ES2244001T3 - Eritromicinas y procedimiento para su preparacion. - Google Patents
Eritromicinas y procedimiento para su preparacion.Info
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Abstract
LAS ERITROMICINAS, PARTICULARMENTE CON SUSTITUYENTES R1 A LA ALTURA DEL C-13 (POR EJEMPLO, GRUPOS CICLOALQUILOS O CICLOALQUENILOS C 3 - C 6 ) SE PREPARAN HACIENDO FERMENTAR ORGANISMOS ADECUADOS EN PRESENCIA DE R 1 CO 2 H. UN ORGANISMO PREFERIDO ES LA SACCHAROPOLYSPORA ERYTHRAEA, QUE CONTENGA PREFERENTEMENTE UN PLASMIDIO INTEGRADO CAPAZ DE DIRIGIR LA SINTESIS DE LOS COMPUESTOS DESEADOS.
Description
Eritromicinas y procedimiento para su
preparación.
La presente invención se refiere a nuevos
policétidos, así como a procedimientos y medios para su preparación,
y específicamente a nuevas eritromicinas que son útiles como agentes
antibacterianos y antiprotozoarios y otras aplicaciones (por
ejemplo, anticancerígenos, aterosclerosis, reducción de motilidad
gástrica, etc.) en mamíferos, incluyendo al hombre, así como en
peces y aves. Esta invención también se refiere a composiciones
farmacéuticas que contienen los nuevos compuestos, y a métodos para
tratar infecciones bacterianas y protozoarias en mamíferos, peces y
aves, mediante la administración de los compuestos a mamíferos,
peces y aves que requieran de dicho tratamiento.
Los genes biosintéticos de policétidos o
porciones de estos, los cuales se pueden derivar a partir de
diferentes sectores de genes biosintéticos de policétidos, son
manipulados para permitir la producción de las nuevas
eritromi-
cinas.
cinas.
Los policétidos son de una clase estructuralmente
muy grande y diversa de productos naturales que incluyen muchos
compuestos que poseen propiedades antibióticas y otras propiedades
farmacológicas, tales como la eritromicina, tetraciclinas,
rapamicina, avermectina, ionóforos de poliéter y FK506. En
particular, los policétidos son producidos abundantemente por medio
de Streptomyces y bacterias de actinomicetos relacionadas.
Estos son sintetizados mediante condensación consecutiva repetida,
de una manera análoga a la de la biosíntesis de ácido graso. La
mayor diversidad estructural encontrada entre los policétidos
naturales proviene de la selección de (usualmente) acetato o
propionato como unidades de "iniciación" o de "extensión";
y del grado variable del procesamiento del grupo
\beta-ceto, observado después de cada
condensación. Ejemplos de las etapas de procesamiento incluyen la
reducción a \beta-hidroxiacilo, reducción seguida
por la deshidratación a 2-enoilo y la reducción
completa del aciltioéster saturado. El resultado estereoquímico de
estas etapas de procesamiento también se especifican para cada
ciclo de extensión de cadena. La biosíntesis de los policétidos es
iniciada por un grupo de enzimas formadoras de cadena conocidas
como sintasas de policétidos. Se han descrito dos clases de sintasa
de policétido (PKS) en actinomicetos. Sin embargo, los nuevos
policétidos y procesos objeto de esta invención son sintetizados por
sintasas de policétidos para los macrólidos de eritromicina,
avermectina y rapamicina (Figura 1) y consiste en un grupo o
"módulo" diferente de enzimas para cada ciclo de extensión de
cadena de policétidos (Figura 2ª) Cortes, J. et al. Nature
(1990) 348:176-178; Donadio, S. et al Science
(1991) 252:675-679; MacNeil, D. J. et al.
Gene (1992), 115:119-125; Schwecke, T.et al, Proc.
Natl. Acad. Sci. EUA (1995) 92:7839-7843. Nota:
el término "módulo natural" tal y como se usa aquí mismo, se
refiere al grupo de dominios contiguos, desde un gen de
\beta-cetoacilsintasa ("KS") al siguiente gen
de proteína portadora de acil ("ACP"), el cual lleva a cabo un
ciclo de extensión de cadena de policétido. El término "módulo
combinatorio" es usado para referirse a cualquier grupo de
dominios contiguos (y partes de dominio) que se extienden desde el
primer punto de un primer módulo natural, a un segundo punto
equivalente de un segundo módulo natural. El primer y segundo punto
generalmente estarán en los dominios del núcleo, los cuales están
presentes en todos los módulos, es decir, ambos en puntos
equivalentes de dominios KS, AT (acil transferasa), ACP
respectivos, o en regiones de enlace entre los dominios.
La Figura 2a muestra la organización de los genes
de la sintasa de policétido productora de eritromicina, (también
conocida como sintasa B 6-desoxieritronolida,
DEBS). Tres marcos de lectura abiertos codifican los polipéptidos
DEBS. Los genes están organizados en seis módulos designados de
unidades repetidas. El primer marco de lectura abierto codifica a
la primera multienzima o casete (DEBS1)la cual consiste en
tres módulos: el módulo de carga (carga ery) y dos módulos de
extensión (módulos 1 y 2). El módulo de carga comprende una
transferasa de acilo y una proteína portadora de acilo. Esto puede
contrastarse con la Figura 1 de WO93-13663 (referida
arriba). Esta muestra ORF1, para consistir en solo dos módulos, el
primero de los cuales, es de hecho el módulo de carga y el primer
módulo de extensión.
La eliminación en marco de la parte de ADN
codificadora del dominio de la cetoreductasa del módulo 5 en el
DEBS, ha mostrado conducir a la formación de análogos de
eritromicina
5,6-dideoxi-3-micarosil-5-ocoeritronolida
B,
5,6-dideoxi-5-oxoeritronolida
B y 5,6-dideoxi-6,
6-epoxi-5-oxoeritronolida
B (Donadio, S, et al. Science, (1991)
252:675-679). De la misma manera, la alteración
de los residuos de sitio activos en el dominio de enoilreductasa
del módulo 4 en el DEBS, por medio de ingeniería genética del ADN
codificador de sintasa de policétido correspondiente y su
introducción dentro de Saccharopolyspora erythraea condujo a
la producción de 6,7-anhidroeritromicina C
(Donadio S, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. EUA (1993)
90:7119-7123).
En la Solicitud de Patente Internacional número
WO 93/13663, la cual está incorporada en su totalidad aquí por
referencia, describe tipos adicionales de manipulación genética de
los genes DEBS que son capaces de producir policétidos alterados.
Sin embargo, se ha indicado que muchos de los intentos de este tipo
son improductivos (Hutchinson C. R. y Fuji, I. Annu. Rev.
Microbiol.(1995) 49:201-238, en la pág. 231).
Ha sido descubierta la secuencia de ADN completa de los genes
procedentes de Streptomyces hygroscopicus que codifican a la
sintasa de policétido Tipo I modular que gobierna la biosíntesis de
la rapamicina de policétido inmunosupresora macrocíclica, ha sido
descubierta (Schwecke, T. et al. (1995) Proc. Natl. Acd. Sci. EUA
92:7839-7843) (Figura 3). La secuencia de ADN
se deposita en la Base de Datos EMBL/Genbank bajo el número
de acceso X86780.
A pesar de que se ha identificado un gran número
de policétidos terapéuticamente importantes, existe todavía la
necesidad de obtener unos nuevos policétidos que tengan propiedades
mejoradas o posean una bioactividad completamente nueva. Los
policétidos complejos producidos por las sintasas de policétidos
Tipo I modulares son particularmente valiosos, ya que éstos
incluyen una actividad conocida como antihelmínticos, insecticidas,
inmunosupresores, fungicidas y/o agentes antibacterianos. A causa
de su complejidad estructural, dichos policétidos nuevos no pueden
ser obtenidos inmediatamente mediante síntesis química total, o
mediante modificaciones químicas de los policétidos conocidos. Un
aspecto de la invención surge de nuestra apreciación de que un
ensamblaje del gen sintasa de policétido Tipo I codifica un módulo
cargador el cual es seguido por los módulos de extensión. Es
particularmente útil el proporcionar un ensamblaje del gen de
sintasa de policétido híbrido en el cual el módulo de carga sea
heterogéneo a los módulos de extensión y que conduzca a un
policétido que tenga una cantidad de iniciación alterada. Este es
un concepto un tanto desconocido para el estado de la técnica
anterior, ya que éste no reconoce la existencia de los módulos de
carga. WO93/13663 se refiere a la alteración de los genes sintasa
de policétido mediante la inactivación de una sola función (es
decir, un solo enzima) para afectar "a un módulo completo" por
medio de la eliminación, inserción o reemplazo de este mismo. El
ensamblaje de carga, en sus términos, no es un módulo.
Si el módulo de carga es uno que acepta muchas
unidades de ácido carboxílico diferentes, entonces el ensamblaje del
gen híbrido puede ser usado para producir muchos policétidos
diferentes. Por ejemplo, un ensamble de gen híbrido puede emplear
ácido nucleico que codifique un módulo de carga avr con
módulos de extensión ery. Un módulo de carga puede aceptar
unidades de ácido no naturales y derivados de estas mismas; el
módulo de carga avr es particularmente útil en este sentido
(Dutton et al., (1991) J. Antibiot.,
44:357-365). Además, es posible determinar la
especificidad del módulo de carga natural para unidades de
iniciación no naturales y para tomar ventaja de la especificidad
relajada del módulo de carga para generar policétidos nuevos. De
esta manera, otro aspecto de la invención, es la capacidad
inesperada del módulo de carga ery para incorporar ácidos
carboxílicos no naturales y derivados de estos mismos, para producir
nuevas eritromicinas y cepas productoras de eritromicina que
contengan únicamente genes DEBS. Por supuesto, se pueden hacer
también alteraciones de un policétido producto, particularmente
reemplazando un módulo de extensión, por uno que dé una unidad de
cétido en un estado de oxidación diferente y/o con una
estereoquímica diferente. Se ha asumido generalmente que la
estereoquímica de los grupos metilo en la cadena de policétido, se
determina mediante la aciltransferasa, pero es de hecho, una
característica de otros dominios de la sintasa de policétido y así
está abierta a la variación solamente mediante el reemplazo de
aquellos dominios individualmente o mediante el reemplazo del
módulo. Pueden añadirse o eliminarse el metilo u otros
sustituyentes mediante el reemplazo total del módulo.
Consecuentemente, se hace aparente para aquellos expertos en la
materia, que es posible combinar el uso de la especificidad de
sustrato relajada del módulo de carga de eritromicina con el
reemplazo del módulo de extensión y la sustitución del módulo de
carga híbrido, como un mecanismo para producir un amplio rango de
nuevas eritromicinas. Así, esta invención describe la producción de
nuevas eritromicinas mediante organismos no transformados y también
dichos ensamblajes de genes, vectores que contienen dichos
ensamblajes de genes, y organismos transformantes que puedan
expresar estos, para producir nuevas eritromicinas en organismos
transformados. Los organismos transformantes pueden albergar
plásmidos recombinantes o se pueden integrar los plásmidos. Un
plásmido con una secuencia int se integrará dentro de un
sitio de adhesión específico (atf) dentro de un cromosoma de
un hospedador. Los organismos transformantes pueden ser capaces de
modificar los productos iniciales, por ejemplo, al llevar a cabo
todas o algunas de las modificaciones biosintéticas normales en la
producción de eritromicinas (como se muestra en la Figura 2B). Sin
embargo, puede hacerse uso de organismos mutantes de tal manera, que
algunos de las vías de paso normales sean bloqueadas, por ejemplo,
para producir productos sin uno o más grupos hidroxi
"naturales" o grupos de azúcares, por ejemplo como se describe
en WO 91/16334 o Weber et al. (1995) J. Bacteriol.
164:425-433 los cuales están incorporados aquí
en su totalidad, para su referencia. Alternativamente, puede
hacerse uso de organismos en los cuales algunas de las vías de paso
normales sean sobreexpresadas para superar etapas limitantes de la
velocidad potenciales, en la producción del producto deseado, por
ejemplo como se describe en WO 97/06266 la cual es incorporada en
su totalidad aquí, para su referencia.
Este aspecto del procedimiento concierne
ampliamente con el tratamiento de los módulos del gen de sintasa de
policétido, como bloques de construcción que pueden ser usados para
construir los sistemas de enzimas y así, de productos de nuevas
eritromicinas de los tipos deseados. Esto involucra generalmente el
partir y ensamblar los módulos y los agrupamientos de módulos
múltiples. Los lugares lógicos para hacer y romper las conexiones
intermodulares son las regiones de enlace que están entre los
módulos. Sin embargo, puede ser preferible hacer los cortes y
uniones adentro de los dominios (es decir, las porciones
codificadoras de enzimas), cerca de los extremos de éstos. El ADN
está altamente conservado aquí, entre todas las sintasas de
policétidos modulares y esto puede ayudar en la construcción de
híbridos que puedan ser transcritos. Esto también ayuda a mantener
el espacio de los sitios activos de las enzimas codificadas, lo cual
puede ser importante. Por ejemplo, al producir un gen híbrido
mediante el reemplazo de un módulo de carga ery por un
módulo de carga avr, se eliminó el módulo ery junto
con una pequeña cantidad del siguiente dominio de cetosintasa (KS).
El inicio del dominio KS (lo suficientemente espaciado del sitio
activo) es altamente conservado y, por lo tanto, proporciona un
sitio de empalme apropiado como alternativa a la región de enlace
que está entre el dominio de carga y el inicio del dominio KS. El
módulo ery extraído fue entonces reemplazado por un módulo
de carga avr.
De hecho, cuando se sustituye un módulo de carga,
es deseable reemplazar, no solo los dominios de los módulos de
carga (generalmente aciltransferasa (AT) y proteína portadora de
acilo (ACP)), sino también la cetosintasa que está en el inicio del
siguiente módulo de extensión. Típicamente el módulo de carga
extraído habría proporcionado un iniciador de propionato y el
reemplazo tiene el objetivo de proporcionar uno o más iniciadores
diferentes. Sin embargo, el propionato puede alimentarse dentro del
módulo de extensión desde un depósito de propionato en la célula
huésped, conduciendo a la disolución de los productos deseados. Esto
se puede evitar en parte sustituyendo un módulo de carga extendido
que incluya todo o la mayoría del dominio de KS. (El sitio de
empalme puede estar en la región del extremo del gen de KS o en el
comienzo del siguiente gen AT, o en la región de enlace que está
entre ellos).
Cuando se reemplazan "módulos", no se
restringe, solo, a módulos "naturales". Por ejemplo, un
"módulo combinatorio" que va a ser extraído y/o reemplazado y/o
insertado puede extenderse desde el dominio correspondiente de dos
módulos de tipo natural, por ejemplo, desde el AT de un módulo
hasta el AT del siguiente, o desde KS hasta KS. Los sitios de
empalme estarán en las correspondientes regiones marginales
conservadas o en las regiones de enlace. Un módulo combinatorio
también puede ser "doble" o múltiple mayor, para añadir 2 o
más módulos al mismo tiempo.
En un aspecto adicional, la invención proporciona
nuevas eritromicinas obtenibles mediante los aspectos previos.
Estos incluyen los siguientes:
(i) Un análogo de eritromicina (siendo un
compuesto macrólido con un anillo de 14 miembros) en el cual,
C-13 soporta una cadena lateral diferente de etilo,
generalmente un grupo alquilo C_{3}-C_{6} de
cadena recta, un grupo alquilo C_{3}-C_{8}
ramificado, un grupo cicloalquilo o cicloalquenilo
C_{3}-C_{8} (sustituido opcionalmente, por
ejemplo, por uno o más grupos alquilo C_{1-4} o
alcoxi de hidroxi o átomos de halógeno), o un heterociclo de
3-6 miembros que contiene O u S, saturado o parcial
o totalmente insaturado, sustituido opcionalmente (como por
cicloalquilo), o R_{1} es fenilo el cual puede estar
opcionalmente sustituido por, al menos, un sustituyente seleccionado
de alquilo C_{1}-C_{4}, alcoxi
C_{1}-C_{4} y grupos alquiltio
C_{1}-C_{4}, átomos de halógeno, trifluorometilo
y ciano; o R_{1} puede ser un grupo con una Fórmula (a) como se
muestra abajo:
en donde x es O, S o -CH-, a, b, c
y d son cada uno independiente O-2 y a + b + c + d
\leq 5. Los candidatos preferidos para el sustituyente R en
C-13, son los grupos de unidades de carboxilato
RCOOR, utilizables como sustratos mediante un módulo iniciador
avr, o variantes de iniciador de rapamicina. Los sustratos
preferidos son los ácidos carboxílicos RCOOH. Los sustratos
alternativos que se pueden utilizar de manera efectiva son las
sales de ácido carboxílico, los ésteres de ácido carboxílico o las
amidas. Los ésteres preferidos son los tioésteres de
N-acetil-cisteamina los cuales
pueden ser utilizados inmediatamente como sustratos por el módulo
iniciador avr, tal y como está ilustrado en Dutton et al. en
EP 0350187, la cual está incorporada en su totalidad aquí, por
referencia. Las amidas preferidas son los imidazoles de
N-acil. Otros sustratos alternativos que se pueden
utilizar, son derivados que son precursores oxidativos de los ácidos
carboxílicos; así, por ejemplo sustratos adecuados pueden ser los
aminoácidos de la fórmula RCH (NH_{2})COOH, ácidos
glioxílicos de la fórmula RCOCOOH, derivados de metilamina de la
fórmula RCH_{2}NH_{2}, derivados de metanol de la fórmula
RCH_{2}OH, aldehídos de la fórmula RCHO o ácidos alcanóicos
sustituidos de la fórmula R(CH_{2})_{n}COOH en
donde n es 2, 4 ó 6. Así, ejemplos de los sustratos preferidos
incluyen al isobutirato (R=i-Pr) y
2-metilbutirato (R=1-metilpropil).
Otras posibilidades incluyen al n-butirato,
carboxilato de ciclopropilo, carboxilato de ciclobutilo,
carboxilato de ciclopentilo, carboxilato de ciclohexilo,
carboxilato de cicloheptanilo, carboxilatos de ciclohexenilo,
carboxilatos de cicloheptanilo y variantes metiladas en anillo, de
carboxilatos cíclicos y los derivados de éstos anteriormente
mencionados.
El análogo de eritromicina puede corresponder al
producto inicial de una sintasa de un PKS
(6-desoxieritronolida) o el producto conseguido
después de uno o más pasos biosintéticos normales. Como se muestra
en la Figura 2B, estos comprenden: 6-hidroxilación;
3-0-glicosilación;
5-0-glicosilación;
12-hidroxilación; y metilación de azúcar
específica.
De esta manera, los análogos pueden incluir
aquellos correspondientes a 6-desoxieritronolida B,
eritromicina A, y los diversos intermediarios y alternativos (a
pesar de no estar limitados a éstos) mostrados en la Figura 2B.
(ii) Análogos de eritromicina que difieren del
compuesto "natural" correspondiente (Figura 2B) en el estado
de oxidación de una o más unidades de cétidos (es decir, la
selección de alternativas de entre el grupo: -CO-,
-CH(OH)-, -CH-, y -CH_{2}-).
La estereoquímica de cualquiera de
-CH(OH)- es también independientemente seleccionable.
(iii) Análogos de eritromicina que difieren del
compuesto "natural" correspondiente en la ausencia de una
cadena lateral de metilo "natural" (esto se consigue mediante
el uso de una variante de AT). Los módulos de extensión normales
usan tanto unidades C_{2} como C_{3} para proporcionar unidades
de cétidos sin metilar o metiladas. Se pueden proporcionar unidades
no metiladas en donde las unidades metiladas sean naturales (y
viceversa, en sistemas en donde existen unidades no metiladas
naturalmente) y también proporcionar unidades más grandes, por
ejemplo, C_{4} para proporcionar sustituyentes de etilo.
(iv) Análogos de eritromicina que difieran del
compuesto "natural" correspondiente en la estereoquímica del
metilo "natural"; y/o sustituyentes de anillo diferentes al
metilo.
(v) Análogos de eritromicina que tengan las
características de dos o más de las secciones (i) a (iv).
(vi) Derivados de cualquiera de los anteriores,
que hayan experimentado procesos adicionales hechos por enzimas que
no sean PKS, por ejemplo, una o más hidroxilación, epoxidación,
glicosilación o metilación.
Se describen procedimientos para la producción de
nuevas eritromicinas de la presente invención. En el procedimiento
más simple, las unidades iniciadoras no naturales (preferentemente,
pero no restringido a los análogos de ácido carboxílico de las
unidades iniciadoras no naturales) son introducidas en organismos no
transformados, capaces de producir eritromicinas. Una aproximación
preferida implica la introducción de una unidad iniciadora en
caldos de fermentación del organismo productor de eritromicina, una
aproximación que es más efectiva para organismos transformados
capaces de producir eritromicinas. Sin embargo, el análogo de la
unidad iniciadora se puede introducir también en preparaciones
alternativas de los organismos productores de eritromicinas, por
ejemplo, preparaciones de células rotas fraccionadas o sin
fraccionar. De nuevo, esta aproximación es igualmente efectiva para
organismos transformados capaces de producir eritromicinas. En otro
procedimiento, uno o más segmentos de módulos o dominios
individuales de ADN codificantes, dentro de una PKS Tipo I
heterogénea (la sintasa de policétido "donadora") han sido
utilizados para reemplazar la codificación del ADN, respectivamente,
módulos o dominios individuales que estén dentro de los genes DEBS
de un organismo productor de eritromicina. Los módulos de carga y
módulos de extensión extraídos de cualquier PKS Tipo I natural o no
natural, son apropiados para esta PKS "donadora", pero
particularmente apropiados para este propósito, son los componentes
de las PKS de Tipo I para la biosíntesis de eritromicina,
rapamicina, avermectina, tetronasina, oleandomicina, monensina,
anfotericina y rifamicina, para las cuales el gen y la organización
modular son conocidos a través del análisis de la secuencia
genética, por lo menos en parte. Ejemplos particularmente
favorables de los módulos de carga de la PKS donadora son aquellos
módulos de carga que muestran una especificidad relajada, por
ejemplo, el módulo de carga de la avermectina, PKS productora de
(avr) de Streptomyces avermitilis; o aquellos módulos de
carga que poseen una especificidad inusual, por ejemplo, los módulos
de carga de PKS productoras de rapamicina, FK506 y ascomicina, las
cuales todas aceptan de manera natural la unidad iniciadora
derivada de shiquimato. Inesperadamente, tanto los organismos
productores de eritromicina manipulados genéticamente como los no
transformados, cuando son cultivados bajo condiciones apropiadas, se
ha encontrado que producen eritromicinas no naturales y en donde
sea apropiado, se ha encontrado que los productos sufren del mismo
proceso que la eritromicina natural.
En un aspecto adicional de la presente invención,
se introduce un plásmido que contenga ADN de PKS "donadora" en
una célula hospedadora bajo condiciones en donde el plásmido se
integra dentro de los genes DEBS del cromosoma de la cepa
productora de eritromicina mediante recombinación homogénea, para
crear una PKS híbrida. Una realización preferida es cuando un ADN
de PKS donadora incluye un segmento que codifica un módulo de carga
de tal manera, que éste módulo de carga se ligue a los genes DEBS
en el cromosoma. Dicha PKS híbrida produce valiosos y nuevos
productos de eritromicina, cuando se cultiva bajo condiciones
apropiadas, como se ha descrito aquí mismo. Específicamente, cuando
el módulo de carga de los genes DEBS es reemplazado por el módulo
de carga de la PKS productora de avermectina (avr), los nuevos
productos de eritromicina contienen una unidad iniciadora típica de
aquéllas usadas por la sintasa de policétido de avr. De esta
manera, cuando el módulo de carga de la PKS de ery es reemplazada
por el módulo de carga de avr, se encuentra que las cepas de
Saccharopolyspora erythraea que contienen dicho híbrido de
PKS, producen macrólidos de 14 miembros que contienen unidades
iniciadoras típicamente utilizadas por la PKS de avr.
Es inesperado que se encuentre que los
policétidos de macrólidos de 14 miembros producidos por dichas
células recombinantes de S. erythraea, incluyan derivados de
eritromicina A, mostrando que son llevados a cabo correctamente los
diversos pasos del proceso, requeridos para la transformación de los
productos del híbrido de PKS en unos nuevos y terapéuticamente
valiosos derivados de eritromicina A. Un aspecto adicional de la
presente invención es el hallazgo inesperado y sorprendente de que
la transcripción de cualquiera de los genes de eritromicina
híbridos se puede incrementar, específicamente, cuando los genes
híbridos se someten al control de un promotor de un gen de PKS de
Tipo II, enlazado a un gen activador específico para este promotor.
Es particularmente destacable que cuando una célula manipulada
genéticamente contiene genes de eritromicina híbridos bajo dicho
control es cultivada bajo condiciones apropiadas para la producción
de eritromicina, se producen niveles significativamente mejorados de
la nueva eritromicina. Dichos incrementos específicos en la
obtención de un producto valioso de eritromicina, también se han
visto en PKS de eritromicina natural colocada bajo el control de un
promotor de PKS Tipo II y un gen activador. En una realización
preferida, los genes deseados presentes en un plásmido derivado de
SCP2*, se colocan bajo el control de un promotor actI bidireccional
derivado del sector del gen biosintético de actinorhodina de
Streptomyces coelicolor y en el cual el vector también
contiene el gen estructural que codifica a la proteína activadora
específica Act II-orf 4. El plásmido recombinante
se introduce en la Saccharopolyspora erythraea, bajo
condiciones en donde ya sea los genes de PKS introducidos o los
genes de PKS ya presentes en la cepa hospedadora, se expresan bajo
el control del promotor actI.
Dichas cepas producen el producto de eritromicina
deseado y el gen activador requiere solamente la presencia del
promotor específico con el fin de mejorar la eficiencia de
transcripción procedente del promotor. Esto es particularmente
sorprendente, ya que los activadores de la familia de
actII-orf4 no pertenecen a una clase reconocida de
las proteínas de unión de ADN. En consecuencia, puede esperarse que
proteínas adicionales u otros elementos de control puedan
requerirse para que tenga lugar la activación en un hospedador
heterogéneo no conocido para producir actinorhodina u otro pigmento
de isocromanoquinona relacionado. También es sorprendente y útil que
las cepas recombinantes puedan producir un producto de eritromicina
más de diez veces, que cuando los mismos genes de PKS están bajo el
control de un promotor natural y el producto de eritromicina
específico también se producido precozmente en un cultivo en
crecimiento, en lugar de solamente durante la transición desde el
crecimiento hasta la fase estacionaria. Dichas eritromicinas son
útiles como antibióticos y para muchos otros propósitos en medicina
humana y veterinaria. De esta manera, cuando la célula manipulada
genéticamente es Saccharopolyspora erythraea, el activador y
el promotor son derivados del sector del gen de PKS de
actinorhodina y el sector del gen de PKS de ery regulado por
actI/actII-orf4 es depositado en el cromosoma
siguiendo la integración específica de sitio de un vector de
plásmido de bajo número de copias, cultivando estas células bajo
condiciones apropiadas se puede producir un producto de macrólido de
14 miembros de más de diez veces en total, que una cepa comparable
que no esté bajo condiciones de control heterogéneo. Cuando en una
célula manipulada genéticamente tal como Saccharopolyspora
erythraea, los genes de PKS bajo este control heterogéneo son
genes de PKS Tipo I híbridos cuya construcción está descrita aquí
mismo, pueden obtenerse más de diez veces de producto de policétido
híbrido, comparándose con los mismos genes de sintasa de policétido
Tipo I híbridos que no estén bajo dicho control. Específicamente,
cuando los genes híbridos de PKS Tipo I son genes de PKS de ery, en
los cuales el módulo cargador es reemplazado por el módulo de carga
avr, se encuentra un incremento de diez veces en las cantidades
totales de los nuevos macrólidos de 14 miembros producidos por las
células manipuladas genéticamente, cuando se cultivan bajo
condiciones apropiadas como se ha descrito aquí mismo
anteriormente.
Los medios apropiados y preferidos para
desarrollar las células productoras de eritromicina diseñadas
genéticamente y sin transformar y los medios apropiados y preferidos
para el aislamiento, identificación y utilidad práctica de las
nuevas eritromicinas están descritos más ampliamente en los
ejemplos.
La presente invención se refiere a los compuestos
de la fórmula 1:
y a las sales farmacéuticamente
aceptables de estos mismos, en
donde:
R_{1} es un grupo alquilo, alquenilo,
alquinilo, alcoxialquilo o alquiltioalquilo
C_{3}-C_{8} alfa-ramificado,
cualquiera de los cuales puede estar opcionalmente sustituido por
unos o más grupos hidroxilo; un grupo cicloalquilalquilo
C_{5}-C_{8} en donde el grupo alquilo es un
grupo alquilo C_{2}-C_{5}
alfa-ramificado; un grupo cicloalquilo
C_{3-}C_{8} o cicloalquenilo C_{5}-C_{8},
cualquiera de los cuales puede estar opcionalmente sustituido por
metilo o uno más hidroxilos, o uno o más grupos alquilo
C_{1}-C_{4} o átomos halo; o un anillo
heterocíclico de 3 a 6 miembros que contenga oxígeno o azufre que
pueda ser saturado, o total o parcialmente insaturado y que pueda
estar opcionalmente sustituido por uno o más grupos alquilo
C_{1}-C_{4} o átomos de halo; o R_{1} es
fenilo el cual puede estar sustituido opcionalmente por, al menos,
un sustituyente seleccionado de los grupos alquilo C_{1-}C_{4},
alcoxi C_{1}-C_{4} y alquiltio
C_{1}-C_{4}, átomos de halógeno, trifluorometilo
y ciano; o R_{1} puede ser un grupo con una fórmula (a) como se
muestra abajo:
\vskip1.000000\baselineskip
en donde x es O, S o -CH_{2}-, a,
b, c y d son cada uno independientemente O-2 y a +
b + c + d =
5.
R_{2} es H o OH;
R_{3}-R_{5} son cada uno, independientemente H,
CH_{3} o CH_{2}CH_{3}; R_{6} es H u OH; y R_{7} es H,
CH_{3}, o CH_{2}CH_{3}; R_{8} es H o desosamina; R_{9} es
H, CH_{3} o CH_{2}CH_{3}; R_{10} es OH, micarosa (R_{13}
es H), o cladinosa (R_{13} es CH_{3}), R_{11} es H; o
R_{10}= R_{11}= O; y R_{12} es H, CH_{3}, o
CH_{2}CH_{3}.
En la definición de arriba, los grupos alquilo
que contienen 3 o más átomos de carbono pueden ser de cadena lineal
o ramificada. Halo significa flúor, cloro, bromo o yodo.
Alfa-ramificado significa que el carbono que está
unido en la posición C-13 es un átomo de carbono
secundario enlazado a dos átomos de carbono adicionales, el
remanente de la cadena alquilo puede ser una cadena lineal o
ramificada.
Los compuestos preferidos de la fórmula 1 son
aquellos en donde R_{3}-R_{5}, R_{7}, R_{9}
y R_{12} son CH_{3} y R_{1} es isopropilo o
sec-butilo,
2-buten-2-ilo,
2-penten-2-ilo o
4-metil-2-penten-2-ilo
opcionalmente sustituidos por uno o más grupos hidroxilos. También
son preferidos los compuestos de fórmula 1 en donde
R_{3}-R_{5}, R_{7}, R_{9} y R_{12} son
CH_{3} y R_{1} es cicloalquilo o cicloalquenilo
C_{3}-C_{6}, el cual puede estar opcionalmente
sustituido por uno o más grupos hidroxilo o uno o más grupos alquilo
C_{1}-C_{4}. En un grupo adicional de los
compuestos preferidos, R_{1} es un anillo heterocíclico que
contiene oxígeno o azufre de 5 ó 6 miembros, particularmente un
anillo 3-tienilo o 3-furilo el cual
puede estar opcionalmente sustituido por uno o más grupos hidroxilo
o uno o más grupos alquilo C_{1}-C_{4} o átomos
de halógeno. En otro grupo de compuestos preferidos, R_{1} es un
grupo alquiltioalquilo C_{3}-C_{6},
particularmente un grupo 1-metiltioetilo.
Otras realizaciones específicas de la presente
invención incluyen los compuestos de la fórmula 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y a las sales farmacéuticamente
aceptables de los mismos, en
donde:
R_{1} es H, alquilo
C_{1}-C_{8}, alquenilo
C_{2}-C_{8}, alquinilo C_{2-}C_{8},
alcoxialquilo o alquiltioalquilo que contiene de 1 a 6 átomos de
carbono en cada grupo alquilo o alcoxi en donde cualquiera de
dichos grupos alquilo, alcoxi, alquinilo o alquinilo pueden estar
sustituidos por uno o más grupos hidroxilo o por uno o más átomos de
halo; o por un cicloalquilo C_{3}-C_{8} o
cicloalquenilo C_{5}-C_{8} cada uno de los
cuales puede estar opcionalmente sustituido por metilo o uno o más
grupos alquilo C_{1}-C_{4} o átomos de halo; o
un anillo heterocíclico de 3 a 6 miembros que contiene oxígeno o
azufre que puede estar saturado, o total o parcialmente insaturado,
el cual puede estar opcionalmente sustituido por uno o más grupos
alquilo C_{1}-C_{4} o átomos de halo; o un grupo
de la fórmula SR_{14} en donde R_{14} es alquilo
C_{1-}C_{8}, alquenilo C_{2}-C_{8},
alquinilo C_{2}-C_{8}, cicloalquilo
C_{3}-C_{8}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{8} fenilo o fenilo sustituido en donde
el sustituyente es alquilo C_{1}-C_{4}, alcoxi
C_{1}-C_{4} o halo, o anillo heterocíclico de 3
a 6 miembros que contiene oxígeno o azufre que puede ser saturado o
total o parcialmente insaturado y el cual puede estar opcionalmente
sustituido por uno o más grupos alquilo
C_{1}-C_{4} o átomos de halo.
R_{2} es H u OH;
R_{3}-R_{5} son cada uno, independientemente H,
CH_{3} o CH_{2}CH_{3}; R_{6} es H u OH; y R_{7} es H,
CH_{3}, o CH_{2}CH_{3}; R_{8} es H o desosamina; R_{9} es
H,CH_{3} o CH_{2}CH_{3}; R_{10} es OH, micarosa (R_{13} es
H), o cladinosa (R_{13} es CH_{3}), R_{11} es H; o R_{10} =
R_{11} = O; y R_{12} es H, CH_{3}, o CH_{2}CH_{3}, con la
condición de que cuando R_{3}-R_{5} sean
CH_{3}, R_{7} sea CH_{3}, R_{9} sea CH_{3} y R_{12} sea
CH_{3}, entonces R_{1} no es H o alquilo C_{1}.
En la definición de arriba, los grupos alquilo
que contienen 3 o más átomos de carbono pueden ser de cadena lineal
o ramificada. Halo significa flúor, cloro, bromo o yodo.
Los compuestos preferidos de la fórmula 2 son
aquellos en donde R_{3}-R_{5} son CH_{3},
R_{7} es CH_{3}, R_{9} es CH_{3} y R_{12} es CH_{3} y
R_{1} es SR_{14} en donde R_{14} es metilo o etilo. En otro
grupo de los compuestos preferidos, R_{1} metilo, isopropilo o
sec-butilo, los cuales pueden estar sustituidos por
uno o más grupos hidroxilo. En un grupo adicional de compuestos
preferidos, R_{1} es un grupo alquilo
C_{3}-C_{8} ramificado sustituido por uno o más
grupos hidroxilo o uno o más átomos halo, particularmente
1-(trifluorometil)etilo.
La invención también se refiere a una composición
farmacéutica para el tratamiento de una infección bacteriana o una
infección protozoaria en un mamífero, pez o ave, que comprende una
cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de fórmula 1 o
de fórmula 2 o una sal farmacéuticamente aceptable de este mismo y
un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La invención también se refiere a un método para
tratar una infección bacteriana o protozoaria en un mamífero, pez o
ave, la cual comprende administrar a dicho mamífero, pez o ave, una
cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de fórmula 1 o
de fórmula 2 o una sal farmacéuticamente aceptable de éste
mismo.
El término "tratamiento" tal y como se
utiliza aquí, a menos que se indique lo contrario, incluye al
tratamiento o prevención de una infección bacteriana o una
infección protozoaria, tal y como se provee en el método de la
presente invención.
Tal y como se utiliza aquí, a menos que se
indique lo contrario, los términos "infección(es)
bacteriana(s)" e "infección(es)
protozoaria(s)" incluyen las infecciones bacterianas e
infecciones protozoarias que ocurren en los mamíferos, peces y aves
así como los desórdenes relacionados con las infecciones bacterianas
e infecciones protozoarias que se puedan tratar o evitar mediante
la administración de antibióticos tales como los compuestos de la
presente invención. Dichas infecciones bacterianas e infecciones
protozoarias y desórdenes relacionadas con dichas infecciones,
incluyen a las siguientes: neumonía, otitis media, sinusitis,
bronquitis, tonsilitis y mastoiditis, relacionadas con la infección
por Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae,
Moraxella catarrhalis, Staphilococcus aureus, o
Staphilococcus aureus, o Peptostreptococcus spp.;
faringitis, fiebre reumática y glomerulonefritis relacionadas con la
infección por Streptococcus pyogenes, estreptococo de Grupos
C y G, Clostridium diphtheriae o Actinobacillus
haemolyticum; infecciones del tracto respiratorio relacionadas
con la infección por Mycoplasma pneumoniae, Legionalla
pneumophila, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus
influenzae o Chlamydia pneumoniae; infecciones de la piel
o de tejidos blandos sin complicaciones, abscesos y osteomielitis y
fiebre puerperal relacionada con la infección por Staphylococcus
auerus, estafilococos de coagulasa positiva (es decir, S.
epidermis, S. hemolyticus, etc.), Streptococcus
pyogenes, Streptococcus agalactiae, grupos
estroptocócicos C-F (estreptococos de colonia en
minuto), Streptococcus viridians, Corynebacterium
minutissimum, Clostridium spp., o Bartonella
henselae; infecciones del tracto urinario agudas sin
complicaciones relacionadas con la infección por Staphylococcus
saprophitycus o Enterococcus spp.; uretritis y cervicitis
y enfermedades transmitidas por vía sexual relacionadas con la
infección por Chlamydia trachomatis, Haemophilus
ducreyi, Treponema pallidum, Ureaplasma
urealyticum, o Neiserria gonorrheae; enfermedades de
toxinas relacionadas con la infección por S. aureus
(envenenamiento de alimento y Síndrome de choque tóxico) o
estreptococos de Grupos A, B y C; úlceras relacionadas con la
infección por Helicobacter pylori; síndromes febriles
sistémicos relacionados con la infección por Borrelia
recurrentis; Enfermedad de lima relacionada con la infección
por Borrelia burgdorfen; conjuntivitis, queratitis y
dracocistitis relacionadas con la infección por Chlamydia
trachomatis, Neisseria gonorrheae, S. aureus,
S. pneumoniae, S. pyogenes, H. influenzae, o Listeria
spp.; enfermedad de complejo (MAC) Mycobacterium avium
diseminada relacionada con la infección por Mycobacterium
avium o Mycobacterium intracellulare; gastroenteritis
relacionada con la infección por Campylobacter jejuni;
protozoa intestinal relacionada con la infección por
Cryptosporidium spp.; infección odontogéneca relacionada con
la infección por Streptococcus viridians; tos persistente
relacionada con la infección por Bordatella Pertussis;
gangrena de gas relacionada con la infección por Clostridium
perfringens o Bacteroides spp.; y aterosclerosis
relacionada con la infección por Helicobacter pylori o
Chlamydia pneumoniae. Las infecciones bacterianas e
infecciones protozoarias y desórdenes relacionados con dichas
infecciones que pueden ser tratadas o evitadas en animales incluyen
los siguientes: enfermedad respiratoria de bovino relacionada con la
infección por P. Haem., P. multocida, Micoplasma
bovis, o Bordetella spp., enfermedad entérica de vaca
relacionada con la infección por E. coli o protozoa (es
decir, Coccidia, criptosporidia, etc.); mastitis de vaca lechera
relacionada con la infección por Staph. Aureus, Streptococcus
uberis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae,
Klebsiella spp., Corynebacterium o Enterococcus
spp.; enfermedad respiratoria de porcino relacionada con la
infección por A. pleuro, P. multocida, o Micoplasma
spp.; enfermedad entérica de porcino relacionada con la
infección por E. coli, Lawsoniaintracellularis, Salmonella,
o Serpullina hyodysinteriae; úlcera de piel infecciosa de
vaca relacionada con la infección por Fusobacterium spp.;
metritis vacuna relacionada a la infección por E. coli;
verrugas velludas de vacuno relacionadas con la infección por
Fusobacterium necrophorum o Bacteriodes nodosus; ojo
rosa de vacuno relacionado con la infección por Moraxella
bovis; aborto prematuro de vacuno relacionado con la infección
por protozoa (es decir, neosporium); infección del tracto
urinario en perros y gatos relacionada con la infección por E.
coli; infecciones de la piel y de tejidos blandos en perros y
gatos relacionadas con la infección por Staph.epidermis,
Staph.intermedius, Staph, de coagulasa negativa o P.
multocida; e infecciones bucales o dentales en perros y gatos,
relacionadas con la infección por Alcaligenes spp.,
Bacteriodes spp., Clostridium spp., Enterobacter
spp., Eubacterium, Peptostreptococcus, Porphyromonas o
Prevotella. Otras infecciones bacterianas e infecciones
protozoarias y desórdenes relacionados con dichas infecciones que
pueden ser tratados o evitados de acuerdo con el método de la
presente invención se hace referencia en J.P. Sanford et al.,
"The Sanford Guide To Antimicrobial Therapy" 26º edición,
(Antimicrobial Therapy Inc. 1996). También se ha hecho
gradualmente evidente que los compuestos de esta invención pueden
tener utilidad considerable en el tratamiento de estados de
enfermedades (por ejemplo, cáncer, SIDA y aterosclerosis) que no
están normalmente asociadas a infecciones bacterianas ni
infecciones
protozoarias.
protozoarias.
Cuando se utiliza en el tratamiento de una
infección bacteriana o un desorden relacionado con una infección
bacteriana o cáncer en un mamífero, tal como un humano, pez o ave,
puede ser administrado un compuesto de fórmula 1 o de fórmula 2,
solo o en forma de una composición farmacéutica que comprenda al
compuesto y un diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Dichas composiciones pueden ser administradas oralmente, por
ejemplo en forma de pastillas o cápsulas, o parenteralmente, que
incluye la inyección subcutánea e intramuscular. Los compuestos de
fórmula 1 o de fórmula 2 pueden ser administrados también
rectalmente, tal como la aplicación mediante un supositorio. El
portador farmacéuticamente aceptable dependerá del modo de
administración usado. Por ejemplo, se pueden utilizar como
portadores farmacéuticamente aceptables en pastillas lactosa,
citrato de sodio, y sales de ácido fosfórico, junto con agentes
desintegrantes (tales como almidón)y agentes lubricantes
(tales como esterato de magnesio, lauril sulfato de sodio y talco).
También, para usarse en cápsulas, los portadores útiles
farmacéuticamente aceptables son la lactosa y polietilenglicoles de
alto peso molecular (por ejemplo, con pesos moleculares de entre
2,000 y 4,000). Para uso parenteral se pueden preparar soluciones
estériles o suspensiones en donde el excipiente farmacéuticamente
aceptable sea acuoso (por ejemplo, agua, dextrosa isotónica o
solución salina isotónica) o no acuosas (aceites grasos de origen
vegetal, tales como aceite de algodón o de cacahuete, de polioles
tales como glicerol, o propilenglicol).
Cuando se usa in vivo para tratar
infecciones bacterianas o trastornos relacionados con una infección
bacteriana en un sujeto mamífero, o para el tratamiento de varios
cánceres en humanos (en particular, cáncer de pulmón de célula no
pequeña, y en otros mamíferos tales como perros, ya sea oral o
parenteralmente, la dosis diaria habitual estará en el rango de
0,1-100 mg/kg. de peso corporal, especialmente
0,5-25 mg/kg. de peso corporal en dosis únicas o
dividi-
das.
das.
La frase "sal(es) farmacéuticamente
aceptable(s)", tal y como se utiliza aquí, a menos que se
indique lo contrario, incluye las sales de grupos ácidos o básicos
las cuales pueden estar presentes en los compuestos de la presente
invención. Los compuestos de la presente invención que son básicos
por su naturaleza, son capaces de formar una amplia variedad de
sales con varios ácidos orgánicos e inorgánicos. Los ácidos que
pueden ser usados para preparar sales de adición de ácidos
farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos básicos, son
aquellos que forman sales de adición de ácido no tóxicas, es decir,
sales que contienen aniones farmacológicamente aceptables, tales
como sales de clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, nitrato,
sulfato, bisulfato, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, acetato,
lactato, salicato, citrato, citrato ácido, tartrato, pantotenato,
bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato,
gluconato, glucaronato, sacarato, formiato, benzoato, glutamato,
metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato,
p-toluenosulfonato y pamoato [es decir,
1,1'-metilen-bis-(2-hidroxi-3-naftoato].
Aquellos compuestos de la presente invención que
son acídicos por su naturaleza son capaces de formar sales básicas
con varios cationes farmacológicamente aceptables. Ejemplos de
dichas sales incluyen las sales de metales alcalinos o de
metalesalcalinotérreos y particularmente, las sales de calcio,
magnesio, sodio y potasio de los compuestos de la presente
invención.
Ciertos compuestos de la presente invención
pueden tener centros asimétricos y por lo tanto, existen en
diferentes formas enantioméricas y diastereoméricas. Esta invención
se refiere al uso de todos los isómeros y estereoisómeros ópticos
de los compuestos de la presente invención y mezclas de estos
mismos, y para todas las composiciones farmacéuticas y métodos de
tratamiento que puedan emplearlos o contenerlos.
La presente invención incluye los compuestos de
la presente invención y sales farmacéuticamente aceptables de éstos,
en donde uno o más átomos de hidrógeno, carbono u otros átomos, son
reemplazados por isótopos de éstos. Dichos compuestos pueden ser
útiles como herramientas de investigación y de diagnóstico en
estudios farmacocinéticos de metabolismo y en ensayos de
enlazamiento.
Los compuestos de la presente invención son
producidos mediante fermentación de un organismo transformado o no
transformado, capaz de producir eritromicinas, incluyendo pero no
limitándose a la especie de Saccharopolyspora, Streptomyces
griseoplanus, Norcadia sp., Micromonospora sp.,
Arthobacter sp., y Streptomyces antibioticus, pero
excluyendo a S. coelicolor. Son particularmente apropiadas a
este respecto, las cepas transformadas o no transformadas de
Saccharopolyspora erythraea, por ejemplo, NRRL 2338, 18643,
21484. Son particularmente preferidas aquellas cepas transformadas
en las cuales, el módulo de carga de eritromicina ha sido
reemplazado por el módulo de carga procedente del productor de
avermectina, Streptomyces avermilitis, o el productor de
rapamicina, Streptomyces hygroscopicus. El método preferido
para producir los compuestos de la presente invención es mediante
la fermentación del organismo apropiado en presencia de un ácido
carboxílico apropiado de la fórmula R_{1}COOH, en donde R_{1}
es como se ha definido previamente en las fórmulas 1 y 2 o una sal,
éster (particularmente preferible si es un tioéster de
N-acetilcisteamina) o amida de éste o un precursor
oxidativo de éste. El ácido o derivado de éste se añade a la
fermentación, ya sea en el momento de la inoculación o en
intervalos durante la fermentación. La producción de los compuestos
de la presente invención se puede seguir retirando muestras de la
fermentación, extrayendo con un solvente orgánico y siguiendo la
aparición de los compuestos de esta invención mediante
cromatografía, por ejemplo, usando cromatografía de líquidos a alta
presión. La incubación se continua hasta que la obtención del
compuesto de fórmula 1 ó 2 ha sido maximizada, generalmente durante
un período de 4 a 10 días. Un nivel preferido de cada adición del
ácido carboxílico o derivado de éste está entre 0,05 y 4,0 g/L. Los
mejores rendimientos de los compuestos de fórmula 1 ó 2 son
generalmente mediante la adición gradual del ácido o el derivado de
la fermentación, por ejemplo, mediante la adición diaria durante un
periodo de varios días. El medio utilizado para la fermentación
puede ser un medio de complejo convencional que contenga fuentes
asimilables de carbono, nitrógeno y elementos
traza.
traza.
Los medios preferidos y adecuados para hacer
crecer las células productoras de eritromicina manipuladas
genéticamente y sin transformar, y los medios adecuados y
preferidos para el aislamiento, identificación, y utilidad práctica
de los compuestos de fórmulas 1 ó 2 están descritos más ampliamente
en los Ejemplos.
Algunas realizaciones de la invención serán
descritas ahora con referencia a los dibujos adjuntos, en los
cuales:
La Figura 1 da las fórmulas químicas de los tres
policétidos conocidos;
La Figura 2a es un diagrama que muestra el
funcionamiento de la sintasa B de
6-desoxieritronolita (DEBS),una
6-desoxieritronolida productora de PKS
(6-DEB), un precursor de eritromicina A;
La Figura 2b muestra la biosíntesis
post-PKS de eritromicinas que incluyen la
conversación de 6-DEB a eritromicina A;
Las Figuras 3a y 3b son diagramas que muestran la
construcción del plásmido pIG1;
Las Figuras 4a, 4b y 4c son diagramas que
muestran la construcción del plásmido pND30;
La Figura 5 es un diagrama que muestra la
construcción de un plásmido pAVLD;
La Figura 6 muestra la integración de pAVLD
dentro del genoma de S. erythraea NRRL2338;
La Figura 7 es un diagrama que muestra la
biosíntesis de la rapamicina;
La Figura 8 es un diagrama que muestra la
construcción de un plásmido pMO6;
La Figura 9 es un diagrama que muestra la
construcción de un plásmido PCJR26;
La Figura 10 es un diagrama que muestra la
construcción de un plásmido pC-ATX;
La Figura 11 es un diagrama que muestra la
construcción de un plásmido pC-AT12;
La Figura 12 es un diagrama que muestra la
construcción de un plásmido pCJR49.
El amplio rango de unidades iniciadoras aceptadas
por el módulo de carga de avr ha sido establecido
comprensivamente con estudios previos (por ejemplo las Solicitudes
de Patente Europea 0 214 731, 0 350 187, 0 317 148 las cuales están
incorporadas aquí en su totalidad). Consecuentemente, se debería de
entender que la invención no está limitada al detalle específico de
estos ejemplos y éstos sirven simplemente para confirmar la
efectividad del módulo de carga de avr. Más aún, los ejemplos
que usan la construcción pIG1 o pND3O demuestran claramente la
capacidad del promotor actI y su gen activador cognato
actII-orf4 para mejorar la expresión de los nuevos
compuestos de esta invención, cuando se unen al módulo de carga
avr. También se deriva de los ejemplos, que las cepas sin
transformar de Saccharopolyspora erythraea son también
capaces de tomar inmediatamente los sustratos administrados
exógenamente para generar los nuevos policétidos de eritromicina.
Consecuentemente, también se hace aparente para aquellos expertos
en la materia, que los nuevos compuestos específicos de esta
invención se pueden producir de manera inmediata mediante la
selección de la cepa productora de eritromicina apropiada
(incorporando opcionalmente el plásmido pIG1 o pND3O dentro de la
cepa deseada), y complementando la fermentación con la unidad de
iniciación adecuada. Así, los derivados de
6-desoxieritromicina y
6,12-didesoxieritromicina de la presente invención
se pueden producir inmediatamente usando la Saccharopolyspora
erythraea NRRL 18643 o NRRL 21484 tal y como se indica en US
5,141,926 y WO 97/06266. De manera similar, el uso de las cepas de
Saccharopolyspora erythraea descritas por Weber et al. en
J. Bacteriol., 164:425-433, 1991 también se
pueden utilizar para obtener los nuevos análogos deseados de la
presente invención. Por ejemplo, la cepa UW24 puede ser usada
(transformada opcionalmente por pIG1 o pND30) para obtener los
nuevos análogos de eritronolida B.
Se registró el espectro UV usando un
espectrofotómetro de arreglo de diodos
Hewlett-Packard 1090M. Todos los espectros NMR
fueron medidos en CDCl_{3} por un espectrómetro de 500 MHz
Varian Unity, a menos que se indique lo contrario, y las
posiciones de los picos se expresan en partes por millón (p.p.m.)
sacados a partir de tetrametilsilano. Las formas de los picos se
indican como sigue: s. singlete; d. doblete; t. triplete; q.
cuarteto; m. multiplete; br. amplio. El número atómico mostrado en
las estructuras de RMN no es representativo de la nomenclatura
estándar, pero correlaciona los datos de RMN con éste ejemplo en
particular. Los datos HPLC-MS fueron obtenidos
usando un cromotógrafo de líquidos
Hewlett-Packard 1090M en interfaz con un
espectrómetro de masas VG plarform II equipado con una fuente
APCI (método A) o usando un cromatógrafo de líquidos
Hewlett-Packard 1050 en interfaz con
espectrómetro de masas VG Plarform II equipado con una fuente
APCI (método B y método C).
- Columna
- Beckman Ultrasphere de 5 \mum ODS
- \quad
- 4 mm x 25 cm
- Flujo
- 0,85 mL/min.
- Fase móvil
- Gradiente: acetonitrilo: acetato de amonio 0,05 M (28:72) respecto acetonitrilo: acetato de amonio 0,05 M (50:50) durante 22 minutos, mantener acetonitrilo: acetato de amonio 0,05 M (50:50) 22-25 minutos; regresar a las condiciones iniciales 25-30 minutos.
- Columna
- MetaChem Inertsil de 5 \mum C8 3 mm x 150 mm
- Flujo
- 0,5 mL/min.
- Fase móvil
- Isocrática: metanol:acetato de amonio 0,05 M con ácido trifluoroacético al 0,1% (60:40)
- Columna
- Waters Symmetry de 5 \mum C18 2,1 mm x 150 mm.
- Flujo
- 0,22 mL/min.
- Fase móvil
- Gradiente: acetonitrilo: acetato de amonio 0,05 M (30:70) a acetonitrilo: acetato de amonio 0,05 M (50:50) por 30 minutos.
Se hace uso de los siguientes medios y
soluciones:
| sacarosa | 69 g |
| KNO_{3} | 10 g |
| ácido succínico | 2,36 g |
| KH_{2}PO_{4} | 2,7 g |
| MgSO_{4}.7H_{2}O | 1,2 g |
| ZnCl_{2} | 10 mg |
| MnCl_{2}.4H_{2}O | 6,2 g |
| CuCl_{2}.2H_{2}O | 0,53 mg |
| CoCl_{2} | 0,55 mg |
| FeSO_{4}.7H_{2}O | 2,5 mg |
| CaCl_{2}.2H_{2}O | 38 mg |
| agua mili-Q | Para 1,0 L |
| KOH | a pH 6-6.4 |
| glucosa | 5 g |
| triptona | 5 g |
| extracto de levadura | 2,5 g |
| EDTA | 36 mg |
| agua corriente | a 1,0 L |
| KOH | a pH 7,1 |
| Dextrosa | 50 g/L |
| harina Nutrisoy^{MR} | 30 g/L |
| (NH_{4})_{2}SO_{4} | 3 g/L |
| NaCl | 5 g/L |
| CaCO_{3} | 6 g/L |
| pH ajustado a 7,0 |
La harina Nutrisoy^{MR} se compró de
British Arkady, Skerton Road, Manchester, Reino
Unido.
La presente invención es ilustrada mediante los
siguientes ejemplos.
El plásmido pIG1 consiste en un plásmido derivado
de SCP2^{*} que contiene un gen de PKS Tipo I híbrido que
comprende el módulo de carga avr en lugar del módulo de carga ery,
los dos primeros módulos de extensión de la PKS de ery y la
tioesterasa de la PKS de ery. Este se construye a través de varios
plásmidos intermediarios como sigue (Figura 3).
El plásmido pVE1446 que contiene una porción de
los genes de PKS de avermectina (avr) fue obtenido de ATCC 68250 de
cepa E. coli (MacNeil, D.J. et al, Ann, N.
Y. Acad. Sci. (1994) 721:123-132). El plásmido
pVE1446 fue digerido con BamHI y el fragmento de 7,6 kbp de entre
las coordenadas 32.15 y 3.40 (MacNeil, D.J. et al, Ann, N.Y.
Acad. Sci. (1994) 721:123-132),se purificó
mediante electroforesis en gel y se recircularizó. La mezcla
contenía el plásmido deseado pVE3.4, el cual fue aislado después de
la transformación del TG1recO de la cepa de E.coli
(construido por P. Oliver, Departamento de Genética, U. de
Cambridge: kolodner, R. et al, J. Bacteriol (1985)
163:1060-1066; T. Gibson, Ph D., Thesis, U. de
Cambridge, 1985).
El plásmido pBK25 (Bevitt, D.J. et al. Eur. J.
Biochem. (1992) 204:19-49) fue digerido con
Ncol y el fragmento de 12 kbp fue reparado en sus extremos y
enlazado al plásmido pUC18 el cual había sido linealizado con SmaI.
La mezcla de ligación fue transformada en TG1 recO de E. coli
y se comprobaron las colonias individuales por su contenido
plasmídico. Se identificó el plásmido pNCO12 deseado, por su patrón
de restricción.
El plásmido pCRabc (Figura 3) fue construido como
sigue. Se llevaron a cabo tres reacciones PCR por separado:
Primeramente, se utilizaron 20 pmoles de cada uno de los
oligonucleótidos sintéticos A1 (5'-CTC GTC GGT GGC
TTT GOG-3') y A2 (5'-CCC GGG AAA AAC
GAA GAC TAG TGG CGC GGA CGG CCG-3') para amplificar
un producto de 1,0 kbp, de una plantilla pNCO12 de 100 ng. El
producto de PCR fue reparado, en sus extremos, fosforilado y
clonado, en un pUC18 con un corte de SmaI, para obtener un plásmido
pCRa. Segundamente, se utilizaron 20 pmoles de cada uno de los
oligonucleótidos sintéticos C1 (5'-CAC GCG CAG CGC
GGC GGA-3') y C2 (5'-CGA ACC GCT AGC
GGT CGT CGC GAT GGC CT-3') para amplificar un
producto de 1,5 kbp, de una plantilla pNCO12 de 100 ng. El producto
fue reparado, en sus extremos, fosforilado y clonado en un pUC18 con
un corte de SmaI, para obtener un plásmido pCRc. Terceramente, se
utilizaron 20 pmoles de cada uno de los oligonucleótidos sintéticos
B1 (5'-GTG GCC CGG CCG TCC GTC CGC GCC ACT AGT CTT
CGT TTT T-3') y B2 (5'-AGC TAG CGG
TTC GTC CGC CGC TGC CGT GCC-3') para amplificar un
producto de 1,4 kbp, de una plantilla pVE3.4 de 100 ng. El producto
fue reparado, en sus extremos, fosforilado y clonado en un pCU18 con
un corte de SmaI, para obtener un plásmido pCRb.
\newpage
El plásmido pCRa fue digerido con Hindi y SpeI y
el inserto de 1,0 kbp se ligó con el plásmido pCRb previamente
digerido con HindIII y SpeI, para obtener el plásmido pCRb. El
plásmido pCRc fue digerido con NheI y EcoR1 y el inserto de 1,5 kbp
se ligó con el plásmido pCRb previamente digerido con NheI y EcoR1
para obtener el plásmido pCRabc.
El plásmido pCRabc fue digerido con MfeI y SfiI y
se purificó el fragmento de ADN que contenía el dominio de carga de
la PKS de avr mediante electroforesis en gel y se ligó al plásmido
pNTEP2, el cual había sido digerido con MfeI y SfiI y el fragmento
más grande se purificó mediante electroforesis en gel. La mezcla de
ligación fue transformada en TG1 recO de E. coli y se
comprobaron las colonias individuales por su contenido plasmídico.
Se identificó al plásmido deseado pNEWAVETE (13,7 kbp) por su patrón
de restricción.
El plásmido pRM52 es un derivado del plásmido
pRM5 (Mc Daniel, R. et. al. Science, (1993)
262:1546-1550). El pRM5 fue primeramente
linealizado mediante digestión con NdeI, reparado en sus extremos y
después se volvió a ligar para producir el pRM51. El pRM51 fue
cortado con PacI y NsiI y el fragmento de PacI - NsiI más grande
fue aislado y ligado al engarce oligonucleótido corto de doble hebra
que contenía el sitio de NdeI y construido a partir de los
oligonucleótidos sintéticos
5'-T-AAGGAGGACACATATGCA-3'
y 5'-TAATTCCTCCTGTGTAT-3' los cuales
se alinearon juntos. La mezcla de ligación fue transformada en TG1
recO de E. coli y se cribaron las colonias aisladas por su
contenido plasmídico. Se identificó el plásmido deseado (19,6 kbp)
deseado, por su mapa de restricción y fue designado como pRN52.
El plásmido pNEWAVETE fue digerido con NdeI y
XbaI y el inserto fue purificado mediante sedimentación en un
gradiente de sacarosa. El inserto purificado se ligó al plásmido
pRM52 (19,6 kbp) el cual había sido digerido con NdeI y XbaI, y el
vector fue purificado mediante sedimentación en un gradiente de
sacarosa. La mezcla de ligación fue usada para transformar E.
coli y se comprobaron las colonias individuales por su contenido
plasmídico. Se identificó al plásmido pIG1 deseado, por su patrón de
restricción.
El plásmido pND30 consiste en un plásmido
derivado de SCP2^{*} que contiene un gen de PKS Tipo I híbrido que
comprende el módulo de carga de avr en lugar del módulo de carga de
ery, los dos primeros módulos de extensión de la PKS de ery y la
tioesterasa de la PKS de ery. Este es construido a través de varios
plásmidos intermediarios como sigue (Figura 4).
El pCJR101 (Figura 4) es un plásmido
transportador, construido para ser usado en la expresión de los
genes de PKS, en actinomicetos. Este incluye un replicón de CoIE1
para permitir duplicarlo en E. coli, un replicón de
Streptomyces de bajo número de copias de SCP2^{*}
(Bibb, M. J. y Hopwood, D. A. J. Gen. Microbiol.
(1981)126:427) y el gen activador
actI-orf4 procedente del sector act, el cual activa
la transcripción procedente del promotor act, durante la transición
desde la fase de crecimiento hasta la fase estacionaria en el
micelio vegetativo. Este se construye como sigue: un fragmento de
ADN de aproximadamente 970 bp de pMF1015 (conteniendo al gen
activador actI-orf4)
(Fernández-Moreno, M.A. et al. Cell (1991)
66:769-780) es amplificado por PCR, usando como
cebadores los oligonucleótidos sintéticos: 5'-ACT
AGT CCA CTG CCT CTC GGT AAA ATC CAG C-3' y
5'-CTT AAG GGC TCC ACC GCG TTC ACG
GAC-3'; los cuales también introducen los sitios de
restricción SpeI y AflII flanqueadores. Este fragmento es clonado en
el sitio reparado AatI del extremo del plásmido pUC19 para obtener
el plásmido pCJR18. Un fragmento de ADN de aproximadamente 215 bp es
amplificado a partir de pMV400, el cual contiene el par promotor
bidireccional PactIII/PactI (Parro, V. et al. Nucl. Acids Res.
(1991) 19:2623-2627), usando como cebadores los
oligonucleótidos synthetics 5'-ACA TTC TCT ACG CCT
AAG TGT TCC CCT CCC TGC CTC-3' y
5'-GTG ATG TAT GCT CAT ATG TGT CCT CCT TAA TTA ATC
GAT GCG TTC GTC CGG TG-3'; los cuales también
introducen los sitios flanqueadores NdeI y AflII. El producto de PCR
es digerido con NdeI y AflII y ligado al plásmido pCJR18 previamente
cortado con NdeI y AflII, para generar al plásmido pCJR19. Se
obtiene un fragmento de HindIII SphI de 1,1 kbp que contiene el gen
tsr, el cual confiere resistencia a la tioestreptona, mediante PCR a
partir del plásmido pIJ922 (Lídiate, D.J. et al gene (1985)
35:223-235) como plantilla, usando como
cebadores los oligonucleótidos sintéticos 5'-TGA ACA
CCA AGC TTG CCA GAG AGC GAC GAC TTC CCC-3' y
5'-GAC AGA TTG CAT GCC CTT CGA GGA GTG CCC GCC GCC
CGG-3'; los cuales también introducen a los sitios
flanqueantes HindIII y SphI. El producto de PCR es digerido con
HindIII y SphI y ligado al plásmido pCJR19, cortado con HindIII y
SphI para obtener el plásmido pCJR24. El plásmido pIJ922 es digerido
con BamHI y SstI y el fragmento que contiene una porción del sitio
de fertilidad y el origen de la duplicación (Lídiate, D. J. et al
gene (1985) 35:223-235) se liga en pUC19
digerido con BamHI y SstI para generar el plásmido pCJR16 (14,7 kbp)
bifuncional. El plásmido pCJR24 es digerido con SalI y SphI, los dos
fragmentos más grandes procedentes de la digestión se purifican
mediante electroforesis en gel y combinados en una ligación de
cuatro componentes con el plásmido pCJR16 el cual ha sido digerido
con XhoI y SphI. La mezcla de enlace es usada para transformar los
Streptomyces lividans y las colonias son seleccionadas en
presencia de tioestreptona. Una colonia tal, se muestra por contener
el plásmido pCJR101 deseado (12,4 kbp aproximadamente), identificado
por su patrón de restricción.
La construcción del plásmido pCJR29 está
ilustrada en la Figura 4. Un fragmento HindIII - XhoI de 1,1 kbp que
contiene al gen tsr, el cual confiere resistencia a la
tioestreptona, es obtenido por PCR a partir del plásmido pIJ922 como
plantilla, usando como cebadores a los oligonucleótidos
5'-TGA ACA CCA AGC TTG CCA GAG AGC GAC GAC TTC
CCC-3' y 5'-GAC AGA TTC TCG AGC CTT
CGA GGA GTG CCC GCC CGG-3', los cuales también
introducen los sitios flanqueadores HindIII y XhoI. El producto de
PCR fue digerido con HindIII y XhoI y se ligó al plásmido pCJR16 que
había sido digerido con HindIII y XhoI, para generar el plásmido
pCJR25. El plásmido pCJR25 es digerido con HindIII y XhoI y enlazado
con el plásmido pCJR19, que había sido digerido con HindIII y SphI,
para producir el plásmido pCJR29 deseado (12,4 kbp aproximadamente),
identificado por su patrón de restricción. El plásmido pCJR29
difiere del pCJR101 en la orientación del gen tsr, el gen
actI-orf4 y el promotor actI/actIII, con respecto al
origen de replicación de origen derivada de SCP2^{*}.
El plásmido pNEWAVETE fue digerido con NdeI y
XbaI y el inserto fue purificado mediante sedimentación en un
gradiente de sacarosa. El inserto purificado fue ligado dentro del
plásmido pCJR29 (12,4 kbp aproximadamente) el cual había sido
digerido con NdeI y XbaI, y el vector fue purificado mediante
sedimentación en un gradiente de sacarosa. La mezcla de ligación fue
usada para transformar E. coli y se comprobaron las colonias
individuales por su contenido plasmídico. Se identificó al plásmido
pND30 deseado, por su patrón de restricción.
El plásmido pMO6 (Figura 8) fue primeramente
construido en varios pasos:
El segmento de ADN de aproximadamente 1,3 kbp del
gen eryAI de S. erythraea, que se extiende desde el
nucleótido 1948 hasta el nucleótido 3273 del eryAI (Donadio S. et
al., Science (1991) 252, 675-679) fue
amplificado por PCR, empleando como cebadores los oligonucleótidos
sintéticos: 5'-CAT GCT CGA GCT CTC CTG GGA
AGT-3' y 5'-CAA CCC TGG CCA GGG AAG
ACG AAG ACG G-3'; y el plásmido pNTEP2 como
plantilla. El producto de PCR fue reparado en sus extremos y ligado
al plásmido pUC18, el cual había sido linealizado mediante digestión
con SmaI y después tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de
ligación fue usada para transformar el TG1 recO de E.coli y
se comprobaron las colonias individuales por su contenido
plasmídico. Se identificó el plásmido pMO1 deseado (3,9 kbp), por su
patrón de restricción, en el cual el sitio StuI que limita el
inserto, está adyacente al sitio HindIII en el poliengarce.
El segmento de ADN de aproximadamente 0,85 kbp el
gen rapA del Streptomyces hygroscopicous, que se extiende
desde el nucleótido 1643 hasta el nucleótido 2486 de rapA, se
amplificó por PCR, empleando como cebadores los siguientes
oligonucleótidos: 5'-TTC CCT GGC CAG GGG TCG CAG CGT
G-3' y 5'-CAC CTA GGA CCG ACC ACT
CGA C-3'; y el ADN procedente del bacteriógrafo
recombinante \lambda-1E (Schewcke, T. et al.,
Proc. Catl. Acad. Sci. EUA (1995) 92:7839-7843)
como plantilla. El producto de PCR fue reparado en sus extremos y
enlazado al plásmido pUC18, el cual había sido linealizado mediante
la digestión con SmaI y después tratado con fosfatasa alcalina. La
mezcla de ligación fue usada para transformar el TG1 recO de E.
coli y se comprobaron las colonias individuales por su contenido
plasmídico. Se identificó al plásmido pMO2 deseado (3,5 kbp), por su
patrón de restricción.
El segmento de ADN de aproximadamente 1,7 kbp del
gen eryAI de S. erythraea, que se extiende desde el
nucleótido 4128 hasta el nucleótido 5928 de eryAI, fue amplificado
mediante PCR, empleando como cebadores los siguientes
oligonucleótidos: 5'-TGG CCA GGG AGT CGG TGC ACC TAG
GCA-3' y 5'-GCC GAC AGC GAG TCG ACG
CCG AGT T-3'; y el plásmido pNTEP2 como plantilla.
El producto de PCR fue reparado en sus extremos y enlazado al
plásmido pUC18, el cual había sido linealizado mediante la digestión
con SmaI y después tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de
ligación fue usada para transformar el TG1 recO de E. coli y
se comprobaron las colonias individuales por su contenido
plasmídico. Se identificó al plásmido pMO3 deseado (4,4 kbp), por su
patrón de restricción, y los sitios BaII y AvrII están adyacentes al
sitio HindIII del poliengarce.
El plásmido pMO1 fue digerido con HindIII y BalI
y el inserto de 1,3 kbp fue ligado al plásmido pMO3 que ha sido
digerido con HindIII y BalI. La mezcla de ligación fue usada para
transformar el TG1 recO de E. coli y se verificaron las
colonias individuales por su contenido plasmídico. Se identificó al
plásmido pMO4 deseado (5,6 kbp), por su patrón de restricción.
El plásmido pMO4 fue digerido con StuI y el
inserto de 3,0 kbp se ligó con el plásmido pNTEP2 que había sido
digerido con StuI y purificada mediante electroforesis en gel para
extraer el inserto de 3,8 Kpb. La mezcla de ligación fue usada para
transformar el TG1 recO de E. coli y se comprobaron las
colonias individuales por su contenido plasmídico. Se identificó al
plásmido pMO5 deseado (12,8 kbp), por su patrón de restricción.
El plásmido pMO2 fue digerido con BalI y AvrII y
el inserto fue ligado con el plásmido pMO5 que ha sido digerido con
BalI y AvrII. La mezcla de ligación se utilizó para transformar el
TG1 recO de E. coli y se comprobaron las colonias
individuales por su contenido plasmídico. Se identificó el
plasmídico pMO6 deseado (13,5 kpb), por su patrón de
restricción.
El plásmido pCJR26 es un plásmido basado en
SCP2^{*}, que contiene un gen de PKS que comprende el módulo de
carga ery, el primer y segundo módulos de extensión de la ery de PKS
y la tioesterasa terminante de cadena de ery, excepto en que el
segmento de ADN que codifica la malonil-CoA:ACP
aciltransferasa dentro del primer módulo de extensión, ha sido
sustituido específicamente por el ADN que codifica a la
malonil-CoA:ACP aciltransferasa del módulo 2 de la
PKS de rap. Este fue construido como sigue (Figura 9): el plásmido
pMO6 fue digerido con NdeI y XbaI y el inserto fue ligado al
plásmido pCJR24, el cual había sido digerido con NdeI y XbaI y
purificado mediante de electroforesis en gel. La mezcla de enlace
fue transformada en TG1 recO de E. coli y se comprobaron las
colonias individuales por su contenido plasmídico. Se identificó al
plásmido pCJR26 deseado, por su patrón de restricción.
El plásmido pCJR26 fue usado para transformar los
protoplastos de JC2 de S. erythraea. Las colonias resistentes
a la tioestreptona fueron seleccionadas en un medio R2T20, que
contenía 10 \mug/ml de tioestreptona. Se probaron diversos clones
por la presencia del pCJR26 integrado dentro del cromosoma, mediante
hibridación de transferencia Southern de su ADN genómico con
un gen DEBS1-TE etiquetado como DIG.
Se hizo crecer un clon con una copia integrada de
pCJR26 en un medio SSM, que contenía 5 mg/ml de tioestreptona y se
dejó crecer durante 7 días a 28-30ºC. Después de
este tiempo, el caldo fue filtrado para retirar los micelios y se
ajustó el pH a 3. Se extrajo el caldo dos veces con dos volúmenes de
acetato de etilo y se lavaron los extractos combinados de acetato de
etilo, con un volumen igual de cloruro de sodio saturado, secaron
sobre sulfato de sodio anhidro y se retiró el acetato de etilo a
presión reducida, para dar aproximadamente 500 mg del producto
crudo. Se mostró que los productos fueron
\delta-lactonas derivadas del ácido (2S, 3R,
5R)-2-metil-3,
5-dihidroxi-n-hexanoico
y del ácido (2S, 3R,
5R)-2-metil-3,5-dihidroxi-n-heptanoico.
Un ADN de pCJR49 de aproximadamente 5 mg fue
usado para transformar los protoplastos de NRRL2338 de S.
erythraea para dar una cepa en la cual, el plásmido está
integrado dentro del cromosoma. Se obtuvo el ADN total de varias
colonias y se analizó mediante hibridación Southern para
confirmar que el plásmido se había integrado en el módulo 2 de EryAI
para dar una nueva ruta biosintética del nuevo macrólido.
Tuvieron lugar integraciones adicionales, dando
secuencias de plásmido repetidas. El NRRL 2338/pCJR49 de S.
erythraea fue inoculado en un caldo de soja tríptico que
contenía 5 mg/ml de tioestreptona y se incubó a 30ºC durante tres
días. Se usaron 100 ml de este cultivo de semilla para inocular 2 L
de un medio definido de succionato de sacarosa que contenía 5 mg/ml
de tioestreptona en 5 matraces de 2 L, cada uno conteniendo 500 mL
de medio junto con dos agitadores para ayudar a la dispersión y
mezclado a 300 r.p.m. Después de 5 días más de crecimiento, los
cultivos fueron centrifugados y el pH del sobrenadante se ajustó a
pH 9. A continuación, se extrajo el sobrenadante tres veces con un
volumen igual de acetato de etilo y el disolvente fue retirado
mediante evaporación. Los productos fueron analizados mediante
HPLC/MS y se identificaron dos macrólidos como análogos de
eritromicina:
El plásmido pC-ATX es un plásmido
basado SCP2^{*} que contiene un gen de PKS que comprende el módulo
de carga ery, el primer y segundo módulos de extensión de la PKS de
ery y la tioesterasa finalizadora de cadena de la PKS de ery,
excepto en que el segmento de ADN que codifica la
metilmalonil-CoA:ACP aciltransferasa dentro del
primer módulo de extensión, ha sido sustituido específicamente por
el ADN que codifica a la malonil-CoA:ACP
aciltransferasa de un sector del gen de PKS Tipo I putativo, clonado
a partir de Streptomyces cinnamonensis ATCC 14513 (productora
de la monensina de policétido de poliéster). Este fue construido a
través de varios plásmidos intermedios como sigue (Figura 10).
La biblioteca genómica de Streptomyces
cinnamonensis ATCC 14513 (el productor de monensina) fue
construido a partir de fragmentos Sau3A de 35 a 45 kpb de tamaño
fraccionado de ADN cromosómico ligado con un BamHI linealizado y un
vector pWE15 cósmido tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de
ligación fue empaquetada en unas partículas \lambda, usando
extractos de empaquetamiento Gigapack, y se transfectaron
dentro de NM1blue de E. coli. Se hicieron crecer
aproximadamente 600 colonias de la librería en la superficie de una
membrana de nylon, se lisaron y se retículo su ADN a la membrana
mediante irradiación UV. La membrana fue subsiguientemente usada
para el procedimiento de cribado. Se marcó el inserto de pMO8 que
comprendía el dominio de la cetosintasa del módulo 2 de DEBS,
mediante cebado aleatorio en presencia de ^{53}p\alphaATP y se
utilizó como sonda para la hibridación del ADN. La muestra se
hibridó durante 16 horas a 68ºC en un tampón de 4,0xSSC y se lavó,
subsiguientemente, durante una hora a 68ºC con un tampón de 0,8xSSC.
Los tres clones positivos fueron aislados. Se secuenció el ADN de
los insertos de los tres clones hasta el final desde los sitios de
cebado T3 a T7, presentes en el vector pWE15. Se descubrió una
región homóloga a los dominios de la cetosintasa de tipo I y a
malonil-CoA:ACP aciltransferasa en la secuencia de
ADN del sitio de cebado T7, usando al clon 2 (llamado pSCIN02) como
plantilla. La secuenciación parcial de ADN del dominio malonil
-CoA:ACP aciltransferasa (llamado ATX) reveló un motivo de secuencia
inusual en la parte de reconocimiento del substrato putativo del
dominio, la cual fue sustancialmente diferente de las de malonato- o
metilmalonato-CoA:ACP aciltransferasas específicas,
previamente descritas (Haydock S.F. et. al., FEBS (1995)
374:246-248).
El segmento de ADN de aproximadamente 0,9 kbp del
dominio ATX fue amplificado mediante PCR, empleando como cebadores
los siguientes oligonucleótidos: 5' -CTG GCC AGG GCG CGC AAT GGC CGA
T-3' y 5'-CCC TAG GAG TCG CCG GCA
GTC CAG CGC GGC GCC-3' usando el ADN procedente del
cósmido pSCIN02 como plantilla. El producto de PCR fue reparado en
sus extremos y se ligó con el plásmido pUC18, el cual había sido
linealizado mediante digestión con SmaI y después tratado con
fosfatasa alcalina. La mezcla de ligación fue usada para transformar
el TG1 recO de E. coli y se comprobaron las colonias
individuales por su contenido plasmídico. Se identificó el plásmido
pMO38 deseado (3,5 kbp), por su patrón de restricción.
El plásmido pMO34 es un derivado del pMO6 con un
sitio de policlonación insertado después del codón de interrupción
del gen D1-AT2 insertado. El plásmido pMO6 fue
digerido con EcoRI y HindIII y se alineó con dos oligonucleótidos,
formando la región de doble cadena del sitio de policlonación:
5'-AAT TCA TAA CTA GTA GGA GGT CTG GCC ATC TAG
A-3' Y 5'-TCG AAG ATC TAC CGG TCT
GGA GGA TGA TCA ATA C-3'. Se ligó la mezcla y se
transformó en TG1 recO de E. coli y se comprobaron las
colonias individuales por su contenido plasmídico. Se identificó al
plásmido pMO34 deseado (13,5 kbp), por su patrón de restricción.
El plásmido pMO35 es un derivado del pMO34 que
contiene el gen TKLS-AT2 y un gen
crotonil-CoA-reductasa unido
traduccionalmente, procedente de Streptomyces collinus
(Wallace et al., E.J. Biochem. (1995)
233:954-962). El gen
crotonil-CoA-reductasa fue extirpado
del plásmido pZYB3 (donado por el Prof. K. Reynolds), como un
fragmento NdeI - NamHI, el cual fue tratado con nucleasa de judía
mung para producir extremos despuntados y se ligó en el pMO34,
previamente cortado con SpeI y, de la misma manera, con extremos
despuntados usando nucleasa de judía mung. La mezcla de ligación se
utilizó para transformar el TG1 recO de E. coli y se
comprobaron las colonias individuales por su contenido plasmídico.
Se identificó el plásmido pMO35 deseado (14,2 kbp) con la
orientación correcta del gen
crotonil-CoA-cetoreductasa, por su
patrón de restricción.
El plásmido pMO38 se digerió con BalI y AvrII y
el inserto se ligó con el plásmido pMO35 que había sido digerido con
BalI y AvrII. La mezcla de ligación se transformó en el TG1 recO de
E. coli y se comprobaron las colonias individuales por su
contenido plasmídico. Se identificó al plásmido pMO36 deseado (13,5
kbp), por su patrón de restricción.
El plásmido pMO36 se digirió con NdeI y XbaI y el
inserto se ligó al plásmido pCJR29, el cual había sido digerido con
NdeI y XbaI y purificado mediante electroforesis en gel. La mezcla
de ligación se transformó en el TG1 recO de E. coli y se
comprobaron las colonias individuales por su contenido plasmídico.
Se identificó el plásmido pC-ATX deseado, por su
patrón de restricción.
Se utilizó el plásmido pC-ATX
para transformar los protoplastos JC2 de S. erythraea. Se
seleccionaron las colonias resistentes a la tioestreptona, en un
medio R2T20 que contenía 10 \mug/ml de tioestreptona. Se probaron
diversos clones por la presencia del pC-ATX
integrado dentro del cromosoma, mediante la hibridación por
transferencia Southern de su ADN genómico con ADN marcado
con DIG que codifica el gen DEBS1-TE.
Se hizo crecer un clon con una copia integrada de
pC-ATX fue cultivado en un medio SSM, que contenía 5
\mug/ml de tioestreptona y se hizo crecer durante 7 días a
28-30ºC. Después de este tiempo, se filtró el caldo
para eliminar los micelios y se ajustó el pH a 3. El caldo se
extrajo dos veces con dos volúmenes de acetato de etilo y los
extractos de acetato de etilo combinados, fueron lavados con un
volumen igual de cloruro de sodio saturado, secado sobre sulfato de
sodio anhidro y se eliminó el acetato de etilo bajo presión
reducida, para dar aproximadamente 500 mg del producto crudo. Los
productos se caracterizaron por cromatografía de gases,
espectrometría de masas y NMR y se mostró que fueron
\delta-lactona del ácido (2S, 3R, 4S,
5R)-2-metil-4-etil-3,5-dihidroxi-n-hexanoico
y \delta-lactona del ácido (2S, 3R, 4S,
5R)-2-metil-4-etil-3,5-dihidroxi-n-heptanoico.
Se utilizaron aproximadamente 5 mg de ADN de
pC-ATX de aproximadamente 5 mg fue usado para
transformar los protoplastos de NRRL2338 de S. erythraea para
dar una cepa en la cual, el plásmido se integra dentro del
cromosoma. Se obtuvo el ADN total de diversas colonias y fue
analizado mediante hibridación Southern para confirmar que el
plásmido se ha integrado en el módulo 2 de EryAI para dar una nueva
ruta biosintética de macrólidos. Tuvieron lugar integraciones
adicionales para dar secuencias de plasmídicas repetidas. Se inoculó
el NRRL 2338/pC-ATX de S. erythraea en un
caldo de soja tríptico, que contenía 5 mg/ml de tioestreptona y se
incubó a 30ºC durante tres días. Se usaron 100 ml de este cultivo de
semilla para inocular 2 L de un medio definido de succionato de
sacarosa, que contenía 5 mg/ml de tioestreptona en 5 matraces de 2
L, cada uno conteniendo 500 mL de medio junto con dos agitadores
para ayudar en la dispersión y mezclar a 300 r.p.m. Después de 5
días más de crecimiento, los cultivos fueron centrifugados y se
ajustó el pH del sobrenadante a pH 9. A continuación, se extrajo el
sobrenadante tres veces con un volumen igual de acetato de etilo y
el disolvente fue retirado mediante evaporación. Los productos
fueron analizados mediante HPLC/MS y se identificaron dos productos
de macrólido:
El plásmido pC-AT12 es un
plásmido basado en SCP2^{*} que contenía un gen de PKS, que
comprende el módulo de carga ery, el primer y segundo módulos de
extensión de la PKS de ery y la tioesterasa terminadora de cadena de
la PKS de ery, excepto en que el segmento de ADN que codifica la
metilmalonil-CoA:ACP aciltransferasa dentro del
segundo módulo de extensión, ha sido sustituido específicamente por
el ADN que codifica a la malonil-CoA:ACP
aciltransferasa del módulo 2 de la PKS de rap. Este fue construido a
través de varios plásmidos intermedios como sigue (Figura 11).
El segmento de ADN de aproximadamente 1,0 kbp del
gen eryAI de S. erythraea que se extiende desde el nucleótido
6696 hasta al nucleótido 7707 de eryAI (Donadio. S. et al.,
Science (1991)252, 675-679) fue
amplificado por PCR, empleando como cebadores los oligonucleótidos
sintéticos 5'-GGC GGG TCC GGA GGT GTT CAC CGA
GTT-3' y 5'-ACC TTG GCC AGG GAA GAC
GAA CAC TGA-3'; y el plásmido pNTEp2 como plantilla.
El producto de PCR fue reparado en sus extremos y se ligó con el
plásmido pUC18, el cual había sido linealizado mediante digestión
con SmaI y después tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de
ligación fue usada para transformar el TG1 recO de E. coli y
se comprobaron las colonias individuales por su contenido
plasmídico. Se identificó el plásmido pMO25 deseado (3,5 kbp), en el
cual el sitio StuI que limita el inserto, es adyacente al sitio
HindIII del poliengarce, por su patrón de restricción.
El segmento de ADN de aproximadamente 0,6 kbp del
gen eryAI de S. erythraea que se extiende desde el nucleótido
8660 hasta el nucleótido 9258 de eryAI fue amplificado por PCR,
empleando como cebadores los oligonucleótidos sintéticos
5'-TCC TAG GCC GGG CCG GAC TGG TCG ACC TGC CGG
GTT-3' Y 5'-AAA CAC CGC GAC CTG GTC
CTC CGA GC-3'; y el plásmido pNTEp2 como plantilla.
El producto de PCR fue reparado en sus extremos y se ligó con el
plásmido pUC18, el cual había sido linealizado mediante digestión
con SmaI y después tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de
ligación se utilizó para transformar el TG1 recO de E. coli y
se comprobaron las colonias individuales por su contenido
plasmídico. Se identificó al plásmido pMO26 deseado (3,2 kbp), en el
cual el sitio AvrII que limita el inserto, es adyacente al sitio
HindIII del poliengarce, por su patrón de restricción.
El plásmido pMO25 fue digerido con EcoRI y BalI y
el inserto de 1,0 kbp se ligó con el plásmido pMO2, el cual había
sido digerido con EcoRI y BalI. La mezcla de ligación fue usada para
transformar el TG1 recO de E. coli y se comprobaron las
colonias individuales por su contenido plasmídico. Se identificó al
plásmido pMO27 deseado (4,4 kbp), por su patrón de restricción.
El plásmido pMO26 fue digerido con AvrII y
HindIII y el inserto de 0,6 kbp se ligó con el plásmido pMO27, el
cual había sido digerido con AvrII y HindIII. La mezcla de ligación
fue usada para transformar el TG1 recO de E. coli y se
comprobaron las colonias individuales por su contenido plasmídico.
Se identificó al plásmido pMO32 deseado (5,1 kbp), por su patrón de
restricción.
El plásmido pMO32 fue digerido con BspEI y SexAI
y el inserto de 2,7 kbp fue ligado al plásmido pNTEP2, el cual había
sido digerido con las mismas dos enzimas y purificado mediante
electroforesis en gel para retirar el inserto de 2,8 kbp. La mezcla
de ligación fue usada para transformar el TG1 recO de E. coli
y se verificaron las colonias individuales por su contenido
plasmídico. Se identificó al plásmido pMO33 deseado (12,8 kbp), por
su patrón de restricción.
El plásmido pMO33 fue digerido con NdeI y XbaI y
el inserto se ligó al plásmido pCJR29, el cual había sido digerido
con NdeI y XbaI y purificado mediante electroforesis en gel. La
mezcla de ligación fue usada para transformar el TG1 recO de E.
coli y se comprobaron las colonias individuales por su contenido
plasmídico. Se identificó el plásmido pC-AT12
deseado, por su patrón de restricción.
El plásmido pC-AT12 fue usado
para transformar los protoplastos JC2 de S. erythraea. Se
seleccionaron las colonias resistentes a la tioestreptona, en un
medio R2T20 que contenía 10 \mug/ml de tioestreptona.
Se hizo crecer un clon con una copia integrada de
C-AT12 en un medio SSM que contenía 5 \mug/ml de
tioestreptona y se hizo crecer durante 7 días a
28-30ºC. Después de este tiempo, el caldo fue
filtrado para retirar los micelios y se ajustó el pH a 3. El caldo
se extrajo dos veces con dos volúmenes de acetato de etilo y los
extractos de acetato de etilo combinados, fueron lavados con un
volumen igual de cloruro de sodio saturado, secado sobre sulfato de
sodio anhidro y se retiró el acetato de etilo bajo presión reducida,
para dar aproximadamente 500 mg del producto crudo. Se comprobó que
los productos eran \delta-lactonas del ácido
4-metil-3,5-dihidroxi-n-hexanoico
y del ácido (3R, 4S,
5R)-4-metil-3,5-dihidroxi-n-heptanoico.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron aproximadamente 5 \mug de ADN de
pC-AT12 para transformar los protoplastos de
NRRL2338 de S. erythraea para dar una cepa en la cual, el
plásmido está integrado dentro del cromosoma. Se obtuvo el ADN total
de varias colonias y fue analizado mediante hibridación
Southern para confirmar que el plásmido se ha integrado en
3' en el módulo 2 de eryAI para dar una nueva ruta biosintética de
macrólidos. Tuvieron lugar integraciones adicionales, dando
secuencias de plásmido repetidas. El NRRL
2338/pC-AT12 de S. erythraea fue inoculado en
un caldo de soja tríptico que contenía 5 mg/ml de tioestreptona y se
incubó a 30ºC durante tres días. Se usaron 100 ml de este cultivo de
semilla para inocular 2 L de un medio definido de succionato de
sacarosa, que contenía 5 \mug/ml de tioestreptona en 5 matraces de
2 L, cada uno conteniendo un medio de 500 mL junto con dos
agitadores para ayudar en la dispersión y mezclado a 300 r.p.m.
Después de 5 días más de crecimiento, los cultivos fueron
centrifugados y el pH del sobrenadante fue ajustado a pH 9. El
sobrenadante fue entonces extraído tres veces con un volumen igual
de acetato de etilo y el disolvente fue eliminado mediante
evaporación. Los productos fueron analizados mediante HPLC/MS y se
identificaron dos productos de macrólido:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pCJR49 es un plásmido basado en
pCJR24 que contiene un gen DEBS1-TE mutante el cual
no tiene cetoreductasa en el módulo 2 y en el que el dominio AT del
módulo 2 ha sido reemplazado por RAPS AT2 con el fin de incorporar
el extensor de malonilo, en lugar del extensor de metilmalonilo en
el segundo módulo (Figura 12).
El plásmido pMO32 fue digerido con BspEI y SexAI
y el fragmento que contiene el AT del módulo 2 de RAP fue clonado
dentro del pUC1-0, el cual había sido previamente
digerido con BspEI y SexAI, para conseguir el plásmido pCJR43.
El plásmido pCJR43 fue digerido con NdeI y XbaI y
el fragmento que contenía el gen DEBS1-TE mutante
fue clonado en el pCJR24 el cual había sido previamente digerido con
NdeI y XbaI, para conseguir el plásmido pCJR49. El plásmido pCJR49
fue confirmado por su mapa de enzimas de restricción.
Se utilizaron aproximadamente 5 \mug de ADN de
pCJR49 para transformar los protoplastos JC2 de S. erythraea
para dar una cepa en la que el plásmido está integrado dentro del
cromosoma Se obtuvo el ADN total de varias colonias y se analizó
mediante hibridación de transferencia Southern para confirmar
que el plásmido se ha integrado en el JC2/pCJR49 de S.
erythraea, el cual es inoculado en un caldo de soja tríptico,
que contiene 5 \mug/ml de tioestreptona e incubado a 30ºC durante
tres días. Se usaron 100 ml de este cultivo de semilla para inocular
2 L de un medio definido de succionato de sacarosa que contiene 5
\mug/ml de tioestreptona en 5 matraces de 2 L, cada uno
conteniendo 500 mL de medio junto con dos agitadores para ayudar en
su dispersión y mezclado a 300 r.p.m. Después de 5 días más de
crecimiento, los cultivos fueron centrifugados y el pH del
sobrenadante fue ajustado a pH 3. El sobrenadante se extrajo, a
continuación, tres veces con un volumen igual de acetato de etilo y
el disolvente fue eliminado mediante evaporación. Los productos
fueron disueltos en metanol y analizados mediante GCMS en un
Sistema GCQ Finnegan-MAT. El análisis indicó
que en comparación con los estándares sintéticos, estaban presentes
las dos nuevas lactonas. Estos productos eran
\delta-lactonas del ácido
4-metil-3-ceto-5-hidroxihexanoico
y del ácido
4-metil-3-ceto-5-hidroxiheptanoico:
Se utilizaron aproximadamente 5 \mug de ADN de
pCJR49 para transformar los protoplásticos de NRRL2338 de S.
erythraea para dar una cepa en la cual, el plásmido está
integrado dentro del cromosoma. Se obtuvo el ADN total de varias
colonias y se analizó mediante hibridación Southern para
confirmar que el plásmido se ha integrado en 3' en el módulo 2 de
EryAI para dar una nueva ruta biosintética de macrólidos. Tuvieron
lugar integraciones adicionales dando secuencias de plásmido
repetidas. El NRRL 1338/pCJR49 de S. erythraea fue inoculado
en un caldo de soja tríptico que contenía 5 mg/ml de tioestreptona e
incubado a 30ºC durante tres días. Se usaron 100 ml de este cultivo
de semilla para inocular 2 L de un medio definido de succionato de
sacarosa que contenía 5 \mug/ml de tioestreptona en 5 matraces de
2 L, cada uno conteniendo 500 mL de medio junto con dos agitadores
para ayudar a la dispersión y mezclado a 300 r.p.m. Después de 5
días más de crecimiento, los cultivos fueron centrifugados y el pH
del sobrenadante fue ajustado a pH 9. El sobrenadante fue, a
continuación, extraído tres veces con un volumen igual de acetato de
etilo y el disolvente fue eliminado mediante evaporación. Los
productos fueron analizados mediante HPLC/MS y se identificaron dos
macrólidos:
El plásmido pCRabc (Ejemplo 1) fue linealizado
con BamHI y ligado a pIJ702, previamente digerido con BgIII. La
mezcla contenía el plásmido pAVLD deseado (Figura 5). La mezcla de
ligación se usó para transformar el TG1 recO de E. coli y se
comprobaron las colonias individuales por su contenido plasmídico.
Se identificó al plásmido pAVLD deseado (Figura 5), por su patrón de
restricción.
Aproximadamente 5 a 10 \mug de pAVLD, aislados
del TG1 recO de E. coli (pAVLD) fueron transformados en
NRRL2338 de S. erythraea y se aislaron las colonias estables
resistentes a la tioestreptona. Una de estas colonias fue
seleccionada y el ADN total fue digerido con PstI y analizado
mediante hibridación Southern, empleando como sonda el
inserto procedente del plásmido pCRc, que contiene el fragmento del
gen ery AI que codifica el dominio de cetosintasa KS1. El análisis
mostró que los fragmentos de PstI hibridados positivamente de 8,5
kbp, 4,8 kbp y 33 kbp, indicaban la presencia de dos copias
integradas consecutivamente de pAVLD (Figura 6).
Se llevó a cabo una fermentación de 50 mL del
ERMD1 de S. erythraea en un medio de agua corriente y después
de 4 días a 30ºC, se recogieron los micelios recolectados y se
usaron para inocular 1,5 L de un medio de succinato de sacarosa que
contenía tioestreptona (5 \mug/mL). Después del crecimiento a 30ºC
durante 4 días, se extrajo dos veces la totalidad del caldo con un
volumen igual de acetato de etilo.
Los extractos combinados se concentraron a
presión reducida y fueron sometidos dos veces a cromatografía de
capa fina, en placas de sílice (20 x 20 cm) eluidas con
cloroformo/metanol/amonio/.88 a 8:2:0,01 (en volumen). Los productos
se separaron, adicionalmente, por HPLC en una columna de fase
inversa de base desactivada C18 PhaseSep S5 ODS
(octadecilsilano) 6 (4,6 mm x 25 mm) eluidos con metanol/acetato de
amonio al 0,5% (70/30 (vol./vol.)) a una razón de 1 mL/min. Las
fracciones fueron recogidas entre 7 y 11 minutos con tres
inyecciones diferentes, y las fracciones retiradas se inyectaron de
nuevo en diez inyecciones diferentes. Los análogos que contenían una
cadena lateral de isopropilo (isopropilo en R_{1} de la fórmula
1)derivadas de la incorporación de una unidad de iniciación
de 4 carbonos (C-4; isobutirilo) eluidas
anteriormente, con los análogos que contenían una cadena lateral de
sec-butilo (sec-butilo en R_{1} de
la fórmula 1) derivadas de la incorporación de una unidad de
iniciación de 5 carbonos (C-5;
2-metilbutirilo) emergiendo varios minutos después.
Un MS de alta resolución dio los resultados de los análogos
C-4 eryA, eryB y eryD y de los análogos
C-5 eryA y eryB, los cuales correspondían
estrechamente a los calculados
en:
en:
| Análogo | Masa Calculada | Masa Medida | |
| C5-eryA | 762,5005 | 762,5021 | |
| C4-eryA | 748,4847 | 748,4820 | |
| C5-eryB | 746,4898 | 748,5077 | |
| C4-eryB | 732,4898 | 732,4933 |
En estos experimentos, las eritromicinas
naturales estaban presentes solo en cantidades bajas o
indetectables, y no hubo cantidades detectables de análogos Eric. La
relación de concentración total de los compuestos
C-4/C-5 en el caldo de fermentación,
tal y como se estimó por ESMS de los extractos de acetato de etilo
de los caldos, fue entre 4:1 y 6:1 a favor de los compuestos
C-4. La relación A:B:D de los análogos es variable,
cerca de 15:60:25, pero con una proporción en incremento de los
análogos A en tanto que procede la fermentación. El rendimiento
total de eritromicinas es de aproximadamente 400 \mug/litro. No
se llevó a cabo ninguna complementación con ninguno de los ácidos
isobutírico o 2-metilbutírico. Así, resulta que las
unidades de iniciación de isobutirilo y
2-metilbutirilo son derivadas de los precursores
suministrados endógenamente, análogos a la síntesis de las
avermectinas naturales (por ejemplo, Hafner et al. (1991), J.
Antibiot. 44:349-356).
Se transformaron aproximadamente 5 \mug del
plásmido pIG1 en los protoplastos NRRL 2338 de S. erythraea y
se aislaron las colonias resistentes a la tioestreptona. Se obtuvo
el ADN total procedente de varias colonias y se analizaron mediante
hibridación Southern, para confirmar que el plásmido se
hallaba integrado específicamente dentro de eryAI y el análisis
Southern también mostró que el sitio de integración era
apropiado para generar un mutante capaz de producir macrólidos
alterados a través de módulo de carga ave.
Se transformaron aproximadamente 5 \mug del
plásmido pND30 en los protoplastos NRRL 2338 de S. erythraea
y se aislaron las colonias resistentes a la tioestreptona. Se obtuvo
el ADN total de varias colonias y se analizó mediante hibridación
Southern, para confirmar que el plásmido se hallaba integrado
específicamente dentro de eryAI y el análisis Southern
también mostró que el sitio de integración era apropiado para
generar un mutante capaz de producir macrólidos alterados a través
de módulo de carga ave.
Se inoculó el NRRL 2338/pIG1 de S.
erythraea en un medio de agua corriente que contenía 50
\mug/mL de tioestreptona y se dejó crecer durante cuatro días a
30ºC. Después de esto, se usaron 20 mL de micelio para germinar 500
mL de un medio de succionato de sacarosa que contenía 50 \mug/mL
de tioestreptona, en un matraz de 2L con un solo agitador para
reducir el aglutinamiento y se agitó a 280 r.p.m. Después de entre
3,5 y 6 días, el caldo fue filtrado para retirar los micelios y, a
continuación, se extrajo tres veces con un cuarto del volumen de
acetato de etilo. Los extractos combinados de acetato de etilo se
secaron sobre sulfato de sodio anhídrido y el disolvente fue
retirado mediante evaporación. El análisis de la mezcla del
producto, usando GC y MS con electrospray, revelaron que del total
de los 5-6 mg de productos macrólidos de 14
miembros, el componente principal era la eritromicina de
sec-butilo D (aproximadamente 1,5 mg/L), con otros
componentes presentes, que eran la eritromicina de
sec-butilo B y la eritromicina de
sec-butilo A; eritromicinas de
sec-butilo A, B y D; y pequeñas cantidades de
eritromicinas naturales A, B y D. El NRRL 2338/pIG1 de S.
erythraea produjo aproximadamente de 10 a 15 veces más de las
nuevas eritromicinas de sec-butilo e isopropilo,
comparándose con la construcción equivalente de ERMD1 de S.
erythraea (ver Ejemplo 2), mostrando claramente la capacidad del
promotor actI y su gen activador cognitivo
actII-orf4, para potenciar la expresión de las PKS
de Tipo I. De nuevo, no se llevó a cabo ninguna complementación con
ninguno de los ácidos isobutírico o 2-metilbutírico.
De esta manera, resulta que las unidades de iniciación de
isobutirilo y 2-metilbutirilo son derivadas de los
precursores suministrados endógenamente.
El NRRL 2338/pND30 de S. erythraea fue
inoculado enun medio de agua corriente que contenía 50 \mug/mL de
tioestreptona y se dejó crecer durante cuatro días a 30ºC. Después
de esto, se usaron 20 mL de micelios para germinar 500 mL de un
medio de succionato de sacarosa que contenía 50 \mug/mL de
tioestreptona, en un matraz de 2L con un solo agitador para reducir
el aglutinamiento y se agitó a 280 r.p.m. Después de entre 3,5 y 6
días, el caldo fue filtrado para retirar los micelios y después se
extrajo tres veces con un cuarto del volumen de acetato de etilo.
Los extractos combinados de acetato de etilo fueron secados sobre
sulfato de sodio anhídrido y el disolvente fue retirado mediante
evaporación. El análisis de la mezcla del producto, usando GC y MS
con electrospray, revelaron que de un total de 5 a 6 mg/L de
productos macrólidos de 14 miembros, el componente principal era la
eritromicina de sec-butilo D (aproximadamente 1,5
mg/L), con otros componentes presentes que eran la eritromicina de
sec-butilo B y la eritromicina de
sec-butilo A; eritromicinas de
sec-butilo A, B y D; y pequeñas cantidades de
eritromicinas naturales A, B y D. El NRRL 2338/pND30 de S.
erythraea produjo aproximadamente de 10 a 15 veces más de las
nuevas eritromicinas de sec-butilo e isopropilo,
comparándose con la construcción equivalente de ERMD1 de S.
erythraea (ver Ejemplo 2), mostrando, claramente, la capacidad
del promotor actI y su gen activador cognitivo
actII-orf4, para potenciar la expresión de las PKS
de Tipo I. De nuevo, no se llevó a cabo ninguna complementación con
ninguno de los ácidos isobutírico o 2-metilbutírico.
De esta manera, resulta que las unidades de iniciación de
isobutirilo y 2-metilbutirilo son derivadas de los
precursores suministrados endógenamente.
El cultivo de NRRL 2338/pIG1 de S.
erythraea fue inoculado en 50 mL de un medio de agua corriente
en un matraz Erlenmeyer de 300 mL. Después de 36 horas de
incubación a 28ºC, se utilizó este matraz para inocular 3,5 L de un
medio de ERY-P, en un recipiente pequeño de 5 L. El
caldo fue incubado a 28ºC, con una velocidad de aeración de 1,75
L/min. Se añadió ácido ciclopentancarboxílico (1,4 mL) después de 24
horas y se continuó la fermentación durante 168 horas. Después de
este tiempo, se ajustó el pH del caldo en su totalidad a un pH 8,5
con hidróxido de sodio acuoso y se extrajo con acetato de etilo (10
L). El extracto de acetato de etilo fue concentrado hasta sequedad,
dando el producto crudo en forma de una goma (4,2 g). Un gramo de
este extracto fue disuelto en acetato de etilo (5 mL) y se añadió a
un cartucho de gel de sílice preempaquetado (10 g; International
Sorbent Technology), previamente acondicionado con acetato de
etilo (10 mL). La columna se eluyó secuencialmente con acetato de
etilo (4 x 10 mL); diclorometano: metanol (1:1) (2 x 10 mL);
diclorometano: metanol: amonio (90:9:1) (1 x 10 mL); diclorometano:
metanol: amoníaco (80:19:1) (1 x 10 mL); metanol (2 x 10 mL). Las
fracciones 7 a 10 fueron combinadas y evaporadas hasta sequedad. Se
repitió el fraccionamiento con los 3,2 g de goma remanentes. Esta
etapa de enriquecimiento dio 920 mg de un sólido gomoso que contenía
el producto deseado. Este fue adicionalmente purificado mediante
HPLC de fase inversa de preparación, usando una columna ODS
Zorbax de 7 \mum (21,2 mm x 25 cm)usando una fase móvil
de acetonitrilo : 0,05 M de acetato de amonio (7:3) a 8 mL/min. Las
fracciones que contenían el producto de interés, fueron combinadas a
partir de cuatro inyecciones diferentes y evaporadas hasta sequedad,
antes de repetir al HPLC de fase inversa de preparación, usando una
columna ODS Ultrasphere Beckman de 5 \mum (10 mm x 25 cm)
usando un gradiente de fase móvil de acetonitrilo: acetato de amonio
0,05 M (28:72) a acetonitrilo: acetato de amonio 0,05 M (50:50)
durante 18 minutos (velocidad de flujo a 4 mL/min.). Las fracciones
que contenían el producto de interés, procedentes de cinco
inyecciones diferentes fueron combinadas y evaporadas hasta
sequedad, para dar un sólido puro y blanco (7 mg). La estructura del
producto fue confirmada mediante espectrometría de masas (MS) y
espectroscopia de resonancia magnética nuclear (NMR), como
sigue:
Tiempo de retención de HPLC - Método A - 26,0
minutos.
Espectrometría de masas APCI (M + H)^{+}
observada a m/e 758, requerido para
C_{40}H_{72}NO_{12}-758.
Un experimento similar al del ejemplo 6a, usando
el cultivo NRRL/2338 pND30 de S. erythraea, produce el
compuesto ejemplificado en el ejemplo 6a.
El cultivo de NRRL 2338/pIG1 de S.
erythraea fue inoculado en 50 mL de un medio de agua corriente
en 3 matraces Erlenmeyer de 300 mL. Después de 72 horas de
incubación a 28ºC, este matraz fue utilizado para inocular 3,5 L de
un medio de ERY-P, en 3 recipientes pequeños de 5 L.
El caldo fue incubado a 28ºC, con una razón de aeración de 2,0
L/min. y se agitó a 500 r.p.m. Se añadieron dos raciones de ácido
ciclobutanocarboxílico (1,4 mL) después de 24 horas y 48 horas, y se
continuó la fermentación durante 168 horas. Después de este tiempo,
se ajustó el pH del caldo en su totalidad a 8,5 con hidróxido de
sodio acuoso y se extrajo, a continuación, con acetato de etilo (20
L). El extracto de acetato de etilo se concentró hasta sequedad,
dando el producto crudo en forma de una goma (9,2 g). Se disolvió
una porción (2,3 g) de este extracto en acetato de etilo (12,5 mL) y
se añadió a un cartucho de gel de sílice preempaquetado (10 g;
International Sorbent Technology), previamente acondicionada
con acetato de etilo (10 mL). Se eluyó la columna secuencialmente
con acetato de etilo (4 x 24 mL); diclorometano: metanol (9:1) (1 x
24 mL); diclorometano: metanol (8:2) (2 x 24 mL); diclorometano:
metanol: amoníaco (80:19:1) (1 x 24 mL); metanol (1 x 24 mL). Se
combinaron las fracciones 6 a 8 y se evaporaron hasta sequedad. Este
fraccionamiento fue repetido en una muestra de goma remanente (4,7
g). Este paso de enriquecimiento dio 415 mg ca. de un sólido que
contenía el producto deseado. Este fue adicionalmente purificado
mediante HPLC de fase inversa de preparación, usando una columna
ODS Zorbax de 7 \mum (21,2 mm x 25 cm) usando una fase
móvil de acetonitrilo: acetato de amonio 0,05 M (3:1) a 8 mL/min.
Las fracciones que contenían el producto de interés procedentes de
cinco inyecciones diferentes, fueron combinadas y evaporadas hasta
sequedad, antes de repetir la HPLC de fase inversa de preparación,
usando una columna ODS Ultrasphere Beckman de 5 \mum (10 mm
x 25 cm) usando un gradiente de fase móvil de acetonitrilo: acetato
de amonio 0,05 M (28:72) a acetonitrilo: acetato de amonio 0,05 M
(50:50) durante 18 minutos (velocidad de flujo a 4 mL/min.). Las
fracciones que contenían el producto de interés, fueron combinadas y
evaporadas hasta sequedad, dando un sólido puro y blanco (27 mg). La
estructura del producto fue confirmada mediante espectrometría de
masas (MS) y espectroscopia de resonancia magnética nuclear (NMR),
como sigue:
Tiempo de retención de HPLC - Método A - 22,3
minutos.
Espectrometría de masas APCI (M + H)^{+}
observada a m/e 744, requerido para
C_{39}H_{70}NO_{12}-744
Un experimento similar al del ejemplo 7a , usando
el cultivo NRRL/2338 pND30 de S. erythraea, produce el
compuesto ejemplificado en el ejemplo 7a.
El cultivo de NRRL 2338/pIG1 de S.
erythraea fue inoculado en 50 mL de un medio de agua corriente
en un matraz Erlenmeyer de 300 mL. Después de 72 horas de
incubación a 28ºC, este matraz fue utilizado para inocular 3,5 L de
un medio ERY-P, en un recipiente pequeño de 5L. El
caldo se incubó a 28ºC, con una velocidad de aeración de 1,75 L/min.
Se añadió ácido 3-furoico (1,4 g en 6 mL de metanol)
a un filtro esterilizado después de 24 horas y se continuó la
fermentación durante 138 horas. Después de este tiempo, se ajustó el
pH del caldo en su totalidad a un pH 8,5 con hidróxido de sodio
acuoso y se extrajo con acetato de etilo (10L). Se concentró el
extracto de acetato de etilo hasta sequedad, dando el producto crudo
en forma de una goma (3,8 g). Una porción (1,9 g) de este extracto
fue disuelto en acetato de etilo (10 mL) y se añadió a un cartucho
de gel de sílice preempaquetado (10 g; International Sorbent
Technology), previamente acondicionada con acetato de etilo (10
mL). La columna se eluyó secuencialmente con acetato de etilo (4 x
24 mL); diclorometano: metanol (9:1) (1 x 24 mL); diclorometano:
metanol (8:2) (2 x 24 mL); diclorometano: metanol: amoníaco
(80:19:1) (1 x 36 mL); metanol (1 x 24 mL). Las fracciones 8 y 9
fueron combinadas y evaporadas hasta sequedad. Se repitió el
fraccionamiento con los 1,9 g de goma restantes. Con este paso de
enriquecimiento se obtuvo un sólido que contenía el producto
deseado. Este fue adicionalmente purificado mediante HPLC de fase
inversa de preparación, usando una columna ODS Zorbax de 7
\mum (21,2 mm x 25 cm) usando una fase móvil de acetonitrilo:
acetato de amonio 0,05 M (3:1) a 8 mL/min. Las fracciones que
contenían el producto de interés, procedentes de tres inyecciones
diferentes fueron combinadas y evaporadas hasta sequedad, antes de
repetir la HPLC de fase inversa de preparación, usando una columna
ODS Ultrasphere Beckman de 5 \mum (10 mm x 25 cm) usando un
gradiente de fase móvil de acetonitrilo: acetato de amonio 0,05 M
(28:72) a acetonitrilo: acetato de amonio 0,05 M (50:50) durante 18
minutos (velocidad de flujo de 4 mL/min.). Las fracciones que
contenían el producto de interés procedentes de tres inyecciones
diferentes, fueron combinadas y evaporadas hasta sequedad, dando la
13-(3-furanil)-eritromicina B pura
en forma de un sólido blanco (9 mg). La estructura del producto fue
confirmada mediante espectrometría de masas (MS).
Tiempo de retención de HPLC - Método A - 17,0
minutos.
Espectrometría de masas APCI (M + H)^{+}
observada a m/e 756, requerido para
C_{39}H_{66}NO_{13}-756.
Un experimento similar al del ejemplo 8a, usando
el cultivo NRRL/2338 pND30 de S. erythraea, produce el
compuesto ejemplificado en el ejemplo 8a.
El cultivo de NRRL 2338/pIG1 de S.
erythraea fue inoculado en 50 mL de un medio de agua corriente
en un matraz Erlenmeyer de 300 mL. Después de 72 horas de
incubación a 28ºC, este matraz fue utilizado para inocular 3,5 L de
un medio de ERY-P. Se añadió tioestreptona (105
mg)inmediatamente después de la esterilización. El caldo se
incubó a 28ºC, con una velocidad de aeración de 1,75 L/min. y
agitándose a 500 r.p.m. Después de 24 horas se añadió ácido
ciclopropanocarboxílico (1,2 mL) y se continuó la fermentación
durante 144 horas. Después de este tiempo, se ajustó el pH del caldo
en su totalidad a un pH de 8,5 con hidróxido de sodio acuoso y, a
continuación, se extrajo con acetato de etilo (3L). El extracto de
acetato de etilo se concentró hasta sequedad, dando al producto
crudo en forma de una goma (1,7 g). Este extracto (0,85 g) se
disolvió en acetato de etilo (10 mL) y se añadió a un cartucho de
gel de sílice preempaquetado (10 g; International Sorbent
Technology), previamente acondicionada con acetato de etilo (20
mL). La columna se eluida secuencialmente con acetato de etilo (4 x
24 mL); diclorometano: metanol (9:1) (1 x 24 mL); diclorometano :
metanol (8:2) (1 x 24 mL); diclorometano: metanol: amonio (80:19:1)
(3 x 24 mL); metanol (1 x 24 mL). Las fracciones 6 a 9 fueron
combinadas y evaporadas hasta sequedad. El fraccionamiento se
repitió con los 0,85 g de goma restantes. Con este paso de
enriquecimiento se obtuvo un sólido que contenía el producto
deseado. Este fue adicionalmente purificado mediante HPLC de fase
inversa de preparación, usando una columna ODS Zorbax de 7
\mum (21,2 mm x 25 cm) usando una fase móvil de acetonitrilo:
acetato de amonio 0,05 M (3:1) a 8 mL/min. Las fracciones que
contenían el producto de interés, procedentes de cuatro inyecciones
diferentes, fueron combinadas y evaporadas hasta sequedad, antes de
repetir la HPLC de fase inversa de preparación, usando una columna
ODS Ultrasphere Beckman de 5 \mum (10 mm x 25 cm) usando
un gradiente de fase móvil de acetonitrilo: acetato de amonio 0,05 M
(28:72) a acetonitrilo: acetato de amonio 0,05 M (50:50) durante 18
minutos (velocidad de flujo a 4 mL/min.). Las fracciones que
contenían el producto de interés, fueron combinadas a partir de tres
inyecciones diferentes y evaporadas hasta sequedad, dando la
13-ciclopropil-eritromicina B pura
en forma de un sólido blanco (9 mg). La estructura del producto fue
confirmada mediante espectrometría de masas (MS).
Tiempo de retención de HPLC - Método A - 17,9
minutos.
Espectrometría de masas APCI (M + H)^{+}
observada a m/e 730, requerido para
C_{38}H_{68}NO_{12}-730
Un experimento similar al ejemplo 9a, usando el
cultivo NRRL/2338 pND30 de S. eryhtraea, produce el compuesto
ejemplificado en el ejemplo 9a.
El cultivo de NRRL 2338/pIG1 de S.
erythraea fue inoculado en 1 L de un medio de agua corriente en
un matraz Fernbach de 2,8 L. Se añadió tioestreptona
inmediatamente después de la inoculación. Después de 84 horas de
incubación a 29ºC, este matraz fue utilizado para inocular 8 L de un
medio complementado de ERY-P (50 g/L de Dextrosa, 30
g/L de harina Nutrisoy, 3 g/L de sulfato de amonio, 5g/L de
NaCl, 6 g/L de CaCO_{3}, 10 g/L de sacarosa, 5 g/L sólidos de maíz
empapado, 0,5 g/L de MgSO_{4} y 1 mL/L de P2000) en un recipiente
de fermentación de 14 L. El caldo se incubó a 28ºC, con una
velocidad de aeración de 8 L/min. y agitándose a 800 r.p.m. y con un
pH mantenido entre 6,9 y 7,3 con NaOH o H_{2}SO_{4} (15%). Se
añadió ácido metiltioláctico (3,2 mL) después de 24 y 48 horas y se
continuó la fermentación durante 142 horas. Se añadió después de 12
horas más, ácido metiltioláctico (1,6 mL). La fermentación continuó
durante 142 horas. Después de este tiempo, se centrífugo el caldo en
su totalidad para obtener el concentrado (34 L) el cual se cargó en
una columna de resina XAD-16 (600 mL; Rohm and
Hass). La columna de resina fue entonces lavada con agua (1,8 L)
y eluida con acetato de etilo (2,5 L). El acetato de etilo fue
parcialmente concentrado (a 250 mL) y después el producto de interés
fue extraído con un tampón de fosfato de sodio, pH 3,5 (1,3 L). El
producto fue transferido otra vez al acetato de etilo, ajustando el
agua a pH 9 con hidróxido de sodio y después mezclándolo con acetato
de etilo (450 mL). La capa de acetato de etilo rica en eritromicina
fue separada y evaporada produciendo una goma (5,0 g) y después fue
suspendida de nuevo en metanol al 20% (120 mL), que se cargó en una
columna de resina CG-161 (100 mL; Toso Haas).
La columna de resina se eluyó secuencialmente con metanol al 20% (3
x 100 mL), metanol al 40% (3 x 100 mL), metanol al 60% (3 x 100 mL),
metanol al 80% (3 x 100 mL) y metanol puro (4 x 100 mL). Las
fracciones 2 y 3 del metanol puro, que contenían el producto de
interés fueron evaporadas a un estado sólido (220 mg) y después
purificadas sobre una columna HPLC Kromasil de 10
\mum de fase inversa (75 mm x 25 cm) usando una fase móvil de
acetonitrilo : acetato de amonio 0,05 M con un gradiente de ácido
trifluoroacético a una relación desde (32:68) hasta (38:62) a una
velocidad de flujo de 215 mL/min. Las fracciones que contenían el
producto de interés, fueron combinadas (1,7 L) ajustadas a pH 9, con
hidróxido de sodio y extraídas con cloruro de metileno (300 mL). La
capa de cloruro de metileno fue separada y evaporada a un estado
seco, para obtener un producto parcialmente puro. El paso de HPLC de
preparación y el paso de extracción fueron repetidos para obtener la
13-(1-metiltio-etil)-eritromicina
B pura (31 mg). La estructura del producto fue confirmada mediante
espectrometría de masas (MS) y espectroscopia de Resonancia
Magnética Nuclear (NMR)(espectrómetro Bruker DMX 500 MHz)
como sigue:
Tiempo de retención de HPLC - Método B - 14,9
minutos.
Espectrometría de masas APCI (M + H)^{+}
observada a m/e 746, requerido para
C_{38}H_{70}NO_{12}S-764
Un experimento similar al del ejemplo 10a, usando
el cultivo NRRL/2338 pND30 de S. erythraea, produce al
compuesto ejemplificado en el ejemplo 10a.
El cultivo de NRRL 2338 de S. erythraea
fue inoculado en 50 mL de medio de agua corriente en un matraz
Erlenmeyer de 300 mL. Después de 48 horas de incubación a
28ºC, este matraz fue utilizado para inocular 50 L de un medio de
ERY-P en un matraz Erlenmeyer de 300 mL. El
caldo fue incubado a 28ºC. Se añadió ácido ciclobutanocarboxílico
(20 mL) después de 24 horas y se continuó la fermentación durante
168 horas. Después de este tiempo, se ajustó el pH del caldo en su
totalidad a un pH de 8,5 con hidróxido de sodio acuoso y se extrajo
con acetato de etilo (50 mL). El extracto de acetato de etilo fue
separado y concentrado hasta sequedad. La muestra fue disuelta de
nuevo en metanol (1 mL) por análisis de espectrometría de masas -
HPLC. Esto confirmó la producción de
13-ciclobutil-eritromicina B
mediante el NRRL 2338 no transformado y no recombinante, tal y como
se describe en el Ejemplo 7 en la cepa diseñada genéticamente, que
contenía el módulo de carga avr (construcción NRRL
2338/pIG1).
Tiempo de retención de HPLC - Método A - 22,3
minutos.
Espectrometría de masas APCI (M + H)^{+}
observada a m/e 744, requerido para
C_{39}H_{70}NO_{12}-744.
El cultivo de NRRL 2338 de S. erythraea
fue inoculado en 50 mL de un medio de agua corriente en un matraz
Erlenmeyer de 300 mL. Después de 48 horas de incubación a
28ºC, este matraz fue utilizado para inocular 50 L de un medio de
ERY-P en un matraz Erlenmeyer de 300 mL. El
caldo fue incubado a 28ºC. Se añadió ácido ciclopropanocarboxílico
(20 mL) después de 24 horas y se continuó la fermentación durante
168 horas. Después de este tiempo, se ajustó el pH del caldo en su
totalidad a un pH de 8,5 con hidróxido de sodio acuoso y se extrajo
con acetato de etilo (50 mL). El extracto de acetato de etilo fue
separado y concentrado hasta sequedad. La muestra fue disuelta de
nuevo en metanol (1 mL) por análisis de espectrometría de
masas-HPLC.
Esto confirmó la producción de
13-ciclopropil-eritromicina B por el
NRRL 2338 no transformado y no recombinante, tal y como se describe
en el Ejemplo 9 en la cepa diseñada genéticamente, que contiene el
módulo de carga avr (construcción NRRL 2338/pIG1).
Tiempo de retención de HPLC - Método A - 17,9
minutos.
Espectrometría de masas APCI (M + H)^{+}
observada a m/e 730, requerido para
C_{38}H_{68}NO_{12}-730
El cultivo de NRRL 2338/pIG1 de S.
erythraea fue inoculado en 50 mL de un medio de agua corriente
en 3 matraces Erlenmeyer de 300 mL. Después de 72 horas de
incubación a 28ºC, cada matraz fue utilizado para inocular 3,5 L de
un medio de ERY-P, en 3 recipientes pequeños de 5L.
El caldo fue incubado a 28ºC, con una velocidad de aeración de 2,0
L/min. y agitándose a 500 r.p.m. Se añadieron dos raciones de ácido
carboxílico de ciclobutano (1,4 mL) después de 24 horas y 48 horas,
y se continuó la fermentación durante 168 horas. Después de este
tiempo, se ajustó el pH del caldo en su totalidad a un de pH 8,5 con
hidróxido de sodio acuoso y se extrajo con acetato de etilo (20 L).
El extracto de acetato de etilo fue concentrado hasta sequedad,
dando el producto crudo en forma de una goma (9,2 g). Una porción
(2,3 g) de este extracto (2,3 g) fue disuelto en acetato de etilo
(12,5 mL) y se añadió a un cartucho de gel de sílice preempaquetado
(10 g; International Sorbent Technology), previamente
acondicionada con acetato de etilo (10 mL). La columna fue eluida
secuencialmente con acetato de etilo (4 x 24 mL); diclorometano:
metanol (9:1) (1 x 24 mL); diclorometano: metanol (8:2) (2 x 24 mL);
diclorometano: metanol: amonio (80:19:1) (1 x 24 mL); metanol (1 x
24 mL). Las fracciones 6 a 8 fueron combinadas y evaporadas hasta
sequedad. Este fraccionamiento fue repetido con la muestra de goma
restante (4,7 g). Este paso de enriquecimiento dio 415 mg de un
sólido que contenía el producto deseado. Este fue adicionalmente
purificado mediante HPLC de fase inversa de preparación, usando una
columna ODS Zorbax de 7 \mum (21,2 mm x 25 cm)usando
una fase móvil de acetonitrilo: acetato de amonio 0,05 M (3:1) a 8
mL/min. Las fracciones que contenían el producto de interés, fueron
combinadas a partir de cinco inyecciones diferentes y evaporadas
hasta sequedad, antes de repetir la HPLC de fase inversa de
preparación, usando una columna ODS Ultrasphere Beckman de 5
\mum (10 mm x 25 cm) usando un gradiente de fase móvil de
acetonitrilo: acetato de amonio 0,05 M (28:72) a acetonitrilo:
acetato de amonio 0,05 M (50:50) durante 18 minutos (velocidad de
flujo de 4 mL/min.). Las fracciones que contenían el producto de
interés, fueron combinadas y evaporadas hasta sequedad, para dar un
sólido puro y blanco (4 mg). La estructura del producto fue
confirmada mediante espectrometría de masas (MS) y espectrometría de
resonancia magnética nuclear (NMR), como sigue:
Tiempo de retención de HPLC - Método A - 17,5
minutos.
Espectrometría de masas APCI (M + H)^{+}
observada a m/e 760, requerido para
C_{39}H_{70}NO_{13}-760
Un experimento similar al del ejemplo 13a, usando
el cultivo NRRL/2338 pND30 de S. erythraea, produce el
compuesto ejemplificado en el ejemplo 13a.
Se inocularon seis matraces Fernbach de
2800 mL con NRRL 2338/pIG1 de S. erythraea. Cada matraz
contenía 1 L de un medio de agua corriente con 50 mg de
tioestreptona añadidos a cada matraz. Después de 24 horas de
incubación a 28ºC, se añadieron 200 ppm de ácido
ciclopropanocarboxílico a cada matraz. Los matraces fueron incubados
durante 90 horas y fueron compuestos dentro de una botella
aspiradora estéril de 8 L. La botella aspiradora fue utilizada para
inocular 314 galones de un medio de ERY-P en un
recipiente piloto de 500 galones. El caldo fue incubado entre 27ºC y
29ºC a un pH que variaba entre 6,7 y 7,4, a una velocidad de
aeración de 20 pies estándar cúbicos/min. y agitándose a 175 r.p.m.
Se añadió ácido ciclopropanocarboxílico (200 mg/L) después de 33
horas, 81 horas y 117 horas. La fermentación continuó durante 198
horas. Después de este tiempo, se filtró el caldo en su totalidad
sobre un filtro de cerámica de 0,2 \mum (filtro Estadounidense, 30
pies^{2}). El filtrado se cargó en una columna de resina
XAD-16 (12 L; Rohm and Haas). La columna de
resina fue eluida, a continuación, con acetato de etilo (60 L). El
acetato de etilo fue concentrado hasta una goma (302 g), a la que se
le añadieron 2 L de cloruro de metileno. La solución de cloruro de
metileno resultante, fue lavada con 8 L de un tampón 250 mM de
bicarbonato de sodio, pH 9. La capa de cloruro de metileno rica en
eritromicina fue separada y evaporada hasta una goma (200 g) y
después suspendida en metanol al 40% (10 L), la cual fue cargada en
una columna de resina CG-161 (9 L; Toso
Haas). La columna de resina fue lavada con metanol al 40% (30 L)
y eluida secuencialmente con metanol al 75% (8 x 10 L) y metanol
puro (3 x 10 L). Las fracciones 5 a 8 de metanol al 75%, que
contenían al producto de interés, fueron combinadas y evaporadas a
3,2 L. El concentrado fue ajustado a pH 9 y se le añadió 0,95 L de
cloruro de metileno. La capa de cloruro de metileno fue separada y
evaporada para obtener 12,4 g de una goma. Parte de la goma (seis
gramos) fue purificada, adicionalmente, mediante HPLC en una columna
HPLC C18 Kromasil de 10 \mum de fase inversa (75 mm x 25
cm) usando una fase móvil de metanol: acetato de amonio 0,05 M con
ácido trifluoroacético isocrático al 0,1% (50:50) a una velocidad de
flujo de 215 mL/min. Las fracciones que contenían el producto de
interés, fueron combinadas (230 mL), evaporadas a un concentrado
(110 mL) y ajustadas a pH 9, con hidróxido de sodio y extraídas con
cloruro de metileno (50 mL). La capa de cloruro de metileno fue
separada y evaporada hasta sequedad, para obtener 630 g del producto
parcialmente puro. Otra porción de la goma (un gramo) fue purificada
adicionalmente mediante HPLC preparativa de fase inversa, usando una
columna C8 MetaChem Intersil de 10 \mum (75 mm x 25 cm)
usando una fase móvil de acetonitrilo : 0,05 M de acetato de amonio
con un gradiente de ácido trifluoroacético a una relación desde
(20:80) hasta (25:75) durante 50 minutos a una velocidad de flujo de
215 mL/min. Las fracciones que contenían el producto de interés (28
a 46 minutos) fueron combinadas, saturadas con bicarbonato de sodio
y extraídas con cloruro de metileno. El cloruro de metileno fue
separado y evaporado hasta sequedad, obteniendo 361 mg del producto
parcialmente puro. Una porción de estos materiales parcialmente
puros fue purificada adicionalmente mediante HPLC de fase inversa,
tal y como se ejemplifica por: una columna Phenomenex Prodigy
de 10 \mum de fase inversa (50 x 250 mm) usando una fase móvil de
metanol: acetato de amonio 0,05 M con ácido trifluoroacético
isocrático al 0,1% (50:50) a una velocidad de flujo de 100 mL/min.
Las fracciones que contenían el producto de interés
(27-31 minutos) fueron combinadas, saturadas con
bicarbonato de sodio y extraídas con cloruro de metileno. El cloruro
de metileno fue separado y evaporado hasta sequedad para obtener el
producto parcialmente puro. El material fue purificado
adicionalmente mediante HPLC de fase inversa, usando una columna
Phenomenex Prodigy de 10 \mum de fase inversa (50 x 250 mm)
usando una fase móvil de metanol: acetato de amonio 0,05 M con
ácido trifluoroacético isocrático al 0,1% (48:52) a una velocidad
de flujo de 100 mL/min. Las fracciones que contenían el producto de
interés (41-45 minutos) fueron combinadas, saturadas
con bicarbonato de sodio y extraídas con cloruro de metileno. El
cloruro de metileno fue separado y evaporado hasta sequedad,
obteniendo
13-ciclopropil-eritromicina A pura
en forma de sólido (20 mg). La estructura del producto fue
confirmada mediante espectrometría de masas (MS) y espectrometría de
Resonancia Magnética Nuclear (RMN) (espectrómetro Bruker DMX 500
MHz).
Tiempo de retención de HPLC - Método B - 5,6
minutos.
Espectrometría de masas APCI (M + H)^{+}
observada a m/e 746, requerido para
C_{36}H_{66}NO_{13}-746.
Un experimento similar al del ejemplo 14a, usando
el cultivo NRRL/2338 pND30 de S. erythraea, produce el
compuesto ejemplificado en el ejemplo 14a.
El cultivo de NRRL 2338/pGI1 de S.
erythraea fue inoculado en 50 mL de un medio de agua corriente
en un matraz Erlenmeyer de 300 mL. Después de 48 horas de
incubación a 28ºC, este inóculo fue utilizado para inocular 50 L de
un medio de ERY-P en un matraz Erlenmeyer de
300 mL. El caldo fue incubado a 28ºC. Se añadió el tioéster de
cisteamina de N-acetil de ácido carboxílico de
3-tiofeno (20 mg en 0,5 mL de metanol) esterilizado
en filtro después de 24 horas y se continuó la fermentación durante
168 horas. Después de este tiempo, se ajustó el pH de la totalidad
del caldo a pH 8,5 con hidróxido de sodio acuoso y, a continuación,
se extrajo con acetato de etilo (50 mL). El acetato de etilo fue
separado y concentrado hasta sequedad. La muestra se disolvió de
nuevo en metanol (1 mL) para el análisis de espectrometría de masas-
HPLC. Esto confirmó la producción de
13-(3-tienil)-eritromicina B.
Tiempo de retención de HPLC - Método A - 20,0
minutos.
Espectrometría de masas APCI (M + H)^{+}
observada a m/e 772, requerido para
C_{39}H_{66}NO_{12}-772.
Un experimento similar al del ejemplo 15a, usando
el cultivo NRRL/2338 pND30 de S. erythraea, produce el
compuesto ejemplificado en el ejemplo 15a.
El cultivo de NRRL 18643 de S. erythraea,
un mutante eryF de S. erythraea (Science, 252:114,
5 de abril de 1991) fue inoculado en 1L de medio de agua
corriente, en un matraz FernBach de 2,8 L. Se añadió ácido
ciclopropanocarboxílico (200 mL) después de 24 horas de incubación a
28ºC, con una agitación a 200 r.p.m. Después de tres (3) días
completos de incubación, se usó un matraz para inocular 8 L de un
medio ERY-P complementado (60 g/L de cerelosa, 30
g/L de harina Nutrisoy, 3 g/L de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 5 g/L de NaCl, 6 g/L de sólidos de
maíz empapado, 0,5 g/L de MgSO_{4} y 1 mL/L de P2000)en un
recipiente de fermentación de 14 L. El caldo fue inoculado a 28ºC,
con una velocidad de aeración de 8 L/min. y agitándose a 800 r.p.m.
y con un pH mantenido entre 6,9 y 7,3 con NaOH o H_{2}SO_{4}
(15%). Se añadió ácido ciclopropanocarboxílico (1,6 mL) después de
24 y 48 horas. La fermentación, que fue hecha en duplicado, fue
recogida después de 163 horas de tiempo de incubación total. Se
ajustó el pH de todo el caldo a pH 9 con hidróxido de sodio y el
caldo fue extraído con acetato de etilo (16 mL). El acetato de etilo
fue concentrado hasta conseguir un aceite, en una unidad de
rotoevaporación Buchi de 20 mL. El aceite fue disuelto, otra
vez, con 500 mL de cloruro de metileno. Se añadieron quinientos mL
de agua a este líquido y el pH de la fase acuosa fue ajustado a 9
con hidróxido de amonio al 10%. Después de agitar vigorosamente, se
recogió la capa de cloruro de metileno y se evaporó en un matraz de
rotoevaporación de 1L, para conseguir 11,0 g del residuo aceitoso.
Este material fue disuelto con 250 mL de una solución de metanol:
agua al 4:6, y se cargó en una columna de resina
CG-161 (Toso Haas) de 80 mL. Esta columna de
resina fue lavada con 350 mL de una solución de metanol: agua al
4:6. A continuación, la columna fue lavada brevemente a una
velocidad de 8 mL/min. con una solución de metanol: agua al 7:3,
hasta que las impurezas coloreadas empezaran a eluirse de la columna
(aproximadamente un lavado de 2 volúmenes del lecho). En este
momento se inició un procedimiento de gradiente de 1 L, con la
concentración de metanol cambiando de 70% a 100%, por un periodo de
1 hora a una velocidad de flujo de 8 mL/min. La fracción que
contenía el producto de interés fue evaporada hasta sequedad y
después purificada sobre una columna HPLC C18 Kromasil de 10
\mum de fase inversa (50 mm x 25 cm) usando una fase móvil de
acetonitrilo: tampón consistente en acetato de amonio 0,01 M, ácido
trifluoroacético al 0,02% y acetonitrilo al 26% a una relación de
(5:95) durante 50 minutos, a una velocidad de flujo de 120 mL/min.
Esto fue seguido por un gradiente lineal de (5:95) a (33:67) por los
siguientes 40 minutos. Las fracciones que contenían el producto de
interés, fueron combinadas (530 mL) ajustadas a pH 9 con hidróxido
de amonio al 10% y extraídas con cloruro de metileno (400 mL). La
capa de cloruro de metileno fue separada y evaporada a un estado
seco, para obtener
6-desoxi-13-ciclopropil-eritromicina
B pura (12 mg). La estructura del producto fue confirmada mediante
espectrometría de masas (MS).
Tiempo de retención de HPLC - Método B - 21,4
minutos.
Espectrometría de masa APCI (M + H)^{+}
observada a m/e 714, requerido para
C_{38}H_{69}NO_{12}S-714.
El NRRL 18643 de S. erythraea fue
inoculado a partir de un periodo de tres días en agar _{-}YPD
(extracto de levadura Difco al 0,5%, Peptona Difco Bacto al 0,5%,
dextrosa al 0,25%, MOPS al 0,5%, agar Difco Bacto al 1,7% y pH
ajustado a 7,0) en 250 mL de un caldo _{-}YPD (extracto de
levadura Difco al 0,5%, Peptona Difco Bacto al 0,5%, dextrosa al
0,25%, MOPS al 0,5% y pH ajustado a 7,0) en un matraz
Erlenmeyer de 250 mL. El matraz fue incubado a 225 r.p.m.,
29ºC, durante 48 horas. Se inocularon 2,5 mL en un medio
ERY-P (dextrosa al 5%, harina Nutrisoy a 3%,
(NH_{4})_{2}SO_{4}al 0,3%, NaCl al 0,5%, CaCO_{3} al
0,6% y el pH ajustado a 7,0) de 25 mL, e incubado a 225 r.p.m., 29ºC
por un total de 6 días. Se añadió ácido butírico al matraz a 24, 72
y 120 horas (400 ppm, 400 ppm, 200 ppm, respectivamente). El pH del
caldo completo fue ajustado, a continuación, a 9,1, usando NaOH 1N.
La muestra fue extraída dos veces con un volumen igual de acetato de
etilo. Las fases de acetato de etilo fueron concentradas hasta
sequedad bajo nitrógeno (baño de agua a 50ºC), y después suspendidas
de nuevo en 1,0 mL de metanol para el análisis de espectrometría de
masas HPLC. Esto confirmó la producción de la
6-desoxi-13-propil-eritromicina
B.
Tiempo de retención de HPLC - Método C - 23,5
minutos.
Espectrometría de masa-APCI (M +
H)^{+} observada a m/e 716, requerido para
C_{38}H_{70}NO_{11}S-716.
Se llevó a cabo un ensayo antibacteriano in
vitro en un microtítulo y se interpretó de acuerdo con
Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests
- Sexta Edición; Approved Standard, publicado por las guías de
The National Comitee for Clinical Laboratory Standards
(NCCLS). Se obtuvieron las concentraciones inhibitorias mínimas
(MICs) en contra de varias bacterias. Por ejemplo, Estafilococo
aureus B0CR5 (cepa susceptible al macrólido) produjo valores
encontrados en un rango de \leq 0,1 a 1,56 \mug/mL.
Claims (29)
1. Compuesto de fórmula 1:
\vskip1.000000\baselineskip
o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo, en
donde:
R_{1} es (i) un grupo alquilo, alquenilo,
alquinilo, alcoxialquilo o alquitioalquilo C_{3-}C_{8}
alfa-ramificado, cualquiera de los cuales pudiendo
estar opcionalmente sustituido por uno o más grupos hidroxilo; (ii)
un grupo cicloalquilalquilo C_{5}-C_{8} en donde
el grupo alquilo es un grupo alquilo C_{2}-C_{5}
alfa-ramificado; (iii) un grupo cicloalquilo
C_{3-}C_{8} o cicloalquenilo C_{5}-C_{8},
cualquiera de los cuales pudiendo estar opcionalmente sustituido
por uno o más hidroxilos, o uno o más grupos alquilo C_{1-}C_{4}
o átomos de halógeno; (iv) o un anillo heterocíclico de 3 a 6
miembros que contiene oxígeno o azufre, que pueda ser saturado, o
total o parcialmente insaturado y que puede estar opcionalmente
sustituido por uno o más grupos alquilo
C_{1}-C_{4} o átomos de halo; (v) fenilo el cual
puede estar sustituido opcionalmente, con al menos, un sustituyente
seleccionado de los grupos alquilo C_{1}-C_{4},
alcoxi C_{1}-C_{4} y alquiltio
C_{1}-C_{4}, átomos de halógeno, trifluorometilo
y ciano; (vi) un grupo con una fórmula (a) como se muestra
abajo:
en donde X es O, S o -CH_{2}-, a,
b, c y d son cada uno independientemente 0-2 y a + b
+ c + d \leq
5;
R_{2} es H u OH;
R_{3}-R_{5} son cada uno, independientemente, H,
CH_{3} o CH_{2}CH_{3}; R_{6} es H u OH; y R_{7} es H,
CH_{3}, o CH_{2}CH_{3}; R_{8} es H o desosamina; R_{9} es
H, CH_{3}, o CH_{2}CH_{3}; R_{10} es OH, micarosa (R_{13}
es H), o cladinosa (R_{13} es CH_{3}), R_{11} es H; o
R_{10}=R_{11}=O; y R_{12} es H, CH_{3}, o CH_{2}CH_{3};
o cualquiera de los compuestos definidos arriba, modificados
reemplazando uno o más de los grupos que constituyen las posiciones
del anillo 3, 5, 7, 9 y 11 con un grupo diferente seleccionado de
>C=O, >CHOH, =CH- y -CH_{2}-.
2. Compuesto de fórmula 1 de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde R_{1} es un grupo cicloalquilo o
cicloalquenilo C_{3}-C_{6}, el cual puede estar
sustituido opcionalmente por uno o más grupos hidroxilo o uno o más
grupos alquilo C_{1}-C_{4}.
3. Compuesto de acuerdo con la reivindicación 2,
en donde R_{1} es ciclopropilo.
4. Compuesto de acuerdo con la reivindicación 2,
en donde R_{1} es ciclobutilo.
5. Compuesto de acuerdo con la reivindicación 2,
en donde R_{1} es ciclopentilo.
6. Compuesto de acuerdo con la reivindicación 2,
en donde R_{1} es ciclohexilo.
7. Compuesto de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde R_{1} es un grupo alquilo, alquenilo, alquinilo,
alcoxialquilo o alquitioalquilo C_{3}-C_{8}
alfa-ramificado.
8. Compuesto de acuerdo con la reivindicación 7,
en donde R_{1} es isopropilo.
9. Compuesto de acuerdo con la reivindicación 7,
en donde R_{1} es sec-butilo.
10. Compuesto de acuerdo con la reivindicación 7,
en donde R_{1} es
2-buten-2-ilo,
2-penten-2-ilo, o
4-metil-2-penten-2-ilo.
11. Compuesto de acuerdo con la reivindicación 7,
en donde R_{1} es 1-metiltioetilo.
12. Compuesto de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde R_{1} es un anillo heterocíclico de 5 ó 6 miembros que
contiene oxígeno o azufre, que puede estar sustituido opcionalmente
por uno o más grupos hidroxilo o grupos alquilo
C_{1}-C_{4} o átomos de halógeno.
13. Compuesto de acuerdo con la reivindicación
12, en donde R_{1} es 3-tienilo.
14. Compuesto de acuerdo con la reivindicación
12, en donde R_{1} es 3-furanilo.
15. Compuesto de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde R_{1} es fenilo.
16. Compuesto de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde R_{1} es un grupo de fórmula (a) en donde a y b son 0, c
y d son 1 y X es -CH_{2}-.
17. Compuesto de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde R_{1} es un grupo de fórmula (a) en donde a y b son 0, c
es 1, d es 2 y X es -CH_{2}-.
18. Compuesto de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde R_{1} es un grupo de fórmula (a) en donde a y b son 0, c
y d son 1 y X es 0.
19. Procedimiento para preparar un compuesto de
fórmula 1 de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende fermentar
un organismo capaz de producir eritromicina caracterizado por
el hecho de contiene una sintasa híbrida de policétidos ("PKS")
en el que la molécula que se carga es el módulo de carga de la PKS
productora de avermectina de Streptomyces avermitilis, en
presencia de un ácido carboxílico de fórmula R_{1}CO_{2}H, en
donde R_{1} es como se ha definido en la reivindicación 1 o una
sal, éster o amida de la misma o un precursor oxidativo de la misma
y aislar el compuesto de fórmula 1.
20. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 19, en donde el organismo es Saccharopolyspora
erythraea, el cual puede contener opcionalmente un plásmido
integrado de manera efectiva, capaz de dirigir la biosíntesis de los
compuestos de la fórmula 1.
21. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 20 en donde dicho organismo contiene un plásmido que
contiene un promotor de pKS Tipo II/gen activador.
22. Procedimiento para preparar un compuesto de
fórmula 1 de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende fermentar
una Saccharopolyspora erythraea seleccionada de las cepas
NRRL 2338, 18643 y 21484 en presencia de un ácido carboxílico de
fórmula R_{1}CO_{2}H en donde R_{1} es según se define en la
reivindicación 1 o una sal, éster o amida del mismo o un precursor
oxidativo del mismo y aislar del compuesto de fórmula 1.
23. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 22 en donde dicho organismo contiene un plásmido
integrado de manera efectiva, capaz de dirigir la biosíntesis de los
compuestos de fórmula 1, conteniendo el plásmido el promotor actI y
a su gen activador cognitivo actII-orf4.
24. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 22, en donde el organismo incluye un plásmido
integrado de manera efectiva seleccionado de pAVLD, pIG1, pND30,
pCJR26, pCJR49, pC-AT12 y
pC-ATX.
25. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 22, en donde el organismo es EMRD1 de S.
erythraea, NRRL 2338/pIG1 de S. erythraea, NRRL
2338/pND30 de S. erythraea.
26. Composición farmacéutica que comprende una
cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de acuerdo con la
reivindicación 1, en combinación con un portador farmacéuticamente
aceptable.
27. Utilización de un compuesto de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1-18 en la
fabricación de una composición para utilizar en el tratamiento de
una infección bacteriana o una alteración relacionada con una
infección bacteriana o una infección protozoaria en un mamífero, pez
o pájaro.
28. Utilización de un compuesto de acuerdo con
la reivindicación 27 en donde el medicamento está destinado al
tratamiento de una infección bacteriana en un mamífero, pez o
ave.
29. Utilización de un compuesto de acuerdo con la
reivindicación 1 para la fabricación de una composición destinada a
mejorar un efecto de actuación seleccionado de aumento de peso o
utilización de eficiencia de la alimentación en un mamífero, pez o
ave, producción de leche, etc.) en un mamífero.
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