도 3은 상이한 pH(7.4 및 5.4)에서 Ery-loaded CS-HAP NPs로부터의 시험관 내 Ery 방출을 보여주었다. 전달 시스템의 키토산과 같은 pH 반응성 고분자로 인해 pH 7.4에 비해 더 높은 수준의 pH 5.4 Ery를 방출할 수 있다. 더욱이, Ery의 버스트 방출은 6시간까지 두 pH 배지에서 관찰되었고, 그 다음 96시간까지 지속 방출을 발견했다. 또한, 96시간째 pH 5.4와 7.4의 배지에서 최대 약물방출률이 각각 47.79%와 30.88%로 관찰되었다. 본 실험예를 통해 Ery-loaded CS-HAP NPs는 뼈 감염 관련 문제에 다른 항생제를 전달하는 약물 전달 매개체로 활용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
3.3. 생물학적 분석
3.3.1. 항균 분석
도 4, 표 2 및 도 7은 그람 양성 및 그람 음성 세균 병원체(B. cereus, S. aureus, E. coli, and S. enterica)에 대한 Ery-loaded CS-HAP NPs 및 Ery의 항균 활성을 보여주었다. 결과는 Ery-loaded CS-HAP NPs가 농도(12.5 ~ 50μg/mL)에 따라 상당한 박테리아 억제 활성을 가짐을 보여주었다.
| Ery-loaded CS-HAP NPs (μg/mL) |
B. cereus | S. aureus | E. coli | S. enterica |
| Zone of inhibition (mm) | ||||
| 12.5 | 20.2 ± 0.9a | 24.0 ± 0.9a | 22.2 ± 0.7a | 21.4 ± 1.7a |
| 25.0 | 25.0 ± 1.0b | 27.1 ± 0.7b | 24.1 ± 1.0b | 25.7 ± 1.4b |
| 50.0 | 29.1 ± 1.2c | 28.0 ± 1.0c | 29.9 ± 1.1c | 29.4 ± 1.3c |
| Ery - 30.0 | 35.0 ± 0.9d | 38.1 ± 1.0d | 36.7 ± 1.4d | 31.5 ± 1.5d |
상기 표 2는 병원체에 대한 Ery-loaded CS-HAP NPs 및 Ery의 억제 영역을 나타낸다. 결과는 평균 ± SD(n-3)로 표시되었다. 다른 위 첨자는 열에 따라 크게 다르다(p < 0.05). 항생제 Ery 단독 처리는 Ery-loaded CS-HAP NPs의 억제 활성과 비교할 때 가장 높은 억제 영역을 나타냈다. 시간 및 pH 반응 방식에 따라 지속적인 방식으로 Ery를 전달한 CS-HAP NPs 약물 전달 시스템에서 Ery 로딩으로 인한 박테리아 억제의 차이를 보였다. 이러한 특정 조건은 웰 확산 방법에서 제공되지 않았다. 본 시럼예를 통해 Ery-loaded CS-HAP NPs가 병원성 미생물에 의한 뼈의 감염으로 인한 염증 및 골변성을 치료하는 골수염에 반응할 수 있음을 확인하였다.
3.3.2.
생물막
제거 분석
B. cereus 및 E. coli에 의해 형성된 생물막에 대한 Ery-loaded CS-HAP NPs 및 Ery의 억제 효과는 SEM 분석에 의해 분석되었다(도 5a-f). 대조군, B. cereus 및 E. coli는 생물막의 두꺼운 층을 형성하는 샘플로 처리되지 않았다(도 5a 및 5d). CHAP-CS-Ery NPs 처리는 대조군에 비해 B. cereus 및 E. coli에 의한 생물막 형성을 상당히 억제하였다. 또한, 결과는 대조군에 비해 적은 수의 박테리아 세포가 부착되었음을 나타내었다(도 5b 및 5e). 유사하게, Ery 처리는 B. cereus 및 E. coli에 의해 형성된 생물막을 크게 제거하여 SEM 이미지에서 금속 토큰의 표면을 볼 수 있었다(도 5c 및 5f). 전반적으로, 비교 결과는 Ery-loaded CS-HAP NPs가 Ery 단독 처리보다 생물막 형성을 실질적으로 억제한다는 것을 보여주었다.
3.4. 용혈 분석
특정 표적에 전달된 Ery-loaded CS-HAP NP를 활용하려면 최대 약물 용량을 줄이고 독성을 낮추는 것이 중요하다. 그러나 나노 입자의 물리적 특성은 일반적으로 사용되는 소분자와 비교하여 순환 중인 세포 및 기타 혈액 매개 구성 요소에 안전 문제를 제기할 수 있다. 따라서 CHAP-CS-Ery NP의 용혈 정도를 확인하기 위해 용혈 분석을 수행했다(도 6a). 그 결과 CHAP-CS-Ery는 31.2μg/mL 농도까지 용혈 활성이 낮았고, 상기 농도를 초과하면 용혈을 일으키는 것으로 나타났다. 초기 연구에서는 최대 용혈량이 5% 이하로 안전한 것으로 보고되었다. 이를 통해 CHAP-CS-Ery는 최소한의 농도로 골수염에 대응하는 나노입자로 활용 가능성을 보였다.
3.5.
CAM
분석
CAM 분석은 세포 기반 분석과 동물 기반 분석의 중간 모델로 사용되며 혈관 신생에 대한 연구 모델로 사용된다. 따라서 합성 약물 전달 시스템이 가임기 여성이나 임산부에게 어떤 영향을 미치는지 확인할 수 있다. 실험 결과 CHAP, CS-HAP, Ery, Ery-loaded CS-HAP NPs는 NaOH 처리에 비해 낮은 독성을 나타냄을 확인하였다. 또한, Ery-loaded CS-HAP NPs는 혈액 응고 및 신경 손상을 일으키지 않았으나 NaOH 처리는 혈관 조직에 혈액 응고 및 심각한 손상을 일으켰다. 따라서 결과는 Ery-loaded CS-HAP NPs가 Ovo 모델에서 이상을 일으키지 않음을 보여주었다.
4. 결론
이 연구에서 Ery-loaded CS-HAP NP를 합성하고 특성화하고 골수염 치료에서 생물학적 효능을 평가했다. Ery-loaded CS-HAP NPs는 분석 연구에 의해 확인된 상당한 기능적 특성을 보였다. 또한, 항균 분석 및 바이오필름 제거 분석 결과, 상당한 박테리아 억제 및 바이오필름 제거를 보였다. 또한, 용혈 분석 및 CAM 분석에서 Ery-loaded CS-HAP NPs(<31.25μg/mL)가 잠재적인 독성을 일으키지 않음을 확인했다. 따라서 본 연구에서는 닭뼈에서 추출한 HAP의 장점과 CS 및 HAP의 우수한 약물전달능력을 골수염 치료를 위한 약물전달체로 활용하고자 한다.
이에, 본 발명은 닭뼈를 증류수로 가열하고, 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 건조하여 얻어진 닭뼈유래 수산화인회석을, 증류수에 용해하여, 얻어진 닭뼈유래 수산화인회석 용해액과; 키토산을 아세트산에 녹여 얻어진 아세트산 용액;을 서로 혼합하고 교반하여 얻어진 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액;에 에리트로마이신(Ery)을 가하고 트리폴리포스페이트(TPP)를 첨가하여 교반하고, 원심분리하여 수집하고 동결건조하여 얻어진 것으로, 항균 활성을 갖지며, 에리트로마이신(Ery)의 방출 시간 조절 등이 최적화되어, 뼈 관련 질환의 치료에 용이한 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자를 개발하였음을 명시한다.
본 발명을 첨부된 도면과 함께 설명하였으나, 이는 본 발명의 요지를 포함하는 다양한 실시 형태 중의 하나의 실시 예에 불과하며, 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 하는 데에 그 목적이 있는 것으로, 본 발명은 상기 설명된 실시예에만 국한되는 것이 아님은 명확하다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 하기의 청구범위에 의해 해석되어야 하며, 본 발명의 요지를 벗어나지 않는 범위 내에서 변경, 치환, 대체 등에 의해 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리에 포함될 것이다. 또한, 도면의 일부 구성은 구성을 보다 명확하게 설명하기 위한 것으로 실제보다 과장되거나 축소되어 제공되는 것임을 명확히 한다.
(S10): 닭뼈유래 수산화인회석 제조단계
(S20): 닭뼈유래 수산화인회석 용해액 제조단계
(S30): 아세트산 용액 제조단계
(S40): 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액 제조단계
(S50): 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자 제조단계
(S20): 닭뼈유래 수산화인회석 용해액 제조단계
(S30): 아세트산 용액 제조단계
(S40): 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액 제조단계
(S50): 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자 제조단계
Claims (12)
- 닭뼈를 증류수로 가열하고, 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 건조하여 얻어진 닭뼈유래 수산화인회석을, 증류수에 용해하여, 얻어진 닭뼈유래 수산화인회석 용해액과; 키토산을 아세트산에 녹여 얻어진 아세트산 용액;을 서로 혼합하고 교반하여 얻어진 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액;에 에리트로마이신(Ery)을 가하고 트리폴리포스페이트(TPP)를 첨가하여 교반하고, 원심분리하여 수집하고 동결건조하여 얻어진 것을 특징으로 하는 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs).
- 제1항에 있어서,
상기 닭뼈는 1N HCl용액에 12 ~ 36시간 담궈 증류수로 세척하고, 1M NaOH 용액에 12 ~ 36시간 담궈 증류수로 세척하여 전처리된 것을 이용하며,
상기 닭뼈유래 수산화인회석은, 전처리된 닭뼈를 60 ~ 100℃의 온도로 30분 ~ 2시간 동안 증류수에서 가열하여 추출하고, 10000 ~ 14000rpm의 속도로 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 12 ~ 36시간 건조하고, 400 ~ 800℃ 머플로에서 3 ~ 7시간 동안 5℃/min의 상승 가열 속도로 가열하여 얻어진 것을 특징으로 하는 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs).
- 제1항에 있어서,
상기 닭뼈유래 수산화인회석 용해액은 상기 닭뼈유래 수산화인회석을 1 ~ 3 mg/mL의 농도가 되도록 증류수에 용해하여 제조된 것을 특징으로 하는 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs).
- 제1항에 있어서,
상기 아세트산 용액은 키토산을 1 ~ 3 mg/mL의 농도가 되도록 0.1 ~ 2% 아세트산 용액에 용해하여 제조된 것을 특징으로 하는 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs).
- 제1항에 있어서,
상기 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액은 상기 닭뼈유래 수산화인회석 용해액과, 상기 아세트산 용액을 혼합하고 자기교반기를 이용하여 1 ~ 3시간 동안 교반하여 제조된 것을 특징으로 하는 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs).
- 제1항에 있어서,
상기 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs)는 상기 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액에 에리트로마이신(Ery)을 가하고 1mL의 트리폴리포스페이트(TPP)를 첨가하고 1 ~ 3시간 동안 교반하여 형성되며, 13000 ~ 17000rpm의 속도로 원심분리하여 수집하고 -50℃의 온도에서 1 ~ 3일간 동결건조한 것을 특징으로 하는 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs).
- 닭뼈를 증류수로 가열하고, 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 건조하여 닭뼈유래 수산화인회석을 얻는 닭뼈유래 수산화인회석 제조단계(S10);
상기 닭뼈유래 수산화인회석 제조단계(S10)에서 얻어진 닭뼈유래 수산화인회석을 증류수에 용해하여 닭뼈유래 수산화인회석 용해액을 제조하는 닭뼈유래 수산화인회석 용해액 제조단계(S20);
키토산을 아세트산에 녹여 아세트산 용액을 제조하는 아세트산 용액 제조단계(S30);
상기 닭뼈유래 수산화인회석 용해액 제조단계(S20)에서 제조된 닭뼈유래 수산화인회석 용해액과, 상기 아세트산 용액 제조단계(S30)에서 제조된 아세트산 용액을 혼합하고 교반하여 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액을 제조하는 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액 제조단계(S40); 및,
상기 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액 제조단계(S40)에서 제조된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액에 에리트로마이신(Ery)을 가하고 트리폴리포스페이트(TPP)를 첨가하고 교반하여, 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs)를 형성하고, 원심분리하여 수집하고 동결건조하는, 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs) 제조단계(S50);를 포함하는 것을 특징으로 하는 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs)의 제조방법.
- 제7항에 있어서,
상기 닭뼈유래 수산화인회석 제조단계(S10)에서는, 닭뼈를 1N HCl용액에 12 ~ 36시간 담궈 증류수로 세척하고, 1M NaOH 용액에 12 ~ 36시간 담궈 증류수로 세척하는 전처리 과정을 거치며, 전처리된 닭뼈를 60 ~ 100℃의 온도로 30분 ~ 2시간 동안 증류수에서 가열하여 추출하고, 10000 ~ 14000rpm의 속도로 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 12 ~ 26시간 건조하고, 400 ~ 800℃ 머플로에서 3 ~ 7시간 동안 5℃/min의 상승 가열 속도로 가열하여 닭뼈유래 수산화인회석을 얻는 것을 특징으로 하는 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs)의 제조방법.
- 제7항에 있어서,
상기 닭뼈유래 수산화인회석 용해액 제조단계(S20)에서는, 상기 닭뼈유래 수산화인회석 제조단계(S10)에서 얻어진 닭뼈유래 수산화인회석을 1 ~ 3 mg/mL의 농도가 되도록 증류수에 용해하여 닭뼈유래 수산화인회석 용해액을 제조하는 것을 특징으로 하는 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs)의 제조방법.
- 제7항에 있어서,
상기 아세트산 용액 제조단계(S30)에서는, 키토산을 1 ~ 3 mg/mL의 농도가 되도록 0.1 ~ 2% 아세트산 용액에 용해하여 아세트산 용액을 제조하는 것을 특징으로 하는 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs)의 제조방법.
- 제7항에 있어서,
상기 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액 제조단계(S40)에서는, 닭뼈유래 수산화인회석 용해액 제조단계(S20)에서 제조된 닭뼈유래 수산화인회석 용해액과, 상기 아세트산 용액 제조단계(S30)에서 제조된 아세트산 용액을 혼합하고 자기교반기를 이용하여 1 ~ 3시간 동안 교반하여 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액을 제조하는 것을 특징으로 하는 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs)의 제조방법.
- 제7항에 있어서,
상기 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs) 제조단계(S50)에서는, 상기 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액 제조단계(S40)에서 제조된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석(CS-HAP) 용액에 에리트로마이신(Ery)을 가하고 1mL의 트리폴리포스페이트(TPP)를 첨가하고 1 ~ 3시간 동안 교반하여, 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs)를 형성하고, 13000 ~ 17000rpm의 속도로 원심분리하여 수집하고 -50℃의 온도에서 1 ~ 3일간 동결건조하는 것을 특징으로 하는 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자(Ery-loaded CS-HAP NPs)의 제조방법.
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2022
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