SK182498A3 - Erythromycins and process for their preparation - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka nových polyketidov a spôsobov ich výroby. Osobitne sa vynález týka nových erytromycínov, ktoré sú užitočné ako antibakteriálne a antiprotozoálne činidlá a pri iných aplikáciách (napríklad ako protirakovinové, činidlá, antiaterosklerotické činidlá a činidlá znižujúce motilitu žalúdku apod.) u cicavcov, vrátane človeka, ako tiež u rýb a vtákov. Ďalej sa vynález týka spôsobu výroby týchto zlúčenín, farmaceutických kompozícií na ich báze a spôsobov liečby bakteriálnych a protozoálnych infekcií u cicavcov, rýb a vtákov.

Doterajší stav techniky

Manipulácia biosyntetických génov alebo ich častí pre polyketidy, ktoré môžu byť odvodené z rôznych zhlukov biosyntetických génov pre polyketidy, umožňujú produkovať nové erytromycíny.

Polyketidy predstavujú rozsiahlu a štruktúrne rôznorodú triedu prírodných látok, ktorá zahŕňa rad zlúčenín, ktoré vykazujú antibiotické alebo iné farmakologické vlastnosti. Takými látkami sú napríklad erytromycín, tetracyklíny, rapamycín, avermektín, polyéterové ionofory a FK506. Polyketidy sú konkrétne hojne produkované Streptomvces a príbuznými baktériami Actinomvcetes. Syntetizujú sa opakovanou niekolkostupňovou kondenzáciou acyltioesterov spôsobom, ktorý je podobný biosyntéze mastných kyselín. Príčinou značnej štrukturálnej rôznorodosti medzi prírodnými polyketidmi je výber (zvyčajne) acetátu alebo propionátu, ako štarté2

rových alebo extenderových jednotiek; a rôzny stupeň premeny β-ketoskupiny, ktorý je pozorovaný po každej kondenzácii. Ako príklady procesných stupňov premeny je možné uviesť redukciu na β-hydroxyacylskupinu, redukciu nasledovanú dehydratáciou na 2-enoylskupinu, a úplnú redukciu na nasýtený acyltioester. Výsledok týchto procesných stupňov je z hľadiska stereochémie rovnako špecifický pre každý cyklus predlžovania reťazca. Biosyntéza polyketidov je zahajovaná skupinou enzýmov tvoriacich reťazce, ktoré sú známe ako polyketid syntézy (PKS). V aktinomycétach boli opísané dve triedy polyketid syntáz (PKS). Nové polyketidy podľa vynálezu sú syntetizované PKS typu I, ktorých predstaviteľmi sú PKS pre makrolidy erytromycín, avermektín a rapamycín (obr. 1). PKS sa skladajú z rôznych sad alebo modulov enzýmov pre každý cyklus predlžovania polyketidového reťazca (obr. 2A) (Cortes, J. et al., Náture 1990, 348: 176 až 178; Donadio S. et al., Science (1991), 252: 675 až 679; MacNeil, D.

J. et al., Gene (1992), 115: 119 až 125; Schwecke T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92: 7839 až 7843). Poznámka: Pojmom prírodný modul sa tu označuje sada priľahlých domén, od génu α,β-ketoacylsyntázy (KS) k nasledujúcemu génu acylového nosičového proteínu (ACP), ktorým sa zaisťuje jeden cyklus predlžovania polyketidového reťazca. Pod pojmom kombinatorický modul sa tu rozumie akákoľvek skupina priľahlých domén (alebo častí domén) od prvého miesta v prvom prírodnom module do druhého ekvivalentného miesta v druhom prírodnom module. Prvé a druhé miesto sa budú všeobecne nachádzať v jadrových doménach, ktoré sú prítomné vo všetkých moduloch, tzn. obidve pri ekvivalentných miestach príslušných KS, AT (acyl transferázy), ACP domén alebo v linkerových oblastiach medzi doménami.

Na obr. 2 je znázornené usporiadanie génov pre PKS produkujúcej erytromycín, ktorá je tiež známa ako 6-deoxyerytronolid B syntáza, DEBS). DEBS polypeptidy sú kódované tromi otvorenými čítacími rámcami. Gény sú usporiadané do šiestich opakujúcich sa jednotiek označených modulov. Prvý otvorený čítací rámec kóduje prvý multienzým alebo kazetu (DEBS1), ktorá sa skladá z troch modulov: vkladacieho modulu (ery-load) a dvoch predlžovacích modulov (moduly 1 a 2). Vkladací modul zahŕňa acyl transferázu a acylový nosičový protein. To môže byť v rozpore s obr. 1 WO 93/13663 (pozri ďalej). Ten znázorňuje, že ORF1 sa skladá len z dvoch modulov, z ktorých prvý je v skutočnosti ako vkladacím modulom, tak prvým predlžovacím modulom.

rámcovej delécii DNA kódujúcej časť ketoreduktázovej domény modulu 5 v DEBS sa ukázalo, že vedie k vzniku analógov erytromycínu, 5,6-dideoxy-3-mykarozyl-5-oxoerytronolidu B, 5,6-dideoxy-5-oxoerytronolidu B a 5,6-dideoxy-6,6epoxy-5-oxoerytronolidu B (Donadio S. et al., Science (1991) 252: 675 až 679). Podobne alterácia zvyškov aktívnych miest v enoylreduktázovej doméne modulu 4 v DEBS, keď sa DNA kódujúca PKS podrobí metódam génového inžinierstva a zavedie do Saccharopolyspora erythraea. vedie k produkcii 6,7-anhydroerytromycínu C (Donadio S et al., Proc. Natl. Acad. sci. USA (1993) 90: 7119 až 7123).

V medzinárodnej patentovej prihláške WO 93/13663, ktorá je tu citovaná náhradou za prenesenie celého jej obsahu do tohto textu, sú opísané ďalšie typy génových manipulácií génov DEBS, ktoré sú schopné produkovať alterované polyketidy. O radu takých pokusov sa však uvádza, že sú neproduktívne (Hutchinson C. R. a Fujii I., Annu. Rev. Microbiol. (1995) 49: 201 až 238, str. 231). Bola opísaná úplná DNA sekvencia génov zo Streptomvces hyqroscopicus, ktorá kóduje modulárnu PKS typu 1 riadiacu biosyntézu makrocyklického imunosupresívneho polyketidu rapamycínu (Schwecke T., et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7839 až 7843) (obr. 3). Táto sekvencia DNA je uložená v zbierke EMBL/Genbank Database pod prírastkovým číslom X86780.

Napriek tomu, že už bol identifikovaný celý rad terapeuticky významných polyketidov, pretrváva potreba získať nové polyketidy, ktorých vlastnosti by boli posilnené, alebo ktoré by vykazovali celkom novú biologickú účinnosť. Zložité polyketidy produkované modulárnym typom I PKS sú osobitne hodnotné, pretože zahŕňajú zlúčeniny, o ktorých je známe, že sú užitočné ako anthelmintika, insekticídy, imunosupresivá, antifungálne a/alebo antibakteriálne činidlá. Vzhladom na svoju štruktúrnu zložitosť nie je možné také nové polyketidy lahko získať totálnou chemickou syntézou alebo chemickými modifikáciami známych polyketidov. Jeden z aspektov tohto vynálezu vychádza z nášho poznatku, že génový súbor PKS typu I kóduje vkladací modul, ktorý je nasledovaný predlžovacími modulmi. To je najmä užitočné pre získanie génového súboru hybridnej PKS, kde vkladací modul je heterológny vzhľadom na predlžovacie moduly a je taký, že vedie k polyketidu s alterovanou štartérovou jednotkou. Tento koncept je vzhladom na doterajší stav techniky celkom neznámy, pretože až dosial nebola známa existencia vkladacích modulov. WO 93/13663 sa týka alterácie génov pre PKS pomocou inaktivácie jedinej funkcie (tzn. jediného enzýmu) alebo ovplyvnením celého modulu deléciou, inzerciou alebo nahradením. Pojem vkladací súbor, ako sa používa v WO 93/ 13663, nepredstavuje modul.

V prípade, že vkladacím modulom je modul, ktorý prijíma rad rôznych jednotiek karboxylovej kyseliny, potom sa na produkciu radu rôznych polyketidov môže použiť hybridný génový súboru. Tak napríklad hybridný génový súbor môže využívať nukleové kyseliny kódujúce avr vkladací modul s ery extenderovými modulmi. Vkladací modul môže prijímať jednotky neprírodných kyselín a ich deriváty; osobitne uži5

točný je v tomto ohlade avr vkladací modul (Dutton et al. (1991). J. Antiobiot., 44: 357 až 365). Okrem toho je možné stanoviť špecifickosť prírodného vkladacieho modulu pre nepri rodné štartérové jednotky a využiť výhody uvoľnenej špecifickosti vkladacieho modulu pre generovanie nových polyketidov. Ďalším aspektom tohto vynálezu je neočakávaná schopnosť ery vkladacieho modulu prijímať neprírodné karboxylové kyseliny a ich deriváty, čím sa pri kmeňoch produkujúcich erytromycín, ktoré obsahujú len DEBS gény, dosiahne produkcia nových erytromycínov. Je samozrejme tiež možné uskutočniť alterácie v polyketidovom produkte, najmä nahradením predlžovacieho modulu modulom, ktorý poskytuje ketidovú jednotku v inom oxidačnom stave a/alebo s inou stereochémiou. Všeobecne sa predpokladá, že stereochémia metylskupín v polyketidovom reťazci je daná acyltransferázou, čo je však v skutočnosti znak ďalších domén PKS, a zmenu je teda možné vykonať iba nahradením týchto domén jednotlivo alebo nahradením modulu. Nahradením acyltransferázovej domény alebo nahradením celého modulu je možné zavádzať alebo odstraňovať metylové a ďalšie substituenty. V týchto súvislostiach bude tiež odborníkom v tomto odbore zrejmé, že je možné kombinovať využitie uvolnenej substrátovej špecifickosti erytromycínového vkladacieho modulu s nahradením predlžovacieho modulu a substitúciu hybridného vkladacieho modulu s nahradením predlžovacieho modulu, ako mechanizmu na produkciu širokej palety nových erytromycínov. Predmetom vynálezu je teda produkcia nových erytromycínov netransformovanými organizmami a ďalej tiež také génové súbory, vektory obsahujúce také génové súbory a transformované organizmy, ktoré ich exprimujú, za účelom produkcie nových erytromycínov transformovanými organizmami. Transformované organizmy môžu obsahovať rekombinantné plazmidy, alebo plazmidy môžu integrovať. Plazmid s int sekvenciou bude integrovať do špecifického miesta pripojenia (att) hostiteľského chromozómu. Transformované organizmy môžu byť

schopné modifikovať počiatočné produkty, napríklad uskutočnením všetkých alebo niektorých biosyntetických modifikácií, ktoré sú normálne pri produkcii erytromycínov (pozri obr. 2b). Je však možné využiť také mutantné organizmy, ktoré majú niektoré normálne dráhy zablokované, napríklad za účelom produkcie produktov bez jednej alebo viacerých prírodných hydroxyskupín alebo cukorných skupín, ako je to napríklad opísané v WO 91/16334 alebo v Weber et al. (1985) J. Bacteriol. 164: 425 až 433, ktoré sú tu citované náhradou za prenesenie celého ich obsahu do tohto textu. Alternatívne je možné využiť organizmy, v ktorých sú niektoré normálne dráhy nadexprimované, za účelom prekonania možných stupňov, ktoré by obmedzovali rýchlosť produkcie požadovaného produktu, pozri napríklad WO 97/06266, ktorá je tu citovaná náhradou za prenesenie celého jej obsahu do tohto textu.

Tento aspekt tohto spôsobu vo veľkej miere súvisí s pôsobením na génové moduly PKS, ako stavebné bloky, ktoré je možné použiť na zostavení enzýmových systémov, a teda nových erytromycínových produktov, požadovaného typu. To zvyčajne zahŕňa vyštepenie a zostavenie modulov a multimodulových zoskupení. Logické miesta pre vytvorenie a prerušenie intermodulárnych spojení sa nachádzajú vo väzbovej oblasti medzi modulmi. Môže však byť výhodné štiepenie a spojovanie vykonávať priamo v doménach (tzn. častiach kódujúcich enzým), v blízkosti ich krajov. DNA je tu medzi všetkými modulárnymi PKS vysoko konzervovaná, čo môže napomáhať pri konštrukcii hybridov, ktoré môžu byť transkribované. To môže tiež napomôcť k zachovaniu vzdialenosti väzbových miest kódovaných enzýmov, čo môže byť dôležité. Tak napríklad pri produkcii hybridného génu nahradením ery vkladacieho modulu avr vkladacím modulom sa spolu s ery modulom odstráni malé množstvo nasledujúcej ketosyntázovej (KS) domény. Počiatok KS domény (v dobrej vzdialenosti od aktívneho miesta) je vysoko konzervovaný a poskytuje teda vhodné miesto zostrihu, ako alternatívu k linkerovej oblasti medzi vkladacou doménou a počiatkom KS domény. Vyštiepený ery modul sa potom nahradí avr vkladacím modulom.

Pri substitúcii vkladacieho modulu v skutočnosti môže byť žiadúce nahradiť nielen domény vkladacieho modulu (všeobecne acyl transferáza (AT) a acylový nosičový proteín (ACP)), ale tiež KS v počiatku nasledujúceho predlžovacieho modulu. Vyštiepený vkladací modul by zvyčajne poskytol propionátový štartér a nahradenie má poskytnúť jeden alebo viac rôznych štartérov. Propionát sa však môže posunovať do KS predlžovacieho modulu z propionátovej skupiny v hostiteľskej bunke, čo vedie k zriedeniu požadovaných produktov. Tomu je možné výrazne zabrániť substitúciou predĺženého vkladacieho modulu vrátane všetkých alebo väčšiny KS domén. (Miesto zostrihu sa môže nachádzať v koncovej oblasti génu KS alebo na počiatku v nasledujúcom AT géne alebo linkerovej oblasti medzi nimi.)

Pri nahradzovaní modulov neexistuje obmedzenie na prírodné moduly. Tak napríklad kombinatorický modul, ktorý má byť vyštiepený a/alebo nahradený a/alebo inzertovaný, môže siahať od zodpovedajúcej domény dvoch modulov prírodného typu, napríklad od AT jedného modulu do AT nasledujúceho modulu, alebo od KS do KS. Miesta zostrihu sa budú nachádzať v zodpovedajúcich konzervovaných marginálnych oblastiach alebo v linkerových oblastiach. Kombinatorický modul tiež môže byť dvojitý alebo viac početný, ked sa súčasne pridajú 2 alebo viac modulov.

Podlá ďalšieho aspektu sú predmetom vynálezu nové erytromycíny, ktoré je možné získať na základe hore opísaných aspektov. Takými zlúčeninami sú:

(i) analóg erytromycínu (ktorý je makrolidovou zlúčeninou s 14-členným kruhom), kde atóm uhlíka C-13 nesie postranný reťazec odlišný od etylskupiny, pričom takým postranným reťazcom je všeobecne lineárna alkylskupina s 3 až 6 atómami uhlíka, rozvetvená alkylskupina s 3 až 8 atómami uhlíka, cykloalkylskupina alebo cykloalkenylskupina s vždy 3 až 8 atómami uhlíka (prípadne substituovaná napríklad jednou alebo viacerými hydroxyskupinami, alkylskupinami alebo alkoxyskupinami vždy s 1 až 4 atómami uhlíka alebo atómami halogénu), alebo 3- až 6-členný heterocyklus obsahujúci kyslík alebo síru, ktorý je nasýtený alebo celkom alebo sčasti nenasýtený a prípadne substituovaný (napríklad tak, ako je to uvedené hore pre cykloalkylskupinu), alebo R¹ predstavuje fenylskupinu, ktorá je prípadne substituovaná aspoň jedným substituentom zvoleným zo súboru skladajúceho sa z alkylskupiny s 1 až 4 atómami uhlíka, alkoxyskupiny s 1 až 4 atómami uhlíka a alkyltioskupiny s 1 až 4 atómami uhlíka, atómov halogénu, trifluórmetylskupiny a kyanoskupiny; alebo R¹ môže predstavovať skupinu všeobecného vzorca a

kde

X predstavuje kyslík, síru alebo skupinu -CH₂-, a, b, c, ad predstavuje každý nezávisle číslo 0 až 2, pričom súčet a+b+c+d<5.

Ako prednostné substituenty R na uhlíku C-13 je možné uviesť zvyšky karboxylátových jednotiek RCOOR’, ktoré sú použiteíné ako substráty avr štartérovým modulom alebo rapamycínovými štartérovými variantmi. Prednostnými sub9

strátmi sú karboxylové kyseliny všeobecného vzorca RCOOH. Ako alternatívne substráty je možné použiť soli karboxylových kyselín, estery karboxylových kyselín alebo amidy. Prednostnými estermi sú tioestery N-acetylcystamínu, ktoré môžu byť avr štartérovým modulom ľahko využité ako substráty, ako je to opísané v Dutton et al. EP 0 350 187, ktorý je tu citovaný náhradou za prenesenie celého jeho obsahu do tohto textu. Prednostnými amidmi sú N-acylimidazoly. Ako iné použiteľné substráty je možné uviesť deriváty, ktoré sú oxidačnými prekurzormi karboxylových kyselín. Vhodnými substrátmi by teda napríklad boli aminokyseliny všeobecného vzorca RCH(NH₂)COOH, glyoxylové kyseliny všeobecného vzorca RCOCOOH, deriváty metylamínu všeobecného vzorca RCH2NH2, deriváty metanolu všeobecného vzorca RCH₂OH, aldehydy všeobecného vzorca RCHO alebo substituované alkánové kyseliny všeobecného vzorca R(CH₂)_nCOOH, kde n predstavuje číslo 2, 4 alebo 6. Ako príklady prednostných substrátov je teda možné uviesť izobutyrát (R = izopropyl) a 2-metylbutyrát (R = 1-metylpropyl). Ďalšími možnosťami sú napríklad nbutyrát, cyklopropylkarboxylát, cyklobutylkarboxylát, cyklopentylkarboxylát, cyklohexylkarboxylát, cykloheptylkarboxylát, cyklohexenylkarboxyláty, cykloheptenylkarboxyláty, obmeny cyklických karboxylátov s metylovaným kruhom a ich hore uvedené deriváty.

Analógy erytromycínu môžu zodpovedať počiatočnému produktu PKS (6-deoxyerytronolidu) alebo produktu získanému po jednom alebo väčšom počte stupňov normálnej biosyntézy. Táto biosyntéza zahŕňa, ako je znázornené na obr. 2b hydroxyláciu v polohe 6; O-glykozyláciu v polohe 3; O-glykozyláciu v polohe 5; hydroxyláciu v polohe 12; a špecifickú metyláciu cukorných zvyškov.

Ako neobmedzujúce príklady takých analógov je možné uviesť analógy zodpovedajúce 6-deoxyerytronolidu B, erytro mycinu A a rôznym medziproduktom a alternatívam, ktoré sú znázornené na obr. 2b.

(ii) Analógy erytromycínu, ktoré sa od zodpovedajúcej prírodnej zlúčeniny (obr. 2b) líšia v oxidačnom stave jednej alebo viacerých ketidových jednotiek (ako alternatívy prichádzajú do úvahy skupiny -C0-, -CH(OH)-, =CH- a -CH₂“).

Stereochémia akejkolvek jednotky -CH(OH)- je rovnako nezávisle volitelná.

(iii) Analógy erytromycínu, ktoré sa líšia od zodpovedajúcich prírodných zlúčenín v absencii prírodnej postrannej metylskupiny. (To je dosiahnutelné pri použití variantu AT). Pri normálnych predlžovacích moduloch sa za účelom získania nemetylovaných a metylovaných ketidových jednotiek využívajú jednotky s 2 alebo 3 atómami uhlíka. Nemetylované jednotky je možné získať, keď sú metylované jednotky prírodné (a naopak, pri systémoch, v ktorých sa vyskytujú prírodné nemetylované jednotky). Pre etylové substituenty je tiež možné poskytnúť dlhšie jednotky, napríklad s 4 atómami uhlíka.

(iv) Analógy erytromycínu, ktoré sa od zodpovedajúcej prírodnej zlúčeniny odlišujú v stereochémii prírodnej metylskupiny; a/alebo substituentoch na kruhu odlišných od metylskupiny.

(v) Analógy erytromycínu, ktoré vykazujú dve alebo viac vlastností opísaných v odsekoch (i) až (iv).

(vi) Deriváty ktorejkolvek zlúčeniny opísanej v predchádzajúcich odsekoch, ktoré boli podrobené ďalšiemu spracovaniu ne-PKS enzýmami, ako je napríklad jedna alebo viac hydroxylácií, epoxidácií, glykozylácií a metylácií.

Ďalej sú opísané spôsoby výroby nových erytromycínov podlá vynálezu. Pri najjednoduchšom spôsobe sa neprírodné štartérove jednotky (prednostne, ale nielen, analógy karboxylových kyselín neprírodných štartérových jednotiek) zavedú do netransformovaných organizmov schopných produkovať erytromycín. V prednostnom rozpracovaní sa štartérová jednotka zavedie do fermentačnej pôdy organizmu produkujúceho erytromycín, čo je pri transformovaných organizmoch schopných produkovať erytromycín efektívnejšie. Analóg štartérovej jednotky je však tiež možné zaviesť do alternatívnych prípravkov organizmov produkujúcich erytromycín, napríklad frakcionovaných alebo nefrakcionovaných prípravkov s rozbitými bunkami. Toto rozpracovanie je rovnako efektívne pre transformované organizmy schopné produkovať erytromycíny. Pri inom spôsobu sa použije jeden alebo viac segmentov DNA kódujúcej jednotlivé moduly alebo domény v heterológnej PKS typu I (donorová PKS) pre nahradenie DNA kódujúcej jednotlivé moduly alebo domény v génoch DEBS organizmu produkujúceho erytromycín. Pre túto donorovú PKS sú vhodné vkladacie moduly a predlžovacie moduly získané z akejkolvek prírodnej alebo neprírodnej PKS typu I. Osobitne vhodné pre tento účel však sú komponenty PKS typu I pre biosyntézu erytromycínu, rapamycínu, avermektínu, tetronasínu, oleandomycínu, monensínu, amfotericínu a rifamycínu, pri ktorých je vďaka génovej sekvenčnej analýze aspoň sčasti známa génová a modulárna organizácia. Ako príklady osobitne prednostných vkladacích modulov donorovej PKS sú vkladacie moduly, ktoré vykazujú uvolnenú špecifickosť, ako je vkladací modul PKS produkujúci avermektín zo Streptomvces avermitilis; alebo vkladacie moduly, ktoré vykazujú neobvyklú špecifickosť, ako sú napríklad vkladacie moduly PKS produkujúcich rapamycín, FK506 alebo askomycín, ktoré všetky prirodzene prijímajú shikimát-odvodenú štartérovú jednotku. Neočakávane bolo zistené, že ako netransformované, tak aj geneticky modifikované organizmy produkujúce erytromycín, keď sú pestované za vhodných podmienok, produkujú neprírodné erytromycíny, a v prípadoch, keď je to vhodné, sa môžu také produkty podrobiť rovnakému spracovaniu ako prírodný erytromycín.

Pri ďalšom spôsobe podľa vynálezu sa plazmid obsahujúci DNA donorovú PKS zavedie do hostiteľskej bunky za podmienok, v ktorých sa plazmid homológnou rekombináciou integruje do DEBS génov na chromozómu kmeňa produkujúceho erytromycín, za vzniku hybridnej PKS. Donorová PKS DNA prednostne zahŕňa segment kódujúci vkladací modul tak, že sa tento vkladací modul viaže k DEBS génom na chromozómu. Také hybridné PKS, keď sú kultivované za vhodných, tu opísaných, podmienok produkujú cenné a nové erytromycínové produkty. Konkrétne, keď sa vkladací modul DEBS génov nahradí vkladacím modulom PKS produkujúcej avermektín (avr), nové erytromycínové produkty obsahujú štartérovú jednotku, ktorá je typická pre produkty, ktoré sú sú prítomné v avr PKS. Keď sa teda vkladací modul ery PKS nahradí avr vkladacím modulom, zistí sa, že kmene Saccharopolvspora ervthraea obsahujúce takú hybridnú PKS produkujú 14-členné makrolidy obsahujúce štartérové jednotky, ktoré sú typicky prítomné v avr PKS.

To, že sa neočakávane zistilo, že 14-členné makro1idové polyketidy produkované takými rekombinantnými bunkami S. ervthraea zahŕňajú deriváty erytromycínu A, ukazuje, že bolo správne vykonaných niekoľko procesných stupňov, ktoré sú potrebné na transformáciu produktov hybridnej PKS na nové a terapeuticky cenné deriváty erytromycínu A. K ďalšiemu aspektu tohto vynálezu viedlo neočakávané a prekvapujúce zistenie, že transkripciu akýchkoľvek hybridných erytromycínových génov je možné špecificky zvyšovať, pokiaľ sa hybridné gény umiestnia pod kontrolu promotoru génu PKS typu II viazaného k špecifickému aktivátorovému génu pre tento promotor. Je osobitne pozoruhodné, že keď sa geneticky mo13

difikované bunky obsahujúce hybridné gény pre erytromycín pod takou kontrolou pestujú za podmienok vhodných pre produkciu erytromycínu, významne sa zvýši úroveň produkcie nového erytromycínu. Také špecifické zvýšenia výťažkov cenného erytromycínového produktu sú tiež pozorované pri prírodných erytromycínových PKS umiestnených pod kontrolu promotoru PKS typu II a aktivátorového génu. V prednostnom rozpracovaní sú požadované gény prítomné na plazmide odvodenom od SCP2 umiestnené pod kontrolou dvojsmerového promotoru actl odvodeného od aktinorodínového biosyntetického génového zhluku Streptomvces coelicolor a vektor tiež obsahuje štruktúrny gén kódujúci špecifický aktivátorový protein Act II-orf 4. Rekombinantný plazmid sa do Saccharopolyspora ervthraea zavádza za podmienok, pri ktorých sú zavedené gény PKS alebo gény PKS už prítomné v hostitelskom kmeni exprimovane pod kontrolou promotoru actl.

Také kmene produkujú požadovaný erytromycínový produkt a aktivátorový gén vyžaduje iba prítomnosť špecifického promotoru, aby sa posilnila transkripčná účinnosť od promotoru. Prekvapujúce je najmä to, že tieto aktivátory typu ActII-0rf4 nepríslušia k poznanej triede proteínov viazajúcich sa na DNA. Dalo by sa teda predpokladať, že pre aktiváciu by bolo potrebné, aby sa v heterológnom hostitelovi, o ktorom nie je známe, že produkuje aktinorodín alebo príbuzný izochromanchinónový pigment, vyskytovali ďalšie proteíny alebo iné kontrolné elementy. Rovnako je prekvapivé a užitočné, že rekombinantné kmene môžu produkovať erytromycínový produkt v množstve viac ako desaťkrát väčšom, než keď sú rovnaké PKS gény pod kontrolou prírodného promotoru, a špecifický erytromycínový produkt je rovnako produkovaný v rastúcej kultúre, skôr ako počas prechodu od rastu do stacionárnej fázy. Také erytromycíny sú užitočné ako antibiotika a slúžia vela ďalším účelom v humánnej i veterinárnej medicíne. Keď je teda bunkou modifikovanou metódami genetic14

kého inžinierstva Saccharopolvspora ervthraea. aktivátor a promotor sú odvodené od aktinorodínového PKS génového zhluku a actl/actlI-Orf4-regulovaný eryPKS génový zhluk je umiestnený v chromozómu, potom nasleduje miestne špecifická integrácia plazmidového vektoru s nízkym počtom kópií, môže sa pestovaním týchto buniek za vhodných podmienok vyrábať 14-členný makrolidový produkt vo viac ako desaťnásobnom celkovom výťažku v porovnaní s kmeňom, ktorý pod takou heterológnou kontrolou nie je. Ked sú v takej geneticky modifikovanej bunke S. ervthraea PKS gény pod touto heterológnou kontrolou hybridnými génmi PKS typu I, ktorých vytvorenie je tu opísané, je možné v porovnaní s rovnakými hybridnými génmi PKS typu I, ktoré pod takou kontrolou nie sú, získať viac ako desaťnásobok hybridného polyketidového produktu. Konkrétne, ked sú hybridnými génmi PKS typu I gény ery PKS, v ktorých je vkladací modul nahradený avr vkladacím modulom, zistí sa desaťnásobné zvýšenie celkového množstva nových 14-členných makrolidov, ktoré sú produkované geneticky modifikovanými bunkami, kedže sú pestované za vhodných podmienok opísaných v tomto textu.

Vhodné a prednostné spôsoby pestovania netransformovaných a geneticky modifikovaných buniek produkujúcich erytromycín a vhodné a prednostné spôsoby izolácie, identifikácie a praktického využitia nových erytromycínov sú podrobnejšie opísané v príkladoch.

Predmetom vynálezu sú zlúčeniny všeobecného vzorca 1

(D kde

predstavuje vodík alebo skupinu vzorca

predstavuje hydroxyskupinu alebo skupinu všeobecného vzorca

predstavuje alfa-rozvetvenú alkyl-, alkenyl-, alkinyl-, alkoxyalkyl- alebo alkyltioalkylskupinu, z ktorých každá obsahuje 3 až 8 atómov uhlíka a je prípadne substituovaná jednou alebo viacerými hydroxyskupinami; cykloalkylalkylskupinu s 5 až 8 atómami uhlíka, ktorej alkylová časť je alfa-rozvetvená a obsahuje 2 až 5 atómov uhlíka; cykloalkylskupinu s 3 až 8 atómami uhlíka alebo cykloalkenylskupinu s 5 až 8 atómami uhlíka, z ktorých každá je prípadne substituovaná metylskupinou alebo jednou alebo viacerými hydroxyskupinami alebo jednou alebo viacerými alkylskupinami s 1 až 4 atómami uhlíka alebo atómami halogénu; alebo troj- až šesťčlenný heterocyklický kruh obsahujúci kyslík alebo síru, ktorý môže byť nasýtený alebo celkom alebo sčasti nenasýtený a je prípadne substituovaný jednou alebo viacerými alkylskupinami s 1 až 4 ató16 mami uhlíka alebo atómami halogénu; alebo R¹ predstavuje fenylskupinu, ktorá je prípadne substituovaná aspoň jedným substituentom zvoleným zo súboru skladajúceho sa z alkylskupiny s 1 až 4 atómami uhlíka, alkoxyskupiny s 1 až 4 atómami uhlíka a alkyltioskupiny s 1 až 4 atómami uhlíka, atómov halogénu, trifluórmetylskupiny a kyanoskupiny; alebo R¹ môže predstavovať skupinu všeobecného vzorca a

kde

X predstavuje kyslík, síru alebo skupinu -CH₂-;

a, b, c a d predstavuje kazdy nezávisle číslo 0 az 2,

	čom súčet a + b +
	R2	predstavuje vodík
•	R3 až	R5 predstavuje každý alebo CH2CH3;
	R6	predstavuje vodík
	R7	predstavuje vodík
	R8	predstavuje vodík
	R9	predstavuje vodík

c + d je menší alebo rovný 5; alebo hydroxyskupinu;

nezávisle vodík alebo skupinu CH₃ alebo hydroxyskupinu;

alebo skupinu CH₃ alebo CH₂CH₃;

alebo desozamín;

alebo skupinu CH₃ alebo CH₂CH₃;

R¹⁰ predstavuje hydroxyskupinu, mykarózu (R¹³ predstavuje vodík) alebo kladinózu (R¹³ predstavuje skupinu CH₃),

R¹¹ predstavuje vodík; alebo

R¹⁰ = R¹¹ = kyslík; a

R¹² predstavuje vodík alebo skupinu CH₃ alebo CH₂CH₃;

a ich farmaceutický vhodné soli.

V hore uvedenej definícii alkylskupiny s 3 alebo viacerými atómami uhlíka môžu mať reťazec priamy alebo rozvetvený. Pod pojmom halogén sa rozumie fluór, chlór, bróm alebo jód. Pod pojmom alfa-rozvetvený sa rozumie, že atóm uhlíka pripojený k uhlíkovému atómu v polohe C-13 je sekundárnym uhlíkovým atómom viazaným k dvoma ďalším atómom uhlíka, pričom zvyšná časť alkylového reťazca môže byť priama alebo rozvetvená.

Prednosť sa venuje zlúčeninám všeobecného vzorca 1, kde R³ až R^, R⁷, R® a R-*-² predstavujú skupinu CH3 a R·*· predstavuje izopropyl- alebo sek.butyl-, 2-butén-2-yl-, 2pentén-2-yl- alebo 4-metyl-2-pentén-2-ylskupinu prípadne substituovanú jednou alebo viacerými hydroxyskupinami. Prednosť sa tiež venuje zlúčeninám všeobecného vzorca 1, kde R³ až R⁵, R⁷, R⁹ a R¹² predstavujú skupinu CH3 a R¹ predstavuje cykloalkylskupinu alebo cykloalkenylskupinu vždy s 3 až 6 atómami uhlíka, z ktorých každá je prípadne substituovaná jednou alebo viacerými hydroxyskupinami alebo jednou alebo viacerými alkylskupinami s 1 až 4 atómami uhlíka. Ďalšiu skupinu prednostných zlúčenín tvoria zlúčeniny, kde R¹ predstavuje päť- alebo šesťčlenný heterocyklický kruh obsahujúci kyslík alebo síru, najmä 3-tienylový alebo 3-furylový kruh, ktorý je prípadne substituovaný jednou alebo viacerými hydroxyskupinami alebo jednou alebo viacerými alkylskupinami s 1 až 4 atómami uhlíka alebo atómami halogénu. Inú skupinu prednostných zlúčenín tvoria zlúčeniny, kde R¹ predstavuje alkyltioalky1skupinu s 3 až 8 atómami uhlíka, najmä 1-metyltioetylskupinu.

Podlá ďalšieho rozpracovania sú predmetom vynálezu zlúčeniny všeobecného vzorca 2

kde

(2) predstavuje vodík alebo skupinu vzorca

ch₃

R¹⁰ predstavuje hydroxyskupinu alebo skupinu všeobecného vzorca

OH

predstavuje vodík, alkylskupinu s 1 až 8 atómami uhlíka, alkenylskupinu s 2 až 8 atómov uhlíka, alkinylskupinu s 2 až 8 atómami uhlíka, alkoxyalkyl- alebo alkyltioalkylskupinu s 1 až 6 atómami uhlíka v každej z alkylových a alkoxylových skupín, pričom ktorákoľvek z uvedených alkylových, alkoxylových, alkenylových alebo alkinylových skupín je prípadne substituovaná jednou alebo viacerými hydroxyskupinami alebo jedným alebo viacerými atómami halogénu; cykloalkylskupinu s 3 až 8 atómami uhlíka alebo cykloalkenylskupinu s 5 až 8 atómami uhlíka, z ktorých každá je prípadne substituovaná metylskupinou alebo jednou alebo viacerými alkylskupinami s 1 až 4 atómami uhlíka alebo atómami halogénu; alebo troj- až šesťčlenný heterocyklický kruh obsahujúci kyslík alebo síru, ktorý môže byť nasýtený alebo celkom alebo sčasti nenasýtený a je prípadne substituovaný jednou alebo viacerými alkylskupinami s 1 až 4 atómami uhlíka alebo atómami halogénu; alebo skupinu SR¹⁴, kde R¹⁴ predstavuje alkylskupinu s 1 až 8 atómami uhlíka, alkenylskupinu s 2 až 8 atómami uhlíka, alkinylskupinu s 2 až 8 atómami uhlíka, cykloalkylskupinu s 3 až 8 atómami uhlíka, cykloalkenylskupinu s 5 až 8 atómami uhlíka, fenylskupinu alebo substituovanú fenylskupinu, kde substituentom je alkylskupina s 1 až 4 atómami uhlíka, alkoxyskupina s 1 až 4 atómami uhlíka, halogén alebo troj- až šesťčlenný heterocyklický kruh obsahujúci kyslík alebo síru, ktorý môže byť nasýtený alebo celkom alebo sčasti nenasýtený a je prípadne substituovaný jednou alebo viacerými alkylskupinami s 1 až 4 atómami uhlíka alebo atómami halogénu;

predstavuje vodík alebo hydroxyskupinu;

R³ až

R⁵ predstavuje každý nezávisle vodík alebo skupinu CH₃ cilčloo 7

R⁶ predstavuj e vodík alebo hydroxyskupinu;

R⁷ predstavuje vodík alebo skupinu CH₃ alebo CH₂CH₃;

R⁸ predstavuje vodík alebo desozamín;

R⁹ predstavuje vodík alebo skupinu CH₃ alebo CH₂CH₃;

R¹⁰ predstavuje vuje vodík) ch₃), hydroxyskupinu, mykarózu (R¹³ predstaalebo kladinózu (R¹³ predstavuje skupinu

R¹¹ predstavuje vodík; alebo

R¹⁰

R¹¹ = kyslík; a

R¹² predstavuje vodík alebo skupinu CH₃ alebo CH₂CH₃;

pričom, ked R³ až R⁵ predstavujú CH3, R⁷ predstavuje CH3, R⁹ predstavuje CH3 a R¹² predstavuje CH3, potom R¹ nepredstavuje vodík alebo alkylskupinu s 1 atómom uhlíka;

a ich farmaceutický vhodné soli.

V hore uvedenej definícii alkylskupiny s 3 alebo viacerými atómami uhlíka môžu mať reťazec priamy alebo rozvetvený. Pod pojmom halogén sa rozumie fluór, chlór, bróm alebo jód.

Prednosť majú zlúčeniny všeobecného vzorca 2, kde R³ až R⁵ predstavujú CH3, R⁷ predstavuje CH3, R⁹ predstavuje

CH₃, R¹² predstavuje CH₃ a R¹ predstavuje skupinu SR¹⁴, kde R¹⁴ predstavuje metylskupinu alebo etylskupinu. Inú skupinu prednostných zlúčenín tvoria zlúčeniny, kde R¹ predstavuje metylskupinu, izopropylskupinu alebo sek.butylskupinu, z ktorých každá je pripadne substituovaná jednou alebo viacerými hydroxyskupinami. Ďalšiu skupinu prednostných zlúčenín tvoria zlúčeniny, kde R¹ predstavuje rozvetvenú alkylskupinu s 3 až 8 atómami uhlíka, ktorá je substituovaná jednou alebo viacerými hydroxyskupinami alebo jedným alebo viacerými atómami halogénu, najmä l-(trifluórmetyl)etylskupinu.

Predmetom vynálezu je ďalej farmaceutická kompozícia pre liečbu bakteriálnych infekcií alebo protozoálnych infekcií u cicavcov, rýb alebo vtákov, ktorá zahŕňa terapeuticky účinné množstvo zlúčeniny všeobecného vzorca 1 alebo 2 alebo jej farmaceutický vhodné soli a farmaceutický vhodný nosič.

Predmetom vynálezu je ďalej spôsob liečby bakteriálnych infekcií alebo protozoálnych infekcií u cicavcov, rýb alebo vtákov, pri ktorom sa takému cicavcovi, rybe alebo vtákovi podáva terapeuticky účinné množstvo zlúčeniny všeobecného vzorca 1 alebo 2 alebo jej farmaceutický vhodnej

Pod pojmom liečba”, ako sa používa v tomto texte, pokial to nie je uvedené inak, sa rozumie liečenia a prevencia bakteriálnych infekcií alebo protozoálnych infekcií uvedených hore.

Pod pojmom bakteriálna infekcia a protozoálna infekcia sa, pokial to nie je uvedené inak, rozumie bakteriálna infekcia a protozoálna infekcia, ktoré sa vyskytujú u cicavcov, rýb a vtákov, ako tiež choroby súvisiace s bakteriálnymi infekciami a protozoálnymi infekciami, ktoré je

možné liečiť alebo ktorým je možné predchádzať podávaním antibiotík, ako sú zlúčeniny podlá vynálezu. Ako také bakteriálne infekcie a protozoálne infekcie a choroby s nimi spojené je možné uviesť pneumóniu, otitis média, sinusitis, bronchitis, tonsilitis a mastoiditis, ktoré súvisia s infekciami Streptococcus pneumoniae, Haemophilus infíuenzae, Moraxella catarrhalis, Staphylococcus aureus alebo Peptostreptococcus spp; pharvnqitis, reumatickú horúčku a glomerulonephritis súvisiace s infekciami Streptococcus pvoqenes, streptokokmi skupiny C a G, Clostridium diptheriae alebo Actinobacillus haemolvticum; infekcie dýchacieho traktu spojené s infekciami Mycoplasma pneumoniae, Leqionella pneumophila, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus infíuenzae alebo Chlamvdia pneumoniae; nekomplikované infekcie kože a mäkkých tkanív, abscesy, osteomyelitis a horúčka šestonedielok spojené s infekciami Staphylococcus aureus, koaguláza pozitívnymi stafylokokmi (tzn. S. epidermidis, S. haemolvticus apod.), Streptococcus pvoqenes, Streptococcus agalactiae, streptokokmi skupín C-F (streptokokmi s malými kolóniami), streptokokmi viridans, Korvnebacterium minutissimum, Clostridium spp. alebo Bartonella henselae; nekomplikované akútne infekcie močového traktu súvisiace s infekciami Staphylococcus saprophyticus alebo Enterococcus spp; uretritis a cervicitis; a pohlavne prenosné choroby spojené s infekciami Chlamvdia trachomatis, Heamophilus ducrevi, Treponema pallidum, Ureaplasma urealyticum alebo Neiserria qonorrheae; choroby z toxínov spojené s infekciami S. aureus (otrava jedlom a syndróm toxického šoku) alebo streptokokmi skupiny A, B a C; vredy spojené s infekciami Helicobacter pylori; systemický febrilný syndróm spojený s infekciou Borrelia recurrentis; Limská borelióza spojená s infekciou Borrelia burqdorferi; conjunctivitis, keratitis a dacrocystitis spojené s infekciou Chlamvdia trachomatis, Neisseria qonorrhoeae, S. aureus, S. pneumoniae, S. pyoqenes, H. infíuenzae alebo Listeria spp.; disseminovaná cho23

roba z mykobaktérií komplexu Mvcobacterium avium spojená s infekciou Mvcobacterium avium alebo Mvcobacterium intracelulare; gastroenteritis spojená s infekciou Campylobacter jejuni; črevové protozoálne infekcie spojené s infekciami Cryptosporidium spp.; odontogénne infekcie spojené s infekciou streptokokmi viridans; perzistentný kašeľ spojený s infekciou Bordetella pertussis; plynná sneť spojená s infekciou Clostridium perfrigens alebo Bacteroides spp.; ateroskleróza spojená s infekciami Helicobacter pylori alebo Chlamydia pneumoniae. Ako bakteriálne infekcie a protozoálne infekcie a choroby spojené s takými infekciami, ktoré je možné liečiť alebo ktorým je možné predchádzať podávaním antibiotík, ako sú zlúčeniny podľa vynálezu, je možné uviesť respiračnú chorobu hovädzieho dobytka spojenú s infekciou P. haem., P. multocida, Mycoplasma bovis alebo Bordetella spp.; enterickú chorobu hovädzieho dobytka spojenú s infekciou E. coli alebo prvokmi (tzn. kokcídiami, kryptosporídiami apod.); mastitis mliečneho dobytka spojenú s infekciou Staph aureus, Strep. uberis, Strep. aqalactiae, Strep. dysqalactiae, Klebsiella spp.. Corynebacterium alebo Enterococcus spp.; respiračnú chorobu ošípaných spojenú s infekciou A. pleuro., P. multocida alebo Mycoplasma spp.; enterickú chorobu ošípaných spojenú s infekciou E. coli, Lawsonia intracellularis, Salmonella alebo Serpulina hyodvisinteriae; paznechtnica u hovädzieho dobytka spojená s infekciou Fusobacterium spp. , metritis hovädzieho dobytka spojená s infekciou E. coli, prstovitá dermatitis (hairy warts) u hovädzieho dobytka, spojená s infekciou Fusobacterium necrophorum alebo Bacteroides nodosus; zápal spojiviek u hovädzieho dobytka spojený s infekciou Moraxella bovis; zmetanie u hovädzieho dobytka spojené s infekciou prvokmi (tzn. neosporium); infekcia močového traktu u psov a mačiek spojené s infekciami E. coli; infekcia kože a mäkkých tkanív u psov a mačiek spojené s infekciami Staph. epidermidis, Staph. intermedius, koaguláza negatívnymi Staph. alebo P. multocida; infekcie zubov alebo

tlamy u psov a mačiek spojené s infekciami Alcaliqenes spp., Bacteroides spp.. Clostridium spp., Enterobacter spp., Eubacterium. Peptostreptococcus. Porphvromonas alebo Prevotella. Ďalšie bakteriálne infekcie a protozoálne infekcie a choroby spojené s takými infekciami, ktoré je možné liečiť alebo ktorým je možné predchádzať spôsobmi podlá vynálezu, je možné nájsť v J. P. Sanford et al., The Sanford Guide To Antimicrobial Therapy, 26. vydanie (Antimicrobial Therapy, Inc., 1996). Je tiež stále zrejmejšie, že zlúčeniny podlá vynálezu môžu byť výrazne užitočné pri liečbe chorobných stavov (napríklad rakoviny, AIDS a aterosklerózy), ktoré normálne nie sú spojené s bakteriálnymi alebo protozoálnymi infekciami.

Zlúčeniny všeobecného vzorca 1 alebo 2 je pri liečbe bakteriálnych infekcií alebo chorôb spojených s bakteriálnymi infekciami alebo rakoviny u cicavcov, ako ludí, alebo rýb alebo vtákov možné podávať samotné alebo vo forme farmaceutických kompozícií, ktoré obsahujú účinnú zlúčeninu a farmaceutický vhodné riedidlo alebo nosič. Také kompozície je možné podávať orálne, napríklad vo forme tabliet alebo toboliek, alebo parenterálne, ako napríklad subkutánnymi a intramuskulárnymi injekciami. Zlúčeniny všeobecného vzorca 1 alebo 2 je rovnako možné podávať rektálne, ako vo forme čapíkov. Voíba farmaceutický vhodného nosiča bude závisieť od zamýšíaného spôsobu podávania. Tak napríklad v tabletách je ako farmaceutický vhodný nosič možné použiť laktózu, citran sodný a soli kyseliny fosforečnej spolu s rozvolňovadlami (ako škrobom) a lubrikačnými činidlami (ako stearanom horečnatým, nátriumlaurylsulfátom a mastencom). V tobolkách sa ako užitočné farmaceutický vhodné nosiče používa laktóza a vysokomolekulárne polyetylénglykoly (napríklad s molekulovou hmotnosťou od 2000 do 4000). Za účelom parenteráIného podávania je možné pripravovať sterilné roztoky alebo suspenzie, v ktorých je farmaceutický vhodný nosič vodný (ako je napríklad voda, izotonický soľný roztok alebo izotonická dextróza) alebo nevodný (ako sú napríklad mastné oleje rastlinného pôvodu, ako bavlníkový olej alebo arašídový olej alebo polyoly, ako glycerol alebo propylénglykol ).

Pri liečbe in vivo bakteriálnych infekcií alebo chorôb spojených s bakteriálnymi infekciami u cicavcov alebo pri liečbe rôznych druhov rakoviny u ľudí (osobitne nemalobunkovej rakoviny pľúc) a iných cicavcov, ako psov, bude obvyklá denná orálna alebo parenterálna dávka kolísať v rozmedzí od 0,1 do 100 mg/kg, prednostne od 0,5 do 25 mg/kg telesnej hmotnosti a je možné ju podávať vo forme jedinej dávky alebo niekoľkých čiastkových dávok.

Pod pojmom farmaceutický vhodná soľ sa rozumejú, pokiaľ to nie je uvedené inak, soli kyslých alebo bázických skupín, ktoré sa môžu vyskytovať v zlúčeninách podľa vynálezu. Zlúčeniny podľa vynálezu, ktoré majú bázickú povahu sú schopné tvoriť rôzne soli s rôznymi anorganickými a organickými kyselinami. Na výrobu farmaceutický vhodných adičných solí bázických zlúčenín podľa vynálezu s kyselinami sa používajú kyseliny, ktoré tvoria netoxické adičné soli, tzn. soli obsahujúce farmakologicky vhodné anióny. Ako príklady takých solí je možné uviesť hydrochloridy, hydrobromidy, hydrojodidy, nitráty, sulfáty, hydrogensulfáty, fosfáty, hydrogenfosfáty, izonikotináty, acetáty, laktáty, salicyláty, citráty, hydrogencitráty, tartráty, pantotenáty, hydrogentartráty, askorbáty, sukcináty, maleáty, gentisináty, fumaráty, glukonáty, glukaronáty, sacharáty, formiáty, benzoáty, glutamáty, metánsulfonáty, etánsufonáty, benzénsulfonáty, p-toluénsulfonáty a pamoáty (tzn. 1,1'-metylénbis(2-hydroxy-3-naftoáty)).

Zlúčeniny podlá vynálezu, ktoré majú kyslú povahu, sú schopné tvoriť soli s bázami, ktoré obsahujú farmakologicky vhodné katióny. Ako príklady takých solí je možné uviesť soli s alkalickými kovmi a kovy alkalických zemín, najmä soli zlúčenín podlá vynálezu s vápnikom, horčíkom, sodíkom a draslíkom.

Niektoré zlúčeniny podlá vynálezu môžu obsahovať centrá asymetrie a vyskytujú sa teda v rôznych enantiomérnych a diastereomérnych formách. Predmetom vynálezu je použitie všetkých optických izomérov a stereoizomérov zlúčenín podlá vynálezu a ich zmesí a všetky farmaceutické kompozície a spôsoby liečby, pri ktorých sa využívajú alebo ktoré ich obsahujú.

Do rozsahu vynálezu rovnako spadajú zlúčeniny podlá vynálezu a ich farmaceutický vhodné soli, v ktorých je jeden alebo viac vodíkových, uhlíkových alebo iných atómov nahradených ich izotopmi. Také zlúčeniny môžu byť užitočné pri výskumu a ako diagnostické prostriedky pri farmakokinetických štúdiách a väzbových skúškach.

Zlúčeniny podlá vynálezu sa pripravujú fermentáciou netransfomovaného alebo transformovaného organizmu, ktorý je schopný produkovať erytromycíny. Ako neobmedzujúce príklady takých organizmov je možno uviesť Saccharopolyspora species, Streptomyces qriseoplanus, Nocardia sp., Micromonospora sp., Artobacter sp. a Streptomyces antibioticus, nie však S. coelicolor. Ako osobitne vhodné sú v tomto smere netransformované a transformované kmene Saccharopolyspora ervthraea, napríklad NRRL 2338, 18643, 21484. Osobitná prednosť sa venuje transformovaným kmeňom, v ktorých je erytromycínový vkladací modul nahradený vkladacím modulom z organizmu produkujúceho avermektín, Streptomyces avermitilis, alebo organizmu produkujúceho rapamycín, Strepto27

mvces hyqroscopicus. Prednostným spôsobom výroby zlúčenín podľa tohto vynálezu je fermentácia vhodného organizmu v prítomnosti vhodnej karboxylovej kyseliny všeobecného vzorca R¹COOH, kde R¹ má význam uvedený hore pri všeobecných vzorcoch 1 a 2, alebo jej soli, esteru (najmä prednostne tioesteru N-acetylcystamínu) alebo amidu alebo oxidačného prekurzoru. Kyselina alebo jej derivát sa k fermentačnej zmesi pridáva budí v čase inokulácie alebo v intervaloch počas fermentácie. Produkciu zlúčenín podľa vynálezu je možné monitorovať tak, že sa odoberú vzorky fermentačnej zmesi, ktoré sa extrahujú organickým rozpúšťadlom a prítomnosť zlúčenín podľa vynálezu sa stanoví chromatograficky, napríklad vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou. Inkubácia sa vykonáva až do maximálneho výťažku zlúčeniny všeobecného vzorca 1 alebo 2, zvyčajne počas 4 až 10 dní. Karboxylová kyselina alebo jej derivát sa pri každom prídavku pridáva v množstve 0,05 až 4,0 g/liter. Najlepšie výťažky zlúčenín všeobecného vzorca 1 alebo 2 sa zvyčajne dosiahnu tak, že sa kyselina alebo jej derivát k fermentačnej zmesi pridáva postupne, napríklad denne počas niekoľkých dní. Ako fermentačné médium je možné použiť obvyklé komplexné médium, ktoré obsahuje asimilovateľné zdroje uhlíka, dusíka a stopových prvkov.

Vhodné a prednostné spôsoby pestovania netransformovaných a geneticky modifikovaných buniek produkujúcich erytromycín a vhodné a prednostné spôsoby izolácie, identifikácie a praktická užitočnosť zlúčenín všeobecných vzorcov 1 a 2 sú úplnejšie opísané v príkladoch.

Opis obr. na výkresoch

Na obr. 1 sú znázornené chemické vzorce troch známych polyketidov.

Na obr. 2a je znázornený diagram, ktorý ukazuje funkciu 6-deoxyerytronolid syntázy B (DEBS), PKS produkujúcej 6-deoxyerytronolid B (6-DEB), prekurzor erytromycínu A.

Na obr. 2b je znázornená biosyntéza post-PKS erytromycínov zahŕňajúca konverziu 6-DEB na erytromycín A.

Na obr. 3a a 3b sú znázornené schémy, ktoré zobrazujú konštrukciu plazmidu pIGl.

Na obr. 4a, 4b a 4c sú znázornené schémy, ktoré zobrazujú konštrukciu plazmidu pND30.

Na obr. 5 je znázornená schéma zobrazujúca konštrukciu plazmidu pAVLD.

Na obr. 6 je znázornená integrácia pAVLD do genómu

S. ervthraea NRRL2338.

Na obr. 7 je schematicky znázornená biosyntéza rapamycínu.

Na obr.

je schematicky znázornená konštrukcia plazmidu pM06.

Na obr

9.

je schematicky znázornená konštrukcia plazmidu pCJR26.

Na obr.

je schematicky znázornená konštrukcia plazmidu pC-ATX.

Na obr.

je schematicky znázornená konštrukcia plazmidu

PC-AT12.

Na obr. 12 je schematicky znázornená konštrukcia plazmidu pCJR49.

Nasleduje podrobnejší opis vynálezu.

Velký rozsah štartérových jednotiek prijímaných avr vkladacím modulom bol súhrnne opísaný v predchádzajúcich štúdiách (napríklad v európskych patentových prihláškach 0 214 731, 0 350 187 a 0 317 148, ktoré sú tu citované náhradou za prenesenie celého ich obsahu do tohto textu). V súvislosti s tým je potrebné chápať, že sa vynález neobmedzuje na konkrétne podrobnosti uvádzaných príkladov, ktoré iba slúžia pre potvrdenie účinnosti avr vkladacieho modulu. Okrem toho sa v príkladoch používa konštrukt pIGl alebo pND30 čisté na demonštráciu schopnosti actl promotoru a jeho rozpoznávacieho aktivátorového génu actll-orf4 zvyšovať expresiu nových zlúčenín podlá vynálezu, keď je pripojený k avr vkladaciemu modulu. Z príkladov je tiež zrejmé, že netransformované kmene Saccharopolyspora ervthraea sú lahko schopné vstrebávať zvonka dodávané substráty za vzniku nových erytromycínových polyketidov. Odborníkom v tomto odbore bude tiež zrejmé, že konkrétne nové zlúčeniny podlá vynálezu je možné lahko produkovať tak, že sa zvolí vhodný kmeň produkujúci erytromycín (prípadne so začlenením plazmidu pIGl alebo pND30 do požadovaného kmeňa) a fermentačná zmes sa doplní vhodnou štartérovou jednotkou. Deriváty 6-deoxyerytromycínu a 6,12-dideoxyerytromycínu podlá vynálezu je teda možné lahko získať pri použití Saccharopolyspora ervthraea NRRL 18643 alebo NRRL 21484, ako je to uvedené v US patente č. 5 141 926 a WO 97/06266. Podobne je možné za účelom získania požadovaných nových analógov podlá vynálezu použiť kmene Saccharopolyspora ervthraea spôsobom opísaným vo Weber et al., J. Bacteriol. 164: 425 až 433. Tak je napríklad za účelom získania nových analógov erytronolidu B možné použiť kmeň UW24 (prípadne transformovaného pIGl alebo pND30).

UV spektrá boli zaznamenané pri použití diódového spektrofotometru Hewlett-Packard 1090M. Všetky spektrá NMR, pokiaľ to nie je uvedené inak, boli merané v CDC1₃ pri použití spektrometra Varian Unity 500 MHz a polohy pikov sú vyjadrené v dieloch na milión dielov (ppm) smerom dole od tetrametylsilánu. Tvary pikov sú označené nasledovne: s = singlet, d = dublet, t = triplet, q = kvartet, m = multiplet a br = široký. Čísla atómov v NMR štruktúrach nepredstavujú číslovanie podľa štandardnej nomenklatúry, ale spojujú NMR údaje s konkrétnym príkladom. Údaje HPLC-MS boli získané pri použití kvapalinového chromatografu Hewlett-Packard 1090M spojeného s hmotnostným spektrometrom VG Platform II opatreným zdrojom APCI (postup A), alebo pri použití kvapalinového chromatografu Hewlett-Packard 1050 spojeného s hmotnostným spektrometrom VG Platform II opatreným zdrojom APCI (postup B a postup C).

HPLC postup A:

Kolóna

Prietok

Beckman Ultrasphere 5 μπι ODS, mm x 25 cm

0,85 ml/min

Mobilná fáza gradient: acetonitril : 0,05M octan amónny (28 : 72) až acetonitril : : 0,05M octan amónny (50 : 50) počas 22 minút, potom zmes acetonitril : : 0,05M octan amónny (50 : 50) počas 22 až 25 minút, potom návrat k pôvodným podmienkam 25 až 30 minút

HPLC postup B:

Kolóna	MetaChem Inertsil 5 μιη C8, 3 mm x 150 mm
Prietok	0,5 ml/min
Mobilná fáza	izokratická: metanol : 0,05M octan

HPLC postup C:

Kolóna

Prietok

Mobilná fáza

amónny s 0,1 % trifluóroctovej kyseliny (60 : 40)

Waters Symmetry 5 μπι C18

2,11 mm x 150 mm

0,22 ml/min gradient: acetoniril : 0,05M octan amónny (30 : 70) až acetonitril :

: 0,05M octan amónny (50 : 50) počas 30 minút

Používajú sa nasledujúce médiá a roztoky:

Sacharózové-sukcinátové definované médium

sacharóza	69 g
dusičnan draselný	10 g
kyselina jantárová	2,36 g
dihydrogenfosforečnan draselný	2,7 g
heptahydrát síranu horečnatého (MgSO4.7H2O)	1,2 g
chlorid zinočnatý (ZnCl2)	10 mg
tetrahydrát chloridu mangánatého (MnCl2.4H2O)	6,2 g
dihydrát chloridu meďnatého (CuC12.2H2O)	0,53 mg
chlorid kobaltnatý (CoCl2)	0,55 mg
heptahydrát síranu železnatého (FeSO4.7H2O)	2,5 mg
dihydrát chloridu vápenatého (CaCl2.2H2O)	38 mg
voda milli-Q	do 1 litru
hydroxid draselný (KOH)	do pH 6 až 6,4

Médium s vodou z vodovodu glukóza tryptón kvasničný extrakt

EDTA voda z vodovodu hydroxid draselný

Médium ERY-P

dextróza múka Nutrisoy(^R)* síran amónny ((NH₄)₂ ^SO4) chlorid sodný (NaCl) uhličitan vápenatý (CaCO₃) pH nastavené na 7,0

2,5 g mg do 1,0 litru do pH 7,1 g/liter g/liter g/liter g/liter g/liter * Múka Nutrisoy(^R) bola získaná od firmy British Arkády Group, Skerton Road, Manchester, Velká Británie.

Vynález je bližšie objasnený v nasledujúcich príkladoch rozpracovania. Tieto príklady majú výhradne ilustratívny charakter a rozsah vynálezu v žiadnom ohlade neobmedzujú.

Príklad la

Konštrukcia plazmidu pIGl

Plazmid pIGl sa skladá z plazmidu odvodeného od SCP2*, ktorý obsahuje hybridný gén PKS typu I zahŕňajúci avr vkladací modul namiesto ery vkladacieho modulu, prvé dva predlžovacie moduly ery PKS a tioesterázu ery PKS. Tento plazmid sa skonštruuje cez niekolko intermediárnych plazmidov, dfalej opísaným postupom (pozri obr. 3).

i) Konštrukcia plazmidu pVE3.4

Plazmid pVE1446, ktorý obsahuje časť génov pre avermektín (avr) PKS sa získa z E. coli kmeň ATCC 68250 (MacNeil, D. J. et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 1994, 721: 123 až 132). Plazmid pVE1446 sa štiepi BamHI a 7,6kbp fragment medzi súradnicami 32.15 a 3.40 (MacNeil D. J. et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 1994, 721: 123 až 132) sa prečistí elektroforézou na géli a recirkularizuje. Zmes obsahujúca požadovaný plazmid pVE3.4 sa izoluje po transformácii E. coli kmeň TGlrecO (konštrukcia: Dr. P. Oliver, Dept. Genetics, U. Cambridge; Kolodner, R. et al., J. Bacteriol, 1985, 163: 1060 až 1066; T. Gibson, Ph.D., diplomová práca, U. Cambridge, 1985).

ii) Konštrukcia plazmidu pNCO12

Plazmid pBK25 (Bevitt, D. J. et al., Eur. J. Biochem, 1992, 204: 39 až 49) sa rozštiepi Ncol a konce 12kbp fragmentu sa reparujú a fragment sa liguje do plazmidu pUC18, ktorý bol linearizovaný Smal. Ligačná zmes sa transformuje do E. coli TG1 recO a jednotlivé kolónie sa skontrolujú na obsah plazmidu. Požadovaný plazmid pNCO12 sa identifikuje reštrikčnou analýzou.

iii) Konštrukcia plazmidu pCRabc

Plazmid pCRabc (obr. 3) sa skonštruuje nasledujúcim postupom. Vykonajú sa tri oddelené PCR reakcie: 1. Pre amplifikáciu l,0kbp produktu z 100 ng templátu pNCO12 sa použije 20 pmol každého zo syntetických oligonukleotidov Al (5'-CTC GTC GGT GGC TTT GCG-3') a A2 (5'-CCC GGG AAA AAC GAA GAC TAG TGG CGC GGA CGG CCG-3'). Konce PCR produktu sa reparujú a produkt sa fosforyluje a klonuje do pUC18 štiepeného Smal, čím sa získa plazmid pCRa. 2. Pre amplifikáciu l,5kbp produktu zo 100 ng pNC012 templátu sa použije 20 pmol každého zo syntetických oligonukleotidov Cl (5'-CAC GCG CAG CGC GGC

GGA-3’) a C2 (5’-CGA ACC GCT AGC GGT CGT CGC GAT GGC CT-3’). Konce PCR produktu sa reparujú a produkt sa fosforyluje a klonuje do pUC18 štiepeného Smal, čím sa získa plazmid pCRc. 3. Pre amplifikáciu l,4kbp produktu z 100 ng pVE3.4 templátu sa použije 20 pmol každého zo syntetických oligonukleotidov BI (5'-GTG GCC CGG CCG TCC GCG CCA CTA GTC TTC GTT ttt_3·) _a B2 (5'-AAC AGC TAG CGG TTC GTC CGC CGC TGC CGT GCC-3'. Konce PCR produktu sa reparujú a produkt sa fosforyluje a klonuje do pUC18 štiepeného Smal, čím sa získa plazmid pCRb.

Plazmid pCRa sa štiepi HindlII a Spel a l,0kbp inzert sa liguje s plazmidom pCRb, ktorý bol skôr štiepený HindlII a Spel, čím sa získa plazmid pCRab. Plazmid pCRc sa štiepi NheI a EcoRI a l,5kbp inzert sa liguje s plazmidom pCRab, ktorý bol skôr štiepený NheI a EcoRI, čím sa získa plazmid pCRabc.

iv) Konštrukcia plazmidu pNEWAVETE

Plazmid pCRabc sa štiepi Mfel a Sfil a DNA fragment obsahujúci vkladaciu doménu avr PKS sa purifikuje elektroforézou na géli a liguje s plazmidom pNTEP2, ktorý bol skôr štiepený Mfel a Sfil. Dlhší fragment sa purifikuje elektroforézou na géli. Ligačná zmes sa transformuje do E. coli TG1 recO a jednotlivé kolónie sa skontrolujú na obsah plazmidu. Požadovaný plazmid pNEWAVETE (13,7 kbp) sa identifikuje reštrikčnou analýzou.

(v) Konštrukcia plazmidu pRM52

Plazmid pRM52 je derivátom plazmidu pRM5 (McDaniel R. et al., Science, 1993, 262: 1546 až 1550). pRM5 sa najskôr linearizuje štiepením Ndel, reparujú sa konce a produkt sa opäť liguje za vzniku pRM51. pRM51 sa štiepi PacI a Nsil.

Izoluje sa veľký Pacl-Nsil fragment, ktorý sa liguje na krátky dvojreťazcový oligonukleotidový linker obsahujúci miesto Ndel, ktorý bol skonštruovaný aneláciou syntetických oligonukleotidov 5'-TAA GGA GGA CAC ATA TGC A-3' a 5'-TAA TTC CTC CTG TGT AT-3'. Ligačná zmes sa transformuje do E. coli TGIrecO a izolované kolónie sa skúšajú na obsah plazmidu. Požadovaný plazmid (19,6 kbp) sa identifikuje pomocou reštrikčnej mapy a označí sa ako pRM52.

vi) Konštrukcia plazmidu pIGl

Plazmid pNEWAVETE sa štiepi Ndel a Xbal a inzert sa purifikuje sedimentáciou v gradiente sacharózy. Purifikovaný inzert sa liguje na plazmid pRM52 (19,6 kbp), ktorý bol štiepený Ndel a Xbal. Vektor sa purifikuje sedimentáciou v gradiente sacharózy. Ligačná zmes sa použije pre transformáciu E. coli. Jednotlivé kolónie sa skúšajú na obsah plazmidu. Požadovaný plazmid pIGl sa identifikuje reštrikčnou analýzou.

Príklad lb

Konštrukcia plazmidu pND30

Plazmid pND30 sa skladá z plazmidu odvodeného od SCP2*, ktorý obsahuje hybridný gén PKS typu I zahŕňajúci avr vkladací modul namiesto ery vkladacieho modulu, prvé dva predlžovacie moduly ery PKS a tioesterázu ery PKS. Tento plazmid sa skonštruuje cez niekoľko intermediárnych plazmidov, ďalej opísaným postupom (pozri obr. 4).

i) Konštrukcia rekombinantného vektoru pCJRIOl pCJRIOl (obr. 4) je shuttle plazmid, skonštruovaný za účelom expresie génov PKS v aktinomycétach. Obsahuje

replikon ColEl, ktorý mu umožní replikovať sa v E. coli, streptomycétový replikon SCP2 s malým počtom kópií (Bibb, M. J. a Hopwood, D. A., J. Gen. Microbiol (1981) 126: 427) a aktivátorový gén actll-orf4 zo zhluku act, ktorý aktivuje transkripciu od promotoru act počas priechodu od rastovej k stacionárnej fáze vo vegetatívnom mycéliu. Skonštruuje sa nasledujúcim postupom: približne 970bp DNA fragment z pMF1015 (ktorý obsahuje aktivátorový gén actll orf4) (Fernandes-Moreno, M. A. et al., Celí (1991) 66: 769 až 780) sa amplifikuje pomocou PCR pri použití syntetických oligonukleotidov 5'-ACT AGT CCA CTG CCT CTC GGT AAA ATC CAG C-3' a 5'-CTT AAG AGG GGC TCC ACC GCG TTC ACG GAC-3', ako prajmerov, pričom sa rovnako zavedú lemujúce reštrikčné miesta Spel a AfIII. Tento fragment sa klonuje do AatlI miesta plazmidu pUC19 s reparovanými koncmi, čím sa získa plazmid pCJR18. Približne 215bp DNA fragment sa amplifikuje z pMV400, ktorý obsahuje dvojsmerový promotorový pár PactIII/ PactI (Parro, V. et al., Nucl. Acids Res. (1991) 19: 26232627), pričom sa ako prajmery použijú syntetické oligonu kleotidy 5'-ACA TTC TCT ACG CCT AAG TGT TCC CCT CCC TGC

CTC-3' a 5¹-GTG ATG TAT GCT CAT ATG TGT CCT CCT TAA TTA ATC GAT GCG TTC GTC CGG TG-3', pričom sa tiež zavedú lemujúce

Ndel a AfIII miesta. PCR produkt sa štiepi Ndel a AfIII a liguje s plazmidom pCJR18, ktorý bol štiepený Ndel a AfIII, čím sa získa plazmid pCJR19. l,lkbp HindlII Sphl fragment obsahujúci gén tsr, ktorý udeľuje rezistenciu voči tiostreptonu, sa získa pomocou PCR z plazmidu pIJ922 (Lydiate, D. J. et al., Gene (1985), 35: 223 až 235), ako templátu, pričom sa ako prajmery použijú oligonukleotidy 5'-TGA ACA CCA AGC TTG CCA GAG AGC GAC GAC TTC CCC-3' a 5'-GAC AGA TTG CAT GCC CTT CGA GGA GTG CCC GCC CGG-3¹, čím sa rovnako zavedú lemujúce miesta HindlII a Sphl. PCR produkt sa štiepi HindlII a Sphl a liguje s plazmidom pCJR19 štiepeným HindlII a Sphl, čím sa získa plazmid pCJR24. Plazmid pIJ922 sa štiepi BamHI a SstI a fragment obsahujúci časť lokusu fertility a počia37 tok replikácie (Lydiate D. J. et al., Gene (1985) 35: 223 až 235) sa liguje do pUC19, ktorý bol štiepený BamHI a SstI, za vzniku bifunkčného plazmidu pCJR16 (14,7 kbp). Plazmid pCJR24 sa štiepi Sali a Sphl, dva väčšie fragmenty zo štiepenia sa purifikujú elektroforézou na gél i a spoja pri štvorzložkovej ligácii s plazmidom pCJR16, ktorý bol štiepený Xhol a Sphl. Ligačná zmes sa použije na transformáciu Streptomvces lividans. Kolónie sa selektujú v prítomnosti tiostreptonu. Ukáže sa, že jedna taká kolónia obsahuje požadovaný plazmid pCJRIOl (približne 12,4 kbp), ktorý sa identifikuje reštrikčnou analýzou.

ii) Konštrukcia plazmidu pCJR29

Konštrukcia plazmidu pCJR29 je znázornená na obr. 4. l,lkbp HindlII-Xhol fragment obsahujúci gén tsr, ktorý udeľuje rezistenciu voči tiostroptonu, sa získa PCR z plazmidu pIJ922, ako templátu, pri použití oligonukleotidov 5'-TGA ACA CCA AGC TTG CCA GAG AGC GAC GAC TTC CCC-3' a 5'-GAC AGA TTC TCG AGC CTT CGA GGA GTG CCC GCC CGG-3' , ako prajmerov, čím sa tiež zavedú lemujúce miesta HindlII a Xhol. PCR pro-

dukt sa štiepi HindlII a Xhol a liguje s plazmidom pCJR16, ktorý bol štiepený HindlII a Xhol za vzniku plazmidu pCJR25. Plazmid pCJR25 sa štiepi HindlII a Sphl a liguje s plazmidom pCJR19, ktorý bol štiepený HindlII a Sphl, čím sa získa požadovaný plazmid pCJR29 (asi 12,4 kbp), identifikovaný svojou reštrikčnou mapou. Plazmid pCJR29 sa od plazmidu pCJRIOl líši orientáciou génu tsr, génu ActII-orf4 a promotoru actl/ actIII vzhladom na SCP2*-odvodenému počiatku replikácie.

iii) Konštrukcia plazmidu pND30

Plazmid pNEWAVETE sa štiepi Ndel a Xbal a inzert sa purifikuje sedimentáciou v gradiente sacharózy. Purifikovaný inzert sa liguje do plazmidu pCJR29 (približne 12,4 kbp), ktorý bol štiepený Ndel a Xbal a vektor sa prečistí sedimentáciou v gradiente sacharózy. Ligačná zmes sa použije na transformáciu E. coli a jednotlivé kolónie sa skúšajú na obsah plazmidu. Požadovaný plazmid pND3O sa identifikuje pomocou svojej reštrikčnej mapy.

Príklad lc

Konštrukcia plazmidu pCJR26

Najskôr sa niekolkostupňovým postupom skonštruuje plazmid pMO6 (obr. 8).

i) Konštrukcia plazmidu pMOl

Približne l,3kbp DNA segment génu eryAI S. ervthraea od nukleotidu 1948 do nukleotidu 3273 eryAI (Donadio S. et al., Science (1991) 252, 675 až 679) sa amplifikuje PCR pri použití syntetických oligonukleotidov 5'-CAT GCT CGA GCT CTC CTG GGA AGT-3' a 5'-CAA CCC TGG CCA GGG AAG ACG AAG ACG G-3', ako prajmerov a plazmidu pNTEP2, ako templátu. PCR produkt sa po reparácii koncov liguje s plazmidom pUC18, ktorý bol linearizovaný štiepením Smal a potom spracovaný alkalickou fosfatázou. Ligačná zmes sa použije na transformáciu E. coli TG1 recO a jednotlivé kolónie sa skúšajú na obsah plazmidu. Požadovaný plazmid pMOl (3,9 kbp), v ktorom Stul miesto lemujúce inzert susedí s HindlII miestom v polylinkeri, sa identifikuje pomocou reštrikčnej mapy.

ii) Konštrukcia plazmidu pMO2

Približne 0,85kbp DNA segment génu rapA Streptomvces hyqroscopicus od nukleotidu 1643 do nukleotidu 2486 rapA sa PCR amplifikuje pri použití nasledujúcich oligonukleotidov 5'-TTC CCT GGC CAG GGG TCG CAG CGT G-3' a 5'

CAC CTA GGA CCG CGG ACC ACT CGA C-3' , ako prajmerov, a DNA z rekombinantného bakteriofágu lambda-ΙΕ (Schwecke T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92: 7839 až 7843), ako templátu. PCR produkt sa po reparácii koncov liguje s plazmidom pUC18, ktorý bol linearizovaný štiepením Smal a potom ošetrený alkalickou fosfatázou. Ligačná zmes sa použije na transformáciu E. coli TG1 recO a jednotlivé kolónie sa skúšajú na obsah plazmidu. Požadovaný plazmid pM02 (3,5 kbp) sa identifikuje reštrikčnou mapou.

iii) Konštrukcia plazmidu pMO3

Približne l,7kbp DNA segment génu eryAI S. ervthraea od nukleotidu 4128 do nukleotidu 5928 eryAI sa PCR amplifikuje pri použití syntetických oligonukleotidov 5'-TGG CCA GGG AGT CGG TGC ACC TAG GCA-3 ' a 5'-GCC GAC AGC GAG TCG ACG CCG AGT T-3', ako prajmerov, a plazmidu pNTEP2, ako templátu. PCR produkt sa po reparácii koncov liguje s plazmidom pUC18, ktorý bol linearizovaný štiepením Smal a potom spracovaný alkalickou fosfatázou. Ligačná zmes sa použije na transformáciu E. coli TG1 recO a jednotlivé kolónie sa skúšajú na obsah plazmidu. Požadovaný plazmid pM03 (4,4 kbp), v ktorom miesta Balí a AvrlI susedia s miestom HindlII polylinkeru, sa identifikuje pomocou reštrikčnej mapy.

vi) Konštrukcia plazmidu pM04

Plazmid pMOl sa štiepi HindlII a Balí a l,3kbp inzert sa liguje s plazmidom pM03, ktorý bol štiepený HindlII a Balí. Ligačná zmes sa použije na transformáciu E. coli TG1 recO a jednotlivé kolónie sa skúšajú na obsah plazmidu. Požadovaný plazmid pM04 (5,6 kbp) sa identifikuje pomocou reštrikčnej mapy.

v) Konštrukcia plazmidu pM05

Plazmid pM04 sa štiepi Stul a 3,0kbp inzert sa liguje s plazmidom pNTEP2, ktorý bol štiepený Stul a purifikovaný elektroforézou na géli, za účelom odstránenia 3,8kbp inzertu. Ligačná zmes sa transformuje do E. coli TG1 recO a jednotlivé kolónie sa skúšajú na obsah plazmidu. Plazmid pMO5 (12,8 kbp) sa identifikuje pomocou reštrikčnej mapy.

vi) Konštrukcia plazmidu pMO6

Plazmid pMO2 sa štiepi Balí a AvrlI a inzert sa liguje s plazmidom pM05, ktorý bol štiepený Balí a AvrlI. Ligačná zmes sa použije na transformáciu E. coli TG1 recO a jednotlivé kolónie sa skúšajú na obsah plazmidu. Požadovaný plazmid pMO6 (13,5 kbp) sa identifikuje pomocou reštrikčnej mapy.

vii) Konštrukcia plazmidu pCJR26

Plazmid pCJR26 je plazmid založený na SCP2*, ktorý zahŕňa gén PKS obsahujúci ery vkladací modul, prvý a druhý rozširovací modul ery PKS a ery tioesterázu pre termináciu reťazcov, kde však bol DNA segment kódujúci metylmalonylCoA:ACP acyltransferázu v prvom rozširovacom module špecificky nahradený DNA kódujúcej malonyl-CoA:ACP acyltransferázu modulu 2 rap PKS. Skonštruuje sa ďalej opísaným spôsobom (pozri obr. 9): plazmid pM06 sa štiepi Ndel a Xbal a inzert sa liguje s plazmidom pCJR24, ktorý bol štiepený Ndel a Xbal a prečistený elektroforézou na géli. Ligačná zmes sa transformuje do E. coli TG1 recO a jednotlivé kolónie sa skúšajú na obsah plazmidu. Požadovaný plazmid pCJR26 sa identifikuje pomocou reštrikčnej mapy.

Konštrukcia S. erythraea JC2/pCJR26 a produkcia TKL derivátov

Na transformáciu protoplastov S. erythraea JC2 sa použije plazmid pCJR26. Na médie R2T20 obsahujúcom 10 μ9/ιη1 tiostreptonu sa vyselektujú kolónie rezistentné voči tiostreptonu. Niekoľko klonov sa Southernovou hybridizáciou genómovej DNA pri použití génu DEBS1-TE značeného DIG skúša na prítomnosť pCJR26 integrovaného do chromozómu.

Kloň s integrovanou kópiou pCJR26 sa pestuje v médie SSM, ktoré obsahuje 5 ^g/ml tiostreptonu počas 7 dní pri 28 až 30°C. Potom sa živné médium prefiltruje, aby sa odstránilo mycélium a pH filtrátu sa nastaví na 3. Médium sa extrahuje dvoma objemami etylacetátu a spojené etylacetátové extrakty sa premyjú rovnakým objemom nasýteného chloridu sodného, vysuší bezvodým síranom sodným a pri zníženom tlaku sa odstráni etylacetát. Získa sa asi 500 mg surového produktu. Ukáže sa, že produkty sú δ-laktón (2S,3R,5R)-2metyl-3,5-dihydroxy-N-hexánovej kyseliny a δ-laktón (2S,3R,5R)2-metyl-3,5-dihydroxy-n-heptánovej kyseliny, ktoré zodpovedajú nasledujúcim vzorcom:

Príklad le

Konštrukcia S. ervthraea NRRL 2338/pCJR26 a jeho použitie pri produkcii 14-členných makrolidov

Na transformáciu protoplastov S. ervthraea NRRL2338 sa použije približne 5 mg DNA pCJR49, čím sa získa kmeň, ktorý má plazmid integrovaný v chromozómu. Z niekolkých kolónií sa získa úplná DNA, ktorá sa analyzuje Southernovou hybridizáciou, aby sa potvrdilo že sa plazmid začlenil do modulu 2 EryAI za vzniku novej makrolidovej biosyntetickej dráhy. Došlo k ďalším začleneniam za vzniku kópií plazmidových sekvencii. S. ervthraea NRRL 2338/pCJR49 sa zaočkuje pôda tryptic soy broth obsahujúca 5 mg/ml tiostreptonu a inkubuje 3 dni pri 30°C. 100 ml tejto inokulačnej kultúry sa použije na zaočkovanie 2 litrov sacharózového sukcinátového definovaného média obsahujúceho 5 mg/ml tiostreptonu v 5 x 21itrových flašiach, z ktorých každá obsahuje 500 ml média s 2 pružinami na ulahčenie dispergácie, a trepe pri frekvencii 300 min“¹. Po ďalšom päťdennom raste sa kultúry centrifugujú a pH supernatantu sa nastaví na 9. Supernatant sa potom extrahuje trikrát rovnakým objemom etylacetátu. Rozpúšťadlo sa odparí a produkty sa analyzujú HPLC/MS. Identifikujú sa dva makrolidy, ako analógy erytromycínu:

NMe₂

Príklad lf

Konštrukcia plazmidu pC-ATX

Plazmid pC-ATX je plazmidom na báze SCP2*, ktorý obsahuje gény PKS zahŕňajúce ery vkladací modul, prvý a druhý predlžovací modul ery PKS a ery tioesterázu pre termináciu reťazcov, pričom však DNA segment kódujúci metylmalonyl-CoA:ACP acyltransferázu v prvom predlžovacom module je špecificky nahradený DNA kódujúcej malonyl-CoA:ACP acyltransferázu z putatívneho génového zhluku PKS typu I klonovaného zo Streptomvces cinnamonensis ATCC 14513 (ktorý produkuje polyéterový polyketid monenzín). Tento plazmid sa skonštruuje cez niekolko intermediárnych plazmidov nasledujúcim postupom (pozri obr. 10).

i) Izolácia kozmidu pSCIN02

Z velkostne frakcionovaných 35 až 45kbp Sau3A fragmentov chromozomálnej DNA ligovaných na kozmidový vektor pWE15 linearizovaného BamHI a ošetreného alkalickou fosfatázou sa zostaví genómová knižnica Streptomvces cinnamonensis ATCC 14513 (organizmus produkujúci monenzín). Ligačná zmes sa pri použití baliacich extraktov Gigapack zabalí do lambda častíc a transfekuje do E. coli NMlblue. Približne 600 kolónií knižnice sa pestuje na povrchu nylonovej membrány, lyžuje a ich DNA sa pomocou ožiarenia paprskmi UV krížovo viaže k membráne. Membrána sa následne použije pre screening. Inzert pMO8 obsahujúci ketosyntázovú doménu z modulu 2 DEBS sa značí náhodilým prajmingom v prítomnosti ³³PaATP a použije ako sonda pre hybridizáciu DNA. Sonda sa hybridizuje 16 hodín pri 68°C v 4,0xSSC tlmivom roztoku a následne vymýva počas 1 hodiny pri 68°C v 0,8xSSC tlmivom roztoku. Izolujú sa tri pozitívne klony. DNA inzertov všetkých troch klonov sa sekvenuje od T3 a T7 prajmovacích miest prítomných vo vektore pWE15. V DNA sekvencii od prajmovacieho miesta T7 je pri použití klonu 2 (nazvaného ako pSCIN02), ako templátu objavená oblasť homológna s doménou ketosyntázy typu I a malonyl-CoA:ACP transferázy. Čiastočným DNA sekvenovaním malonyl-CoA:ACP acyltransferázovej domény (nazvanej ako ATX) sa zistí neobvyklý sekvenčný motív v putatívnej časti domény rozpoznávacej substrát, ktorá sa podstatne líši od hore opísaných malonát- alebo metylmalonát-špecifických CoA:ACP acyltransferáz (Haydock, S. F. et al., FEBS (1995) 374: 246 až 248).

ii) Konštrukcia plazmidu pMO38

Približne 0,9kbp segment DNA domény ATX sa amplifikuje pomocou PCR pri použití nasledujúcich oligonukleogidov, ako prajmerov: 5'-CTG GCC AGG GCG CGC AAT GGC CGA GCA T-3' a 5' -CCC TAG GAG TCG CCG GCA GTC CAG CGC GGC GCC C-3 ' a kozmidu pSCLN02, ako templátu. PCR produkt sa koncovo reparuje a liguje s plazmidom pUC18, ktorý bol linearizovaný štiepením Smal a ošetrený alkalickou fosfatázou. Ligačná zmes sa použije na transformáciu E. coli TGI recO. Jednotlivé kolónie sa skontrolujú na obsah plazmidu. Požadovaný plazmid pMO38 (3,5 kbp) sa identifikuje pomocou reštrikčnej mapy.

iii) Konštrukcia plazmidu pMO34

Plazmid pMO34 je derivát pMO6 s polyklonovacím miestom inzertovaným za stop kodónom inzertovaného génu D1-AT2. Plazmid pM06 sa štiepi EcoRI a HindlII a aneluje sa dvoma oligonukleotidmi, ktoré tvoria dvojreťazcovú oblast polyklonovacieho miesta: 5'-AAT TCA TAA CTA GTA GGA GGT CTG GCC ATC TAG A-3' a 5'-TCG AAG ATC TAC CGG TCT GGA GGA TGA TCA ATA C-3'. Zmes sa liguje a transformuje do E. coli TGI recO. Jednotlivé kolónie sa skontrolujú na obsah plazmidu.

Požadovaný plazmid pMO34 (13,5 kbp) sa identifikuje reštrikčnou mapou.

vi) Konštrukcia plazmidu pMO35

Plazmid pMO35 je derivátom pMO34, ktorý obsahuje gén TKLS-AT2 a translačne kopulovaný gén pre krotonyl-CoAreduktázu zo Streptomyces collinus (Wallace et al., E. J. Biochem (1995) 233: 954 až 962). Gén pre krotonyl-CoA-reduktázu sa vyštiepi z plazmidu pZYB3 (dar od prof. K. Reynoldsa), ako fragment Ndel-BamHI, ktorý sa ošetrí nukleázou z fazule mungo, čím sa dosiahne otupenie koncov a liguje do pMO34, ktorý bol štiepený Spel, s koncmi podobne otupenými pri použití nukleázy fazule mungo. Ligačná zmes sa použije na transformáciu E. coli TG1 recO. Pri jednotlivých kolóniách sa overí obsah plazmidu. Požadovaný plazmid pMO35 (14,2 kbp) so správnou orientáciou génu pre krotonyl-CoAketoreduktázu sa identifikuje pomocou reštrikčnej mapy.

v) Konštrukcia plazmidu pMO36

Plazmid pMO38 sa štiepi Balí a AvrlI. Inzert sa liguje s plazmidom pMO35, ktorý bol štiepený Balí a AvrlI. Ligačná zmes sa použije na transformáciu E. coli TG1 recO. Pri jednotlivých kolóniách sa overí obsah plazmidu. Požadovaný plazmid pMO36 (13,5 kbp) sa identifikuje pomocou reštrikčnej mapy.

vi) Konštrukcia plazmidu pC-ATX

Plazmid pMO36 sa štiepi Ndel a Xbal. Inzert sa liguje s plazmidom pCJR29, ktorý bol štiepený Ndel a Xbal a prečistený gélovou elektroforézou. Ligačná zmes sa transformuje do E. coli TG1 recO. pri jednotlivých kolóniách sa overí obsah plazmidu. Požadovaný plazmid pC-ATX sa identifikuje pomocou reštrikčnej mapy.

Príklad lg

Konštrukcia s. ervthraea JC2/pC-ATX a produkcia derivátov TKL

Na transformáciu protoplastov S. ervthraea JC2 sa použije plazmid pC-ATX. Na médie R2T20 obsahujúcom 10 μ9/ιη1 tiostreptonu sa vyselektujú kolónie rezistentné voči tiostreptonu. Niekolko klonov sa skúša na prítomnosť pC-ATX integrovaného do chromozómu tak, že sa ich genómová knižnica podrobí Southernovej hybridizácii s DNA kódujúcej gén DEBS1-TE značenou DIG.

Kloň s integrovanou kópiou pC-ATX sa vypestuje v SSM médie obsahujúcom 5 ug/ml tiostreptonu a nechá rásť 7 dní pri 28 až 30’C. Potom sa živná pôda prefiltruje, aby sa odstránilo mycélium a pH filtrátu sa nastaví na 3. Živná pôda sa extrahuje dvakrát dvoma objemami etylacetátu. Spojené etylacetátové extrakty sa premyjú rovnakým objemom nasýteného chloridu sodného, vysušia bezvodým síranom sodným a pri zníženom tlaku sa z nich odstráni etylacetát. Získa sa 500 mg surového produktu. Produkty sa charakterizujú plynovou chromatografiou, hmostnostnou spektrometriou a NMR. Ukáže sa, že sa získa δ-laktón (2S,3R,4S,5R)-2-metyl4-etyl-3,5-dihydroxy-N-hexánovej kyseliny a δ-laktón (2S,3R,4S,5R)-2-metyl-4-etyl-3,F-dihydroxy-N-heptánovej kyseliny.

Príklad lh

Konštrukcia S. ervthraea NRRL 2338/pC-ATX a jeho použitie pri produkcii 14-členných makrolidov

Na transformáciu protoplastov S. ervthraea NRRL 2338 sa použije približne 5 mg DNA pC-ATX, čím sa získa kmeň s plazmidom integrovaným do chromozómu. Z niekolkých kolónií sa získa úplná DNA, ktorá sa analyzuje Southernovou hybridizáciou, aby sa potvrdilo že sa plazmid začlenil do modulu 2 EryAI za vzniku novej makrolidovej biosyntetickej dráhy. Došlo k ďalším začleneniam za vzniku kópií plazmidových sekvencií. S. ervthraea NRRL 2338/pC-ATX sa zaočkuje pôda tryptic soy broth obsahujúca 5 mg/ml tiostreptonu a inkubuje 3 dni pri 30’C. 100 ml tejto inokulačnej kultúry sa použije na inokuláciu 2 litrov sacharózového sukcinátového definovaného média obsahujúceho 5 mg/ml tiostreptonu v 5 x 21itrových flašiach, z ktorých každá obsahuje 500 ml média s 2 pružinami na uľahčenie dispergácie, a trepe pri frekvencii 300 min^-1. Po ďalšom päťdennom raste sa kultúry centrifugujú a pH supernatantu sa nastaví na 9. Supematant sa potom extrahuje trikrát rovnakým objemom etylacetátu. Rozpúšťadlo sa odparí a produkty sa analyzujú HPLC/MS. Identifikujú sa dva makrolidy:

OH

OH

Príklad li

Konštrukcia plazmidu pC-AT12

Plazmid pC-AT12 je plazmidom na báze SCP2*, ktorý obsahuje gén PKS zahŕňajúci ery vkladací modul, prvý a druhý predlžovací modul ery PKS a ery terminačnú tioesterázu, pričom však DNA segment kódujúci metylmalonyl-CoA:ACP acyltransferázu v druhom predlžovacom module je špecificky nahradený DNA kódujúcej malonyl-CoA:ACP acyltransferázu modulu 2 rap PKS. Plazmid sa skonštruuje cez niekolko intermediárnych plazmidov nasledujúcim postupom (pozri obr. 11).

i) Konštrukcia plazmidu pMO25

Približne l,Okbp DNA segment génu eryAI S. erythraea od nukleotidu 6696 do nukleotidu 7707 eryAI (Donadio S. et al., Science (1991) 252, 675 až 679) sa amplifikuje PCR pri použití syntetických oligonukleotidov 5'-GGC GGG TCC GGA GGT GTT CAC CGA GTT-3 ' a 5'-ACC TTG GCC AGG GAA GAC GAA CAC TGA-3', ako prajmerov a plazmidu pNTEp2, ako templátu. PCR produkt sa po reparácii koncov liguje s plazmidom pUC18, ktorý bol linearizovaný štiepením Smal a potom ošetrený alkalickou fosfatázou. Ligačná zmes sa použije na transformáciu E. coli TG1 recO a jednotlivé kolónie sa skúšajú na obsah plazmidu. Požadovaný plazmid pMO25 (3,6 kbp), v ktorom Stul miesto lemujúce inzert susedí s HindlII miestom v polylinkeri, sa identifikuje pomocou reštrikčnej mapy.

ii) Konštrukcia plazmidu pMO26

Približne 0,6kbp DNA segment génu eryAI S. ervthraea od nukleotidu 8660 do nukleotidu 9258 eryAI sa PCR amplifikuje pri použití syntetických oligonukleotidov 5'TCC TAG GCC GGG CCG GAC TGG TCG ACC TGC CGG GTT-3' a 5'

AAA CAC CGC GAC CTG GTC CTC CGA GC-3', ako prajmerov, a plazmidu pNTEP2, ako templátu. PCR produkt sa po reparácii koncov liguje s plazmidom pUC18, ktorý bol linearizovaný štiepením Smal a potom ošetrený alkalickou fosfatázou. Ligačná zmes sa použije na transformáciu E. coli TGI recO a jednotlivé kolónie sa skúšajú na obsah plazmidu. Požadovaný plazmid pMO26 (3,2 kbp), v ktorom miesto AvrlI susedí s miestom HindlII polylinkeru, sa identifikuje pomocou reštrikčnej mapy.

iii) Konštrukcia plazmidu pMO27

Plazmid pMO25 sa štiepi EcoRI a Balí a l,Okbp inzert sa liguje s plazmidom pMO2, ktorý bol štiepený EcoRI a Balí. Ligačná zmes sa použije na transformáciu E. coli TGI recO. Pri jednotlivých kolóniách sa overí obsah plazmidu. Požadovaný plazmid pMO27 (4,4 kbp) sa identifikuje pomocou reštrikčnej mapy.

iv) Konštrukcia plazmidu pMO32

Plazmid pMO26 sa štiepi AvrlI a HindlII a 0,6kbp inzert sa liguje s plazmidom pMO27, ktorý bol štiepený AvrlI a HindlII. Ligačná zmes sa použije na transformáciu E. coli TGI recO. Pri jednotlivých kolóniách sa overí obsah plazmidu. Požadovaný plazmid pMO32 (5,1 kbp) sa identifikuje pomocou reštrikčnej mapy.

v) Konštrukcia plazmidu pMO33

Plazmid pMO32 sa štiepi BspEI a SexAI a 2,7kbp inzert sa liguje s plazmidom pNTEP2, ktorý bol štiepený dvoma rovnakými enzýmami a prečistený gólovou elektroforézou, aby sa odstránil 2,8kbp inzert. Ligačná zmes sa transformuje do E. coli TGI recO. Pri jednotlivých kolóniách sa overí obsah plazmidu. Plazmid pMO33 (12,8 kbp) sa identifikuje pomocou reštrikčnej mapy.

vi) Konštrukcia plazmidu pC-AT12

Plazmid pMO33 sa štiepi Ndel a Xbal a inzert sa liguje s plazmidom pCJR29, ktorý bol štiepený Ndel a Xbal a prečistený gélovou elektroforézou. Ligačná zmes sa transformuje do E. coli TG1 recO. Pri jednotlivých kolóniách sa overí obsah plazmidu. Požadovaný plazmid pC-AT12 sa identifikuje pomocou reštrikčnej mapy.

Príklad lj

Konštrukcia S. ervthraea JC2/pC-AT12 a produkcia derivátov TKL

Na transformáciu protoplastov S. ervthraea JC2 sa použije plazmid pC-AT12. Na médie R2T20 obsahujúcom 10 μg/ml tiostreptonu sa vyselektujú kolónie rezistentné voči tiostreptonu.

Kloň s integrovanou kópiou pC-AT12 sa vypestuje v SSM médie obsahujúcom 5 μς^Ι tiostreptonu a nechá rásť počas 7 dní pri 28 až 30’C. Potom sa živná pôda prefiltruje, aby sa odstránilo mycélium a pH filtrátu sa nastaví na 3. Živná pôda sa extrahuje dvakrát dvoma objemami etylacetátu. Spojené etylacetátové extrakty sa premyjú rovnakým objemom nasýteného chloridu sodného, vysušia bezvodým síranom sodným a pri zníženom tlaku sa z nich odstráni etylacetát. Získa sa 500 mg surového produktu. Ukáže sa, že sa získa δ-laktón (3R,4S,5R)-4-metyl-3,5-dihydroxy-N-hexánovej kyseliny a δ-laktón (3R,4S,5R)-4-metyl-3,5-dihydroxy-Nheptánovej kyseliny.

OH

Príklad lk

Konštrukcia S. ervthraea NRRL 2338/pC-AT12 a jeho použitie pri produkcii 14-členných makrolidov

Na transformáciu protoplastov S. ervthraea NRRL 2338 sa použije približne 5 μg DNA pC-AT12, čím sa získa kmeň s plazmidom integrovaným do chromozómu. Z niekoľkých kolónií sa získa úplná DNA, ktorá sa analyzuje Southernovou hybridizáciou, aby sa potvrdilo že sa plazmid začlenil 3' vzhľadom na modul 2 EryAI za vzniku novej makrolidovej biosyntetickej dráhy. Došlo k ďalším začleneniam za vzniku kópií plazmidových sekvencii. S. ervthraea NRRL 2338/pC-AT12 sa inokuluje pôda tryptic soy broth obsahujúca 5 mg/ml tiostreptonu a inkubuje 3 dni pri 30’C. 100 ml tejto inokulačnej kultúry sa použije na zaočkovanie 2 litrov sacharózového sukcinátového definovaného média obsahujúceho 5 μg/ml tiostreptonu v 5 x 21itrových fľašiach, z ktorých každá obsahuje 500 ml média s 2 pružinami na uľahčenie dispergácie, a trepe pri frekvencii 300 min^-1. Po ďalšom päťdennom raste sa kultúry centrifugujú a pH supernatantu sa nastaví na 9. Supernatant sa potom extrahuje trikrát rovnakým objemom etylacetátu. Rozpúšťadlo sa odparí. Produkty sa analyzujú HPLC/MS a identifikujú sa dva makrolidy:

pCJR49 je plazmidom naloženým na plazmide pCJR24 a obsahuje mutantný gén DEBS1-TE, ktorý nemá žiadnu ketoreduktázu v module 2 a AT doména v module 2 je nahradená RAPS

AT2, za účelom začlenenia malonylového extenderu namiesto metylmalonylového extenderu v druhom module (obr. 12).

Príklad 11

Konštrukcia plazmidu pCJR49

pMO32 sa štiepi BspEI a SexAI. Fragment obsahujúci AT z RAP modulu 2 sa klonuje do pUCl-O, ktorý bol štiepený BspEI a SexAI, čím sa získa plazmid pCJR43.

pCJR43 sa štiepi Ndel a Xbal a fragment obsahujúci mutantný gén DEBS1-TE sa klonuje do pCJR24, ktorý bol štiepený Ndel a Xbal, čím sa získa plazmid pCJR49. pCJR49 sa potvrdí pomocou reštrikčnej mapy.

Príklad lm

Konštrukcia S. ervthraea JC2/pCJR49 a produkcia TKL derivátov

Na transformáciu protoplastov S. ervthraea JC2 sa použije približne 5 μ9 DNA pCJR49, čím sa získa kmeň s plazmidom integrovaným do chromozómu. Z niekolkých kolónií sa získa úplná DNA, ktorá sa analyzuje Southernovou hybridizáciou, aby sa potvrdilo že sa plazmid začlenil do EryTE. S. ervthraea JC2/pCJR49 sa inokuluje pôda tryptic soy broth obsahujúca 5 ug/ml tiostreptonu a inkubuje 3 dni pri 30°C. 100 ml tejto inokulačnej kultúry sa použije na zaočkovanie 2 litrov sacharózového sukcinátového definovaného média obsahujúceho 5 μ9/ιη1 tiostreptonu v 5 x 2litrových flašiach, z ktorých každá obsahuje 500 ml média s 2 pružinami

na uíahčenie dispergácie, a trepe pri frekvencii 300 min“¹. Po ďalšom päťdennom raste sa kultúry centrifugujú a pH supernatantu sa nastaví na 3. Supernatant sa potom extrahuje trikrát rovnakým objemom etylacetátu. Rozpúšťadlo sa odparí. Produkty sa rozpustia v metanole a analyzujú GCMS pri použití zariadenia Finnegan-MAT GCQ Systém. Táto analýza ukáže, že na rozdiel od syntetických štandardov sa tu vyskytujú dva nové laktóny. Týmito produktmi sú δ-laktón (4S,5R)-4-metyl-3-keto-5-hydroxyhexánovej kyseliny a 8laktón (4S,5R)-4-metyl-3-keto-5-hydroxyheptánovej kyseliny, ktoré zodpovedajú nasledujúcim vzorcom:

Príklad ln

Konštrukcia S. ervthraea NRRL 2338/pCJR49 a jeho použitie pri produkcii 14-členných makrolidov

Pre transformáciu protoplastov S. ervthraea NRRL 2338 sa použije približne 5 ug DNA pCJR49, čím sa získa kmeň s plazmidom integrovaným do chromozómu. Z niekoíkých kolónií sa získa úplná DNA, ktorá sa analyzuje Southernovou hybridizáciou, aby sa potvrdilo že sa plazmid začlenil do modulu 2 EryAI za vzniku novej makrolidovej biosyntetickej dráhy. Došlo k ďalším začleneniam za vzniku kópií plazmidových sekvencii. S. ervthraea/pCJR49 sa inokuluje pôda tryptic soy broth obsahujúca 5 μg/ml tiostreptonu a inkubuje 3 dni pri 30°C. 100 ml tejto inokulačnej kultúry sa použije na zaočkovanie 2 litrov sacharózového sukcinátového definovaného média obsahujúceho 5 μ9/ιη1 tiostreptonu v x 21itrových fľašiach, z ktorých každá obsahuje 500 ml média s 2 pružinami na uľahčenie dispergácie, a trepe pri frekvencii 300 min“¹. Po ďalšom päťdennom raste sa kultúry centrifugujú a pH supernatantu sa nastaví na 9. Supernatant sa potom extrahuje trikrát rovnakým objemom etylacetátu. Rozpúšťadlo sa odparí. Produkty sa analyzujú HPLC/MS a identifikujú sa dva makrolidy:

Príklad 2

Konštrukcia S. ervthraea ERMD1 nesúcej hybridný gén pre PKS, v ktorom je avr vkladacou didoménou nahradená ery vkladacia didoména S. ervthraea NRRL 2338

i) Konštrukcia plazmidu pAVLD

Plazmid pCRabc (pozri príklad 1) sa linearizuje pomocou BamHI a liguje k pIJ702 štiepenému BglII. Zmes obsahuje požadovaný plazmid pAVLD (obr. 5). Ligančná zmes sa transformuje do E. coli TG1 recO a pri jednotlivých kolóniách sa overí obsah plazmidu. Požadovaný plazmid pAVLD sa identifikuje pomocou reštrikčnej mapy (obr. 5) ii) Konštrukcia S. ervtrea ERMD1

Približne 5 až 10 μg pAVLD izolovaného z E. coli TGlrecO(pAVLD) sa transformuje do S. ervthraea NRRL 2338 a izolujú sa stabilné kolónie rezistentné voči tiostreptonu. Vyberie sa jedna z týchto kolónií a celá DNA sa štiepi PstI a analyzuje Southernovou hybridizáciou pri použití inzertu z plazmidu pCRc, ktorý obsahuje fragment génu ery Al kódujúceho ketosyntázovú doménu KSI, ako sondy. Analýza ukáže pozitívne hybridizačné PstI fragmenty s veľkosťou 8,5 kbp, 4,8 kbp a 33 kbp, ktoré indikujú prítomnosť dvoch za sebou integrovaných kópií pAVLD (obr. 6).

Príklad 3

Príprava izopropyl- a sek.butylerytromycínov pri použití

S. ervthraea ERMD1

Fermentácia (50 ml) S. ervthraea ERMD1 sa vykoná pri použití média s vodou z vodovodu. Po 4 dňoch pri 30°C sa zoberie mycélium a použije sa na zaočkovanie 1,5 litru sacharózového-sukcinátového média obsahujúceho tiostrepton (50 μg/ml). Po štvordennom rast pri 30“C sa celá živná pôda extrahuje dvakrát rovnakým objemom etylacetátu.

Spojené extrakty sa skoncentrujú pri zníženom tlaku a dvakrát podrobia chromatografii na tenkej vrstve sillkagélu pri použití dosiek 20 x 20 cm a zmesi chloroformu, metanolu a 0,88 amoniaku v pomeru 8 : 2 : 0,01 (objemovo). Produkty sa ďalej rozdelia HPLC na PhaseSep C18, bázický dezaktivovanom stĺpci s reverznými fázami S5 ODS (oktadecylsilán) 6 (4,6 mm x 25 cm), pri použití zmesi metanolu a 0,5% octanu amónneho v pomere 70 : 30 (objemovo), ako elučného činidla, pri rýchlosti prietoku 1 ml/min. Frakcie eluované v rozmedzí od 7 do 11 minút z troch oddelených nástrekov sa zhromaždia a opäť nastrieknu v desiatich oddelených nástrekoch. Analógy obsahujúce izopropylový postranný reťazec (R¹ vo všeobecnom vzorci 1 predstavuje izopropylskupinu) odvodené začlenením C-4 (uhlík v polohe 4; izobutyryl) štartérovej jednotky sa eluujú skôr, analógy obsahujúce sek.butylový postranný reťazec (R¹ = sek.butyl vo všeobecnom vzorci 1) odvodené začlenením C-5 (uhlík v polohe 5, 2-metylbutyryl) štartérovej jednotky sa eluujú o niekoľko minút neskoršie. Hmotnostná spektroskopia s vysokým rozlíšením poskytne výsledky pre C-4 analógy eryA, eryB a eryD a analógy C-5 eryA a eryB, ktoré blízko korešpondujú s teóriou:

Analógy

HRMS vypočítané

HRMS nájdené

C5-eryA

762,5004

762,5021

C4-eryA

748,4847

748,4820

C5-eryB

746,4898

748,5077

C4-eryB

732,4898

732,4933

Pri týchto skúškach boli prírodné erytromycíny prítomné len v nízkych alebo nedetektovateľných množstvách a nevyskytli sa tu žiadne detektovateľné množstvá analógov eryC. Pomer celkovej koncentrácie zlúčenín C-4/C-5 vo fermentačnej pôde, stanovené pomocou ESMS etylacetátových extraktov živnej pôdy, je medzi 4:1 a 6:1 v prospech zlúčenín C-4. Pomer analógov A:B:D je premenlivý, okolo 15:60:25, ale počas fermentácie sa zvyšuje podiel analógov A. Celkový výťažok erytromycínov je okolo 400 μg/liter. Žiadna izomaslová ani 2-metylmaslová kyselina sa nedoplňuje. Zdá sa teda, že izobutyrylové a 2-metylbutyrylové štartérové jednotky sú odvodené od endogénne dodávaných prekurzorov, podobne ako je to pri syntéze prírodných avermektínov (napr. Hafner et al., 1991), J. Antibiot., 44: 349 až 356).

Príklad 4a

Konštrukcia S. ervthraea NRRL 2338/pIGl

Približne 5 μ9 plazmidu pIGl sa transformuje do protoplastov S. ervthraea NRRL 2338 a stabilné kolónie rezistentné voči tiostreptonu sa izolujú. Úplná DNA získaná z niekolkých takých kolónií sa analyzuje Southernovou hybridizáciou, aby sa potvrdilo špecifické začlenenie plazmidu do eryAI. Southernova analýza tiež ukáže, že miesto začlenenia je vhodné pre vytvorenie mutantu schopného produkovať pozmenené makrolidy prostredníctvom ave vkladacieho modulu.

Príklad 4b

Konštrukcia S. ervthraea NRRL 2338/pND30

Približne 5 μ9 plazmidu pND30 sa transformuje do protoplastov S. ervthraea NRRL 2338 a stabilné kolónie rezistentné vuči tiostreptonu sa izolujú. Úplná DNA získaná z niekolkých takých kolónií sa analyzuje Southernovou hybridizáciou, aby sa potvrdilo špecifické začlenenie plazmidu do eryAI. Southernova analýza tiež ukáže, že miesto začlenenia je vhodné pre vytvorenie mutantu schopného produkovať pozmenené makrolidy prostredníctvom ave vkladacieho modulu.

Príklad 5a

Príprava 13-izopropyl- a 13-sek.butylerytromycínov pri použití S. ervthraea NRRL 2338/pIGl

S. ervthraea NRRL 2338/pIGl sa zaočkuje do média s vodou z vodovodu obsahujúceho 50 μ9/ιη1 tiostreptonu a nechá rásť niekoľko dní pri 30’C. Potom sa 20 ml mycélia použije na zaočkovanie 500 ml sacharózového-sukcinátového média

obsahujúceho 50 μg/ml tiostreptonu v dvojlitrovej nádobe, ktorá je za účelom zabránenia tvorbe zhlukov opatrená jednou špirálou, a zmes sa trepe pri frekvencii 280 min”¹. Po 3,5 až 6 dňoch sa živná pôda prefiltruje, aby sa odstránilo mycélium a extrahuje trikrát štvrtinovým objemom etylacetátu. Spojené etylacetátové extrakty sa vysušia bezvodým síranom sodným a rozpúšťadlo sa odparí. Analýzou zmesi produktov pri použití GC a elektrosprejovej MS sa zistí, že v celkom 5 až 6 mg/liter 14-členných makrolidových produktov je hlavnou zložkou sek.butylerytromycín D (asi 1,5 mg/1), pričom ako ďalšie zložky sú prítomné sek.butylerytromycín B a sek.butylerytromycín A; izopropylerytromycíny A, B a D; a malé množstvá prírodných erytromycínov A, Ba D. V porovnaní s ekvivalentným konštruktom S. ervthraea ERMD1 (pozri príklad 2) S. ervthraea NRRL 2338/pIGl produkuje približne asi 10 až 15x viac nových izopropyl- a sek.butylerytromycínov, čo jasne demonštruje schopnosť promotoru actl a jeho rozpoznávacieho aktivátorového génu actll-orf4 posilňovať expresiu PKS typu I. Ani kyselina izomaslová ani 2-metylmaslová sa opäť nedoplňujú. Zdá sa teda, že izobutyrylové a 2-metylbutyrylové štartérové jednotky sú odvodené od endogénne dodávaných prekurzorov.

Príklad 5b

Príprava 13-izopropyl- a 13-sek.butylerytromycínov pri použití S. ervthraea NRRL 2338/pND30

S. ervthraea NRRL 2338/pND30 sa zaočkuje do média s vodou z vodovodu obsahujúceho 50 μg/ml tiostreptonu a nechá rásť 4 dni pri 30’C. Potom sa 20 ml mycélia použije na zaočkovanie 500 ml sacharózového-sukcinátového média obsahujúceho 50 μg/ml tiostreptonu v dvojlitrovej nádobe, ktorá je za účelom zabránenia tvorbe zhlukov opatrená jednou špirálou, a zmes sa trepe pri frekvencii 280 min”¹. Po 3,5 až

dňoch sa živná pôda prefiltruje, aby sa odstránilo mycélium a extrahuje trikrát štvrtinovým objemom etylacetátu. Spojené etylacetátové extrakty sa vysušia bezvodým síranom sodným a rozpúšťadlo sa odparí. Analýzou zmesi produktov pri použití GC a elektrosprejovej MS sa zistí, že v celkovom výťažku 5 až 6 mg/liter 14-členných makrolidových produktov je hlavnou zložkou sek.butylerytromycín D (asi 1,5 mg/1), pričom ako d'alšie zložky sú prítomné sek.butylerytromycín B sek.butylerytromycín A; izopropylerytromycíny A, B a D;

a malé množstvá prírodných erytromycínov A, B a D. V porovnaní s ekvivalentným konštruktom S. ervthraea ERMD1 (pozri príklad 2), S. ervthraea NRRL 2338/pND30 produkuje približne 10 až 15x viac nových izopropyl- a sek.butylerytromycínov, čo jasne demonštruje schopnosť promotoru actl a jeho rozpoznávacieho aktivátorového génu actll-orf4 posilňovať expresiu PKS typu I. Ani kyselina izomaslová ani 2metylmaslová sa opäť nedoplňujú. Zdá sa teda, že izobutyrylové a 2-metylbutyrylové štartérové jednotky sú odvodené od endogénne dodávaných prekurzorov.

Príklad 6a

Príprava 13-cyklopentylerytromycínu B pri použití S. ervthraea NRRL 2338/pIGl

Kultúrou S. ervthraea NRRL 2338/pIGl sa zaočkuje 50 ml média s vodou z vodovodu v 300ml Erlenmeyerovej banke. Po 36hodinovej inkubácii pri 28’C sa obsah banky použije na zaočkovanie 3,5 litru média ERY-P v Slitrovej nádobe. Živná pôda sa inkubuje pri 28’C za aerácie rýchlosťou 1,75 litru/min. Po 24 hodinách sa k nej pridá cyklopentánkarboxylová kyselina (1,4 ml) a vo fermentácii sa pokračuje 168 hodín. Potom sa celá živná pôda vodným hydroxidom sodným zalkalizuje na pH 8,5 a extrahuje etylacetátom (10 litrov). Etylacetátový extrakt sa skoncentruje do sucha, čím sa získa surový produkt

vo forme živice (4,2 g). 1 gram tohto extraktu sa rozpustí v etylacetáte (5 ml) a umiestni do patróny so silikagélovou náplňou (10 g, International Sorbent Technology), ktorá bola vopred kondiciovaná etylacetátom (10 ml). Stĺpec sa postupne eluuje etylacetátom (4 x 10 ml), zmesou dichlórmetánu a metanolu (1 : 1) (2 x 10 ml), zmesou dichlórmetánu, metanolu a amoniaku (90 : 9 : 1) (1 x 10 ml), zmesou dichlórmetánu, metanolu a amoniaku (80 : 19 : 1) (1 x 10 ml) a metanolom (2 x 10 ml). Frakcie 7 až 10 sa spoja a odparia do sucha. Živicový zvyšok (3,2 g) sa opäť frakcionuje. Pri tomto obohacovacom stupni sa získa približne 920 mg živicovej pevnej látky, ktorá obsahuje požadovaný produkt. Táto pevná látka sa ďalej prečistí preparátívnou HPLC s obrátenými fázami na stĺpci Zorbax 7 μπι ODS (21,2 mm x x 25 cm) pri použití zmesi acetonitrilu a 0,05M octanu amónneho (7 : 3), ako mobilnej fázy pri prietoku 8 ml/min. Frakcie obsahujúce produkt, ktorý je predmetom záujmu, zo štyroch oddelených nástrekov sa spoja a odparia do sucha. Zvyšok sa opäť podrobí preparátívnej HPLC s obrátenými fázami na stĺpci Beckman 5 μπι Ultrasphere ODS (10 mm x 25 cm) pri použití gradientu: acetonitril : 0,05M octan amónny (28 : 72) až acetonitril : 0,05M octan amónny (50 : 50) počas 18 minút, ako mobilnej fázy, pri prietoku 4 ml/min. Frakcie obsahujúce produkt, ktorý je predmetom záujmu, z piatich oddelených nástrekov sa spoja a odparia do sucha, čím sa získa čistá biela pevná látka (7 mg). Štruktúra produktu sa potvrdí hmotnostnou spektrometriou (MS) a nukleárnou magnetickou rezonanciou (NMR), pozri ďalej:

HPLC retenčný čas - postup A - 26,0 minút

APCI-MS-(M+H)⁺ pre C₄qH₇₂ ^noi2^: nájdené pri m/e 758, vypočítané 758

Údaje NMR:

Číslo atómu ¹³C chemický posun, chemický posun zo spektra ¹³C NMR a multiplicita

176,0

2	45,0	2,891 H dq J = 9,4, 7,1
3	80,4	4,021 H dd J = 9,4,1,7
4	39,2	2,08 1H multiplet
5	83,8	3,59 1H d J = 7,4
6	75,4	-
7	38,0	2,001 H dd J = 14,7, 10,8 ca. 1,651H multiplet
8	45,0	2,711 H dqd J = 10,6, 6,8, 2,6
9	ca. 220,0	-
10	38,9*	3,981 H qd J = 6,8,1,5
11	69,4	3,731 H dd J = 9,9,1,2
12	38,8*	1,71 1H multiplet
13	78,3	5,19 1Hdd J = 10,5, 1,0
14	41,7	3.15 1H br sextet

15	30,4	ca. 1,691H multiplet ca. 1,21 1H multiplet
16	25,4	ca. 1,63 1H multiplet ca. 1,52 1H multiplet
17	25,1 ’	ca. 1,63 1H multiplet ca. 1,521H multiplet
18	29,0	ca. 1,69 1H multiplet A ca. 1,21 1H multiplet
19	15,8	1,183Hd J = 7,1
20	9,24	1,13 3H d J = 7,0
21	27,4	1,46 3H s
22	18,5	1,14 3H d J = 6,8
23	9,5	0,99 3H d J = 6,8
24	9,16	0,86 3H d J = 7,1
ľ	103,2	4,43 1H d J = 7,3
2'	70,9	3,241 H dd J = 10,3, 7,3
3’	65,4	2,51 1HdddJ = 12,0. 10,6,4,1
4'	29,0	ca. 1,681H multiplet ca. 1,24 1H multiplet
5'	68,8	3,50 1H br sextet
6'	21,5	'1,22 3H d J = 6,1
7·,8·	40;1	2,32 2 x 3H s
1	96,5	4,901Hd J = 4,6
2	35,1	2,361H d J = 15,2+malá hodnota (menej ako 1 1,58 1H multiplet
3	72,6	-
4	78,0	3,02 1Hd J = 9,1

5	65,6	4,01 1H multiplet
6	18,7	1,29 3Hd J = 6,3
7	21,4	1,24 3H s
8	49,5	3,31 3H s

* priradenia označené hviezdičkou môžu byť zameniteľné

Príklad 6b

Príprava 13-cyklopentylerytromycínu B pri použití

S. ervthraea NRRL 2338/pND 30

Podobným postupom, aký je opísaný v príklade 6a sa pri použití S. ervthraea NRRL 2338/pND30 vyrobí zlúčenina uvedená v príklade 6a.

Príklad 7a

Príprava 13-cyklobutylerytromycínu B pri použití S. ervthraea NRRL 2338/pIGl

Kultúrou S. ervthraea NRRL 2338/pIGl sa zaočkuje 50 ml média s vodou z vodovodu v troch 300ml Erlenmeyerových bankách. Po 72hodinovej inkubácii pri 28’C sa obsah banky použije na zaočkovanie 3,5 litru média ERY-P v troch Slitrových nádobách. Živná pôda sa inkubuje pri 28“C za aerácie rýchlosťou 2,0 litru/min a miešania rýchlosťou 500 min^-1. Po 24 a 48 hodinách sa k nej pridá cíalší cyklobutánkarboxylová kyselina (1,4 ml) a vo fermentácii sa pokračuje 168 hodín. Potom sa celá živná pôda vodným hydroxidom sodným zalkalizuje na pH 8,5 a extrahuje etylacetátom (20 litrov). Etylacetátový extrakt sa skoncentruje do sucha, čím sa získa surový produkt vo forme živice (9,2 g). Časť (2,3 g) tohto

extraktu sa rozpustí v etylacetáte (12,5 ml) a umiestni do patróny so silikagélovou náplňou (10 g, International Sorbent Technology), ktorá bola vopred kondiciovaná etylacetátom (10 ml). Stĺpec sa postupne eluuje etylacetátom (4 x 24 ml), zmesou dichlórmetánu a metanolu (9 : 1) (1 x 24 ml), zmesou dichlórmetánu a metanolu (8 : 2) (2 x 24 ml), zmesou dichlórmetánu, metanolu a amoniaku (80 : 19 : 1) (1 x 24 ml) a metanolom (1 x 24 ml). Frakcie 6 až 8 sa spoja a odparia do sucha. Vzorka živicového zvyšku (4,7 g) sa opäť frakcionuje. Pri tomto obohacovacom stupni sa získa približne 415 mg pevnej látky, ktorá obsahuje požadovaný produkt. Táto pevná látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC s obrátenými fázami na stĺpci Zorbax 7 μιη ODS (21,2 mm x 25 cm) pri použití zmesi acetonitrilu a 0,05M octanu amónneho (3 : 1), ako mobilnej fázy pri prietoku 8 ml/min. Frakcie obsahujúce produkt, ktorý je predmetom záujmu, z piatich oddelených nástrekov sa spoja a odparia do sucha. Zvyšok sa opäť podrobí preparatívnej HPLC s obrátenými fázami na stĺpci Beckman 5 μιη Ultrasphere ODS (10 mm x 25 cm) pri použití gradientu: acetonitril : 0,05M octan amónny (28 : 72) až acetonitril : 0,05M octan amónny (50 : 50) počas 18 minút, ako mobilnej fázy, pri prietoku 4 ml/min. Frakcie obsahujúce produkt, ktorý je predmetom záujmu, sa spoja a odparia do sucha, čím sa získa čistá biela pevná látka (27 mg). Štruktúra produktu sa potvrdí hmotnostnou spektrometriou (MS) a nukleárnou magnetickou rezonanciou (NMR), pozri ďalej:

HPLC retenčný čas - postup A - 22,3 minút

APCI-MS-(M+H)⁺ pre C₃₉H₇₀NO₁₂: nájdené pri m/e 744 vypočítané 744

Údaje NMR:

Číslo atómu	13C chemický posun, zo spektra 13C NMR	1H chemický posun a multiplicita
1	176,3	-
2	44,5	2,87 1Hdq J = 9,1,7,1
3	80,4	4,03 1Hd J = 9,1
4	39,2	2,08 1H multiplet
5	83,9	3,59 1Hd J = 7,4
6	75,4	-
7	37,7	1,99 1H multiplet 1,64’ 1Hdd J = 15,0, 3,0
8	44,5	2,731 H br dublet pentetov
		J = ca. 7,0,3,0
9	219,4	-
10	38,9	2,97 1Hqd J = 6,9,1,1
11	69,1	3,75 1Hdd J= 10,2+ malá hodnota
12	37,3	1,62 1H multiplet
13	77,4	5,39 1Hdd J = 9,3,1,1
14	37,0	2,60 1H br sextet
15	25,2	ca 1,97 1H multiplet

ca 1,82 1H multiplet

16	17,7	ca 1,83 2Η multiplet
17	24,2	ca1,93 1H multiplet
		ca 1,75 1H multiplet
18	15,5	1,17 3Hd J = 7,1
19	9,3	1,12 3Hd J = 7,5
20	27,0	1,46 3Hs
21	18,0	1,14 3Hd J = 7,1
22		0,98 3Hd J = 6,9
23	9,3	0,81 3Hd J = 7,1
ľ	103,4	4,43 1Hd J = 7,3
2‘	70,9	3,27 1Hdd J = 10,3. 7,3
3'	65,2	2,64 1H multiplet
4'	29,1	ca1,72 1H multiplet
		ca 1,22 1H multiplet
5'	68,7	3,52 1H br sextet J = ca. 6,1
6'	21,0	1,23 3Hd J = 6,1
7‘,8’	40,0	2,38 2x3Hs
1	96,8	4,89 1Hd J =4,5
2	34,7	2,38 1H multiplet»,
		1,57 1Hdd J = 15,0, 5,0
3	72,5	-
4	77,8	3,02 1Hd J = 9,2
5	65,3	4,02 1H multiplet
6	18,2	1,29 3Hd J = 6,2
7	21,2	1,24 3Hs
8	49,1	3,31 3Hs

Príklad 7b

Príprava 13-cyklobutylerytromycínu B pri použití

S. ervthraea NRRL 2338/pND30

Podobným postupom, aký je opísaný v príklade 7a sa pri použití S. ervthraea NRRL 2338/pND30 vyrobí zlúčenina uvedená v príklade 7a.

Príklad 8a

Príprava 13-(3-furyl)erytromycínu B pri použití S. ervthraea NRRL 2338/pIGl

Kultúrou S. ervthraea NRRL 2338/pIGl sa zaočkuje 50 ml média s vodou z vodovodu v 300ml Erlenmeyerovej banke. Po 72hodinovej inkubácii pri 28’C sa obsah banky použije na zaočkovanie 3,5 litru média ERY-P v Slitrovej nádobe. Živná pôda sa inkubuje pri 28’C za aerácie rýchlosťou 1,75 litru/ min. Po 24 hodinách sa k nej pridá 3-furoová kyselina (1,4 g v 6 ml metanolu) sterilizovaná filtráciou a vo fermentácii sa pokračuje 138 hodín. Potom sa celá živná pôda vodným hydroxidom sodným zalkalizuje na pH 8,5 a extrahuje etylacetátom (10 litrov). Etylacetátový extrakt sa skoncentruje do sucha, čím sa získa surový produkt vo forme živice (3,8 g). Časť (1,9 g) tohto extraktu sa rozpustí v etylacetáte (10 ml) a umiestni do patróny so silikagélovou náplňou (10 g, Internát ional Sorbent Technology), ktorá bola vopred kondiciovaná etylacetátom (10 ml). Stĺpec sa postupne eluuje etylacetátom (4 x 24 ml), zmesou dichlórmetánu a metanolu (9 : 1) (1 x 24 ml), zmesou dichlórmetánu a metanolu (8 : 2) (2 x 24 ml), zmesou dichlórmetánu, metanolu a amoniaku (80 : 19 : 1) (1 x 36 ml) a metanolom (1 x 24 ml). Frakcie 8 a 9 sa spoja a odparia do sucha. Živicový zvyšok (1,9 g) sa opäť frakcionuje. Pri tomto obohacovacom stupni sa získa živicová pevná

látka, ktorá obsahuje požadovaný produkt. Táto pevná látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC s obrátenými fázami na stĺpci Zorbax 7 μπι ODS (21,2 mm x 25 cm) pri použití zmesi acetonitrilu a 0,05M octanu amónneho (3 : 1), ako mobilnej fázy pri prietoku 8 ml/min. Frakcie obsahujúce produkt, ktorý je predmetom záujmu, z troch oddelených nástrekov sa spoja a odparia do sucha. Zvyšok sa opäť podrobí preparatívnej HPLC s obrátenými fázami na stĺpci Beckman 5 μπι Ultrasphere ODS (10 mm x 25 cm) pri použití gradientu: acetonitril : 0,05M octan amónny (28 : 72) až acetonitril : 0,05M octan amónny (50 : 50) počas 18 minút, ako mobilnej fázy, pri prietoku 4 ml/min. Frakcie obsahujúce produkt, ktorý je predmetom záujmu, z piatich oddelených nástrekov sa spoja a odparia do sucha, čím sa získa čistý 13-(3-furyl)erytromycín B vo forme bielej pevnej látky (9 mg). Štruktúra produktu sa potvrdí hmotnostnou spektrometriou (MS).

HPLC retenčný čas - postup A - 17,0 minút

APCI-MS-(M+H)⁺ pre ^c39^h66^no13^: nájdené pri m/e 756, vypočítané 756

Údaje NMR:

Číslo atómu	1 7 C chemický posun, zo spektra 13c NMR	chemický posun a multiplicita
1	174,7	-
2	44,4	2,93 iHdq J = 8,1.7,0
3	80,3	4,14 1Hd J = 8,1
4	39,5	2,18 1H m J = 7,0, 7,2
5	83,9	3,61 1Hd J = 7,2
6	75,0	-
7	37,8	2,07 1Hdd J = 14,6.11,3
		1,70 1H dd J = 14,6, nerozlíšené
8	44,8	2,78 1Hbrm J = 11,3, 7,0, 2,2
9	219,7	-
10	39,2	3,05 1Hdq J = 6,9, nerozlíšené
11	69,5	3,95 1Hdd J = 10,0. nerozlíšené
12	41,4	1,88 1Hdq J = 10,0, 7,0
13	69,2	6,47 1H komplex m

14	138,3	7,31 1H komplex m J= 0,7,1,8
15	124,3	-
16	108,6	6,31 1H komplex m, J = 1,8, 0,7
17	142,8	7,39 1Ht J = 1,8
18	15,5	1,21 3Hd J = 7,0
19	8'7	1,16 3Hd J = 7,0
20	27,0	1,48 3Hs · >
21	18,3	1,18 3Hd J = 7,0
22	8,4	1,03 3Hd J = 6,9
23	8,7	0,88 3Hd J = 7,0
ľ	103,3	4,46 iHd J = 7,4
2'	71,1	3,29 1Hm
3'	65,1	2,60 iHbr m
4'	29,3	1,78 1Hm
		1,24 1Hm
5'	68,8	3,54 1Hm
6'	20,7	1,24 3H d (zastrené)
7',8'	40,0	2,39 2x3Hs
1	96,6	4,88 iHbrd J = 4,9
2	35,2	2,39 1Hm
		.1,59 1Hdd J =15,0,4,9
3	71,7	-
4	77,8	3,03 iHd (zastrené)
5	66,1	4,03 iHdq J = 9,0. 6,1
6	18,3	1,30 3Hd J = 6,1
7	21,2	1,26 3Hs
8	49,1	3,33 3Hs

*priradenia označené hviezdičkou môžu byť zamenené

Príklad 8b

Príprava 13-(3-furyl)erytromycínu B pri použití

S. ervthraea NRRL 2338/pND 30

Podobným postupom, aký je opísaný v príklade 8a sa pri použití kultúry S. ervthraea NRRL 2338/pND30 vyrobí zlúčenina uvedená v príklade 8a.

Príklad 9a

Príprava 13-cyklopropylerytromycínu B pri použití S. ervthraea NRRL 2338/pIGl

Kultúrou S. ervthraea NRRL 2338/pIGl sa zaočkuje 50 ml média s vodou z vodovodu v 300ml Erlenmeyerovej banke. Po 72hodinovej inkubácii pri 28C sa obsahu banky použije na zaočkovanie 3,5 litru média ERY-P. K zaočkovanému médiu sa pridá tiostrepton (105 mg) bezprostredne po sterilizácii. Živná pôda sa inkubuje pri 28’C za aerácie rýchlosťou 2 litre/ min a miešania pri frekvencii otáčania 500 min^-1. Po 24 hodinách sa k nej pridá cyklopropánkarboxylová kyselina (1,2 ml) a vo fermentácii sa pokračuje 144 hodín. Potom sa celá živná pôda vodným hydroxidom sodným zalkalizuje na pH 8,5 a extrahuje etylacetátom (3 litre). Etylacetátový extrakt sa skoncentruje do sucha, čím sa získa surový produkt vo forme živice (1,7 g). Tento extrakt (0,85 g) sa rozpustí v etylacetáte (10 ml) a umiestni do patróny so silikagélovou náplňou (10 g, International Sorbent Technology), ktorá bola vopred kondiciovaná etylacetátom (20 ml). Stĺpec sa postupne eluuje etylacetátom (4 x 24 ml), zmesou dichlórmetánu a metanolu (9 : 1) (1 x 24 ml), zmesou dichlórmetánu a metanolu (8 : 2) (1 x 24 ml), zmesou dichlórmetánu, metanolu a amoniaku (80 : 19 : 1) (3 x 24 ml) a metanolom (1 x 24 ml).

Frakcie 6 až 9 sa spoja a odparia do sucha. Živicový zvyšok (0,85 g) sa opäť frakcionuje. Pri tomto obohacovacom stupni sa získa pevná látka, ktorá obsahuje požadovaný produkt. Táto pevná látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC s obrátenými fázami na stĺpci Zorbax 7 μιη ODS (21,2 mm x x 25 cm) pri použití zmesi acetonitrilu a 0,05M octanu amónneho (3 : 1), ako mobilnej fázy pri prietoku 8 ml/min. Frakcie obsahujúce produkt, ktorý je predmetom záujmu, z 4 oddelených nástrekov sa spoja a odparia do sucha. Zvyšok sa opäť podrobí preparatívnej HPLC s obrátenými fázami na stĺpci Beckman 5 μπι Ultrasphere ODS (10 mm x 25 cm) pri použití gradientu: acetonitril : 0,05M octan amónny (28 : 72) až acetonitril : 0,05M octan amónny (50 : 50) počas 18 minút, ako mobilnej fázy, pri prietoku 4 ml/min. Frakcie obsahujúce produkt, ktorý je predmetom zájmu, z 3 oddelených nástrekov sa spoja a odparia do sucha, čím sa získa čistý 13-cyklopropylerytromycín B vo forme belej pevnej látky (9 mg). Štruktúra produktu sa potvrdí hmotnostnou spektrometriou (MS).

HPLC retenčný čas - postup A - 17,9 minút

APCI-MS-(M+H)⁺ pre ^C38^H68^NO12^: nájdené pri m/e 730, vypočítané 730

Číslo atómu n o >

C chemický posun, zo spektra ¹³C NMR ¹H chemický posun a multiplicita

1	176,4	•
2	44,8	2,88 1Hdq J = 8,5,7,1
3	80,3	4,04 iHdd J = 8,5, 1,9
4	39,5	2/11 IHbrpentet J = ca7
5	83,7	3,58 1Hd J = 7,5
6	75(2	-
7	38,0	2,02 1Hdd J = 14,7, 10,9

		1,66 1Hdd J = 14,7, 2,8
8	45,1	2,74 1Hdqd J = 10,9, 7,1, 2,8
9	220,0	-
10	39,0	3,01 IHmultiplet
11	69,8	3,76 1Hdd J = 10,0, ca 1,4
12	40,4.	1,84 1Hdqd J = 10,0, 6,9, 1,2
13	78,5	4,68 1Hdd J = 9,2,1,2
14	13,2	1,09 IHmultiplet
15	V	0,51 1H multiplet
		0,42 IHmultiplet
16	2,7	0,51 IHmultiplet
		0,29 IHmultiplet
17	15,1	1,19 3Hd J = 7.1
18	9,3	1,14 3Hd J = ca7.1
19	27,4	1,46 3HS
20	18,3	1,16 3Hd J = 7,1
21	9,3	1,001 3Hd J = ca7,2*
22	9,3	0,998 3Hd J = ca6,9*
ľ	103,3	4,43 1Hd J = 7,2
2'	71,0	3,25 1Hdd J = 10,3, 7,2
3’	65,6	2,54 IHbrddd J = ca 12,5,10,3,4
4'	29,0	1,69 IHmultiplet
		1,25 IHmultiplet
5’	69,2	3,51 IHbrdq J = ca11,6
6'	20,9	1,22 3Hd J = 6,2
7,81	39,9	2,33 2 x 3Hs
1	97,1	4,87 1H brd J = ca5

2	35,0	2,37 1Hbrd J = ca. 15
		1,57 1Hdd J = 15,1,5,0
3	72,5	-
4	78,1	3,01 1Hbrd J = 9,2
5	66,0	4,02 1Hdq J = 9,2, 6,2
6	18,3	1,28 3Hd J = ca6,2
7	21,0	1,24 3Hs
8	49,3	3,32 3Hs

*priradenia označené hviezdičkou môžu byť zamenené

Príklad 9b

Príprava 13-(cyklopropylJerytromycínu B pri použití

S. ervthraea NRRL 2338/pND30

Podobným postupom, aký je opísaný v príklade 9a sa pri použití kultúry S. ervthraea NRRL 2338/pND30 vyrobí zlúčenina uvedená v príklade 9a.

Príklad 10a

Príprava 13-(1-metyltioetyl)erytromycínu B pri použití S. ervthraea NRRL 2338/pIGl

Kultúrou S. ervthraea NRRL 2338/pIGl sa zaočkuje liter média s vodou z vodovodu v 2,81itrovej Fernbachovej banke. Bezprostredne po inokulácii sa pridá tíostrepton (50 mg). Po 84hodinovej inkubácii pri 29’C sa obsah banky použije na zaočkovanie 8 litrov doplneného média ERY-P (50 g/liter dextrózy, 30 g/liter múky Nutrisoy, 3 g/liter síranu amónneho, 5 g/liter chloridu sodného, 6 g/liter uhličitanu vápenatého, 10 g/liter sacharózy, 5 g/liter sušiny z kukuričného

výluhu, 0,5 g/liter síranu horečnatého a 1 ml/liter P2000) v 141itrovej fermentačnej nádobe. Živná pôda sa inkubuje pri 28’C za aerácie rýchlosťou 8 litrov/min a miešania pri frekvencii otáčania 800 min“¹, pričom sa pH hydroxidom sodným alebo kyselinou sírovou (15%) udržuje medzi 6,9 až 7,3. Po 24 a 48 hodinách sa k živnej pôde pridá metyltiomliečna kyselina (3,2 ml). Po 120 hodinách sa pridá ďalšia dávka metyltiomliečnej kyseliny (1,6 ml) a vo fermentácii sa pokračuje 144 hodín. Potom sa celá živná pôda odstriedi za vzniku centrifugátu (34 litrov), ktorý sa nanesie na stĺpec živice XAD-16 (600 ml, Rohm and Haas). Stĺpec živice sa premyje vodou (1,8 litrov a eluuje etylacetátom (2,5 litru). Etylacetát sa sčasti odparí (do zvyškového objemu 250 ml) a potom sa požadovaný produkt extrahuje do lOOmM tlmivého roztoku na báze fosforečnanu sodného s pH 3,5 (1,3 litru). Produkt sa opäť prevedie do etylacetátu, nastavením pH vodnej zmesi na 9 pomocou hydroxidu sodného a pridaním etylacetátu (450 ml). Etylacetátová vrstva bohatá na erytromycín sa oddelí a odparí na živici (5,0 g). Tento zvyšok sa resuspenduje v 20% metanolu (120 ml) a suspenzia sa nanesie na stĺpec živice CG 161 (100 ml, Toso Haas). Stĺpec živice sa postupne eluuje 20% metanolom (3 x 100 ml), 40% metanolom (3 x 100 ml), 60 % metanolom (3 x 100 ml), 80% metanolom (3 x 100 ml) a čistým metanolom (4 x 100 ml). Frakcie 2 a 3 eluované čistým metanolom obsahujúce produkt, ktorý je predmetom záujmu, sa odparia. Pevný zvyšok (220 mg) sa ďalej prečistí vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou s obrátenými fázami na stĺpci Kromasil C18 (10 |xm) (75 mm x 25 cm) pri použití gradientu acetonitril : 0,05M octan amónny s 0,1 % trifluóroctovej kyseliny 32 : 68 až 38 : 62 počas 60 minút, ako mobilnej fázy, pri prietoku 215 ml/min. Frakcie obsahujúce produkt, ktorý je predmetom záujmu, sa spoja (1,7 litru), hydroxidom sodným zalkalizujú na pH 9 a extrahujú metylénchloridom (300 ml). Metylénchloridová vrstva sa oddelí a odparí do sucha na čiastočne čistý pro dukt. Stupeň preparatívnej HPLC a extrakcia sa opakuje, čím sa získa čistý 13-(l-metyltioetyl)erytromycín B (31 mg). Štruktúra produktu sa potvrdí MS a NMR spektroskopiou, pri použití spektrometru Bruker DMX 500 MHz:

Retenčný čas HPLC - postup B - 14,9 minút

APCI-MS-(M+H)⁺ pre C₃₈H₇₀NO₁₂S: nájdené pri m/e 764 vypočítané 764

Údaje NMR:	Číslo z atómu	“C (ppm)	Počet priy pojených H	Ή (ppm)
	1	221,08	0
	2	176,10	0
	3	103,42	1	4,49
	4	96,93	1	4,94
	5	84,31	1	3,63
	6	80,69	1	4,06
	7	78,30	1	3,07
	8	76,17	1	5,42
	9	75,75	0
	10	73,11	0
	11	71,23	1	3,32
	12	69,84	1	3,77
	13	69,03	1	3,56
	14	66,18	1	.4,06

15	65ζ99	1	2,68
16	49,91	3	3,36
17	45,62	1	2,74
18	45,26	1	2,96
19	40,61	3	2,46
20	40,01	1	2,83
21	39,60	1	2,14
22	38,94	1	3/04
23	38,44	2	2,03/1,70
24	37,68	1	2,44
25	35,47	2	2,41/1,63
26	29,66	2	1,79/1,32
27	27,70	3	1,51
28	21,89	3	1,29
29	21,77	3	1,28
30	19,08	3	1/33
31	18,92	3	1,20
32	18,19	3	1,33
33	16,29	3	1,23
34	11,11	3	2,12
35	10,16	3	1,07
36	9,70	3	1,17
37	9.62	3	0,90

Príklad 10b

Príprava 13-(1-metyltioetyl)erytromycínu B pri použití S. ervthraea NRRL 2338/pND30

Podobným postupom, aký je opísaný v príklade 10a sa pri použití kultúry S. ervthraea NRRL 2338/pND30 vyrobí zlúčenina uvedená v príklade 10a.

Príklad 11

Príprava 13-cyklobutylerytromycínu B pri použití

S. ervthraea NRRL 2338

Kultúrou S. ervthraea NRRL 2338 sa zaočkuje 50 ml média s vodou z vodovodu v 300ml Erlenmeyerovej banke. Po 48 hodinách inkubácie pri 28’C sa obsahu banky použije na zaočkovanie 50 ml média ERY-P v 300ml Erlenmayerovej banke. Živná pôda sa inkubuje pri 28’C, po 24 hodinách sa k nej pridá cyklobutánkarboxylová kyselina (20 ml) a vo fermentácii sa pokračuje počas 168 hodín. Potom sa celá živná pôda vodným hydroxidom sodným zalkalizuje na pH 8,5 a potom extrahuje etylacetátom (50 ml). Etylacetátová vrstva sa oddelí a skoncentruje do sucha. Vzorka sa za účelom analýzy HPLC-MS opäť rozpustí v metanole (1 ml). Touto analýzou sa potvrdí, že netransformovaným nerekombinantným kmeňom NRRL 2338 bol vyprodukovaný 13-cyklobutylerytromycín B, pozri príklad 7 pre geneticky modifikovaný kmeň obsahujúci avr vkladací modul (konštrukt NRRL 23 338/pIGl).

Retenčný čas HPLC - postup A - 22,3 minút

APCI-MS-(M+H)⁺ pre ^C3g^H7o^N0i2^: nájdené pri m/e 744 vypočítané 744

Príklad 12

Príprava 13-cyklopropylerytromycínu B pri použití

S. ervthraea NRRL 2338

Kulturou S. ervthraea NRRL 2338 sa zaočkuje 50 ml média s vodou z vodovodu v 300ml Erlenmeyerovej banke. Po 48 hodinách inkubácie pri 28’C sa obsah banky použije na zaočkovanie 50 ml média ERY-P v 300ml Erlenmeyrovej banke. Živná pôda sa inkubuje pri 28’C, po 24 hodinách sa k nej pridá cyklopropánkarboxylová kyselina (20 ml) a vo fermentácii sa pokračuje počas 168 hodín. Potom sa celá živná pôda vodným hydroxidom sodným zalkalizuje na pH 8,5 a potom extrahuje etylacetátom (50 ml). Etylacetátová vrstva sa oddelí a skoncentruje do sucha. Vzorka sa za účelom analýzy HPLC-MS opäť rozpustí v metanole (1 ml).

Touto analýzou sa potvrdí, že netransformovaným nerekombinantným kmeňom NRRL 2338 bol vyprodukovaný 13cyklopropylerytromycín B, pozri príklad 9 pre geneticky modifikovaný kmeň obsahujúci avr vkladací modul (konštrukt NRRL 23 338/pIGl).

Retenčný čas HPLC - postup A - 17,9 minút

APCI-MS-(M+H)⁺ pre C₃₈H₆₈NO₁₂í nájdené pri m/e 730 vypočítané 730

Príklad 13a

Príprava 13-cyklobutylerytromycínu A pri použití S. ervthraea NRRL 2338/pIGl

Kultúrou S. ervthraea NRRL 2338/pIGl sa zaočkuje ml média s vodou z vodovodu v troch 300ml Erlenmeyero82

vých bankách. Po 72hodinovej inkubácii pri 28’C sa obsah banky použije na zaočkovanie 3,5 litru média ERY-P v troch 51itrových nádobách. Živná pôda sa inkubuje pri 28’C za aerácie rýchlosťou 2,0 litre/min a miešaní rýchlosťou 500 min^-1. Po 24 a 48 hodinách sa k nej pridá ďalší cyklobutánkarboxylová kyselina (1,4 ml) a vo fermentácii sa pokračuje 168 hodín. Potom sa celá živná pôda vodným hydroxidom sodným zalkalizuje na pH 8,5 a extrahuje etylacetátom (20 litrov). Etylacetátový extrakt sa skoncentruje do sucha, čím sa získa surový produkt vo forme živice (9,2 g). Časť (2,3 g) tohto extraktu sa rozpustí v etylacetáte (12,5 ml) a roztok sa umiestni do patróny so silikagélovou náplňou (10 g, International Sorbent Technology), ktorá bola vopred kondiciovaná etylacetátom (10 ml). Stĺpec sa postupne eluuje etylacetátom (4 x 24 ml), zmesou dichlórmetánu a metanolu (9 : 1) (1 x 24 ml), zmesou dichlórmetánu a metanolu (8 : 2) (2 x 24 ml), zmesou dichlórmetánu, metanolu a amoniaku (80 : 19 : 1) (1 x 24 ml) a metanolom (2 x 24 ml). Frakcie 6 až 8 sa spoja a odparia do sucha. Vzorka živicového zvyšku (4,7 g) sa opäť frakcionuje. Pri tomto obohacovacom stupni sa získa približne 415 mg pevnej látky, ktorá obsahuje požadovaný produkt. Táto pevná látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC s obrátenými fázami na stĺpci Zorbax 7 μη ODS (21,2 mm x 25 cm) pri použití zmesi acetonitrilu a 0,05M octanu amónneho (3 : 1), ako mobilnej fázy pri prietoku 8 ml/min. Frakcie obsahujúce produkt, ktorý je predmetom záujmu, z piatich oddelených nástrekov sa spoja a odparia do sucha. Zvyšok sa opäť podrobí preparatívnej HPLC s obrátenými fázami na stĺpci Beckman 5 μη Ultrasphere ODS (10 mm x 25 cm) pri použití gradientu: acetonitril : 0,05M octan amónny (28 : 72) až acetonitril : 0,05M octan amónny (50 : 50) počas 18 minút, ako mobilnej fázy, pri prietoku 4 ml/min. Frakcie obsahujúce produkt, ktorý je predmetom záujmu, sa spoja a odparia do sucha, čím sa získa čistá biela pevná látka (4 mg). Štruktúra produktu sa potvrdí hmotnostnou spektrometriou (MS) a nukleárnou magnetickou rezonanciou (NMR), pozri ďalej:

HPLC retenčný čas - postup A - 17,5 minúty

APCI-MS-(M+H)⁺ pre C_3QH₇qNO₁₃: nájdené pri m/e 760 vypočítané 760

Údaje NMR:

Číslo atómu	13C chemický posun, z korelácie ·*·Η -13H	•lH chemický posun a multiplicita
1	176,1
2	44,7	2,83 1H multiplet
3	79,8	3,99 1H multiplet
4	39,3	1,97 1H multiplet
5	83,4	3,57 1Hd J = 7.6
6	75,4	-
7	38,3	1,92 1H multiplet 1,72. 1H multiplet

8	45,1	2,70	ι 1Η multiplet
9	222,5	-
10	37,4	3,07	1HbrqJ = 7,0
11	69,1	3,77	1Hbrs
12	76,1	-
13	77,1	5,10	1Hd J = 7,1
14	34,8	2,86	1H multiplet
15	26,7	1,98	1H multiplet
		1,80	1H multiplet
16	18,8	1,88	1H multiplet
		1,71	1H multiplet
17	24,8	1,89	2H multiplet
18	15,8	1,19	3Hd J = 7.0
20	26,9	1,47	3Hs
21	18,1	1,16	3Hd J = 7,0
Γ	103,0	4,42	1Hd J = 7,2
2'	71,0	3,24	1Hdq J = 10,4, 7,2
3'	65,3	2,51	1H multiplet
4'	28,7	1,68	1H multiplet
		1,26	1H multiplet
5'	69,2	3,49	1H multiplet
6'	21,3	1,23	3Hd J = 6,2
7',8'	40,0	2,38	2x3Hs
1	96,3	4,89	1Hd J = 4,5
2	34,7	2,38	1H multiplet
		1,57	1H dd J = 15,0, 5,0
3	73,0	-

4	78,0	3,02	1Hd J = 9,4
5	65,6	4,00	1H multiplet
6	18,4	1,29	3Hd J = 6,2
7	21,3	1,24	3Hs
8	49.4	3>32	3Hs

Príklad 13b

Príprava 13-cyklobutylerytromycínu A pri použití S. ervthraea NRRL 2338/pND30

Podobným postupom, aký je opísaný v príklade 13a sa pri použití kultúry S. ervthraea NRRL 2338/pND30 vyrobí zlúčenina uvedená v príklade 13a.

Príklad 14a

Príprava 13-cyklopropylerytromycínu A pri použití S. ervthraea NRRL 2338/pIGl

Šesť 2800mi Fernbachových baniek sa zaočkuje S. ervthraea NRRL 2338/pIGl. Každá z baniek obsahuje 1 liter média s vodou z vodovodu s prídavkom 50 mg tiostreptonu. Po 24hodinovej inkubácii pri 28°C sa do každej banky pridá 200 ppm cyklopropánkarboxylovej kyseliny. Banky sa inkubujú 90 hodín a ich obsah sa umiestni do sterilnej 8 litrovej odsávanej nádoby. Obsah odsávanej nádoby sa použije na zaočkovanie 1426 litrov média ERY-P v 22701itrovej poloprevádzkovej nádobe. Živná pôda sq inkubuje pri 27 až 29°C pri pH od 6,7 do 7,4 za aerácie 0,57 m³/min a miešania pri frekvencii 175 min“¹ a po 33, 81 a 117 hodinách sa k nej pridá cyklopropánkarboxylová kyselina (200 mg/1). Vo fermentácii sa pokračuje počas 198 hodín. Potom sa celá fermentačná pôda

prefiltruje cez keramický filter (0,2 μπι, 2,8 m², U.S. Filter). Filtrát sa nanesie na stĺpec živice XAD-16 (12 litrov, Rohm and Haas). Stĺpec živice sa potom eluuje etylacetátom (60 litrov). Etylacetátový eluát sa skoncentruje na živicový zvyšok (302 g). K tomuto zvyšku sa pridajú 2 litre metylénchloridu. Výsledný metylénchloridový roztok sa premyje 8 litrami 250mM tlmivého roztoku hydrogenuhličitanu sodného, pH 9. Metylénchloridová vrstva bohatá na erytromycín sa oddelí a odparí na živicový zvyšok (200 g). Tento zvyšok sa resuspenduje v 40% metanole (10 litrov) a vzniknutá suspenzia sa nanesie na stĺpec živice CG-161 (9 litrov, Toso Haas), ktorá sa potom premyje 40% metanolom (30 litrov) a postupne eluuje 75% metanolom (8 x 10 litrov) a neriedeným metanolom (3 x 10 litrov). Frakcie 5 až 8 eluované 75% metanolom obsahujúce produkt, ktorý je predmetom záujmu, sa spoja a odparia na objem 3,2 litru. Hodnota pH tohto koncentrátu sa nastaví na 9 a pridá sa k nemu 0,95 litru metylénchloridu. Metylénchloridová vrstva sa oddelí a odparí na 12,4 g živice. Časť tohto zvyšku (6 g) sa ďalej prečistí preparatívnou vysokotlakovou chromatografiou s obrátenými fázami na stĺpci Kromasil 10 μπι C18 (75 mm x 25 cm) pri použití zmesi metanolu a 0,05M octanu amónneho s obsahom 0,1 % trifluóroctovej kyseliny v pomere 50 : 50, ako mobilnej izokratickej fáze, pri prietoku 215 ml/min. Frakcie obsahujúce produkt, ktorý je predmetom záujmu, sa spoja (230 ml) a odparením skoncentrujú (110 ml). Koncentrát sa hydroxidom sodným zalkalizuje na pH 9 a extrahuje metylénchloridom (50 ml). Metylénchloridová vrstva sa oddelí a odparí do sucha, čím sa získa 630 mg čiastočne znečisteného produktu. Ďalšia časť živice (1 g) sa ďalej prečistí preparatívnou vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou s obrátenými fázami na stĺpci MetaChem Inertsil 10 μπι C8 (50 mm x 25 cm) pri použití gradientu acetonitril : 0,05M octan amónny s obsahom 0,1 % trifluóroctovej kyseliny (20 : 80) až (25 : 75) počas 50 minút, ako mobilnej fázy, pri prietoku 125 ml/min. Frakcie

obsahujúce produkt, ktorý je predmetom záujmu (28 až 46 minút) sa spojí, nasýti hydrogenuhličitanom sodným a extrahujú metylénchloridom. Metylénchloridová vrstva sa oddelí a odparí do sucha, čím sa získa 361 mg čiastočne znečisteného produktu. Časť týchto čiastočne znečistených produktov sa dalej prečistí vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou s obrátenými fázami, ako napríklad na stĺpci Phenomenex Prodigy 10 μπι C18 (50 x 250 mm) pri použití zmesi metanolu a 0,05M octanu amónneho s 0,1 % kyseliny trifluóroctovej (50 : 50), ako izokratickej mobilnej fázy, pri prietoku 100 ml/min. Frakcie obsahujúce produkt, ktorý je predmetom záujmu (27 až 31 minút) sa spoja, nasýtia hydrogenuhličitanom sodným a extrahujú metylénchloridom. Metylénchloridová vrstva sa oddelí a odparí do sucha, čím sa získa čiastočne znečistený produkt. Táto látka sa dalej prečistí vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou s obrátenými fázami na stĺpci Phenomenex Prodigy 10 μπι C18 (50 x 250 mm) pri použití zmesi metanolu a 0,05M octanu amónneho s 0,1 % kyseliny trifluóroctovej (48 : 52), ako izokratickej mobilnej fázy, pri prietoku 100 ml/min. Frakcie obsahujúce produkt, ktorý je predmetom záujmu (41 až 45 minút) sa spoja, nasýtia hydrogenuhličitanom sodným a extrahujú metylénchloridom. Metylénchloridová vrstva sa oddelí a odparí do sucha, čím sa získa 13-cyklopropylerytromycín A vo forme pevnej látky (20 mg). Štruktúra produktu sa potvrdí MS a NMR spektroskopiou, pri použití spektrometru Bruker DMX 500 MHz:

Retenčný čas HPLC - postup B - 5,6 minút

APCI-MS-(M+H)⁺ pre ^C38^H68^NOi3^: nájdené pri m/e 746 vypočítané 746

Číslo atómu ’H(ppm) °C(ppm)

Počet pripojených atóme* H

1	222,41	0
2	175,88	0
3	103,63	1	4,45
4	96,75	1	4,92
5	83,92	1	3,60
6	80,25	1	4,02
7	78,52	1	4,74
8	78,42	1	3,05
9	75,99	0

10	75,49	0
11	73,05	0
12	71,31	1	3,27
13	69,46	1	3,84
14	69,39	1	3,52
15	66,02	1	4,04
16	65,95	1	2,49
17	49,93	3	3,36
18	45,47	1	2,74
19	45,23	1	2,89
20	40,70	1	2,34
21	40,00	1	2,02
22	38,94	2	1,96/1,76
23	38,46	1	3,15
24	35,38	2	2,41/1,61
25	29,07	2	1,71/1,28
26	27,36	3	1,50
27	21,94	3	1,28
28	21,84	3	1,26
29	19,08	3	1,32
30	18,69	3	1,21
31	17,38	3	1,31
32	16.11	3	1,21
33	12,38	3	1,20
34	10,64	1	1,20
35	9,60	3	1,16
36	4,23	2	0,67/1,33
37	1,64	2	0,47/0,32

Príklad 14b

Príprava 13-cyklopropylerytromycínu A pri použití

S. ervthraea NRRL 2338/pND30

Podobným postupom, aký je opísaný v príklade 14a sa pri použití kultúry S. ervthraea NRRL 2338/pND30 vyrobí zlúčenina uvedená v príklade 14a.

Príklad 15a

Príprava 13-(3-tienyl)erytromycínu B pri použití S. ervthraea NRRL 2338/pIGl

Kultúrou S. ervthraea NRRL 2338/pIGl sa zaočkuje ml média s vodou z vodovodu v 300ml Erlenmeyerovej banke. Po 48hodinovej inkubácii pri 28’C sa 5 ml inokula použije na zaočkovanie 50 ml média ERY-P v 300ml Erlenmeyerovej banke. Živná pôda sa inkubuje pri 28’C, po 24 hodinách sa k nej pridá N-acetylcystamíntioester 3-tiofénkarboxylovej kyseliny (20 mg) v 0,5 ml metanolu sterilizovaný filtráciou a vo fermentácii sa pokračuje počas 168 hodín. Potom sa celá živná pôda vodným hydroxidom sodným zalkalizuje na pH 8,5 a extrahuje etylacetátom (50 ml). Etylacetátová vrstva sa oddelí a skoncentruje do sucha. Vzorka sa za účelom analýzy HPLC-MS opäť rozpustí v metanole (1 ml). Potvrdí sa, že bol vyprodukovaný 13-(3-tienyl)erytromycín B.

Retenčný čas HPLC - postup A - 20,0 minút

APCI-MS-(M+H)⁺ pre ^C38^H66^Noi2^S: nájdené pri m/e 772 vypočítané 772

Príklad 15b

Príprava 13-(3-tienyl)erytromycínu B pri použití

S. ervthraea NRRL 2338/pND30

Podobným postupom, aký je opísaný v príklade 15a sa pri použití kultúry S. ervthraea NRRL 2338/pND30 vyrobí zlúčenina uvedená v príklade 15a.

Príklad 16

Príprava 6-deoxy-13-cyklopropylerytromycínu B pri použití

S. ervthraea NRRL 18643

Kultúrou S. ervthraea NRRL 18643, eryF mutantom S. ervthraea (Science, 252: 114, 5. apríla 1991), sa inokuluje 1 liter média z vody z vodovodu v 2,81itrovej Fernbachovej banke. Po 24hodinovej inkubácii pri 29°C za miešania pri frekvencii 200 min^-1 sa do banky pridá cyklopropánkarboxylová kyselina (200 ml). Po celkom 3 dňoch inkubácie sa obsah banky použije na zaočkovanie 8 litrov doplneného média ERY-P (60 g/liter cerelózy, 30 g/liter múky Nutrisoy, 3 g/liter síranu amónneho, 5 g/liter chloridu sodného, 6 g/liter sušiny z kukuričného výluhu, 0,5 g/liter síranu horečnatého a 1 ml/ liter P2000) v 141itrovej fermentačnej nádobe. Živná pôda sa inkubuje pri 28°C za aerácie rýchlosťou 8 litrov/min a miešania pri frekvencii otáčok 800 min^-1, pričom sa pH hydroxidom sodným alebo kyselinou sírovou (15%) udržuje medzi 6,9 až 7,3. Po 24 a 48 hodinách sa k živnej pôde pridá cyklopropánkarboxylová kyselina (1,6 ml). Produkt fermentácie, vykonané dvojíte, sa zoberie po 163 hodinách celkového času inkubácie. Hodnota pH celej pôdy sa pomocou hydroxidu sodného nastaví na 9 a pôda sa extrahuje etylacetátom (16 litrov). Etylacetátový extrakt sa v Buchiho rotačnej odparovacej jednotke skoncentruje. Olejovitý zvyšok sa rozpustí v 500 ml metylén92

chloridu. K vzniknutej kvapaline sa pridá 500 ml vody a pH vodnej fázy sa 10% hydroxidom amónnym nastaví na 9. Po intenzívnom trepaní sa zhromaždí metylénchloridová vrstva, ktorá sa odparí v llitrovom rotačnom odparovači, čím sa získa 11,0 g olejovitého zvyšku. Tento zvyšok sa rozpustí v 250 ml zmesi metanolu a vody v pomere 4:6a vzniknutý roztok sa umiestni na stĺpec 80 ml živice CG-161 (Toso Haas). Stĺpec sa premyje 350 ml zmesi metanolu a vody v pomere 4:6a potom krátko eluuje pri prietoku 8 ml/min zmesou metanolu a vody v pomere 7:3, kým sa z kolóny nezačnú eluovať farebné nečistoty (premytie asi 2 objemami lôžka). Potom sa zaháji jednohodinová elúcia gradientom so zvyšujúcou sa koncentráciou metanolu od 70 do 100 % počas jednej hodiny pri prietoku 8 ml/min. Frakcie obsahujúce produkt, ktorý je predmetom záujmu, sa odparia do sucha a ďalej prečistia vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou s obrátenými fázami na stĺpci Kromasil 10 μιη C18 (50 mm x 25 cm) pri použití zmesi acetonitrilu a tlmivého roztoku skladajúceho sa z 0,01M octanu amónneho, 0,02% trifluóroctovej kyseliny a 26% acetonitrilu v pomere (5:95) počas 50 minút pri prietoku 120 ml/min, ako mobilnej fázy. Potom sa elúcia uskutočňuje lineárnym gradientom tejto zmesi (5 : 95) až (33 : 67) počas 40 minút. Frakcie obsahujúce produkt, ktorý je predmetom záujmu, sa spoja (530 ml), 10% hydroxidom amónnym zalkalizujú na pH 9 a extrahujú metylénchloridom (400 ml). Metylénchloridová vrstva sa oddelí a odparí do sucha. Získa sa purifikovaný 6-deoxy-13-cyklopropylerytromycín B (12 mg). Štruktúra produktu sa potvrdí hmotnostnou spektroskopiou.

Retenčný čas HPLC - postup B - 21,4 minút

APCI-MS-(M+H)⁺ pre ^C38^H68^NO12^: nájdené pri m/e 714 vypočítané 714

Príklad 17

Príprava 6-deoxy-13-propylerytromycínu B pri použití

S. ervthraea NRRL 18643

Kultúrou S. ervthraea NRRL 18643, z trojdennej vrstvy na agare YPD (0,5% kvasničný extrakt Difco, 0,5% Bacto peptón Difco, 0,25% dextróza, 0,5% MOPS, 1,7% agar Basto Difco, s pH nastavenom na 7,0) sa zaočkuje 25 ml pôdy YPD (0,5% kvasničný extrakt Difco, 0,5% Bacto peptón Difco, 0,25% dextróza, 0,5% MOPS, s pH nastavenom na 7,0) v 250ml Erlenmeyerovej banke. Obsah banky sa inkubuje pri 225 min^-1 a 29“C počas 48 hodín a 2,5 ml obsahu sa zaočkuje 25 ml média ERY-P (5% dextróza, 3% múka Nutrisoy, 0,3% síran amónny, 0,5% chlorid sodný, 0,6% uhličitan vápenatý, pH nastavené na 7,0) a inkubuje pri 225 min^-1 a 29C počas celkom 6 dní. Do banky sa pridáva kyselina maslová: v čase 24 hodín (400 ppm), 72 hodín (400 ppm) a 120 hodín (200 ppm). Hodnota pH celej pôdy sa potom IM hydroxidom sodným nastaví na 9,1 a jej vzorka sa extrahuje dvakrát rovnakým objemom etylacetátu. Etylacetátové fázy sa skoncentrujú do sucha pod atmosférou dusíka (vodný kúpeľ, 50°C) a potom za účelom analýzy HPLC-MS resuspendujú v 1,0 ml metanolu. Potvrdí sa, že bol získaný 6-deoxy-13-propylerytromycín B.

Retenčný čas HPLC - postup C - 23,5 minút

APCI-MS-(M+H)⁺ pre C^gHypNOj-^: nájdené pri m/e 716 vypočítané 716

Príklad 18

Hodnotenie antibakteriálnej účinnosti

In vitro mikrotitrová zkouška antibakteriálnej účinnosti sa interpretuje v súlade so smernicami Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests - 6. vydanie; Approved Štandard, publikovanými The National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Stanovia sa minimálne inhibičné koncentrácie (MIC) voči rôznym baktériám. Tak napríklad Staphvlococcus aureus 80CR5 (kmeň citlivý voči makrolidom) vykazuje zvyčajne hodnoty v rozmedzí od <0,1 do 1,56 μg/ml.

Claims (31)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Erytromycíny všeobecného vzorca 1 kde predstavuje vodík alebo skupinu vzorca predstavuje hydroxyskupinu alebo skupinu všeobecného vzorca

   ΌΗ predstavuje alfa-rozvetvenú alkyl-, alkenyl-, alkinyl-, alkoxyalkyl- alebo alkyltioalkylskupinu, z ktorých každá obsahuje 3 až 8 atómov uhlíka a je prípadne substituovaná jednou alebo viacerými hydroxyskupinami; cykloalkylalkylskupinu s 5 až 8 atómami uhlíka, ktorej alkylová časť je alfa-rozvetvená a obsahuje 2 až 5 atómov uhlíka; cykloalkylskupinu s 3 až 8 atómami uhlíka alebo cykloalkenylskupinu s 5 až 8 atómami uhlíka, z ktorých každá je prípadne substituovaná metylskupinou alebo jednou alebo viacerými hydroxyskupinami alebo jednou alebo viacerými alkylskupinami s 1 až 4 atómami uhlíka alebo atómami halogénu; alebo troj- až šesťčlenný heterocyklický kruh obsahujúci kyslík alebo síru, ktorý môže byť nasýtený alebo celkom alebo sčasti nenasýtený a je prípadne substituovaný jednou alebo viacerými alkylskupinami s 1 až 4 atómami uhlíka alebo atómami halogénu; alebo R¹ predstavuje fenylskupinu, ktorá je prípadne substituovaná aspoň jedným substituentom zvoleným zo súboru skladajúceho sa z alkylskupiny s 1 až 4 atómami uhlíka, alkoxyskupiny s 1 až 4 atómami uhlíka a alkyltioskupiny s 1 až 4 atómami uhlíka, atómov halogénu, hydroxyskupiny, trifluórmetylskupiny a kyanoskupiny; alebo R¹ môže predstavovať skupinu všeobecného vzorca a (a) kde predstavuje kyslík, síru alebo skupinu -CH₂~;

   a, b, c a d predstavuje každý nezávisle číslo 0 až 2, pričom súčet a+b+c+dje menší alebo rovný 5;

   R² predstavuje vodík alebo hydroxyskupinu;

   R³ až R⁵ predstavuje každý nezávisle vodík alebo skupinu CH₃ alebo CH₂CH₃;

   R⁶ predstavuje vodík alebo hydroxyskupinu;

   R⁷ predstavuje vodík alebo skupinu CH₃ alebo CH₂CH₃;

   R⁸ predstavuje vodík alebo desozamín;

   R⁹ predstavuje vodík alebo skupinu CH₃ alebo CH₂CH₃;

   R¹⁰ predstavuje hydroxyskupinu, mykarózu (R¹³ predstavuje vodík) alebo kladinózu (R¹³ predstavuje skupinu CH₃),

   R¹¹ predstavuje vodík; alebo r¹⁰ = r¹¹ = kyslík; a

   R¹² predstavuje vodík alebo skupinu CH₃ alebo CH₂CH₃;

   alebo ktorékoľvek z hore definovaných zlúčenín modifikované nahradením jednej alebo viacerých skupín -CHOH alebo -CHÓR ketoskupinou;

   a ich farmaceutický vhodné soli.
2. 2. Erytromycíny všeobecného vzorca 2 (2) predstavuje vodík alebo skupinu vzorca predstavuje hydroxyskupinu alebo skupinu všeobecného vzorca

   OH predstavuje vodík, alkylskupinu s 1 až 8 atómami uhlíka, alkenylskupinu s 2 až 8 atómami uhlíka, alkinylskupinu s 2 až 8 atómami uhlíka, alkoxyalkyl- alebo alkyltioalkylskupinu s 1 až 6 atómami uhlíka v každej z alkylových a alkoxylových skupín, pričom ktorákoívek z uvedených alkylových, alkoxylových, alkenylových alebo alkinylových skupín je prípadne substituovaná jednou alebo viacerými hydroxyskupinami alebo jedným alebo viacerými atómami halogénu; cykloalkylskupinu s 3 až 8 atómami uhlíka alebo cykloalkenylskupinu s 5 až 8 atómami uhlíka, z ktorých každá je prípadne substituovaná metylskupinou alebo jednou alebo viacerými alkylskupinami s 1 až 4 atómami uhlíka alebo atómami halogénu; alebo troj- až šesťčlenný heterocyklický kruh obsahujúci kyslík alebo síru, ktorý môže byť nasýtený alebo celkom alebo sčasti nenasýtený a je prípadne substituovaný jednou alebo viacerými alkylskupinami s 1 až 4 atómami uhlíka alebo atómami halogénu; alebo skupinu SR¹⁴, kde R¹⁴ predstavuje alkylskupinu s 1 až 8 atómami uhlíka, alkenylskupinu s 2 až 8 atómami uhlíka, alkinylskupinu s 2 až 8 atómami uhlíka, cykloalkylskupinu s 3 až 8 atómami uhlíka, cykloalkenylskupinu s 5 až 8 atómami uhlíka, fenylskupinu alebo substituovanú fenylskupinu, kde substituentom je alkylskupina s 1 až 4 atómami uhlíka, alkoxyskupina s 1 až 4 atómami uhlíka, halogén alebo troj- až šesťčlenný heterocyklický kruh obsahujúci kyslík alebo síru, ktorý môže byť nasýtený alebo celkom alebo sčasti nenasýtený a je prípadne substituovaný jednou alebo viacerými alkylskupinami s 1 až 4 atómami uhlíka alebo atómami halogénu;

   predstavuje vodík alebo hydroxyskupinu;

   100

   R³ až R⁵ predstavuje každý nezávisle vodík alebo skupinu CH₃ alebo CH₂CH₃;

   R⁶ predstavuje vodík alebo hydroxyskupinu;

   R⁷ predstavuje vodík alebo skupinu CH₃ alebo CH₂CH₃;

   R⁸ predstavuje vodík alebo desozamín;

   predstavuje vodík alebo skupinu CH₃ alebo CH₂CH₃;

   predstavuje hydroxyskupinu, mykarózu (R¹³ predstavuje vodík) alebo kladinózu (R¹³ predstavuje skupinu ch₃), predstavuje vodík; alebo

   R¹⁰ = R¹¹ = kyslík; a

   R¹² predstavuje vodík alebo skupinu CH₃ alebo CH₂CH₃;

   pričom, kečf R³ až R^ predstavujú CH3, R⁷ predstavuje CH3, R⁹ predstavuje CH3 a R¹² predstavuje CH3, potom R¹ nepredstavuje vodík alebo alkylskupinu s 1 atómom uhlíka;

   alebo ktorékoľvek z hore definovaných zlúčenín modifikované nahradením jednej alebo viacerých skupín -CHOH alebo -CHÓR ketoskupinou;

   a ich farmaceutický vhodné soli.
3. 3. Erytromycíny všeobecného vzorca 1 podlá nároku 1, kde R¹ predstavuje cykloalkylskupinu alebo cykloalkenylskupinu, vždy s 3 až 6 atómami uhlíka, ktorá je prípadne substituovaná jednou alebo viacerými hydroxyskupinami alebo jednou alebo

   101 viacerými alkylskupinami s 1 až 4 atómami uhlíka; a ich farmaceutický vhodné soli.
4. 4. Erytromycíny všeobecného vzorca 1 podľa nároku

   3, kde R¹ prestavuje cyklopropylskupinu; a ich farmaceutický vhodné soli.
5. 5. Erytromycíny všeobecného vzorca 1 podľa nároku

   3, kde R¹ prestavuje cyklobutylskupinu; a ich farmaceutický vhodné soli.
6. 6. Erytromycíny všeobecného vzorca 1 podľa nároku

   3, kde R¹ prestavuje cyklopentylskupinu; a ich farmaceutický vhodné soli.
7. 7. Erytromycíny všeobecného vzorca 1 podľa nároku

   3, kde R¹ prestavuje cyklohexylskupinu; a ich farmaceutický vhodné soli.
8. 8. Erytromycíny všeobecného vzorca 1 podľa nároku

   1, kde R¹ prestavuje alfa-rozvetvenú alkyl-, alkenyl-, alkinyl-, alkoxyalkyl- alebo alkyltioalkylskupinu vždy s 3 až 8 atómami uhlíka; a ich farmaceutický vhodné soli.
9. 9. Erytromycíny všeobecného vzorca 1 podľa nároku

   8, kde R¹ prestavuje izopropylskupinu; a ich farmaceutický vhodné soli.
10. 10. Erytromycíny všeobecného vzorca 1 podľa nároku

    8, kde R¹ prestavuje sek.butylskupinu; a ich farmaceutický vhodné soli.
11. 11. Erytromycíny všeobecného vzorca 1 podľa nároku

    8, kde R¹ prestavuje 2-butén-2-ylskupinu, 2-pentén-2-ylsku

    102 pinu alebo 4-metyl-2-pentén-2-ylskupinu; a ich farmaceutický vhodné soli.
12. 12. Erytromycíny všeobecného vzorca 1 podlá nároku

    8, kde R¹ prestavuje 1-metyltioetylskupinu; a ich farmaceutický vhodné soli.
13. 13. Erytromycíny všeobecného vzorca 1 podlá nároku 1, kde R¹ prestavuje päť- alebo šesťčlenný heterocyklický kruh obsahujúci kyslík alebo síru, ktorý je prípadne substituovaný jednou alebo viacerými hydroxyskupinami, alkylskupinami s 1 až 4 atómami uhlíka alebo atómami halogénu; a ich farmaceutický vhodné soli.
14. 14. Erytromycíny všeobecného vzorca 1 podlá nároku

    13, kde R¹ prestavuje 3-tienylskupinu; a ich farmaceutický vhodné soli.
15. 15. Erytromycíny všeobecného vzorca 1 podlá nároku

    13, kde R¹ prestavuje 3-furylskupinu; a ich farmaceutický vhodné soli.
16. 16. Erytromycíny všeobecného vzorca 1 podlá nároku

    1, kde R¹ prestavuje fenylskupinu; a ich farmaceutický vhodné soli.
17. 17. Erytromycíny všeobecného vzorca 1 podlá nároku

    1, kde R¹ prestavuje skupinu všeobecného vzorca (a), kde a a b predstavuje vždy číslo 0, c a d predstavuje vždy číslo 1 a X predstavuje skupinu -CH₂-; a ich farmaceutický vhodné soli.
18. 18. Erytromycíny všeobecného vzorca 1 podlá nároku

    1, kde R¹ prestavuje skupinu všeobecného vzorca (a), kde a a b predstavuje vždy číslo 0, c predstavuje číslo 1, d

    103 predstavuje číslo 2 a X predstavuje skupinu -CH₂-; a ich farmaceutický vhodné soli.
19. 19. Erytromycíny všeobecného vzorca 1 podía nároku 1, kde R¹ prestavuje skupinu všeobecného vzorca (a), kde a a b predstavuje vždy číslo 0, c a d predstavuje vždy číslo 1 a X predstavuje kyslík; a ich farmaceutický vhodné soli.
20. 20. Erytromycíny všeobecného vzorca 2 podlá nároku 2, kde r! prestavuje skupinu všeobecného vzorca SR¹⁴, kde R¹⁴ predstavuje metylskupinu alebo etylskupinu; a ich farma ceuticky vhodné soli.
21. 21. Erytromycíny všeobecného vzorca 2 podlá nároku 2, kde R¹ prestavuje etylskupinu, propylskupinu, butylskupinu, izopropylskupinu alebo sek.butylskupinu; a ich farmaceutický vhodné soli.
22. 22. Erytromycíny všeobecného vzorca 2 podlá nároku

    2, kde R¹ prestavuje l-(trifluórmetyl)etylskupinu; a ich farmaceutický vhodné soli.
23. 23. Spôsob výroby erytromycínov všeobecného vzorca 1 podlá nároku 1 alebo všeobecného vzorca 2 podlá nároku 2, vy značujúci sa tým, že sa fermentuje organizmus schopný produkovať erytromycín v prítomnosti karboxylovej kyseliny všeobecného vzorca R CO₂H, kde R má význam uvedený v nároku 1 alebo nároku 2 alebo jej soli, esteru alebo amidu alebo oxidačného prekurzoru, a izoluje sa zlúčenina všeobecného vzorca 1 alebo 2.
24. 24. Spôsob podlá nároku 23, vyznačujúci sa t ý m, že organizmom je Saccharopolyspora ervthraea prípadne obsahujúci efektívne integrovaný plazmid schopný riadiť biosyntézu erytromycínov všeobecného vzorca 1, tento

    104 plazmid prípadne obsahuje promotorový/aktivátorový gén PKS typu II.
25. 25. Spôsob podlá nároku 24, vyznačujúci sa t ý m, že organizmus Saccharopolvspora ervthraea je zvolený z kmeňov NRRL 2338, 18643 alebo 21484 prípadne obsahujúcich efektívne integrovaný plazmid schopný riadiť biosyntézu erytromycínov všeobecného vzorca 1, tento plazmid prípadne obsahuje actl promotor a jeho rozpoznávací aktivátorový gén actll-orf4.
26. 26. Spôsob podlá nároku 25, vyznačujúci sa t ý m, že prípadným efektívne integrovaným plazmidom je pAVLD, pIGl, pND30, pCJR26, pCJR49, pC-AT12, pC-ATX alebo iný podobný konštrukt.
27. 27. Spôsob podlá nároku 25, vyznačujúci sa t ý m, že organizmom je S. ervthraea ERMD1, S. ervthraea NRRL 2338/pIGl, S. ervthraea NRRL 2338/pND30 alebo iný podobný transformant.
28. 28. Farmaceutická kompozícia, vyznačuj úca sa t ý m, že obsahuje terapeuticky účinné množstvo erytromycínu podlá nároku 1 alebo 2 v kombinácii s farmaceutický vhodným nosičom.
29. 29. Spôsob liečby bakteriálnej infekcie alebo poruchy spojenej s bakteriálnou infekciou alebo protozoálnej infekcie u cicavcov, rýb a vtákov, vyznačujúci sa tým, že sa týmto cicavcom, rybám alebo vtákom podá terapeuticky účinné množstvo erytromycínu podlá nároku 1 alebo 2.
30. 30. Použitie erytromycínu podlá nároku 1 alebo 2 na výrobu liečiva pre liečenie bakteriálnych infekcií u cicavcov, rýb alebo vtákov.

    105
31. 31. Použitie erytromycínu podía nároku 1 alebo 2 na zlepšení ukazovatelov efektívnosti chovu, ako sú hmotnostný prírastok, efektívnosť využitia krmív, dojivosť apod. u cicavcov, rýb alebo vtákov.