EA001744B1 - Новые эритромицины и способы их получения - Google Patents

Новые эритромицины и способы их получения Download PDF

Info

Publication number
EA001744B1
EA001744B1 EA199900087A EA199900087A EA001744B1 EA 001744 B1 EA001744 B1 EA 001744B1 EA 199900087 A EA199900087 A EA 199900087A EA 199900087 A EA199900087 A EA 199900087A EA 001744 B1 EA001744 B1 EA 001744B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
compound
plasmid
group
alkyl
formula
Prior art date
Application number
EA199900087A
Other languages
English (en)
Other versions
EA199900087A1 (ru
Inventor
Питер Фрэнсис Лидлей
Джеймс Стаунтон
Хесус Кортес
Майкл Стефен Пэйси
Original Assignee
Байотика Текнолоджи Лимитед (Gb)
Пфайзер Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB9614189.0A external-priority patent/GB9614189D0/en
Priority claimed from GBGB9710962.3A external-priority patent/GB9710962D0/en
Application filed by Байотика Текнолоджи Лимитед (Gb), Пфайзер Инк. filed Critical Байотика Текнолоджи Лимитед (Gb)
Publication of EA199900087A1 publication Critical patent/EA199900087A1/ru
Publication of EA001744B1 publication Critical patent/EA001744B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D498/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D498/12—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D498/18—Bridged systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/06—Anti-spasmodics, e.g. drugs for colics, esophagic dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H17/04—Heterocyclic radicals containing only oxygen as ring hetero atoms
    • C07H17/08—Hetero rings containing eight or more ring members, e.g. erythromycins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
    • C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

В настоящем изобретении предложен способ продуцирования эритромицинов путем ферментации соответствующих микроорганизмов в присутствии RCOH, в частности эритромицинов с новыми С-13-заместителями R(например, с С-С-циклоалкильными или циклоалкенильными группами). Предпочтительным микроорганизмом является Saccharopolyspora erythraea, который предпочтительно содержит интегрированную плазмиду, способную регулировать синтез желаемых соединений.

Description

Предпосылки создания изобретения
Настоящее изобретение относится к новым поликетидам, а также к способам и средствам для их получения; а более конкретно, к новым эритромицинам, которые могут быть использованы в качестве антибактериальных средств, антипротозойных средств и других средств (например, в качестве противораковых средств, средств против атеросклероза и средств, улучшающих двигательную функцию желудка и т.п.) для лечения млекопитающих, включая человека, а также рыб и птиц. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим новые соединения, и к способам лечения бактериальных и протозойных инфекций у млекопитающих, рыб и птиц путем введения указанных новых соединений млекопитающим, рыбам и птицам, нуждающимся в таком лечении.
Биосинтетические гены поликетидов или их фрагменты, которые могут быть получены от различных кластеров биосинтетических генов поликетидов, были подвергнуты различным превращениям, позволяющим получить новые эритромицины.
Поликетиды представляют собой большой и структурно разнообразный класс природных продуктов, который включает многие соединения, обладающие антибиотическими или другими фармакологическими свойствами, такие как эритромицин, тетрациклины, рапамицин, авермектин, полиэфирные ионофоры и БК506. В частности, поликетиды в большом количестве продуцируются стрептомицетами (8!тер!отусе5) и родственными бактериями актиномицетами. Их синтезируют повторной постадийной конденсацией сложных ацилтиоэфиров методом, аналогичным методу биосинтеза жирных кислот. Большое структурное разнообразие, обнаруженное среди природных поликетидов, обусловлено выбором (обычно) ацетата или пропионата в качестве исходных или удлиняющих звеньев и различной степенью обработки β-кетогруппы, наблюдаемой после каждой конденсации. Примерами стадий такой обработки являются восстановление до β-гидроксиацила-, восстановление с последующей дегидратацией до 2-еноила- и полное восстановление до насыщенного сложного ацилтиоэфира. Стереохимический выход продукта на этих стадиях обработки является также определенным для каждого цикла наращивания цепи. Биосинтез поликетидов инициируется группой цепь-образующих ферментов, известных как поликетид-синтазы. Для актиномицетов описаны два класса поликетид-синтаз (РК8). Однако новые поликетиды и способы их синтеза, которые являются целью настоящего изобретения, были получены с использованием поликетид-синтаз (РК8) Типа I, которые представлены поликетид-синтазами (РК8) для таких макролидов, как эритромицин, авермектин и рапамицин (фиг. 1), и которые состоят из различного набора или модуля ферментов для каждого цикла наращивания цепи поликетидов (фиг. 2) (Сог1с5, 1. е! а1., Иа!иге (1990) 348:176-178; □огоЛю, 8. е! а1., 8с1еисе (1991) 252:675-679, МасИей, ^.^. е! а1., Оеие (1992), 115:119-125; 8с11\\еске. Т. е! а1.,
Ргос.Иа!1.Асаб.8с1. И8Л, (1995) 92:7839-7843. Следует отметить, что термин природный модуль, используемый в настоящем описании, означает набор смежных доменов, начиная от гена α, β-кетоацилсинтазы (К8) и кончая следующим геном ацил-переносящего белка (АСР), и осуществляющих один цикл наращивания поликетидной цепи. Используемый термин комбинаторный модуль относится к любой группе смежных доменов (и фрагментов доменов), простирающихся от первой точки в первом природном модуле до второй эквивалентной точки во втором природном модуле. Первая и вторая точки находятся, обычно, в центре доменов, присутствующих во всех модулях, т.е. они представляют собой эквивалентные точки, находящиеся в соответствующих доменах К8, АТ (ацилтрансферазы), АСР или в линкерных областях между доменами.
На фиг. 2 показана организация генов эритромицин-продуцирующей РК8 (известной также как 6-дезоксиэритронолид-В-синтаза, ΌΕΒ8). Три открытые рамки считывания (ОРС) кодируют полипептиды ΌΕΒ8. Эти гены организованы в шесть повторяющихся звеньев, называемых модулями. Первая открытая рамка считывания кодирует первый мультифермент или кассету (ΌΕΒ81), которая состоит из трех модулей: модуля загрузки (егу-загрузка) и двух модулей наращивания (модули 1 и 2). Модуль загрузки включает ацил-трансферазу и ацилпереносящий белок. Он может отличаться от модуля, показанного на фиг. 1 \УО 93/13663 (см. ниже). Это указывает на то, что ОРС1 состоит лишь из двух модулей, первый из которых является в действительности как модулем загрузки, так и первым модулем наращивания.
Показано, что деления в рамке считывания ДНК, кодирующей часть домена кеторедуктазы модуля 5 в ΌΕΒ8, приводит к образованию аналогов эритромицина: 5,6-дидезокси-3-микарозил-5-оксоэритронолида В; 5,6-дидезокси-5оксоэритронолида В; и 5,6-дидезокси-6,6эпокси-5-оксоэритронолида В Юоиабю, 8. е! а1., 8с1еисе, (1991) 252:675-679). Аналогичным образом, модификация остатков активного сайта в домене еноилредуктазы модуля 4 в ΌΕΒ8, проводимая методами генной инженерии путем модификации соответствующей РК8кодирующей ДНК, и ее введение в 8ассйаторо1у§рота етуШтаеа приводит к продуцированию 6,7-ангидроэритромицина С Юоиабю, 8. е! а1., Ргос. Иа!1. Асаб. 8сЕ И8А, (1993) 90:7119-7123).
В международной патентной заявке № \¥О 93/13663, которая в полном объеме включена сюда в качестве ссылки, описаны дополнительные типы генетической модификации генов ΌΕΒ8, способных продуцировать модифицированные поликетиды. Однако сообщалось, что многие такие попытки оказались непродуктивными (НШсйнъоп С.В. & Енщ, I. Аппи.Веу.МюгоЬю1. (1995) 49:201-238, р. 231). Описана полная ДНК-последовательность генов, происходящих от 81гер1отусе5 йудго5сор1си5. кодирующих модульную РК8 типа I, регулирующую биосинтез макроциклического иммуносуппрессорного поликетида рапамицина (8сйтеске, Т. е1 а1., (1995) Ргос. Иа11. Асаб. 8ск И8А, 92:7839-7843) (фиг. 3). Эта ДНКпоследовательность депонирована в банке генов ЕМВЬ/ОепЬапк Эа1аЬа5е под номером допуска Х86780.
Хотя идентифицировано большое количество терапевтически эффективных поликетидов, однако необходимость в получении новых поликетидов, которые обладали бы улучшенными свойствами или абсолютно новой биологической активностью, остается актуальной. Комплексные поликетиды, продуцированные модульной РК8 типа I, имеют особенно важное значение, поскольку они включают соединения, которые, как известно, являются эффективными противогельминтными средствами, инсектицидами, иммуносупрессантами, противогрибковыми средствами и/или антибактериальными средствами. Из-за своей сложной структуры эти новые поликетиды не могут быть легко получены обычными методами химического синтеза или методами химической модификации известных поликетидов. Один из аспектов настоящего изобретения основан на том обнаруженном факте, что набор генов РК8 типа I кодирует модуль загрузки, за которым следуют модули наращивания. Это имеет особенно важное значение для получения набора гибридных генов РК8, в котором модуль загрузки гетерологичен модулям наращивания, что позволяет продуцировать поликетид, имеющий модифицированное исходное звено. Эта идея была ранее абсолютно неизвестна, поскольку не было выявлено существование модулей загрузки. В \УО 93/13663 описана модификация генов РК8 путем инактивации одной функции (т.е. одного фермента) или воздействия на весь модуль, путем его делеции, включения или его замены. В этом смысле этот загрузочный набор не является модулем.
Если модулем загрузки является модуль, который акцептирует множество различных карбоновокислотных звеньев, то этот набор гибридных генов может быть использован для продуцирования множества различных поликетидов. Так, например, в наборе гибридных генов может быть использована нуклеиновая кислота, кодирующая модуль ауг-загрузки с егумодулями-удлинителями. Модуль загрузки может присоединять неприродные кислотные звенья и их производные и, в этом смысле, модуль ауг-загрузки является наиболее ценным (ИиИоп е! а1., (1991) ЕАпбЬю!., 44:357-365). Кроме того, можно определить специфичность природного модуля загрузки для неприродных исходных звеньев и использовать преимущества ослабленной специфичности модуля загрузки для продуцирования новых поликетидов. Таким образом, другим аспектом настоящего изобретения является неожиданно обнаруженная способность модуля егу-загрузки включать неприродные карбоновые кислоты и их производные для получения новых эритромицинов в эритромицин-продуцирующих штаммах, содержащих только гены ΌΕΒ8. Само собой разумеется, что в поликетидный продукт можно также ввести модификации, в частности путем замены модуля наращивания модулем, который дает кетидное звено с другой степенью окисления и/или с другой стереохимической структурой. В основном, предположено, что стереохимия метильных групп в поликетидной цепи определяется ацил-трансферазой, но в действительности она является отличительным признаком других доменов РК8, и, таким образом, она позволяет проводить модификации только путем замены этих доменов отдельно или путем замены модулей. Метил и другие заместители могут быть добавлены или удалены путем замены ацилтрансферазного домена или путем замены всего модуля. Следовательно, для специалистов в этой области также очевидно, что можно комбинировать использование ослабленной субстратной специфичности модуля загрузки эритромицина с заменой модуля наращивания и использование гибридного модуля загрузки с заменой модуля наращивания в качестве механизма, позволяющего продуцировать широкий ряд новых эритромицинов. Таким образом, в настоящем изобретении описано получение новых эритромицинов с использованием нетрансформированных микроорганизмов, а также указанных наборов генов, векторов, содержащих такие наборы генов, и микроорганизмовтрансформантов, которые могут их экспрессировать, с последующим продуцированием новых эритромицинов в трансформированных микроорганизмах. Микроорганизмы-трансформанты могут включать рекомбинантные плазмиды, либо эти плазмиды могут быть интегрированы в их геном. Плазмида, имеющая последовательность т!, будет интегрироваться в сайт специфического связывания (а1Г) хромосомы хозяина. Микроорганизмы-трансформанты могут быть способными к модификации исходных продуктов, например, путем осуществления всех или частичных биосинтетических модификаций, обычно используемых при продуцировании эритромицинов (как показано на фиг. 2В). Однако могут быть использованы мутантные микроорганизмы, такие, что некоторые из нормальных метаболических реакций будут блоки рованы, например, с продуцированием продуктов без одной или нескольких природных гидроксильных групп или сахарных групп, например как описано в работах \\Ό 91/16 334 или \\'еЪег е! а1., (1985) 1.Вае1ег1о1., 164:425-433, которые во всем объеме включены в настоящее описание в качестве ссылки. Альтернативно, могут быть использованы микроорганизмы, в которых некоторые нормальные реакции метаболизма сверхэкспрессированы, что позволит избежать возможных стадий, ограничивающих скорость при продуцировании нужного продукта, как, например, описано в работе \ 0 97/06266, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки.
В этом аспекте рассматриваемый способ касается, главным образом, обработки РК8генных модулей как структурных блоков, которые могут быть использованы для конструирования ферментных систем и, тем самым, новых эритромициновых продуктов нужных типов. Для этого, обычно, эти генные модули вырезают и набор этих модулей группируют с образованием мультимодулей. В этом случае представляется логичным, если участки продуцирования и разрыва междумольных связей находятся в областях соединения модулей. Однако может оказаться предпочтительным делать разрезы и сшивки точно внутри доменов (т.е. в ферменткодирующих областях) вблизи от их концов. ДНК между всеми модульными РК8 является высоко сохраненной, и это может оказаться полезным при конструировании гибридов, которые могут быть транскрибированы. Это может быть также полезным для сохранения расположения активных сайтов кодируемых ферментов, что может оказаться крайне важным. Так, например, при продуцировании гибридного гена путем замены модуля егу-загрузки модулем аугзагрузки егу-модуль, вместе с небольшим участком следующего за ним домена кетосинтазы (К8), удаляют. Начало домена К8 (расположенного от активного центра на значительном расстоянии) является в высокой степени сохранным, а поэтому обеспечивает подходящий сайт сплайсинга в качестве альтернативы для линкерной области, расположенной между доменом загрузки и началом К8-домена. Вырезанный егу-модуль затем заменяют модулем аугзагрузки.
Действительно, при замене модуля загрузки может оказаться предпочтительным заменить не только домены модуля загрузки (обычно ацилтрансферазы (АТ) и ацил-переносящего белка (АСР), но также и К8, в начале следующего за ним модуля наращивания. Обычно вырезанный модуль загрузки должен обеспечивать пропионатное исходное звено и его замена приводит к необходимости получения одного или нескольких других исходных звеньев. Однако пропионат может вводиться в К8 модуля наращивания из пропионатного пула в клетке хозяине, что будет приводить к разбавлению нужных продуктов. Этого можно избежать, главным образом, путем замены удлиненного модуля загрузки, включающего весь или большую часть К8-домена. (Сайт сплайсинга может находиться в конце гена К8 или в начале расположенного за ним гена АТ или в линкерной области, соединяющей эти два гена).
При замене модулей не ограничиваются природными модулями. Так, например, комбинаторный модуль, предназначенный для вырезания и/или замены и/или вставки, может иметь длину от соответствующего домена двух природных модулей, например от АТ одного модуля до АТ следующего модуля, или от К8 до К8. Сайты сплайсинга будут находиться в соответствующих сохранившихся концевых областях или в линкерных областях. Комбинаторный модуль может быть также двойным или более крупным мультимодулем, что обеспечивает добавление 2 или более модулей одновременно.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к новым эритромицинам, полученным способами, изложенными выше. Такими эритромицинами являются следующие соединения:
(ΐ) Аналог эритромицина (являющийся макролидным соединением с 14-членным кольцом), в котором С-13 имеет боковую цепь, не являющуюся этилом, а, в основном, прямую С3С6-алкильную группу, разветвленную С3-С8алкильную группу, С3-С8-циклоалкильную или циклоалкенильную группу (необязательно замещенную, например, одной или несколькими гидроксигруппами, С1-С4-алкильными или алкоксигруппами или атомами галогена), или 3-6членный гетероцикл, содержащий О или 8, насыщенный, либо полностью или частично ненасыщенный, и необязательно замещенный (как для циклоалкила), или К! представляет фенил, который может быть необязательно замещен, по крайней мере, одним заместителем, выбранным из С1-С4-алкильной, С1-С4-алкокси- и С1-С4алкилтиогрупп, атомов галогена, трифторметила и циано; или Κι может быть группой формулы (а), показанной ниже
где Х представляет О, 8 или -СН2-, каждый из а, Ъ, с и ά независимо представляют 0-2 и а+Ъ+е+б < 5. Предпочтительными кандидатами на С-13 заместитель К являются группы карбоксилатных звеньев КС00К', используемых в качестве субстратов для исходного ауг-модуля или исходных вариантов рапамицина. Предпочтительными субстратами являются карбоновые кислоты КС00Н. Альтернативными субстратами, которые могут быть эффективно использованы, являются соли карбоновых кислот, сложные эфиры карбоновых кислот или амиды. Предпоч тигельными сложными эфирами являются тиоэфиры Ν-ацетилцистамина, которые могут быть легко использованы в качестве субстратов для исходного ауг-модуля, как было проиллюстрировано в работе ΌιιΙΙοη е1 а1. в ЕР 0350187, которая в полном объеме включена в настоящее описание в качестве ссылки. Предпочтительными амидами являются Ν-ацилимидазолы. Другими альтернативными субстратами, которые могут быть использованы, являются производные, которые представляют собой окисленные предшественники карбоновых кислот, например подходящими субстратами являются аминокислоты формулы К.СН(ЫН2)СООН. глиоксиловые кислоты формулы ИСОСООН. метиламиновые производные формулы ВСН2ХН2. производные метанола формулы ИСН2ОН. альдегиды формулы ИСНО или замещенные алкановые кислоты формулы И(СН2)п-СООН. где η = 2. 4 или 6. Таким образом, примерами предпочтительных субстратов являются изобутират (К=изо-Рг) и 2метилбутират (К=1-метилпропил). Другими возможными вариантами этих соединений являются н-бутират, циклопропилкарбоксилат. циклобутилкарбоксилат, циклопентилкарбоксилат, циклогексилкарбоксилат, циклогептанилкарбоксилат, циклогексенилкарбоксилаты, циклогептенилкарбоксилаты и метилированные в кольце производные циклических карбоксилатов и их вышеупомянутые производные.
Аналог эритромицина может соответствовать исходному продукту РК8 (6-дезоксиэритронолиду) или продукту, полученному после одной или нескольких стандартных стадий биосинтеза. Эти стадии, как показано на фиг. 2Ь, включают 6-гидроксилирование, 3-О-гликозилирование, 5-О-гликозилирование, 12-гидроксилирование и специфическое метилирование сахара.
Таким образом, аналоги могут включать соединения, которые соответствуют 6-дезоксиэритронолиду В, эритромицину А и различные промежуточные соединения и альтернативные соединения (но не ограничиваются ими), показанные на фиг. 2Ь.
(ίί) Аналоги эритромицина, отличающиеся от соответствующего природного соединения (фиг. 2Ь) степенью окисления одной или нескольких кетидных единиц (т.е. альтернативно выбранных из группы, включающей -СО-, -СН(ОН)-, =СН- и -СН2-).
Стереохимию любого -СН(ОН)- также выбирают независимо.
(ΐϊϊ) Аналоги эритромицина, отличающиеся от соответствующего природного соединения отсутствием природной метильной боковой цепи. (Это может быть достигнуто с использованием варианта АТ). В нормальных модулях наращивания используются либо С2 или С3единицы для получения неметилированных и метилированных кетидных единиц. Могут быть получены неметилированные единицы, где ме тилированные единицы являются природными (и наоборот, могут быть получены метилированные единицы в системах, где имеются природные неметилированные единицы). а также более крупные единицы, например С4, для получения этиловых заместителей.
(ίν) Аналоги эритромицина, отличающиеся от соответствующего природного соединения стереохимией природного метила; и/или кольцевых заместителей, не являющихся метилом.
(ν) Аналоги эритромицина, имеющие отличительные признаки одного или более пунктов (ί)-(ίν).
(νί) Производные любого из вышеуказанных соединений, которые подвергаются последующей обработке ферментами, не являющимися РК8. например одной или несколькими из таких обработок, как гидроксилирование, эпоксидирование, гликозилирование и метилирование.
Далее описаны способы получения новых эритромицинов настоящего изобретения. В наиболее простом способе неприродные исходные звенья (предпочтительно, но не ограничиваясь ими, карбоновокислотные аналоги неприродных исходных звеньев) вводят в нетрансформированные микроорганизмы, способные продуцировать эритромицины. Предпочтительный способ предусматривает введение исходного звена в бульон для ферментации, содержащий эритромицин-продуцирующий микроорганизм, причем указанный способ является более эффективным для трансформированных микроорганизмов, способных к продуцированию эритромицинов. Однако аналог исходного звена может быть также введен в альтернативные препараты эритромицин-продуцирующих микроорганизмов, например в препараты фракционированных или нефракционированных разрушенных клеток. И в этом случае этот способ является в равной мере эффективным для трансформированных микроорганизмов, продуцирующих эритромицины. В другом способе один или несколько сегментов ДНК, кодирующей отдельные модули или домены в гетерологичной РК8 типа I (донорной РК8). были использованы для замены ДНК, кодирующей, соответственно, отдельные модули или домены в генах ΌΕΒ8 эритромицин-продуцирующих микроорганизмов. Подходящими для этой донорной РК8 являются модули загрузки и модули наращивания, взятые из любой природной или синтетической РК8 типа I. а особенно подходящими для этих целей являются компоненты РК8 типа I для биосинтеза эритромицина, рапамицина, авермектина, тетроназина, олеандомицина, монензина, амфотерицина и рифамицина, для которых организация гена и модуля, по крайней мере частично, известны на основании анализа последовательности генов. Особенно предпочтительными примерами модулей загрузки до норной РК8 являются модули загрузки, обладающие ослабленной специфичностью, например модуль загрузки авермектин(ауг)-продуцирующей РК8 81гер1отусе§ ауегтИПК, или модули загрузки, обладающие необычной специфичностью, например модули загрузки рапамицин-, ЕК506- и аскомицин-продуцирующих РК8, все из которых обычно акцептируют исходное звено, происходящее от шикимата. Неожиданно было обнаружено, что как нетрансформированные, так и генетически сконструированные эритромицин-продуцирующие микроорганизмы, культивированные в подходящих условиях, продуцируют неприродные эритромицины, и эти продукты могут быть подвергнуты, если это необходимо, той же самой обработке, что и природный эритромицин.
В другом аспекте настоящего изобретения плазмиду, содержащую ДНК донорной РК8, встраивают посредством гомологичной рекомбинации в клетку-хозяина в условиях, при которых плазмида интегрирует в гены ΌΕΒ8 на хромосоме эритромицин-продуцирующего штамма с образованием гибридной РК8. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения ДНК донорной РК8 включает сегмент, кодирующий модуль загрузки так, чтобы этот модуль загрузки становился связанным с генами ΌΕΒ8 на хромосоме. Такая гибридная РК8 при культивировании в подходящих условиях, описанных в настоящей заявке, продуцирует новые и ценные эритромициновые продукты. В частности, при замене модуля загрузки генов ΌΕΒ8 модулем загрузки авермектин(ауг)продуцирующей РК8, новые эритромициновые продукты содержат исходное звено, типичное для тех звеньев, которые используются ауг-РК8. Таким образом, при замене модуля загрузки егуРК8 модулем ауг-загрузки было обнаружено, что штаммы 8ассйагоро1у§рога егу!йгаеа, содержащие такую гибридную РК8, продуцируют 14членные макролиды, содержащие исходные звенья, обычно используемые ауг-РК8.
Неожиданно было обнаружено, что 14членные макролидные поликетиды, продуцируемые такими рекомбинантными клетками 8. егуШгаеа, включают производные эритромицина А, что указывает на то, что несколько стадий обработки, необходимых для трансформации продуктов гибридной РК8 с получением новых и терапевтически ценных производных эритромицина А, были правильно осуществлены. В еще одном аспекте настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что транскрипция любого из гибридных генов эритромицина может быть специфически усилена в том случае, если эти гибридные гены поместить под контроль промотора гена РК8 Типа II, присоединенного к специфическому гену-активатору для этого промотора. Особенно примечательным является тот факт, что, если генетически сконструированную клетку, содержащую гибридные гены эритромицина, помещенные под такой контроль, культивировать в условиях, подходящих для продуцирования эритромицина, то уровень продуцирования нового эритромицина значительно увеличивается. Такое специфическое увеличение выхода ценного эритромицинового продукта также наблюдалось для природной эритромицин-продуцирующей РК8, ген которой был помещен под контроль промотора и генаактиватора РК8 типа II. В предпочтительном варианте осуществления изобретения нужные гены, присутствующие на 8СР2*-производной плазмиде, помещены под контроль разнонаправленного аеН-промотора, производного от биосинтетического кластера генов актинородина 81гер1отусе§ соейсо1ог, причем в указанном варианте вектор также содержит структурный ген, кодирующий специфический белокактиватор ЛсШ-огГ 4. Рекомбинантную плазмиду вводят в 8ассйагоро1у§рога егуШгаеа в условиях, при которых либо встроенные гены РК8, либо гены р8К, уже присутствующие в штаммехозяине, экспрессируются под контролем асНпромотора.
Такие штаммы продуцируют нужный эритромициновый продукт, а ген-активатор требует только присутствия специфического промотора для усиления эффективности транскрипции, обеспечиваемой промотором. Особенно является неожиданным, что активаторы семейства АсШ-огГ 4 не принадлежат к известному классу ДНК-связывающих белков. Поэтому следует ожидать, что для того, чтобы активация происходила в гетерологичном хозяине, который, как известно, не продуцирует актинородин или родственный изохроманхиноновый пигмент, должны потребоваться вспомогательные белки или другие контролирующие элементы. Неожиданным и важным фактором является также то, что эти рекомбинантные штаммы могут продуцировать более чем в 10 раз большее количество эритромицинового продукта, чем при тех же самых генах РК8 под контролем природного промотора, и, кроме того, эритромициновый продукт очень быстро продуцируется в растущей культуре, а не только в процессе перехода этой культуры из фазы роста в стационарную фазу. Такие эритромицины могут быть использованы как антибиотики, а также для многих других целей в медицине и ветеринарии. Таким образом, если генетически сконструированной клеткой является 8ассйагоро1у§рога егуйгаеа и если активатор и промотор происходят от кластера генов актинородин-продуцирующей РК8, а кластер асП/асШ-огГ4регулируемых генов егу-РК8 находится в хромосоме после сайт-специфической интеграции низкокопийного плазмидного вектора, то культивирование этих клеток в подходящих условиях может обеспечивать продуцирование 1 4членного макролидного продукта, которое более чем 10 раз превышает продуцирование этого продукта в таком же штамме, но не находящемся под таким гетерологичным контролем. Если в такой генетически сконструированной клетке 8.егу1йтаеа гены РК8, находящиеся под гетерологичным контролем, являются гибридными генами РК8 типа II, конструирование которых описано в настоящей заявке, то эта клетка может продуцировать более чем в 10 раз большее количество гибридного поликетидного продукта, чем то, которое может быть получено от тех же самых гибридных генов РК8 типа I, но не находящихся под таким контролем. Более конкретно, если гибридными генами РК8 типа I являются гены РК8, в которых модуль загрузки заменен модулем ауг-загрузки, то наблюдается 10-кратное увеличение общего количества новых 14-членных макролидов, продуцируемых генетически сконструированными клетками, культивированными в подходящих условиях, описанных в настоящей заявке.
Подходящие и предпочтительные способы культивирования ^трансформированных и генетически сконструированных эритромицинпродуцирующих клеток и подходящие и предпочтительные способы выделения, идентификации, и практического использования новых эритромицинов более подробно описаны в примерах.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к соединениям формулы 1
и к их фармацевтически приемлемым солям, где К1 представляет α-разветвленную С3-С8алкильную, алкенильную, алкинильную, алкоксиалкильную или алкилтиоалкильную группу, каждая из которых может быть необязательно замещена одной или несколькими гидроксильными группами; С5-С8-циклоалкилалкильную группу, где указанная алкильная группа является α-разветвленной С2-С5-алкильной группой; С3-С8-циклоалкильную или С5-С8-циклоалкенильную группу, каждая из которых может быть необязательно замещена метильной группой, либо одной или несколькими гидроксильными группами, либо одной или несколькими С1-С4алкильными группами или атомами галогена: или 3-6-членное кислород- или серосодержащее гетероциклическое кольцо, которое может быть насыщенным, либо полностью или частично ненасыщенным и которое может быть необяза тельно замещено одной или несколькими С1-С4алкильными группами или атомами галогена; либо К1 представляет фенил, который может быть необязательно замещен, по крайней мере, одним заместителем, выбранным из С1-С4-алкильной, С1-С4-алкокси- и С1-С4-алкилтиогрупп, атомов галогена, трифторметила, и циано; либо К1 может представлять группу формулы
где Х обозначает О, 8, или -СН2-, а каждый из а, Ь, с и б независимо представляет 0-2, и а+Ь+с+б < 5.
К2 представляет Н или ОН;
каждый из К3-К5 независимо представляет Н, СНз или СН2СН3;
Кб представляет Н или ОН;
К7 представляет Н, СН3, или СН2СН3;
К8 представляет Н или дезозамин,
К9 представляет Н, СН3 или СН2СН3;
К10 представляет ОН, микарозу (К13=Н) или кладинозу (К13=СН3);
К11 представляет Н; или К10=К11=0; и
К12 представляет Н, СН3, или СН2СН3.
В вышеуказанных определениях алкильные группы, содержащие 3 или более атомов углерода, могут иметь прямую или разветвленную цепь. Термин галоген означает фтор, хлор, бром или иод. Термин альфаразветвленный означает, что атом углерода, присоединенный в положении С-13, является вторичным атомом углерода, связанным с двумя другими атомами углерода, а остальная часть алкильной группы может иметь прямую или разветвленную цепь.
Предпочтительными соединениями формулы 1 являются соединения, в которых К3-К5, К7, К9 и К12 представляют СН3, а К1 представляет изопропил или втор-бутил, 2-бутен-2-ил, 2пентен-2-ил или 4-метил-2-пентен-2-ил, необязательно замещенный одной или несколькими гидроксильными группами. Предпочтительными также являются соединения формулы 1, в которых К3-К5, К7, К9 и К12 представляют СН3, а К1 представляет С3-С6-циклоалкил или циклоалкенил, который может быть необязательно замещен одной или несколькими гидроксильными группами или одной или несколькими С1-С4алкильными группами. В другой группе предпочтительных соединений К1 представляет 5или 6-членное кислород- или серосодержащее гетероциклическое кольцо, а в частности 3тиениловое или 3-фуриловое кольцо, которое может быть необязательно замещено одной или несколькими гидроксильными группами, либо одной или несколькими С1-С4-алкильными группами или атомами галогена. В другой предпочтительной группе соединений К1 представляет С3-С8-алкилтиоалкильную группу, в частности, 1 -метилтиоэтильную группу.
В другом конкретном варианте настоящее изобретение относится к соединениям формулы
и к их фармацевтически приемлемым солям, где Κ1 представляет Н, С1-С8-алкильную. С2-С8алкенильную, С2-С8-алкинильную, алкоксиалкильную или алкилтиоалкильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода в каждой алкильной или алкоксигруппе, где каждая из указанных алкильной, алкокси-, алкенильной или алкинильной групп может быть замещена одной или несколькими гидроксильными группами, либо одним или несколькими атомами галогена; или С3-С8-циклоалкильную или С5-С8-циклоалкенильную группу, каждая из которых может быть необязательно замещена метильной группой, либо одной или несколькими С1-С4алкильными группами или атомами галогена; или 3-6-членное кислород- или серосодержащее гетероциклическое кольцо, которое может быть насыщенным, либо полностью или частично ненасыщенным и которое может быть необязательно замещено одной или несколькими С1-С4алкильными группами или атомами галогена; либо группу формулы 8Κ14, где Κ14 представляет С ГС8-алкильную, С2-С8-алкенильную, С2-С8алкинильную, С3-С8-циклоалкильную, С5-С8циклоалкенильную, фенильную или замещенную фенильную группу, где заместителем является С1-С4-алкил, С1-С4-алкокси или галоген; или 3-6-членное кислород- или серосодержащее гетероциклическое кольцо, которое может быть насыщенным, либо полностью или частично ненасыщенным и которое может быть необязательно замещено одной или несколькими С1-С4алкильными группами или атомами галогена.
К2 представляет Н или ОН;
каждый из Κ3-Κ5 независимо представляет Н, СН3 или СН2СН3;
К6 представляет Н или ОН; а
К7 представляет Н, СН3 или СН2СН3;
К8 представляет Н или дезозамин;
К9 представляет Н, СН3 или СН2СН3;
Κ10 представляет ОН, микарозу (Κ13=Η) или кладинозу (К13=СН3);
Κ11 представляет Н, либо Κ10=Κ11=0; а
Κ12 представляет Н, СН3 или СН2СН3, при условии, что если Κ3-Κ5 представляют СН3, К7 представляет СН3, К9 представляет СН3, а
Κ12 представляет СН3, то Κ1 не является Н или С1-алкилом.
В вышеприведенных определениях алкильные группы, содержащие 3 или более атомов углерода, могут иметь прямую или разветвленную цепь. Галоген означает фтор, хлор, бром или иод.
Предпочтительными соединениями формулы 2 являются соединения, в которых Κ3-Κ5 представляют СН3, К7 представляет СН3, К9 представляет СН3, Κ12 представляет СН3, а Κ1 представляет 8Κ14, где Κ14 представляет метил или этил. В другой группе предпочтительных соединений Κ1 представляет метил, изопропил или втор-бутил, который может быть замещен одной или несколькими гидроксильными группами. В еще одной группе предпочтительных соединений Κ1 представляет разветвленную С3С8-алкильную группу, замещенную одной или несколькими гидроксильными группами, либо одним или несколькими атомами галогена, в частности, 1-(трифторметил)-этил.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции для лечения бактериальных инфекций или протозойных инфекций у млекопитающих, рыб или птиц, где указанная композиция содержит терапевтически эффективное количество соединения формулы 1 или 2, его фармацевтически приемлемой соли и фармацевтически приемлемый носитель.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения бактериальных инфекций или протозойных инфекций у млекопитающих, рыб или птиц путем введения указанному млекопитающему, рыбе или птице терапевтически эффективного количества соединения формулы 1 или формулы 2, или его фармацевтически приемлемой соли.
Если это не оговорено особо, то используемый в настоящем описании термин лечение означает лечение или предупреждение бактериальной инфекции или протозойной инфекции с использованием способов настоящего изобретения.
Если это не оговорено особо, то используемые в настоящем описании термины бактериальная инфекция и протозойная инфекция означают бактериальные и протозойные инфекции, которые поражают млекопитающих, рыб и птиц, а также нарушения, связанные с бактериальными и протозойными инфекциями, которые могут излечиваться или предупреждаться посредством введения антибиотиков, таких как соединения настоящего изобретения. Такими бактериальными и протозойными инфекциями, а также нарушениями, связанными с указанными инфекциями, являются следующие: пневмония, отит среднего уха, синусит, бронхит, тонзилит и мастоидит, связанные с инфекциями, вызываемыми 81гер1ососси8 рпеишошае, НаешорЫшз тйиеп/ае, Могахе11а са1аггйа118, 81арйу1ососси8 аигеиз или Рер1о81гер1ососси8 8рр.; фарингит, ревматическая лихорадка и гломерулонефрит, связанные с инфекциями, вызы ваемыми 81гер1ососсик руодепек, стрептококками Группы С и 6, С1ок1пбшш б1р1йепае, или АсбпоЬасШик 11аето1убсит; респираторные инфекции дыхательных путей, вызываемые инфекциями Мусор1акта рпеитошае, Ьедюпе11а рпеиторййа, 81гер1ососсик рпеитошае, НаеторЫ1ик тПиепхае или СЫатуб1а рпеитошае; неосложненные инфекции кожи и мягких тканей, абцессы и остеомиелиты и послеродовая лихорадка, связанная с инфекцией, вызываемой 81арйу1ососсик аигеик, коагулазо-позитивными стафилококками (т.е. 8.ер|бегниб15. 8.11ето1убсик и т.п.), 81гер1ососсик руодепек, 81гер1ососсик ада1асбае, группой стрептококков С-Е (мелкие колонии стрептококков), 81гер1ососа νίηбапк, СогупеЬас1ег1нт ттибкатит, С1ок1пбтт крр. или Ваг1опе11а йепке1ае; неосложненные острые инфекции мочеполовых путей, связанные с инфекциями, вызываемыми 81арйу1ососсик каргорйубсик или Еыегососсик крр, уретрит и цервицит; и заболевания, передаваемые половым путем и связанные с инфекциями, вызываемыми СЫат1б1а 1гасйотабк, НаеторШик бисгеуц Тгеропета ра1йбит, Игеар1акта игеа1убсит или Ыешкепа допоггйеае, токсикозы, связанные с инфекцией, вызываемой 8.аигеик (пищевое отравление и синдром токсического шока) или стрептококками групп А, В и С; язвы, вызываемые инфицированием НейсоЬас1ег ру1оп; синдромы системной лихорадки, вызываемые инфицированием Воггейа гесиггепбк, болезнь Лайма, вызываемая инфицированием ВоггеНа ЬигдбогГеп; конъюктивит, кератит и дакроцистит, связанные с инфицированием СЫат1б1а 1гасйотабк, №ккепа допоггйоеае, 8.аигеик, 8.рпеитошае, 8.руодепек, Н.1пГ1иеп7ае, или Ык1епа крр.; заболевания диссеминированного симптомокомплекса МусоЬас1егшт атшт (МАС), связанные с инфицированием МусоЬас1ег1нт адтт или МусоЬас1егшт т!гасе11и1аге; гастроэнтериты, связанные с инфицированием Сашру1оЬас1ег )е)шп; кишечные паразитарные инвазии, связанные с инфицированием СгурЮкропбннп крр.; одонтогенная инфекция, связанная с инфицированием 81гер1ососа νίπбапк; хронический кашель, связанный с инфицированием Вогбе1е11а рейикык, газовая гангрена, связанная с инфицированием С1ок1пбшш регГппдепк или Вас1егснбек крр.; и атеросклероз, связанный с инфицированием НеНсоЬас1ег ру1оп или С’111аниб1а рпеитошае. Бактериальными и протозойными инфекциями, а также нарушениями, вызываемыми у животных такими инфекциями, которые могут подвергаться лечению или предупреждению, являются респираторное заболевание у коров, связанное с инфицированием Р.йаеш., Р.шиИоаба, Мусор1акта Ьо\эк или Вог-бе1е11а крр; кишечное заболевание у коров, связанное с инфицированием Е.сой или инвазией простейших (т.е. кокцидий, криптоспоридий и т. п.), мастит у молочных коров, связанный с инфицированием 81арй.аигеик, 81гер.иЬепк,
81гер.ада1асбае, 81гер.букда1асбае, К1еЬк1е11а крр., СогупеЬас1епит или Ейегососсик крр.; респираторное заболевание у свиней, связанное с инфицированием А.р1еиго, Р.ши1!ос1ба или Мусор1акта крр., кишечное заболевание у свиней, связанное с инфицированием Е.сой, Ьа^коша т!гасе11и1апк. 8а1топе11а или 8егри1та йуобу1кт-!епае, копытная гниль коров, связанная с инфицированием ЕикоЬас1епит крр., воспаление матки у коров, связанное с инфицированием Е.со11, папиллома кожи у коров, связанная с инфицированием ЕикоЬас1ег1ит песгорйогит или Вас1его1бек побокик, инфекционный конъюктивит, связанный с инфицированием Могахе11а ЬоЛк; преждевременные роды у коров, связанные с инвазией простейшими (т. е. неоспорами); инфекции мочеполовых путей у собак и кошек, связанные с инфицированием Е.Сой, инфекции мягких тканей и кожи у собак и кошек, связанные с инфицированием 81арй.ер1бегт1б1к., 81арй.т!егтеб1к соасцбаке пед. 81арй. или Р.тийоаба, и зубные инфекции и инфекции ротовой полости у собак и кошек, вызванные инфицированием А1са11депек крр., Вас1егснбек крр., С1ок1пбшт крр., Еп!егоЬас1ег крр., ЕиЬас1егтт, Рер1ок1гер1ососсик, Рогрйуготопак или Ргесо1е11а. Другими бактериальными или прото зойными инфекциями, а также нарушениями, связанными с такими инфекциями и поддающимися лечению и предупреждению способом настоящего изобретения, являются инфекции и нарушения, перечисленные в работе ГР. 8аиГогб е1 а1., Тйе 8апГогб 6шбе То АпИ1шсгоЫа1 Тйегару 261й Ебйюп (Апбт1сгоЫа1 Тйегару, 1пс., 1996). Соединения настоящего изобретения могут также оказаться полезными для лечения заболеваний (например, рак, СПИД и атеросклероз), которые обычно не связаны с бактериальными или протозойными инфекциями.
При использовании для лечения бактериальных инфекций или нарушений, связанных с бактериальной инфекцией или раком у млекопитающих, таких как человек, или у рыб или птиц, соединения формулы 1 или формулы 2 могут быть введены отдельно или в форме фармацевтической композиции, содержащей соединение и фармацевтически приемлемый разбавитель или носитель. Такие композиции могут быть введены перорально, например, в виде таблеток или капсул, или парентерально, например путем подкожных или внутримышечных инъекций. Соединения формулы 1 или формулы 2 могут быть также введены ректально в форме суппозиториев. Выбор фармацевтически приемлемого носителя зависит от способа введения. Так, например, лактоза, цитрат натрия и соли фосфорной кислоты вместе с дезинтегрирующими агентами (такими как крахмал) и смазывающими агентами (такими как стеарат магния, лаурилсульфат натрия и тальк) могут быть использованы в качестве фармацевтически приемлемого носителя в таблетках. Для исполь зования в капсулах подходящими фармацевтически приемлемыми носителями являются лактоза и высокомолекулярные полиэтиленгликоли (например имеющие молекулярную массу от 2000 до 4000). Для парентерального введения могут быть получены стерильные растворы или суспензии, в которых фармацевтически приемлемый носитель является водным (например, вода, изотонический физиологический раствор или изотоническая декстроза) или безводным (например, жирные масла растительного происхождения, такие как масло из семян хлопчатника или арахисовое масло; масла полиолов, такие как глицерин или пропиленгликоль).
При использовании ίη νίνο для лечения бактериальной инфекции или состояний, связанных с бактериальными инфекциями у млекопитающих, или для лечения различных видов рака у человека (в частности, немелкоклеточного рака легких) и у других млекопитающих, таких как собаки, путем перорального или парентерального введения лекарственного средства, обычная доза этого лекарственного средства может варьироваться от 0,1 до 100 мг/кг массы тела, а в частности 0,5-25 мг/кг массы тела, и может быть введена в виде одной дозы или в виде раздельных доз.
Если это не оговорено особо, используемое в настоящем описании понятие фармацевтически приемлемые соли означает соли кислотных или основных групп, которые могут присутствовать в соединениях настоящего изобретения. Соединения настоящего изобретения, которые по своей природе являются основными, способны образовывать широкий ряд солей с различными неорганическими или органическими кислотами. Кислотами, которые могут быть использованы для получения фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей таких основных соединений, являются кислоты, которые образуют нетоксические кислотноаддитивные соли, т.е. соли, содержащие фармацевтически приемлемые анионы, такие как гидрохлорид, гидробромид, гидроиодид, нитрат, сульфат, бисульфат, фосфат, кислый фосфат, изоникотинат, ацетат, лактат, салицилат, цитрат, кислый цитрат, тартрат, пантотенат, битартрат, аскорбат, сукцинат, малеат, гентизинат, фумарат, глюконат, глюкаронат, сахарат, формат, бензоат, глутамат, метансульфонат, этансульфонат, бензолсульфонат, п-толуолсульфонат и памоат [т.е. 1,1'-метилен-бис-(2-гидрокси-3нафтоат)].
Соединения настоящего изобретения, которые по своей природе являются кислотными, способны образовывать основные соли с различными фармакологически приемлемыми катионами. Примерами таких солей являются соли щелочных металлов или щелочно-земельных металлов, а в частности кальциевые, магниевые, натриевые и калиевые соли соединений настоящего изобретения.
Некоторые соединения настоящего изобретения могут иметь асимметрические центры, а поэтому они могут существовать в виде различных энантиомерных и диастереомерных форм. Настоящее изобретение относится к использованию оптических изомеров и стереоизомеров соединений настоящего изобретения и их смесей, а также ко всем фармацевтическим композициям и способам лечения, в которых могут быть использованы эти оптические изомеры или стереоизомеры.
Настоящее изобретение относится к соединениям, описанным в настоящей заявке, и к их фармацевтически приемлемым солям, где один или несколько атомов водорода, углерода и других атомов заменены их изотопами. Такие соединения могут быть использованы в экспериментах и в качестве диагностических средств при фармокинетических исследованиях метаболизма и в анализах на связывание.
Соединения настоящего изобретения получают ферментацией нетрансформированных или трансформированных микроорганизмов, способных продуцировать эритромицины, включая, но не ограничиваясь ими, такие виды, как 8ассйагоро1у5рога 5р., 81гер1ошусе5 дг5еор1апи5, №гсагб1а 5р.. Мкгошопокрога 5р., Лг11юЬас1ег 5р. и 81гер1ошусе5 ап11Ью11си5, но за исключением 8.соейсо1ог. Особенно подходящими для этих целей являются нетрансформированные и трансформированные штаммы 8ассйагоро1у5рога егуИгаеа, например ИККЬ 2338, 18643, 21484. Особенно предпочтительными трансформированными штаммами являются штаммы, в которых модуль загрузки эритромицина был заменен модулем загрузки, происходящим от продуцента авермектина, 81гер1ошусе5 ауегшй11115 или от продуцента рапамицина, 81гер1ошусе5 Йудго5сор1си5. Предпочтительный способ продуцирования соединений настоящего изобретения предусматривает ферментацию соответствующего микроорганизма в присутствии соответствующей карбоновой кислоты формулы К.1СООН, где К.1 является таким, как был ранее определен в формулах 1 или 2, или ее соли, сложного эфира (особенно предпочтительно сложного тиоэфира Ν-ацетилцистамина) или амида, или их окисленных предшественников. Кислоту или ее производное добавляют в ферментер во время инокуляции, либо через определенные интервалы времени в процессе ферментации. Контроль за продуцированием соединений настоящего изобретения может быть осуществлен путем отбора образцов из ферментера, экстракции органическим растворителем и последующей идентификации соединений настоящего изобретения с помощью хроматографии, например жидкостной хроматографии высокого давления. При этом инкубирование продолжают до тех пор, пока выход со единения формулы 1 или 2 не будет максимальным, обычно в течение 4-10 дней. Предпочтительное количество карбоновой кислоты или ее производного при каждом добавлении составляет от 0,05 до 4,0 г/л. Наилучшие выходы соединений формулы 1 или 2 обычно получают путем постепенного добавления кислоты или ее производного в смесь для ферментации, например путем ежедневного добавления в течение нескольких дней. Средой, используемой для ферментации, может быть стандартная комплексная среда, содержащая усвояемые источники углерода, азота и микроэлементов.
Подходящие и предпочтительные способы культивирования нетрансформированных и генетически сконструированных эритромицинпродуцирующих клеток, а также подходящие и предпочтительные способы выделения, идентификации и практического применения соединений формулы 1 или 2 более подробно описаны в примерах.
Краткое описание чертежей
Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения описаны со ссылками на прилагаемые к настоящему изобретению чертежи, где на фиг. 1 представлены химические формулы трех известных поликетидов;
на фиг. 2а представлена диаграмма, иллюстрирующая действие 6-дезоксиэритронолидсинтазы В (ΌΕΒ8); РК8, продуцирующей 6дезоксиэритронолид В (6-ΌΕΒ), предшественник эритромицина А;
на фиг. 2Ь показан пост-РК8-биосинтез эритромицинов, включающий превращение 6ΌΕΒ в эритромицин А;
на фиг. 3 а и 3Ь представлены диаграммы, иллюстрирующие конструирование плазмиды рЮ1;
на фиг. 4а, 4Ь и 4с представлены диаграммы, иллюстрирующие конструирование плазмиды ρΝΏδΘ;
на фиг. 5 представлена диаграмма, иллюстрирующая конструирование плазмиды рАУЪП;
на фиг. 6 проиллюстрирована интеграция плазмиды рАУЪП в геном УегуОнаеа ΝΚΚΕ2338;
на фиг. 7 представлена диаграмма, иллюстрирующая биосинтез рапамицина;
на фиг. 8 представлена диаграмма, иллюстрирующая конструирование плазмиды рМО6;
на фиг. 9 представлена диаграмма, иллюстрирующая конструирование плазмиды рСЖ26;
на фиг. 10 представлена диаграмма, иллюстрирующая конструирование плазмиды рСАТХ;
на фиг. 11 представлена диаграмма, иллюстрирующая конструирование плазмиды рСАТ12;
на фиг. 12 представлена диаграмма, иллюстрирующая конструирование плазмиды рС!К49.
Подробное описание изобретения
Широкий ряд исходных звеньев, обычно используемых в модуле загрузки ауг, был исчерпывающе определен в предшествующих исследованиях (например, в Европейских патентных заявках 0214731, 0350187, 0317148, которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки). Поэтому необходимо отметить, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными деталями представленных примеров, которые просто служат для подтверждения эффективности модуля аугзагрузки. Кроме того, примеры использования конструкций рЮ1 или рХЛ30 ясно указывают на способность асО-промотора и его соответствующего гена-активатора асШ-огГ 4 усиливать экспрессию новых соединений настоящего изобретения при соединении с модулем аугзагрузки. Из этих примеров также очевидно, что ^трансформированные штаммы 8ассйагоро1узрога егуШгаеа также способны легко включать экзогенно введенные субстраты с образованием новых эритромициновых поликетидов. Следовательно, для каждого специалиста также очевидно, что конкретные новые соединения настоящего изобретения могут быть легко получены путем отбора соответствующего эритромицин-продуцирующего штамма (необязательно с включением в нужный штамм плазмиды рЮ1 или рХЛ30) и добавления в среду ферментации соответствующего исходного звена. Таким образом, 6-дезоксиэритромициновые и 6,12-дидезоксиэритромициновые производные настоящего изобретения могут быть легко получены с использованием 8ассйагоро1узрога егуФгаеа ΝΒΚΕ 18643 или ΝΒΚΕ 21484, как указано в патенте США 5141926 и XVО 97/06266. Аналогичным образом штаммы 8ассйагоро1узрога егуШгаеа, описанные XVеЬе^ е1 а1., в ГВас1егю1., 164:425-433, 1991, могут быть также легко использованы для получения нужных новых аналогов настоящего изобретения. Так, например, штамм И^24 (необязательно трансформированный плазмидами рЮ1 или рХЛ30) может быть использован для получения новых аналогов эритронолида В.
УФ-спектры были получены с использованием диодно-матричного спектрофотометра НеМей-Раскагб 1090М. Все ЯМР-спектры, если это не оговорено особо, были получены в СОС13 на спектрометре Уапап Иийу 500 МГц, а положения пиков выражены в миллионных долях (мл.д.), где в качестве стандарта был использован тетраметилсилан. Сдвиги пиков обозначены следующим образом: с(з) - синглет; д(б) - дублет; т(1) - триплет; кв.(с.|) - квартет; м(т) - мультиплет; шир.(Ьг) - широкий. Число атомов, указанных в ЯМР-структурах, не является репрезентативным для стандартной номенклатуры, но коррелирует с ЯМР-данными для конкретного примера. ЖХВД-МС-данные были получены с использованием жидкостного хроматографа Не\\!е11-Раскагй 1090М, подсоединенного к масс-спектрометру УС ΡΙαΙίοπη II, снабженному источником АПХИ (метод А) или с использованием жидкостного хроматографа Не\\!е11РаскагС 1050, подсоединенного к массспектрометру УС ΡΙαΙίοπη II, снабженному источником АПХИ (метод В и метод С).
ЖХВД-метод А:
Колонка Весктап иИгазрЕеге (Ультрасфер): 5 мкм ОГ8 4 мм х 25 см
Поток 0,85 мл/мин
Подвижная фаза Градиент: ацетоннтрнл:0,05М ацетат аммония (28:72) ацетоннтрнл:0,05М ацетат аммония (50:50), в течение 22 мин; сохранение ацетонитрил:0,05М ацетат аммония (50:50) в течение 22-25 мин; возвращение к исходным условиям, 25-30
мин
ЖХВД-метод В:
Колонка \[е1аС11ет Гп1ег811 (Интерсил): 5 мкм
С8 3 мм х 150 мм
Поток 0,5 мл/мин
Подвижная фаза Изократный раствор: метанол:0,05М
ацетат аммония с 0, кислотой (60:40) 1% трифторуксусной
ЖХВД-метод С: Колонка ^а!ег§ 8утте!гу: 5 мкм
С18 2,1 мм х 150 мм
Поток 0,22 мл/мин
Подвижная фаза Градиент: ацетонитрил:0,05М ацетат аммония (30:70) ацетонитрил:0,05М ацетат аммония (50:50), в течение 30 мин
Были использованы следующие среды и
растворы:
Сахарозо-сукцинатная среда:
Сахароза 69 г
КЫО3 10 г
Янтарная кислота 2,36 г
КН2РО4 2,7 г
М§8О4 7 Н2О 1,2 г
ХпСЕ 10 мг
МпС12 4 Н2О 6,2 мг
СиС12 2 Н2О 0,53 иг
СоС12 0,55 мг
Ге8О4 7 Н2О 2,5 мг
СаС12 2 Н2О 38 мг
Вода 1111111-(,) до 1,0 л
КОН рН до 6-6,4
Среда с водопроводной водой
Глюкоза 5 г
Триптон 5 г
Дрожжевой экстракт 2,5 г
ЕБТА 36 мг
Водопроводная вода до 1,0 л
КОН до рН 7,1
Среда ЕКУ-Р Декстроза 50 г/ л
Мука Ыийтзоу™ 30 г/ л
(ЫН4)28О4 3 г/ л
ЫаС1 5 г/ л
СаСО3 6 г/ л
Доведение рН до 7,0
Мука Ыи1п8оу™ поставляется фирмой Впйзк Агкайу Сгоир, 8кег1оп КоасЕ Мапске81ег, ϋΚ.
Настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1а. Конструирование плазмиды рЮ1.
Плазмида рЮ1 состоит из 8СР2*производной плазмиды, содержащей гибридный ген РК8 Типа I, включающий вместо модуля егу-загрузки модуль аут-загрузки, первые два модуля наращивания егу-РК8 и тиоэстеразы егуРК8. Эту плазмиду конструировали через несколько промежуточных плазмид следующим образом (фиг. 3).
(ί) Конструирование плазмиды рУЕ3.4.
Плазмиду рУЕ1446, которая содержала часть генов авермектин(ауг)-продуцнрующей РК8, получали из штамма Е.сой АТСС 68250 (МасЫей, БЛ. е1 а1., Апп.Ы.¥.Асаб.8с1. (1994) 721:123-132). Плазмиду рУЕ1446 гидролизовали ферментом ВатШ и 7,6 т.п.о.-фрагмент между координатами 32,15 и 3,40 (МасЫей, Б.1. е1 а1., Апп.Ы.У.Асаб.Зск (1994) 721:123-132) очищали с помощью гель-электрофореза и снова восстанавливали в кольцевую структуру. Смесь содержала нужную плазмиду рУЕ3,4, которая была выделена после трансформации штамма ТС1 гесО Е.сой (сконструированного Бт.Р.Ойует, БерЕ оГ Сепейск, и. СатЬпбде: Ко1обпет, К. е1 а1., 1.Вас1епо1 (1985) 163:1060-1066; Т.СФкоп, Рй.Б. Тйе818, и. СатЬпйде, 1985.
(й) Конструирование плазмиды рЫС012.
Плазмиду рВК25 (Веуй1, Б.Т е1 а1., ЕитЛ.Вюсйет. (1992) 204:39-49) гидролизовали ферментом Ысо! и 12 т.п.о.-фрагмент восстанавливали по концам и лигировали в плазмиду рИС18, которая была линеаризована ферментом 8таТ Лигированную смесь трансформировали в штамм ТС1 гесО Е.сой, и отдельные колонии тестировали на содержание плазмиды. Нужную плазмиду рЫС012 идентифицировали по ее рестрикционной карте.
(ΐϊϊ) Конструирование плазмиды рСКаЬс.
Плазмиду рСКаЬс (фиг. 3) конструировали следующим образом. Проводили три отдельные реакции РСК: в первой реакции 20 пмоль каждого из синтетических олигонуклеотидов А1 (5'СТС СТС ССТ ССС ТТТ ССС-3') и А2 (5'-ССС ССС ААА ААС САА САС ТАС ТСС ССС ССА ССС ССС-3') использовали для амплификации 1,0 т.п.о.-продукта из 100 нг рЫС012матрицы. РСЯ-продукт восстанавливали по концам, фосфорилировали и клонировали в 8таI -разрезанную плазмиду рИС18 с получением плазмиды рСКа. Во второй реакции 20 пмоль каждого из синтетических олигонуклеотидов С1 (5'-САС ССС САС ССС ССС ССА-3') и С2 (5'-С САА ССС СТА ССС СТС СТС ССС АТС СССТ-3') использовали для амплификации 1,5 т.п.о.-продукта из 100 нг рНСО 12-матрицы. РСЯ-продукт восстанавливали по концам, фосфорилировали и клонировали в 8та!разрезанную плазмиду рИС18 с получением плазмиды рСКс. В третьей реакции 20 пмоль каждого из синтетических олигонуклеотидов В1 (5'-ОТО ОСС С66 ССО ТСС ССС ССА СТА СТС ТТС ОТТ ТТТ-3') и В2 (5'-ААС АОС ТАО СОО ТТС ОТС СОС СОС ТОС СОТ ОСС-3') использовали для амплификации 1,4 т.п.о.продукта из 100 нг рУЕ3.4-матрицы. РСКпродукт восстанавливали по концам, фосфорилировали и клонировали в 8та1-разрезанную плазмиду рИС18 с получением плазмиды рСКЬ.
Плазмиду рСКа гидролизовали ферментами ΗίηάΙΙΙ и 8ре1 и 1,0 т.п.о.-вставку лигировали с плазмидой рСКЬ. предварительно гидролизованной ферментами ΗίηάΙΙΙ и 8ре1, в результате чего получали плазмиду рСКаЬ. Плазмиду рСКс гидролизовали ферментами ΝΙκΙ и ЕсоК1. и 1.5 т.п.о.-вставку лигировали с плазмидой рСКаЬ. предварительно гидролизованной ферментами ΝΙκΙ и ЕсоК1. в результате чего получали плазмиду рСКаЬс.
(ίν) Конструирование плазмиды рМЛЕАУЕТЕ.
Плазмиду рСКаЬс гидролизовали ферментами ΜίάΙ и 8ΠΙ и ДНК-фрагмент, содержащий домен загрузки ауг-РК8. очищали с помощью гель-электрофореза и лигировали с плазмидой р№ГЕР2. которая была гидролизована ферментами ΜίάΙ и δίίΙ. и более крупный фрагмент очищали с помощью гель-электрофореза. Лигированную смесь трансформировали в штамм ТО1 гесО Е.соН, и отдельные колонии тестировали на содержание плазмиды. Нужную плазмиду рNЕ\VΑУЕТЕ (13 т.п.о.) идентифицировали по ее рестрикционной карте.
(ν) Конструирование плазмиды рКМ52.
Плазмида рКМ52 является производной плазмиды рКМ5 (МсПаше1. К. е! а1.. 8с1епсе. (1993) 262:1546-1550). Плазмиду рКМ5 сначала линеаризовали путем гидролиза ферментом ^еЕ восстанавливали по концам, а затем повторно лигировали с получением плазмиды рКМ51. Плазмиду рРМ51 разрезали ферментами Рас1 и ΝκίΙ и крупный РасЕЖН-фрагмент выделяли и лигировали в короткий двухцепочечный олигонуклеотидный линкер, содержащий Ыйе1-сайт и сконструированный из синтетических олигонуклеотидов 5'-ТААССАССАСАСАТАТССА-3' и 5'-ТААТТССТССТОТОТАТ-3'. которые были гибридизированы вместе. Лигированную смесь трансформировали в штамм ТО1 гесО Е.соН и выделенные колонии скринировали на содержание в них указанной плазмиды. Нужную плазмиду (19.6 т.п.о.) идентифицировали по ее рестрикционной карте и обозначили рРМ52.
(νί) Конструирование плазмиды рЮ1.
Плазмиду рNЕ\VΑУЕТЕ гидролизовали ферментами NάеI и ΧΗ;·1Ι и вставку очищали путем осаждения в градиенте сахарозы
Очищенную вставку лигировали в плазмиду рКМ52 (19.6 т.п.о.), которая была гидролизована ферментами NάеI и ХЬаф и полученный вектор очищали путем осаждения в градиенте сахарозы. Лигированную смесь использовали для трансформации Е.соН, и отдельные колонии тестировали на содержание в них нужной плазмиды. Нужную плазмиду рЮ1 идентифицировали по ее рестрикционной карте.
Пример 1Ь. Конструирование плазмиды рНЭ30.
Плазмида рНЭ30 состоит из 8СР2*производной плазмиды, содержащей гибридный ген РК8 Типа Ι. включающий вместо модуля егу-загрузки модуль аут-загрузки, первые два модуля наращивания ету-РК8 и тиоэстеразы егуРК8. Эту плазмиду конструировали через несколько промежуточных плазмид следующим образом (фиг. 4).
(ί) Конструирование рекомбинантного вектора рС1К101.
рС1К101 (фиг. 4) представляет собой челночную плазмиду, сконструированную в целях ее использования для экспрессии генов РК8 в актиномицетах. Эта плазмида включает репликон Со1Е1. который позволяет ей реплицироваться в Е.соН, низкокопийный репликон 8СР2* 81гер1отусе5 (В1ЬЬ. М.1. & Нор\\оой. Ό.Α. 1.Оеп. МютоЬю1.. (1981) 126:427) и ген-активатор асШогГ 4 от асЕкластера, который активирует транскрипцию от асЕпромотора во время перехода от фазы роста в стационарную фазу в вегетативном мицелии. Эту плазмиду конструировали следующим образом: приблизительно 970 п.о.ДНК-фрагмент из плазмиды рМЕ1015 (содержащей ген-активатор асШ-отГ 4) (ЕегнапйехМогепо. М.А. е! а1.. Се11 (1991) 66:769-780) амплифицировали с помощью РСК с использованием в качестве праймеров олигонуклеотиды 5'АСТ АОТ ССА СТО ССТ СТС ООТ ААА АТС САО С-3' и 5'-СТТ ААО АОО ООС ТСС АСС ОСО ТТС АСО ОАС 3'. которые также вводят фланкирующие рестрикционные 8реЕ и АГШсайты. Этот фрагмент клонировали в восстановленный по концам АаШ-сайт плазмиды рИС19 и получали плазмиду рС1К18. ДНК-фрагмент, размером приблизительно в 215 п.о., амплифицировали из плазмиды рМУ400 (которая содержит разнонаправленную промоторную пару РасНП/РасН) (Рагго. У. е! а1.. ШсЕАайк Кек.. (1991) 19:2623-2627) с использованием в качестве праймеров синтетических олигонуклеотидов 5'-АСА ТТС ТСТ АСО ССТ ААО ТОТ ТСС ССТ ССС ТОС СТС-3' и 5'-ОТО АТО ТАТ ОСТ САТ АТО ТОТ ССТ ССТ ТАА ТТА АТС ОАТ ОСО ТТС ОТС СОО ТО-3'. которые также вводят фланкирующие ШеЕ и АГШ-сайты. РСКпродукт гидролизовали ферментами NάеI и АГШ и лигировали с плазмидой рС1К18. предварительно разрезанной ферментами NάеI и АГШ. в результате чего получали плазмиду рС1К19. 1.1 т.п.о.-НшйШ-8рЫ-фрагмент, содержащий ген Ϊ8Γ. несущий резистентность к тиострептону, получали с помощью РСК. где в качестве матрицы использовали плазмиду рП922 (Ьуй1а1е. Ό.Ε е! а1.. Оепе (1985) 35:223-235). а в качестве праймеров использовали олигонуклеотиды 5'ТСА АСА ССА АСС ТТС ССА САС АСС САС ТТС ССС-3' и 5'-САС АСА ТТС САТ ССС СТТ ССА ССА СТС ССС ССС ССС-3', которые также вводят фланкирующие ΗίηάΙΙΙ- и 8рЫсайты. РСВ-продукт гидролизовали ферментами ΗίηάΙΙΙ и 8рЫ и лигировали с плазмидой рС1К19, разрезанной ферментами ΗίηάΙΙΙ и 8рЫ, в результате чего получали плазмиду рС1К24. Плазмиду рП922 гидролизовали ферментами ВатШ и 8Ш, и фрагмент, содержащий часть локуса фертильности и область начала репликации (ЕлЛ|а1е, Ό.Ε е! а1., Сепе (1985) 35:223-235), лигировали в рИС19, гидролизованную ферментами ВатШ и 8δίΙ, в результате чего получали бифункциональную плазмиду рС1К16 (14,7 т.п.о.). Плазмиду рС1К24 гидролизовали ферментами 8аП и 8рЫ, а затем два полученных после гидролиза крупных фрагмента очищали с помощью гель-электрофореза и объединяли путем четырехкомпонентного лигирования с плазмидой рС1К16, которая была гидролизована ферментами ΧΙιοΙ и 8рЫ. Лигированную смесь использовали для трансформации 81гер1отусе5 Ιίνίάίΐηδ. и полученные колонии отбирали в присутствии тиострептона. Одна колония обнаруживала содержание нужной плазмиды рС1К101 (приблизительно 12,4 т.п.о.), идентифицированной по ее рестрикционной карте.
(ίί) Конструирование плазмиды рС1К29.
Конструирование плазмиды рС1К29 проиллюстрировано на фиг. 4. 1,1-т.п.ο.-Η^ηάIIIХйо1-фрагмент, содержащий ген 15Г, который сообщает резистентность к тиострептону, получали с помощью РСК, где в качестве матрицы использовали плазмиду рП922, а в качестве праймеров использовали олигонуклеотиды 5'ТСА АСА ССА АСС ТТС ССА САС АСС САС САС ТТС ССС-3' и 5'-САС АСА ТТС ТСС АСС СТТ ССА ССА СТС ССС ССС ССС-3', которые также вводят фланкирующие ΗίηάΙΙΙ- и Хйо1-сайты. РСК-продукт гидролизовали ферментами ΗίηάΙΙΙ и ΧΙιοΙ и лигировали с плазмидой рС1К16, которая была гидролизована ферментами ΗίηάΙΙΙ и ΧΙιοΙ, в результате чего получали плазмиду рС1К25. Плазмиду рС1К25 гидролизовали ферментами ΗίηάΙΙΙ и 8рЫ и лигировали с плазмидой рС1К19, которая была гидролизована ферментами ΗίηάΙΙΙ и 8рЫ, в результате чего продуцировали нужную плазмиду рС1К29 (приблизительно 12,4 т.п.о.), идентифицированную по ее рестрикционной карте. Плазмида рС1К29 отличалась от плазмиды рС1К 101 ориентацией гена йт, гена асШ-οτί 4 и асЙ/асЙПпромотора по отношению к области начала репликации, производной от 8СР2*.
(ΐϊϊ) Конструирование плазмиды рХЭ30.
Плазмиду рХЕ\У АУЕТЕ гидролизовали ферментами NάеI и ХЬаЕ и вставку очищали осаждением в градиенте сахарозы. Очищенную вставку лигировали в плазмиду рС1К18 (приблизительно 12,4 т.п.о.), которая была гидроли зована ферментами NάеI и ХЬаЕ и полученный вектор очищали осаждением в градиенте сахарозы. Смесь, полученную в результате лигирования, использовали для трансформации Е.сой, и индивидуальные колонии тестировали на содержание плазмиды. Нужную плазмиду рХЭ30 идентифицировали по ее рестрикционной карте.
Пример 1с. Конструирование плазмиды рС1В26.
Плазмида рМО6 (фиг. 8) вначале была сконструирована с использованием нескольких стадий:
(ί) Конструирование плазмиды рМО1.
ДНК-сегмент (приблизительно 1,3 т. п. о.) гена егуА1 8.ету1йтаеа, занимающий место от нуклеотида 1948 до нуклеотида 3273 егуА1 (Ωοηηάίο 8. е! а1., 8с1еисе (1991) 252:675-679), амплифицировали с помощью РСК с использованием в качестве праймеров синтетических олигонуклеотидов 5'-САТ ССТ ССА ССТ СТС СТС ССА АСТ-3' и 5'-САА ССС ТСС ССА ССС ААС АСС ААС АССС-3' и плазмид рЫТЕР2 в качестве матрицы. РСК-продукт восстанавливали по концам и лигировали с плазмидой рИС18, которая была линеаризована путем гидролиза ферментом 8таI, а затем обработана щелочной фосфатазой. Смесь, полученную в результате лигирования, использовали для трансформации штамма ТС1 гес0 Е.сой, и индивидуальные колонии тестировали на содержание в них плазмиды. Нужную плазмиду рМО1 (3,9 т.п.о.), в которой 81и1-сайт, фланкирующий вставку, граничит с ΗίηάΙΙΙ-сайтом в полилинкере, идентифицировали по ее рестрикционной карте.
(ίί) Конструирование плазмиды рМО2.
ДНК-сегмент (приблизительно 0,85 т.п.о.) гена гарА 81герЮтусе5 йудгоксоркик, занимающий место от нуклеотида 1643 до нуклеотида 2486 гарА, амплифицировали с помощью РСК, где в качестве праймеров использовали синтетические олигонуклеотиды 5'-ТТС ССТ ССС САС ССС ТСС САС СОТ 0-3' и 5'-САС СТА ССА ССС ССС АСС АСТ ССАС-3', а в качестве матрицы использовали ДНК от рекомбинантного бактериофага λ- 1Е (8с11\уеске Т. е! а1., Ргос. Ка11.Лсаа.8с1. И8А, (1995) 92:7839-7843). РСКпродукт восстанавливали по концам и лигировали с плазмидой рИС18, которая была линеаризована путем гидролиза ферментом 8таф а затем обработана щелочной фосфатазой. Смесь, полученную в результате лигирования, использовали для трансформации штамма ТС1 гес0 Е.сой, и индивидуальные колонии тестировали на содержание в них плазмиды. Нужную плазмиду рМО2 (3,5 т.п.о.) идентифицировали по ее рестрикционной карте.
(ш) Конструирование плазмиды рМО3.
ДНК-сегмент (приблизительно 1,7 т.п.о.) гена егуА1 8.ету1йтаеа, занимающий место от нуклеотида 4128 до нуклеотида 5928 егуА1, амплифицировали с помощью РСК, где в качестве праймеров использовали синтетические олигонуклеотиды 5'-ТОО ССА ООО АОТ СОО ТСС АСС ТАО ОСА-3' и 5'-ОСС ОАС АОС ОАО ТСО АСО АОТ Т-3', а в качестве матрицы использовали плазмиду рХТЕР2. РСК-продукт восстанавливали по концам и лигировали с плазмидой риС18, которая была линеаризована путем гидролиза ферментом 8ша1, а затем обработана щелочной фосфатазой. Смесь, полученную в результате лигирования, использовали для трансформации штамма ТО1 гес0 Е.еоН, и индивидуальные колонии тестировали на содержание в них плазмиды. Нужную плазмиду рМО3 (4,4 т.п.о.), в которой Ва11- и АугП-сайты граничат с НтбШ-сайтом полилинкера, идентифицировали по ее рестрикционной карте.
(ιν) Конструирование плазмиды рМО4.
Плазмиду рМО1 гидролизовали ферментами ΗΐηάΙΙΙ и Ва11, и 1,3 т.п.о.-вставку лигировали с плазмидой рМО3, которая была гидролизована ферментами ΗΐηάΙΙΙ и Ва11. Смесь, полученную в результате лигирования, использовали для трансформации штамма ТО1 гесО Е.еоН, и индивидуальные колонии тестировали на содержание плазмиды. Нужную плазмиду рМО4 (5,6 т.п.о.) идентифицировали по ее рестрикционной карте.
(ν) Конструирование плазмиды рМО5.
Плазмиду рМО4 гидролизовали ферментом 8ΐπΙ, и 3,0 т.п.о.-вставку лигировали с плазмидой ρΝΓΕΡ2, которая была гидролизована ферментом 8ΐπΙ и очищена с помощью электрофореза для удаления 3,8 т.п.о.-вставки. Смесь, полученную в результате лигирования, использовали для трансформации штамма ТО1 гес0 Е.соН, и индивидуальные колонии тестировали на содержание в них плазмиды. Нужную плазмиду рМО5 (12,8 т.п.о.) идентифицировали по ее рестрикционной карте.
(νι) Конструирование плазмиды рМО6.
Плазмиду рМО2 гидролизовали ферментами ВаП и Αν^II, и вставку лигировали с плазмидой рМО5, которая была гидролизована ферментами ВаП и Αν^Π. Смесь, полученную в результате лигирования, использовали для трансформации штамма ТО1 гесО Е.соН, и индивидуальные колонии тестировали на содержание плазмиды. Нужную плазмиду рМО6 (13,5 т.п.о.) идентифицировали по ее рестрикционной карте.
(νΐΐ) Конструирование плазмиды рСЖ26.
Плазмида рСЖ26 представляет собой плазмиду, полученную на основе 8СР2* и содержащую ген РК8, включающий модуль егузагрузки, первый и второй модули наращивания егу-РК8 и тиоэстеразу, обрывающую егу-цепь, за исключением ДНК-сегмента, кодирующего метилмалонил-СоА:АСР-ацилтрансферазу, где первый модуль наращивания специфически заменен на ДНК, кодирующую малонилСоА:АСР-ацилтрансферазу модуля 2 гар-РК8. Эту плазмиду конструировали следующим образом (фиг. 9): плазмиду рМО6 гидролизовали ферментами ΝιΚΙ и ХЫ, а вставку лигировали с плазмидой рСЖ24, которая бьша гидролизована ферментами ΝΈ и ХМ и очищена с помощью гель-электрофореза. Смесь, полученную после лигирования, трансформировали в штамм ТО1 гесО Е.соН, индивидуальные колонии тестировали на содержание плазмиды. Нужную плазмиду рСЖ26 идентифицировали по ее рестрикционной карте.
Пример 11. Конструирование 8.егу4Нгаеа 1С2/рСЖ26 и продуцирование производных ТКЕ
Плазмиду рСЖ26 использовали для трансформации протопластов 1С2 8.егу4Нгаеа. Колонии, резистентные к тиострептону, отбирали на среде К2Т20, содержащей 10 мкг/мл тиострептона. Несколько клонов тестировали на присутствие рСЖ26, интегрированной в хромосому путем Саузерн-блот-гибридизации их геномной ДНК с ЭЮ-меченным геном ЭЕВ81-ТЕ.
Клон с интегрированной копией рСЖ26 культивировали в среде 88М, содержащей 5 мкг/мл тиострептона и оставляли на семь дней при температуре 28-30°С для роста. По истечении этого времени, бульон фильтровали для удаления мицелия, и рН доводили до рН 3. Затем бульон два раза экстрагировали двумя объемами этилацетата и объединенные этилацетатные экстракты промывали равным объемом насыщенного хлорида натрия, сушили над безводным сульфатом натрия и этилацетат удаляли при пониженном давлении, в результате чего получали около 500 мг неочищенного продукта. Было установлено, что этими продуктами являются δ-лактон (28,3К,5К)-2-метил-3,5дигидрокси-н-гексановой кислоты и δ-лактон (28,3К,5К)-2-метил-З,5-дигидрокси-н-гептановой кислоты
Пример 1е. Конструирование 8.егу4Нгаеа ΝΚΚΕ 2338/рСЖ26 и ее использование для продуцирования 14-членных макролидов.
Приблизительно 5 мг ДНК плазмиды рСЖ49 использовали для трансформации протопластов ΝΚΚΕ 2338 8.егу4Нгаеа, в результате чего получали штамм, в хромосому которого была интегрирована плазмида. Из нескольких колоний была получена полная ДНК, которая была проанализирована с помощью Саузернблот-гибридизации для подтверждения интеграции указанной плазмиды в модуль 2 ЕгуА1, в результате чего был получен способ биосинтеза нового макролида. Осуществляли дальнейшие интеграции для получения плазмидных последовательностей. 8.егу4Нгаеа ΝΚΚΕ 2338/рСЖ49 инокулировали в трипсино-соевый бульон, содержащий 5 мг/мл тиострептона и инкубирова ли три дня при 30°С. 100 мл этой посевной культуры использовали для инокуляции 2 л среды, состоящей из сукцината сахарозы и содержащей 5 мг/мл тиострептона в 5 х 2 л колбах, каждая из которых содержала 500 мл среды с 2 пружинами (для облегчения диспергирования) и которые встряхивали при 300 об/мин. После культивирования еще в течение 5 дней культуры центрифугировали и рН супернатанта доводили до рН 9. Затем супернатант три раза экстрагировали равным объемом этилацетата и растворитель удаляли выпариванием. Полученные продукты анализировали с помощью ЖХВД/МС и два макролида идентифицировали как аналоги эритромицина
Пример II'. Конструирование плазмиды рСАТХ.
Плазмида рС-АТХ представляет собой плазмиду, полученную на основе 8СР2* и содержащую ген РК8, включающий модуль егузагрузки, первый и второй модули удлинения егу-РК8 и тиоэстеразу, обрывающую егу-цепь, за исключением ДНК-сегмента, кодирующего метилмалонил-СоА:АСР-ацилтрансферазу, где первый модуль наращивания был специфически заменен ДНК, кодирующей малонил- СоА:АСРацилтрансферазу и взятой из соответствующего кластера генов РК8 типа Ι, клонированного из 81гер1отусез стпашопеп818 АТСС 14513 (продуцента полиэфирного поликетида монензина). Эту плазмиду конструировали через несколько промежуточных плазмид (фиг. 10).
(1) Выделение космиды р8СШО2.
Геномную библиотеку 81гер1ошусез с1ппашопеп818 АТСС 14513 (продуцента монензина) конструировали из фракционированных по размерам 35-45 т.п.о.-8аи3А-фрагментов хромосомной ДНК, лигированной в ВатН1-линеаризованный и обработанный щелочной фосфатазой космидный вектор р^Е15. Смесь, полученную в результате лигирования, упаковывали в λ-частицы с использованием экстрактов для упаковки Ощараск и трансфецировали в штамм ХМ1Ыие Е.соН. Приблизительно 600 колоний этой библиотеки культивировали на поверхности найлоновой мембраны, лизировали и их ДНК перекрестно сшивали с мембраной путем УФ-облучения. После этого мембрану использовали в методах скрининга. Вставку рМО8, содержащую домен кетосинтазы из модуля 2 ΌΕΒ8, метили путем рандомизированного праймирования в присутствии 33Р аАТР и использовали в качестве пробы для ДНКгибридизации. Гибридизацию пробы проводили в течение 16 ч при 68°С в 4,0 х буфере 88С, а затем промывали в течение 1 ч при 68°С в 0,8 х буфере 88С. Три положительных клона выделяли. ДНК вставок от всех трех клонов секвенировали по концам от сайтов праймирования Т3 и Т7, присутствующих в векторе р^Е15. Область, гомологичную доменам кетосинтазы типа I и малонил-СоА:АСР-ацилтрансферазы, идентифицировали в ДНК-последовательности от сайта праймирования Т7 с использованием в качестве матрицы клона 2 (названного р8ШО2). Частичное ДНК-секвенирование домена малонил-СоА:АСР-ацилтрансферазы (обозначенного АТХ) выявило присутствие необычного мотива последовательности в области узнавания соответствующего субстрата, что значительно отличает этот домен от различных ранее описанных доменов малонат- или метилмалонатспецифических СоА:АСР-ацилтрансфераз (Наубоск, 8.Г. е! а1., ГЕВ8 (1995) 374:246-248).
(й) Конструирование плазмиды рМО38.
ДНК-сегмент (приблизительно 0,9 т.п.о.) домена АТХ амплифицировали с помощью РСК, где в качестве праймеров использовали синтетические олигонуклеотиды 5'-СТО ОСС АОО ОСО СОС ААТ ООС СОА ОСАТ- 3' и 5'ССС ТАО ОАО ТСО ССО ОСА ОТС САО СОС ООС ОСС С-3', а в качестве матрицы использовали ДНК, производную от космиды р8СШО2. РСК-продукт восстанавливали по концам и лигировали с плазмидой риС18, которая была линеаризована путем гидролиза ферментом 8та1, а затем обработана щелочной фосфатазой. Смесь, полученную в результате лигирования, использовали для трансформации штамма ТО1 гесО Е.соН, и индивидуальные колонии тестировали на содержание в них плазмиды. Нужную плазмиду рМО38 (3,5 т.п.о.) идентифицировали по ее рестрикционной карте.
(ΐΐΐ) Конструирование плазмиды рМО34.
Плазмида рМО34 представляет собой производную от плазмиды рМО6, содержащую сайт поликлонирования, встроенный после стопкодона инсертированного гена П1-АТ2. Плазмиду рМО6 гидролизовали ферментами ЕсоК1 и НтбШ и гибридизировали с двумя олигонуклеотидными праймерами, образующими двухцепочечную область сайта поликлонирования: 5'-ААТ ТСА ТАА СТА ОТА ООА ООТ СТО ОСС АТС ТАО А-3' и 5'-ТСО ААО АТС ТАС СОО ТСТ ООА ООА ТОА ТСА АТА С-3'. Смесь лигировали и трансформировали в штамм ТО1 гес0 Е.соН. Отдельные колонии тестировали на содержание плазмиды. Нужную плазмиду рМО34 (13,5 т.п.о.) идентифицировали по ее рестрикционной карте.
(ιν) Конструирование плазмиды рМО35.
Плазмида рМО35 представляет собой производную от плазмиды рМО34, содержащую ген ТКЕ8-АТ2 и трансляционно-связанный с ним ген кротонил-СоА-редуктазы, производный от 81гер1отусез соШпиз (^аНасе е! а1.,
Е.Ч.ВюсЕеш., (1995) 233:954-962). Ген кротонилСоА-редуктазы вырезали из плазмиды ρΖΥΒ3 (предоставленной проф. К.ЕеупоИз) в виде Ибе1-ВашН1-фрагмента, который для затупления концов обрабатывали нуклеазой фасоли золотистой и лигировали в плазмиду рМО34, предварительно разрезанную ферментом 8реТ и аналогичным образом затупленную по концам с использованием нуклеазы фасоли золотистой. Смесь, полученную в результате лигирования, использовали для трансформации штамма Т61 гес0 Е.соЕ и индивидуальные колонии тестировали на содержание в них плазмиды. Нужную плазмиду рМО35 (14,2 т.п. о.) с правильной ориентацией гена кротонил-СоА-кеторедуктазы идентифицировали по ее рестрикционной карте.
(ν) Конструирование плазмиды рМО36.
Плазмиду рМО38 гидролизовали ферментами ВаП и ΑνίΠ и вставку лигировали с плазмидой рМО35, которая была гидролизована ферментами ВаП и ΑνίΠ. Смесь лигирования использовали для трансформации штамма Тб 1 гес0 Е.со11 и индивидуальные колонии тестировали на содержание в них плазмиды. Нужную плазмиду рМО36 (13,5 т.п. о.) идентифицировали по ее рестрикционной карте.
(νΐ) Конструирование плазмиды рС-АТХ.
Плазмиду рМО36 гидролизовали ферментами Ж1еЧ и ХЫЧ и вставку лигировали с плазмидой рСЧЕ29, которая была гидролизована ферментами Ж1еЧ и ХЬаТ и очищена с помощью гель-электрофореза. Смесь для лигирования использовали для трансформации штамма ТО1 гес0 Е.со11 и индивидуальные колонии тестировали на содержание в них плазмиды. Нужную плазмиду рС-АТХ идентифицировали по ее рестрикционной карте.
Пример 1д. Конструирование 8.егу1Ьгаеа ЧС2/рС-АТХ и продуцирование производных ТКЕ.
Плазмиду рС-АТХ использовали для трансформации протопластов ЧС2 8.егу1Ьгаеа. Колонии, резистентные к тиострептону, отбирали на среде Е2Т20, содержащей 10 мкг/мл тиострептона. Несколько клонов тестировали на присутствие интегрированной в хромосому плазмиды рС-АТХ путем Саузерн-блотгибридизации их геномной ДНК с ИЮмеченной ДНК, кодирующей ген ИЕВ81-ТЕ.
Клон с интегрированной копией рС-АТХ культивировали в среде 88М, содержащей 5 мкг/мл тиострептона, и оставляли на семь дней для роста при температуре 28-3 0°С. По истечении этого времени бульон фильтровали для удаления мицелия и рН доводили до 3. Затем бульон два раза экстрагировали двумя объемами этилацетата и объединенные этилацетатные экстракты промывали равным объемом насыщенного хлорида натрия, сушили безводным сульфатом натрия и этилацетат удаляли при пониженном давлении, в результате чего получали около 500 мг неочищенного продукта. С помощью газовой хроматографии, массспектрометрии и ЯМР было установлено, что этими продуктами являются δ-лактон (28,3Ε,48,5Ε)-2 -метил-4 -этил-3,5 - дигидрокси-нгексановой кислоты и δ-лактон (28, 3Ε, 48, 5Ε)2-метил-4-этил-3,5-дигидрокси-н-гептановой кислоты
Пример 111. Конструирование 8.егу1Ьгаеа ΝΙΕΕ. 2338/рС-АТХ и ее использование для продуцирования 1 4-членных макролидов.
Приблизительно 5 мг ДНК рС-АТХ использовали для трансформации протопластов ΝΕΡΗ 2338 8.егу1Ьгаеа, в результате чего получали штамм, в хромосому которого была интегрирована эта плазмида. Из нескольких колоний была получена полная ДНК, которая была проанализирована с помощью Саузерн-блотгибридизации для подтверждения интеграции указанной плазмиды в модуль 2 ЕгуА1, в результате чего был получен способ биосинтеза новых макролидов. Проводили дальнейшие интеграции для получения повторяющихся плазмидных последовательностей. 8.егу1Ьгаеа ΝΕΕΕ
2338/рС-АТХ инокулировали в трипсиносоевый бульон, содержащий 5 мг/мл тиострептона, и инкубировали три дня при 30°С. 100 мл этой посевной культуры использовали для инокуляции 2 л среды, состоящей из сукцината сахарозы и содержащей 5 мг/мл тиострептона в 5 х 2 л колбах, каждая из которой содержала 500 мл среды с 2 пружинами (для облегчения диспергирования) и которые встряхивали при 300 об/мин. После культивирования еще в течение 5 дней культуры центрифугировали и рН супернатанта доводили до 9. Затем супернатант три раза экстрагировали равным объемом этилацетата и растворитель удаляли выпариванием. Полученные продукты анализировали с помощью ЖХВД/МС и два макролидных продукта
Пример 11. Конструирование плазмиды рС-АТ12.
Плазмида рС-АТ1 2 представляет собой плазмиду, полученную на основе 8СР2* и содержащую ген РК8, включающий модуль егузагрузки, первый и второй модули наращивания егу-РК8 и тиоэстеразы, обрывающей егу-цепь, за исключением ДНК-сегмента, кодирующего метилмалонил-СоА:АСР-ацилтрансферазу, где второй модуль наращивания специфически заменен ДНК, кодирующей малонил-СоА:АСРацилтрансферазу модуля 2 гар РК8. Эту плазмиду конструировали через несколько промежуточных плазмид (фиг. 11).
(ΐ) Конструирование плазмиды рМО25.
ДНК-сегмент (приблизительно 1,0 т.п.о.) гена егуА1 8.егу1йгаеа, занимающий место от нуклеотида 6696 до нуклеотида 7707 егуА1 (ОопаФо 8. е! а1., 8с1епсе (1991) 252:675-679), амплифицировали с помощью РСК, где в качестве праймеров использовали синтетические олигонуклеотиды 5'-66С 666 ТСС 66А 66Т 6ТТ САС С6А 6ТТ-3' и 5'-АСС ТТ6 6СС А66 6АА 6АС 6АА САС Т6А-3', а в качестве матрицы плазмиду рЫТЕр2. РСВ-продукт восстанавливали по концам и лигировали с плазмидой рИС18, которая была линеаризована путем гидролиза ферментом 8та1, а затем обработана щелочной фосфатазой. Смесь, полученную в результате лигирования, использовали для трансформации штамма Т61 гес0 Е.со11 и индивидуальные колонии тестировали на содержание в них плазмиды. Нужную плазмиду рМО25 (3,6 т.п.о.), в которой 81и1-сайт. фланкирующий вставку, граничит с ΗίηάΙΙΙ-сайтом в полилинкере, идентифицировали по ее рестрикционной карте.
(ίί) Конструирование плазмиды рМО26.
ДНК-сегмент (приблизительно 0,6 т.п.о.) гена егуА1 8.егу!йгаеа, занимающий место от нуклеотида 8660 до нуклеотида 9258 егуА1, амплифицировали с помощью РСК с использованием в качестве праймеров синтетические олигонуклеотиды 5'-ТСС ТА6 6СС 666 СС6 6АС Т66 ТС6 АСС Т6С С66 6ТТ-3' и 5'ААА САС С6С 6АС СТ6 6ТС СТС С6А 6С3', а в качестве матрицы - плазмиду рЫТЕР2. РСК-продукт восстанавливали по концам и лигировали с плазмидой рИС18, которая была линеаризована путем гидролиза ферментом 8та1, а затем обработана щелочной фосфатазой. Смесь, полученную в результате лигирования, использовали для трансформации штамма Т61 гес0 Е.со11 и отдельные колонии тестировали на содержание в них плазмиды. Нужную плазмиду рМО26 (3,2 т.п.о.), в которой ЛугП-сайт граничит с ΗίηάΙΙΙ-сайтом полилинкера, идентифицировали по ее рестрикционной карте.
(ΐϊϊ) Конструирование плазмиды рМО27.
Плазмиду рМО25 гидролизовали ферментами ЕсоШ и Ва11 и 1,0 т.п.о.-вставку лигировали с плазмидой рМО2, которая была гидролизована ферментами ЕсоК! и Ва11. Смесь, полученную в результате лигирования, использовали для трансформации штамма Т61 гес0 Е.сой и индивидуальные колонии тестировали на содержание плазмиды. Нужную плазмиду рМО27 (4,4 т.п.о.) идентифицировали по ее рестрикционной карте.
(ίν) Конструирование плазмиды рМО32.
Плазмиду рМО26 гидролизовали ферментами ΆνιΉ и ΗίηάΙΙΙ и 0,6 т.п.о.-вставку лигировали с плазмидой рМО27, которая была гидролизована ферментами АугП и ΗίηάΙΙΙ. Смесь, полученную в результате лигирования, использовали для трансформации штамма Т61 гес0 Е.сой и индивидуальные колонии тестировали на содержание плазмиды. Нужную плазмиду рМО32 (5,1 т.п.о.) идентифицировали по ее рестрикционной карте.
(ν) Конструирование плазмиды рМО33.
Плазмиду рМО32 гидролизовали ферментами В§рЕ1 и 8ехА1 и 2,7 т.п.о.-вставку лигировали с плазмидой рЫТЕР2, которая была гидролизована этими же двумя ферментами и очищена с помощью гель-электрофореза для удаления 2,8 т.п.о.-вставки. Смесь, полученную в результате лигирования, использовали для трансформации штамма Т61 гес0 Е.сой и индивидуальные колонии тестировали на содержание плазмиды. Нужную плазмиду рМО33 (12,8 т.п.о.) идентифицировали по ее рестрикционной карте.
(νί) Конструирование плазмиды рС-АТ12.
Плазмиду рМО33 гидролизовали ферментами Ν^Ι и ХЪа! и вставку лигировали с плазмидой рС1К29, гидролизованной ферментами NάеI и ХЪа! и очищенной с помощью гельэлектрофореза. Смесь, полученную в результате лигирования, использовали для трансформации штамма Т61 гес0 Е.сой и индивидуальные колонии тестировали на содержание плазмиды. Нужную плазмиду рС-АТ12 идентифицировали по ее рестрикционной карте.
Пример Р) Конструирование 8.егуШгаеа 1С2/рС-АТ12 и продуцирование производных ТКЬ.
Плазмиду рС-АТ12 использовали для трансформации протопластов 1С2 8.егу111гаеа. Колонии, резистентные к тиострептону, отбирали на среде К2Т20, содержащей 10 мкг/мл тиострептона. Несколько клонов тестировали на присутствие интегрированной в хромосому рСАТ12 путем Саузерн-блот-гибридизации их геномной ДНК с ОЮ-меченым геном ЭЕВ81-ТЕ. Клон с интегрированной копией рС-АТ12 культивировали в среде 88М, содержащей 5 мкг/мл тиострептона, и оставляли на семь дней для роста при температуре 28-30°С. По истечении этого времени бульон фильтровали для удаления мицелия и рН доводили до рН 3. Затем бульон два раза экстрагировали двумя объемами этилацетата и объединенные этилацетатные экстракты промывали равным объемом насыщенного хлорида натрия, сушили над безводным сульфатом натрия, а этилацетат удаляли при пониженном давлении, в результате чего получали около 500 мг неочищенного продукта. Было установлено, что этими продуктами являются δ-лактон (3К,48,5К)-4-метил-3,5-дигидрокси-нгексановой кислоты и δ-лактон (3К,48,5К)-4метил-3,5-дигидрокси-н-гептановой кислоты
Пример 1к. Конструирование 8.егу!кгаеа ΝΚΚΌ 2338/рС-АТ12 и ее использование для продуцирования 14-членных макролидов.
Приблизительно 5 мкг ДНК рС-АТ12 использовали для трансформации протопластов ΝΚΚΕ 2338 8.егу1Бгаеа, в результате чего получали штамм, в хромосому которого была интегрирована эта плазмида. Из нескольких колоний была получена полная ДНК, которая была проанализирована с помощью Саузерн-блотгибридизации для подтверждения интеграции указанной плазмиды в 3'-конец модуля 2 ЕгуА1, в результате чего был получен способ биосинтеза новых макролидов. Последующие интеграции давали повторяющиеся плазмидные последовательности. 8.егу1Бгаеа ΝΚΚΌ 2338/рС-АТ2 инокулировали в трипсино-соевый бульон, содержащий 5 мг/мл тиострептона, и инкубировали три дня при 30°С. 100 мл этой посевной культуры использовали для инокуляции 2 л среды, состоящей из сукцината сахарозы и содержащей 5мкг/мл тиострептона в 5 х 2 л колбах, каждая из которой содержала 500 мл среды с 2 пружинами (для облегчения диспергирования) и которые встряхивали при 300 об/мин. После культивирования еще в течение 5 дней культуры центрифугировали и рН супернатанта доводили до 9. Затем супернатант три раза экстрагировали равными объемами этилацетата и растворитель удаляли выпариванием. Полученные продукты анализировали с помощью ЖХВД/МС и два макролидных продукта были идентифицированы.
Пример 11. Конструирование плазмиды рСЖ49.
Плазмида представляет собой плазмиду, полученную на основе рСШ24, содержащей мутантный ген ЭЕВ81-ТЕ, который не имеет кеторудуктазы в модуле 2 и в котором домен АТ в модуле 2 заменен на ВАР8 АТ2 для того, чтобы вводить малониловый удлинитель вместо метилмалонилового удлинителя во втором модуле (фиг. 12).
рМО32 гидролизовали ферментами Β8рΕI и 8еxАI и фрагмент, содержащий АТ от модуля ВАР 2, клонировали в рИС1-О, предварительно гидролизованную ферментами Β8рΕI и 8ехА[, в результате чего получали плазмиду рСЖ43.
рСЖ43 гидролизовали ферментами Ν^ и XЬаI и фрагмент, содержащий мутантный ген ΌΕΒ81-ΤΕ, клонировали в рСЖ24, предварительно гидролизованную ферментами ΝΑΊ и ХЬаГ в результате чего получали плазмиду рСЖ49. рСЖ49 подтверждали путем рестрикционного ферментативного картирования.
Пример 1т. Конструирование 8.егу1Бгаеа 1С2/рСЖ49 и продуцирование производных ТКЬ.
Приблизительно 5 мкг рСЖ49-плазмидной ДНК использовали для трансформации протопластов 1С2 8.егу1Бгаеа, в результате чего получали штамм, в хромосому которого была интегрирована эта плазмида. Из нескольких колоний была получена полная ДНК, которая была проанализирована с помощью Саузерн-блотгибридизации для подтверждения интеграции указанной плазмиды в модуль егуТЕ. 8.егу1Бгаеа 4С2/рСЖ49 инокулировали в трипсино-соевый бульон, содержащий 5мкг/мл тиострептона, и инкубировали три дня при 30°С. 100 мл этой посевной культуры использовали для инокуляции 2 л среды, состоящей из сукцината сахарозы и содержащей 5 мкг/мл тиострептона в 5 х 2 л колбах, каждая из которых содержала 500 мл среды с 2 пружинами для облегчения диспергирования и которые встряхивали при 300 об/мин. После культивирования еще в течение 5 дней культуры центрифугировали и рН супернатанта доводили до 3. Затем супернатант три раза экстрагировали равными объемами этилацетата и растворитель удаляли выпариванием. Продукты растворяли в метаноле и анализировали с использованием системы ГХ-МС Ттпедап-МАТ ОСр. Анализ путем сравнения с синтетическими стандартами указывал на присутствие двух новых лактонов. Было установлено, что этими продуктами являются δ-лактон (48,5К)-4-метил3-кето-5-гидроксигексановой кислоты и δлактон (48,5К)-4-метил-3-кето-3-гидроксигептановой кислоты
Пример 1п. Конструирование 8.егу1Бгаеа ΝΚΚΕ 2338/рСЖ49 и ее использование для продуцирования 14-членных макролидов.
Приблизительно 5 мкс ДНК рСЖ49 использовали для трансформации протопластов КВВБ 2338 8.егу1Бгаеа, в результате чего получали штамм, в хромосому которого была интегрирована эта плазмида. Из нескольких колоний была получена полная ДНК, которая была проанализирована с помощью Саузернгибридизации для подтверждения интеграции указанной плазмиды в модуль 2 ЕгуА1, в результате чего был получен способ биосинтеза новых макролидов. Проводили дальнейшие интеграции с получением повторяющихся плазмидных последовательностей. 8.егуФгаеа/рСЖ49 инокулировали в трипсино-соевый бульон, содержащий 5 мкг/мл тиострептона, и инкубировали три дня при 30°С. 100 мл этой посевной культуры использовали для инокуляции 2 л среды, состоящей из сукцината сахарозы и содержащей 5мкг/мл тиострептона в 5 х 2 л колбах, каждая из которых содержала 500 мл среды с 2 пружинами для облегчения диспергирования и которые встряхивали при 300 об/мин. После культивирования еще в течение 5 дней культуры центрифугировали и рН супернатанта доводили до 9. Затем супернатант три раза экстрагировали равными объемами этилацетата и растворитель удаляли выпариванием. Полученные продукты анализировали с помощью ЖХВД-МС и два макролида были идентифицированы.
Пример 2. Конструирование ΕΚΜΏ1 8.егуФгаеа. несущей гибридный ген РК8. в котором би-домен егу-загрузки 8.егуФгаеа ΝΗΗΙ. 2338 заменен би-доменом ауг-загрузки.
(I) Конструирование плазмиды рАУЬЭ.
Плазмиду рСКаЬе (пример 1) линеаризовали ферментом ВатН1 и лигировали в плазмиду рЕ702. предварительно гидролизованную ферментом В§Ш. Полученная смесь содержала нужную плазмиду рАУЬЭ (фиг. 5). Лигированную смесь трансформировали в гес0 ТО1 Е.еой и индивидуальные колонии тестировали на содержание плазмиды. Нужную плазмиду рАУЬЭ идентифицировали по ее рестрикционной карте (фиг. 5).
(II) Конструирование 8.егуФгаеа ΕΚΜΏ1.
Приблизительно 5-10 мкг рАУЬЭ. выделенной из гес0 ТО1 Е.сой (рАУЬЭ). трансформировали в 8.егуФгаеа ΝΗΗΙ. 2338 и стабильные колонии, резистентные к тиострептону, выделяли. Одну из этих колоний отбирали и полную ДНК гидролизовали ферментом Р§И и анализировали с помощью Саузерн-гибридизации, используя в качестве пробы вставку из плазмиды рСИс. которая содержала фрагмент гена егу-А1. кодирующего кетосинтазный домен К81. Анализ выявил позитивно гибридизирующиеся Р§Ифрагменты размерами 8.5 т.п.о., 4.8 т.п.о. и 33 т.п.о., указывая, при этом, на присутствие двух тандемно интегрированных копий рАУЬЭ (фиг. 6).
Пример 3. Получение изопропил- и вторбутилэритромицинов с использованием 8.егуФгаеа ΕΚΜΏ1.
Ферментацию 50 мл 8.егуФгаеа ΕΚΜΏ1 осуществляли в среде водопроводной воды и после выдерживания в течение 4 дней при температуре 30°С мицелий собирали и использовали для инокуляции 1.5 л сахарозо-сукцинатной среды, содержащей тиострептон (50 мкг/мл). После культивирования в течение 4 дней при 30°С цельный бульон дважды экстрагировали равными объемами этилацетата.
Объединенные экстракты концентрировали при пониженном давлении и дважды подвергали препаративной тонкослойной хроматографии на пластинах с двуокисью кремния (20 х 20 см). элюируя хлороформом/метанолом/88 аммиаком (8:2:0.01) (по объему). Затем продукты разделяли с помощью ЖХВД на обращеннофазовой колонке 85 (4.6 мм х 25 см) с дезактивированным основанием С18 Рйа§е8ер и с ОЭ8 (октадецилсиланом) 6. элюируя метанолом/0,5% ацетатом аммония (70:30(об/об)) при скорости потока 1 мл/мин. Собирали фракции между 7-11 минутами от трех отдельных вводов и объединенные фракции повторно вводили в виде 10 отдельных порций. Аналоги, содержащие изопропиловую боковую цепь (изопропил в Щ формулы 1), полученную в результате включения исходного звена 4-углерода (С-4; изобутирил). элюировались раньше, тогда как аналоги, содержащие втор-бутиловую боковую цепь (втор-бутил в И1 формулы 1). полученную в результате включения исходного звена 5-углерода (С-5; 2-метилбутирил), появлялись на несколько минут позже. МС высокого разрешения давала результаты для С-4 егуА-, егуВ- и егуЭ-аналогов и для С-5 егуА-, егуВ-аналогов, которые близко соответствовали вычисленным результатам:
Аналог Вычисленная масса Измеренная масса
С5-егуА 762.5004 762.5021
С4-егуА 748.4847 748.4820
С5-егуВ 746.4898 748.5077
С4-егуВ 732.4898 732.4933
В этих экспериментах природные эритромицины присутствовали только в низких или необнаруживаемых количествах и не наблюдалось обнаруживаемых количеств егуС-аналогов. Отношение полных концентраций С-4/С-5соединений в бульоне для ферментации, по оценке этилацетатных экстрактов этого бульона методами ЭС-МС, составляло от 4:1 до 6:1 в пользу С-4-соединений. Отношение А:В:Эаналогов варьировалось и составляло около 15:60:25. но по мере прохождения процесса ферментации содержание А-аналога увеличивалось. Общий выход эритромицинов составлял около 400 мкг/л. Каких-либо добавлений изомасляной или 2-метилмасляной кислоты не проводили. Таким образом, очевидно, что исходные звенья изомасляной и 2-метилмасляной кислоты образуются из эндогенно поставляемых предшественников, аналогично синтезу натуральных авермектинов (например, НаГпег с1 а1., (1991), 1. АпЪЫо!., 44:349-356).
Пример 4а. Конструирование 8.егу1йгаеа ΝΚΚΕ 2338/рЮ1.
Приблизительно 5 мкг плазмиды рЮ1 трансформировали в протопласты 8.егу111гаеа ΝΚΚΕ 2338 и выделяли стабильные колонии, резистентные к тиострептону. Из нескольких таких колоний получали полную ДНК и, для подтверждения того, что указанная плазмида была специфически интегрирована в ЕгуА1, эту ДНК анализировали с помощью Саузернгибридизации, которая также показала, что этот сайт интеграции был подходящим для генерирования мутанта, способного продуцировать модифицированные макролиды благодаря модулю ауе-загрузки.
Пример 4Ы. Конструирование 8.егу111гаеа ΝΚΚΕ 2338/рИО30.
Приблизительно 5 мкг плазмиды рИО30 трансформировали в протопласты 8.егу111гаеа ΝΚΚΕ 2338 и выделяли стабильные колонии, резистентные к тиострептону. Из нескольких таких колоний получали полную ДНК и для подтверждения того, что указанная плазмида была специфически интегрирована в ЕгуА1, эту ДНК анализировали с помощью Саузернгибридизации, которая также показала, что этот сайт интеграции был подходящим для генерирования мутанта, способного продуцировать модифицированные макролиды благодаря модулю ауе-загрузки.
Пример 5а. Получение 13-изопропил- и 13втор-бутил-эритромицинов с использованием 8.егу111гаеа ΝΚΚΕ 2338/рЮ1.
8.егу111гаеа ΝΚΚΕ 2338/рЮ1 инокулировали в среду с водопроводной водой, содержащую 50 мкг/мл тиострептона, и оставляли для роста на 4 дня при 30°С. По истечении этого времени 20 мл мицелия использовали для засевания в 500 мл сахарозо-сукцинатной среды, содержащей 50 мкг/мл тиострептона в 2-литровой колбе, снабженной одной пружиной (для снижения агглютинации), и встряхивали при 280 об/мин. Через 3,5-6 дней бульон фильтровали для удаления мицелия, а затем три раза экстрагировали четвертью объема этилацетата. Объединенные этилацетатные экстракты сушили над безводным сульфатом натрия и растворитель удаляли выпариванием. Анализ смеси продуктов, проводимый с использованием ГХ и массспекроскопии методом электронапыления, выявил, что из общего количества 5-6 мг/л 14членных макролидных продуктов основным компонентом был втор-бутил-эритромицин Ό (около 1,5 мг/л), а другими присутствующими компонентами были втор-бутил-эритромицин В и втор-бутил-эритромицин А, изопропилэритромицины А, В и Ό и небольшие количества природных эритромицинов А, В и Ό. 8.егу111гаеа ΝΚΚΕ 2338/рЮ1 продуцировала приблизительно в 10-15 раз больше новых изо пропил- и втор-бутил-эритромицинов, чем эквивалентно сконструированная 8.егу111гаеа ΕΚΜΌ1 (см. пример 2), что ясно указывало на способность аеЧ-промотора и соответствующего ему гена-активатора асШ-огГ 4 обеспечивать повышенную экспрессию РК8 Типа I. Каких-либо дополнительных количеств изомасляной или 2метилмасляной кислоты не добавлялось. Таким образом, очевидно, что исходные звенья изомасляной и 2-метилмасляной кислоты образуются из эндогенно поставляемых предшественников.
Пример 5Ь. Получение 13-изопропил- и 13втор-бутил-эритромицинов с использованием 8.егу111гаеа ΝΚΚΕ 2338/рИО30.
8.егу111гаеа ΝΚΚΕ 2338/рИО30 инокулировали в среду с водопроводной водой, содержащую 50 мкг/мл тиострептона, и оставляли для роста на 4 дня при 30°С. По истечении этого времени 20 мл мицелия засевали в 500 мл сахарозо-сукцинатной среды, содержащей 50 мкг/мл тиострептона в 2-литровой колбе, снабженной одной пружиной (для снижения агглютинации), и встряхивали при 280 об/мин. Через 3,5-6 дней бульон фильтровали для удаления мицелия, а затем три раза экстрагировали четвертью объема этилацетата. Объединенные этилацетатные экстракты сушили над безводным сульфатом натрия и растворитель удаляли выпариванием. Анализ смеси продуктов, проводимый с использованием ГХ и масс-спектроскопии методом электронапыления, показал, что из всего количества 5-6 мг/л 14-членных макролидных продуктов основным компонентом был втор-бутилэтироромицин Ό (около 1,5 мг/л), а другими присутствующими компонентами были вторбутил-этиромицин В и втор-бутил-эритромицин А, изопропил-эритромицины А, В и Ό, и небольшие количества природных эритромицинов А, В и Ό. 8.егу111гаеа ΝΚΚΕ 2338/рИО30 продуцировала приблизительно в 10-15 раз больше новых изопропил- и втор-бутил-эритромицинов, чем эквивалентно сконструированная 8.егу111гаеа ΕΚΜΌ1 (см. пример 2), что ясно указывало на способность аеЧ-промотора и соответствующего ему гена-активатора асШ-огГ 4 обеспечивать повышенную экспрессию РК8 Типа I. И в этом случае каких-либо дополнительных количеств изомасляной или 2-метилмасляной кислоты не добавлялось. Таким образом, очевидно, что исходные звенья изомасляной и 2метилмасляной кислоты образуются из эндогенно поставляемых предшественников.
Пример 6а. Получение 13-циклопентилэритромицина В с использованием 8.егу111гаеа ΝΚΚΕ 2338/рЮ1.
Культуру 8.егу111гаеа ΝΚΚΕ 2338/рЮ1 инокулировали в 50 мл среды с водопроводной водой в 300-миллилитровой колбе Эрленмейера. После 36-часового инкубирования при 28°С содержимое колбы использовали для инокуляции 3,5 л среды ΕΚΥ-Р в 5 л мини-сосуде. Этот бульон инкубировали при 28°С со скоростью аэрации 1,75 л/мин. Через 24 ч добавляли циклопентанкарбоновую кислоту (1,4 мл) и осуществляли ферментацию в течение 168 ч. По истечении этого времени рН всего бульона доводили до 8,5 добавлением водного раствора гидроксида натрия и экстрагировали этилацетатом (10 л). Этилацетатный экстракт концентрировали досуха и получали неочищенный продукт в виде смолы (4,2 г). Один грамм этого экстракта растворяли в этилацетате (5 мл) и помещали в заранее наполненную силикагелем колонку (10 г; 1п1егпа1юпа1 8огЬеп1 ТесЬпо1оду), предварительно кондиционированную этилацетатом (10 мл). Колонку последовательно элюировали этилацетатом (4 х 10 мл), смесью дихлорметана:метанола (1:1) (2 х 10 мл), смесью дихлорметана:метанола:аммиака (90:9:1) (1 х 10 мл), смесью дихлорметана:метанола:аммиака (80:19:1) (1 х 10 мл); и метанолом (2 х 10 мл). Фракции 710 объединяли и выпаривали досуха. Это фракционирование повторяли для оставшихся 3,2 г смолы. Эта стадия обогащения давала примерно 920 мг смолистого твердого вещества, содержащего нужный продукт. Затем это вещество очищали с помощью препаративной обращеннофазовой ЖХВД на колонке (21,2 мм х 25 см) с 7 мкм 01)8 2огЬах с использованием в качестве подвижной фазы смеси ацетонитрила:0,05М ацетата аммония (7:3) при скорости потока 8 мл/мин. Фракции, содержащие нужный продукт, от четырех отдельных вводов объединяли и выпаривали досуха, а затем снова осуществляли препаративную обращенно-фазовую
ЖХВД на колонке Весктап (10 мм х 25 см) с 5 мкм и11га5рйеге О1)8 с использованием градиента ”ацетонитрил:0,05М ацетат аммония (28:72) ацетонитрил:0,05М ацетат аммония (50:50) в качестве подвижной фазы, проходящей за 18 мин (скорость потока 4 мл/мин). Фракции, содержащие нужный продукт, от пяти отдельных вводов объединяли и выпаривали досуха, в результате чего получали очищенный белый твердый продукт (7 мг). Структуру этого продукта подтверждали с помощью масс-спектрометрии (МС) и спектроскопии методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР):
Время удерживания ЖХВД - Метод А 26,0 мин
АПХИ-МС (т/е): (М+Н)+ - наблюдали 758; для С40Н72ХО12 требуется 758
39.2
2.08
83.8
3.59(
75.4
1Н, мультиплет
38.0
45.0 прибл. 220.0
38.9*
69.4
2.00(
2.71
2.98
3.73,
1Н,дд, 0=14.7, 10,8
1Н, дквд, 0=10.6, 6,8.,
2,6 ,
1Н, квд, 0=6.8, 1.5
1Н,ДД, 0=9.9, 1.2
38.8·
1.71,
78.3
5.19,
41.7
2.15,
1Н, мультиплет
1Н, шир.секстет
1н,дд, о=ю.5, 1.о
15 30.4 ок.1.69, ок.1.21, 1н, 1Η, мультиплет мультиплет
16 25.4 ок. 1. .63, 1н, мультиплет
ок. 1. .52, 1Η, мультиплет
Ϊ7 25.1 ок. 1. .63, 1Н, мультиплет
ок. 1. .52, 1Н, мультиплет
18 29.0 ок'. 1. .69, 1н, мультиплет
ок.1. .21, 1Н, мультиплет
19 15.8 1.18, . ЗН, Д/ о=7.1
20 9.24 1.13, ЗН, д, 0=7.0
21 27.4 1.46, зн, с
22 18.5 1.14, зн, д, 0=6.8
23 ' 9.5 0.99, зн, Д, 0=6.8
24 9.16 0.86, зн, Д, 0=7.1
1’ 103.2 4.43, 1Η, Дг 0=7.3
2’ 70.9 3.24, 1Н,ЛД, 0=10.3, 7.3
3’ 65.4 2.51, 1Н, ддд, 0=12.0,
10.6,
4.1
29.0 ок. 1.68.
ок.1.24
1Н, мультиплет
1Н, мультиплет
7’,8
3’
5’
6’
68.8
21.5
40.1
96.5
35.1
78.0
65.6
18.7
21.4
49.5
3.50, 1Н, шир.секстет
1.22, ЗН, д, σ-6.1
2.32 2х ЗН, с
4.90, 1Н, д,
2.36, 1Н, небольшая
1.58,
3.02,
4.01,
1.29,
1.24,
3.31
1Н,
1Н(
1Н,
ЗН,
ЗН, зн,
0=4.6 д, 0=15.2+ линия (<1 Гц) мультиплет д, σ=9.ι мультиплет д, д=б.з с ' * Сигналы со звездочкой могут быть взаимозаменяемыми.
Пример 6Ь. Получение 13-циклопентилэритромицина В с использованием 8.егуФгаеа \1Ш1. 2338/рХЭ30.
Соединение, указанное в примере 6а, получали по методике, аналогичной описанной в примере 6а, с использованием культуры 8.егуФгаеа \ИИ1. 2338φΝϋ30.
Пример 7а. Получение 13-циклобутилэритромицина В с использованием 8.егуФгаеа \1Ш1. 2338/рЮ1.
Культуру 8.егуФгаеа ΝΕΡΚ 2338/рЮ1 инокулировали в 50 мл среды с водопроводной водой в 300-миллилитровой колбе Эрленмейера. После 72 часового инкубирования при 28°С содержимое колбы использовали для инокуляции 3,5 л среды ΕΒΥ-Ρ в 3 х 5 л мини-сосуде. Этот бульон инкубировали при 28°С со скоро43 стью аэрации 2,0 л/мин и перемешивали при скорости 500 об/мин. Две порции циклобутанкарбоновой кислоты (1,4 мл) добавляли через 24 ч и через 48 ч, после чего осуществляли ферментацию в течение 168 ч. По истечении этого времени рН всего бульона доводили до 8,5 водным раствором гидроксида натрия и экстрагировали этилацетатом (20 л). Этилацетатный экстракт концентрировали досуха и получали неочищенный продукт в виде смолы (9,2 г). Часть этого экстракта (2,3 г) растворяли в этилацетате (12,5 мл) и добавляли в заранее наполненную силикагелем колонку (10 г; 1и!егиа!юиа1 8огЬеи! Тесйио1оду), предварительно кондиционированную этилацетатом (10 мл). Колонку последовательно элюировали этилацетатом (4 х 24 мл), смесью дихлорметана: метанола (9:1) (1 х 24 мл), смесью дихлорметана: метанола (8:2) (2 х 24 мл), смесью дихлорметана:метанола:аммиака (80:19:1)(1 х 24 мл) и метанолом (1 х 24 мл). Фракции 6-8 объединяли и выпаривали досуха. Это фракционирование повторяли для оставшегося образца смолы (4,7 г). Эта стадия обогащения давала примерно 415 мг твердого вещества, содержащего нужный продукт. Затем это вещество очищали с помощью препаративной обращенно-фазовой ЖХВД на колонке (21,2 мм х 25 см) с 7 мкм ΟΏ8 2огЬах с использованием в качестве подвижной фазы смеси ацетонитрила:0,05М ацетата аммония (3:1) при скорости потока 8 мл/мин. Фракции, содержащие нужный продукт, от пяти отдельных вводов, объединяли и выпаривали досуха, а затем снова проводили препаративную обращенно-фазовую ЖХВД на колонке Весктаи (10 мм х 25 см) с 5 мкм И1!газрйеге ΟΏ8 с использованием градиента ацетонитрил :0,05М ацетат аммония (28:72) ацетонитрил:0,05М ацетат аммония (50:50) в качестве подвижной фазы, проходящей за 18 мин (скорость потока 4 мл/мин). Фракции, содержащие нужный продукт, объединяли и выпаривали досуха, в результате чего получали очищенный белый твердый продукт (27 мг). Структуру этого продукта подтверждали с помощью массспектрометрии (МС) и спектроскопии методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР):
Время удерживания при ЖХВД - Метод А - 22,3 мин
АПХИ-МС (т/е): (М+Н)+ - наблюдали 744; для С39Н70ИО12 требовалось 744.
ЯМР-данные:
Атомное число 13С химический сдвиг в 13С-ЯМР-спектрах
176.3 ^Ή-химический сдвиг и муль типлетность
44.5
80.4
39.2
83.9
75.4
37.7
1’
2’
3’
2.87, 1Н, дкв, 0=9.1, 7.1
4.03, 1Н, д, 0=9.1
2.08, 1Н, мультиплет
3.59, 1Н, д, 0=7.4
1.99, 1Н, мультиплет
44.5
1.64, 1И, дд, 0=15.0, 3.0
2.73, 1Н, шир.дублет пентеТов, 0=прибл.7.0, 3.0
219.4 -
38.9 2.97, 1Н, квд, 0=6.9, 1.1
69.1 3.75, 1Н, дд, 0=10.2+
небольшая линия
37.3 1.62, 1Н, мультиплет
77.4 5.39, 1Н, дд, 0=9.3, 1.1
37.0 2.60, 1Н, шир.секстет
25.2 ок :.1, .97, 1Н, мультиплет
ок :,1. .82, 1Н, мультиплет
17.7 ок :.1. .83, 2Н, мультиплет
24.2 ок :.1. .93, 1Н, мультиплет
ок ,.1. .75, 1Н, мультиплет
15.5 1. 17, . ЗН, я, σ=7.ι
9.3 1. 12, . ЗН, д, 0=7.5
27.0 1. 46, . ЗН, с
18.0 1. 14, , ЗН, Д, ο=7.ι
9.1 0. 98, . ЗН, Дг ο=6.9
9.3 0. 81, , ЗН, Д, ο=7.ι
103.4 4. 43, , 1Н, д, 0=7.3
70.9 3. 27, , 1Н, дд. , 0=10.3, 7.3
65.2 2. 64, . 1Н, - мультиплет
4* 29.1 οκ.1.72, οκ.1.22, ΙΗ, мультиплет ΙΗ, мультиплет
5’ 68.7 3.52, - ΙΗ, шир.секстет
Ο=οκ.β.1
6' 21.0 1.23, 3Η, Д, 1=6.1
7',8' 40.0 2.38, 2 χ ЗН, с
1” 96.8 4.89, ΙΗ, д, 1=4.5
2 34.7 2.38, ΙΗ, мультиплет,
1.57, ΙΗ, дд, 1=15.0, 5.0
3” 72.5 -
4 77.8 3.02, ΙΗ, д, 1=9.2
5« 65.3 4.02, ΙΗ, мультиплет
6” 18.2 1.29, 3Η, д, 1=6.2
7’* 21.2 1.24, 3Η, с
8 49.1 3.31, 3Η, с
Пример 7Ь. Получение 13-циклобутилэритромицина В с использованием 8.егу!йгаеа ΝΚΚΒ 2338/ρΝΏ30.
Соединение, указанное в примере 7 а, получали по методике, аналогичной описанной в примере 7а, с использованием культуры
З.егуФгаеа \1Ш1. 2338/ρΝΏ30.
Пример 8а. Получение 13-(3-фуранил)эритромицина В с использованием 8.егу!йгаеа \1Ш1. 2338/рЮ1.
Культуру 8.егу!йгаеа ΝΚΚΒ 2338/рЮ1 инокулировали в 50 мл среды с водопроводной водой в 300-миллилитровой колбе Эрленмейера. После 72 часового инкубирования при 28°С содержимое колбы использовали для инокуляции 3,5 л среды ΕΚΥ-Р в 5 л мини-сосуде. Этот бульон инкубировали при 28°С со скоростью аэрации 1,75 л/мин. Через 24 ч через стерилизованный фильтр добавляли 3-фуроновую кислоту (1,4 г в 6 мл метанола), после чего осуществляли ферментацию в течение 138 ч. По истечении этого времени рН всего бульона доводили до 8,5 водным раствором гидроксида натрия и экстрагировали этилацетатом (10 л). Этилацетатный экстракт концентрировали досуха и получали неочищенный продукт в виде смолы (3,8 г). Часть этого экстракта (1,9 г) растворяли в этилацетате (10 мл) и добавляли в заранее наполненную силикагелем колонку (10 г; 1п1егиа1юиа1 ВогЬеи! ТесИпо1оду), предварительно кондиционированную этилацетатом (10 мл). Колонку последовательно элюировали этилацетатом (4 х 24 мл), смесью дихлорметана:метанола (9:1)(1 х 24 мл), смесью дихлорметана:метанола (8:2) (2 х 24 мл), смесью дихлорметана:метанола: аммиака (80:19:1) (1 х 36 мл), метанолом (1 х 24 мл). Фракции 8 и 9 объединяли и выпаривали досуха. Это фракционирование повторяли для оставшихся 1,9 г смолы. В этой стадии обогащения получали твердое вещество, содержащее нужный продукт. Затем это вещество очищали с помощью препаративной обращенно-фазовой ЖХВД на колонке (21,2 мм х 25 см) с 7 мкм ΟΌ8 2огЬах с использованием в качестве подвижной фазы смеси ацетонитрила:0,05М ацетата аммония (3:1) при скорости потока 8 мл/мин. Фракции, содержащие нужный продукт, от трех отдельных инъекций, объединяли и выпаривали досуха, а затем снова осуществляли препаративную обращенно-фазовую ЖХВД на колонке Весктаи (10 мм х 25 см) с 5 мкм ИНгазрЬеге ΟΌ8 с использованием градиента ацетонитрил:0,05М ацетат аммония (28:72) ацетонитрил:0,05М ацетат аммония (50:50) в качестве подвижной фазы, проходящей за 18 мин (скорость потока 4 мл/мин). Фракции, содержащие нужный продукт, от трех отдельных вводов объединяли и выпаривали досуха, в результате получали очищенный 13-(3-фуранил)эритромицин В в виде белого твердого продукта (9 мг). Структуру этого продукта подтверждали с помощью масс-спектрометрии (МС).
Время удерживания при ЖХВД - Метод А - 17,0 мин
АПХИ-МС (т/е): (М+Н)+ - наблюдали 756; для С39Н6^О13 требовалось 756.
ЯМР-данные:
Атомное число
Прибл. 13С химический сдвиг 1Н-химический сдвиг по данным 1Н-13С-корреляции и мультиплетность
174.7
44.4
80.3
39.5
83.9
75.0
37.8
219.7
39.2
69.5
41.4
69.2
138.3
124.3
108.6
142.8
15.5
27.0
2.93,
4.14,
2.18,
3.61,
2.07.
1.70,
1Н,
1Н,
1Н,
Дл м,
1Н, д,
0=7.0, 7.2
0=7.2
1Н,дд, 0=14.6,11.3 не разрешен
7.0, 2.2 не разрешен
3.95, 1Н,Дд, 0=10.0, не разрешен
6.47, 1Н, комплексный мультиплет
7.31, 1Н, м, 0=0.7 м, 0=1.8,
7.39,
1.16,
1.48, комплексный комплексный
0.7
1Н,
ЗН,
ЗН,
ЗН,
Т, д,
Д, о=1.8 о=7.о
1=7.0
18.3
1.18,
ЗН, о=7.о д,
1.03, о=б. 9
ЗН,
0=7.0
Д|
1’ 103.3 4.46, 1Н, , Д, 0=7.4
2' 71.1 3.29, 1н, , м
3’ 65.1 2.60, 1Н, г широкий м
4’ 29.3 1.78, 1Н, , м
1.24, 1Н, г М
5’ 68.8 3.54, 1н, г М
6' 20.7 1.24, ЗН, , д (неясный)
7’,8’ 40.0 2.39, 2 X ЗН, с
1 96.6 4.88, 1Н, . шир.д, 0=4.9
2 35.2 2.39, 1Н, . м
1.59, 1Н, дц, 0=15.0, 4.9
3” 71.7 -
4” 77.8 3.03, 1Н, д (неясный)
5 66.1 4.03, 1Н, дкв, 0=9.0, 6.
6 18.3 1.30, ЗН, . д, 0=6.1
7” 21.2 1.26, ЗН, - с
8 49.1 3.33, ЗН, с
* Сигналы со звездочкой могут быть обратимыми.
.1
Пример 8Ь. Получение 13-(3-фуранил)эритромицина В с использованием 8.егу1Игаеа ΝΚΚΕ 2338φΝΌ30.
Соединение, указанное в примере 8а, получали по методике, аналогичной описанной в примере 8а и проводимой с использованием культуры 8.егу1Игаеа ΝΚΚΕ 2338/ρN^30.
Пример 9а. Получение 13-циклопропилэритромицина В с использованием 8.егу1Игаеа ΝΚΚΕ 2338/рЮ1.
Культуру 8.егу1Игаеа ΝΚΚΕ 2338/рЮ1 инокулировали в 50 мл среды с водопроводной водой в 300-миллилитровой колбе Эрленмейера. После 72-часового инкубирования при 28°С содержимое колбы использовали для инокуляции 3,5 л среды ΕΚΥ-Р. Сразу после стерилизации добавляли тиострептон (105 мг). Этот бульон инкубировали при 28°С со скоростью аэра47 ции 2 л/мин и перемешивали при скорости 500 об/мин. Через 24 ч добавляли циклопропанкарбоновую кислоту (1,2 мл), после чего осуществляли ферментацию в течение 144 ч. По истечении этого времени рН всего бульона доводили до 8,5 водным раствором гидроксида натрия и экстрагировали этилацетатом (3 л). Этилацетатный экстракт концентрировали досуха и получали неочищенный продукт в виде смолы (1,7 г). Часть этого экстракта (0,85 г) растворяли в этилацетате (10 мл) и добавляли в заранее наполненную силикагелем колонку (10 г, ИЧегпаЕопа1 8огЬеп1 Тесйпо1о§у), предварительно кондиционированную этилацетатом (20 мл). Колонку последовательно элюировали этилацетатом (4 х 24 мл), смесью дихлорметана:метанола (9:1)(1 х 24 мл), смесью дихлорметана:метанола (8:2) (1 х 24 мл), смесью дихлорметана:метанола:аммиака (80:19:1)(3 х 24 мл) и метанолом (1 х 24 мл). Фракции 6-9 объединяли и выпаривали досуха. Это фракционирование повторяли для оставшихся 0,85 г смолы. В этой стадии обогащения получали твердое вещество, содержащее нужный продукт. Затем это вещество очищали с помощью препаративной обращеннофазовой ЖХВД на колонке (21,2 мм х 25 см) с 7 мкм ΘΌ8 2огЬах с использованием в качестве подвижной фазы смеси ацетонитрила: 0,05М ацетата аммония (3:1) при скорости потока 8 мл/мин. Фракции, содержащие нужный продукт, от четырех отдельных вводов, объединяли и выпаривали досуха, а затем снова осуществляли препаративную обращенно-фазовую
ЖХВД на колонке Весктап (10 мм х 25 см) с 5 мкм иНгазрйеге ΘΌ8 с использованием градиента ’’ацетонитрил:0,05М ацетат аммония (28:72) ацетонитрил:0,05М ацетат аммония (50:50) в качестве подвижной фазы, проходящей за 18 мин (скорость потока 4 мл/мин). Фракции, содержащие нужный продукт, от трех отдельных вводов объединяли и выпаривали досуха, в результате чего получали очищенный 1 3циклопропил-эритромицин В в виде белого твердого продукта (9 мг). Структуру этого продукта подтверждали с помощью массспектрометрии (МС).
Время удерживания при ЖХВД - Метод А - 17,9 мин
АПХИ-МС (т/е): (М+Н)+ - наблюдали 730, для С38Н68ЫО12 требовалось 730.
ЯМР-данные:
Атомное число
Прибл. 13С-химический сдвиг по данным 1Н-13С-корреляции 1Н-химический сдвиг и мультиплетность
6.4
2 44.8 2.88, 1Н, дкв, 1=8.5, 7.1
3 80.3 4.04, 1Н, дц, 1=8.5, 1.9
4 39.5 2.11, 1Н, шир.пентет,
1=ок.7
5 83.7 3.58, 1Н, д, 1=7.5
6 75.2 -
7 38.0 2.02, 1Н,дд„ 1=14.7, 10.9
1.66, 1Н,дд, 1=14.7, 2.8
8 45.1 2.47, 1Н, дквд, 1=10.9,
7.1, 2.8
9 220.0 -
10 39.0 3.01, 1Н, мультиплет
11 69.8 3.76, 1Н,дд, 1=10.0
ок.1.4
12 40.4 1.84, 1Н, дквд, 1=10.0,
6.9, 1.2
13 78.5 4.68, 1Н,ДД, 1=9.2, 1.2
14 13.2 1.09, 1Н ! мультиплет
15 4.1 0.51, 1Н, мультиплет
0.42, 1Н, мультиплет
16 2.7 0.51, 1Н, мультиплет
0.29, 1Н, мультиплет
17 15.1 1.19, ЗН, д, 1=7.1
18 9.3 1.14, 1Н, д, 1=приб.7.1
19 27.4 1.46, ЗН, с
20 18.3 1.16, ЗН, д, 1=7.1
21 9.3 1.001 , ЗН, , д, 1=ок.7.2*
22 9.3 0.998 , ЗН, - д, 1=ок.6.9*
1 ’ 103.3 4.43, 1Н, Д, 1=7.2
2’ 71.0 3.25, 1Н, дц, 1=10.3, 7.2
3’ 65.6 2.54, 1Н, шир.ддд,
1=ок.12.5, 10.3, 4
4 ’ 29.0 1.69, 1.25, 1Н, мультиплет
1Н, , мультиплет
5’ 69.2 3.51, 1Н, , шир.дкв,
1=ок.11.6
6’ 20.9 1.22, ЗН, - д, 1=6.2
7’, 8’ 39.9 2.33, 2 х ЗН, с
1 97.1 4.87, 1Н, - шир.д, 1=ок.5
2 35.0 2.37, 1Н, , шир.д, 1=ок.15
1.57, 1Н, - д, 1=15.1, 5.0
3” 72.5 -
4 78.1 3.01, 1Н, . шир.д, 1=9.2
5” 66.0 4.02, 1Н, дкв, 1=9.2, 6.2
6 18.3 1.28, ЗН, г д, 1=ок.6.2
7 21.0 1.24, ЗН, . с
8” 49.3 3.32, ЗН, , с
* Сигналы со звездочкой могут быть обратимыми.
Пример 9Ь. Получение 13-циклопропилэритромицина В с использованием 8.егуШгаеа ЫККЬ 2338φΝΌ30.
Соединение, указанное в примере 9а получали по методике, аналогичной описанной в примере 9а, проводимой с использованием культуры 8.егуШгаеа ΝΚΒΕ 2338φΝΌ30.
Пример 10а. Получение 13-(1-метилтиоэтил)-эритромицина В с использованием 8.егуФгаеа ΝΚΚΕ 2338/рЮ1.
Культуру 8.егуШгаеа ΝΚΚΕ 2338/рЮ1 инокулировали в 1 л среды с водопроводной водой в 2,8 л колбе Фернбаха. Сразу после инокуляции добавляли тиострептон (50 мг). После 84-часового инкубирования при 29°С содержимое колбы использовали для инокуляции 8 л среды ΕΚΥ-Р (содержащей 50 г/л декстрозы, 30 г/л соевой муки ШиГоу, 3 г/л сульфата аммо49 ния, 5 г/л \аС1, 6 г/л СаСО3, 10 г/л сахарозы, 5 г/л замоченных семян кукурузы, 0,5 г/л Мд8О4 и 1 мл/л Р2000) в 14 л ферментере. Этот бульон инкубировали при 28°С со скоростью аэрации 8 л/мин и перемешивали при скорости 800 об/мин, при этом рН поддерживали при 6,9-7,3 добавлением \аО11 или Н28О4 (15%). Через 24 ч и через 48 ч добавляли метилтиомолочную кислоту (3,2 мл). Затем через 120 ч добавляли еще 1,6 мл метилтиомолочной кислоты. Ферментацию осуществляли в течение 142 ч. По истечении этого времени весь бульон центрифугировали с получением остатка (34 л), который загружали в колонку со смолой ΧΆΌ-16 (600 мл; КоНт & Нааз). Затем колонку со смолой промывали водой (1,8 л) и элюировали этилацетатом (2,5 л). Этилацетат частично концентрировали (до 250 мл), после чего нужный продукт экстрагировали 100 мМ натрийфосфатным буфером, рН 3,5 (1,3 л). Затем этот продукт снова переносили в этилацетат, доводя воду до рН 9 добавлением гидроксида натрия с последующим смешиванием с этилацетатом (450 мл). Обогащенный эритромицином этилацетатный слой отделяли, выпаривали с получением смолы (5,0 г), а затем ресуспендировали в 20% метаноле (120 мл), который загружали в ГХ-колонку со смолой 161 (100 мл; Тозо Нааз). Колонку со смолой последовательно элюировали 20% метанолом (3 х 100 мл), 40% метанолом (3 х 100 мл), 60% метанолом (3 х 100 мл), 80% (3 х 100 мл) и чистым метанолом (4 х 100 мл). Чистые метаноловые фракции 2 и 3, содержащие нужный продукт, выпаривали до получения твердого остатка (220 мг), а затем очищали с помощью обращенно-фазовой ЖХВД на колонке (75 мм х 25 см) с 10 мкм С18 КготазП с использованием смеси ацетонитрил:0,05М ацетат аммония с градиентом 0,1% трифторуксусной кислоты (32:68) (38:62) в качестве подвижной фазы, проходящей 60 мин при скорости потока 215 мл/мин. Фракции, содержащие нужный продукт, объединяли (1,7 л), рН доводили до 9 добавлением гидроксида натрия и экстрагировали метиленхлоридом (300 мл). Метиленхлоридный слой отделяли и выпаривали досуха, в результате чего получали частично очищенный продукт. Затем повторяли стадию препаративной ЖХВД и стадию экстракции и получали чистый 13-(1метилтиоэтил)-эритромицин В (31 мг). Структуру продукта подтверждали с помощью массспектроскопии и ЯМР-спектроскопии (на спектрометре Вгикег ΌΜΧ 500 МГц):
Время удерживания при ЖХВД - Метод В - 14,9 мин
АПХИ-МС (т/е): (М+Н)+ наблюдали 764; для С38Н70\О128 требовалось 764
ЯМР-данные:
Атомный (мл. д.) присоединенного 1Н аН (мл.д.)
221.08
176.10
103.42
96.93
84.31
80.69
78.30
76.17
75.75
73.11
71.23
69.84
69.03
66.18
65.99
49.91
45.62
45.26
40.61
40.01
39.60
38.94
38.44
37.68
35.47
29.66
27.70
21.89
21.77
4.49
4.94
3.63
4.06
3.07
5.42
3.32
3.77
3.56
4.06
2.68
3.36
2.74
2.96
2.46
2.83
2.14
3.04
2.03/1.70
2.44
2.41/1.63
1.79/1.32
1.51
1.29
1.28
1.33
19.08
1.20
18.92
1.33
18.19
Получение
13-(1Пример 10Ь. метилтиоэтил)-эритромицина В с использованием 8.егуШгаеа \ККЬ 2338/р\Э30.
Соединение, указанное в примере 1 0а, получали по методике, аналогичной описанной в примере 1 0а и проведенной с использованием культуры 8.егуШгаеа \ККЬ 2338/р\Э30.
Пример 11. Получение 1 3-циклобутилэритромицина В с использованием 8.егуШгаеа \ККЬ 2338.
Культуру 8.егуШгаеа \ККЬ 2338 иноку лировали в 50 мл среды с водопроводной водой в 300-миллилитровой колбе Эрленмейера. После 48-часового инкубирования при 28°С, содержи51 мое колбы использовали для инокуляции 50 мл среды ЕКУ-Р в 300 мл колбе Эрленмейера. Этот бульон инкубировали при 28 °С. Через 24 ч добавляли циклобутанкарбоновую кислоту (20 мл), после чего осуществляли ферментацию в течение 168 ч. По истечении этого времени рН всего бульона доводили до 8,5 водным раствором гидроксида натрия и экстрагировали этилацетатом (50 мл). Этилацетат отделяли и концентрировали досуха. Образец снова растворяли в метаноле (1 мл) для ЖХВД-МС-анализа. Этот анализ подтверждал продуцирование 13циклобутил-эритромицина В нетрансформированным нерекомбинантным штаммом ΝΚΚΒ 2338, описанным в примере 7 для генетически сконструированного штамма, содержащего модуль ауг-загрузки (конструкция ΝΚΚΕ 2338/рЮ1).
Время удерживания при ЖХВД - Метод А22,3 мин
АПХИ-МС- (т/е): (М+Н)+ наблюдали 744; для Ο39Η70ΝΟΐ2 требовалось 744.
Пример 12. Получение 13-циклопропилэритромицина В с использованием 8.егу111гаеа ΝΚΚΒ 2338.
Культуру 8.егу111гаеа ΝΚΚΒ 2338 инокулировали в 50 мл среды с водопроводной водой в 300-миллилитровой колбе Эрленмейера. После 48-часового инкубирования при 28°С, содержимое колбы использовали для инокуляции 50 мл среды ЕКУ-Р в 300 мл колбе Эрленмейера. Этот бульон инкубировали при 28°С. Через 24 ч добавляли циклопропанкарбоновую кислоту (20 мл), после чего осуществляли ферментацию в течение 168 ч. По истечении этого времени рН всего бульона доводили до 8,5 водным раствором гидроксида натрия и экстрагировали этилацетатом (50 мл). Этилацетат отделяли и концентрировали досуха. Образец снова растворяли в метаноле (1 мл) для ЖХВД-МС-анализа.
Этот анализ подтверждал продуцирование 1 3-циклопропил-эритромицина В нетрансформированным нерекомбинантным штаммом ΝΚΚΕ 2338, описанным в примере 7 для генетически сконструированного штамма, содержащего модуль ауг-загрузки (конструкция ΝΚΚΠ 2338/р1О1).
Время удерживания при ЖХВД - Метод А - 17,9 мин
АПХИ-МС (т/е): (М+Н)+ наблюдали 730; для Ε8Η68ΝΟ12 требовалось 730.
Пример 1 3а. Получение 1 3-циклобутилэритромицина А с использованием 8.егу111гаеа ΝΚΚΕ 2338/р1О1.
Культуру 8.егу111гаеа КККЬ 2338/р1О1 инокулировали в 50 мл среды с водопроводной водой в 3 х 300-миллилитровой колбе Эрленмейера. После 72-часового инкубирования при 28°С, содержимое колбы использовали для инокуляции 3,5 л среды ЕКУ-Р в 3 х 5 л мини-сосудах. Этот бульон инкубировали при 28°С со скоро стью аэрации 2,0 л/мин и перемешивали при 500 об/мин. Две порции циклобутанкарбоновой кислоты (1,4 мл) добавляли через 24 ч и через 48 ч, после чего осуществляли ферментацию в течение 168 ч. По истечении этого времени рН всего бульона доводили до 8,5 водным раствором гидроксида натрия и экстрагировали этилацетатом (20 л). Этилацетатный экстракт концентрировали досуха и получали неочищенный продукт в виде смолы (9,2 г). Часть этого экстракта (2,3 г) растворяли в этилацетате (12,5 мл) и добавляли в заранее наполненную силикагелем колонку (10 г; ^егпайопа! 8огЬеп1 Тескпо1оду), предварительно кондиционированную этилацетатом (10 мл). Колонку последовательно элюировали этилацетатом (4 х 24 мл), смесью дихлорметана: метанола (9:1) (1 х 24 мл), смесью дихлорметана: метанола (8:2) (2 х 24 мл), смесью дихлорметана:метанола:аммиака (80:19:1) (1 х 24 мл) и метанолом (1 х 24 мл). Фракции 68 объединяли и выпаривали досуха. Это фракционирование повторяли для оставшегося образца смолы (4,7 г). Эта стадия обогащения давала 415 мг твердого вещества, содержащего нужный продукт. Затем это вещество очищали с помощью препаративной обращенно-фазовой ЖХВД на колонке (21,2 мм х 25 см) с 7 мкм ΟΌ8 2огЬах с использованием в качестве подвижной фазы смеси ацетонитрила:0,05М ацетата аммония (3:1) при скорости потока 8 мл/мин. Фракции, содержащие нужный продукт, от пяти отдельных вводов объединяли и выпаривали досуха, а затем снова осуществляли препаративную обращенно-фазовую ЖХВД на колонке Весктап (10 мм х 25 см) с 5 мкм иНгазркеге ΟΌ8 с использованием градиента ацетонитрил:0,05М ацетат аммония (28:72) ацетонитрил:0,05М ацетат аммония (50:50) в качестве подвижной фазы, проходящей за 18 мин (скорость потока 4 мл/мин). Фракции, содержащие нужный продукт, объединяли и выпаривали досуха, в результате чего получали очищенный белый твердый продукт (4 мг). Структуру этого продукта подтверждали с помощью массспектрометрии (МС) и спектроскопии методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР):
Время удерживания при ЖХВД - Метод А - 17,5 мин
АПХИ-МС (т/е): (М+Н)+ наблюдали 760; для С38Н7^О13 требовалось 760.
ЯМР-данные:
Атомное число
Прибл. 13С химический сдвиг гН-химический сдвиг и из данных 1Н-13С-корреляции мультиплетность
176.1
44.7
79.8
39.3
83.4
75.4
38.3
45.1
225.1
37.4
69.1
76.1
77.1
34.8
26.7
18.8
2.88, 1Н, мультиплет
3.99, 1Н, мультиплет
1.97, 1Н, мультиплет
3.57, 1Н, д, Л=7.6
1.92, 1Н, мультиплет
1.72, 1Н, мультиплет
2.70, 1Н, мультиплет
3.07, 1Н, шир.кв., Л=7.0
3.77, 1Н, шир.с
5.10, 1Н,
2.86, 1Н,
1.98, 1Н,
1.80, 1Н,
1.88, 1Н,
1.71, 1Н,
Д, 0=7.1 мультиплет мультиплет мультиплет мультиплет мультиплет
17 24.8 1.89, 2Н; г мультиплет
18 15.8 1.19, ЗН; г д, Д=7.0
20 26.9 1.47, ЗН; , с
21 18.1 1.16, ЗН; г д, з=7.о
1’ 103.0 4.42, 1Н; г д, 3=7.2
2’ 71.0 3.24, 1Н, дкв, 3=10.4, 7.2
3’ 65.3 2.51, 1Н; г мультиплет
4’ 28.7 1.68, 1Н; г мультиплет
1.26, 1Н; г мультиплет
5’ 69.2 3.49, 1Н; , мультиплет
6’ 21.3 1.23, ЗН, . д, 3=6.2
7’,8’ 40.0 2.38, 2 х ЗН, с
1 96.3 4.89, 1Н, > д, 3=4.5
2” 34.7 2.38, 1Н, . мультиплет
1.57, 1Н, дд, 3=15.0, 5.0
3 73.0 -
4 я 78.0 3.02, 1Н, - д, 3=9.4
5 я 65.6 4.00, 1Н, • мультиплет
6я 18.4 1.29, ЗН, - д, 3=6.2
7 я 21.3 1.24, ЗН, . с
8 я 49.4 3.32, ЗН, с
Пример 13Ь. Получение 13-циклобутилэритромицина А с использованием 8.егуФгаеа ΝΕΕΠ 2338/ρΝΌ30.
Соединение, указанное в примере 13 а, получали по методике, аналогичной описанной в примере 13а и проведенной с использованием культуры 8.егуФгаеа ΝΕΒΠ 2338/ρΝΌ30.
Пример 1 4а. Получение 1 3-циклопропилэритромицина А с использованием 8.егуФгаеа ΝΕΕΠ 2338/рЮ1.
Шесть 2800 мл колб Фернбаха инокулировали культурой 8.егуФгаеа ΝΕΕΠ 2338/рЮ1. Каждая колба содержала 1 л водопроводной воды с 50 мг тиострептона, добавленного в каждую колбу. Через 24 ч после инкубирования при 26°С в каждую колбу добавляли 200 мл.д. циклопропанкарбоновой кислоты. Колбы инкубировали в течение 90 ч и помещали в стерильные 8-литровые вакуум-колбы. Эти вакуум-колбы использовали для инокуляции 314 галлонов (~1193 дм ) среды ЕΕΥ-Р в сосуде с автоматическим регулированием емкостью в 500 галлонов (~2280 дм3). Этот бульон инкубировали при 27-29°С, при рН 6,7-7,4 и со скоростью аэрации 20 стандартных куб. футов/мин, и размешивали при скорости 175 об/мин. Через 33, 81 и 117 ч добавляли циклопропанкарбоновую кислоту (200мг/л). Ферментацию осуществляли в течение 198 ч. По истечении этого времени весь бульон фильтровали через керамический 0,2 мкм-фильтр (20 фут2, фильтр и.8.). Фильтрат загружали на колонку со смолой ΧΑΌ-16 (12 мл; ИоЬт & Нааз). Затем колонку со смолой элюировали этилацетатом (60 л). Этилацетат концентрировали с получением смолы (302 г), к которой было добавлено 2 л метиленхлорида. Полученный метиленхлоридный раствор промывали 8 л 250 мМ натрийбикарбонатного буфера, рН 9. Обогащенный эритромицином метиленхлоридный слой отделяли, упаривали с получением смолы (200 г), а затем ресуспендировали в 40% метаноле (10 л), который загружали в ГХ-колонку со смолой 161 (9 л; Тозо Нааз). Колонку со смолой промывали 40% метанолом (30 л), а затем элюировали 75% метанолом (8 х 10 л) и чистым метанолом (3 х 10 л). 75% метаноловые фракции 5-8, содержащие нужный продукт, объединяли и выпаривали до получения 3,2 л. Концентрат доводили до рН 9 и добавляли к 0,95 л метиленхлорида. Метиленхлоридный слой отделяли и выпаривали с получением 12,4 г смолы. Затем часть этой смолы (шесть граммов) очищали с помощью препаративной обращенно-фазовой ЖХВД на колонке (75 мм х 25 см) с 10 мкм С18 КгошазП с использованием в качестве подвижной фазы смеси ацетонитрил:0,05М ацетат аммония с изократным количеством 0,1% трифторуксусной кислоты (50:50) при скорости потока 215 мл/мин. Фракции, содержащие нужный продукт, объединяли (230 мл), выпаривали с получением концентрата (110 мл), рН доводили до 9 добавленим гидроксида натрия и экстрагировали метиленхлоридом (50 мл). Метиленхлоридный слой отделяли и выпаривали досуха, в результате чего получали 630 мг частично очищенного продукта. Затем другую порцию смолы (один грамм) очищали с помощью препаративной обращенно-фазовой ЖХВД на колонке (50 мм х 25 см) с 10 мкм С8 Ме!аСИеш Ыег&П с использованием смеси ацетонитрил:0,05М ацетат аммония в градиенте 0,1% трифторуксусной кислоты (20:80) (25:75) в качестве подвижной фазы, проходящей за 50 мин при скорости потока 125 мл/мин. Фракции, содержащие нужное соединение (28-46 мин), объединяли, насыщали бикарбонатом натрия и экстрагировали метиленхлоридом. Метиленхлорид отделяли и выпаривали досуха с получением 361 мг частично очищенного продукта. Часть этих частично очищенных продуктов снова очищали с помощью обращенно-фазовой ЖХВД, например на колонке (50 мм х 250 мм) с 10 мкм С18 РЕепошепех РгоФду с использованием в качестве подвижной фазы смеси метанол:0,05М ацетат аммония с изократным количеством 0,1% трифторуксусной кислоты (50:50) при скорости потока 100 мл/мин. Фракции, содержащие нужное соединение (27-31 мин), объединяли, насыщали бикарбонатом натрия и экстрагировали метиленхлоридом. Метиленхлорид отделяли и выпаривали досуха с получением частично очищенного продукта. Этот материал снова очищали с помощью обращенно-фазовой ЖХВД, например на колонке (50 мм х 25 см) с 10 мкм С18 Рйепотепех РгоШду с использованием в качестве подвижной фазы смеси метанол:0,05М ацетат аммония с изократным количеством 0.1% трифторуксусной кислоты (48:52) при скорости потока 100 мл/мин. Фракции, содержащие нужное соединение, (41-45 мин) объединяли, насыщали бикарбонатом калия и экстрагировали метиленхлоридом. Метиленхлорид отделяли и упаривали досуха с получением 1 3-циклопропил-эритромицина А в виде твердого продукта (20 мг). Структуру этого продукта подтверждали с помощью масс-спектрометрии и ЯМР-спектроскопии (на спектрометре Вгипкег ΌΜΧ 500 МГц).
Время удерживания при ЖХВД - Метод В - 5.6 мин.
АПХИ-МС (т/е): (М+Н)+-наблюдали 746; для С38Н6^О13 требовалось 746.
ЯМР-данные:
Атомный # 13С (мл.д) # присоединенного 1Н ’Н (мл.
1 222.41 0
2 175.88 0
3 103.63 1 4.45
4 96.75 1 4.92
5 83.92 1 3.60
6 80.25 1 4.02
7 78.52 1 4.74
8 78.42 1 3.05
9 75.99 0
10 75.49 0
11 73.05 0
12 71.31 1 3.27
13 69.46 1 3.84
14 69.39 1 3.52
15 66.02 1 4.04
16 65.95 1 2.49
17 49.93 3 3.36
18 45.47 1 2.74
19 45.23 1 2.89
20 40.70 1 2.34
21 40.00 1 2.02
22 38.94 2 1.96/1.76
23 38.46 1 3.15
24 35.38 2 2.41/1.61
25 29.07 2 1.71/1.28
26 27.36 3 1.50
27 21.94 3 1.28
28 21.84 3 1.26
29 19.08 3 1.32
30 18.69 3 1.21
31 17.38 3 1.31
32 16.11 3 1.21
33 12.38 3 1.20
34 10.64 1 1.20
35 9.60 3 1.16
36 4.23 2 0.67/1.33
37 1.64 2 0.47/0.32
Пример 14Ь. Получение 13-циклопропилэритромицина А с использованием 8.егу1кгаеа ΝΚΚΕ 2338φΝΌ30.
Соединение, указанное в примере 1 4а, получали по методике, аналогичной описанной в примере 1 4а и проведенной с использованием культуры 8.егуШгаеа ΝΕΡΕ 2338φΝΌ30.
Пример 15а. Получение 13-(3-тиенил)эритромицина В с использованием 8.егуШгаеа ΝΚΚΕ 2338/рЮ1.
Культуру 8.егу1кгаеа ΝΚΕΕ 2338/рЮ1 инокулировали в 50 мл среды с водопроводной водой в 300-миллилитровой колбе Эрленмейера. После 48-часового инкубирования при 28°С содержимое колбы использовали для инокуляции 50 мл среды ΕΕΥ-Р в 300 мл колбе Эрленмейера. Этот бульон инкубировали при 28°С. Через 24 ч через стерилизованный фильтр добавляли Ν-ацетилцистаминотиоэфир 3-тиофенкарбоновой кислоты (20 мг в 0.5 мл метанола), после чего осуществляли ферментацию в течение 168 ч. По истечении этого времени рН всего бульона доводили до 8.5 водным раствором гидроксида натрия и экстрагировали этилацетатом (50 мл). Этилацетат отделяли и концентрировали досуха. Образец снова растворяли в метаноле (1 мл) для ЖХВД-МС-анализа. Этот анализ подтверждал продуцирование 13-(3тиенил)-эритромицина В.
Время удерживания при ЖХВД - Метод А - 20.0 мин
АПХИ-МС (т/е); (М+Н)+-наблюдали 772; для С39Н6^О128 требовалось 772.
Пример 15Ь. Получение 13-(3-тиенил)эритромицина В с использованием 5.егуШгаеа ΝΚΚΕ 2338φΝΌ30.
Соединение, указанное в примере 1 5а, получали по методике, аналогичной описанной в примере 1 5а и проведенной с использованием культуры 8.егуШгаеа ΝΚΕΕ 2338φΝΌ30.
Пример 16. Получение 6-дезокси-13циклопропил-эритромицина В с использованием 8.егуШгаеа ΝΚΕΕ 18643.
Культуру 8.егу!йгаеа ΝΒΚΕ 18643, егуЕмутанта 8.егу!йгаеа (8с1епсе, 252:114, 5 Арп1 1991) инокулировали в 1 л водопроводной воды в 2,8 л колбах Фернбаха. После 24-часового инкубирования при 29°С в каждую колбу добавляли циклопропанкарбоновую кислоту (200 мл.д.) с перемешиванием при 200 об/мин. Через полные три (3) дня инкубирования содержимое колбы использовали для инокуляции 8 л среды ΕΒΥ-Р (содержащей 60 г/л церелозы, 30 г/л соевой муки ЫиДткоу, 3 г/л (ΝΗ4)28Ο4, 5 г/л №С1, 6 г/л замоченных семян кукурузы, 0,5 г/л Мд8О4 и 1 мл/л Р2000) в 14 л ферментере. Этот бульон инкубировали при 28°С со скоростью аэрации 8 л/мин и перемешивали при 800 об/мин, при этом рН поддерживали 6,9-7,3 добавлением Ν;·ιΟΗ или Η28Ο4 (15%). Через 24 и 48 ч добавляли циклопропанкарбоновую кислоту (1,6 мл). Продукт ферментации (полученный в дубликате) собирали после инкубирования в течение полных 163 ч. рН всего бульона доводили до 9 добавлением гидроксида натрия и этот бульон экстрагировали этилацетатом (16 л). Этилацетат концентрировали на 20-литровом роторном испарителе ВисЫ с получением масла. Это масло снова растворяли в 500 мл метиленхлорида. К полученной жидкости добавляли 500 мл воды и рН водной фазы доводили до 9 путем добавления 10% гидроксида аммония. После интенсивного встряхивания метиленхлоридный слой собирали и упаривали в роторном 1 л испарителе, в результате чего получали 11,0 г маслянистого остатка. Полученное вещество растворяли в 250 мл раствора метанола и воды (4:6) и вводили в 80 мл ГХ-колонку со смолой 161 (Токо Наак). Колонку промывали 350 мл раствора метанола и воды (4:6). Затем колонку быстро промывали при 8 мл/мин раствором метанола и воды (7:3) до тех пор, пока из колонки не начинали элюироваться окрашенные примеси (промывка приблизительно 2 объемами слоя). На этой стадии начинали элюировать градиентом метанола с изменением концентрации от 70 до 100% в течение 1 ч при скорости потока 8 мл/мин. Фракции, содержащие нужный продукт, упаривали досуха, а затем очищали с помощью обращеннофазовой ЖХВД на колонке (50 мм х 25 см) с 10 мкм С18 Кготакб с использованием смеси ацетонитрил:буфер, состоящий из 0,01М ацетата аммония, 0,02% трифторуксусной кислоты и 26% ацетонитрила, (5:95) в качестве подвижной фазы, проходящей за 50 мин при скорости потока 120 мл/мин. Затем использовали линейный градиент от (5:95) до (33:67) в течение еще 40 мин. Фракции, содержащие нужный продукт, объединяли (530 мл), рН доводили до 9 добавлением 10% гидроксида аммония и экстрагировали метиленхлоридом (400 мл). Метиленхлоридный слой отделяли и выпаривали досуха, в результате чего получали очищенный 6дезокси-1 3-циклопропил-эритромицин В (12 мг). Структуру этого продукта подтверждали с помощью масс-спектрометрии.
Время удерживания при ЖХВД - Метод В21,4 мин
АПХИ-МС (т/е); (М+Н)+-наблюдали 714; для С38Н68ЫО12 требовалось 714.
Пример 17. Получение 6-дезокси-1 3пропил-эритромицина В с использованием 8.егуШгаеа ΝΚΚΕ 18643.
Культуру 8.егу!йгаеа ΝΚΚΕ 18643 инокулировали из трехдневных бляшек, полученных на ΥΡΌ-агаре (0,5% дрожжевой экстракт Ойсо, 0,5% бакто-пептон ОГсо, 0,25% декстроза, 0,5% МОР8, 1,7% бакто-агар ОГсо, рН доводили до 7,0) в 25 мл ΥР^-бульоне (0,5% дрожжевой экстракт О1Гсо, 0,5% бакто-пептон ОГсо, 0,25% декстроза, 0,5% МОР8, рН доводили до 7,0) в 250 мл колбе Эрленмейера. Колбу инкубировали при 225 об/мин в течение 48 ч при 29°С. 2,5 мл инокулировали в 25 мл среды ΕΒΥ-Р (содержащей 5% декстрозу, 3% соевую муку ΝιιΙπкоу, 0,3% (ΝI у8Об 0,5% ЫаС1, 0,6% СаСО3, рН доводили до 7,0) и инкубировали при 225 об/мин и при 29°С в течение полных 6 дней. Через 24, 72 и 120 ч в колбу добавляли масляную кислоту (400 мл.д., 400 мл.д. и 200 мл.д., соответственно). рН всего бульона доводили до 9,1 с использованием 1н. №1ОН. Образец два раза экстрагировали равным объемом этилацетата. Этилацетатные фазы концентрировали досуха в присутствии азота (на водяной бане при 50°С), а затем ресуспендировали в 1,0 мл метанола для ЖХВД-анализа. Этот анализ подтвердил получение 6-дезокси-13-пропилэритромицина В.
Время удерживания при ЖХВД - Метод С - 23,5 мин
АПХИ-МС (т/е); (М+Н)+-наблюдали 716; для С38Н70КО11, требовалось 716.
Пример 18. Оценка антибактериальной активности.
Анализ на антибактериальную активность осуществляли ш νίΙΐΌ в планшетах для микротитрования и интерпретировали в соответствии со стандартами РегГотапсе 8!апбайк Гог ΛπΙίιηίсгоЫа1 ΌίκΚ 8иксерДЬ11йу Тек!к - 8ίχ(4 Εά^ΐ^оп: Арргоуеб 8!апбай, опубликованными Национальным комитетом по клиническим лабораторным стандартам (ЫССЬ8). Для различных бактерий были получены минимальные ингибирующие концентрации (МГС). Так, например, штамм 80СВ5 8!арйу1ососсик аигеик (штамм, восприимчивый к макролиду) давал, в основном, значения в пределах от <0,1 до 1,56 мкг/мл.

Claims (31)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Соединение формулы 1
    НзС ОР13 и его фармацевтически приемлемые соли, где К! представляет α-разветвленную С3-С8алкильную, алкенильную, алкинильную, алкоксиалкильную или алкилтиоалкильную группу, каждая из которых может быть необязательно замещена одной или несколькими гидроксильными группами; С5-С8-циклоалкилалкильную группу, где указанная алкильная группа является α-разветвленной С2-С5-алкильной группой; С3-С8-циклоалкильную или С5-С8-циклоалкенильную группу, каждая из которых может быть необязательно замещена метильной группой, или одной или несколькими гидроксильными группами, или одной или несколькими С1-С4алкильными группами или атомами галогена; или 3-6-членное кислород- или серосодержащее гетероциклическое кольцо, которое может быть насыщенным или полностью или частично ненасыщенным и которое может быть необязательно замещено одной или несколькими С1-С4алкильными группами или атомами галогена; или К1 представляет фенил, который может быть необязательно замещен, по крайней мере, одним заместителем, выбранным из С1-С4алкильной, С1-С4-алкокси- и С1-С4-алкилтиогрупп, атомов галогена, гидроксильных групп, трифторметила и циано; или К! может представлять группу формулы где Х обозначает О, 8. или -СН2-, а каждый из а, Ь, с и ά независимо представляет 0-2. и а+Ь+с+ά < 5;
    К2 представляет Н или ОН;
    каждый из К3-К5 независимо представляет Н, СН3 или СН2СН3;
    К6 представляет Н или ОН; а
    К7 представляет Н, СН3 или СН2СН3;
    К8 представляет Н или дезозамин;
    К9 представляет Н, СН3 или СН2СН3;
    К10 представляет ОН, микарозу (К13 = Н) или кладинозу (К13 = СН3);
    К11 представляет Н, или К10=К11=0; и
    Κί2 представляет Н, СН3 или СН2СН3;
    или любое из определенных выше соединений, модифицированное заменой одной или нескольких групп -СНОН или -СНОК кетогруппой.
  2. 2. Соединение формулы и его фармацевтически приемлемые соли, где К! представляет Н, С1-С8-алкильную, С2-С8алкенильную, С2-С8-алкинильную, алкоксиалкильную или алкилтиоалкильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода в каждой алкильной или алкоксигруппе, где каждая из указанных алкильной, алкокси-, алкенильной или алкинильной групп может быть замещена одной или несколькими гидроксильными группами, или одним или несколькими атомами галогена; или С3-С8-циклоалкильную или С5-С8-циклоалкенильную группу, каждая из которых может быть необязательно замещена метильной группой, либо одной или несколькими С1-С4алкильными группами или атомами галогена; или 3-6-членное кислород- или серосодержащее гетероциклическое кольцо, которое может быть насыщенным либо полностью или частично ненасыщенным и которое может быть необязательно замещено одной или несколькими С1-С4алкильными группами или атомами галогена; или группу формулы 8К14. где К14 представляет С1-С8-алкильную, С2-С8-алкенильную, С2-С8алкинильную, С3-С8-циклоалкильную, С5-С8циклоалкенильную, фенильную или замещенную фенильную группу, где заместителем является С1-С4-алкил, С1-С4-алкокси или галоген;
    или 3-6-членное кислород- или серосодержащее гетероциклическое кольцо, которое может быть насыщенным, либо полностью или частично ненасыщенным и которое может быть необязательно замещено одной или несколькими С1-С4-алкильными группами или атомами галогена;
    К2 представляет Н или ОН;
    каждый из К3-К5 независимо представляют Н, СН3, или СН2СН3;
    К6 представляет Н или ОН;
    К7 представляет Н, СН3 или СН2СН3;
    К8 представляет Н или дезозамин; К9 представляет Н, СН3 или СН2СН3;
    К10 представляет ОН, микарозу (К13=Н) или кладинозу (К13=СН3);
    К11 представляет Н; или К10=Кп=0; и
    К12 представляет Н, СН3 или СН2СН3. при условии, что если К3-К5 представляют СН3. К7 представляет СН3. К9 представляет СН3 и К12 представляет СН3, то К1 не является Н или С1алкилом, или любое из определенных выше соединений, модифицированное заменой одной или нескольких групп -СНОН или -СНОК кетогруппой.
  3. 3. Соединение формулы 1 по п.1, где Κι представляет С3-С6-циклоалкильную или циклоалкенильную группу, которая может быть необязательно замещена одной или несколькими гидроксильными группами или одной или несколькими С1 -С4-алкильными группами.
  4. 4. Соединение циклопропил.
  5. 5. Соединение циклобутил.
  6. 6. Соединение циклопентил.
  7. 7. Соединение циклогексил.
  8. 8. Соединение по по по по по
    п.3,
    п.3,
    п.3,
    п.3,
    п.1, где где где где где
    Κ1
    Κ1
    Κ1
    Κ1 представляет представляет представляет представляет представляет α-разветвленную С3-С8-алкильную, алкенильΚ1 ную, алкинильную, алкоксиалкильную или алкилтиоалкильную группу.
  9. 9. Соединение по п.8, где Κ1 представляет изопропил.
  10. 10. Соединение по п.8, где Κ1 представляет втор-бутил.
  11. 11. Соединение по п. 8, где Κ1 представляет 2-бутен-2-ил, 2-пентен-2-ил, или 4-метил-2пентен-2-ил.
  12. 12 Соединение по п. 8, где Κ1 представляет 1 -метилтиоэтил.
  13. 13. Соединение по п.1, где Κ1 представляет 5- или 6-членное кислород- или серосодержащее гетероциклическое кольцо, которое может быть необязательно замещено одной или несколькими гидроксильными группами, или С1 -С4алкильными группами, или атомами галогена.
  14. 14. Соединение по п.13, где Κ1 представляет 3-тиенил.
  15. 15. Соединение по п.13, где Κ1 представляет 3-фуранил.
  16. 16. Соединение по п. 1, где Κ1 представляет фенил.
  17. 17. Соединение по п.1, где Κ! представляет группу формулы (а), где а и Ь=0, с и ά = 1, а X представляет -СН2-.
  18. 18. Соединение по п. 1, где Κ1 представляет группу формулы (а), где а и Ь=0, с=1, ά=2, а X представляет -СН2-.
  19. 19. Соединение по п. 1, где Κ! представляет группу формулы (а), где а и Ы=0, с и ά=1, а Х=0.
  20. 20. Соединение по п.2, где Κ1 представляет 8Κ14, а Κ14 представляет метил или этил.
  21. 21. Соединение по п. 2, где Κ1 представляет этил, пропил, бутил, изопропил или втор-бутил.
  22. 22. Соединение по п.2, где Κ! представляет 1-(трифторметил)этил.
  23. 23. Способ получения соединения формулы 1 по п. 1 или формулы 2 по п.2, который включает ферментацию микроорганизма, способного продуцировать эритромицин в присутствии карбоновой кислоты формулы ВдСОгН, где Κ| является таким, как он был определен в п.1 или в п. 2, или ее соли, сложного эфира или амида или ее окисленного предшественника и выделения соединения формулы 1 или 2.
  24. 24. Способ по п.23, где указанным микроорганизмом является 8ассйагоро1у5рога егуФгаеа. который может необязательно содержать эффективно интегрированную плазмиду, способную регулировать биосинтез соединения формулы 1, где указанная плазмида может необязательно содержать промотор/ген-активатор РК8 типа II.
  25. 25. Способ по п.24, где указанный микроорганизм 8ассйагоро1у5рога егуфгаеа выбирают из штаммов ΝΚΚΣ 2338, 18643 или 21484, которые могут необязательно содержать эффективно интегрированную плазмиду, способную регулировать биосинтез соединения формулы 1 , где указанная плазмида может необязательно содержать асй-промотор и соответствующий ему ген-активатор асШ-огГ 4.
  26. 26. Способ по п.25, где указанной необязательно интегрированной плазмидой является рАУЪО, рЮ1, рМЭ30, рСЖ26, рСЖ49, рсАТ12, рс-АТХ или другие аналогичные конструкции.
  27. 27. Способ по п.25, где указанным микроорганизмом является 8.егу111гаеа ΕΚΜΌ1, 8.егу111гаеа ΝΕΚΣ 2338/рЮ1, 8.егу111гаеа ΝΕΚΣ 2338ΦΝΏ30 или другие аналогичные трансформанты.
  28. 28. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество соединения по п. 1 или 2 в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.
  29. 29. Способ лечения бактериальной инфекции или нарушения, связанного с бактериальной инфекцией, или протозойной инфекции у млекопитающего, рыбы или птицы, включающий введение указанному млекопитающему, рыбе или птице терапевтически эффективного количества соединения по п. 1 или 2.
  30. 30. Использование соединения по п.1 или 2 для получения лекарственного средства для лечения бактериальной инфекции у млекопитающего, рыбы или птицы.
  31. 31. Использование соединения по п. 1 или 2 для улучшения показателей продуктивности (таких как прирост массы, эффективность усвоения пищи, увеличение удоев и т.п.) у млекопитающего, рыбы или птицы.
EA199900087A 1996-07-05 1997-07-04 Новые эритромицины и способы их получения EA001744B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9614189.0A GB9614189D0 (en) 1996-07-05 1996-07-05 Polyketides and their synthesis
US2418896P 1996-08-19 1996-08-19
GBGB9710962.3A GB9710962D0 (en) 1997-05-28 1997-05-28 Polyketides and their synthesis
PCT/GB1997/001810 WO1998001571A2 (en) 1996-07-05 1997-07-04 Erythromycins and process for their preparation

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA199900087A1 EA199900087A1 (ru) 1999-08-26
EA001744B1 true EA001744B1 (ru) 2001-08-27

Family

ID=27268361

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA199900087A EA001744B1 (ru) 1996-07-05 1997-07-04 Новые эритромицины и способы их получения

Country Status (28)

Country Link
EP (3) EP2182067A3 (ru)
JP (2) JP2000511063A (ru)
KR (1) KR20000023579A (ru)
CN (1) CN1179046C (ru)
AP (1) AP1029A (ru)
AT (2) ATE451455T1 (ru)
AU (2) AU731301B2 (ru)
BG (1) BG103133A (ru)
BR (1) BR9710209A (ru)
CA (2) CA2259420C (ru)
DE (2) DE69739688D1 (ru)
DK (2) DK0910633T3 (ru)
EA (1) EA001744B1 (ru)
EE (1) EE03976B1 (ru)
ES (2) ES2244001T3 (ru)
GB (1) GB2331518B (ru)
GE (1) GEP20012348B (ru)
IL (1) IL127916A0 (ru)
IS (1) IS4940A (ru)
NO (1) NO990012L (ru)
NZ (1) NZ333861A (ru)
OA (1) OA10952A (ru)
PL (1) PL331285A1 (ru)
PT (1) PT909327E (ru)
SI (1) SI0910633T1 (ru)
SK (1) SK182498A3 (ru)
TR (1) TR199900006T2 (ru)
WO (2) WO1998001571A2 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA014711B1 (ru) * 2005-05-24 2011-02-28 Пфайзер Инк. Мотилидные соединения, содержащая их фармацевтическая композиция, их применение, способ лечения заболевания со сниженной моторикой желудочно-кишечного тракта и способ индукции сокращения ткани

Families Citing this family (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6063561A (en) * 1991-01-17 2000-05-16 Abbott Laboratories Polyketide derivatives and recombinant methods for making same
US6060234A (en) * 1991-01-17 2000-05-09 Abbott Laboratories Polyketide derivatives and recombinant methods for making same
US6558942B1 (en) 1994-05-06 2003-05-06 The Leland Stanford Junior University Combinatorial polyketide libraries produced using a modular PKS gene cluster as scaffold
US5712146A (en) 1993-09-20 1998-01-27 The Leland Stanford Junior University Recombinant combinatorial genetic library for the production of novel polyketides
US6500960B1 (en) 1995-07-06 2002-12-31 Stanford University (Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University) Method to produce novel polyketides
US6927057B2 (en) 1993-09-20 2005-08-09 Kosan Biosciences Macrolide analogs
US20030170725A1 (en) 1993-09-20 2003-09-11 Chaitan Khosla Combinatorial polyketide libraries produced using a modular PKS gene cluster as scaffold
US6495348B1 (en) 1993-10-07 2002-12-17 Regents Of The University Of Minnesota Mitomycin biosynthetic gene cluster
JP3633629B2 (ja) 1995-07-06 2005-03-30 ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ ポリケチドの無細胞合成
EP0870053A4 (en) 1995-12-19 2002-09-11 Univ Minnesota METABOLIC PROCESS FOR THE MANUFACTURE OF POLYHYDROXYALCANOATE MONOMER SYNTHASES
US6271255B1 (en) 1996-07-05 2001-08-07 Biotica Technology Limited Erythromycins and process for their preparation
US6399789B1 (en) 1996-12-18 2002-06-04 Kosan Biosciences, Inc. Multi-plasmid method for preparing large libraries of polyketides and non-ribosomal peptides
US6902913B2 (en) 1997-04-30 2005-06-07 Kosan Biosciences, Inc. Recombinant narbonolide polyketide synthase
US6117659A (en) 1997-04-30 2000-09-12 Kosan Biosciences, Inc. Recombinant narbonolide polyketide synthase
US6503741B1 (en) 1998-05-28 2003-01-07 Kosan Biosciences, Inc. Polyketide synthase genes from Streptomyces venezuelae
AU732909B2 (en) 1997-04-30 2001-05-03 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Combinatorial polyketide libraries produced using a modular PKS gene cluster as scaffold
JP2008169226A (ja) * 1997-04-30 2008-07-24 Kosan Biosciences Inc 足場としてモジュラー性ｐｋｓ遺伝子クラスターを使用して生成されるコンビナトリアルなポリケチドライブラリー
US6262340B1 (en) 1997-07-10 2001-07-17 Kosan Biosciences, Inc. Production of polyketides in plants
AP1060A (en) 1998-01-02 2002-04-23 Pfizer Prod Inc Novel erythromycin derivatives.
WO1999036546A1 (en) * 1998-01-14 1999-07-22 Glaxo Group Limited Polyketides and their synthesis
CA2328427A1 (en) * 1998-05-28 1999-12-02 Kosan Biosciences, Inc. Recombinant narbonolide polyketide synthase
US6265202B1 (en) 1998-06-26 2001-07-24 Regents Of The University Of Minnesota DNA encoding methymycin and pikromycin
GB9814006D0 (en) * 1998-06-29 1998-08-26 Biotica Tech Ltd Polyketides and their synthesis
CA2341640A1 (en) 1998-07-02 2000-01-13 Chaitan Khosla Methods for making polyketides using altered pks
GB9814622D0 (en) * 1998-07-06 1998-09-02 Biotica Tech Ltd Polyketides,their preparation,and materials for use therein
CA2347128A1 (en) 1998-10-28 2000-05-04 Kosan Biosciences, Inc. Library of novel "unnatural" natural products
JP4043191B2 (ja) 1998-11-03 2008-02-06 ファイザー・プロダクツ・インク 新規なマクロライド抗生物質
US6358712B1 (en) 1999-01-05 2002-03-19 Trustee Of Boston University Ordered gene assembly
ID30233A (id) 1999-01-27 2001-11-15 Pfizer Prod Inc Antibiotika ketolida
US7001748B2 (en) 1999-02-09 2006-02-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods of making polyketides using hybrid polyketide synthases
EP1153124A2 (en) * 1999-02-09 2001-11-14 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods to mediate polyketide synthase module effectiveness
MXPA01010521A (es) 1999-04-16 2003-08-19 Johnson & Johnson Antibacteriales de cetolidos.
AU775637B2 (en) 1999-04-16 2004-08-12 Kosan Biosciences, Inc. Macrolide antiinfective agents
US6514944B2 (en) 1999-04-16 2003-02-04 Kosan Biosciences, Inc. Macrolide antiinfective agents
US6590083B1 (en) 1999-04-16 2003-07-08 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Ketolide antibacterials
US6939861B2 (en) 1999-04-16 2005-09-06 Kosan Biosciences, Inc. Amido macrolides
US6451768B1 (en) 1999-04-16 2002-09-17 Kosan Biosciences, Inc. Macrolide antiinfective agents
PL352720A1 (en) 1999-05-24 2003-09-08 Pfizer Products Inc. 13-methyl-erythromycin derivatives
GB9912563D0 (en) * 1999-05-28 1999-07-28 Biotica Tech Ltd Polyketides and their synthesis
ES2283344T3 (es) 1999-10-29 2007-11-01 Kosan Biosciences, Inc. Analogos de la rapamicina.
EP1101769A3 (en) 1999-11-18 2001-10-24 Pfizer Products Inc. Nitrogen containing erythromycin derivatives
AU2001238476A1 (en) 2000-02-18 2001-08-27 Kosan Biosciences, Inc. Motocide compounds
EP1146051A3 (en) * 2000-04-10 2001-10-31 Pfizer Products Inc. Erythromycin A derivatives
AU2001248588B2 (en) 2000-04-13 2006-02-02 Biotica Technology Limited Hybrid glycosylated products and their production and use
EP1492404B1 (en) 2002-02-19 2011-12-28 Dow AgroSciences LLC Novel spinosyn-producing polyketide synthases
ES2544624T3 (es) 2002-07-16 2015-09-02 Buck Institute For Research On Aging Producción de policétidos
DK200201957A (da) 2002-12-20 2003-01-20 Alpharma Aps 10-substituted erythromycin ketolides and methods of making
GB0230217D0 (en) * 2002-12-27 2003-02-05 Biotica Tech Ltd Borrelidin-producing polyketide synthase and its uses
EP2535042A1 (en) 2003-06-16 2012-12-19 ANDRX Pharmaceuticals LLC. Oral sustained-release composition comprising a macrolide
GB0327720D0 (en) 2003-11-28 2003-12-31 Biotica Tech Ltd Erythromycins and process for their preparation
GB0417852D0 (en) 2004-08-11 2004-09-15 Biotica Tech Ltd Production of polyketides and other natural products
WO2010034243A1 (en) 2008-09-24 2010-04-01 Shanghai Institute Of Organic Chemistry, Chinese Academy Of Sciences Novel gene cluster
GB0904540D0 (en) 2009-03-17 2009-04-29 Biotica Tech Ltd Novel compounds and methods for their production
CN101519637B (zh) * 2009-04-07 2011-06-15 华东理工大学 一种红色糖多孢菌及其发酵生产红霉素的方法
GB0914589D0 (en) 2009-08-20 2009-09-30 Biotica Tech Ltd Novel compounds and methods for their production
JP5894935B2 (ja) 2010-02-09 2016-03-30 ニューロヴィベ プハルマセウトイカル エービー サングリフェリン系化合物
WO2011098808A1 (en) 2010-02-09 2011-08-18 Biotica Technology Limited Sanglifehrin based compounds
WO2011098805A1 (en) 2010-02-09 2011-08-18 Biotica Technology Limited Sanglifehrin based compounds
GB201118334D0 (en) 2011-10-24 2011-12-07 Biotica Tech Ltd Novel dosage form
WO2013172782A1 (en) * 2012-05-16 2013-11-21 Nanyang Technological University A polyketide synthase construct and its use in the preparation of polyketides
US10533016B2 (en) 2015-01-09 2020-01-14 Revolution Medicines, Inc. Compounds that participate in cooperative binding and uses thereof
EP4085933A3 (en) 2016-04-12 2023-01-11 Ginkgo Bioworks, Inc. Compositions and methods for the production of compounds
US11781128B2 (en) 2016-07-29 2023-10-10 Isomerase Therapeutics Limited Methods for producing hybrid polyketide synthase genes and polyketides
US20190264184A1 (en) * 2016-10-28 2019-08-29 Ginkgo Bioworks, Inc. Compositions and methods for the production of compounds
AU2017350900A1 (en) 2016-10-28 2019-06-13 Ginkgo Bioworks, Inc. Compositions and methods for the production of compounds
JP7100653B2 (ja) 2017-02-22 2022-07-13 アイエスアール イミューン システム レギュレイション ホールディング アクチエボラグ（パブル） 新規な免疫刺激マクロライド
US11059845B2 (en) 2017-02-22 2021-07-13 ISR Immune System Regulation Holding AB (publ) Immune stimulating macrolides
CA3094747A1 (en) 2018-03-23 2019-09-26 ISR Immune System Regulation Holding AB (publ) Combinations of macrolide compounds and immune checkpoint inhibitors
CN116947884A (zh) 2019-01-22 2023-10-27 艾奥维安制药公司 Mtorc调节剂及其用途
TW202132316A (zh) 2019-11-04 2021-09-01 美商銳新醫藥公司 Ｒａｓ抑制劑
KR20220109407A (ko) 2019-11-04 2022-08-04 레볼루션 메디슨즈, 인크. Ras 억제제
WO2021091967A1 (en) 2019-11-04 2021-05-14 Revolution Medicines, Inc. Ras inhibitors
CA3194067A1 (en) 2020-09-15 2022-03-24 Revolution Medicines, Inc. Ras inhibitors
KR20240014756A (ko) 2022-07-26 2024-02-02 강원대학교산학협력단 에리트로마이신으로 로딩된 키토산 결합 닭뼈유래 수산화인회석 나노입자 및 그 제조방법
CN117288869B (zh) * 2023-11-24 2024-02-09 中国医学科学院医药生物技术研究所 一种原料药中对甲苯磺酸酯类杂质的检测方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993013663A1 (en) * 1992-01-17 1993-07-22 Abbott Laboratories Method of directing biosynthesis of specific polyketides
US6060234A (en) * 1991-01-17 2000-05-09 Abbott Laboratories Polyketide derivatives and recombinant methods for making same
US5712146A (en) * 1993-09-20 1998-01-27 The Leland Stanford Junior University Recombinant combinatorial genetic library for the production of novel polyketides
ATE206164T1 (de) * 1993-09-20 2001-10-15 Univ Leland Stanford Junior Rekombinante herstellung von neuen polyketiden

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA014711B1 (ru) * 2005-05-24 2011-02-28 Пфайзер Инк. Мотилидные соединения, содержащая их фармацевтическая композиция, их применение, способ лечения заболевания со сниженной моторикой желудочно-кишечного тракта и способ индукции сокращения ткани

Also Published As

Publication number Publication date
WO1998001546A2 (en) 1998-01-15
AU3450997A (en) 1998-02-02
WO1998001571A2 (en) 1998-01-15
GB9900156D0 (en) 1999-02-24
DE69733416D1 (de) 2005-07-07
ES2337424T3 (es) 2010-04-23
PT909327E (pt) 2005-10-31
EE9900014A (et) 1999-08-16
ATE451455T1 (de) 2009-12-15
EP0910633B1 (en) 2009-12-09
EA199900087A1 (ru) 1999-08-26
AP1029A (en) 2001-12-11
JP2000516450A (ja) 2000-12-12
JP2000511063A (ja) 2000-08-29
BR9710209A (pt) 2000-01-11
NO990012D0 (no) 1999-01-04
BG103133A (en) 2000-04-28
EP2182067A2 (en) 2010-05-05
OA10952A (en) 2002-02-25
TR199900006T2 (xx) 1999-04-21
CA2259420C (en) 2007-09-18
GEP20012348B (en) 2001-01-25
CN1179046C (zh) 2004-12-08
DK0910633T3 (da) 2010-03-29
CA2259420A1 (en) 1998-01-15
DK0909327T3 (da) 2005-09-26
ES2244001T3 (es) 2005-12-01
GB2331518B (en) 2001-03-14
ATE296893T1 (de) 2005-06-15
GB2331518A (en) 1999-05-26
JP4173551B2 (ja) 2008-10-29
AP9901444A0 (en) 1999-03-31
NZ333861A (en) 2000-08-25
AU731654B2 (en) 2001-04-05
EP0909327A2 (en) 1999-04-21
IS4940A (is) 1999-01-04
EE03976B1 (et) 2003-02-17
KR20000023579A (ko) 2000-04-25
AU731301B2 (en) 2001-03-29
CA2259463A1 (en) 1998-01-15
WO1998001546A3 (en) 1998-04-09
EP0909327B1 (en) 2005-06-01
EP2182067A3 (en) 2010-07-14
IL127916A0 (en) 1999-11-30
SI0910633T1 (sl) 2010-04-30
DE69739688D1 (de) 2010-01-21
PL331285A1 (en) 1999-07-05
SK182498A3 (en) 2000-05-16
WO1998001571A3 (en) 1998-02-19
DE69733416T2 (de) 2006-04-27
CN1229438A (zh) 1999-09-22
AU3451497A (en) 1998-02-02
EP0910633A2 (en) 1999-04-28
NO990012L (no) 1999-02-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA001744B1 (ru) Новые эритромицины и способы их получения
US6271255B1 (en) Erythromycins and process for their preparation
US6777543B2 (en) 13-methyl erythromycin derivatives
US7015203B2 (en) Macrolides
JP2000219697A (ja) 新規なアザリドとその製造方法
JP2000515390A (ja) 新規ポリケチド誘導体およびそれを製造するための組換え方法
KR20010071684A (ko) 폴리케타이드 및 그들의 합성방법
US6946482B2 (en) Motilide compounds
Cane et al. Macrolide biosynthesis. 6 Mechanism of polyketide chain elongation
EP2423319B1 (en) Amycolamicin, method for production thereof, and use thereof
US7807418B2 (en) Method for producing hybrid polyketide synthases
EP1602727A2 (en) Novel erythromycins and process for their preparation
CN111378610B (zh) 一种巴弗洛霉素高产工程菌及其构建和应用
WO2015145152A1 (en) Antimicrobial agents
CZ437598A3 (cs) Erythromyciny, způsoby jejich výroby, farmaceutická kompozice na jejich bázi, způsob léčení a použití
MXPA01010817A (en) 13-methyl-erythromycin derivatives
JP2009219493A (ja) ポリケチド類及びそれらの合成

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU