CN1229438A - 新型红霉素及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

在有R1CO2H存在的情况下,通过发酵合适的有机体来制备特别是带有新型C－13取代基R1(例如C3－C6环烷基或环链烯基)的红霉素。优选的有机体是红色糖多孢菌,它优选含有一种能够指导所需化合物合成的整合质粒。

Description

新型红霉素及其制备方法
发明背景
本发明涉及新型聚酮化合物及其制备方法和方式、且特别涉及用作哺乳类动物(包括人)体内以及鱼和鸟体内抗菌和抗原生动物药剂以及其它应用(例如抗癌、动脉粥样硬化、胃蠕动性降低等)的新型红霉素。本发明还涉及含有新型化合物的药物组合物并涉及治疗哺乳类动物、鱼、或鸟中细菌和原生动物感染的方法，该方法通过对需要这类治疗的哺乳类动物、鱼、或鸟给予该新型化合物来进行。
操纵可来源于不同聚酮化合物生物合成基因群体的聚酮化合物生物合成基因或其部分以便生产新型红霉素。
聚酮化合物是大类且结构上不同类的天然产物，它们包括许多可形成抗菌或其它药物特性的化合物，诸如红霉素、四环素、雷怕霉素、除虫菌素、聚醚离子载体和FK506。特别地，链霉菌属和相关放线菌属的细菌大量产生聚酮化合物。按照一种类似于脂肪酸生物合成的方式、通过反复逐步缩合酰基硫酯来合成聚酮化合物。在天然聚酮化合物中发现的较大的结构差异性是由对作为“起子”或“伸展剂”单位的乙酸酯或丙酸酯(通常)进行选择而产生的；并且是由每次缩合后所观察到的对β-酮基的不同加工程度而产生的。加工步骤的实例包括还原成β-羟基酰基-、在脱水后还原成2-烯酰基和完全还原成饱和的酰基硫酯。还规定将这些加工步骤的立体化学结果用于每一链延伸的循环。用一组形成链的称作聚酮化合物合酶的酶来引发聚酮化合物的生物合成。已经描述了在放线菌内有两类聚酮化合物合酶(PKS)。然而，作为本发明主题的新型聚酮化合物和方法由I型PKS’s来合成、以用于大环内酯红霉素、除虫菌素和雷怕霉素的PKS’s为代表(附图1)、并且由用于每一聚酮化合物链延伸的不同组或“组件”的酶构成(附图2)(Cortes，J.等《自然》(1990)348：176-178；Donadio，S.等《科学》(1991)252：675-679；MacNeil，D.J.等《基因》(1992)，115：119-125；Schwecke，T.等《美国国家科学院学报》(1995)92：7839-7843)。注意：本文所用的术语“天然组件”指的是邻接结构域组，从β-酮脂酰基合酶(“KS”)基因到下一个酰基载体蛋白(“ACP”)基因，这样可完成聚酮化合物链延伸的一个循环。所用的术语“组合组件”指的是任意组的邻接结构域(和结构域部分)，从第一个天然组件中的第一点延伸至第二个天然组件中的第二个等同点。第一和第二个点一般处于存在于所有组件中的核心结构域中，即两者均处于相应KS、AT(酰基转移酶)、ACP结构域的等同点，或在结构域间的接头区中。
附图2表示产生PKS(也称作6-脱氧红诺霉素(erythronolide)B合酶，DEBS)基因的红霉素的构成。三个开放读框编码DEBS多肽。在指定组件的六个重复单位中构成基因。第一个开放读框编码第一个多酶或弹夹(DEBS1)，这种多酶或弹夹由三种组件组成：装配组件(ery-装配)和两种延伸组件(组件1和2)。装配组件包括一种酰基转移酶和一种酰基载体蛋白。这可以与WO93/13663(参照后面)的附图1形成对照。这表明ORF1仅由两种组件组成，它们中的第一种实际上即是装配组件又是第一个延伸组件。
已经证实DEBS中组件5的酮还原酶结构域DNA编码部分的符合读框的缺失可导致形成红霉素类似物5，6-双脱氧-3-碳霉糖基-5-氧代红诺霉素B、5，6-双脱氧-5-氧代红诺霉素B和5，6-双脱氧-6，6-环氧-5-氧代红诺霉素B(Donadio，S.等《科学》，(1991)252：675-679)。同样，通过相应PKS编码的DNA的遗传工程并将其引入红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)来改变DEBS中组件4烯酰还原酶结构域内残余活性位点，这可导致产生6，7-脱水红霉素C(Donadio，S.等《美国国家科学院学报》(1993)90：7119-7123)。
国际专利申请号WO93/13663(将该文献的全部内容引入本文作为参考)中记载了另外类型的遗传操作的DEBS基因，这些基因能够生产改变的聚酮化合物。然而，据报导许多这类的尝试均没有结果(Hutchinson C.R.和Fujii，I.《微生物学回顾年鉴》(1995)49：201-238，在231页)。已经公开了来自吸水链霉菌基因的全DNA序列，所述的吸水链霉菌编码可调节大环内酯免疫抑制剂聚酮化合物雷怕霉素的生物合成的制成组件的1型PKS(Schwecke，T.等(1995)《美国国家科学院学报》92：7839-7843)(附图3)。将DNA序列寄存在EMBL/Genbank资料库中、登记号为X86780。
尽管已经鉴定了大量在治疗上重要的聚酮化合物，但是仍有一种对获得具有增强特性或具有完全新型生物活性的新型聚酮化合物的需求。由制成组件的I型PKS’s产生的复合聚酮化合物是特别有价值的，即它们包括具有公知作为驱肠虫药、杀昆虫剂、免疫抑制剂、抗真菌药、和/或抗菌剂的用途的化合物。由于它们的结构复杂性，所以这类新型聚酮化合物不易通过总化学合成或通过公知聚酮化合物的化学修饰法而获得。本发明的一个方面来源于我们对下列事实的评价：即I型PKS基因集合编码一种跟随在延伸组件后的装配组件。特别有用的是提供一种杂种PKS基因集合，其中装配组件与延伸组件是异源的且这样可导致聚酮化合物带有一种改变的起子单位。这是一种在现有技术中还不十分了解的概念，因为它不考虑到装配组件的存在。WO93/13663涉及通过使单一功能(即单一酶)失活来改变PFS基因或通过缺失、插入或置换而影响“完整组件”。在其术语中，装配的集合不是组件。
如果装配组件是一种可接受许多不同羧酸单位的组件，那么可以将杂种基因集合用于生产许多不同的聚酮化合物。例如，一种杂种基因集合可以应用编码一种带有ery延伸组件的avr装配组件的核酸。装配组件可以接受非天然的酸单位及其衍生物；avr装配组件在这方面特别有用(Dutton等，(1991)《抗菌素杂志》44：357-365)。此外，能够确定用于非天然起子单位的天然装配组件的特异性并其能够利用天然装配组件松弛型特异性的优点来生成新型聚酮化合物。因此，本发明的另一个方面是ery装配组件的一种出人意料的能力，即它可结合非天然羧酸及其衍生物，从而在仅含有DEBS基因的产生红霉素的菌株中产生新型红霉素。当然，特别是通过由可生成不同氧化态和/或具有不同立体化学结构的酮类化合物单位的组件来置换一种延伸组件，也可以在产物聚酮化合物中发生改变。一般假定通过酰基转移酶来测定聚酮化合物链中甲基的立体化学结构，但实际上这是PKS其它结构域的一个特征并由此仅通过置换这些结构域、分别地或通过组件置换而发生变异。通过酰基转移酶结构域的置换或总组件的置换可以添加或去除甲基和其它取代基。因此，能够将联用用延伸组件置换的红霉素装配组件的松弛型底物特异性和用延伸组件置换的杂交装配组件取代物作为机理而生产广谱的新型红霉素，对于本领域技术人员来说，这是显而易见的。所以，本发明描述了通过非转化有机体，以及这类基因集合、含有这类基因集合的载体和在转化有机体表达它们来生产新型红霉素的转化有机体产生新型红霉素这一内容。转化有机体可以载有重组质粒，或质粒可以整合。带有int序列的质粒会进入宿主染色体的特异性附着位点(att)。例如通过通常在红霉素的产生过程中进行全部或部分的生物合成修饰，转化有机体能够修饰初产物(如附图2B中所示)。然而，应用可由突变体有机体构成，这样将某些常规的途径阻断，从而(例如)产生不带有一个或多个“天然”羟基或糖基的产物，例如如WO 91/16334或Weber等(1985)在《细菌学杂志》164：425-433中所述，将这些文献的全部内容引入本文作为参考。另一方面，应用可由有机体构成，其中超表达某些常规途径而克服了在所需产物产生过程中潜在的限速步骤，例如如WO97/06266中所述，将该文献的全部内容引入本文作为参考。
本方法的这一方面主要涉及将PKS基因组件处理成可用于构建所需类型酶系统的组件以及由此产生合乎要求的类型红霉素产物。该方法一般包括切割过程和组件以及多组件组的装配过程。用于构成和截断组件间连接的合乎逻辑的位置处于组件间的连接区。然而，可优选实际在接近结构域边缘的结构域内(即编码酶的部分)内形成切口和接合点。所有制成组件的PKS’s之间此处的DNA高度保守，且这样有助于构建可被转录的杂种分子。还有助于保持所编码酶的活性位点的间距，这是很重要的。例如，在通过由一种avr装配组件置换ery装配组件而生产组件基因的过程中，去除ery组件以及小量后面的酮合酶(KS)结构域。KS结构域(距离活性位点很远)高度保守并由此提供出一种合适的剪接位点而替代装配结构域与KS结构域起点间的接头区。然后由一种avr装配组件置换切下的ery组件。
实际上，当取代一种装配组件时，不仅需要置换装配组件结构域(一般为酰基转移酶(AT)和酰基载体蛋白(ACP))、而且需要置换在后面的延伸组件起点处的KS。一般来说，切下的装配组件可以提供一种丙酸酯起子，且这种置换是用来提供一种或多种不同的起子的。然而，丙酸酯可以从宿主细胞内的丙酸酯库中进入延伸组件的KS中，导致所需产物稀释。通过置换延伸的装配组件、包括所有或多数KS结构域可以基本上防止这一过程。(剪接位点可以在KS基因的末端区中、或后面的AT基因的早期(early)、或在它们之间的接头区。)
当置换“组件”时，不限于“天然”组件。例如，所切下和/或置换和/或插入的“组合组件”可以从两种天然型组件的相应结构域开始延伸，例如从一种组件的AT至下一组件的AT，或从KS至KS。剪接位点处于相应的保守边缘区或接头区中。对于同时添加2个或多个组件来说，组合组件还可以是‘双重’或较大的多重型的。
在另一方面中，本发明提供了通过上述方面而获得的新型红霉素。这些红霉素包括如下：
(i)一种红霉素类似物(为一种带有14节环的大环内酯化合物)，其中C-13带有一个侧链而不是乙基，一般为直链的C3-C6的烷基；支链的C3-C8的烷基；C3-C8的环烷基或环链烯基(可用例如一个或多个羟基、C1-C4的烷基或烷氧基或卤原子任意取代)；或含有O或S3-6节的、饱和或完全或部分不饱和的、任意取代(就环烷基而言)的杂环，或R1是可以被至少一个取代基任意取代的苯基，所述的取代基选自C1-C4的烷基、C1-C4的烷氧基和C1-C4的烷基硫基、卤原子、三氟甲基和氰基；或R1可以是带有如下所示通式(a)的基团：
其中X是O、S或-CH2-，a、b、c和d各自独立地为0-2且a+b+c+d≤5。对于C-13取代基R来说，优选的候选者是羧酸酯单位RCOOR’的基团，可用作avr起子组件的底物、或雷怕霉素起子变体。优选的底物是羧酸RCOOH。能够有效使用的可选择的底物是羧酸盐、羧酸酯或酰胺。优选的酯是可方便地被avr起子组件用作底物的N-乙酰基-半胱胺硫酯，正如Dutton等在EP 0350187中所述，将该文献的全部内容引入本文作为参考。优选的酰胺是N-酰基咪唑。其它可以使用的可选择的底物是衍生物，它们是羧酸的氧化前体；因此，例如合适的底物可以是通式RCH(NH2)COOH的氨基酸、通式RCOCOOH的二羟乙酸、通式RCH2NH2的甲胺衍生物、通式RCH2OH的甲醇衍生物、通式RCHO的醛或通式R(CH2)nCOOH的取代链烷酸，其中n为2、4或6。由此优选的底物实例包括异丁酸酯(R＝i-Pr)和2-甲基丁酸酯(R＝1-甲基丙基)。其它的可能性包括正丁酸酯、羧酸环丙酯、羧酸环丁酯、羧酸环戊酯、羧酸环己酯、羧酸环庚酯、羧酸环己烯酯、羧酸环庚烯酯、和环羧酸酯的环甲基化的变化形式以及上述它们的衍生物。
该红霉素类似物可以对应于PKS的起始产物(6-脱氧红诺霉素)或一个或多个常规生物合成步骤后的产物。正如附图2b中所示，这些步骤包括：6-羟基化；3-o-糖基化；5-o-糖基化；12-羟基化；以及特异性糖的甲基化。
因此，这些类似物可以包括那些符合附图2b中所示的6-脱氧红诺霉素B、红霉素A和不同中间产物和可替换物(尽管不对它们进行限定)的物质。
(ii)以一个或多个酮化合物单位(即选择来自下列基团的可替换物：-CO-、-CH(OH)-、＝CH-和-CH2-)的氧化态形式区别于相应“天然”化合物(附图2b)的红霉素类似物。
任意-CH(OH)-的立体化学结构也是独立地可选择的。
(iii)在没有“天然”甲基侧链存在的情况下区别于相应“天然”化合物的红霉素类似物。(这是通过使用变体AT而获得的)。一般的延伸组件使用C2或C3单位以提供未甲基化的和甲基化的酮化合物单位。可以提供未甲基化的单位，其中甲基化的单位是天然的(且反之亦然，在系统中有天然的未甲基化的单位)，并且还可以生成较大的单位(例如C4)以提供乙基取代基。
(iv)以‘天然’甲基的立体化学结构、和/或是环取代基而不是甲基的形式区别于相应“天然”化合物的红霉素类似物。
(v)具有两个或多个(i)-(iv)部分的特征的红霉素类似物。
(vi)已由非PKS酶进行进一步加工、例如进行羟基化、环氧化、糖基化和甲基化中的一种或多种的任意上述衍生物。
本文描述了用于生产本发明新型红霉素的方法。在最简单的方法中，将非天然起子单位(优选、但不限于非天然起子单位的羧酸类似物)引入能够产生红霉素的未转化的有机体中。优选的方法包括将起子单位引入产生红霉素的有机体的发酵肉汤中，这种方法对能够产生红霉素的转化有机体来说更为有效。然而，还可以将起子单位类似物引入能够产生红霉素的有机体的可选择制备物中、例如分级分离的或未分级分离的破碎细胞制备物中。此外，这种方法对于能够产生红霉素的转化有机体来说同样有效。在另一种方法中，已经将异源I型PKS(“供体”PKS)内单个组件或结构域的一种或多种DNA区段用于置换分别编码产生红霉素有机体的DEBS基因内各个组件或结构域的DNA。从任意天然或非天然I型PKS中得到的装配组件和延伸组件(它们适于这种供体PKS且特别适于这一目的)是用于红霉素、雷怕霉素、除虫菌素、替曲那新、竹桃霉素、莫能星、两性霉素和利福霉素的生物合成的I型PKS’s成分，己通过基因序列分析了解了它们基因和制成组件的结构，至少部分上是这样。供体PKS装配组件的特别有益的实例是：那些表现出松弛型特异性的装配组件、例如除虫链霉菌产生的除虫菌素(avr)的PKS的装配组件；那些具有一种罕见特异性的装配组件、例如雷怕霉素-、FK506-和生产子囊霉素的PKS’s的装配组件，所有这些装配组件均可自然地接受莽草酸酯衍生的起子单位。出人意外的是，当在合适的条件下进行培养时，发现未转化的和遗传工程的产生红霉素的有机体可生产非天然的红霉素，并其如果合适，发现可以对产物进行与天然红霉素同样的加工。
在本发明的另一个方面中，将含有“供体”PKS DNA的质粒在一定条件下引入一种宿主细胞中，其中通过同源重组将该质粒整合入产生红霉素的菌株的染色体上的DEBS基因中，从而生成一种杂种PKS。如果供体PKS DNA包括一种区段、该区段以装配组件变成与染色体上的DEBS基因连接这样一种方式编码该装配组件，那么是一个优选的实施方案。当在如本文所述的合适条件下培养时，这样一种杂种PKS产生有价值的和新型的红霉素产物。特别地，当由产生除虫菌素(avr)的PKS的装配组件置换DEBS基因的装配组件时，新型红霉素产物含有以avr PKS所用的那些为特征的起子单位。因此，当由avr装配组件置换ery PKS的装配组件时，发现含有这类杂种PKS的红色糖多孢菌菌株可产生14节的大环内酯，它们含有一般由avr PKS使用的起子单位。
令人意外的是发现由这类红色糖多孢菌重组细胞产生的14节的大环内酯聚酮化合物包括红霉素A的衍生物，这证明正确地进行了要求将杂种PKS转化成新型和治疗上有价值的红霉素A衍生物的几个加工步骤。本发明的另一个方面是令人意外和惊奇地发现：当将杂种基因置于一种启动子控制下时，可以特别地增加任意杂交红霉素基因的转录，其中，该启动子是连接到该启动子的特异性激活基因的II型PKS基因的启动子。特别值得注意的是：当在适于红霉素产生的条件下培养含有这样控制下的杂交红霉素基因的遗传工程细胞时，产生的新型红霉素的含量显著增加。对于置于II型启动子和激活物基因控制下天然红霉素PKS来说，还观察到了有价值红霉素产物在产量上的这类特异性增加。在一个优选的实施方案中，在来源于天蓝色链霉菌的放线紫红素生物合成基因族的双向actI启动子控制下引入出现在SCP-2*衍生的质粒上的所需基因，且其中载体还含有编码特异性激活蛋白Act II-orf 4的结构基因。将重组质粒引入红色糖多孢菌，在引入PKS基因或PKS基因已经存在于宿主菌株的条件下，在actI启动子控制下表达。
这类菌株产生所需的红霉素产物且仅在有特异性启动子存在的情况下需要激活物基因以便增加从启动子的转录效率。特别出人意料的是Act II-orf 4族的激活物不属于值得考虑的结合DNA蛋白质的种类。因此，预计需要另外的蛋白质或其它控制元件用于在未知可产生放线紫红素或一种相关的异色原烷醌色素的异源宿主中发生激活。此外令人惊奇和有用的是重组菌株可以产生比当同样的PKS基因在天然启动子控制下时多10倍以上的红霉素产物，且在生长培养中、而不是仅在从生长期至稳定期的转换过程中还可早熟地产生特异性红霉素产物。这类红霉素用作抗菌素并用于人体和兽药的许多其它目的。因此，当遗传工程细胞是红色糖多孢菌时，在进行低拷贝数质粒载体的位点特异性整合后，激活物和启动子来源于放线紫红素PKS基因族且actI/act II-orf 4调节的ery PKS基因族位于在染色体中，在合适条件下培养这些细胞可产生比未在这类异源控制下的可比拟菌株中多10倍以上总计达14节的大环内酯产物。在这类红色糖多孢菌的遗传工程细胞中，当在这种异源控制下的PKS基因是杂交I型PKS基因时、其构建在本文中描述，与未在这类控制下的同样杂交I型PKS基因相比，可以获得10倍以上的杂交聚酮化合物产物。特别地，当杂交I型PKS基因是ery PKS基因时、其中由avr装配组件转换该装配组件，如果在本文所述的合适条件下培养，则发现由遗传工程细胞产生的新型14节大环内酯在总量上增加了10倍。
在实施例中将更完整地描述使未转化和遗传工程的产生红霉素的细胞生长的的合适和优选方式以及用于新型红霉素的分离、鉴定和实际应用的合适和优选方式。
发明概括
本发明涉及通式1的化合物及其药物上可接受的盐：
Figure A9719764900141
其中：
R1是α-支链的C3-C8的烷基、链烯基、炔基、烷氧基烷基或烷基硫代烷基，它们中的任何一种均可以任意被一个或多个羟基取代；R1的是C5-C8的环烷基烷基，其中烷基是α-支链的C2-C5的烷基；R1是C3-C8的环烷基或C5-C8的环链烯基，它们各自可以被甲基或一个或多个羟基或一个或多个C1-C4的烷基或卤原子任意地取代；或R1是含有氧或硫3-6节的杂环，该杂环可以是饱和的、或完全或部分不饱和的且该杂环可以任意被一个或多个C1-C4的烷基或卤原子取代；或R1是可以由至少一个取代基任意取代的苯基，所述的取代基选自C1-C4的烷基、C1-C4的烷氧基和C1-C4的烷基硫基、卤原子、三氟甲基、和氰基；或R1可以是带有如下所示通式(a)的基团：
Figure A9719764900142
其中X是O、S或-CH2-，a、b、c和d每个均独立地为0-2且a+b+c+d≤5。
R2是H或OH；R3-R5每个均独立地为H、CH3、或CH2CH3；R6是H或OH；且R7是H、CH3、或CH2CH3；R8是H或德糖胺；R9是H、CH3、或CH2CH3；R10是OH、碳霉糖(mycarose)(R13是H)、或克拉定糖(R13是CH3)，R11是H；或R10＝R11＝O；且R12是H、CH3、或CH2CH3。
在上述定义中，含有3个或多个碳原子的烷基可以是直链或支链的。卤素指的是氟、氯、溴或碘。α-支链指的是连接在C-13位置上的碳是与两个另外的碳原子连接的仲碳原子，烷基链的剩余部分可以是直链或支链。
通式1的优选化合物是这样一些化合物，其中R3-R5、R7、R9和R12是CH3，且R1是异丙基或仲丁基、2-丁烯-2-基、2-戊烯-2-基、或4-甲基-2-戊烯-2-基，它们可任意被一个或多个羟基取代。另外优选的是通式1的化合物，其中R3-R5、R7、R9和R12是CH3，且R1是C3-C6的环烷基或环链烯基，它们可以被一个或多个羟基或一个或多个C1-C4的烷基任意取代。在另一组优选的化合物中，R1是含有氧或硫的5或6节杂环，特别是3-噻吩基或3-呋喃基环，它们可以被一个或多个羟基、或一个或多个C1-C4的烷基或卤原子任意取代。在另一组优选的化合物中，R1是C3-C8的烷基硫代烷基，特别是1-甲硫基乙基。
本发明的其它特殊实施方案包括通式2的化合物及其药物上可接受的盐：
Figure A9719764900151
其中：
R1是H、C1-C8的烷基、C2-C8的链烯基、C2-C8的炔基、在各自烷基或烷氧基中含有1-6个碳原子的烷氧基烷基或烷基硫代烷基，其中任意一种所述的烷基、烷氧基、链烯基或炔基均可以被一个或多个羟基或可以被一个或多个卤原子所取代；或R1是C3-C8的环烷基或C5-C8的环链烯基，它们各自可以被甲基或一个或多个C1-C4的烷基或卤原子任意地取代；或R1是含有氧或硫的3-6节的杂环，该杂环可以是饱和的或完全或部分不饱和的且该杂环可以任意被一个或多个C1-C4的烷基或卤原子任意地取代；或R1是通式SR14的基团，其中R14是C1-C8的烷基、C2-C8的链烯基、C2-C8的炔基、C3-C8的环烷基、C5-C8的环链烯基、苯基或其中取代基是C1-C4的烷基、C1-C4的烷氧基或卤素的取代的苯基、或含有氧或硫的3-6节杂环，该杂环可以是饱和的、或完全或部分不饱和的且该杂环可以任意被一个或多个C1-C4的烷基或卤原子所取代。
R2是H或OH；R3-R5每个均独立地为H、CH3、或CH2CH3；R6是H或OH；且R7是H、CH3、或CH2CH3；R8是H或德糖胺；R9是H、CH3、或CH2CH3；R10是OH、碳霉糖(R13是H)、或克拉定糖(R13是CH3)，R11是H；或R10＝R11＝O；且R12是H、CH3、或CH2CH3，条件是当R3-R5是CH3、R7是CH3、R9是CH3、且R12是CH3时，那么R1不是H或C1烷基。
在上述定义中，含有3个或多个碳原子的烷基可以是直链或支链。卤素指的是氟、氯、溴或碘。
通式2的优选化合物是这样一些化合物，其中R3-R5是CH3、R7是CH3、R9是CH3、且R12是CH3，且R1是SR14，其中R14是甲基或乙基。在另一组优选的化合物中，R1是甲基、异丙基、或仲丁基，它们可以被一个或多个羟基取代。在另一组优选的化合物中，R1是被一个或多个羟基或一个或多个卤原子取代的支链的C3-C8的烷基，特别是1-(三氟甲基)乙基。
本发明还涉及一种用于治疗哺乳类动物、鱼、或鸟中细菌感染或原生动物感染的药物组合物，该药物组合物包括一种治疗有效量的通式1或通式2的化合物或一种其药物上可接受的盐以及一种药物上可接受的载体。
本发明还涉及一种用于治疗哺乳类动物、鱼、或鸟中细菌感染或原生动物感染的方法，该方法包括对所述的哺乳类动物、鱼、或鸟给予一种治疗有效量的通式1或通式2的化合物或一种其药物上可接受的盐。
除非另有说明，本文所用的术语“治疗”包括治疗或预防本发明方法中所述的细菌感染或原生动物感染。
除非另有说明，本文所用的术语“细菌感染”和“原生动物感染”包括发生在哺乳类动物、鱼和鸟体内的细菌感染和原生动物感染以及与细菌感染和原生动物感染相关的病症，所述的细菌感染和原生动物感染可以通过给予诸如本发明化合物这样的抗菌素来治疗或预防。这类细菌感染和原生动物感染、以及与这类感染相关的病症包括下列疾病：与由肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、粘膜炎莫拉氏菌、金黄色葡萄球菌或消化链球菌属种类引起的感染相关的肺炎、中耳炎、窦炎(sinusitus)、支气管炎、扁桃体炎、和乳突炎；与由化脓链球菌、C族和G族链球菌、Clostridium diptheriae或溶血放线杆菌(Actinobacillus haemolyticum)引起的感染相关的咽炎、风湿性发热和肾小球肾炎；与由肺炎枝原体、嗜肺性军团杆菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌或肺炎衣原体引起的感染相关的呼吸道感染；与由金黄色葡萄球菌、凝固酶阳性葡萄球菌(即表皮葡萄球菌、溶血性葡萄球菌(S.hemolyticus)等)、化脓链球菌、无乳链球菌、C-F族链球菌(微小菌落的链球菌)、草绿色链球菌、微小棒状杆菌、梭状芽孢杆菌属的种类或汉氏巴尔通氏体引起的感染相关的无并发症的皮肤和软组织感染、脓肿和骨髓炎、以及产后期发热；与由腐生葡萄球菌或肠球菌属种类引起的感染相关的无并发症的急性尿道感染；与由沙眼衣原体、杜克氏嗜血杆菌、苍白密螺旋体、解脲脲原体或淋病奈瑟氏球菌(Neiserria gonorrheae)引起的感染相关的尿道炎和宫颈炎、以及性传播疾病；与由金黄色葡萄球菌(食物中毒和中毒性休克综合征)或A、B和C族链球菌引起的感染相关的中毒性疾病；与由幽门螺旋菌引起的感染相关的溃疡；与由欧洲回归热疏螺旋体引起的感染相关的系统性发热性综合征；与由布氏疏螺旋体引起的感染相关的莱姆病；与由沙眼衣原体、淋病奈瑟氏球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓链球菌、流感嗜血杆菌或利斯特氏菌属种类引起的感染相关的结膜炎、角膜炎和泪囊炎(dacrocystitis)；与由鸟分枝杆菌或胞内分枝杆菌引起的感染相关的弥散性鸟分枝杆菌综合征(MAC)疾病；与由空肠弯曲杆菌引起的感染相关的胃肠炎；与由隐孢子虫属种类引起的感染相关的肠原虫；与由草绿色链球菌引起的感染相关的牙源性疾病；与由百日咳博德特氏杆菌引起的感染相关的持续性咳嗽；与由产气荚膜梭状芽孢杆菌或类杆菌属种类引起的感染相关的气性坏疽；以及与由幽门螺旋菌或肺炎衣原体引起的感染相关的动脉粥样硬化。可以在哺乳类动物体内治疗或预防的细菌感染和原生动物感染以及与这类感染相关的病症包括下列疾病：与由P.haem.、P.multocida、牛枝原体或博德特氏杆菌种类引起的感染相关的牛呼吸性疾病；与由大肠杆菌或原生动物(即球虫属、隐孢子虫属等)引起的感染相关的母牛肠道疾病；与由金黄色葡萄球菌、乳房链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、克雷白氏杆菌属种类、棒状杆菌属或肠球菌属种类引起的感染相关的奶牛乳腺炎；与由大叶性肺炎放线杆菌(A.pleuro.)、P.multocida或枝原体属引起的感染相关的猪呼吸性疾病；与由大肠杆菌、Lawsonia intracellularis、沙门菌属或猪痢疾小蛇菌(Serpulina hyodyisinteriae)引起的感染相关的猪肠道疾病；与由梭杆菌属的种类引起的感染相关的母牛根腐病；与由坏死梭杆菌或节瘤拟杆菌引起的感染相关的母牛多毛刺疣；与由牛莫拉氏菌引起的感染相关的母牛红眼；与由原生动物(即neosporium)引起的感染相关的母牛流产；与由大肠杆菌引起的感染相关的狗和猫体内的尿道感染；与由表皮葡萄球菌、中间葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌属或P.multocida起的感染相关的狗和猫中的皮肤软组织感染；以及与由产碱杆菌属的种类、类杆菌属的种类、梭状芽孢杆菌属的种类、肠杆菌属、消化链球菌属、卟啉单胞菌属或普雷沃氏菌属引起的感染相关的狗和猫中体内的牙齿或口腔感染。可以根据本发明方法治疗或预防的其它精细管或如原生动物感染以及与这类感染相关的病症参照J.P.Sanford等在“抗微生物疗法的Sanford指南”第26版中所述(抗微生物治疗有限公司，1996)。本发明化合物在治疗通常与细菌或原生动物感染无关的疾病情况(例如癌症、AIDS和动脉粥样硬化)中具有不可忽视的实用性这一事实已经变得日益明显。
当用于治疗哺乳类动物(诸如人)或鱼或鸟体内的细菌感染或与细菌感染相关的病症或癌症时，可以单独或以含有化合物和药物上可接受稀释剂或载体的药物组合物的形式给予通式1或通式2的化合物。可以将这类组合物、例如作为片剂或胶囊的形式进行口服给药，或可以将这类组合物进行非肠道、包括皮下和肌内注射给药。还可以将通式1或通式2的化合物进行直肠给药，诸如通过施用栓剂。药物上可接受的载体将取决于所要求的给药方式。例如，可以将乳糖、柠檬酸钠、和磷酸的盐、以及崩解剂(诸如淀粉)和润滑剂(诸如硬脂酸镁、月桂硫酸钠和滑石)用作片剂中药物上可接受的载体。此外，对于胶囊的应用来说，有用的药物上可接受的载体是乳糖和高分子量的聚乙二醇(例如具有的分子量为2,000-4,000)。对于非肠道应用来说，可以制备灭菌溶液或悬浮液，其中药物上可接受的载体是水(例如水、等渗盐水或等渗右旋糖)或非水(例如来源于植物的脂肪油，诸如棉子或花生油，多元醇，诸如丙三醇或丙二醇)。
当通过口服或非肠道给药而用于体内治疗哺乳动物实验对象中的细菌感染或与细菌感染相关的疾病、或用于治疗人体内的各种癌症(特别是非小型细胞肺癌)和其它诸如狗这样的哺乳类动物时，通常的每日剂量在0.1-100mg/kg体重的范围，尤其是0.25-25mg/kg体重，以单一剂量或分剂量给予。
除非另有说明，本文所用的短语“药物上可接受的盐”包括可存在于本发明化合物中的酸式或碱式基团的盐。性质上是碱性的本发明化合物能够形成带有各种无机和有机酸的各种盐。可用于制备这类碱性化合物的药物上可接受的酸加成的盐的酸是那些形成无毒性酸加成的盐的物质，即盐含有药物上可接受的阴离子，诸如氢氯化物、氢溴化物、氢碘化物、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乙酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖二酸盐、糖二酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐[即1，1’-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸)]盐。
性质上是酸的这些本发明的化合物能够形成带有各种药物上可接受阳离子的碱式盐。这类盐的实例包括碱金属或碱土金属盐且特别是本发明化合物的钙、镁、钠和钾的盐。
本发明的某些化合物可以具有不对称中心并由此以不同的对映和非对映形存在。本发明涉及本发明化合物的旋光异构体和立体异构体、及其混合物的用途，且本发明涉及所有可使用或包括它们的药物组合物和治疗方法。
本发明包括本发明的化合物和它们的药物上可接受的盐，其中一个或多个氢、碳或其它原子被其同位素替代。可以将这类化合物用作药代动力学研究中和结合检测试验中的研究和诊断工具。
通过发酵能够产生红霉素的未转化的或转化的有机体来生产本发明的化合物，所述的有机体包括、但不限于糖多孢菌属种类、灰平链霉菌、诺卡氏菌属种类、小单孢属种类、节杆菌属种类和抗生链霉素、而不包括天蓝色链霉菌。在这方面特别合适的是未转化的和转化的红色糖多孢菌菌株，例如NRRL2338、18643、21484。在特别优选的转化菌株中，已经用来自除虫菌素产生者(除虫链霉菌)、或雷怕霉素产生者(吸水链霉菌)的装配组件置换了红霉素装配组件。本发明生产化合物的优选方法是在有合适的通式R1COOH的羧酸、或其盐、酯(特别优选的是N-酰基半胱胺硫酯)、或酰胺或其氧化前体存在的情况下、通过发酵合适的有机体来进行，其中R1如上述通式1或2中所定义。在接种的同时或在发酵过程中间断地向发酵物中添加酸或其衍生物。本发明化合物的生产可以通过下列步骤来监测：从发酵物中取出样品、用有机溶剂提取且接下来通过色谱法来显现本发明的化合物，例如使用高压液相色谱法。持续温育，直到通式1或2化合物的产量达到最大限度为止，一般需要4-10天的期限。每次添加的羧酸及其衍生物的优选浓度为0.05-4.0/L。通过逐步向发酵物中添加酸或衍生物、例如通过在几天的期限内每日进行添加而一般可产生最佳产量的来自通式1或2的化合物。用于发酵的培养基可以是一种常规的复合培养基，该培养基含有可同化的碳、氮和微量元素源。
在实施例中将更完整地描述使未转化和遗传工程的产生红霉素的细胞生长的的合适和优选方式以及用于通式1或2化合物的分离、鉴定和实际应用的合适和优选方式。
附图的简要描述
现在参照附图来描述本发明的某些实施方案，其中：
附图1给出了三种公知聚酮化合物的化学通式；
附图2a表示6-脱氧红诺霉素合酶B(DEBS)、产生6-脱氧红诺霉素B(6-DEB)的PKS、红霉素A的前体起作用的示意图；
附图2b表示PKS后红霉素生物合成、包括6-DEB转化成红霉素A的情况；
附图3a和3b是表示构建质粒pIG1的示意图；
附图4a、4b和4c是表示构建质粒pND30的示意图；
附图5是表示构建质粒pAVLD的示意图；
附图6表示pAVLD整合入红色糖多孢菌NRRL2338基因组的情况；
附图7是表示雷怕霉素生物合成的示意图；
附图8是表示构建质粒pMO6的示意图；
附图9是表示构建质粒pCJR26的示意图；
附图10是表示构建质粒pC-ATX的示意图；
附图11是表示构建质粒pC-AT12的示意图；
附图12是表示构建质粒pC-ATJR49的示意图。
本发明的详细描述
由avr装配组件接受的宽范围的起子单位已经在预先的研究中得到了全面的确认(例如欧洲专利申请0 214 731、0 350 187、0 317148，将这些文献的全部内容引入本文作为参考)。因此，应理解本发明不限于这些实施例的特定描述且它们仅是用作证明avr装配组件的有效性。此外，使用pIG1或pND30构建体的实施例清楚地证实了当与avr装配组件连接时、actI启动子及其关联激活物基因ActII-orf4促进本发明新型化合物表达的可能性。从这些实施例中还可明显地看出红色糖多孢菌的未转化菌株也能够轻易地吸收外源供给的底物以生成新型红霉素聚酮化合物。因此，通过下列步骤可以方便地生产本发明的特殊新型化合物：选择合适的产生红霉素的菌株(任意将pIG1或pND30质粒引入所需的菌株)并用合适的起子单位补充发酵物，这些内容对于本领域技术人员来说也是显而易见的。所以，正如U.S.5,141,926和WO 97/06266中所述，使用红色糖多孢菌NRRL 18643或NRRL 21484可以方便地生产本发明的6-脱氧红霉素和6，12-双脱氧红霉素衍生物。类似地，还可以将由Weber等在《细菌学杂志》164：425-433，1991中所述的红色糖多孢菌菌株的用途用于获得本发明所需的新型类似物。例如，可以将菌株UW24用于(由pIG1或pND30任意转化)获得红诺霉素B的新型类似物。
使用一种Hewlett-Parkard 1090M二极管阵列分光光度计来记录UV光谱。除非另有说明，使用Varian Unity 500MHz分光计在CDCl3中测定所有的NMR光谱，并且从四甲基硅的低磁场中以份/百万(ppm)来表示峰的位置。将峰形表示如下：s，单峰；d，双峰；t，三重峰；q，四重峰；m，多重峰；br，宽峰。在NMR结构中显示的原子数不代表标准命名法的特征、而使NMR数据与特殊实施例联系起来。使用下列仪器获得HPLC-MS数据：与安装APCI源的VG Platform II质谱仪连用的Hewlett-Parkard 1090M液相色谱仪(方法A)或与安装APCI源的VG Platform II质谱仪连用的Hewlett-Parkard 1050液相色谱仪(方法B和方法C)。
HPLC方法A：
柱        Beckman Ultrasphere 5μm ODS 4mm×25cm
流速      0.85ml/分
流动相    梯度：在22分钟内乙腈∶0.05M乙酸铵
                (28∶72)至乙腈∶0.05M乙酸铵
                (50∶50)，维持乙腈∶0.05M乙酸铵
                (50∶50)22-25分钟；恢复到
                起始条件25-30分钟。
HPLC方法B：
柱        MetaChem Inertsil 5μm C8 3mm×150mm
流速      0.5ml/分
流动相    等度洗脱(isocrotic)：甲醇∶含有0.1％三氟乙酸的
                      0.05M乙酸铵(60∶40)。
HPLC方法C：
柱        Waters Symmerey 5μm C18 2.1mm×25mm
流速      0.22ml/分
流动相    梯度：在30分钟内乙腈∶0.05M乙酸铵
                (30∶70)至乙腈∶0.05M乙酸铵
                (50∶50)。由下列培养基和溶液构成的用途：蔗糖-琥珀酸盐确定成分培养基蔗糖                       69gKNO3                      10g琥珀酸                     2.36gKH2PO4                   2.7gMgSO4.7H2O               1.2gZnCl2                     10mgMnCl2.4H2O               6.2gCuCl2.2H2O               0.53mgCoCl2                     0.55mgFeSO4.7H2O               2.5mgCaCl2.2H2O               38mgmilli-Q水                  至1.0LKOH                        至pH6-6.4自来水培养基葡萄糖                     5g胰化蛋白胨                 5g酵母提取物                 2.5gEDTA                       36mg自来水                     至1.0LKOH                        至pH7.1ERY-P培养基右旋糖                     50g/LNutrisoyTM粉              30g/L(NH4)2SO4               3g/LNaCl                       5g/LCaCO3                     6g/L调整pH至7.0
NutrisoyTM粉购自British Arkady Group，Skerton Road，Manchester，UK。
通过下面的实施例来解释本发明。
实施例1a-质粒pIG1的构建
质粒pIG1由含有杂交I型PKS基因的SCP2*-衍生的质粒组成，其中的杂交I型PKS基因包括置换了ery装配组件的avr装配组件、ery PKS的起始端的两种延伸组件和ery PKS的硫酯。通过如下几种中间体质粒来进行这种构建(附图3)。
(i)质粒pVE3.4的构建
从大肠杆菌菌株ATCC 68250中获得含有部分除虫菌素(avr)PKS基因的质粒pVE1446(MacNeil，D.J.等《纽约科学院年鉴》(1994)721：123-132)。用BamH1来消化质粒pVE1446并通过凝胶电泳将坐标32.15与3.40间的7.6kbp片段(MacNeil，D.J.等《纽约科学院年鉴》(1994)721：123-132)纯化并重新环化。该混合物含有在大肠杆菌菌株TG1recO(由剑桥大学遗传系的P.Oliver博士构建；Kolodner.R.等《细菌学杂志》(1985)163：1060-1066；T.Gibson，《剑桥大学博士论文》，1985)转化后分离的所需质粒pVE3.4。
(ii)质粒pNCO12的构建
用Ncol消化质粒pBK25(Bevitt，D.J.等《欧洲生物化学杂志》(1992)204：39-49)并将12kbp片段进行终端修复且连入已经用Smal线性化的质粒pUC18中。将连接混合物转化入大肠杆菌TG1 recO中并对各个菌落检验它们的质粒含量。所需的质粒pNCO12通过其限制模式来鉴定。
(iii)质粒pCRabc的构建
如下构建质粒pCRabc(附图3)。进行三个独立的PCR反应：第一个，将20pmol合成的寡核苷酸A1(5’-CTCGTCGGTGGCTTTGCG-3’)和A2(5’-CCCGGGAAAAACGAAGACTAGTGGCGCGGACGGCCG-3’)的每种用于扩增来自100ng pNCO12模板的1.0kbp产物。将PCR产物进行终端修复、磷酸化并克隆入Smal切割的pUC18中以获得质粒pCRa。第二个，将20pmol合成的寡核苷酸C1(5’-CACGCGCAGCGCGGCGGA-3’)和C2(5’-CGAACCGCTAGCGGTCGTCGCGATGGCCT-3’)的每种用于扩增来自100ng pNCO12模板的1.5kbp产物。将产物进行终端修复、磷酸化并克隆入Smal切割的pUC18中以获得质粒pCRc。第三个，将20pmol合成的寡核苷酸B1(5’-GTGGCCCGGCCGTCCGCGCCACTAGTCTTCGTTTTT-3’)和B2(5’-AACAGCTAGCGGTTCGTCCGCCGCTGCCGTGCC-3’)的每种用于扩增来自100ng pVE3.4模板的1.4kbp产物。将产物进行终端修复、磷酸化并克隆入Smal切割的pUC18中以获得质粒pCRb。
用HindIII和SpeI来消化质粒pCRa并将1.0kbp插入片段与预先用HindIII和SpeI消化的质粒pCRb连接，从而获得质粒pCRab。用NheI和EcoR1来消化质粒pCRc并将1.5kbp插入片段与预先用NheI和EcoR1消化的质粒pCRab连接，从而获得质粒pCRabc。
(iv)质粒pNEWAVETE的构建
用MfeI和SfiI来消化质粒pCRabc、并通过凝胶电泳纯化含有avr PKS的装配结构域的DNA片段，将该片段与已经用MfeI和SfiI消化的质粒pNTEP2连接并通过凝胶电泳纯化较大的片段。将连接混合物转化入大肠杆菌TG1 recO中并对各个菌落检验它们的质粒含量。所需的质粒pNEWAVETE(13.7kbp)通过其限制模式来鉴定。
(v)质粒pRM52的构建
质粒pRM52是一种质粒pRM5的衍生物(McDaniel，R.等《科学》(1993)262：1546-1550)。首先通过用NdeI消化来使pRM5线性化、将它进行终端修复、且然后重新连接以产生pRM51。用Pacl和Nsil切割pRM51，分离较大的Pacl-Nsil片段并将它与一种含有NdeI位点的短双链寡核苷酸接头连接并由一起退火的合成的寡核苷酸5’-TAAGGAGGACACATATGCA-3’和5’-TAATTCCTCCTGTGTAT-3’构建。将连接混合物转化入大肠杆菌TG1 recO中并将所分离的菌落用于其质粒含量的筛选。所需的质粒(19.6kbp)通过其限制图来鉴定并命名为pRM52。
(vi)质粒pIG1的构建
用NdeI和XbaI来消化质粒pNEWAVETE并通过蔗糖梯度沉降法来纯化插入片段。将纯化的插入片段连入已经用NdeI和XbaI消化的质粒pRM52(19.6kbp)中，且通过蔗糖梯度沉降法来纯化载体。将连接混合物用于转化大肠杆菌并对各个菌落检验它们的质粒含量。所需的质粒pIG1通过其限制模式来鉴定。
实施例1b-质粒pND30的构建
质粒pND30由含有杂交I型PKS基因的SCP2*-衍生的质粒组成，其中的杂交I型PKS基因包括置换了ery装配组件的avr装配组件、ery PKS的起始端的两种延伸组件和ery PKS的硫酯。如下通过几种中间体质粒来进行这种构建(附图4)。
(i)重组载体pCJR101的构建
pCJR101(附图4)是构建用于在放线菌中表达PKS基因的一种穿梭质粒。它包括ColE1复制子以使它在大肠杆菌内复制一种SCP2*低拷贝数的链霉菌属复制子(Bibb，M.J.和Hopwood，D.A.《遗传微生物学杂志》(1981)126：427)和来自act族的ActII-orf4激活物基因，所述来自act族的ActII-orf4激活物基因可激活营养菌丝体内从生长期到稳定期的转换期间从act启动子的转录。如下进行构建：使用作为引物的合成的寡核苷酸：5’-ACT AGT CCA CTG CCTCTC GGT AAA ATC CAG C-3’和5’-CTT AAG AGG GGC TCC ACC GCG TTCACG GAC-3’，通过PCR来扩增来自pMF1015的约970kbp的DNA片段(含有ActII-orf4激活物基因)(Fernandez-Moreno，M.A.等《细胞》(1991)66：769-780)，这样还可引入侧翼SpeI和AflII限制位点。将这种片段克隆入质粒pUC19的终端修复的AatII位点以产生质粒pCJR18。使用作为引物的合成的寡核苷酸：5’-ACA TTC TCT ACGCCT AAG TGT TCC CCT CCC TGC CTC-3’和5’-GTG ATG TAT GCT CAT ATGTGT CCT CCT TAA TTA ATC GAT GCG TTC GTC CGG TG-3’，从含有双向启动子对PActIIl/PActII的pMV400扩增约215bp的DNA片段(Parro，V.等《核酸研究》(1991)19：2623-2627)，这样还可引入侧翼NdeI和AflII位点。用NdeI和AflII来消化PCR产物并与预先用NdeI和AflII切割的质粒pCJR18连接，从而生成质粒pCJR19。使用作为引物的寡核苷酸5’-TGA ACA CCA AGC TTG CCA GAG AGC GACGAC TTC CCC-3’和5’-GAC AGA TTG CAT GCC CTT CGA GGA GTG CCC GCCCGG-3’，通过来自作为模板的质粒pIJ922(Lydiate，D.J.等《基因》(1985)35：223-235)的PCR来获得含有tsr基因(使硫链丝菌肽产生耐受性)的一种1.1kbp HindIII SphI片段，这样可引入侧翼HindIII和SphI位点。用HindIII和SphI来消化PCR产物并将它与用HindIII和SphI切割的质粒pCJR19连接以获得质粒pCJR24。用BamH1和Sstl来消化质粒plJ922并将含有部分致育基因座和复制起点的片段(Lydiate，D.J.等《基因》(1985)35：223-235)连入用BamHl和Sstl消化的pCJR19以生成双功能质粒pCJR16(14.7kbp)。用Sall和SphI来消化质粒pCJR24，通过凝胶电泳来纯化来自该消化物的两种较大的片段，并将它们结合成带有已经用XhoI和SphI消化的质粒pCJR16的四成分连接物。将连接混合物用于转化变青链霉菌并在硫链丝菌肽存在的情况下选择菌落。所显示的一种这样的菌落含有所需的质粒pCJR101(约12.4kbp)，通过其限制模式来鉴定。
(ii)质粒pCJR29的构建
附图4中例举了质粒pCJR29的构建。使用作为引物的寡核苷酸5’-TGA ACA CCA AGC TTG CCA GAG AGC GAC GAC TTC CCC-3’和5’-GAC AGA TTC TCG AGC CTT CGA GGA GTG CCC GCC CGG-3’，通过来自作为模板的质粒plJ922的PCR来获得含有tsr基因(使硫链丝菌肽产生耐受性)的一种1.1kbpHindIII-XhoI片段，这样还可引入侧翼HindIII和XhoI位点。用HindIII和XhoI来消化PCR产物并将它与已经用HindIII和XhoI消化的质粒pCJR16连接，从而生成质粒pCJR25。用HindIII和SphI来消化质粒pCJR25并将它与已经用HindIII和SphI消化的质粒pCJR19连接，从而产生所需的质粒pCJR29(约12.4kbp)，通过其限制模式来鉴定。就SCP2*-衍生的复制起点而言，在tsr基因、ActII-off4基因和actI/ActIIl启动子的取向上质粒pCJR29与质粒pCJR101不同。
(iii)质粒pN30的构建
用NdeI和XbaI来消化质粒pNEWAVETE并通过蔗糖梯度沉降法来纯化插入片段。将纯化的插入片段连入已经用NdeI和XbaI消化的质粒pCJR29(约12.4kbp)中，且通过蔗糖梯度沉降法来纯化载体。将连接混合物用于转化大肠杆菌并对各个菌落检验它们的质粒含量。所需的质粒pND30通过其限制模式来鉴定。
实施例1c-质粒pCJR26的构建
首先分几步来构建质粒pMO6(附图8)：
(i)质粒pMO1的构建
使用作为引物的合成的寡核苷酸：5’-CAT GCT CGA GCT CTC CTGGGA AGT-3’和5’-CAA CCC TGG CCA GGG AAG ACG G-3’，并采用质粒pNTEP2作为模板，通过PCR来扩增可伸展eryAI的核苷酸1948至核苷酸3273的红色糖多孢菌的eryAI的约1.3kbp DNA片段(Donado，S.等《科学》(1991)252，675-679)。将PCR产物进行终端修复并与质粒pUC18连接，通过用Smal消化而将它线性化且然后用碱性磷酸酶处理。将连接混合物用于转化大肠杆菌TG1 recO并对各个菌落检验它们的质粒含量。所需的质粒pMO1(3.9kbp)通过其限制模式来鉴定，在质粒pMO1中邻接插入片段的StuI与多接头中的HindIII位点邻接。
(ii)质粒pMO2的构建
使用下列寡核苷酸作为引物：5’-TTC CCT GGC CAG GGG TCG CAGCGT G-3’和5’-CAC CTA GGA CCG CGG ACC ACT CGA C-3’，并采用来自重组噬菌体λ-1E(Schwecke，T.等《美国国家科学院学报》(1995)92：7839-7843)作为模板，通过PCR来扩增可伸展rapA的核苷酸1643至核苷酸2486的吸水链霉菌的rapA基因的约0.85kbp DNA区段。将PCR产物进行终端修复并与已经通过用Smal消化而线性化且然后用碱性磷酸酶处理的质粒pUC18进行连接。将连接混合物用于转化大肠杆菌并对各个菌落检验其质粒含量。所需的质粒pMO2(3.5kbp)通过其限制模式来鉴定。
(iii)质粒pMO3的构建
使用合成的寡核苷酸作为引物：5’-TGG CCA GGG AGT CGG TGC ACCTAG GCA-3’和5’-GCC GAC AGC GAG TCG ACG CCG AGT T-3’，并采用质粒pNTEP2作为模板，通过PCR来扩增可伸展eryAI的核苷酸4128至核苷酸5928的红色糖多孢菌的eryAI基因的约1.7kbp DNA区段。将PCR产物进行终端修复并与已经通过用Smal消化而线性化且然后用碱性磷酸酶处理的质粒pUC18进行连接。将连接混合物用于转化大肠杆菌TG1 recO并对各个菌落检验其质粒含量。所需的质粒pMO3(4.4kbp)通过其限制模式来鉴定，在质粒pMO3中BalI和AvrII位点与多接头的HindIII位点邻接。
(iv)质粒pMO4的构建
用HindIII和BalI来消化质粒pMO1并将1.3kbp插入片段与已经用HindIII和BalI消化的质粒pMO3连接。将连接混合物用于转化大肠杆菌TG1 recO并对各个菌落检验其质粒含量。所需的质粒pMO4(5.6kbp)通过其限制模式来鉴定。
(v)质粒pMO5的构建
用StuI来消化质粒pMO4并将3.0kbp插入片段与已经用StuI消化且通过凝胶电泳纯化的质粒pNTEP2连接以除去3.8kbp插入片段。将连接混合物用于转化大肠杆菌TG1 recO并对各个菌落检验其质粒含量。所需的质粒pMO5(12.8kbp)通过其限制模式来鉴定。
(vi)质粒pMO6的构建
用BalI和AvrII来消化质粒pMO2并将插入片段与已经用BalI和AvrII消化的质粒pMO5连接。将连接混合物用于转化大肠杆菌TG1recO并对各个菌落检验其质粒含量。所需的质粒pMO6(13.5kbp)通过其限制模式来鉴定。
(vii)质粒pCJR26的构建
质粒pCJR26是一种以SCP2*为主的质粒，该质粒含有包括ery装配组件、ery PKS的第一和第二延伸组件以及终止ery链的硫酯酶的PKS基因，不包括已经被编码rap PKS组件2的丙二酰基-CoA：ACP酰基转移酶的DNA所特别取代的编码第一延伸组件内的甲基丙二酰基-CoA：ACP的DNA区段。如下进行构建(附图9)：用NdeI和XbaI来消化质粒pMO6并将插入片段与已经用NdeI和XbaI消化且通过凝胶电泳纯化的质粒pCJR24连接。将连接混合物用于转化大肠杆菌TG1recO并对各个菌落检验其质粒含量。所需的质粒pCJR26通过其限制模式来鉴定。
实施例1d-红色糖多孢菌JC2/pCJR26的构建和TKL衍生物的生产
将质粒pCJR26用于转化红色糖多孢菌JC2原生质体。在含有10μg/ml硫链丝菌肽的R2T20培养基上选择硫链丝菌肽耐受性菌落。通过克隆的基因组DNA与DIG标记的DEBS1-TE基因的Southern印迹杂交法来对这几种克隆检测整合入染色体的pCJR26的存在。
使含有整合型拷贝的pCJR26的克隆生长在含有5μg/ml硫链菌丝肽的SSM培养基中并使它在28-30℃下生长7天。此后，过滤肉汤以除去菌丝体并将pH调整至pH为3。用两个体积的乙酸乙酯将该肉汤提取两次并将合并的乙酸乙酯提取物用等体积的饱和氯化钠洗涤、在无水硫酸钠上干燥并减压条件下除去乙酸乙酯，从而生成约500mg粗制品。证明产物为(2S，3R，5R)-2-甲基-3，5-二羟基-正己酸δ-内酯和(2S，3R，5R)-2-甲基-3，5-二羟基-正庚酸δ-内酯：
Figure A9719764900301
实施例1e-红色糖多孢菌NRRL 2338/pCJR26的构建及其在14节大环内酯生产中的用途
将约5mg pCJR49 DNA用于转化红色糖多孢菌NRRL 2338原生质体以生成一种菌株，其中将质粒整合入染色体。从几种克隆中获得总DNA并通过Southern杂交法分析，从而证实已在EryAI的组件2中整合了质粒而得到了一种新型大环内酯生物合成途径。已经进行了进一步的整合而得到了重复质粒序列。将红色糖多孢菌NRRL2338/pCJR49接种入含有5mg/ml硫链丝菌肽的胰蛋白酶大豆肉汤中并在30℃下培养3天。将100ml种子培养物用于在5×2L烧瓶中接种2L含有5mg/ml硫链丝菌肽的蔗糖琥珀酸盐确定成分培养基，所述烧瓶中各自含有500ml培养基和2个帮助分散的簧板片，以300rpm振摇该烧瓶。在进一步生长5天后，离心培养物并将上清液的pH调整酯pH为9。然后用等体积的乙酸乙酯将该上清液提取三次并通过蒸发除去溶剂。通过HPLC/MS分析产物且将两种大环内酯鉴定为红霉素类似物：
Figure A9719764900302
实施例1f-质粒pC-ATX的构建
质粒pC-ATX是一种基于SCP2*的质粒，该质粒包括含有ery装配组件、ery PKS的第一和第二延伸组件以及终止ery链的硫酯酶的PKS基因，除了编码第一延伸组件内的甲基丙二酰基-CoA：ACP的DNA区段已经被编码来自推定I型PKS基因族的丙二酰基-CoA：ACP酰基转移酶的DNA所特别取代，其中所述的推定I型PKS基因族克隆自肉桂地链霉菌ATCC 145113(聚醚聚酮化合物莫能菌素的产生者)。如下通过几种中间体质粒来进行构建(附图10)。
(i)粘粒pSCIN02的分离
由大小分级的35-45kbp染色体DNA的Sau3A片段构建肉桂地链霉菌ATCC 14513(莫能菌素的产生者)的基因组文库，所述的染色体DNA与BamHl线性化的且经碱性磷酸酶处理的粘粒载体pWE15连接。使用Gigapack包装提取物将连接混合物装入λ-颗粒并转染入大肠杆菌NM1blue。使文库的约600个菌落生长在尼龙膜表面上、使它们裂解并通过UV照射将其DNA与膜交联。随后将该膜用于筛选程序。在33PαATP存在的情况下、通过随机引发来标记含有来自DEBS组件2的酮合酶结构域的pMO8插入片段并将它用作一种用于DNA杂交的探针。在68℃下、4.0×SSC缓冲液中将该探针杂交16小时且随后在68℃下、0.8×SSC缓冲液中将其洗去。分离三种阳性克隆。将所有三种克隆的DNA插入片段从存在于载体pWE15中的T3和T7引物位点(priming site)进行末端测序.使用克隆2(称作pSCIN02)作为模板，在来自T7引导位点的DNA序列中发现了与I型酮合酶和丙二酰基CoA：ACP酰基转移酶结构域同源的区域。丙二酰基CoA：ACP酰基转移酶结构域(称作ATX)的部分DNA排序在该结构域的推定底物识别部分中显示出一种非常规的序列基元，所述的结构域基本上与上述丙二酸酯或丙二酸甲酯特异性CoA：ACP酰基转移酶不同(Haydock，S.F.等FEBS(1995)374：246-248)。
(ii)质粒pMO38的构建
使用下列寡核苷酸作为引物：5’-CTG GCC AGG GCG CGC AAT GGCCGA GCA T-3’和5’-CCC TAG GAG TCG CCG GCA GTC CAG CGC GGC GCCC-3’，使用来自粘粒pSCIN02的DNA作为模板，通过PCR来扩增ATX结构域的约0.9kbp的DNA区段。将PCR产物进行终端修复并与已经通过用Smal消化而线性化且然后用碱性磷酸酶处理的的质粒pUC18连接。将连接混合物用于转化大肠杆菌TG1 recO并对各个菌落检验其质粒含量。所需的质粒pCJR38(3.5kbp)通过其限制模式来鉴定。
(iii)质粒pMO34的构建
质粒pMO34是一种带有多克隆位点的pMO6的衍生物，所述的多克隆位点在插入的D1-AT2基因的终止密码子之后插入。用EcoR1和HindIII来消化质粒pMO6并与形成多克隆位点双链区的两种寡核苷酸退火：5’-AAT TCA TAA CTA GTA GGA GGT CTG GCC ATC TAG A-3’和5’-TCG AAG ATC TAC CGG TCT GGA GGA TGA TCA ATA C-3’。连接该混合物并转化入大肠杆菌Tg1 recO。对各个菌落检验其质粒含量。所需的质粒pCJR34(13.5kbp)通过其限制模式来鉴定。
(iv)质粒pMO35的构建
质粒pMO35是一种pMO34的衍生物，pMO34含有TKLS-AT2基因和一种来自丘链霉菌的平移偶联的巴豆酰基-CoA-还原酶基因(Wallace等《欧洲生物化学杂志》(1995)233：954-962)。从质粒pZYB3(K.Reynolds教授的命名物)切下巴豆酰基-CoA-还原酶基因作为NdeI-Bamlll片段，将该片段用绿豆核酸酶处理以产生平端物并使用绿豆核酸酶将它与预先用SpeI切割且同样是平头的pMO34连接。将连接混合物用于转化大肠杆菌TG1 recO并对各个菌落检验其质粒含量。所需具有巴豆酰基-CoA-酮还原酶基因的正确取向的质粒pMO35(14.2kbp)通过其限制模式来鉴定。
(v)质粒pMO36的构建
用BalI和AvrII来消化质粒pMO38并将插入片段与已经用BalI和AvrII消化的质粒pMO35连接。将连接混合物用于转化大肠杆菌TG1 recO并对各个菌落检验其质粒含量。所需的质粒pMO36(13.5kbp)通过其限制模式来鉴定。
(vi)质粒pMO-ATX的构建
用NdeI和XbaI来消化质粒pMO36并将插入片段与已经用NdeI和XbaI消化并通过凝胶电泳纯化的质粒pCJR29连接。将连接混合物转化入大肠杆菌TG1 recO并对各个菌落检验其质粒含量。所需的质粒pC-ATX通过其限制模式来鉴定。
实施例1g-红色糖多孢菌JC2/pC-ATX的构建和TKL衍生物的生产
将质粒pC-ATX用于转化红色糖多孢菌JC2原生质体。在含有10μg/ml硫链丝菌肽的R2T20培养基上选择硫链丝菌肽耐受性菌落。通过克隆的基因组DNA与DIG标记的编码DEBS1-TE基因的DNA的Southern印迹杂交法来对这几种克隆检测整合入染色体的pC-ATX的存在。
使含有整合型拷贝的pC-ATX的克隆生长在含有5μg/ml硫链菌丝肽的SSM培养基中并使它在28-30℃下生长7天。此后，过滤肉汤以除去菌丝体并将pH调整至pH为3。用两个体积的乙酸乙酯将该肉汤提取两次并将合并的乙酸乙酯提取物用等体积的饱和氯化钠洗涤、在无水硫酸钠上干燥并在减压条件下除去乙酸乙酯，从而生成约500mg粗制品。通过气相色谱法、质谱法和NMR来分析产物的特征且证明产物为(2S，3R，4S，5R)-2-甲基-4-乙基-3，5-二羟基-正己酸δ-内酯和(2S，3R，4S，5R)-2-甲基-4-乙基-3，5-二羟基-正庚酸δ-内酯：
Figure A9719764900331
实施例1h-红色糖多孢菌NRRL 2338/pC-ATX的构建及其在14节大环内酯生产中的用途
将约5mg pC-ATX DNA用于转化红色糖多孢菌NRRL 2338原生质体以生成一种菌株，其中将质粒整合入染色体。从几种克隆中获得总DNA并通过Southern杂交法分析，从而证实已在EryAI的组件2中整合了质粒而得到了一种新型大环内酯生物合成途径。已经进行了进一步的整合而得到了重复质粒序列。将红色糖多孢菌NRRL2338/pC-ATX接种入含有5mg/ml硫链丝菌肽的胰蛋白酶大豆肉汤中并在30℃下培养3天。将100ml种子培养物用于在5×2L烧瓶中接种2L含有5mg/ml硫链丝菌肽的蔗糖琥珀酸盐确定成分培养基，所述烧瓶中各自含有500ml培养基和2个帮助分散的簧板片，以300rpm振摇该烧瓶。在进一步生长5天后，离心培养物并将上清液的pH调整至pH为9。然后用等体积的乙酸乙酯将该上清液提取三次并通过蒸发除去溶剂。通过HPLC/MS分析产物并鉴定两种大环内酯产物：
实施例1i-质粒pC-AT12的构建
质粒pC-AT12是一种以SCP2*为基础的质粒，该质粒包括含有ery装配组件、ery PKS的第一和第二延伸组件以及终止ery链的硫酯酶的PKS基因，除了编码第二延伸组件内的甲基丙二酰基-CoA：ACP的DNA区段已经被编码rap PKS组件2的丙二酰基-CoA：ACP酰基转移酶的DNA所特别取代。如下通过几种中间体质粒来进行构建(附图11)。
(i)质粒pMO25的构建
使用作为引物的合成的寡核苷酸：5’-GGCGGGTCCGGAGGTGTTCACCGAGTT-3’和5’-ACCTTGGCCAGGGAAGACGAACACTGA-3’，并采用质粒pNTEp2作为模板，通过PCR来扩增可伸展eryAI的核苷酸6696至核苷酸7707的红色糖多孢菌的eryAI的约1.0kbp DNA区段(Donado，S.等《科学》(1991)252，675-679)。将PCR产物进行终端修复并与已经通过用Smal消化而线性化且然后用碱性磷酸酶处理质粒pUC18的连接。将连接混合物用于转化大肠杆菌TG1 recO并对各个菌落检验它们的质粒含量。所需的质粒pMO25(3.6kbp)通过其限制模式来鉴定，在质粒pMO25中邻接插入片段的StuI与多接头中的HindIII位点邻接。
(ii)质粒pMO26的构建
使用合成的寡核苷酸作为引物：5’-TCC TAG GCC GGG CCG GAC TGGTCG ACC TGC CGG GTT-3’和5’-AAA CAC CGC GAC CTG GTC CTC CGAGC-3’，并采用质粒pNTEP2作为模板，通过PCR来扩增可由eryAI的核苷酸8660延伸至核苷酸9258的红色糖多孢菌的eryAI基因的约0.6kbp DNA区段。将PCR产物进行终端修复并与已经通过用Smal消化而线性化且然后用碱性磷酸酶处理的质粒pUC18进行连接。将连接混合物用于转化大肠杆菌TG1 recO并对各个菌落检验其质粒含量。所需的质粒pMO26(3.2kbp)通过其限制模式来鉴定，在质粒pMO26中AvrII位点与多接头的HindIII位点邻接。
(iii)质粒pMO27的构建
用EcoR1和BalI来消化质粒pMO25并将1.0kbp插入片段与已经用EcoR1和BalI消化的pMO2连接。将连接混合物用于转化大肠杆菌TG1 recO并对各个菌落检验其质粒含量。所需的质粒pMO27(4.4kbp)通过其限制模式来鉴定。
(iv)质粒pMO32的构建
用AvrII和HindIII来消化质粒pMO26并将0.6kbp插入片段与已经用AvrII和HindIII消化的质粒pMO27连接。将连接混合物用于转化大肠杆菌TG1 recO并对各个菌落检验其质粒含量。所需的质粒pMO32(5.1kbp)通过其限制模式来鉴定。
(v)质粒pMO33的构建
用BSpeI和SexAl来消化质粒pMO32并将2.7kbp插入片段与已经用两种相同的酶消化的质粒pNTEP2连接，且通过凝胶电泳纯化以除去2.8kbp插入片段。将连接混合物转化入大肠杆菌TG1 recO并对各个菌落检验其质粒含量。所需的质粒pMO33(12.8kbp)通过其限制模式来鉴定。
(vi)质粒pC-AT12的构建
用NdeI和XbaI来消化质粒pMO33并将插入片段与已经用NdeI和XbaI消化且通过凝胶电泳纯化的质粒pCJR29连接。将连接混合物转化入大肠杆菌TG1 recO并对各个菌落检验其质粒含量。所需的质粒pC-AT12通过其限制模式来鉴定。
实施例1j-红色糖多孢菌JC2/pC-AT12的构建和TKL衍生物的生产
将质粒pC-AT12用于转化红色糖多孢菌JC2原生质体。在含有10μg/ml硫链丝菌肽的R2T20培养基上选择硫链丝菌肽耐受性菌落。使含有整合型拷贝的pC-AT12的克隆生长在含有5μg/ml硫链菌丝肽的SSM培养基上并使它在28-30℃下生长7天。此后，过滤肉汤以除去菌丝体并将pH调整至pH为3。用两个体积的乙酸乙酯将该肉汤提取两次并将合并的乙酸乙酯提取物用等体积的饱和氯化钠洗涤、在无水硫酸钠上干燥并在减压条件下除去乙酸乙酯，从而生成约500mg粗制品。证明产物为(3R，4S，5R)-4-甲基-3，5-二羟基-正己酸δ-内酯和(3R，4S，5R)-4-甲基-3，5-二羟基-正庚酸δ-内酯：
Figure A9719764900361
实施例1k-红色糖多孢菌NRRL 2338/pC-AT12的构建及其在14节大环内酯生产中的用途
将约5μg pC-AT12 DNA用于转化红色糖多孢菌NRRL 2338原生质体以生成一种菌株，其中将质粒整合入染色体。从几种克隆中获得总DNA并通过Southern杂交法分析，从而证实质粒已经整合了EryAI组件2的3’而得到了一种新型大环内酯生物合成途径。已经进行了进一步的整合而得到了重复质粒序列。将红色糖多孢菌NRRL2338/pC-AT12接种入含有5mg/ml硫链丝菌肽的胰蛋白酶大豆肉汤中并在30℃下培养3天。将100ml这种种子培养物用于在5×2L烧瓶中接种2L含有5μg/ml硫链丝菌肽的蔗糖琥珀酸盐确定成分培养基，所述烧瓶中各自含有500ml培养基和2个帮助分散的簧板片，以300rpm振摇该烧瓶。在进一步生长5天后，离心培养物并将上清液的pH调整至pH为9。然后用等体积的乙酸乙酯将该上清液提取三次并通过蒸发除去溶剂。通过HPLC/MS分析产物并鉴定两种大环内酯产物：
Figure A9719764900362
实施例1l-质粒pCJR49的构建
质粒pCJR49是一种以pCJR24为主的含有突变体DEBS1-TE基因的质粒，所述的DEBS1-TE基因在组件2中不含有酮还原酶，且组件2中的AT结构域已经被RAPS AT2所置换，从而在第二组件中掺入一种丙二酰基伸展物而不是甲基丙二酰基伸展物(附图12)。
用BSpeI和SexAl来消化pMO32并将含有来自RAP组件2的AT的片段克隆入已经预先用BSpeI和SexAl消化的pUC1-0中，从而产生质粒pCJR43。
用NdeI和XbaI来消化pCJR43并将含有突变体DEBS1-TE基因的片段克隆入已经预先用NdeI和XbaI消化的pUJR24，从而产生质粒pCJR49。通过限制酶图谱来证实pCJR49。
实施例1m-红色糖多孢菌JC2/pCJR49的构建和TKL衍生物的生产
将约5μg pCJR49 DNA用于转化红色糖多孢菌JC2原生质体以生成一种菌株，其中将质粒整合入染色体。从几种克隆中获得总DNA并通过Southern杂交法分析，从而证实质粒已经整合入eryTE。将红色糖多孢菌JC2/pCJR49接种入含有5mg/ml硫链丝菌肽的胰蛋白酶大豆肉汤中并在30℃下培养3天。将100ml这种种子培养物用于在5×2L烧瓶中接种2L含有5μg/ml硫链丝菌肽的蔗糖琥珀酸盐确定成分培养基，所述烧瓶中各自含有500ml培养基和2个帮助分散的簧板片，以300rpm振摇该烧瓶。在进一步生长5天后，离心培养物并将上清液的pH调整至pH为3。然后用等体积的乙酸乙酯将该上清液提取三次并通过蒸发除去溶剂。将产物溶于甲醇并通过在Finnegan-MAT GCQ系统上的GCMS进行分析。这种分析证明通过与合成的标准物比较存在两种新的内酯。这些产物是(4S，5R)-4-甲基-3-酮基-5-羟基己酸δ内酯和(4S，5R)-4-甲基-3-酮基-5-羟基庚酸δ内酯：
实施例1n-红色糖多孢菌NRRL 2338/pCJR49的构建及其在14节大环内酯生产中的用途
将约5μg pCJR49 DNA用于转化红色糖多孢菌NRRL 2338原生质体以生成一种菌株，其中将质粒整合入染色体。从几种克隆中获得总DNA并通过Southern杂交法分析，从而证实已经在EryAI组件2中整合了质粒而得到了一种新型大环内酯生物合成途径。已经进行了进一步的整合而得到了重复质粒序列。将红色糖多孢菌/pCJR49接种入含有5μg/ml硫链丝菌肽的胰蛋白酶大豆肉汤中并在30℃下培养3天。将100ml这种种子培养物用于在5×2L烧瓶中接种2L含有5μg/ml硫链丝菌肽的蔗糖琥珀酸盐确定成分培养基，所述烧瓶中各自含有500ml培养基和2个帮助分散的簧板片，以300rpm振摇该烧瓶。在进一步生长5天后，离心培养物并将上清液的pH调整至pH为9。然后用等体积的乙酸乙酯将该上清液提取三次并通过蒸发除去溶剂。通过HPLC/MS分析产物并鉴定两种大环内酯：
Figure A9719764900381
实施例2-携带杂种PKS基因的红色糖多孢菌ERMD1的构建、其中用avr装配结构域替代红色糖多孢菌NRRL2338的ery装配结构域
(i)质粒pAVLD的构建
用BamH1使质粒pCRabc(实施例1)线性化并与预先用Bglll消化的plJ702连接。该混合物含有所需的质粒pAVLD(附图5)。将连接混合物转化入大肠杆菌TG1 recO并对各个菌落检验其质粒含量。所需的质粒pAVLD通过其限制模式来鉴定(附图5)。
(ii)红色糖多孢菌ERMD1的构建
将分离自大肠杆菌TG1 recO(pAVLD)约5-10μg的pAVLD转化入红色糖多孢菌NRRL2338并分离稳定的硫链丝菌肽的耐受性菌落。选择这些菌落之一并用Pstl来消化总DNA，使用来自质粒pCRc的插入片段作为探针、通过Southern杂交法分析，所述的质粒pCRc含有可编码酮合酶结构域KS1的eryAI基因的片段。分析显示了8.5kbp、4.8kbp和33kbp的阳性杂交Pstl片段，这证明存在两种pAVLD的串联整合型拷贝(附图6)。
实施例3-使用红色糖多孢菌ERMD1制备异丙基和仲丁基红霉素
在自来水培养基上进行50mL红色糖多孢菌ERMD1的发酵，且在4天后30℃下收集菌丝体并用于接种1.5L含有硫链丝菌肽(50μg/ml)的蔗糖琥珀酸盐培养基。在30℃下生长4天后，用等体积的乙酸乙酯将全部肉汤提取两次。
在减压条件下浓缩合并的提取物并两次在硅胶板(20×20cm)上进行制备型薄层层析，用氯仿/甲醇/.88氨8∶2∶0.01(按体积计)洗脱。通过在一种PhaseSep C18碱失活的反相柱S5 ODS(十八烷基硅烷)6(4.6mm×25cm)上的HPLC来进一步分离产物，用甲醇/0.5％乙酸铵(70∶30(体积/体积))以1ml/分洗脱。从三个单独的注射物中收集7-11分钟间的级分，并将收集的级分以分10次单独注射的形式再次注入。含有异丙基侧链(在通式1的R1处的异丙基)的类似物来源于较早洗脱的引入的4-碳(C-4；异丁酰基)起子单位，而含有仲丁基侧链(在通式1的R1处的仲丁基)的类似物来源于晚几分钟出现的引入的5-碳(C-5；2-甲基丁酰基)起子单位。高分辨MS得到的结果是C-4 eryA、eryB和eryD类似物以及C-5 eryA和eryB类似物，它们基本上符合下列计算结果：类似物      已计算的质量      测定的质量C5-eryA     762.5004          762.5021C4-eryA     748.4847          748.4820C5-eryB     746.4898          748.5077C4-eryB     732.4898          732.4933
在这些实验中，天然红霉素仅以较低或可检测到的量存在，且没有可检测到量的eryC类似物。正如通过肉汤的乙酸乙酯提取物的ESMS所估计的，发酵肉汤中C-4/C-5化合物的总浓度比为4∶1-6∶1、C-4化合物含量较高。A∶B∶D类似物之比是可变的、约为15∶60∶25，而作为发酵物的A类似物的比例继续增加。红霉素的总产量约为400μg/升。没有补加异丁酸或2-甲基丁酸。因此，可以发现异丁酰基和2-甲基丁酰基起子单位来源于内源性供给前体、类似于天然除虫菌素的合成(例如Hafner等(1991)，《抗菌素杂志》44：349-356)。
实施例4a-红色糖多孢菌NRRL2338/pIG1的构建
将约5μg的质粒pIG1转化入红色糖多孢菌NRRL2338的原生质体并分离稳定的硫链丝菌肽的耐受性菌落。从几种这样的菌落中获得总DNA并通过Southern杂交法分析，从而证实质粒已经特异性地整合入eryA，且Southern分析也证明整合的位点适于生成能够通过ave装配组件产生改变的大环内酯的一种突变体。
实施例4b-红色糖多孢菌NRRL2338/pND30的构建
将约5μg的质粒pND30转化入红色糖多孢菌NRRL2338的原生质体并分离稳定的硫链丝菌肽的耐受性菌落。从几种这样的菌落中获得总DNA并通过Southern杂交法分析，从而证实质粒已经特异性地整合入eryA，且Southern分析证明整合的位点适于生成能够通过ave装配组件产生改变的大环内酯的一种突变体。
实施例5a-使用红色糖多孢菌NRRL2338/pIG1制备13-异丙基和13-仲丁基红霉素
将红色糖多孢菌NRRL2338/pIG1接种入含有50μg/ml硫链丝菌肽的自来水培养基并使其在30℃下生长4天。此后，在一个带有可减少凝集的单簧板片的2L烧瓶中，将20ml菌丝体用于接种含有50μg/ml硫链丝菌肽(50μg/ml)的500ml蔗糖琥珀酸盐培养基，并以280rpm振摇。在3.5-6天后，过滤肉汤以除去菌丝体，然后用四分之一体积的乙酸乙酯将肉汤提取三次。将合并的乙酸乙酯提取物在无水硫酸钠上干燥并通过蒸发除去溶剂。使用GC和电喷射MS进行的产物混合物分析显示：在总的5-6mg/L 14-节大环内酯产物中，主要成分是仲丁基红霉素D(约1.5mg/L)，而存在的其它成分是仲丁基红霉素B和仲丁基红霉素A；异丙基红霉素A、B和D；且小量的是天然红霉素A、B和D。红色糖多孢菌NRRL2338/pIG1产生的新型异丙基和仲丁基红霉素比同等的红色糖多孢菌ERMD1构建体多约10-15倍以上(参见实施例2)，这清楚地证明了actI启动子及其关联激活物基因ActII-orf4促进I型PKS’s表达的能力。此外，不补加异丁酸或2-甲基丁酸。因此，可以发现异丁酰基或2-甲基丁酰基起子单位来源于内源性供给前体。
实施例5b-使用红色糖多孢菌NRRL2338/pND30制备13-异丙基和13-仲丁基红霉素
将红色糖多孢菌NRRL2338/pND30接种入含有50μg/ml硫链丝菌肽的自来水培养基并使其在30℃下生长4天。此后，在一个带有可减少凝集的单簧板片的2L烧瓶中，将20ml菌丝体用于接种含有50μg/ml硫链丝菌肽(50μg/ml)的500ml蔗糖琥珀酸盐培养基，并以280rpm振摇。在3.5-6天后，过滤肉汤以除去菌丝体，然后用四分之一体积的乙酸乙酯将肉汤提取三次。将合并的乙酸乙酯提取物在无水硫酸钠上干燥并通过蒸发除去溶剂。使用GC和电喷射MS进行的产物混合物分析显示：在总的5-6mg/L 14-节大环内酯产物中，主要成分是仲丁基红霉素D(约1.5mg/L)，而存在的其它成分是仲丁基红霉素B和仲丁基红霉素A；异丙基红霉素A、B和D；且小量的是天然红霉素A、B和D。红色糖多孢菌NRRL2338/pND30产生的新型异丙基和仲丁基红霉素比同等的红色糖多孢菌ERMD1构建体多约10-15倍以上(参见实施例2)，这清楚地证明了actI启动子及其关联激活物基因ActII-orf4促进I型PKS’s表达的能力。此外，不补加异丁酸或2-甲基丁酸。因此，可以发现异丁酰基或2-甲基丁酰基起子单位来源于内源性供给前体。
实施例6a-使用红色糖多孢菌NRRL2338/pIG1制备13-环戊基红霉素B
将培养物红色糖多孢菌NRRL2338/pIG1接种入300mL锥瓶内的50mL自来水培养基中。在28℃下培养36小时后，将该瓶内物用于在5L小瓶内接种3.5L的ERY-p培养基。在28℃下以1.75L/分的充气速率培养该肉汤。在24小时后添加环戊烷羧酸(1.4mL)并继续发酵168小时。此后，用氢氧化钠水溶液将整个肉汤调整至pH为8.5并用乙酸乙酯(10L)提取。将乙酸乙酯提取物浓缩至干，得到粗制品、为一种树胶(4.2g)。将1克的该提取物溶于乙酸乙酯(5mL)并加到预先用乙酸乙酯(10mL)调整的预填充硅胶柱(10g；国际吸附剂技术)上。用乙酸乙酯(4×10mL)、二氯甲烷∶甲醇(1∶1)(2×10mL)、二氯甲烷∶甲醇∶氨(90∶9∶1)(1×10mL)、二氯甲烷∶甲醇∶氨(80∶19∶1)(1×10mL)、甲醇(2×10mL)将该柱连续洗脱。合并级分7-10并蒸发至干。用剩余的3.2g树胶重复这种分级分离过程。这种浓缩步骤产生约920mg含有所需产物的粘性固体。使用zorbax 7μm ODS柱(21.2mm×25cm)、通过制备型反相HPLC来进一步纯化该固体，其中使用乙腈∶0.05M乙酸铵(7∶3)为流动相，流速为8mL/分。在重复应用Beckman 5μm Ultrasphere ODS(10mm×25cm)柱的制备型反相HPLC之前、其中在18分钟内使用乙腈∶0.05M乙酸铵(28∶72)至乙腈∶0.05M乙酸铵(50∶50)梯度的流动相(流速为4mL/分)，将来自四种单独的注射物的级分(含有所关注的产物)合并并蒸发至干。将来自五种单独的注射物(含有所关注的产物)的级分合并并蒸发至干，从而得到一种纯白色固体(7mg)。如下通过质谱(MS)和核磁共振(NMR)波谱法来证明产物的结构：
HPLC保留时间-方法A-26.0分钟
在m/e 758处观察APCI-MS-(M+H)+，目的是确定C40H72NO12-758
Figure A9719764900421
NMR数据：原子数       13C化学位移，来自13C1H化学位移和峰的多样性
         NMR谱1            176.02            45.0                  2.89 1H dq J＝9.4，7.13            80.4                  4.02 1H dd J＝9.4，1.74            39.2                  2.08 1H多重峰5            83.8                  3.59 1H d J＝7.46            75.47            38.0                  2.00 1H dd J＝14.7，10.8
                               约1.65 1H多重峰8            45.0                  2.71 1H dqd J＝10.6，6.8，
                               2.69            约220.010           38.9*                 2.98 1H qd J＝6.8，1.511           69.4                  3.73 1H dd J＝9.9，1.212           38.8*                 1.71 1H多重峰13           78.3                  5.19 1H dd J＝10.5，1.014           41.7                  2.15 1H br六重峰15           30.4                  约1.69 1H多重峰
                               约1.21 1H多重峰16           25.4                  约1.63 1H多重峰
                               约1.52 1H多重峰17           25.1                  约1.63 1H多重峰
                               约1.52 1H多重峰18           29.0                  约1.69 1H多重峰
                               约1.21 1H多重峰19           15.8                  1.18 3H d J＝7.120           9.24                 1.13 3H d J＝7.021           27.4                 1.46 3Hs22           18.5                 1.14 3H d J＝6.823           9.5                  0.99 3H d J＝6.824           9.16                 0.86 3H d J＝7.11’          103.2                4.43 1H d J＝7.32’          70.9                 3.24 1H dd J＝10.3，7.33’          65.4                 2.51 1H ddd J＝12.0，10.6，
                              4.14’          29.0                 约1.68 1H多重峰
                              约1.24 1H多重峰5’          68.8                 3.50 1H br六重峰6’          21.5                 1.22 3H d J＝6.17’，8’     40.1                 2.32 2×3Hs1”          96.5                 4.90 1H d J＝4.62”          35.1                 2.36 1H d J＝15.2+小峰
                              (＜Hz)
                              1.58 1H多重峰3”          72.64”          78.0                 3.02 1H d J＝9.15”          65.6                 4.01 1H多重峰6”          18.7                 1.29 3H d J＝6.37”          21.4                 1.24 3Hs8”          49.5                 3.31 3Hs
*带有星号标记的排布可以互换。
实施例6b-使用红色糖多孢菌NRRL2338/pND30制备13-环戊基红霉素B
一种类似于实施例6a的实验，使用培养物红色糖多孢菌NRRL2338/pND30，产生以实施例6a中为典型的化合物。
实施例7b-使用红色糖多孢菌NRRL2338/pIG1制备13-环丁基红霉素B
将培养物红色糖多孢菌NRRL2338/pIG1接种入3×300mL锥瓶内的50mL自来水培养基中。在28℃下培养72小时后，将该瓶内物用于在3×5L小瓶内接种3.5L的ERY-P培养基。在28℃下以2.0L/分的充气速率培养该肉汤并以500rpm搅拌。分别在24小时和48小时后添加环丁烷羧酸(1.4mL)并继续发酵168小时。此后，用氢氧化钠水溶液将整个肉汤调整至pH为8.5且然后用乙酸乙酯(20L)提取。将乙酸乙酯提取物浓缩至干，得到粗制品、为一种树胶(9.2g)。将部分(2.3g)该提取物溶于乙酸乙酯(12.5mL)并加到预先用乙酸乙酯(10mL)调整的预填充硅胶柱(10g；国际吸附剂技术)上。用乙酸乙酯(4×24mL)、二氯甲烷∶甲醇(9∶1)(1×24mL)、二氯甲烷∶甲醇(8∶2)(2×24mL)、二氯甲烷∶甲醇∶氨(80∶19∶1)(1×24mL)、甲醇(1×24mL)将该柱连续洗脱。合并级分6-8并蒸发至干。用剩余的树胶样品(4.7g)重复这种分级分离过程。这种浓缩步骤产生约415mg含有所需产物的固体。使用zorbax 7μm ODS柱(21.2mm×25cm)、通过制备型反相HPLC来进一步纯化该固体，其中使用乙腈∶0.05M乙酸铵(3∶1)为流动相，流速为8mL/分。在重复应用Beckman 5μm Ultrasphere ODS柱(10mm×25cm)的制备型反相HPLC之前、其中在18分钟内使用乙腈∶0.05M乙酸铵(28∶72)至乙腈∶0.05M乙酸铵(50∶50)梯度的流动相(流速为4mL/分)，将来自四种单独的注射物的级分(含有所关注的产物)合并并蒸发至干。将含有所关注的产物的级分合并并蒸发至干，从而得到一种纯白色固体(27mg)。如下通过MS和NMR来证明产物的结构：
HPLC保留时间一方法A-22.3分钟
在m/e 744处观察APCI-MS-(M+H)+，目的是确定C39H70NO12-744
Figure A9719764900461
NMR数据：原子数      13C化学位移，来自13C1H化学位移和峰的多样性
        NMR谱1           176.32           44.5                      2.87 1H dq J＝9.4，7.13           80.4                      4.03 1H dd J＝9.14           39.2                      2.08 1H多重峰5           83.9                      3.59 1H d J＝7.46           75.47           37.7                      1.99 1H多重峰
                                  1.64 1H dd J＝15.0，3.08           44.5                      2.73 1H br五重峰中的宽双
                                  峰J＝约7.0，3.09           219.410          38.9                      2.97 1H qd J＝6.9，1.111          69.1                      3.75 1H dd J＝10.2+小峰12          37.3                      1.62 1H多重峰13          77.4                      5.39 1H dd J＝9.3，1.114          37.0                      2.60 1H br六重峰15          25.2                      约1.97 1H多重峰
                                  约1.82 1H多重峰16          17.7                      约1.83 2H多重峰17              24.2                        约1.93 2H多重峰
                                        约1.75 1H多重峰18              15.5                        1.17 3H d J＝7.119              9.3                         1.12 3H d J＝7.520              27.0                        1.46 3Hs21              18.0                        1.14 3Hd H＝7.122              9.1                         0.98 3H d J＝6.923              9.3                         0.81 3H d J＝7.11’             103.4                       4.43 1H d J＝7.32’             70.9                        3.27 1H dd J＝10.3，7.33’             65.2                        2.64 1H多重峰4’             29.1                        约1.72 1H多重峰
                                        约1.22 1H多重峰5’             68.7                        3.52 1H br六重峰J＝约6.16’             21.0                        1.23 3H d J＝6.17’，8’        40.0                        2.38 2×3Hs1”             96.8                        4.89 1H d J＝4.52”             34.7                        2.38 1H多重峰
                                        1.57 1Hdd J＝15.0，5.03”             72.54”             77.8                        3.02 1H d J＝9.25”             65.3                        4.02 1H多重峰6”             18.2                        1.29 3H d J＝6.27”             21.2                        1.24 3Hs8”             49.1                        3.31 3Hs
实施例7b-使用红色糖多孢菌NRRL2338/pND30制备13-环丁基红霉素B
一种类似于实施例7a的实验，使用培养物红色糖多孢菌NRRL2338/pND30，产生以实施例7a中例举的化合物。
实施例8a-使用红色糖多孢菌NRRL2338/pIG1制备13-(3-呋喃基)-红霉素B
将培养物红色糖多孢菌NRRL2338/pIG1接种入300mL锥瓶内的50mL自来水培养基中。在28℃下培养72小时后，将该瓶内物用于在5L小瓶内接种3.5L的ERY-P培养基。在28℃下以1.75L/分的充气速率培养该肉汤。在24小时后添加过滤无菌的3-糠酸(6mL甲醇中含1.4g)并继续发酵138小时。此后，用氢氧化钠水溶液将整个肉汤的pH调整至8.5且然后用乙酸乙酯(10L)提取。将乙酸乙酯提取物浓缩至干，得到粗制品、为一种树胶(3.8g)。将部分该提取物(1.9g)溶于乙酸乙酯(10mL)并加到预先用乙酸乙酯(10mL)调整的预填充硅胶柱(10g；国际吸附剂技术)上。用乙酸乙酯(4×24mL)、二氯甲烷∶甲醇(9∶1)(1×24mL)、二氯甲烷∶甲醇(8∶2)(2×24mL)、二氯甲烷∶甲醇∶氨(80∶19∶1)(1×36mL)、甲醇(1×24mL)将该柱连续洗脱。合并级分8和9并蒸发至干。用剩余的1.9g树胶重复这种分级分离过程。这种浓缩步骤产生一种含有所需产物的固体。使用Zorbax 7μm ODS柱(21.2mm×25cm)、通过制备型反相HPLC来进一步纯化该固体，其中使用乙腈∶0.05M乙酸铵(3∶1)为流动相，流速为8mL/分。在重复应用Beckman 5μmUltrasphere ODS柱(10mm×25cm)的制备型反相HPLC之前、其中在18分钟内使用乙腈∶0.05M乙酸铵(28∶72)至乙腈∶0.05M乙酸铵(50∶50)梯度的流动相(流速为4mL/分)，将来自三种单独的注射物的级分(含有所关注的产物)合并并蒸发至干。将来自三种单独注射物的级分(含有所关注的产物)合并并蒸发至干，从而得到纯13-(3-呋喃基)-红霉素B、为白色固体(9mg)。通过质谱法来证明产物的结构：
HPLC保留时间-方法A-17.0分钟
在m/e 756处观察APCI-MS-(M+H)+，目的是确定C36H66NO13-756
Figure A9719764900491
NMr数据：原子数          大约的13C化学位移，来1H化学位移和峰的多样
            自1H-13C相关数据    性1               174.72               44.4                2.93 1H dq J＝8.1，7.03               80.3                4.14 1H d J＝8.14               39.5                2.18 1H m J＝7.0，7.25               83.9                3.61 1H d J＝7.26               75.07               37.8                2.07 1Hdd J＝14.6，11.3
                                1.70 1H dd J＝14.6，未
                                解析8               44.8                2.78 1H br m J＝11.3，
                                7.0，2.29               219.710              39.2                3.05 1H qd J＝6.9，未
                                解析11              69.5                3.95 1H dd J＝10.0，未
                                解析12              41.4                1.88 1H qd J＝10.0，7.013                69.2                    6.47 1H复合峰m14                138.3                   7.31 1H复合峰m J＝0.7，
                                      1.815                124.316                108.6                   6.31 1H复合峰m J＝1.8，
                                      0.717                142.8                   7.39 1H t J＝1.818                15.5                    1.21 3H d J＝7.019                8.7                     1.16 3H d J＝7.020                27.0                    1.48 3Hs21                18.3                    1.18 3Hd H＝7.022                8.4                     1.03 3H d J＝6.923                8.7                     0.88 3H d J＝7.01’               103.3                   4.46 1H d J＝7.42’               71.1                    3.29 1H m3’               65.1                    2.60 1H宽峰m4’               29.3                    1.78 1Hm
                                      1.24 1Hm5’               68.8                    3.54 1Hm6’               20.7                    1.24 3H d(峰模糊不
                                      清)7’，8’          40.0                    2.39 2×3Hs1”               96.6                    4.88 1H br d J＝4.92”               35.2                    2.39 1H m
                                      1.59 1Hdd J＝15.0，4.93”               71.74”               77.8                    3.03 1H d(峰模糊不
                                      清)5”          66.1                 4.03 1Hdq J＝9.0，6.16”          18.3                 1.30 3H d J＝6.17”          21.2                 1.26 3Hs8”          49.1                 3.33 3Hs
*用星号表示的排布可以颠倒。
实施例8b-使用红色糖多孢菌NRRL2338/pND30制备13-(3-呋喃基)-红霉素B
一种类似于实施例8a的实验，使用培养物红色糖多孢菌NRRL2338/pND30，产生以实施例8a中为典型的化合物。
实施例9a-使用红色糖多孢菌NRRL2338/pIG1制备13-环丙基-红霉素B
将培养物红色糖多孢菌NRRL2338/pIG1接种入300mL锥瓶内的50mL自来水培养基中。在28℃下培养72小时后，将该瓶内物用于接种3.5L的ERY-P培养基。在灭菌后立即添加硫链丝菌肽(105mg)。在28℃下以2L/分的充气速率培养该肉汤并以500rpm搅拌。在24小时后添加环丙烷羧酸(1.2mL)并继续发酵144小时。此后，用氢氧化钠水溶液将整个肉汤调整至pH为8.5且然后用乙酸乙酯(3L)提取。将乙酸乙酯提取物浓缩至干，得到粗制品、为一种树胶(1.7g)。将提取物(0.85g)溶于乙酸乙酯(10mL)并加到预先用乙酸乙酯(20mL)调整的预填充硅胶柱(10g；国际吸附剂技术)上。用乙酸乙酯(4×24mL)、二氯甲烷∶甲醇(9∶1)(1×24mL)、二氯甲烷∶甲醇(8∶2)(1×24mL)、二氯甲烷∶甲醇∶氨(80∶19∶1)(3×24mL)、甲醇(1×24mL)将该柱连续洗脱。合并级分6-9并蒸发至干。用剩余的0.85g树胶重复这种分级分离过程。这种浓缩步骤产生一种含有所需产物的固体。使用Zorbax 7μm ODS柱(21.2mm×25cm)、通过制备型反相HPLC来进一步纯化该固体，其中使用乙腈∶0.05M乙酸铵(3∶1)为流动相，流速为8mL/分。在重复应用Beckman 5μmUltrasphere ODS柱(10mm×25cm)的制备型反相HPLC之前、其中在18分钟内使用乙腈∶0.05M乙酸铵(28∶72)至乙腈∶0.05M乙酸铵(50∶50)梯度的流动相(流速为4mL/分)，将来自4种单独的注射物的级分(含有所关注的产物)合并并蒸发至干。将来自三种单独注射物的级分(含有所关注的产物)合并并蒸发至干，从而得到纯13-环丙基-红霉素B、为白色固体(9mg)。通过质谱法来证明产物的结构：
HPLC保留时间-方法A-17.9分钟
在m/e 730处观察APCI-MS-(M+H)+，目的是确定C38H68NO12-730
Figure A9719764900521
NMR数据：原子数        大约的13C化学位移，来1H化学位移和峰的多样
          自1H-13C相关数据     性1             176.42             44.8                   2.88 1H dq J＝8.5，7.13             80.3                   4.04 1H dd J＝8.5，1.94             39.5                   2.11 1H br五重峰J＝
                                 约75             83.7                   3.58 1H d J＝7.56             75.27             38.0                   2.02 1Hdd J＝14.7，
                                 10.9
                                 1.66 1H dd J＝14.7，
                                 2.88              45.1                      2.74 1H dqd J＝10.9，
                                     7.1，2.89              220.0                     -10             39.0                      3.01 1H多重峰11             69.8                      3.76 1H dd J＝10.0，约
                                     1.412             40.4                      1.84 1H dqd J＝10.0，
                                     6.9，1.213             78.5                      4.68 1H dd J＝9.2，1.214             13.2                      1.09 1H多重峰15             4.1                       0.51 1H多重峰
                                     0.42 1H多重峰16             2.7                       0.51 1H多重峰
                                     0.29 1H多重峰17             15.1                      1.19 1H d J＝7.118             9.3                       1.14 3H d J＝约7.119             27.4                      1.46 3Hs20             18.3                      1.16 3Hd J＝7.121             9.3                       1.001 3Hd J＝约7.2*22             9.3                       0.998 3H d J＝约6.9*1’            103.3                     4.43 1H d J＝7.22’            71.0                      3.25 1H dd J＝10.3，
                                     7.23’            65.6                      2.54 1H br ddd J＝约
                                     12.5，10.3，44’            29.0                      1.69 1H多重峰
                                       1.25 1H多重峰5’            69.2                        3.51 1Hbr dq J＝约11.66’            20.9                        1.22 3H d J＝6.27’，8’       39.9                        2.33 2×3Hs1”            97.1                        4.87 1H br d J＝约52”            35.0                        2.37 1H br d J＝约15
                                       1.57 1Hdd J＝15.1，5.03”            72.54”            78.1                        3.01 1H br d J＝9.25”            66.0                        4.02 1Hqd J＝9.2，6.26”            18.3                        1.28 3H d J＝约6.27”            21.0                        1.24 3Hs8”            49.3                        3.32 3Hs
*用星号表示的排布可以颠倒。
实施例9b-使用红色糖多孢菌NRRL2338/pND30制备13-环丙基-红霉素B
一种类似于实施例9a的实验，使用培养物红色糖多孢菌NRRL2338/pND30，产生以实施例9a中为典型的化合物。
实施例10a-使用红色糖多孢菌NRRL2338/pIG1制备13-(1-甲硫基-乙基)-红霉素B
将培养物红色糖多孢菌NRRL2338/pIG1接种入2.8L Fernbach瓶内的1L自来水培养基中。接种后立即添加硫链丝菌肽(50mg)。在29℃下培养84小时后，将该瓶内物用于在14L发酵罐内接种8L补充的ERY-P培养基(50g/L右旋糖、30g/L营养大豆粉、3g/L硫酸铵、5g/L NaCl、6g/L CaCO3、10g/L蔗糖、5g/L玉米固体、0.5g/L MgSO4、1mL/L P2000)。在28℃下以8L/分的充气速率培养该肉汤，且以800rpm搅拌并用NaOH和H2SO4(15％)将pH维持在6.9-7.3。在24小时和48小时后添加甲硫基乳酸(3.2mL)。120小时后再添加甲硫基乳酸(1.6mL)。继续发酵142小时。此后，离心整个肉汤以产生可上XAD-16树脂柱(600ml；Rohm和Haas)的离心物(34L)。然后用水(1.8L)洗涤该树脂柱并用乙酸乙酯(2.5L)洗脱。将乙酸乙酯部分浓缩(至250ml)且然后将所关注的产物萃取入100mM、pH3.5的硫酸钠缓冲液(1.3L)中。通过用氢氧化钠调整水至pH为9而将产物转回乙酸乙酯中并与乙酸乙酯(450ml)混合。分离红霉素含量较多的乙酸乙酯层、蒸发至得到一种树胶(5.0g)、且然后将其重新悬浮于20％的甲醇(120ml)中，将其上CG-161树脂柱(100ml；Toso Haas)。用20％的甲醇(3×100ml)、40％的甲醇(3×100ml)、60％的甲醇(3×100ml)、80％的甲醇(3×100ml)和纯甲醇(4×100ml)将树脂柱连续洗脱。将纯甲醇级分2和3(含有所关注的产物)蒸发至得到一种固体(220mg)并进一步在反相10μm Kromasil C18 HPLC柱(75mm×25cm)上进一步纯化，其中使用含有0.1％三氟乙酸的乙腈∶0.05M乙酸铵为流动相，梯度为(32∶62)至(38∶62)，洗脱时间为60分钟，流速为215mL/分。将含有所关注产物的级分合并(1.7L)、用氢氧化钠调整至pH为9并萃取入二氯甲烷(300mL)。分离二氯甲烷层并蒸发至干，从而产生部分纯化的产物。重复制备型HPLC步骤和萃取步骤以获得纯得到纯13-(1-甲硫基-乙基)-红霉素B(31mg)。如下通过MS和NMR波谱法(Bruker DMX 500MHz分光计)来证明产物的结构：
HPLC保留时间-方法B-14.9分钟
在m/e 764处观察APCI-MS-(M+H)+，目的是确定C38H70NO12S-764
NMR数据：原子数#      13C(ppm)     #结合的1H     1H(ppm)1            221.08         02            176.10         03            103.42         1             4.494            96.93          1             4.945            84.31          1             3.636            80.69          1             4.067            78.30          1             3.078            76.17          1             5.429            75.75          010           73.11          011           71.23          1             3.3212           69.84          1             3.7713           69.03          1             3.5614           66.18          1             4.0615           65.99          1             2.6816           49.91          3             3.3617           45.62          1             2.7418           45.26          1             2.9619           40.61          3             2.4620           40.01          1             2.8321           39.60          1             2.1422           38.94          1             3.0423           38.44          2             2.03/1.7024           37.68          1             2.4425           35.47          2             2.41/1.6326           29.66          2             1.79/1.3227           27.70          3             1.5128           21.89          3             1.2929           21.77          3             1.2830           19.08          3             1.3331             18.92         3             1.2032             18.19         3             1.3333             16.29         3             1.2334             11.11         3             2.1235             10.16         3             1.0736             9.70          3             1.1737             9.62          3             0.90
实施例10b-使用红色糖多孢菌NRRL2338/pND30制备13-(1-甲硫基-乙基)-红霉素B
一种类似于实施例10a的实验，使用培养物红色糖多孢菌NRRL2338/pND30，产生以实施例10a中为典型的化合物。
实施例11-使用红色糖多孢菌NRRL2338制备13-环丁基-红霉素B
将培养物红色糖多孢菌NRRL2338接种入300mL锥瓶内的50mL自来水培养基中。在28℃下培养48小时后，将该瓶内物用于在300mL锥瓶内接种50mL ERY-P培养基。在28℃下培养该肉汤。在24小时后添加环丁烷羧酸(20mL)并继续发酵168小时。此后，用氢氧化钠水溶液将整个肉汤调整至pH为8.5且然后用乙酸乙酯(50mL)提取。分离乙酸乙酯并浓缩至干。将样品重新溶于甲醇(1mL)以用于HPLC-MS分析。这证明：对于含有avr装配组件的遗传工程菌株(NRRL2338/pIG1构建体)来说，通过如实施例7中所述的未转化的、非重组NRRL2338产生了13-环丁基-红霉素B。
HPLC保留时间-方法A-22.3分钟
在m/e 744处观察APCI-MS-(M+H)+，目的是确定C39H70NO12-744
实施例12-使用红色糖多孢菌NRRL2338制备13-环丙基-红霉素B
将培养物红色糖多孢菌NRRL2338接种入300mL锥瓶内的50mL自来水培养基中。在28℃下培养48小时后，将该瓶内物用于在300mL锥瓶内接种50mL ERY-P培养基。在28℃下培养该肉汤。在24小时后添加环丁烷羧酸(20mL)并继续发酵168小时。此后，用氢氧化钠水溶液将整个肉汤调整至pH为8.5且然后用乙酸乙酯(50mL)提取。分离乙酸乙酯并浓缩至干。将样品重新溶于甲醇(1mL)以用于HPLC-MS分析。
这证明：对于含有avr装配组件的遗传工程菌株(NRRL2338/pIG1构建体)来说，通过如实施例9中所述的未转化的、非重组NRRL2338产生了13-环丙基-红霉素B。
HPLC保留时间-方法A-17.9分钟
在m/e 730处观察APCI-MS-(M+H)+，目的是确定C38H68NO12-730
实施例13a-使用红色糖多孢菌NRRL2338/pIG1制备13-环丁基-红霉素A
将培养物红色糖多孢菌NRRL2338/pIG1接种入3×300mL锥瓶内的50mL自来水培养基中。在28℃下培养72小时后，将各该瓶内物用于接种3×3.5L小瓶内的3.5L ERY-P培养基。在28℃下以2.0L/分的充气速率培养该肉汤并以500rpm搅拌。分别在24小时和48小时后添加环丁烷羧酸(1.4mL)并继续发酵168小时。此后，用氢氧化钠水溶液将整个肉汤的pH调整至8.5且然后用乙酸乙酯(20L)提取。将乙酸乙酯提取物浓缩至干，得到粗制品、为一种树胶(9.2g)。将部分(2.3g)这种提取物(2.3g)溶于乙酸乙酯(12.5mL)并加到预先用乙酸乙酯(10mL)调整的预填充硅胶柱(10g；国际吸附剂技术)上。用乙酸乙酯(4×24mL)、二氯甲烷∶甲醇(9∶1)(1×24mL)、二氯甲烷∶甲醇(8∶2)(2×24mL)、二氯甲烷∶甲醇∶氨(80∶19∶1)(1×24mL)、甲醇(1×24mL)将该柱连续洗脱。合并级分6-8并蒸发至干。用剩余的4.7g树胶重复这种分级分离过程。这种浓缩步骤产生415mg含有所需产物的固体。使用Zorbax7μm ODS柱(21.2mm×25cm)、通过制备型反相HPLC来进一步纯化该固体，其中使用乙腈∶0.05M乙酸铵(3∶1)为流动相，流速为8mL/分。在重复应用Beckman 5μm Ultrasphere ODS柱(10mm×25cm)的制备型反相HPLC之前、其中在18分钟内使用乙腈∶0.05M乙酸铵(28∶72)至乙腈∶0.05M乙酸铵(50∶50)梯度的流动相(流速为4mL/分)，将来自5种单独的注射物的级分(含有所关注的产物)合并并蒸发至干。将含有所关注产物的级分合并且蒸发至干，从而得到一种纯白色固体(4mg)。通过MS和NMR质谱法来证明产物的结构：
HPLC保留时间-方法A-17.5分钟
在m/e 760处观察APCI-MS-(M+H)+，目的是确定C39H70NO13-760
NMr数据：原子数       大约的13C化学位移，来1H化学位移和峰的多样
         自1H-13C相关数据  性1            176.12            44.7                2.88 1H多重峰3            79.8                3.99 1H多重峰4            39.3                1.97 1H多重峰5            83.4                3.57 1H d J＝7.66            75.47            38.3                1.92 1H多重峰
                             1.72 1H多重峰8            45.1                2.70 1H多重峰9            222.5               -10             37.4                3.07 1H br q J＝7.011             69.1                3.77 1H br s12             76.1                -13             77.1                5.10 1H d J＝7.114             34.8                2.86 1H多重峰15             26.7                1.98 1H多重峰
                               1.80 1H多重峰16             18.8                1.88 1H多重峰
                               1.71 1H多重峰17             24.8                1.89 2H多重峰18             15.8                1.19 3H d J＝7.020             26.9                1.47 3Hs21             18.1                1.16 3Hd J＝7.21’            103.0               4.42 1H d J＝7.22’            71.0                3.24 1H dq J＝10.4，
                               7.23’            65.3                2.51 1H多重峰4’            28.7                1.68 1H多重峰
                               1.26 1H多重峰5’            69.2                3.49 1H多重峰6’            21.3                1.23 3H d J＝6.27’，8’       40.0                2.38 2×3Hs1”            96.3                4.89 1H d J＝4.52”            34.7                2.38 1H多重峰
                               1.57 1Hdd J＝15.0，5.03”            73.04”            78.0                3.02 1H br d J＝9.45”             65.6               4.00 1H多重峰6”             18.4               1.29 3H d J＝6.27”             21.3               1.24 3Hs8”             49.4               3.32 3Hs
实施例13b-使用红色糖多孢菌NRRL2338/pND30制备13-环丁基-红霉素A
一种类似于实施例13a的实验，使用培养物红色糖多孢菌NRRL2338/pND30，产生以实施例13a中为典型的化合物。
实施例14a-使用红色糖多孢菌NRRL2338/pIG1制备13-环丙基-红霉素A
在6支2800ml Fernbach烧瓶内接种红色糖多孢菌NRRL2338/pIG1。向每只含有1L自来水培养基烧瓶内添加50mg硫链丝菌肽。在28℃下培养24小时后，向每只烧瓶内添加200ppm的环丙烷羧酸。将该瓶保温90小时并与一种无菌的8L吸气瓶接通。将该吸气瓶内物用于在500加仑中间试验容器内接种314加仑的ERY-P培养基。在温度控制在27℃-29℃、pH为6.7-7.4的条件下，以20标准立方英尺/分的充气速率培养该肉汤并以175rpm搅拌。分别在33小时、81小时和117小时后添加环丙烷羧酸(200mg/L)。继续发酵198小时。此后，将全部肉汤过0.2μm的陶瓷过滤器(30ft2，美国过滤器)。将过滤物上XAD-16树脂柱(12L；Rohm和Haas)。然后将树脂柱用乙酸乙酯(60L)洗脱。将乙酸乙酯浓缩至得到一种树胶(302g)，向其中添加2L的二氯甲烷。将所得二氯甲烷溶液用8L 250mM的碳酸氢钠缓冲液(pH为9)进行洗涤。分离含红霉素较多的二氯甲烷层、蒸发至得到一种树胶(200g)、且然后将其重新悬浮于上CG-161树脂柱(9L；Toso Haas)的40％甲醇(10L)中。用40％的甲醇(30L)洗涤该树脂柱并用75％的甲醇(8×10L)和纯甲醇(3×10L)连续洗脱。合并75％的甲醇级分5-8(含有所关注的产物)并蒸发至3.2L。将浓缩物调整至pH为9并添加0.95L二氯甲烷。分离二氯甲烷层并蒸发至产生12.4g的树胶。将部分树胶(6克)通过应用Kromasil 10μm C18 HPLC柱(75mm×25cm)的制备型反相HPLC来进一步进行纯化，其中使用甲醇∶含有0.1％三氟乙酸的0.05M乙酸铵(50∶50)为流动相进行等度洗脱(isocaratic)，流速为215mL/分。将含有所关注产物的级分合并(230mL)、蒸发至得到一种浓缩物(110mL)、用氢氧化钠调整至pH为9并萃取入二氯甲烷(50mL)中。分离二氯甲烷层并蒸发至干以产生630mg部分纯化的产物。通过应用MetaChem Inertsil 10μm C8柱(50mm×25cm)的制备型反相HPLC来进一步纯化另一部分树胶(1克)，其中使用甲醇∶含有0.1％三氟乙酸的0.05M乙酸铵为流动相、梯度为(20∶80)-(25∶75)、时间为50分钟、流速为125mL/分。合并含有所关注化合物(28-46分钟)的级分、用碳酸氢钠饱和并用二氯甲烷提取。分离二氯甲烷并蒸发至干以产生361mg部分纯化的产物。将一部分这些部分纯化的物质通过反相HPLC来进一步纯化，所述的反相HPLC以下列为典型：Phenomenex Prodigy 10μm C18柱(50×250mm)，使用甲醇∶含有0.1％三氟乙酸的0.05M乙酸铵(50∶50)为流动相进行等度洗脱(isocaratic)，流速为100mL/分。合并含有所关注化合物(27-31分钟)的级分、用碳酸氢钠饱和并用二氯甲烷提取。分离二氯甲烷并蒸发至干以产生部分纯化的产物。将该物质通过应用Phenomenex Prodigy 10μm C18柱(50mm×25mm)的制备型反相HPLC来进一步纯化，其中使用甲醇∶含有0.1％三氟乙酸的0.05M乙酸(48∶52)为流动相进行等度洗脱，流速为100mL/分。合并含有所关注化合物(41-45分钟)的级分、用碳酸氢钠饱和并用二氯甲烷提取。分离二氯甲烷并蒸发至干以产生13-环丙基-红霉素A、为一种固体(20mg)。如下通过MS和NMR质谱法(Bruker DMX500MHz分光计)来证明产物的结构：
HPLC保留时间-方法B-5.6分钟
在m/e 746处观察APCI-MS-(M+H)+，目的是确定C38H68NO13-746
Figure A9719764900631
NMR数据：原子数#       13C(ppm)     #结合的1H     1H(ppm)1             222.41        02             175.88        03             103.63        1              4.454             96.75         1              4.925             83.92         1              3.606             80.25         1              4.027             78.52         1              4.748             78.42         1              3.059             75.99         010            75.49         011            73.05         012            71.31         1              3.2713            69.46         1              3.8414            69.39         1              3.5215            66.02         1              4.0416            65.95         1              2.4917            49.93         3              3.3618            45.47         1              2.7419            45.23         1              2.8920            40.70         1              2.3421             40.00         1              2.0222             38.94         2              1.96/1.7623             38.46         1              3.1524             35.38         2              2.41/1.6125             29.07         2              1.71/1.2826             27.36         3              1.5027             21.94         3              1.2828             21.84         3              1.2629             19.08         3              1.3230             18.69         3              1.2131             17.38         3              1.3132             16.11         3              1.2133             12.38         3              1.2034             10.64         1              1.2035             9.60          3              1.1636             4.23          2              0.67/1.3337             1.64          2              0.47/0.32
实施例14b-使用红色糖多孢菌NRRL2338/pND30制备13-环丙基-红霉素A
一种类似于实施例14a的实验，使用培养物红色糖多孢菌NRRL2338/pND30，产生以实施例14a中为典型的化合物。
实施例15a-使用红色糖多孢菌NRRL2338/pIG1制备13-(3-噻吩基)-红霉素B
将培养物红色糖多孢菌NRRL2338/pIG1接种入300mL锥瓶内的50mL自来水培养基中。在28℃下培养48小时后，将5mL这种接种物用于在300mL锥瓶内接种50mL ERY-P培养基。在28℃下培养该肉汤。24小时后，添加过滤无菌的3-噻吩羧酸的N-乙酰基半胱硫酯(20mg溶于0.5mL甲醇)并继续发酵168小时。此后，用氢氧化钠水溶液将整个肉汤调整至pH为8.5且然后用乙酸乙酯(50mL)提取。分离乙酸乙酯并浓缩至干。将样品重新溶于甲醇(1mL)以用于HPLC-MS分析。这证明产生的是13-(3-噻吩基)-红霉素B。
HPLC保留时间-方法A-20.0分钟
在m/e 772处观察APCI-MS-(M+H)+，目的是确定C39H66NO12-772
实施例15b-使用红色糖多孢菌NRRL2338/pND30制备13-(3-噻吩基)-红霉素B
一种类似于实施例15a的实验，使用培养物红色糖多孢菌NRRL2338/pND30，产生以实施例15a中为典型的化合物。
实施例16-使用红色糖多孢菌NRRL18643制备6-脱氧-13-环丙基-红霉素B
将培养物红色糖多孢菌NRRL18643(一种红色糖多孢菌的eryF突变体(《科学》252：114，1991年4月5日))接种入2.8L Fernbach烧瓶内的1L自来水培养基中。在29℃下培养24小时后，在以200rpm搅拌条件下添加环丙烷羧酸(200mL)。总计培养三(3)天后，将一只烧瓶内物用于在14L发酵罐内接种8L补充的ERY-P培养基(60g/L工业葡萄糖、30g/L营养大豆粉、3g/L(NH4)SO4、5g/L NaCl、6g/L玉米固体、0.5g/L MgSO4和1mL/L P2000)。在28℃下以8L/分的充气速率培养该肉汤、以800rpm搅拌并用NaOH和H2SO4(15％)将pH维持在6.9-7.3。在24小时和48小时后添加环丙烷羧酸(1.6mL)。在总计培养163小时后收集发酵物(一式两份)。用氢氧化钠将整个肉汤调整至pH为9且然后用乙酸乙酯(16L)提取。将乙酸乙酯在20L Buchi旋转蒸发装置中浓缩至得到一种油状物。将该油状物用500mL的二氯甲烷重新溶解。向该液体中添加500mL的水，并用10％的氢氧化铵将水相的pH调整至9。剧烈振摇后，收集二氯甲烷层并在1L旋转蒸发烧瓶内蒸发至产生11.0g的油状残余物。将该物质用250mL的4∶6甲醇∶水溶液溶解，并上80mL的CG-161树脂柱(Toso Haas)。将该柱用350mL的4∶6甲醇∶水溶液洗涤。然后以8mL/分将该柱用350mL的7∶3甲醇∶水溶液短暂地洗涤，直到有色的杂质开始从该柱上洗脱下来为止(约2柱床体积的洗涤液)。此后，开始进行1小时的梯度洗脱，甲醇的浓度在70％-100％内变化，期限为1小时，流量为8mL/分。将含有所关注产物的级分蒸发至干并进一步在反相10μm Kromasil C18 HPLC柱(50mm×25cm)上进一步纯化，其中使用乙腈∶由0.01M乙酸铵、0.02％三氟乙酸和26％乙腈组成的缓冲液(5∶95)为流动相，时间为50分钟，流速为120mL/分。此后在接下来的40分钟内进行(5∶95)-(33∶67)的线性梯度洗脱。将含有所关注产物的级分合并(530mL)、用10％的氢氧化铵调整至pH为9并萃取入二氯甲烷(400mL)。分离二氯甲烷层并蒸发至干，从而产生纯化的6-脱氧-13-环丙基-红霉素B(12mg)。通过MS来证明产物的结构。
HPLC保留时间-方法B-21.4分钟
在m/e 714处观察APCI质谱-(M+H)+，目的是确定C38H68NO12-714
实施例17-使用红色糖多孢菌NRRL18643制备6-脱氧-13-丙基-红霉素B
从3天YPD琼脂(0.5％Difo酵母提取物、0.5％Difo Bacto胨、0.25％右旋糖、0.5％MOPS、1.7％Difo Basto琼脂，pH调整至7.0)上的膜片将红色糖多孢菌NRRL18643接种入250mL锥瓶内的25mL_YPD肉汤(0.5％Difo酵母提取物、0.5％Difo Bacto胨、0.25％右旋糖、0.5％MOPS，pH调整至7.0)中。在29℃、225rpm下将该烧瓶保温48小时。取2.5mL接种入25mL ERY-P培养基(5％的右旋糖、3％的营养大豆粉、0.3％的(NH4)SO4、0.5％的NaCl、0.6％的CaCO3，pH调整至7.0)并在29℃、225rpm下保温总计6天。在24、72和120小时(分别以400rpm、400rpm、2rpm)向该烧瓶内添加丁酸。然后将整个肉汤的pH用1N的NaOH调整至9.1。将样品用等体积的乙酸乙酯提取两次。在氮气环境中(50℃水浴)将乙酸乙酯相浓缩至干，然后重新悬浮于1.0mL甲醇中以用于HPLC-MS分析。这证明产生的是6-脱氧-13-丙基-红霉素B。
HPLC保留时间-方法C-23.5分钟
在m/e 716处观察APCI-MS-(M+H)+，目的是确定C38H70NO11-716
实施例18-抗菌活性的评价
用微量滴定法进行体外抗菌试验并根据《用于抗微生物盘式敏感性试验的标准操作法》第6版-经核准的标准法来解释，它由临床实验室标准国家委员会(NCCLS)的指南公布。获得了抗各种细菌的最小抑制浓度(MICs)。例如，金黄色葡萄球菌80CR5(大环内酯敏感性菌株)产生的数值一般在≤0.1-1.56μg/mL的范围。

Claims (31)

1.一种通式1的化合物及其药物上可接受的盐，其中
Figure A9719764900021
R1是α-支链的C3-C8的烷基、链烯基、炔基、烷氧基烷基或烷基硫代烷基，它们中的任何一种均可以任意被一个或多个羟基取代；R1是C5-C8的环烷基烷基，其中烷基是α-支链的C2-C5的烷基；R1是C3-C8的环烷基或C5-C8的环链烯基，它们各自可以被甲基或一个或多个羟基或一个或多个C1-C4的烷基或卤原子任意地取代；或R1是含有氧或硫的3-6节的杂环，该杂环可以是饱和的、或完全或部分不饱和的且该杂环可以任意被一个或多个C1-C4的烷基或卤原子取代；或R1是可以由至少一个取代基任意取代的苯基，所述的取代基选自C1-C4的烷基、C1-C4的烷氧基和C1-C4的烷基硫基、卤原子、羟基、三氟甲基、和氰基；或R1可以是带有如下所示通式(a)的基团：
Figure A9719764900022
其中X是O、S或-CH2-，a、b、c和d每个均独立地为0-2且a+b+c+d≤5。
R2是H或OH；R3-R5每个均独立地为H、CH3或CH2CH3；R6是H或OH；且R7是H、CH3、或CH2CH3；R8是H或德糖胺；R9是H、CH3、或CH2CH3；R10是OH、碳霉糖(R13是H)、或克拉定糖(R13是CH3)，R11是H；或R10＝R11＝O；且R12是H、CH3、或CH2CH3；或上述所定义的化合物通过用一个酮基取代一个或多个-CHOH或-CHOR基团来修饰。
2.一种通式2的化合物及其药物上可接受的盐，其中：
R1是H，C1-C8的烷基、C2-C8的链烯基、C2-C8的炔基、在各自烷基或烷氧基中带有1-6个碳原子的烷氧基烷基或烷基硫代烷基，其中任意一种所述的烷基、烷氧基、链烯基或炔基均可以被一个或多个羟基或可以被一个或多个卤原子所取代；或R1是C3-C8的环烷基或C5-C8的环链烯基，它们各自可以被甲基或一个或多个C1-C4的烷基或卤原子任意地取代；或R1是含有氧或硫的3-6节的杂环，该杂环可以是饱和的或完全或部分不饱和的且该杂环可以任意被一个或多个C1-C4的烷基或卤原子任意地取代；或R1是通式SR14的基团，其中R14是C1-C8的烷基、C2-C8的链烯基、C2-C8的炔基、C3-C8的环烷基、C5-C8的环链烯基、苯基或其中取代基是C1-C4的烷基、C1-C4的烷氧基或卤素的取代的苯基、或含有氧或硫的3-6节的杂环，该杂环可以是饱和的、或完全或部分不饱和的且该杂环可以任意被一个或多个C1-C4的烷基或卤原子所取代。
R2是H或OH；R3-R5每个均独立地为H、CH3、或CH2CH3；R6是H或OH；且R7是H、CH3、或CH2CH3；R8是H或德糖胺；R9是H、CH3、或CH2CH3；R10是OH、碳霉糖(R13是H)、或克拉定糖(R13是CH3)，R11是H；或R10＝R11＝O；且R12是H、CH3、或CH2CH3，条件是当R3-R5是CH3、R7是CH3、R9是CH3、且R12是CH3时，那么R1不是H或C1烷基；或上述所定义的化合物通过用一个酮基取代一个或多个-CHOH或-CHOR基团来修饰。
3.一种如权利要求1所要求的通式1的化合物，其中R1是可以被一个或多个羟基或一个或多个C1-C4的烷基任意取代的C3-C6的环烷基或环链烯基。
4.一种权利要求3的化合物，其中R1是环丙基。
5.一种权利要求3的化合物，其中R1是环丁基。
6.一种权利要求3的化合物，其中R1是环戊基。
7.一种权利要求3的化合物，其中R1是环己基。
8.一种权利要求1的化合物，其中R1是α-支链的C3-C8的烷基、链烯基、炔基、烷氧基烷基或烷基硫代烷基。
9.一种权利要求8的化合物，其中R1是异丙基。
10.一种权利要求8的化合物，其中R1是仲丁基。
11.一种权利要求8的化合物，其中R1是2-丁烯-2-基、2-戊烯-2基、或4-甲基-2-戊烯-2-基。
12.一种权利要求8的化合物，其中R1是1-甲硫基乙基。
13.一种权利要求1的化合物，其中R1是含有氧或硫的5或6节的杂环，该杂环可以被一个或多个羟基或C1-C4的烷基或卤原子任意地取代。
14.一种权利要求13的化合物，其中R1是3-噻吩基
15.一种权利要求13的化合物，其中R1是3-呋喃基
16.一种权利要求1的化合物，其中R1是苯基
17.一种权利要求1的化合物，其中R1是通式(a)的基团，其中a和b是0、c和d是1且X是-CH2-。
18.一种权利要求1的化合物，其中R1是通式(a)的基团，其中a和b是0、c是1、d是2且X是-CH2-。
19.一种权利要求1的化合物，其中R1是通式(a)的基团，其中a和b是0、c和d是1且X是O。
20.一种权利要求2的化合物，其中R1是SR14且R14是甲基或乙基。
21.一种权利要求2的化合物，其中R1是乙基、丙基、丁基、异丙基或仲丁基。
22.一种权利要求2的化合物，其中R1是1-(三氟甲基)乙基。
23.一种用于制备如权利要求1中所要求的通式1的化合物或如权利要求2中所要求的通式2的化合物的方法，包括下列步骤：在有通式R1CO2H的羧酸或其盐、酯或酰胺或其氧化前体存在的情况下发酵能够产生红霉素的一种有机体，其中R1如权利要求1或权利要求2中所定义，得到一种；并且分离通式1或2的化合物。
24.一种权利要求23的方法，其中有机体是红色糖多孢菌且它可以任意含有一种能够指导通式1化合物生物合成的有效整合质粒，所述的质粒可以任意含有一种II型PKS启动子/激活物基因。
25.一种权利要求24的方法，其中有机体红色糖多孢菌选自菌株NRRL 2338、18643或21484，它们可以任意含有一种能够指导通式1化合物生物合成的有效整合质粒，所述的质粒可以任意含有actI启动子及其关联激活物基因ActII-orf4。
26.一种权利要求25的方法，其中任意有效的整合质粒是pAVLD、pIG1、pND30、pCJR26、pCJR49、pC-AT12、pc-ATX或其它类似的构建体。
27.一种权利要求25的方法，其中有机体是红色糖多孢菌ERMD1、红色糖多孢菌NRRL 2338/pIG1、红色糖多孢菌NRRL 2338/pND30、或其它类似的转化体。
28.一种药物组合物，包括一种治疗有效量的权利要求1或权利要求2的化合物以及一种药物上可接受的载体。
29.一种治疗哺乳类动物、鱼、或鸟中细菌感染、或与细菌感染相关的病症、或原生动物感染的方法，包括对所述的哺乳类动物、鱼、或鸟给予治疗有效量的权利要求1或权利要求2的化合物。
30.权利要求1或权利要求2的化合物在制备用于治疗哺乳类动物、鱼、或鸟中细菌感染的药剂中的用途。
31.权利要求1或权利要求2的化合物用于改善哺乳类动物、鱼、或鸟中特性作用(诸如增加体重、食物利用效率、产奶量等)的用途。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6060234A (en) * 1991-01-17 2000-05-09 Abbott Laboratories Polyketide derivatives and recombinant methods for making same
US6063561A (en) * 1991-01-17 2000-05-16 Abbott Laboratories Polyketide derivatives and recombinant methods for making same
US5712146A (en) 1993-09-20 1998-01-27 The Leland Stanford Junior University Recombinant combinatorial genetic library for the production of novel polyketides
US6927057B2 (en) 1993-09-20 2005-08-09 Kosan Biosciences Macrolide analogs
US6500960B1 (en) 1995-07-06 2002-12-31 Stanford University (Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University) Method to produce novel polyketides
US20030170725A1 (en) 1993-09-20 2003-09-11 Chaitan Khosla Combinatorial polyketide libraries produced using a modular PKS gene cluster as scaffold
US6558942B1 (en) 1994-05-06 2003-05-06 The Leland Stanford Junior University Combinatorial polyketide libraries produced using a modular PKS gene cluster as scaffold
WO1998049315A2 (en) 1997-04-30 1998-11-05 Kosan Biosciences, Inc. Combinatorial polyketide libraries produced using a modular pks gene cluster as scaffold
US6495348B1 (en) 1993-10-07 2002-12-17 Regents Of The University Of Minnesota Mitomycin biosynthetic gene cluster
WO1997002358A1 (en) 1995-07-06 1997-01-23 The Leland Stanford Junior University Cell-free synthesis of polyketides
WO1997022711A1 (en) 1995-12-19 1997-06-26 Regents Of The University Of Minnesota Metabolic engineering of polyhydroxyalkanoate monomer synthases
US6271255B1 (en) 1996-07-05 2001-08-07 Biotica Technology Limited Erythromycins and process for their preparation
US6399789B1 (en) 1996-12-18 2002-06-04 Kosan Biosciences, Inc. Multi-plasmid method for preparing large libraries of polyketides and non-ribosomal peptides
US6117659A (en) 1997-04-30 2000-09-12 Kosan Biosciences, Inc. Recombinant narbonolide polyketide synthase
US6503741B1 (en) 1998-05-28 2003-01-07 Kosan Biosciences, Inc. Polyketide synthase genes from Streptomyces venezuelae
JP2008169226A (ja) * 1997-04-30 2008-07-24 Kosan Biosciences Inc 足場としてモジュラー性ｐｋｓ遺伝子クラスターを使用して生成されるコンビナトリアルなポリケチドライブラリー
US6902913B2 (en) 1997-04-30 2005-06-07 Kosan Biosciences, Inc. Recombinant narbonolide polyketide synthase
AU744751C (en) 1997-07-10 2005-11-24 Kosan Biosciences, Inc. Production of polyketides in plants
AP1060A (en) 1998-01-02 2002-04-23 Pfizer Prod Inc Novel erythromycin derivatives.
EP1045912A1 (en) * 1998-01-14 2000-10-25 Glaxo Group Limited Polyketides and their synthesis
AU762399C (en) * 1998-05-28 2004-02-05 Kosan Biosciences, Inc. Recombinant narbonolide polyketide synthase
US6265202B1 (en) 1998-06-26 2001-07-24 Regents Of The University Of Minnesota DNA encoding methymycin and pikromycin
GB9814006D0 (en) * 1998-06-29 1998-08-26 Biotica Tech Ltd Polyketides and their synthesis
WO2000001838A2 (en) * 1998-07-02 2000-01-13 The Board Of Regents Of The Leland Stanford Junior University Methods for making polyketides
GB9814622D0 (en) * 1998-07-06 1998-09-02 Biotica Tech Ltd Polyketides,their preparation,and materials for use therein
EP1124968A2 (en) 1998-10-28 2001-08-22 Kosan Biosciences, Inc. Library of novel "unnatural" natural products
CA2349338C (en) 1998-11-03 2005-12-06 Pfizer Products Inc. Novel macrolide antibiotics
US6358712B1 (en) 1999-01-05 2002-03-19 Trustee Of Boston University Ordered gene assembly
OA11753A (en) 1999-01-27 2005-07-19 Pfizer Prod Inc Ketolide antibiotics.
EP1153124A2 (en) 1999-02-09 2001-11-14 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods to mediate polyketide synthase module effectiveness
US7001748B2 (en) 1999-02-09 2006-02-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods of making polyketides using hybrid polyketide synthases
US6514944B2 (en) 1999-04-16 2003-02-04 Kosan Biosciences, Inc. Macrolide antiinfective agents
JP2002542197A (ja) 1999-04-16 2002-12-10 オーソ−マクニール・フアーマシユーチカル・インコーポレーテツド ケトライド抗菌剤
US6590083B1 (en) 1999-04-16 2003-07-08 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Ketolide antibacterials
US6451768B1 (en) 1999-04-16 2002-09-17 Kosan Biosciences, Inc. Macrolide antiinfective agents
DE60030847T2 (de) 1999-04-16 2007-04-19 Kosan Biosciences, Inc., Hayward Antiinfektiöse makrolidderivate
US6939861B2 (en) 1999-04-16 2005-09-06 Kosan Biosciences, Inc. Amido macrolides
AP2001002302A0 (en) 1999-05-24 2001-10-25 Pfizer Prod Inc 13-Methyl erythromycin derivatives.
GB9912563D0 (en) * 1999-05-28 1999-07-28 Biotica Tech Ltd Polyketides and their synthesis
AU2748701A (en) 1999-10-29 2001-06-06 Kosan Biosciences, Inc. Rapamycin analogs
EP1101769A3 (en) 1999-11-18 2001-10-24 Pfizer Products Inc. Nitrogen containing erythromycin derivatives
WO2001060833A2 (en) 2000-02-18 2001-08-23 Kosan Biosciences, Inc. Motilide compounds
EP1146051A3 (en) * 2000-04-10 2001-10-31 Pfizer Products Inc. Erythromycin A derivatives
JP5037771B2 (ja) 2000-04-13 2012-10-03 バイオチカ テクノロジー リミテッド グリコシル化されたハイブリッド産物およびその産生方法と利用
US20030225006A1 (en) * 2002-02-19 2003-12-04 Burns Lesley S Novel spinosyn-producing polyketide synthases
EP2277898A3 (en) 2002-07-16 2011-06-01 Biotica Technology Limited Rapamycin analogues
DK200201957A (da) 2002-12-20 2003-01-20 Alpharma Aps 10-substituted erythromycin ketolides and methods of making
GB0230217D0 (en) * 2002-12-27 2003-02-05 Biotica Tech Ltd Borrelidin-producing polyketide synthase and its uses
CA2673334C (en) 2003-06-16 2013-11-12 Andrx Pharmaceuticals, Llc Oral extended-release composition
GB0327720D0 (en) 2003-11-28 2003-12-31 Biotica Tech Ltd Erythromycins and process for their preparation
GB0417852D0 (en) 2004-08-11 2004-09-15 Biotica Tech Ltd Production of polyketides and other natural products
US7582611B2 (en) * 2005-05-24 2009-09-01 Pfizer Inc. Motilide compounds
ES2556211T3 (es) 2008-09-24 2016-01-14 Shanghai Institute Of Organic Chemistry, Chinese Academy Of Sciences Agrupación de genes novedosa
GB0904540D0 (en) 2009-03-17 2009-04-29 Biotica Tech Ltd Novel compounds and methods for their production
CN101519637B (zh) * 2009-04-07 2011-06-15 华东理工大学 一种红色糖多孢菌及其发酵生产红霉素的方法
GB0914589D0 (en) 2009-08-20 2009-09-30 Biotica Tech Ltd Novel compounds and methods for their production
EP2533784B1 (en) 2010-02-09 2015-04-22 Neurovive Pharmaceutical AB Sanglifehrin based compounds
WO2011098808A1 (en) 2010-02-09 2011-08-18 Biotica Technology Limited Sanglifehrin based compounds
WO2011098805A1 (en) 2010-02-09 2011-08-18 Biotica Technology Limited Sanglifehrin based compounds
GB201118334D0 (en) 2011-10-24 2011-12-07 Biotica Tech Ltd Novel dosage form
WO2013172782A1 (en) * 2012-05-16 2013-11-21 Nanyang Technological University A polyketide synthase construct and its use in the preparation of polyketides
US10533016B2 (en) 2015-01-09 2020-01-14 Revolution Medicines, Inc. Compounds that participate in cooperative binding and uses thereof
WO2017180748A1 (en) 2016-04-12 2017-10-19 Warp Drive Bio, Inc. Compositions and methods for the production of compounds
WO2018020272A1 (en) 2016-07-29 2018-02-01 Isomerase Therapeutics Limited Novel methods
AU2017350900A1 (en) 2016-10-28 2019-06-13 Ginkgo Bioworks, Inc. Compositions and methods for the production of compounds
KR102561694B1 (ko) * 2016-10-28 2023-07-28 징코 바이오웍스, 인크. 화합물의 생산을 위한 조성물 및 방법
AU2018226340C1 (en) 2017-02-22 2022-04-21 ISR Immune System Regulation Holding AB (publ) Novel immune stimulating macrolides
CN110678476A (zh) 2017-02-22 2020-01-10 免疫系统调节控股有限公司 新型免疫刺激大环内酯
WO2019180265A1 (en) 2018-03-23 2019-09-26 Immune System Regulation Holding Ab Combinations of macrolide compounds and immune checkpoint inhibitors
KR102643707B1 (ko) 2019-01-22 2024-03-04 에오비안 파마슈티컬스, 인크. Mtorc 조절제 및 이의 용도
CR20220240A (es) 2019-11-04 2022-08-03 Revolution Medicines Inc Inhibidores de ras
TW202132316A (zh) 2019-11-04 2021-09-01 美商銳新醫藥公司 Ｒａｓ抑制劑
TW202132314A (zh) 2019-11-04 2021-09-01 美商銳新醫藥公司 Ｒａｓ抑制劑
TW202227460A (zh) 2020-09-15 2022-07-16 美商銳新醫藥公司 Ｒａｓ抑制劑
KR20240014756A (ko) 2022-07-26 2024-02-02 강원대학교산학협력단 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자 및 그 제조방법
CN117288869B (zh) * 2023-11-24 2024-02-09 中国医学科学院医药生物技术研究所 一种原料药中对甲苯磺酸酯类杂质的检测方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6060234A (en) * 1991-01-17 2000-05-09 Abbott Laboratories Polyketide derivatives and recombinant methods for making same
WO1993013663A1 (en) * 1992-01-17 1993-07-22 Abbott Laboratories Method of directing biosynthesis of specific polyketides
ES2164713T3 (es) * 1993-09-20 2002-03-01 Univ Leland Stanford Junior Produccion recombinante de nuevos poliquetidos.
US5712146A (en) * 1993-09-20 1998-01-27 The Leland Stanford Junior University Recombinant combinatorial genetic library for the production of novel polyketides

Also Published As

Publication number Publication date
AP1029A (en) 2001-12-11
SK182498A3 (en) 2000-05-16
CA2259463A1 (en) 1998-01-15
CA2259420A1 (en) 1998-01-15
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DE69733416D1 (de) 2005-07-07
TR199900006T2 (xx) 1999-04-21
DE69733416T2 (de) 2006-04-27
JP2000511063A (ja) 2000-08-29
IL127916A0 (en) 1999-11-30
CA2259420C (en) 2007-09-18
ATE451455T1 (de) 2009-12-15
PT909327E (pt) 2005-10-31
PL331285A1 (en) 1999-07-05
OA10952A (en) 2002-02-25
DK0910633T3 (da) 2010-03-29
EA199900087A1 (ru) 1999-08-26
DK0909327T3 (da) 2005-09-26
GB9900156D0 (en) 1999-02-24
SI0910633T1 (sl) 2010-04-30
NO990012L (no) 1999-02-23
AU731654B2 (en) 2001-04-05
WO1998001546A3 (en) 1998-04-09
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WO1998001546A2 (en) 1998-01-15
JP2000516450A (ja) 2000-12-12
ES2337424T3 (es) 2010-04-23
EP0910633A2 (en) 1999-04-28
EP0909327B1 (en) 2005-06-01
NZ333861A (en) 2000-08-25
EA001744B1 (ru) 2001-08-27
DE69739688D1 (de) 2010-01-21
EP0910633B1 (en) 2009-12-09
AP9901444A0 (en) 1999-03-31
BG103133A (en) 2000-04-28
AU3450997A (en) 1998-02-02
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ES2244001T3 (es) 2005-12-01
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AU3451497A (en) 1998-02-02

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