ES2337424T3 - Gen poliquetido sintasa i hibrido. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN GEN DE SINTETASA DE POLICETIDOS DE TIPO I, HIBRIDO, QUE CONTIENE TIPICAMENTE UN MODULO INICIADOR Y DIVERSOS MODULOS ALARGADORES. DICHO GEN SE EMPLEA PARA LA SINTESIS DE NUEVOS POLICETIDOS Y ESTA PREFERIBLEMENTE BAJO EL CONTROL DE UN PROMOTOR DE SINTETASA DE POLICETIDOS DE TIPO II, P.EJ. EL ACT I DE S. COELICOLOR.
Description
Gen de poliquétido sintasa I híbrido.
La presente invención se refiere a nuevos
poliquétidos y a métodos y medios para prepararlos mediante síntesis
recombinante. Se manipulan genes biosintéticos de poliquétido o sus
partes, que pueden derivarse de diferentes grupos de genes de
poliquétido biosintéticos, para permitir la producción de nuevos
poliquétidos híbridos específicos con estructura predeterminada. La
invención también se refiere a nuevos sistemas
huésped-vector que permiten aumentar los niveles de
producción tanto de poliquétidos naturales como artificiales, in
vivo e in vitro.
Los poliquétidos son una clase grande y
estructuralmente diversa de productos naturales que incluyen muchos
compuestos que poseen propiedades antibióticas u otras
farmacológicas, tales como eritromicina, tetraciclinas, rapamicina,
avermectina y FK506. En particular, los poliquétidos son producidos
en abundancia por Streptomyces y bacterias relacionadas de
actinomicetos. Se sintetizan mediante la condensación paso a paso
repetida de aciltioesteres de una manera análoga a la de la
biosíntesis de ácidos grasos. La mayor diversidad estructural
encontrada entre los poliquétidos naturales proviene de la selección
(por lo general) de acetato o propionato como unidades
"iniciadoras" o "extensibles"; y del grado de
diferenciación del procesamiento del grupo
D-\beta-ceto observado después de
cada condensación. Los ejemplos de etapas de procesamiento incluyen
la reducción a
D-\beta-hidroxiacil-, reducción
seguida de deshidratación a 2-enoil-, y la completa
reducción al aciltioester saturado. El resultado estereoquímico de
estas etapas de procesamiento también se especifica para cada ciclo
de extensión de cadena.
La biosíntesis de poliquétidos se inicia por un
grupo de enzimas formadoras de cadena conocidas como las poliquétido
sintasas. Se han descrito dos clases de poliquétido sintasas (PKS)
en actinomicetos. Una clase, llamada PKS Tipo I, representada por
las PKS para la eritromicina, avermectina y rapamicina de macrólidos
(Figura 1), consiste en un grupo diferente o "módulo" de
enzimas para cada ciclo de extensión de cadena poliquétida (Figura
2) (Cortes, J. et al. Nature (1990)
348:176-178; Donadio, S. et al.
Science (1991) 252:675-679; MacNeil,
D. J. et al. Gene (1992),
115:119-125; Schwecke, T. et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995)
92:7839-7843). Nota: el término "módulo
natural", según se usa en este documento, se refiere al grupo de
dominios contiguos, desde un gen de la
\beta-cetoacil-ACP sintasa
("KS") al siguiente gen de la proteína portadora de acilo
("ACP"), que lleva a cabo un ciclo de extensión de la cadena
poliquétida. La expresión "módulo combinatorio" se usa para
referirse a cualquier grupo de dominios contiguos (y partes de
dominio), que se extienden desde un primer punto en un primer
módulo natural, a un segundo punto equivalente en un segundo módulo
natural. Los primeros y segundos puntos estarán generalmente en
dominios principales que están presentes en todos los módulos, es
decir ambos en puntos equivalentes de dominios de la KS, AT (acilo
transferasa) o ACP respectiva. La longitud del poliquétido formado
se ha modificado, en el caso de la biosíntesis de eritromicina,
mediante relocalización específica usando ingeniería genética del
dominio enzimático de la PKS productora de eritromicina que
contiene la actividad de tioesterasa liberadora de cadena/ciclasa
(Cortes, J. et al. Science (1995)
268:1487-1489; Kao, C. M. et al. J.
Am. Chem. Soc. (1995) 117:9105-9106)
Se ha demostrado que la eliminación en marco del
ADN que codifica parte del dominio de cetoreductasa en el módulo 5
de la PKS productora de eritromicina, (también conocida como la
6-desoxieritronolida B sintasa, DEBS) conduce a la
formación de los análogos de eritromicina
5,6-didesoxi-3-\alpha-micarosil-5-oxoeritronolida
B,
5,6-didesoxi-5-oxoeritronolida
B y
5,6-didesoxi-6,6\beta-epoxi-5-oxoeritronolida
B (Donadio, S. et al. Science, (1991)
252:675-679). Igualmente, la modificación de
residuos de sitios activos en el dominio de enoilreductasa del
módulo 4 en DEBS, por ingeniería genética del correspondiente ADN
que codifica PKS y su introducción en Saccharopolyspora
erythraea, condujo a la producción de
6,7-anhidroeritromicina C (Donadio S. et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993)
90:7119-7123).
La solicitud de patente internacional Nº. WO
93/13663 describe otros tipos de manipulación genética de los genes
de DEBS que son capaces de producir poliquétidos modificados. Sin
embargo, se dice que muchas de tales tentativas han sido
improductivas (Hutchinson C. R. y Fujii, I. Annu. Rev.
Microbiol. (1995) 49:201-238, en p.
231), y no se ha publicado ningún otro ejemplo de poliquétidos
modificados. Se ha descrito la secuencia completa de ADN de los
genes de Streptomyces hygroscopicus que codifican la PKS Tipo
1 modular que gobierna la biosíntesis de la rapamicina poliquétida
inmunodepresora macrocíclica (Schwecke, T. et al. (1995)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
92:7839-7843) (Figura 3). La secuencia de ADN
está depositada en la Base de Datos del EMBL/Genbank con el número
de entrada X86780.
La segunda clase de PKS, llamada PKS Tipo II,
está representada por las sintasas para compuestos aromáticos. Las
PKS Tipo II contienen sólo un único grupo de actividades enzimáticas
para la extensión de cadena y éstos son reutilizados, cuando es
apropiado, en ciclos sucesivos (Bibb, M. J. et al. EMBO
J. (1989) 8:2727-2736; Sherman, D. H.
et al. EMBO J. (1989)
8:2717-2725;
Fernández-Moreno, M. A. et al. J. Biol.
Chem. (1992) 267:19278-19290). Las
unidades "extensibles" para las PKS Tipo II son, por lo
general, unidades de acetato, y la presencia de ciclasas
específicas dicta la ruta preferida para la ciclación de la cadena
completada en un producto aromático (Hutchinson, C. R. y Fujii, I.
Annu. Rev. Microbiol. (1995)
49:201-238). Se han obtenido poliquétidos
híbridas mediante la introducción de ADN que contiene el gen de PKS
Tipo II clonado en otra cepa que contiene un grupo de genes de PKS
Tipo II diferente, por ejemplo mediante la introducción del ADN
derivado del grupo de genes para actinorrodina, un poliquétido
pigmentado de azul de Streptomyces coelicolor, en una cepa
productora de poliquétido de antraquinona de Streptomyces
galileus (Bartel, P. L. et al. J. Bacteriol.
(1990) 172:4816-4826).
La solicitud de patente internacional Nº. WO
95/08548 describe el reemplazo de genes de PKS de actinorrodina por
ADN heterólogo de otros grupos de PKS Tipo II, para obtener
poliquétidos híbridos. La misma solicitud de patente internacional
WO 95/08548 describe la construcción de una cepa de Streptomyces
coelicolor que carece sustancialmente del grupo de genes
naturales para la actinorrodina, y el uso en aquella cepa de un
vector de plásmido pRM5 derivado del vector de plásmido de número de
copia bajo SCP2* aislado de Streptomyces coelicolor (Bibb,
M. J. y Hopwood, D. A. J. Gen. Microbiol. (1981)
126:427) y en el que el ADN heterólogo que contiene PKS
puede ser expresado bajo el control de la región divergente del
promotor act I/act III del grupo de genes de actinorrodina
(Fernández-Moreno, M. A. et al. J. Biol.
Chem. (1992) 267:19278-19290). El
plásmido pRM5 también contiene el ADN del grupo de genes
biosintético de actinorrodina que codifica el gen para una proteína
activadora específica, Act II-orf4. La proteína Act
II-orf4 es requerida para la transcripción de los
genes colocados bajo el control del promotor bidireccional de act
I/act III y activa la expresión durante la transición del
crecimiento a la fase estacionaria en el micelio vegetativo (Hallam,
S. E. et al. Gene (1988)
74:305-320).
Se sabe que los grupos de PKS tipo II en
Streptomyces se activan mediante genes activadores
específicos de ruta (Narva, K. E. y Feitelson, J. S. J.
Bacteriol. (1990) 172:326-333;
Stutzman-Engwall, K. J. et al. J.
Bacteriol (1992) 174:144-154;
Fernández-Moreno, M. et al. Cell
(1991) 66:769-780; Takano, E. et al.
Mol. Microbiol. (1992) 7:837-845;
Takano, E. et al. Mol. Microbiol. (1992)
6:2797-2804) cuyo producto génico es
requerido para la transcripción de promotores específicos. Se
especula que el producto génico de los genes activadores actúa
uniéndose a secuencias de ADN específicas en promotores del grupo de
genes de PKS en los que el gen activador está localizado
(Stutzman-Engwall, K. J. et al. J.
Bacteriol (1992) 174:144-154; Takano, E.
et al. Mol. Microbiol. (1992)
7:837-845). El producto génico de DnrI
complementa una mutación en el gen de ActII-orf4 de
S. coelicolor, los que implica que las proteínas de DnrI y
ActII-orf4 actúan sobre dianas similares. Se ha
descrito un gen (srmR) (documento EP 0 524 832 A2) que está
localizado cerca del grupo de genes de PKS Tipo I para el
poliquétido de macrólido espiramicina, este gen activa expresamente
la producción de la poliquétido de macrólido espiramicina, pero no
se ha encontrado ningún otro ejemplo de tal gen. Tampoco se ha
descrito ningún homólogo de la familia
ActII-orf4/DnrI/RedD de activadores que actúe en
los genes de PKS Tipo I.
Aunque se hayan identificado muchos poliquétidos
terapéuticamente importantes, queda la necesidad de obtener nuevos
poliquétidos que tengan mejores propiedades o posean una
bioactividad completamente nueva. Los poliquétidos complejos
producidos por las PKS Tipo I modulares son particularmente valiosos
porque incluyen compuestos de utilidad conocida como agentes
antihelmínticos, insecticidas, inmunodepresores, antifungosos o
antibacterianos. A causa de su complejidad estructural, no se
obtienen fácilmente dichos nuevos poliquétidos por síntesis química
total, o por modificaciones químicas de los poliquétidos
conocidos.
Queda la necesidad de desarrollar modos fiables
y específicos para ampliar los módulos individuales en la práctica,
de modo que todos los genes de PKS híbrida que se construyan, o una
fracción grande de éstos, sean viables y produzcan el producto
poliquétido deseado. Esto es particularmente cierto si se desea
crear un gran número de grupos de genes de PKS individuales usando
los genes de PKS Tipo I modulares de forma manera combinatoria, en
la que no será factible analizar a todos los miembros del grupo.
Tales bibliotecas de poliquétidos ofrecen una alternativa muy
atractiva respecto a la selección aleatoria de muestras de suelo
para el descubrimiento de nuevos poliquétidos con valiosas
propiedades bioactivas.
Del mismo modo, aunque se hayan descrito
combinaciones de huésped-vector específicas que
permiten la expresión controlada de genes heterólogos en ciertas
Streptomyces como, por ejemplo, usando inducción por
tioestreptona añadida como se describe para Streptomyces
lividans 66 y Streptomyces coelicolor (Takano, E. et
al. Gene (1995) 166:133-137) y
utilizando señales alimenticias en el inicio de la diferenciación,
como para Streptomyces coelicolor en la solicitud de patente
internacional Nº. WO 95/08548, queda una importante necesidad de
desarrollar métodos generales para controlar y hasta realzar la
expresión de un gen estructural, o de un grupo de genes
estructurales, que gobierne la biosíntesis de un metabolito
secundario potencialmente valioso, tal como uno de los poliquétidos
complejos, en una cepa modificada de Streptomyces o de una
bacteria filamentosa relacionada.
Un aspecto de la invención proviene de que los
inventores han apreciado que un ensamblaje de genes de PKS
(particularmente del tipo I) codifica un módulo de carga que es
seguido de módulos de extensión. Así, la Figura 2 muestra la
organización de los genes de DEBS. El primer marco de lectura
abierto codifica la primera multienzima o casete (DEBS1) que
consiste en tres módulos: el módulo de carga (ery-carga) y
dos módulos de extensión (módulos 1 y 2). El módulo de carga
comprende una acilo-transferasa y una proteína
portadora de acilo. Esto puede ser contrastado con la Figura 1 del
documento WO93/13663 (mencionado anteriormente). Este muestra que el
ORF1 consiste en sólo dos módulos, el primero de los cuales es, de
hecho, tanto el módulo de carga como el primer módulo de
extensión.
En consecuencia, la presente invención
proporciona, en un primer aspecto, un gen de poliquétido sintasa
("PKS") híbrido que comprende: una primera parte de ácido
nucleico o partes que codifican un módulo de carga, y opcionalmente
también la cetosintasa (KS) en el principio del primer módulo de
extensión siguiente, de una primera PKS tipo I; y una segunda parte
de ácido nucleico o partes que codifican al menos un dominio de un
módulo de extensión de PKS tipo I de una segunda PKS tipo I, en la
que el módulo de carga, y opcionalmente también la cetosintasa (KS)
en el principio del primer módulo de extensión siguiente, es de una
PKS tipo I diferente a todos los módulos de extensión del gen de
PKS híbrida.
\newpage
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un gen de PKS híbrida que comprende una primera parte de
ácido nucleico o partes de una primera PKS tipo I, y una segunda
parte de ácido nucleico o partes de una segunda PKS tipo I que es
diferente de dicha primera PKS en la que dicha primera parte de
ácido nucleico o partes codifican un módulo de carga de dicha
primera PKS tipo I y opcionalmente el dominio de cetosintasa del
primer módulo de extensión de dicha primera PKS tipo I, dicha
segunda parte de ácido nucleico o partes codifican al menos un
dominio de un módulo de extensión de PKS tipo I de dicha segunda PKS
tipo I; y en la que el sitio de corte y empalme entre la primera
parte de ácido nucleico y la segunda parte de ácido nucleico está
localizado en la región enlazante entre el módulo de carga y el
dominio de KS del primer módulo de extensión de la segunda PKS tipo
I, en el principio del dominio de KS del primer módulo de extensión
de la segunda PKS tipo I, en la región final del dominio de KS del
primer módulo de extensión de la primera PKS tipo I o en la región
enlazante entre el dominio de KS del primer módulo de extensión de
la primera PKS tipo I y el dominio AT del primer módulo de
extensión de la segunda PKS tipo I.
En una realización, el módulo de carga puede
comprender una aciltransferasa y una proteína portadora de
acilo.
En una realización, la primera parte de ácido
nucleico o partes codifican el módulo de carga sólo.
En una realización, en la primera PKS tipo I, el
módulo de carga es seguido de un módulo de extensión que comienza
con un dominio de cetosintasa ("KS"); y la primera parte de
ácido nucleico codifica el módulo de carga junto con sólo el
dominio de cetosintasa ("KS") del módulo de extensión de la
primera PKS.
En una realización, el módulo de carga es capaz
de cargar un sustrato para producir una unidad iniciadora diferente
de una unidad iniciadora de un poliquétido como se produce por la
segunda PKS tipo I.
En una realización, el módulo de carga es capaz
de cargar cualquiera de una multiplicidad de unidades iniciadoras
diferentes.
En una realización, el módulo de carga es un
módulo de carga de avr.
En una realización, el módulo de carga es un
módulo de carga de rap.
En una realización, el módulo de carga es un
módulo de carga productor de FK506.
En una realización, al menos una de las partes
de ácido nucleico codifica un módulo combinatorio, a saber una
parte de ácido nucleico que se extiende en la primera o segunda PKS
tipo I entre dominios correspondientes de dos módulos
naturales.
En una realización, el gen de PKS híbrida
incluye ácido nucleico que codifica una enzima terminadora de cadena
distinta a la tioesterasa.
En una realización, el ácido nucleico que
codifica el gen de PKS híbrida está operativamente unido a un
promotor de PKS tipo II.
En una realización, el ácido nucleico que
codifica el gen de PKS híbrida operativamente unido a un promotor
de PKS tipo II está acompañado por su gen activador natural.
En una realización, el promotor de PKS tipo II,
promotor operativamente unido al ácido nucleico que codifica el gen
de PKS híbrida, es act I de S. coelicolor.
En una realización, el act I del promotor r de
S. coelicolor está acompañado por el activador de
actII-ort4 de S. coelicolor.
En una realización, se proporciona una
poliquétido sintasa híbrida como se codifica por el ácido nucleico
que codifica el gen de PKS híbrida expuesto antes.
En una realización, se proporciona un vector que
incluye el ácido nucleico que codifica el gen de PKS híbrida
expuesto antes.
En una realización, se proporciona una bacteria
filamentosa transformada que contiene el ácido nucleico que
codifica el gen de PKS híbrida expuesto antes y capaz de expresar
una poliquétido sintasa codificada por éste.
En una realización, se proporciona un método
para producir una bacteria filamentosa transformada como se define
anteriormente en el que el método comprende la etapa de introducir
un plásmido que contiene el ADN "donante" en una célula
huésped en condiciones tal que hay recombinación homóloga con el ADN
de PKS cromosómico heterólogo.
En una realización, se proporciona un método
para preparar un poliquétido cultivando la bacteria filamentosa
como se define anteriormente.
Se describe en este documento la producción de
un ensamblaje de genes de PKS híbrido que comprende un módulo de
carga y al menos un, y preferiblemente varios, módulos de extensión
ensamblando juntos una primera parte de ácido nucleico o partes que
codifican al menos un dominio de una primera PKS tipo I con una
segunda parte de ácido nucleico o partes que codifican al menos un
dominio de PKS tipo I que es heterólogo a dicha primera PKS.
Generalmente, los ácidos nucleicos son ADN. Las primeras y segundas
partes pueden codificar cada una el(los) dominio(s)
de las diferentes PKS respectivas.
Preferiblemente, la PKS híbrida codifica un
módulo de carga y de 1 a 6 módulos de extensión dentro de cualquier
casete dado. Más preferiblemente, hay al menos 2 módulos de
extensión. NB: los productos que resultan de muchos más de 6
módulos pueden originarse de ensamblajes de sintasas (c.f.
rapamicina).
La primera parte puede codificar un módulo de
carga, mientras que la segunda parte codifica uno o varios módulos
de extensión. O bien, la(s) primera(s) parte(s)
puede(n) codificar todo o parte de un módulo de carga, los
dos primeros módulos de extensión, y una enzima terminadora de
cadena (generalmente una tioesterasa), p.ej de PKS de eritromicina,
y la(s) segunda(s) parte(s)
corresponde(n) a uno o varios dominios y/o módulos de una
PKS diferente.
Es particularmente útil proporcionar un
ensamblaje de genes de PKS híbrido en el que el módulo de carga sea
heterólogo respecto a los módulos de extensión y sea tal que
conduzca a un poliquétido con una unidad iniciadora modificada.
Nota: Este es un concepto completamente desconocido en la técnica
anterior ya que éste no reconoce la existencia de módulos de carga.
El documento W093/13663 se refiere a la modificación de genes de PKS
desactivando una función sola (es decir, una enzima sola) o
afectando a "un módulo entero" por deleción, introducción o
reemplazo de éste. Pero en sus términos, el ensamblaje de carga no
es un módulo. Si el módulo de carga es el que acepta muchas
unidades diferentes de ácido carboxílico entonces el ensamblaje de
genes híbrido puede usarse para producir muchos poliquétidos
diferentes. Por ejemplo, un ensamblaje de genes híbrido puede
emplear el ácido nucleico que codifica un módulo de carga de
avr con módulos extensores de ery. Un módulo de carga
puede aceptar unidades de ácido no naturales. O bien, o además, se
puede cambiar el extremo de un ensamblaje de genes.
Por lo tanto, la enzima terminadora de cadena
normal de una PKS (por lo general la tioesterasa) puede ser
sustituida por una enzima que conduzca a un tipo diferente de
producto. Consecuentemente, puede hacerse uso de la enzima del
sistema de rapamicina que conecta la cadena poliquétida a una cadena
de aminoácidos. Esto puede usarse para sintetizar combinaciones de
polipéptido/poliquétido, p.ej para producir derivados de
D-\beta-lactama.
Por supuesto, se pueden hacer modificaciones
dentro de un producto poliquétido, particularmente sustituyendo un
módulo de extensión por uno que dé una unidad de quetida en un
estado de oxidación diferente y/o con una estereoquímica diferente.
Nota: se asumía de forma general que la estereoquímica de los grupos
metilo en la cadena poliquétida estaba determinada por la
aciltransferasa. Pero esto es, de hecho, un rasgo de otros dominios
de la PKS, y por eso se abre a la variación sólo por el reemplazo de
aquellos dominios, individualmente o por el reemplazo de un módulo.
Pueden añadirse o eliminarse el metilo y otros sustituyentes
mediante reemplazo del dominio de aciltransferasa o reemplazo del
módulo total.
Este aspecto de la invención se ocupa, en gran
parte, del tratamiento de módulos de gen de PKS como componentes
básicos que pueden usarse para construir sistemas enzimáticos, y por
consiguiente productos poliquétidos, de los tipos deseados. Esto
generalmente implica el recorte y el ensamblaje de agrupaciones
multimodulares y modulares. Podría asumirse que los sitios
correctos para hacer y romper uniones intermodulares estarían en
las regiones de unión entre módulos, donde con experimentos
anteriormente publicados por los inventores usando proteolisis
limitada se ha demostrado que dichos enlazantes están en la
superficie de la proteína (Aparicio, J. F. et al. (1994)
J. Biol. Chem. 269:8524-8528;
Staunton, J. et al. (1996) Nature Structural Biol.
3:188-192). Sin embargo, los inventores han
encontrado que puede ser preferible hacer cortes y uniones
realmente dentro de los dominios (es decir, en las partes que
codifican enzimas), cerca de sus bordes. El ADN está muy conservado
allí entre todas las PKS modulares, y esto puede ayudar a la
construcción de híbridos que pueden ser transcritos. Esto también
ayuda al mantenimiento del espaciado de los sitios activos de las
enzimas codificadas, lo que puede ser importante. Por ejemplo, en la
producción de un gen híbrido sustituyendo el módulo de carga
ery por un módulo de carga avr, se elimina el módulo
de ery junto con una pequeña cantidad del dominio de
cetosintasa siguiente (KS). El principio del dominio de KS (bien
espaciado del sitio activo) está muy conservado y por lo tanto
proporciona un sitio de corte y empalme alternativo al sitio obvio
en la región enlazante entre el módulo de carga y dominio de KS. El
módulo de ery escindido fue sustituido entonces por un
módulo de carga de avr.
De hecho, cuando se sustituye un módulo de
carga, puede ser deseable sustituir no sólo los dominios del módulo
de carga (generalmente, la acil-transferasa (AT) y
la proteína portadora de acilo (ACP)) sino también la KS en el
principio del módulo de extensión siguiente. Típicamente, el módulo
de carga escindido habría proporcionado un iniciador de propionato,
y se requiere el reemplazo para proporcionar uno o varios
iniciadores diferentes. Pero el propionato puede alimentarse en la
KS del módulo de extensión a partir de una reserva de propionato en
la célula huésped, conduciendo a la dilución de los productos
deseados. Esto puede ser, en gran parte, prevenido sustituyendo un
módulo de carga ampliado que incluya todos o la mayor parte del
dominio de KS. (El sitio de empalme puede estar en la región del
extremo del gen de KS, o adelantado en el siguiente gen AT, o en la
región enlazante entre los dominios de KS y AT.) Cuando se
sustituyen los "módulos", los inventores no se restringen a la
cuestión de los módulos "naturales". Por ejemplo un "módulo
combinatorio" que se escinde y/o se sustituye y/o se inserta
puede extenderse desde el dominio correspondiente de dos módulos de
tipo natural, p.ej desde el AT de un módulo al AT del siguiente, o
desde KS a KS. Los sitios de empalme estarán en regiones marginales
conservadas correspondientes, o en regiones enlazantes entre
dominios cerca de sitios conocidos para la proteolisis limitada. Un
módulo combinatorio también puede ser un múltiplo "doble" o más
grande, para añadir 2 o más módulos a la vez. También se describen
en este documento ensamblajes de genes como se detallan
anteriormente, vectores que contienen tales ensamblajes de genes y
organismos transformantes que pueden expresarlos. Los organismos
transformantes pueden albergar plásmidos recombinantes, o los
plásmidos pueden integrarse. Un plásmido con una secuencia int se
integrará en un sitio de unión específico (att) de un
cromosoma de un huésped. Los organismos transformantes pueden ser
capaces de modificar los productos iniciales, p.ej realizando todas
o algunas de las modificaciones biosintéticas normales en la
producción de eritromicinas (como se muestra en la Figura 2B) y/o
otros poliquétidos. Puede hacerse uso de organismos mutantes tal que
algunas de las rutas normales sean bloqueados, p.ej para producir
productos sin ninguno o algunos grupos hidroxilo "naturales" o
grupos de azúcar. La invención proporciona además nuevos
poliquétidos producibles, directamente o indirectamente, por
organismos transformantes. (Esto incluye poliquétidos que se han
sometido a una modificación enzimática en los organismos y/o que se
han aislado y sometido a modificación química.)
En otro aspecto, la invención proporciona un
ensamblaje de genes híbrido que comprende componentes génicos
estructurales operativamente unidos a un promotor que no está
naturalmente unido a éste y es de una PKS tipo II, preferiblemente
unidos a su gen activador cognado específico. Es particularmente
preferido el uso del promotor act I y el gen activador de
Act II-orf4 de S. coelicolor, para la
expresión en huéspedes distintos de S. coelicolor (por lo
general otros actinomicetos, particularmente otros estreptomicetos).
Los componentes de genes estructurales pueden ser de un sistema de
genes de PKS tipo I.
La invención, en este otro aspecto, proporciona
vectores que contienen tales ensamblajes de genes, y organismos
transformantes que pueden expresarlos. Es posible combinar los dos
aspectos de la invención, de modo que sea expresado un gen tipo I
híbrido bajo el control de un promotor tipo II.
Se describen en este documento nuevos
poliquétidos asequibles por medio de los aspectos anteriores. Éstas
incluyen las siguientes.
- (i)
- Un análogo de eritromicina (que es un compuesto macrólido con un anillo de 14 miembros) en el que el C-13 lleva una cadena secundaria distinta de etilo, generalmente un grupo alquilo C_{2}-C_{5} O-ramificado, un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{8} o cicloalquenilo (opcionalmente sustituido, p.ej, con uno o varios hidroxi, grupos alquilo C_{1-4} o alcoxi o átomos de halógeno), o un heterociclo de 3-6 miembros que contiene O o S, saturado o totalmente o parcialmente insaturado, opcionalmente sustituido (en cuanto al cicloalquilo). Los candidatos preferidos para el sustituyente de C-13 R son los grupos de unidades de carboxilato R. CO.O-utilizables como sustratos por un módulo iniciador de avr, o variantes de iniciador de rapamicina. Los sustratos preferidos incluyen isobutirato (R=i-Pr) y 2-metilbutirato (R=1-metilpropilo). Otras posibilidades incluyen n-butirato, carboxilato de ciclohexilo, carboxilato de cicloheptanilo, carboxilatos de ciclohexenilo, carboxilatos de cicloheptenilo y variantes metiladas de anillo de los carboxilatos cíclicos. El análogo de eritromicina puede corresponder al producto inicial de una PKS (6-desoxieritronolida) o el producto después de una o varias de las etapas biosintéticas normales. Como se muestra en la Figura 2B, éstos comprenden: 6-hidroxilación; 3-0-glicosilación; 5-0-glicosilación; 12-hidroxilación; y metilación de azúcar específica.
- \quad
- Por lo tanto, los análogos incluyen los correspondientes a 6-desoxieritronolida B, eritromicina A, y los diversos intermedios y alternativas mostradas en la Figura 2B.
- \quad
- Además o de forma alternativa, puede haber modificación química. Por ejemplo, pueden oxidarse uno o varios grupos hidroxi (p.ej para producir derivados 3-ceto) o eliminarse (p.ej para producir derivados de 10-eno). Algunos ejemplos de modificaciones químicas aplicables a los poliquétidos producidos de acuerdo con la presente invención son aquellos que dan lugar a azitromicina, roxitromicina, claritromicina y aquellos descritos en algunas patentes francesas de Roussel Uclaf: 2697523, 2697524 y 2702480.
- (ii)
- análogos de eritromicina que se diferencian del compuesto "natural" correspondiente (Figura 2a) en el estado de oxidación de una o varias de las unidades de quetida (es decir, selección de alternativas del grupo: -CO-, -CH(OH)-, =CH-, y -CH_{2}-). La estereoquímica de cualquier -CH(OH)- es también independientemente seleccionable.
- (iii)
- análogos de eritromicina que se diferencian del compuesto "natural" correspondiente por la ausencia de una cadena secundaria de metilo "natural". (Este es alcanzable por el uso de una variante AT). Los módulos de extensión normales usan unidades C_{2} o C_{3} para proporcionar unidades de quetida no metiladas y metiladas. Se pueden proporcionar unidades no metiladas donde las unidades metiladas son naturales (y viceversa, en sistemas en los que hay unidades naturalmente no metiladas) y también se pueden proporcionar unidades más grandes, p.ej. C_{4} para proporcionar sustituyentes de etilo.
- (iv)
- análogos de eritromicina que se diferencian del compuesto "natural" correspondiente en la estereoquímica del metilo "natural"; y/o sustituyentes de anillo distintos de metilo.
- (v)
- análogos de eritromicina que tienen las características de dos o más de las secciones (i) a (iv);
- (vi)
- análogos de triquetida lactona ("TKL"):
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- \quad
- R_{3} es la cadena secundaria derivada de la unidad iniciadora, y se somete a la variación descrita para la cadena secundaria C-13 descrita anteriormente en (i).
- \quad
- R_{1} y R_{2} son "naturalmente" metilo, pero tanto uno como ambos pueden ser sustituidos por hidrógeno o etilo (usando unidades extensibles que emplean butirato).
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La estereoquímica natural es:
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pero alguno o dos o todos de
R_{1}, R_{2} R_{3} y OH pueden tener la estereoquímica
opuesta. Generalmente, los análogos de TKL pueden tener variaciones
como se describe para eritromicinas en los (i) a (v)
anteriores.
(vi) poliquétidos de otros tipos de
eritromicina, p.ej rapamicina o avermectina, que tienen
modificaciones correspondientes a las descritas en las secciones de
(i) a (v). Por ejemplo, los inventores han producido variantes de
rapamicina usándolas como ácidos iniciadores añadidos:
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viii) versiones truncadas o
ampliadas de cadenas
poliquétidas:
- a)
- diquetidas R^{1}-CHOH-CHR^{2}-CO_{2}H
- b)
- triquetidas R^{1}-CHOH-CHR^{2}-CHOH-CHR^{3}-CO_{2}H
- c)
- tetraquetidas R^{1}-CHOH-CHR^{2}-CHOH-CHR^{3}-CHOH-CHR^{4}-CO_{2}H
- d)
- penta-, hexa-, hepta-cadenas de quetida y más grandes.
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Las cadenas pueden tener variantes como se
describe en de (i) a (iv).
ix) fusiones de quetida/no quetida.
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La rapamicina es un ejemplo natural de una
fusión de poliquétido/péptido. Pueden emplearse medios tales como
una enzima que incorpora péptidos para crear poliquétidos fusionados
a uno o varios aminoácidos.
x) Poliquétidos (o fusiones) ciclados por
formación de lactonas, hemicetales, cetales, lactamas o
lactoles.
xi) derivados de cualquiera de los anteriores
que se han sometido a un procesamiento adicional por enzimas que no
son PKS, por ej. una o varias de hidroxilación, epoxidación,
glicosilación y metilación.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona un método para
obtener nuevos poliquétidos complejos; y nuevos métodos para
aumentar la producción tanto de poliquétidos nuevos como de los
conocidos.
Por consiguiente, en un tipo de realización de
la invención, se han usado uno o varios segmentos de ADN que
codifican módulos individuales o dominios dentro de una PKS Tipo I
natural (la PKS "donante") para sustituir el ADN que codifica,
respectivamente, módulos individuales o dominios de otra PKS Tipo I
natural (la PKS "aceptadora"). El número total de módulos de
extensión reunidos en la PKS híbrida no es fijo, pero el número
preferido de tales módulos en cualquier multienzima o casete varía
entre uno, creando la PKS funcional lo más pequeña posible, y seis,
que iguala el número más grande de módulos consecutivos encontrados
hasta ahora que se alojan en una sola multienzima de una PKS Tipo I
natural, denominada la PKS de rap de Streptomyces
hygroscopicus. Con el fin de definir qué genes de PKS híbrida
serán viables y productivos, el ADN de la PKS aceptadora consiste
en, o está comprendido por, el módulo de carga, primeros dos módulos
de extensión y tioesterasa terminadora de cadena de la PKS de ery,
u otra PKS, preferiblemente natural, tipo I, alojada en un vector de
plásmido adecuado. Se sustituyen expresamente uno o varios dominios
individuales, o uno o varios módulos individuales, por el ADN que
codifica dominios análogos o módulos y se derivan de una PKS Tipo I
natural diferente (la PKS "donante").
La secuencia de ADN modificada se introduce en
un microorganismo adecuado y el microorganismo genéticamente
modificado se cultiva en condiciones adecuadas para la producción
del poliquétido.
Sorprendentemente y de improviso, cuando se
cultivan estos microorganismos genéticamente modificados en
condiciones adecuadas se encuentra que producen análogos
artificiales del(de los) producto(s)
poliquétido(s) de la PKS aceptadora natural, y cuando es
apropiado se encuentra que los productos sufren el mismo proceso que
el poliquétido natural.
En este aspecto de la invención, el vector del
plásmido puede ser cualquiera escogido de una larga lista de
vectores de plásmido conocidos por ser útiles para clonar en
Streptomyces y bacterias Gram positivo relacionadas. Se ha
encontrado que es particularmente útil seleccionar un vector de
plásmido de número de copia bajo con un amplio rango de huéspedes
según el plásmido SCP2* de Streptomyces coelicolor M110. Se
describe en este documento la construcción de dos plásmidos
derivados de SCP2* particularmente adecuados para este fin. Un
plásmido precursor en la construcción de uno de estos dos plásmidos,
que carezca de un origen de replicación de estreptomiceto pero que,
por otra parte, tenga las mismas características, es también
particularmente adecuado. Es conocido en la técnica que la
integración por recombinación homóloga puede ser conseguida usando
los llamados vectores suicidas, que sólo tienen un origen de
replicación activo en Escherichia coli, en actinomicetos
("Stimulation of erythromycin yield by integration of a
chromosomal DNA fragment including the eryCI gene into the
chromosome of S. erythraea", Hanel, F. et al.
Biotechnology Letters (1993)
15:105-110; "Insertion of plasmids into
the chromosome of Streptomyces griseofuscus", Larson, J. L. and
Hershberger, C. L. Plasmid (1990)
23:252-256; véase también: "Denaturation of
circular or linear DNA facilitates integrative transformation of
Streptomyces coelicolor A3(2): possible relevance to other
organisms", Oh, S. H. y Chater, K. F. (1997) J. Bacteriol
179:122-127). Los triquetida lactona sintasa
de la PKS "aceptadora" puede estar formada por módulos de
carga, módulos de extensión y actividades terminadoras de cadena
presentadas por cualquier PKS Tipo I natural o artificial, pero son
particularmente adecuados para este fin los componentes de las PKS
tipo I para la biosíntesis de eritromicina, rapamicina, avermectina,
tetronasina, oleandomicina, monensina, anfotericina y rifamicina,
para todos los cuales la organización de genes y modular es conocida
por el análisis de secuencia de genes, al menos en parte. Los
ejemplos particularmente favorables de los módulos de carga de la
PKS donante son aquellos módulos de carga que muestran una
especificidad relajada, por ejemplo el módulo de carga de la PKS
productora de avermectina (avr) de Streptomyces avermitilis;
o aquellos módulos de carga que poseen una especificidad extraña,
por ejemplo los módulos de carga de las PKS que producen rapamicina,
FK506 y ascomicina, todos los cuales aceptan naturalmente una
unidad iniciadora derivada de shikimate.
Las células genéticamente modificadas adecuadas
para la expresión de los genes de PKS Tipo I híbrida pueden ser
obtenidas a partir de algunos actinomicetos capaces de mantener el
vector en una forma autónoma o integrada. Los huéspedes
particularmente eficaces son Saccharopolyspora erythraea,
Streptomyces coelicolor, Streptomyces avermitilis,
Streptomyces griseofuscus, Streptomyces cinnamonensis,
Micromonospora griseorubida, Streptomyces
hygroscopicus, Streptomyces fradiae, Streptomyces
longisporoflavus, Streptomyces lasaliensis,
Streptomyces tsukubaensis, Streptomyces griseus,
Streptomyces venezuelae, Streptomyces antibioticus,
Streptomyces lividans, Streptomyces rimosus y
Streptomyces albus. Éstos incluyen a huéspedes en los cuales
se sabe que los vectores del plásmido derivados de SCP2* se clonan
autónomamente, como, por ejemplo, S. coelicolor, S.
avermitilis y S. griseofuscus; y otros huéspedes tales
como Saccharopolyspora erythraea en los que los plásmidos
derivados de SCP2* se vuelven integrados en el cromosoma por
recombinación homóloga entre secuencias en el inserto del plásmido y
sobre el cromosoma; y todos los huéspedes que están integrantemente
transformados por vectores de plásmido suicidas.
En un aspecto más de la presente invención, se
introduce un plásmido que contiene el ADN de PKS "donante" en
una célula huésped bajo condiciones en las que el plásmido se vuelve
integrado en genes de la PKS aceptadora en el cromosoma bacteriano
por recombinación homóloga, para crear una PKS híbrida. Una
realización preferida es cuando el ADN de la PKS donante incluye un
segmento que codifica un módulo de carga, de tal modo que este
módulo de carga se vuelve unido a los genes de la PKS aceptadora en
el cromosoma. Dicha PKS híbrida produce productos poliquétidos
híbridos valiosos y nuevos cuando se cultivan bajo las condiciones
adecuadas como se describe en este documento. Expresamente, cuando
el módulo de carga de la PKS aceptadora es sustituido por el módulo
de carga de la PKS productora de avermectina (avr), los productos
poliquétidos híbridos contienen una unidad iniciadora típica de las
usadas por la PKS de avr. Así, cuando el módulo de carga de la PKS
de ery es sustituido por el módulo de carga de avr, se encuentra
que las cepas de Saccharopolyspora erythraea que contienen
tal PKS híbrida producen macrólidos de 14 miembros que contienen
unidades iniciadoras típicamente usadas por la PKS de avr.
Es muy sorprendente e inesperado que se haya
encontrado que los poliquétidos de macrólido de 14 miembros
producidos por tales células recombinantes de S. erythraea
incluyan derivados de eritromicina A, mostrando que se realizan
correctamente las diversas etapas de proceso requeridas para la
transformación de los productos de la PKS híbrida en nuevos, y
terapéuticamente valiosos, derivados de eritromicina.
Un aspecto más de la presente invención es el
descubrimiento inesperado y sorprendente de que la transcripción de
cualquiera de los genes de PKS Tipo I híbrida, cuya construcción es
descrita en este documento, puede ser expresamente aumentada cuando
los genes híbridos son colocados bajo el control de un promotor para
un gen de PKS Tipo II unido a un gen activador específico para
aquel promotor. Es particularmente notable que cuando se cultiva
una célula genéticamente modificada que contiene los genes tipo I
híbridos bajo tal control en las condiciones adecuadas para la
producción de poliquétidos, se producen niveles sustancialmente
mayores del poliquétido híbrido. Tales aumentos específicos del
rendimiento de un producto poliquétido valioso también se observan
para los poliquétidos naturales producidos por una PKS Tipo I
colocada bajo el control de un promotor de PKS Tipo II y el gen
activador. En una realización preferida, se colocan genes de PKS
tipo I presentes en un plásmido derivado de SCP2* o un plásmido
precursor que carece sólo del origen de replicación de
estreptomiceto, bajo el control del promotor de actI derivado del
grupo de genes biosintético de actinorrodina de Streptomyces
coelicolor, y en el que el vector también contiene el gen
estructural que codifica la proteína activadora específica Act
II-orf 4. El plásmido recombinante se introduce en
huéspedes bacterianos distintos de la Streptomyces
coelicolor elegida de los géneros Streptomyces y
relacionados, bajo condiciones en las cuales los genes de PKS
introducidos, o genes de PKS ya presentes en la cepa huésped, son
expresados bajo el control del promotor de actI.
Las cepas recombinantes producen el producto
poliquétido específico deseado y el gen activador requiere sólo la
presencia del promotor específico a fin de realzar la eficacia
transcripcional del promotor. Esto es particularmente sorprendente
porque los activadores de la familia ActII-orf4 no
pertenecen a una clase reconocida de proteínas de unión de ADN. Por
lo tanto, sería esperable que otras proteínas u otros elementos de
control fueran requeridos para que la activación ocurriera en un
huésped heterólogo no conocido para producir actinorrodina o un
pigmento de isocromanoquinona relacionado. Es también sorprendente
y útil que las cepas recombinantes producen hasta 10 veces de
producto poliquétido más específico que cuando los mismos genes de
PKS están bajo el control del promotor natural, y el producto
poliquétido específico también se produce precozmente en el cultivo
creciente, en vez de sólo durante la transición del crecimiento a
la fase inmóvil. Tales poliquétidos son útiles como antibióticos,
agentes anticáncer, inmunodepresores y para muchos otros fines en
medicina humana y veterinaria.
Cuando la célula genéticamente modificada es
Saccharopolyspora erythraea, el activador y el promotor se
derivan del grupo de genes de PKS de actinorrodina y el grupo de
genes de PKS de ery regulado por actI/actII-orf4 se
aloja en el cromosoma, después de la integración específica del
sitio de un vector del plásmido, el cultivo de estas células en
condiciones adecuadas produce hasta diez veces más producto
macrólido de 14 miembros total que en una cepa comparable que no
está bajo tal control heterólogo. Cuando en dicha célula
genéticamente modificada de S. erythraea, los genes de PKS
bajo este control heterólogo son genes de PKS Tipo I híbrida cuya
construcción es la descrita en este documento, entonces se obtienen
de nuevo hasta diez veces más producto poliquétido híbrido
comparado con los mismos genes de PKS Tipo I híbrida, no bajo dicho
control. Expresamente, cuando los genes de PKS Tipo I híbrida son
los genes de PKS de ery en los cuales el módulo de carga está
sustituido por el módulo de carga de avr, se encuentra un aumento
de diez veces en las cantidades totales de nuevos macrólidos de 14
miembros producidos por las células genéticamente modificadas cuando
se cultivan bajo las condiciones adecuadas como se describe en este
documento. Se ha descrito la capacidad de que una poliquétido
sintasa modular funcione en un sistema sin células, para el sistema
de DEBS1-TE de Saccharopolyspora erythraea
(Leadlay, P. F. Presentación del 9ª Simposio Internacional de la
Biología de Actinomicetos, Moscú, 10-15 de julio
(1994) S7-2; Wiesmann, K. E. et al.
Presentación del póster P2-02, p. 154, Resúmenes del
9ª Simposio Internacional de la Biología de Actinomicetos, Moscú,
10-15 de julio (1994); Wiesmann, K. E. et al.
(1995) Chem. and Biol. 2:583-589) y
para la producción de 6-desoxieritronolida B por
DEBS1, DEBS2 y DEBS3 (Pieper et al. (1995) Nature
378:263266). En consecuencia, la sorprendente e inesperada
capacidad del gen de actII-orf4 activa al promotor
de actI en S. erythraea y, para hacerlo con más eficacia que
en su cepa de huésped natural, conduce naturalmente a un aumento
impresionante y valioso correspondiente en una cantidad de enzimas
de DEBS activas producidas por las cepas de S. erythraea
recombinantes que se describe en este
documento.
documento.
Los medios adecuados y preferidos para cultivar
las células genéticamente modificadas, y los medios preferidos de
aislamiento tanto de poliquétidos naturales como híbridos se
describen más ampliamente en los Ejemplos.
Algunas realizaciones de la invención serán
descritas ahora con referencia a los dibujos que acompañan en los
que:
La figura 1 proporciona las fórmulas químicas de
tres poliquétidos conocidos;
La figura 2A es un diagrama que muestra el
funcionamiento de la 6-desoxieritronolida sintasa B
(DEBS), una PKS que produce 6-desoxieritronolida B
(6-DEB), un precursor de la eritromicina A;
La figura 2B muestra la biosíntesis
post-PKS de eritromicinas incluyendo la conversión
de 6-DEB a la eritromicina A;
La figura 3 es un diagrama que muestra la
biosíntesis de rapamicina;
La figura 4 es un diagrama que muestra la
construcción del plásmido pDEL702;
La figura 5 es un diagrama que muestra la
construcción del plásmido pJC3;
La figura 6 es un diagrama que muestra la
construcción del plásmido pCJR701; y del plásmido precursor p20.5
que es ahora el plásmido renombrado pCJR24;
La figura 7 es un diagrama que muestra la
construcción del plásmido pCJR110 que es ahora el plásmido
renombrado pCJR29;
La figura 8 es un diagrama que muestra la
construcción del plásmido pNTEP2;
La figura 9 es un diagrama que muestra la
construcción del plásmido pRMTE y pCJRTE; el último plásmido es
renombrado ahora como pCJR30;
La figura 10 a y b es un diagrama que muestra la
construcción del plásmido pIG1;
La figura 11 es un diagrama que muestra la
construcción del plásmido pND20;
La figura 12 es un diagrama que muestra la
construcción del plásmido pKW15; este incluye el ADN que codifica
un módulo de carga, un primer módulo extensible, y la tioesterasa
terminadora de cadena, capaz de recibir módulos;
La figura 13 es un diagrama que muestra la
construcción del plásmido pAR33;
La figura 14 es un diagrama que muestra la
construcción del plásmido pAR8;
La figura 15 es un diagrama que muestra la
construcción del plásmido pE1A2TE;
La figura 16 es un diagrama que muestra la
construcción del plásmido pKS22;
La figura 17a es un diagrama que muestra la
construcción del plásmido pIB018;
La figura 17b es un diagrama que muestra la
construcción del plásmido pIB017;
La figura 18 es un diagrama que muestra la
construcción del plásmido pIBO1S y del plásmido pIB016;
La figura 19 es un diagrama que muestra la
construcción del plásmido pJLK15;
La figura 20 es un diagrama que muestra la
construcción del plásmido pJLK18;
La figura 21 es un diagrama que muestra la
construcción del plásmido pJLK21;
La figura 22 es un diagrama que muestra la
construcción del plásmido pKR1-0;
La figura 23 es un diagrama que muestra la
construcción del plásmido pKETO;
La figura 24 es un diagrama que muestra la
construcción del plásmido pMO7;
La figura 25 es un diagrama que muestra la
construcción del plásmido pCJR26;
La figura 26 es un diagrama que muestra la
construcción del plásmido pC-ATX;
La figura 27 es un diagrama que muestra la
construcción del plásmido pC-AT12;
La figura 28 es un diagrama que muestra la
construcción del plásmido pCJR49;
La figura 29 es un diagrama que muestra la
construcción del plásmido pCART11;
La figura 30 es un diagrama que muestra la
construcción del plásmido pARE24;
La figura 31 es un diagrama que muestra la
construcción del plásmido pARL3;
La figura 32 es un diagrama que muestra la
construcción del plásmido pAVLD;
La figura 33 muestra la integración de pAVLD en
el genoma de NRRL2338 de S. erythraea; y
La figura 34 muestra la integración de pAVLD en
el genoma de TER43 de S. erythraea.
La presente invención será ilustrada a
continuación por medio de algunos ejemplos, aunque no se pretende
con ellos su limitación. Cualquier ejemplo que pueda estar fuera
del alcance de la invención reivindicada se proporciona únicamente
para ayudar a la persona experta en entender la técnica del campo
técnico de la construcción de genes de PKS híbrida. Se hizo uso de
los siguientes medios y soluciones.
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Solución de elementos traza: ZnCl_{2},
40 mg/l; FeCl_{3}.6H_{2}O, 200 mg/l; CuCl_{2}.2H_{2}O, 10
mg/l; MnCl_{2}.4H_{2}O, 10 mg/l;
Na_{2}B_{4}O_{7}.10H_{2}O), 10 mg/l;
(NH_{4})_{6}MO_{7}O_{24}.4H_{2}O, 10 mg/l;
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Hasta 1 litro hecho con agua destilada. pH
ajustado a 7,2.
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Fue construida una célula huésped de S.
erythraea, genéticamente modificada para eliminar todos los
genes de eryA naturales que codificaban la PKS tipo I productora de
eritromicina, excepto para la región de ADN de eryAIII que
codificaba la tioesterasa terminadora de cadena, por recombinación
homóloga comenzando por NRRL2338 de S. erythraea. La
NRRL2338 de S. erythraea es una cepa productora de
eritromicina tipo silvestre obtenida de los laboratorios de
investigación Northern Regional, Peoria, Illinois, EE.UU., bajo la
susodicha denominación. El grupo ery está constituido por los genes
de PKS, bordeados por otros genes implicados en etapas posteriores
de la biosíntesis de eritromicina, incluyendo aquellos implicados en
la glicosilación, hidroxilación y metilación.
El plásmido pDEL fue construido como sigue
(Figura 4). El segmento SmaI de 1,4 kbp que contiene el codón de
iniciación de eryAI se clonó en pUC18 para dar p612SL, el segmento
se escindió como un fragmento BamHI-SacI usando los
sitios de clonación múltiples de pUC18, y se subclonó en un derivado
del plásmido pT7-18 (Roberts, G. A. et al.
Eur. J. Biochem. (1993) 214:305-311))
que contiene el fragmento SacI/KpnI de eryAIII que codifica el
extremo C-terminal de DEBS3 desde el cual se había
escindido un fragmento BglII-SacI. La identidad del
plásmido pDEL se confirmó mediante análisis de restricción.
El plásmido pDEL se digirió con BamH1 y se trató
con fosfatasa alcalina intestinal de ternero, y se hibridó al
plásmido pIJ702 (Katz, E. et al. J. Gen. Microbiol.
(1983) 129:2703-2714) que había sido
linearizado con BglII. La mezcla resultante contiene el plásmido
deseado pDEL702 (Figura 4).
Se transformaron protoplastos de NRRL2338 de
S. erythraea (Yamamoto, H. et al. J. Antibiot.
(1986) 39:1304-1313) con 10 \mug de
pDEL702 y se aislaron colonias estables resistentes a la
tioestreptona. Las colonias individuales se seleccionaron y se
subcultivaron cuatro veces en medio líquido no selectivo (caldo de
soja tríptico) seguido de la preparación y regeneración de los
protoplastos. Las colonias sensibles a la tioestreptona se aislaron
y se caracterizaron mediante análisis de restricción e hibridación
Southern. Dicha colonia fue denominada JC2. La cepa JC2 de S.
erythraea se ha depositado en la Colección Nacional de Bacterias
Industriales y Marinas, 23 St Machar Drive, Aberdeen, Escocia AB2
1RY, bajo la denominación NCIMB 40802.
\vskip1.000000\baselineskip
Se construyó una célula huésped de S.
erythraea, genéticamente modificada que contenía un plásmido
derivado de pCJR29 integrado en el cromosoma útil para la expresión
de genes homólogos y heterólogos mediante recombinación homóloga
comenzando por JC2 de S. erythraea (Figura 5).
El plásmido pCJR29K se construyó como sigue
(Figura 5), el fragmento de restricción SacI-SphI de
1,4 kbp que contiene el gen de resistencia a la kanamicina del
plásmido pIJ6021 (Takano, E. et al. Gene (1995)
166:133-137) se clonó en pUC18 digerido con
SacI-SphI para producir pKAN, este plásmido se
digirió con PvuII y el fragmento de 1,7 kbp que contenía el gen de
resistencia a la kanamicina se clonó en pCJR29 digerido con EcoRV
para producir el plásmido pCJR29K.
El plásmido pJC3 se construyó como sigue (Figura
5), el fragmento de restricción de SpeI-XbaI de 6,2
kbp de pNCO62 (Gaisser, S. et al. Mol. Gen. Genet.
(1997) en prensa) se clonó en pCJR29K digerido con Xba I para
producir pJC3.
Los protoplastos de JC2 de S. erythraea,
preparados como se describe para NRRL2338 de S. erythraea,
se transformaron con 10 \mug de pJC3 y se aislaron las colonias
estables resistentes a la kanamicina (100 \mug/ml). Las colonias
individuales se aislaron y se caracterizaron mediante análisis de
restricción e hibridación Southern. Dicha colonia fue denominada
JC3 de S. erythraea.
\vskip1.000000\baselineskip
Para obtener una cepa de S. erythraea que
sobre-expresa DEBS1, DEBS2 y DEBS3, la construcción
de plásmidos intermedios fue realizada como sigue.
El segmento de ADN de 1,6 kbp que codifica el
dominio de carga de la poliquétido sintasa de eritromicina desde el
nucleótido 1 al 1680 se amplificó por PCR empleando el procedimiento
CloneAmp (Raschtian, A. et al. Anal. Biochem. (1992)
91: 91-97) con los dos oligonucleótidos
siguientes como cebadores:
y
y usando como plantilla el ADN del
plásmido pNTEP2. Aproximadamente 30-60 ng del
producto PCR (1,6 kbp) se digieren con la uracilo ADN glicosilasa
durante 30 minutos a 37ºC en presencia de 25 ng del ADN del vector
de pAMPl8 (Gibco BRL), la mezcla se enfría en hielo y se usa para
transformar TGIrecO de E. coli y se comprueban las colonias
individuales según su contenido de plásmido. El plásmido deseado se
identifica por su mapa de restricción y se denomina
pARLD.
Un fragmento de 1,6 kbp del plásmido pARLD se
escinde usando PacI y NheI, se purifica por electroforesis de gel,
y se hibrida al plásmido pCJR24 que había sido cortado con PacI y
XbaI.
La mezcla de hibridación se transforma en DH1OB
de E. coli (Gibco BRL) y las colonias individuales,
cultivadas en presencia de ampicilina (100 \mug/ml), se
comprueban según su contenido en plásmido. El plásmido deseado se
identifica por su mapa de restricción y se denomina pNHE.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
Aproximadamente 5 \mug de pNHE, aislados de
DH1OB de E. coli (pNHE), se usan para transformar
protoplastos de NRRL2338 de S. erythraea y se seleccionan
las colonias estables resistentes a la tioestreptona. Se selecciona
una de estas colonias y el ADN total se prepara para el análisis de
hibridación Southern, para confirmar que el plásmido se ha
integrado específicamente en la copia cromosómica del gen de eryAI
en el área que codifica el dominio de carga del extremo
N-terminal. Esta cepa se denomina JC103 de S.
erythraea (NRRL2338/pNHE).
\vskip1.000000\baselineskip
El pCJR101 (Figura 6) es un plásmido lanzadera
construido para ser usado en la expresión de genes de PKS en
actinomicetos. Esto incluye un replicón de ColEI para permitir que
se replique en E. coli, un replicón de Streptomyces
de bajo número de copia de SCP2* (Bibb, M. J. y Hopwood, D. A. J.
Gen. Microbiol. (1981) 126:427) y el gen activador de
actII-orf4 del grupo de act que activa la
transcripción del promotor de act durante la transición desde la
fase de crecimiento a la fase estacionaria en el micelio vegetativo.
Es construido como sigue: un fragmento de ADN de aproximadamente
970 bp de pMF1015 (que contiene el gen activador de
ActII-orf4) (Fernandez-Moreno, M. A.
et al. Cell (1991) 66:769-780)
se amplifica por PCR, usando como cebadores los oligonucleótidos
sintéticos: 5'-ACT AGT CCA CTG CCT CTC GGT AAA ATC
CAG C-3' y 5'-CTT AAG AGG GGC TCC
ACC GCG TTC ACG GAC-3', que también introduce los
sitios de restricción de SpeI y AflII flanqueantes. Este fragmento
se introduce en el sitio de AatII reparado por el final del plásmido
pUC19 para proporcionar el plásmido p18.14 (renombrado pCJR18). Un
fragmento de ADN de aproximadamente 215 bp se amplifica a partir de
pMV400 que contiene el par promotor bidireccional PactIII/PactI)
(Parro, V. et al. Nucl. Acids Res. (1991)
19:2623-2627), usando como cebadores los
oligonucleótidos sintéticos 5'-ACA TTC TCT ACG CCT
AAG TGT TCC CCT CCC TGC CTC-3' y
5'-GTG ATG TAT GCT CAT ATG TGT CCT CCT TAA TTA ATC
GAT GCG TTC GTC CGG TG-3', que también introduce
los sitios NdeI y AflII flanqueantes. El producto PCR se digiere con
NdeI y AflII y se hibrida con el plásmido p18.14 (pCJR18) antes
cortado con NdeI y AflII, para generar el plásmido p19.4 (renombrado
pCJR19). Se obtiene por PCR un fragmento de 1,1 kbp de
HindIII-SphI que contiene el gen tsr, que confiere
resistencia a la tioestreptona, a partir del plásmido pIJ922
(Lydiate, D. J. et al. Gene (1985)
35:223-235) como plantilla, usando como
cebadores los oligonucleótidos 5'-TGA ACA CCA AGC
TTG CCA GAG AGC GAC GAC TTC CCC-3' y
5'-GAC AGA TTG CAT GCC CTT CGA GGA GTG CCC GCC
CGG-3' que también introduce los sitios flanqueantes
SphI y HindIII. El producto PCR se digiere con HindIII y SphI y se
hibrida con el plásmido p19.4 (pCJR19) cortado con HindIII y SphI
para obtener el plásmido p20.5 (pCJR24). El plásmido pIJ922 se
digiere con BamHI y SstI y el fragmento que contiene una parte del
locus de fertilidad y el origen de replicación (Lydiate, D.
J. et al. Gene (1985) 35:223-235) se
hibrida en pUC19 digerido con BamHI y Sst I para generar el
plásmido bifuncional p16/2.2 (renombrado pCJR16) (14,7 kbp). El
plásmido p20.5 (pCJR24) se digiere con SalI y SphI, los dos
fragmentos más grandes de la digestión se purifican por
electroforesis de gel, y se combinan en una hibridación de cuatro
componentes con el plásmido 16/2.2 (pCJR16) que ha sido digerido con
XhoI y SphI. La mezcla de hibridación se usa para transformar
Streptomyces lividans y las colonias se seleccionan en
presencia de tioestreptona. Una tal colonia se muestra que contiene
el plásmido deseado pCJR101 (aprox. 12,4 kbp), identificado por su
modelo de restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
La construcción del plásmido pCJR29 (pCJR110) se
representa en la Figura 7. Se obtiene un fragmento
HindIII-XhoI de 1,1 kbp que contiene el gen tsr,
que confiere resistencia a la tioestreptona, por PCR del plásmido
pIJ922 como plantilla, usando como cebadores los oligonucleótidos
5'-TGA ACA CCA AGC TTG CCA GAG AGC GAC GAC TTC
CCC-3' y 5'-GAC AGA TTC TCG AGC CTT
CGA GGA GTG CCC GCC CGG-3' que también introduce los
sitios flanqueantes HindIII y XhoI. El producto PCR se digiere con
HindIII y XhoI y se hibrida con el plásmido 16/2.2 (pCJR16) que ha
sido digerido con HindIII y XhoI, para generar el plásmido 22.1
(pCJR25). El plásmido p22.1 (pCJR25) se digiere con HindIII y SphI
y se hibrida con el plásmido p19.4 (pCJR19) que ha sido digerido con
HindIII y SphI, para producir el plásmido deseado pCJR29 (pCJR110)
(aprox. 12,4 kbp), identificado por su modelo de restricción. El
plásmido pCJR29 (pCJR110) se diferencia de pCJR101 en la orientación
del gen tsr, el gen ActII-orf4 y el promotor
actI/actIII, con respecto al origen de replicación derivado de
SCP2*.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pRM52 es un derivado del plásmido
pRMS (McDaniel, R. et al. Science, (1993)
262:1546-1550). El pRM5 se linearizó primero
por digestión con NdeI, reparado por el final y luego se hibridó de
nuevo para producir pRM51. El pRM51 se cortó con PacI y NsiI y el
fragmento PacI-NsiI grande se aisló y se hibridó a
un enlazante de oligonucleótido bicatenario corto que contenía un
sitio NdeI y se construyó a partir de los oligonucleótidos
sintéticos 5'-TAAGGAGGACACATATGCA-3'
y 5'-TAATTCCTCCTGTGTAT-3' que fueron
templados juntos.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La mezcla de hibridación se transformó en
TGIrecO de E. coli y las colonias aisladas se rastrearon
según su contenido de plásmido. El plásmido deseado (19,6 kbp) se
identificó por su mapa de restricción y se denominó pRM52.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pNTEP2 contiene el marco de lectura
abierto entero para el DEBS1 quimérico más el gen de tioesterasa,
con un sitio NdeI único en el codón de iniciación y sitios XbaI y
HindIII únicos inmediatamente 3' del codón de terminación. Es
construido vía varios plásmidos intermedios como sigue (Figura
8):
Una biblioteca de ADN total de TED8 de S.
erythraea (Cortes, J. et al. Science (1995)
268: 1487-1489) se construyó en el vector
_DASH II (Stratagene) y se sondó con fragmentos del gen de eryA. Un
bacteriófago recombinante denominado \lambda-4B
tenía un inserto que se extiende de 700 bp corriente arriba del
codón de inicio de eryAI respecto al gen de resistencia a la
tioestreptona del plásmido integrado en TED8 de S.
erythraea.
El ADN de \lambda-4B se
digirió con NcoI y el fragmento de 12 kbp NcoI fue reparado por el
final y se hibridó en pUC18 SmaI-cut y se
transformó en TGIrecO de E. coli. Las colonias individuales
se rastrearon según su contenido de plásmido y un plásmido que
lleva el inserto de NcoI se seleccionó y se denominó pTENCO11.
Un fragmento de KpnI de 4,0 kilobytes que se
extiende desde 1,4 kbp corriente arriba del codón de inicio de
eryAI correcto como se ha determinado previamente (Caffrey, P. et
al. FEBS Letters (1992)
304:225-228), a 2,6 kbp dentro del gen de
eryAI de S. erythraea, se escindió del plásmido pBK25
(Bevitt, D. J. et al. Eur. J. Biochem. (1992)
204:39-49) y se clonó en pUC18 para obtener
el plásmido pBK6.12. El ADN de este plásmido se usó como plantilla
para una reacción PCR para obtener un producto de 360 bp en el que
un único sitio Nde I es creado en el codón de iniciación de eryAI y
un sitio único SmaI es creado en el otro extremo del producto PCR.
Los oligonucleótidos usados fueron 5'-CCC ATA TGG
CGG ACC TGT CAA AGC-3' y 5'-ATT GCG
CGC CCT GGC CCG GGA A-3'. El producto se reparo por
el final y se hibridó en pUC18 cortado por SmaI, y se transformó en
TGIrecO de E. coli.
Las colonias individuales se rastrearon según su
contenido de plásmido y se seleccionó un plásmido que llevaba el
inserto en una orientación tal que el sitio SmaI era adyacente al
sitio KpnI del polienlazante y el plásmido se denominó pNDE6. El
plásmido pNDE6 se digirió con SmaI y KpnI, y se hibridó con un
fragmento de 2,3 kbp del gen eryAI obtenido por la digestión del
plásmido pBK6.12 con SmaI y KpnI. La mezcla de hibridación se usó
para transformar TGIrecO de E. coli y las colonias
individuales se rastrearon según su contenido de plásmido. Se aisló
un plásmido que contenía el fragmento de NdeI-KpnI
de 2,6 kbp deseado y se denominó al plásmido pNDE7. El inserto de
NdeI-KpnI se escindió del plásmido pNDE7 y se
hibridó en el plásmido pT7-18, previamente digerido
con NdeI y KpnI. El plásmido pT7-18 es un derivado
del plásmido pT7-7 (Tabor, S. y Richardson, C.C.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985)
82:1074-1078) en el que el polienlazante se
sustituye por el polienlazante de pUC18. La mezcla de hibridación
se usó para transformar TGIrecO de E. coli y las colonias
individuales se rastrearon según su contenido de plásmido y se
seleccionó un plásmido que contenía el inserto de
NdeI-KpnI de 2,6 kbp deseado y se denominó
pNK8.
El plásmido pNK8 se transformó en una cepa
deficiente por metilación de ET12567 de E. coli (MacNeil,
D.J. et al. Gene (1992)
111:61-68) y el plásmido pNK8 se aisló de
esta cepa y se digirió con ClaI. Un fragmento de ClaI de 11 kbp
obtenido por la digestión de pTENO0ll se hibridó en el pNK8 digerido
y se transformó en TGIrecO de E. coli. Las colonias
individuales se rastrearon según su contenido de plásmido y se
seleccionó un plásmido, en el cual el inserto de 11 kbp estaba
correctamente orientado para regenerar el marco de lectura de
eryAI, y se denominó pNTE5.
Se construyó un polienlazante de
ClaI-EcoRI, que llevaba sitios de restricción únicos
para XbaI y para HindIII, a partir de los oligonucleótidos
sintéticos complementarios siguientes:
5'-AATTCATAGTCTAGAAGCTTAT-3' y
5'-CGATAAGCTTCTAGACTATG-3'.
El polienlazante se hibridó en el plásmido
pNTE5, que había sido digerido con ClaI y EcoRI para quitar un
fragmento de ClaI-EcoRI de 2,3 kbp. La mezcla de
hibridación se usó para transformar TGIrecO de E. coli y las
colonias individuales se rastrearon según su contenido de plásmido.
Se identificó un plásmido que contenía el polienlazante y se
denominó pNTEP2.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pNTEP2 (14 kbp) se digirió con NdeI
y XbaI y el inserto se purificó por sedimentación en un gradiente
de sacarosa. El inserto purificado se hibridó en el plásmido pRM52
(19,6 kbp) (Ejemplo 4) que había sido digerido con NdeI y XbaI, y
el vector se purificó por sedimentación en un gradiente de sacarosa.
La mezcla de hibridación se usó para transformar E. coli y
se comprobó el contenido de plásmido de las colonias individuales.
El plásmido deseado pRMTE (31,5 kbp) se identificó por su modelo de
restricción (Figura 9).
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pNTEP2 (Ejemplo 5) se digiere con
NdeI y XbaI y el inserto se purifica por sedimentación en un
gradiente de sacarosa. El inserto purificado se hibrida en el
plásmido pCJR101 (12,4 kbp) que ha sido digerido con NdeI y XbaI, y
se purifica por sedimentación en un gradiente de sacarosa. La mezcla
de hibridación se usa para transformar DHB10 de E. coli y
las colonias individuales se rastrean según su contenido de
plásmido. El plásmido deseado pCJRTE (pCJR30) (24,3 kbp) se
identifica por su modelo de restricción (Figura 9).
\vskip1.000000\baselineskip
Se transforman aproximadamente 5 \mug del
plásmido pCJRTE (pCJR30) en protoplastos de ATCC 31272 de S.
avermitilis y se aíslan las colonias estables resistentes a la
tioestreptona. Se analizan diversas colonias según su contenido de
ADN del plásmido. Una colonia que contenía un plásmido cuyo mapa de
restricción muestra que es idéntico a pCJRTE (pCJR30), se denomina
ATCC 31272/pCJRTE de S. avermitilis (pCJR30).
Se inocula ATCC 31272/pCJRTE de S.
avermitilis (pCJR30) en medio BW1 que contiene 50 \mug/ml de
tioestreptona, y se deja crecer durante cuatro días a
28-30ºC. Después de este tiempo, se usan 15 ml de la
suspensión celular para inocular 150 ml de medio líquido BW2 que
contiene 50 \mug/ml de tioestreptona, y se deja crecer durante 6
días. Después de este tiempo, las células se eliminan por
centrifugación, se lavan con agua, y los sobrenadantes se combinan
y se extraen tres veces con acetato de etilo (250 ml). Los extractos
de acetato de etilo combinados se lavan con un volumen igual de
cloruro de sodio saturado, se secan sobre sulfato de sodio anhidro
y se elimina el acetato de etilo por evaporación bajo presión
reducida. Se toman muestras del residuo en una cantidad mínima de
éter de dietilo, se filtran mediante un tapón de sílice y se
analizan por CG, revelando la presencia tanto de
(Ac)-TKL como de TKL (Fórmula II:
R_{1}=R_{2}=Me; R_{3}=Me para (Ac)-TKL, y Et
para TKL), con tiempos de retención idénticos con relación a
muestras sintéticas auténticas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los plásmidos pIG1 y pIG101 consiste cada uno en
un plásmido derivado de SCP2* que contiene un gen de PKS Tipo I
híbrido que comprende el módulo de carga de avr en lugar del módulo
de carga de ery, los dos primeros módulos de extensión de la PKS de
ery y la tioesterasa de la PKS de ery. Éstos se construyen vía
varios plásmidos intermedios como sigue (Figura 10).
El plásmido pVE1446 que contiene una parte de
los genes de PKS de avermectina (avr) se obtuvo de la cepa de E.
coli ATCC 68250 (MacNeil, D. J. et al. Ann. N. Y.
Acad. Sci. (1994) 721:123-132). El
plásmido pVE1446 se digirió con BamHI y el fragmento de 7,6 kbp
entre las coordenadas 32,15 y 3,40 (MacNeil, D. J. et al.
Ann. N. Y. Acad. Sci. (1994)
721:123-132) se purificó por electroforesis
de gel y se circularizó de nuevo. La mezcla contenía el plásmido
deseado pVE3.4 que se aisló después de la transformación de la cepa
de E. coli TGIrecO.
\newpage
El plásmido pBK25 (Bevitt, D. J. et al.
Eur. J. Biochem. (1992) 204:39-49) se
digirió con NcoI y el fragmento de 12 kbp se reparó por el final y
se hibridó en el plásmido pUC18 que había sido linearizado con
SmaI. La mezcla de hibridación se transformó en TG1 recO de E.
coli y se comprobó el contenido de plásmido de las colonias
individuales. El plásmido deseado pNC012 se identificó por su modelo
de restricción.
El plásmido pCRabc (Figura 10) se construyó como
sigue. Se llevaron a cabo tres reacciones PCR separadas: Primera,
se usaron 20 pmol de cada uno de los oligonucleótidos sintéticos A1
(5'-CTC GTC GGT GGC TTT GCG-3') y
A2 (5'-CCC GGG AAA AAC GAA GAC TAG TGG CGC GGA CGG
CCG-3') para amplificar un producto de 1,0 kbp a
partir de 100 ng de plantilla pNCO12. El producto PCR se reparó por
el final, se fosforiló y se clonó en SmaI-cut pUC18
para obtener el plásmido pCRa. En segundo lugar, se usaron 20 pmol
de cada uno de los oligonucleótidos sintéticos C1
(5'-CAC GCG CAG CGC GGC GGA-3') y C2
(5'-CGAA CCG CTA GCG GTC GTC GCG ATG GCC
T-3') para amplificar un producto de 1,5 kbp de 100
ng de plantilla de pNC012. El producto se reparó por el final, se
fosforiló y se clonó en pUC18 SmaI-cut para obtener
el plásmido pCRc. En tercer lugar, se usaron 20 pmol de cada uno de
los oligonucleótidos sintéticos B1
(5'-GTGGCCCGGCCGTCCGCGCCACTAGTCTTCGTTTTT-3')
y B2
(5'-AACAGCTAGCGGTTCGTCCGCCGCTGCCGTGCC-3')
para amplificar un producto de 1,4 kbp de 100 ng de
plantilla
pVE3.4. El producto se reparó por el final, se fosforiló y se clonó en pUC18 SmaI-cut para obtener el plásmido pCRb.
pVE3.4. El producto se reparó por el final, se fosforiló y se clonó en pUC18 SmaI-cut para obtener el plásmido pCRb.
El plásmido pCRa se digirió con HindIII y SpeI y
el inserto de 1,0 kbp se hibridó con el plásmido pCRb previamente
digerido con HindIII y SpeI, para obtener el plásmido pCRab. El
plásmido pCRc se digirió con NheI y EcoR1 y el inserto de 1,5 kbp
se hibridó con el plásmido pCRab previamente digerido con NheI y
EcoR1 para obtener el plásmido pCRabc.
El plásmido pCRabc se digirió con MfeI y SfiI y
el fragmento de ADN que contenía el dominio de carga de la PKS de
avr se purificó por electroforesis de gel y se hibridó con el
plásmido pNTEP2 que había sido digerido con MfeI y SfiI y el
fragmento más grande se purificó por electroforesis de gel. La
mezcla de hibridación se transformó en TG1 recO de E. coli y
se comprobó el contenido de plásmido de las colonias individuales.
El plásmido deseado pNEWAVETE (13,7 kbp) se identificó por su modelo
de restricción.
El plásmido pNEWAVETE se digirió con NdeI y XbaI
y el inserto se purificó por sedimentación en un gradiente de
sacarosa. El inserto purificado se hibridó en el plásmido pRM52
(19,6 kbp) que había sido digerido con NdeI y XbaI, y el vector se
purificó por sedimentación en un gradiente de sacarosa. La mezcla de
hibridación se usó para transformar E. coli y se comprobó el
contenido de plásmido de las colonias individuales. El plásmido
deseado pIG1 se identificó por su modelo de restricción.
El plásmido pNEWAVETE se digiere con NdeI y XbaI
y el inserto se purifica por sedimentación en un gradiente de
sacarosa. El inserto purificado se hibrida en el plásmido pCJR101
(Ejemplo 4) que ha sido digerido con NdeI y XbaI, y se purifica por
electroforesis de gel. La mezcla de hibridación se usa para
transformar DHB10 de E. coli y las colonias individuales se
rastrean según su contenido de plásmido. El plásmido pIG101 deseado
se identifica por su modelo de restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pIG1 que había sido aislado de
ET12567 de E. coli (MacNeil. D. J. et al. Gene
(1992) 111:61-68) se usó para transformar
protoplastos de CH999 y se aislaron colonias estables resistentes a
la tioestreptona. Se comprobó el contenido de plásmido de las
colonias individuales y se confirmó la presencia del plásmido pIG1
por su modelo de restricción.
Se inoculó CH999/pIG1 de S. coelicolor en
100 ml de medio YEME que contenía 50 \mug/ml de tioestreptona y
se dejó crecer durante cinco días a 28-30ºC. Después
de este tiempo, el caldo se filtró para eliminar los micelios. El
caldo se extrajo tres veces con cuartos volúmenes de acetato de
etilo y los extractos de acetato de etilo combinados se secaron
sobre sulfato de sodio anhidro, y el acetato de etilo se eliminó
bajo presión reducida. El residuo se tomó en acetato de etilo y se
filtró mediante un tapón de sílice, el acetato de etilo se eliminó
otra vez y el residuo se llevó en éter de dietilo y se sometió a
cromatografía súbita en una columna del gel de sílice eluída con
éter de dietilo. Se separó una fracción que contenía
(s-pent)-TKL e
("i-but")-TKL de una fracción
que contenía TKL, con cantidades menores de (Ac)-TKL
en una tercera fracción. Los compuestos se identificaron por su
co-migración con estándares auténticos en análisis
CG (columna de 25 m, programada durante 2 minutos a 70ºC, después
incremento a 250ºC durante 24 minutos. Los tiempos de retención para
(s-pent)-TKL,
("i-but")-TKL, TKL y
(Ac)-TKL fueron 14,9, 13,6, 12,9 y 11,9 minutos
respectivamente. Se usaron la CG, MS electropulverización. y
1H-RMN para mostrar que el componente principal
(50-60%) era TKL.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pIG101 que se ha aislado a partir de
ET12567 de E. coli (MacNeil, D. J. et al. Gene
(1992) 111:61-68) se usa para transformar
protoplastos de CH999 de S. coelicolor y se aislaron las
colonias estables resistentes a la tioestreptona. Se comprueba el
contenido de plásmido de las colonias individuales y la presencia
de plásmido el pIG101 se confirma por su modelo de restricción.
Se inocula CH999/pIG101 de S. coelicolor
en medio YEME que contiene 50 \mug/ml de tioestreptona y se deja
crecer durante cinco días a 28-30ºC. El caldo se
extrae tres veces con cuarto de volúmenes de acetato de etilo y los
extractos de acetato de etilo combinados se secan sobre sulfato de
sodio anhidro, y se elimina el acetato de etilo bajo presión
reducida. El residuo se trató como en el Ejemplo 12 y dio resultados
similares.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pIG1 que había sido aislado de
ET12567 de E. coli (MacNeil, D. J. et al. Gene
(1992) 111:61-68) se transformó en
protoplastos de ATCC31272 de S. avermitilis y se aislaron las
colonias estables resistentes a la tioestreptona. Se comprobó el
contenido de plásmido de las colonias individuales y la presencia
del plásmido pIG1 se confirmó por su modelo de restricción.
Se inoculó primero ATCC31272/pIG1 de S.
avermitilis en medio BW1 que contenía 50 \mug/ml de
tioestreptona, y se dejó crecer durante cuatro días a
28-30ºC. Después de este tiempo, se usaron 20 ml del
caldo para sembrar 150 ml de medio BW2 que contenía 50 \mug/ml de
tioestreptona.
Se permitió entonces que el organismo inoculado
creciera durante 10-12 días. El caldo se filtró para
quitar los micelios, y se extrajo tres veces con cuarto volúmenes
de acetato de etilo y los extractos de acetato de etilo combinados
se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, y el acetato de etilo se
eliminó bajo presión reducida, para dar el producto ordinario de
aproximadamente 10 mg por litro. El residuo se disolvió en acetato
de etilo, se pasó a través de un tapón de sílice, y el disolvente se
eliminó. El residuo se disolvió en éter de dietilo y se sometió a
cromatografía súbita en una columna de sílice (1 cm x 15 cm) eluída
con éter de dietilo, y se recuperaron fracciones de 10 ml cada una
y se analizaron por GC. El éter de dietilo se evaporó para dejar
aproximadamente 10 mg del residuo aceitoso que contenía triquetida
lactonas. El componente principal (50-60%) fue
(s-pent)-TKL,
(i-but)-TKL, TKL y
(Ac)-TKL también presente (es decir, los compuestos
de fórmula II con R_{1}=R_{2}=Me, y
R_{3}=1-metilpropilo
((s-pent)-TKL),
i-Pr((i-but)-TKL),
Et(TKL) y Me((Ac)-TKL).
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pIG101 que se ha aislado de ET12567
de E. coli (MacNeil, D. J. et al. Gene (1992)
111:61-68) se transforma en protoplastos de
ATCC31272 de S. avermitilis y se aíslan las colonias estables
resistentes a la tioestreptona. Se comprueba el contenido de
plásmido de las colonias individuales y la presencia del plásmido
pIG101 se confirma por su modelo de restricción.
Primero se inocula ATCC31272/pIG101 de S.
avermitilis en medio BW1, descrito anteriormente y se deja
crecer durante 10-12 días. El aislamiento de
productos como en el ejemplo anterior da una fracción que contiene
(s-pent)-TKL y
(i-but)-TKL, una fracción que
contiene TKL, y una tercera fracción con cantidades menores de
(Ac)-TKL. Los compuestos se identifican por su
co-migración con estándares auténticos en el
análisis CG.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transforman aproximadamente 5 \mug del
plásmido pIG1 en protoplastos de JC2 de S. erythraea y se
aíslan las colonias estables resistentes a la tioestreptona. A
partir de diversas colonias, se obtiene el ADN total y se analiza
por hibridación Southern, para confirmar que el plásmido se ha
integrado específicamente en la parte del gen eryAIII que codifica
la tioesterasa/ciclasa del extremo C-terminal,
mediante recombinación homóloga.
Se inocula JC2/pIG1 de S. erythraea en
medio de agua del grifo que contiene 50 \mug/ml de tioestreptona
y se deja crecer durante cuatro días a 30ºC. Después de esto, se
usan 20 ml de micelio para sembrar 500 ml de medio
sacarosa-succinato que contienen 50 \mug/ml de
tioestreptona, en un matraz de 2L con un muelle sencillo para
reducir la aglutinación, agitado a 280 revoluciones por minuto.
Después de entre 3,5 y 6 días, el caldo se filtra para quitar los
micelios y luego se extrae tres veces con un cuarto volumen de
acetato de etilo. Los extractos de acetato de etilo combinados se
secan sobre sulfato de sodio anhidro y el disolvente se elimina por
evaporación. El análisis de la mezcla del producto usando CG y MS
electropulverización reveló que de un total de 5-6
mg/L de productos de triquetida lactona, el componente principal fue
(s-pent)-TKL (aproximadamente 1,5
mg/L), siendo otros componentes presentes
(i-but)-TKL, TKL y una cantidad
menor de (Ac)-TKL.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transforman aproximadamente 5 \mug del
plásmido pIG101 en protoplastos de JC2 de S. erythraea y se
aíslan las colonias estables resistentes a la tioestreptona. A
partir de diversas colonias, se obtiene el ADN total y se analiza
por hibridación Southern, para confirmar que el plásmido se ha
integrado específicamente en la parte del gen eryAIII que codifica
la tioesterasa/ciclasa del extremo C-terminal,
mediante recombinación homóloga.
Se siguió el mismo procedimiento que en el
Ejemplo 16 (ii). El análisis de la mezcla de producto usando GC y
MS electropulverización reveló que de un total de
5-6 mg/L de productos de triquetida lactona, el
componente principal fue
(s-pent)-TKL (aproximadamente 1,5
mg/L), siendo otros componentes presentes
(ibut)-TKL, TKL y una cantidad menor de
(Ac)-TKL.
\vskip1.000000\baselineskip
Este fue llevado a cabo en dos etapas:
El plásmido pNEWAVETE se digirió con EcoRI e
HindIII y el vector se purificó por electroforesis de gel. Un
inserto bicatenario de oligonucleótido sintético que codifica un
marcador de 6-histidina y que posee estos sitios en
cada extremo (mostrado más abajo) se hibridó al vector.
(5'-AATTCACATCACCATCACCATCACTAGTAGGAGGTCTGGCCATCTAGA-3')
(3'-GTAGTGGTAGTGGTAGTGATCATCCTCCAGACCGGTAGATCTTCGC-5')
La mezcla de hibridación se usó para transformar
DH1OB de E. coli y las colonias individuales se rastrearon
según su contenido de plásmido. El plásmido deseado, el pHISAVE se
identificó por su modelo de restricción.
El plásmido pHISAVE se digirió con NdeI y XbaI y
el inserto se hibridó en pCJR24 digerido con NdeI y XbaI. La mezcla
de hibridación se usó para transformar DH1OB y las colonias
individuales se rastrearon según su contenido de plásmido. El
plásmido deseado, el pND20 se identificó por su modelo de
restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pND20 que se ha aislado de ET12567
de E. coli se usa para transformar protoplastos de JC3 de
S. erythraea y se aíslan las colonias estables de
tioestreptona.
Se inocula JC3/pND20 de S. erythraea en
medio de agua del grifo que contiene 50 \mug/ml de tioestreptona
y se deja crecer durante cuatro días a 30ºC. 20 ml de esto se usan
para inocular 500 ml del medio sacarosa-succinato
que contienen 50 \mug/ml de tioestreptona, en un matraz de 2L con
un muelle sencillo para reducir la aglutinación y se agita a 280
revoluciones por minuto. Después de entre 3,5 y 6 días, el caldo se
filtra para quitar los micelios y luego se extrae tres veces con un
cuarto volumen de acetato de etilo. Los extractos de acetato de
etilo combinados se secan sobre sulfato de sodio anhidro y el
solvente se elimina por evaporación. El análisis de la mezcla del
producto usando GC y MS electropulverización revela que de un total
de aproximadamente 20 mg/L de productos de triquetida lactona,
aproximadamente el noventa por ciento consistió en TKL y el resto
era Ac(TKL).
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pKW15 es un vector derivado de pT7
que contiene un inserto que comprende el módulo de carga, el primer
módulo de extensión y la tioesterasa de la PKS de ery, adecuado para
subclonar en un vector basado en SCP2* para obtener la expresión de
un gen de sintasa diquetida; y también adecuado para la introducción
del ADN heterólogo que contiene uno o varios módulos intactos. El
plásmido pKW15 se obtiene vía varios plásmidos intermedios como
sigue (Figura 12).
El plásmido pNTEP2 (Ejemplo 5) se digirió con
BglII, los extremos adhesivos se rellenaron e hibridaron de nuevo,
para producir el plásmido pKW11. El inserto en el plásmido pKW11
consiste en un gen de eryAI-eryAIII quimérico que
abarca el dominio de carga, módulo 1 y módulo 2 de DEBS1 y la
tioesterasa de DEBS3. La estrategia para obtener esta "diquetida
sintasa" era eliminar el ADN que codifica parte del módulo 1,
todo el módulo 2 y parte de la tioesterasa, por digestión del
plásmido pKW11 con EcoRV y EcoR1, y luego reconstituir el módulo 1
y la parte del extremo N-terminal de ACP1 por la
introducción de un producto PCR apropiado, y de manera similar se
diseñó un producto PCR para sustituir la parte del extremo
C-terminal de ACP2 y la tioesterasa. Los dos
productos PCR se unen por un sitio único BglII creado con el sitio
activo de ACP, lo que implica una modificación en la secuencia de
aminoácidos del dominio de ACP híbrido EL (ácido glutámico seguido
de leucina) como se encuentra tanto en los dominios ACP1 como en
ACP2, a DL (ácido aspártico seguido de leucina). Tales
modificaciones en la secuencia en un sitio activo de PKS, con miras
a retener la función, no han sido intentadas antes y no es obvio
que tales sitios modificados deban permanecer activos.
Para la amplificación por PCR del ADN para el
módulo 1, se usaron los siguientes oligonucleótidos sintéticos como
cebadores mutagénicos, uno que contiene un sitio EcoRV y el otro un
sitio BglII:
5'-GCAGGGATATCGCACGTTCCTGG-3'
y
5'-CGCCGAGATCTGCGAAGGCCTGGTCGGCGGG-3'
El PCR se realizó en pNTEP2 como plantilla
usando la ADN polimerasa de Pfu y 30 ciclos del 95% (1 minuto);
hibridación a 55ºC (1 minuto) y amplificación a 72ºC (2 minuto), en
presencia de dimetilsulfóxido al 10% (vol/vol). El producto (PCR1)
se reparó por el final y se clonó en el fagémido de
SmaI-cut pUC119 y la mezcla de hibridación se usó
para transformar TGIrecO de E. coli. El ADN del plásmido se
preparó a partir de colonias individuales y el plásmido deseado
(5,0 kbp) se identificó por su modelo de restricción y se denominó
pKW12.
\newpage
Para la amplificación por PCR del ADN para el
extremo 5' final del módulo 2 y el dominio de tioesterasa, se
usaron los siguientes oligonucleótidos que contienen respectivamente
un sitio de Bgl II y un sitio de EcoRI, como cebadores
mutagénicos:
5'-ATGAATTCCCTCCGCCCAGCCAG-3'
y
5'-ACAGATCTCGGCTTCGACTCGCTGACCG-3'
La PCR se realizó con pNTEP2 como plantilla
exactamente como se describe antes para la PCR1 y el producto
(PCR2) se reparó por el final y se clonó en el fagémido de
SmaI-cut pUC119. La mezcla de hibridación se usó
para transformar TGIrecO de E. coli y el ADN del plásmido se
preparó a partir de colonias individuales. El plásmido deseado (4,1
kbp) se identificó por su modelo de restricción y se denominó
pKW13.
El plásmido pKW12 se digirió con EcoRV e
HindIII, y el inserto de 1,8 kbp se reparó por el final, y luego se
hibridó junto con el plásmido pKW11 que había sido linearizado con
EcoRV y que se había tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de
hibridación se transformó en TGIrecO de E. coli y el
contenido del plásmido de las colonias individuales fue comprobado.
El plásmido deseado (15,8 kbp) se identificó en que el sitio Eco RV
único había sido reconstituido, y este plásmido se denominó
pKW14.
El plásmido pKW13 se digirió con BglII y EcoRI y
el inserto de 0,9 kbp se hibridó en el plásmido pKW14 que había
sido digerido con BglII y EcoRI. La mezcla de hibridación se
transformó en TGIrecO de E. coli y el contenido del plásmido
de las colonias individuales fue comprobado. El plásmido deseado
(9,32 kbp) se identificó, en que el fragmento de 0,9 kbp de
BglII-EcoRI de pKW13 sustituyó al segmento de 9,5
kbp de BglII-EcoRI de pKW14, y este plásmido se
denominó pKW15.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pKW15 se digirió con NdeI y XbaI y
el inserto se hibridó en el plásmido pRM52 que también había sido
digerido con NdeI y XbaI. La hibridación se transformó en TGI recO
de E. coli y las colonias aisladas se rastrearon según su
contenido de plásmido. El plásmido deseado se identificó por su mapa
de restricción y se denominó pKW16.
El plásmido pKW16 se usó para transformar la
cepa de E. coli ET12567 deficiente de metilación (MacNeil,
D. J. et al. Gene (1992)
111:61-68) y el ADN del plásmido desmetilado
pKW16 aislado de esta cepa se usó para transformar CH999 de S.
coelicolor (McDaniel, R. et al. Science (1993)
262:1546-1550. Los protoplastos de S.
coelicolor se transformaron con pKW16 y se transfirieron
colonias estables resistentes a la tioestreptona a placas de
agar-agar con medio de agua del grifo que contenía
50 \mug/ml de tioestreptona.
Se escogió una colonia de CH999/pKW16 S.
coelicolor y se trasladó a 100 ml de YEME suplementado con 50
\mug/ml de tioestreptona y se permitió crecer a 30ºC. Después de 4
días el caldo se filtró para eliminar los micelios, se acidificó a
pH 3,0 y se añadió cloruro de sodio sólido hasta que la solución
estuviera saturada. El caldo se extrajo 5 veces con un volumen
igual de acetato de etilo, y los extractos de acetato de etilo
combinados se secaron por extracción con la solución de cloruro de
sodio saturada y se concentró por evaporación. La cromatografía de
capa fina en placas de gel de sílice, eluída con acetato de
etilo:ácido acético 99:1 (v/v) y teñida con permanganato de
potasio, mostró la presencia de un compuesto con la misma movilidad
(Rf 0,55) como una muestra de referencia de
(2S)-metil-(3R)-ácido butanoico, que no estaba
presente en un extracto obtenido de CH999 de S. coelicolor
solo. El análisis por espectrometría de masas por
electropulverización (ESMS), en el modo de ión negativo, de los
extractos de acetato de etilo mostró un pico principal en m/e 117 no
presente en la muestra de control. En el modo de ión positivo, y en
presencia de ácido fórmico, se observó un pico en m/e 119, que
cambió a m/e 141 en presencia de iones de sodio añadidos. La masa
exacta del aducto de sodio se determinó que era 141,05171 (la sal
de sodio del ácido
2-metil-3-hidroxibutanoico
requiere 141,05248). Se escogió una colonia de CH999/pKW16 de S.
coelicolor y se trasladó a 100 ml de YEME suplementado con 50
\mug/ml de tioestreptona y se permitió crecer a 30ºC durante 7
días, un extracto de acetato de etilo preparado como antes mostró
un pico adicional, en ESMS operado en el modo de ión negativo a m/e
131. En el ESMS operado en el modo de ión positivo, y en presencia
del ácido fórmico añadido, el pico se encuentra a m/e 155. La masa
exacta de este pico se determinó que era 155,06973 (la sal de sodio
del ácido
2-metil-3-hidroxipentanoico
requiere 155,06890).
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pAR33 contiene una PKS Tipo I
híbrida que comprende el módulo de carga de ery, módulo de extensión
1 de la PKS de ery, módulo de extensión 12 de la PKS de rap y la
ery tioesterasa terminadora de cadena. Se construye vía varios
plásmidos intermedios como sigue (Figura 13):
El segmento de ADN de 4,7 kbp del gen de rapC
que codifica el módulo 12 de la PKS de rapamicina se amplificó por
PCR empleando el procedimiento de CloneAmp (Raschtian, A. et
al. Anal. Biochem. (1992)
91:91-97) y con los dos siguientes
oligonucleótidos como cebadores:
y usando como plantilla el ADN del
clon \sim\lambda-1C (Schwecke, T. et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995)
92:7839-7843). Aproximadamente
30-60 ng del producto PCR (4,7 kbp) se digieren con
la uracilo ADN glicosilasa durante 30 minutos a 37ºC en presencia
de 25 ng de ADN del vector de pAMP18 (Gibco BRL), la mezcla se
enfría en hielo y se transforma en TGIrecO de E. coli y se
comprueban las colonias individuales según su contenido de
plásmido. El plásmido deseado (7,4 kbp) se identifica por su mapa de
restricción y se denomina
pARRAP.
El plásmido pARRAP se digiere con BglII para
liberar el fragmento de 4,7 kbp que codifica el módulo de rap 12,
que se purifica por electroforesis de gel y luego se hibrida en el
plásmido pKW15, que se ha linearizado por digestión con BglII. La
mezcla de hibridación se transforma en TGIrecO de E. coli y
se comprueban las colonias individuales según su contenido de
plásmido. El plásmido deseado es aquel en el cual el módulo de rap
12 tiene la orientación correcta con respecto a la secuencia de
codificación del marco de lectura abierto del inserto en pKW15, de
modo que sea producido un gen de triquetida lactona sintasa híbrido.
Tal plásmido se identifica por su modelo de restricción, y se
denomina pAR32.
El plásmido pAR32 contiene un inserto que puede
ser escindido por digestión con NdeI y XbaI, pero hay un sitio NdeI
adicional en el inserto que debe ser específicamente protegido
contra la división. Esto se hace usando el método de protección
RecA (Koob, M. et al. Nucl. Acids Res. (1992)
20:5831-5835)). El oligonucleótido sintético
5'GCACC
CACGACGCCACCACCACATATGCCCTGCACCCTGCCCTCC-3' (en el que el sitio NdeI está subrayado) se usa junto con la proteína RecA purificada y ATP_S, para formar un complejo de ADN-proteína triple estable que protege específicamente de la digestión el sitio NdeI interno en el módulo de rap 12. El plásmido protegido pAR32 se digiere con NdeI y XbaI, produciendo el inserto de cadena entera deseado (13,1 kbp), y este se hibrida con el plásmido pRM52 (Ejemplo 4) que ha sido digerido con NdeI y XbaI. La mezcla de hibridación se transforma en TG1 recO de E. coli y las colonias individuales se rastrean según su contenido de plásmido. El plásmido deseado pAR33 se identifica por su modelo de restricción.
CACGACGCCACCACCACATATGCCCTGCACCCTGCCCTCC-3' (en el que el sitio NdeI está subrayado) se usa junto con la proteína RecA purificada y ATP_S, para formar un complejo de ADN-proteína triple estable que protege específicamente de la digestión el sitio NdeI interno en el módulo de rap 12. El plásmido protegido pAR32 se digiere con NdeI y XbaI, produciendo el inserto de cadena entera deseado (13,1 kbp), y este se hibrida con el plásmido pRM52 (Ejemplo 4) que ha sido digerido con NdeI y XbaI. La mezcla de hibridación se transforma en TG1 recO de E. coli y las colonias individuales se rastrean según su contenido de plásmido. El plásmido deseado pAR33 se identifica por su modelo de restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transforman aproximadamente 5 \mug del
plásmido pAR33 en protoplastos de JC2 de S. erythraea y se
seleccionan las colonias estables resistentes a la tioestreptona. El
ADN total de dicha colonia se aísla y se analiza por hibridación
Southern, para confirmar que el plásmido se ha integrado
específicamente en la copia cromosómica de la parte del gen eryAIII
que codifica la tioesterasa/ciclasa del extremo
C-terminal. Esta cepa se denomina JC2/pAR33 de
S. erythraea.
Se inocula JC2/pAR33 de S. erythraea en
medio sacarosa-succinato que contienen 50 \mug/ml
de tioestreptona, y se deja crecer durante cinco días a
28-30%C. Después de este tiempo, el caldo se filtra,
y se extrae dos veces con un volumen igual de acetato de etilo, y
los extractos de acetato de etilo combinados se secan sobre sulfato
de sodio anhidro y se elimina el acetato de etilo por evaporación
bajo presión reducida. La MS por electropulverización del residuo
mostró la presencia de
Ac-2-nor-3-epi-TKL
(III, R=Me) y
2-nor-3-epi-TKL
(III, R=Et).
\vskip1.000000\baselineskip
Construcción de un híbrido de triquetida lactona
sintasa que contiene el dominio de carga de ery y la tioesterasa
terminadora de cadena/ciclasa de ery, y los módulos 11 y 12 de la
PKS de rap.
Este ejemplo requiere la construcción inicial de
cinco plásmidos separados, cuatro albergando elementos separados
del constructo objetivo, y un quinto albergando un gen que confiere
resistencia a la tetraciclina. Los insertos en estos plásmidos se
combinan secuencialmente mediante técnicas de ADN recombinante
estándar in vitro para formar el plásmido pAR5. Tres etapas
de clonación adicionales conducen al plásmido de expresión final
pAR8 (Figura 14).
El segmento del gen de AI de ery desde el
nucleótido 1 al nucleótido 1673, que codifica el didominio de carga
AT-ACP, se amplificó por PCR empleando el
procedimiento de CloneAmp con los dos oligodesoxinucleótidos
siguientes como cebadores:
y el plásmido pBK6.12 (Ejemplo 5)
como plantilla, para dar el plásmido
pARLD.
El segmento del gen de rapC de S.
hygroscopicus (Schwecke, T. et al. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA (1995) 92:7839-7843) del
nucleótido 112 al nucleótido 2095, el extremo
5'-final del ADN que codifica el módulo de rap 11,
se amplifica por PCR empleando el procedimiento CloneAmp con los dos
oligodesoxinucleótidos siguientes como cebadores:
5'-AUGGAGAUCUCUCCGCTAGCGATTGTGGGTATGGCG-3'
y
5'-ACGCGUACUAGUCCATGCATCTG
CAGCACGGCGGCCTCATCACCGGA-3' y el ADN del bacteriófago recombinante _\lambda-1C (Schwecke, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:78397843) como plantilla. Se digieren aproximadamente 30-60 ng del producto PCR (2,0 kbp) con la uracilo ADN glicosilasa durante 30 minutos a 37ºC en presencia de 25 ng de ADN del vector de pAMP18, la mezcla se enfría en hielo y se transforma en TG1 recO de E. coli y se comprueban las colonias individuales según su contenido de plásmido. El plásmido deseado (4,7 kbp) se identifica por su mapa de restricción y se denomina pAR12.
CAGCACGGCGGCCTCATCACCGGA-3' y el ADN del bacteriófago recombinante _\lambda-1C (Schwecke, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:78397843) como plantilla. Se digieren aproximadamente 30-60 ng del producto PCR (2,0 kbp) con la uracilo ADN glicosilasa durante 30 minutos a 37ºC en presencia de 25 ng de ADN del vector de pAMP18, la mezcla se enfría en hielo y se transforma en TG1 recO de E. coli y se comprueban las colonias individuales según su contenido de plásmido. El plásmido deseado (4,7 kbp) se identifica por su mapa de restricción y se denomina pAR12.
El segmento del gen de rapC de S.
hygroscopicus (Schwecke, T. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA (1995) 92:7839-7843) del
nucleótido 7405 al nucleótido 9396, el extremo
3'-final del ADN que codifica el módulo de rap 12,
se amplifica por PCR empleando el procedimiento CloneAmp con los dos
oligodesoxinucleótidos siguientes como cebadores:
5'-ACGCGUACUAGUCCATGCATTCCCGGAGCGGCGATCTGTGG-3'
y 5'-AUGGAGAUCUCUCCCGCGGCC
GCGCTGTCACGCACCAGCTTCAGCAGTGCGTC-3' y el ADN del bacteriófago recombinante \lambda-1C (Schwecke, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:7839-7843) como plantilla. Se digieren aproximadamente 30-60 ng del producto PCR (2,0 kbp) con la uracilo ADN glicosilasa durante 30 minutos a 37ºC en presencia de 25 ng de ADN del vector de pAMP18, la mezcla se enfría en hielo y se transforma en TGIrecO de E. coli y se comprueban las colonias individuales según su contenido de plásmido. El plásmido deseado (4,7 kbp) se identifica por su mapa de restricción y se denomina pAR12.
GCGCTGTCACGCACCAGCTTCAGCAGTGCGTC-3' y el ADN del bacteriófago recombinante \lambda-1C (Schwecke, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:7839-7843) como plantilla. Se digieren aproximadamente 30-60 ng del producto PCR (2,0 kbp) con la uracilo ADN glicosilasa durante 30 minutos a 37ºC en presencia de 25 ng de ADN del vector de pAMP18, la mezcla se enfría en hielo y se transforma en TGIrecO de E. coli y se comprueban las colonias individuales según su contenido de plásmido. El plásmido deseado (4,7 kbp) se identifica por su mapa de restricción y se denomina pAR12.
El segmento de 1,3 kbp del gen eryAIII, que se
extiende por 132 nucleótidos de 3' del codón de parada de eryAIII a
un sitio KpnI, y codifica la tioesterasa/ciclasa de terminación de
la cadena del extremo C-terminal de DEBS, se
amplifica por PCR empleando el procedimiento CloneAmp con los dos
oligodesoxinucleótidos siguientes como cebadores:
5'-ACGCGUACUAGUCCGCGGCCGCGATCCTCGGGCATTCCAGC-3'
y 5'-AUGGAGAUCUCUAAG
CATTGGTAACTGTC-3', y el plásmido pEXDB3 (Roberts, G. A. et al. Eur J. Biochem. (1993) 214:305311) como plantilla. Se digieren aproximadamente 30-60 ng del producto PCR (1,3 kbp) con la uracilo ADN glicosilasa durante 30 minutos a 37ºC en presencia de 25 ng del ADN del vector de pAMPl8, la mezcla se enfría en hielo y se transforma en TG1 recO de E. coli y las colonias individuales se comprueban según su contenido de plásmido. El plásmido deseado (4,0 kbp) se identifica por su mapa de restricción y se denomina pARTE.
CATTGGTAACTGTC-3', y el plásmido pEXDB3 (Roberts, G. A. et al. Eur J. Biochem. (1993) 214:305311) como plantilla. Se digieren aproximadamente 30-60 ng del producto PCR (1,3 kbp) con la uracilo ADN glicosilasa durante 30 minutos a 37ºC en presencia de 25 ng del ADN del vector de pAMPl8, la mezcla se enfría en hielo y se transforma en TG1 recO de E. coli y las colonias individuales se comprueban según su contenido de plásmido. El plásmido deseado (4,0 kbp) se identifica por su mapa de restricción y se denomina pARTE.
El segmento de 1,3 kbp del plásmido pBR322 que
contiene el gen de la resistencia a la tetraciclina se amplifica
por el procedimiento CloneAmp con los dos oligodesoxinucleótidos
siguientes como cebadores: 5'-ACGC
GUACUAGUATCTAGACCATGCATGTTTGACAGCTTATCATC-3' y 5'-AUGGAGAUCUCUATCTAGACCATG
CATGCCGCCGGCTTCCATTCA-3' y el plásmido pBR322 como plantilla. Se digieren aproximadamente 30-60 ng del producto PCR (1,3 kbp) con la uracilo ADN glicosilasa durante 30 minutos a 37ºC en presencia de 25 ng de ADN del vector de pAMP18, la mezcla se enfría en hielo y se transforma en TGIrecO de E. coli y se comprueban las colonias individuales según su contenido de plásmido. El plásmido deseado (4,0 kbp) se identifica por su mapa de restricción y se denomina pARTr.
GUACUAGUATCTAGACCATGCATGTTTGACAGCTTATCATC-3' y 5'-AUGGAGAUCUCUATCTAGACCATG
CATGCCGCCGGCTTCCATTCA-3' y el plásmido pBR322 como plantilla. Se digieren aproximadamente 30-60 ng del producto PCR (1,3 kbp) con la uracilo ADN glicosilasa durante 30 minutos a 37ºC en presencia de 25 ng de ADN del vector de pAMP18, la mezcla se enfría en hielo y se transforma en TGIrecO de E. coli y se comprueban las colonias individuales según su contenido de plásmido. El plásmido deseado (4,0 kbp) se identifica por su mapa de restricción y se denomina pARTr.
El plásmido pARLD se digiere con NheI e HindIII,
y se hibrida al inserto de 2,0 kbp de NheI-HindIII
obtenido a partir del plásmido pAR11. La mezcla de hibridación se
transforma en TGIrecO de E. coli y se comprueban las
colonias individuales según su contenido de plásmido. El plásmido
deseado se identifica por su mapa de restricción y se denomina
pAR1.
El plásmido pAR1 se lineariza con NsiI y se
hibrida con el fragmento de NsiI a partir de pARTr. La mezcla de
hibridación se transforma en TGIrecO de E. coli y se
comprueban las colonias individuales según su contenido de
plásmido. El plásmido deseado se identifica por su mapa de
restricción y se denomina pAR2.
El plásmido pAR2 se digiere con SpeI y XbaI y el
inserto se hibrida con el plásmido pAR12 que se ha linearizado con
SpeI. La mezcla de hibridación se transforma en TGIrecO de E.
coli y se comprueban las colonias individuales según su
contenido de plásmido. El plásmido deseado se identifica por su mapa
de restricción y se denomina pAR3.
El plásmido pAR3 se digiere con NsiI y el vector
se hibrida al fragmento NsiI de pARTr, que contiene el gen de
resistencia a la tetraciclina. La mezcla de hibridación se
transforma en TGIrecO de E. coli y las colonias
individuales, cultivadas en presencia de tetraciclina (12,5
\mug/ml), se comprueban según su contenido de plásmido. El
plásmido deseado se identifica por su mapa de restricción y se
denomina pAR4.
El plásmido pAR4 se digiere con NotI y XbaI y se
hibrida con un fragmento NotI-XbaI obtenido por
digestión del plásmido pARTE. La mezcla de hibridación se
transforma en TGIrecO de E. coli y las colonias individuales,
cultivadas en presencia de tetraciclina (12,5 \mug/ml), se
comprueban según su contenido de plásmido. El plásmido deseado se
identifica por su mapa de restricción y se denomina pAR5.
\newpage
Un segmento de 7,2 kbp del gen de rapC de S.
hygroscopicus se escinde del cósmido 13 (Schwecke, T. et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995)
92:7839-7843) usando BstXI y NdeI, se
purifica por electroforesis de gel, y se hibrida con pares de
plásmido que también se han digerido con BstXI y NdeI. La mezcla de
hibridación se transforma en TGIrecO de E. coli y las
colonias individuales, cultivadas en presencia de tetraciclina
(12,5 \mug/ml), se comprueban según su contenido de plásmido. El
plásmido deseado (11,9 kbp) se identifica por su mapa de
restricción y se denomina pAR5-2.
Un segmento de 3,0 kbp del plásmido
pAR5-3 se escinde por digestión con NdeI, se
purifica por electroforesis de gel, y se hibrida con el plásmido
pAR5-2 que había sido linearizado con NdeI. La
mezcla de hibridación se transforma en TGIrecO de E. coli y
las colonias individuales, cultivadas en presencia de tetraciclina
(12,5 \mug/ml), se comprueban según su contenido de plásmido. El
plásmido deseado (14,9 kbp) se identifica por su mapa de
restricción y se denomina pAR5-3.
Un fragmento de 12,2 kbp del plásmido
pAR5-3 se escinde usando PacI y XbaI, se purifica
por electroforesis de gel, y se hibrida con el plásmido pRM52
(Ejemplo 4) que había sido cortado con PacI y XbaI. La mezcla de
hibridación se transforma en TGIrecO de E. coli y las
colonias individuales, cultivadas en presencia de tetraciclina
(30,3 Ug/ml), se comprueban según su contenido de plásmido. El
plásmido deseado (14,9 kbp) se identifica por su mapa de
restricción y se denomina pAR8.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usan aproximadamente 5-10
\mug de pAR8, aislado de DH1OB de E. coli (pAR8) para
transformar protoplastos de JC2 de S. erythraea y se
seleccionan las colonias estables resistentes a la tioestreptona.
Una de estas colonias se selecciona y el ADN total se prepara para
el análisis de hibridación Southern, para confirmar que el plásmido
se ha integrado específicamente en la copia cromosómica de la parte
del gen eryAIII que codifica la tioesterasa/ciclasa del extremo
C-terminal. Esta cepa se denomina JC2/pAR8 de S.
erythraea.
Se escoge una colonia de JC2/pAR8 de S.
erythraea y se transfiere al medio
sacarosa-succinato suplementado con 50 \mug/ml de
tioestreptona y se deja crecer a 30ºC. Después de 3 días, el caldo
se filtra y se extrae dos veces con un volumen igual de acetato de
etilo. Los extractos de acetato de etilo combinados se secan sobre
sulfato de sodio anhidro y se concentran bajo presión reducida. La
GC-MS del residuo muestra la presencia de
2,4-bisnor-3-epi-TKL
(IV, R=E+) y
(Ac)-2,4-bisnor-3-epi-TKL
(IV, R=Me).
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pE1A2TE (como el plásmido
pElA2TE-2 también descrito en este documento)
consiste en un plásmido derivado de pT7.7 que contiene un gen de
PKS Tipo I híbrido que comprende el módulo de carga de ery, el
primer módulo de extensión de la PKS de ery, después el segundo
módulo de extensión de la PKS de avr, y la tioesterasa de la PKS de
ery. Se construye vía varios plásmidos intermedios como sigue
(Figura 15).
El plásmido pVE1446 que contiene una parte de
los genes de la PKS de avermectina se obtuvo a partir de ATCC 68250
de E. coli. El plásmido pVE1446 se digirió con BamHI y el
fragmento de 7,0 kbp entre las coordenadas 6,05 y 13,05 se purificó
por electroforesis de gel y se hibridó en el plásmido pUC119 que
había sido linearizado con BamHI. La mezcla de hibridación se usó
para transformar TG1 recO de E. coli y se comprobó el
contenido del plásmido de las colonias individuales. De las dos
posibles orientaciones del inserto de BamHI pIG70 se seleccionó
aquella en la que se obtenían, cuando se digería con fragmentos
PstI, aproximadamente 2,0 y 8,6 kbp y, cuando se digería con
fragmentos EcoRI, en la que se obtenían de aproximadamente 5,1 y 5,5
kbp.
El plásmido pVE1446 que contiene una parte de
los genes de la PKS de avermectina se obtuvo a partir de ATCC 68250
de E. coli. El plásmido pVE1446 se digirió con BamHI y el
fragmento de 7,1 kbp entre las coordenadas 13,05 y 20,15 se
purificó por electroforesis de gel y se hibridó en el plásmido
pUC119 que había sido linearizado con BamHI. La mezcla de
hibridación se usó para transformar TG1 recO de E. coli y se
comprobó el contenido de plásmido de las colonias individuales. De
las dos orientaciones posibles del inserto de BamHI pIG71 se
seleccionó aquella que, cuando se digería con EcoRI y XhoI, se
obtenían 2 fragmentos de aproximadamente 5 kbp.
El pIG70 se cortó con PstI y se rehibridó. El
pIG70\DeltaPst se aisló después de la transformación en TG1 recO
de E. coli.
El pIG70 se cortó con EcoRI y se rehibridó. El
pIG70\DeltaEco se aisló después de la transformación en TG1 recO
de E. coli.
El pIG71 se cortó con SacI y se rehibridó. El
pIG71\DeltaSac se aisló después de la transformación en TG1 recO
de E. coli.
Se usaron 50 pmol de cada uno de los
oligonucleótidos sintéticos 8985
(5'-GAGCAGTCGTTCCGAGATCTCGGC
TTCGATTCA-3'), que introdujo un sitio BglII, y 9204 (5'-GGGAGGAGATCAGATCCCAGAAGT-3') por PCR para amplificar un producto de 300 bp de 60 ng de pIG70\DeltaEco. El producto PCR se reparó por el final, se fosforiló y se hibridó en pUC18 que había sido linearizado con SmaI y se desfosforiló. La mezcla de hibridación se usó para transformar TG1 recO de E. coli y se comprobó el contenido de plásmido de las colonias individuales. La orientación de pIGPCRstart fue identificada por una doble digestión con enzima de restricción con EcoRI y BglII para dar un modelo que incluía un fragmento de 300 bp.
TTCGATTCA-3'), que introdujo un sitio BglII, y 9204 (5'-GGGAGGAGATCAGATCCCAGAAGT-3') por PCR para amplificar un producto de 300 bp de 60 ng de pIG70\DeltaEco. El producto PCR se reparó por el final, se fosforiló y se hibridó en pUC18 que había sido linearizado con SmaI y se desfosforiló. La mezcla de hibridación se usó para transformar TG1 recO de E. coli y se comprobó el contenido de plásmido de las colonias individuales. La orientación de pIGPCRstart fue identificada por una doble digestión con enzima de restricción con EcoRI y BglII para dar un modelo que incluía un fragmento de 300 bp.
Se usaron 50 pmol de cada uno de los
oligonucleótidos sintéticos 8986
(5'-GAGGGAGTCGAACCGAGATCTCG
GAACGCGCGG-3'), que introdujo un sitio BglII, y 9205 (5'-GGGGGATCCTGGGGTCGGCCGGGCAGGGCAA-3') por PCR para amplificar un producto de 440 bp de 60 ng de pIG71\DeltaSac. El producto PCR se reparó por el final, se fosforiló y se hibridó en pUC18 que había sido linearizado con SmaI y se desfosforiló. La mezcla de hibridación se usó para transformar TG1 recO de E. coli y se comprobó el contenido de plásmido de las colonias individuales. La orientación de pIGPCRend se identificó por su modelo de digestión con enzima de restricción.
GAACGCGCGG-3'), que introdujo un sitio BglII, y 9205 (5'-GGGGGATCCTGGGGTCGGCCGGGCAGGGCAA-3') por PCR para amplificar un producto de 440 bp de 60 ng de pIG71\DeltaSac. El producto PCR se reparó por el final, se fosforiló y se hibridó en pUC18 que había sido linearizado con SmaI y se desfosforiló. La mezcla de hibridación se usó para transformar TG1 recO de E. coli y se comprobó el contenido de plásmido de las colonias individuales. La orientación de pIGPCRend se identificó por su modelo de digestión con enzima de restricción.
El plásmido pIGPCRstart se digirió con PstI y el
fragmento de 300 bp se purificó por electroforesis de gel y se
hibridó en el plásmido pIG70\DeltaPst que había sido linearizado
con PstI y se desfosforiló. La mezcla de hibridación se usó para
transformar TG1 recO de E. coli y se comprobó el contenido de
plásmido de las colonias individuales. Los plásmidos que contenían
la orientación correcta del inserto de PstI-PstI se
identificaron por la secuenciación del ADN.
El plásmido pIGstart+middle se digirió con BamHI
y el fragmento de 5,0 kbp se purificó por electroforesis de gel y
se hibridó en el plásmido pIGPCRend que había sido cortado con BamHI
y se desfosforiló. La mezcla de hibridación se usó para transformar
TG1 recO de E. coli y se comprobó el contenido de plásmido de
las colonias individuales. Los plásmidos que contenían la
orientación correcta del inserto de BamHI-BamHI se
identificaron por la secuenciación del ADN.
El plásmido pIGAve2Bgl se digirió con BglII y el
fragmento de 6 kbp se purificó por electroforesis de gel y se
hibridó en el plásmido pKW15 (Ejemplo 16) que había sido linearizado
con BglII y se desfosforiló. La mezcla de hibridación se usó para
transformar TG1 recO de E. coli y se comprobó el contenido de
plásmido de las colonias individuales. Los plásmidos que contenían
la orientación correcta del inserto de BglII-BglII
se identificaron por digestión por enzima de restricción con
EcoRI.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.850000\baselineskip
El plásmido pE1A2TE se digirió con NdeI y XbaI y
el fragmento de 11 kbp se purificó por electroforesis de gel y se
hibridó en el plásmido pRM52 (Ejemplo 4) que había sido cortado con
NdeI y XbaI. La mezcla de hibridación se usó para transformar TG1
recO de E. coli y se comprobó el contenido de plásmido de las
colonias individuales.
El plásmido pIG2 que había sido aislado a partir
de ET12567 de E. coli (MacNeil, D. J. et al.
Gene (1992) 111:61-68) se transformó
en protoplastos de S. coelicolor CH999 de E. coli y
las colonias estables resistentes a la tioestreptona se aislaron.
Se comprobó el contenido de plásmido de las colonias individuales y
la presencia del plásmido pIG2 se confirmó por su modelo de
restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pE1A2TE se digirió con NdeI y XbaI y
el fragmento de 11 kbp se purificó por electroforesis de gel y se
hibridó en el plásmido pCJR101 (Ejemplo 2) que había sido cortado
con NdeI y XbaI. La mezcla de hibridación se usó para transformar
TG1 recO de E. coli y se comprobó el contenido de plásmido de
las colonias individuales.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pKS22 es un vector derivado de
pNTEP2 que contiene una triquetida sintasa derivada de
DEBS1-TE con un dominio de KS2 en lugar del dominio
de KS1. El plásmido pKS22 se obtiene vía varios plásmidos
intermedios como sigue (Figura 16).
Para la amplificación por PCR para el plásmido
pMO07, se usaron los siguientes oligonucleótidos sintéticos como
cebadores mutagénicos, uno que contiene un sitio HindIII y otro un
sitio EcoRV: 5'-GTCTCAAGCTTCGGCAT
CAGCGGCACCAA-3' y 5'-CGTGCGATATCCCTGCTCGGCGAGCGCA-3'.
CAGCGGCACCAA-3' y 5'-CGTGCGATATCCCTGCTCGGCGAGCGCA-3'.
Para la amplificación por PCR para el plásmido
pMO08, se usaron los siguientes oligonucleótidos sintéticos como
cebadores mutagénicos, uno que contiene un sitio PstI y otro un
sitio HindIII: 5'-CATGGCCTGCAGGCTGCCCGGG
GAGGTCGACT-3' y 5'-CCCGAAGCTTGACACACCTGCCCGGCGCACCCCGT-3'.
GAGGTCGACT-3' y 5'-CCCGAAGCTTGACACACCTGCCCGGCGCACCCCGT-3'.
Para la amplificación por PCR para el plásmido
pMO09, se usaron los siguientes oligonucleótidos sintéticos como
cebadores mutagénicos, uno que contiene un sitio MunI y otro un
sitio PstI: 5'-GCGCGCCAATTGCGTGCA
CATCTCGAT-3' y 5'-CCTGCAGGCCATCGCGACGACCGCGACCGGTTCGCCG-3'.
CATCTCGAT-3' y 5'-CCTGCAGGCCATCGCGACGACCGCGACCGGTTCGCCG-3'.
La PCR se realizó en pNTEP2 como plantilla
usando la ADN polimerasa de Pwo y un ciclo de: 96ºC (1 minuto);
hibridación a 50ºC (3 minutos); y ampliación a 72ºC (1 minuto), y 25
ciclos de: 96ºC (1 minuto); hibridación a 50ºC (1 minuto); y
ampliación a 72ºC (1 minuto) en presencia de dimetilsulfóxido al 10%
(vol/vol). Los productos se repararon por el final y se clonaron en
pUC18 digerido con SmaI y la mezcla de hibridación se transformó en
DH 10B de E. coli. El ADN de plásmido se preparó a partir de
las colonias individuales. Los plásmidos deseados para pMO07 (3,8
kbp), pMO08 (3,9 kbp) y pMO09 (4,3 kbp) se identificaron por su
modelo de restricción y la secuenciación del ADN.
El plásmido pMO08 se digirió con HindIII, y el
inserto de 1,2 kbp se clonó en pMO07 que había sido digerido con
HindIII. La mezcla de hibridación se transformó en DH 10B de E.
coli. El plásmido deseado (5,0 kbp) se identificó por su modelo
de restricción y se denominó pMO10.
El plásmido pMO09 se digirió con PstI, y el
inserto de 1,6 kbp se clonó en pMO10 que había sido digerido con
PstI. La mezcla de hibridación se transformó en DH 10B de E.
coli. El plásmido deseado (6,6 kbp) se identificó por su modelo
de restricción y se denominó pMO11.
El plásmido pMO11 se digirió con MunI y EcoRV, y
el fragmento de 3,9 kbp se clonó en pNTEPH (véase más abajo) que
había sido digerido con MunI y EcoRV. La mezcla de hibridación se
transformó en DK 10B de E. coli. El plásmido deseado (13
kbp) se identificó por su modelo de restricción y se denominó
pKS22.
El plásmido pNTEPH se obtuvo a partir de pNTEP2
eliminando el sitio HindIII. El pNTEP2 se digirió con HindIII, la
proyección 5' se rellenó con ADN polimerasa I del Fragmento Klenow y
se rehibridó. El plásmido deseado (13,6 kbp) se identificó por su
modelo de restricción.
\global\parskip1.000000\baselineskip
El plásmido pIB018 es un vector derivado de
pCJR24 que contiene una triquetida sintasa derivada de DEBS1TE con
KS1 en lugar de KS2. El plásmido pIB018 se obtiene vía varios
plásmidos intermedios como sigue (Figura 17A).
Para la amplificación por PCR para el plásmido
pKSA, se usaron los siguientes oligonucleótidos sintéticos como
cebadores mutagénicos, uno que contiene un sitio PstI y otro un
sitio HindIII: 5'-GATGGCCTGCAGGCTGCCCGGC
GGTGTGAGCA-3' y 5'-GCCGAAGCTTGAGACCCCCGCCCGGCGCGGTCGC-3'.
GGTGTGAGCA-3' y 5'-GCCGAAGCTTGAGACCCCCGCCCGGCGCGGTCGC-3'.
Para la amplificación por PCR para el plásmido
pKSB, se usaron los siguientes oligonucleótidos sintéticos como
cebadores mutagénicos, uno que contiene un sitio EspI y otro un
sitio PstI: 5'-TGGCTTCGCTGGCGGACACGCT
CAG-3' y 5'-CCTGCAGGCCATGCCGACGATCGCGATCGGCT-3'.
CAG-3' y 5'-CCTGCAGGCCATGCCGACGATCGCGATCGGCT-3'.
Para la amplificación por PCR para el plásmido
pKSC, se usaron los siguientes oligonucleótidos sintéticos como
cebadores mutagénicos, uno que contiene un sitio HindIII y otro un
sitio BspEI: 5'-GTCAAGCTTCGGGGT
GAGCGGGACGAA-3' y 5'-GCGTCCGGACGTGGCTCCAGCA-3'
GAGCGGGACGAA-3' y 5'-GCGTCCGGACGTGGCTCCAGCA-3'
La PCR se realizó en pNTEP2 como plantilla
usando la ADN polimerasa de Pwo y un ciclo de: 96º (1 minuto);
hibridación a 50º (3 minutos); y ampliación a 72º (1 minuto), y 25
ciclos de: 96ºC (1 minuto); hibridación a 50ºC (1 minuto); y
ampliación a 72ºC (1 minuto) en presencia de dimetilsulfóxido al 10%
(vol/vol). Los productos se repararon por el final y se clonaron en
pUC18 digerido con SmaI y la mezcla de hibridación se transformó en
DH 10B de E. coli. El ADN de plásmido se preparó a partir de
colonias individuales. Los plásmidos deseados para pKSA (4,0 kbp),
se identificaron pKSB (4,2 kbp) y pKSC (3,2 kbp) por su modelo de
restricción.
El plásmido pKSA se digirió con PstI, y el
inserto de 1,2 kbp se clonó en pKSB que había sido digerido con
PstI. La mezcla de hibridación se transformó en DH 10B de E.
coli. El plásmido deseado (5,5 kbp) se identificó por su modelo
de restricción y se denominó pKSD.
El plásmido pKSC se digirió con HindIII, y el
inserto de 0,5 kbp se clonó en pKSC que había sido digerido con
HindIII. La mezcla de hibridación se transformó en DH 10B de E.
coli. El plásmido deseado (6,0 kbp) se identificó por su modelo
de restricción y se denominó pKSE.
El plásmido pKSE se digirió con EspI y BspeEI, y
el fragmento de 3,3 kbp se clonó en pUCTE que había sido digerido
con EspI y BspeEI. La mezcla de hibridación se transformó en DH 10B
de E. coli. El plásmido deseado (13,9 kbp) se identificó por
su modelo de restricción y se denominó pIB004.
El plásmido pIB004 se digirió con NdeI y XbaI, y
el inserto de 11,2 kbp se clonó en pCJR24 que había sido digerido
con NdeI y XbaI. La mezcla de hibridación se transformó en DH 10B de
E. coli. El plásmido deseado (15,9 kbp) se identificó por su
modelo de restricción y se denominó pIB018.
Aproximadamente 5 \mug del plásmido pIB018 se
transforman en protoplastos de NRRL 2338 de S. erythraea y
se aíslan las colonias estables resistentes a la tioestreptona. A
partir de diversas colonias, se obtiene el ADN total y se analiza
por hibridación Southern, para confirmar que el plásmido se ha
integrado en el extremo del módulo 2 de eryAI.
Se inocula NRRL2338/pIB018 de S.
erythraea en caldo de soja tríptico que contiene 50 \mug/ml de
tioestreptona y se deja crecer durante tres días a 30ºC. 20 ml de
este cultivo de semilla se usan para inocular 400 ml de medio
sacarosa-succinato que contienen 50 \mug/ml de
tioestreptona en un matraz de 2L con un muelle sencillo para
reducir la aglutinación, se agita a 300 revoluciones por minuto.
Después de 6 días, el caldo se filtró, se ajustó a pH 4 y se
extrajo tres veces con un volumen igual de acetato de etilo. El
disolvente se eliminó por evaporación. Los productos de triquetida
lactona (10 mg/L) se identificaron por GC-MS y RMN.
El componente principal fue la \delta lactona del ácido (2R, 3S,
4S,
5R)-2,4-dimetil-3,5-dihidroxi-n-hexanoico;
también se encontró la \delta lactona del ácido (2R, 3S, 4S,
5R)-2,4-dimetil-3,5-dihidroxi-n-heptanoico:
Se identificaron los siguientes macrólidos por
HPLC/MS:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pIB017 es un vector derivado de
pCJR24 que contiene una sintasa triquetida derivada de DEBSITE con
KS2 en lugar de KS1 y KS1 en lugar de KS2. El plásmido pIB017 se
obtiene vía varios plásmidos intermedios como sigue (Figura
17B).
El plásmido pIB004 se digirió con EcoRV y EcoRI,
y el fragmento de 7,2 kbp se clonó en pKS22 que había sido digerido
con EcoRV y EcoRI. La mezcla de hibridación se transformó en DH 10B
de E. coli. El plásmido deseado (13,6 kbp) se identificó por
su modelo de restricción y se denominó pIB009.
El plásmido pIB009 se digirió con NdeI y XbaI, y
el inserto de 11,2 kbp se clonó en pCJR24 que había sido digerido
con NdeI y XbaI. La mezcla de hibridación se transformó en DH 10B de
E. coli. El plásmido deseado (15,9 kbp) se identificó por su
modelo de restricción y se denominó pIB017.
Aproximadamente 5 \mug del plásmido pIB017 se
transforman en protoplastos de NRRL 2338 de S. erythraea y
se aíslan las colonias estables resistentes a la tioestreptona. A
partir de diversas colonias, se obtiene el ADN total y se analiza
por hibridación Southern, para confirmar que el plásmido se ha
integrado en el extremo del módulo 2 de
eryAI.
eryAI.
Se inocula NRRL2338/pIB017 de S.
erythraea en caldo de soja tríptico que contiene 50 \mug/ml de
tioestreptona y se deja crecer durante tres días a 30ºC. 20 ml de
este cultivo de semilla se usan para inocular 400 ml de medio
sacarosa-succinato que contienen 50 \mug/ml de
tioestreptona en un matraz de 2L con un muelle sencillo para
reducir la aglutinación, se agita a 300 revoluciones por minuto.
Después de 6 días, el caldo se filtró, se ajustó a pH 4 y se
extrajo tres veces con un volumen igual de acetato de etilo. El
disolvente se eliminó por evaporación. El análisis de triquetida
lactonas (0,4 mg/L) se hizo por GC-MS, rotación
óptica y RMN. Los compuestos aislados se encontró que eran \delta
lactona del ácido (2R, 3S, 4S,
5S)-2,4-dimetil-3,5-dihidroxi-n-hexanoico;
y \delta lactona del ácido (2R, 3S, 4S,
5S)-2,4-dimetil-3,5-dihidroxi-n-heptanoico.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se identificaron los siguientes macrólidos por
HPLC/MS:
El plásmido pIBO1S es un vector derivado de
pCJR24 que contiene una sintasa diquetida con LD, KS1, AT2, KR2,
ACP2/6 y TE. El plásmido pIBO1S se obtiene vía varios plásmidos
intermedios como sigue (Figura 18).
El plásmido pIB009 se digirió con PstI para
eliminar un fragmento de 4,4 kbp, y se rehibridó. La mezcla de
hibridación se transformó en DH 10B de E. coli. El plásmido
deseado (9,2 kbp) se identificó por su modelo de restricción y se
denominó pIBO11.
El plásmido pIBO11 se digirió con NdeI y XbaI, y
el inserto de 6,8 kbp se clonó en pCJR24 que había sido digerido
con NdeI y XbaI. La mezcla de hibridación se transformó en DH 10B de
E. coli. El plásmido deseado (9,2 kbp) se identificó por su
modelo de restricción y se denominó pIBO1S.
Aproximadamente 5 \mug del plásmido pIBO1S se
transforman en protoplastos de JC2 de S erythraea y se
aíslan las colonias estables resistentes a la tioestreptona. A
partir de diversas colonias, se obtiene el ADN total y se analiza
por hibridación Southern, para confirmar que el plásmido se ha
integrado en el TE.
Se inocula JC2/pIB015 de S. erythraea en
caldo de soja tríptico que contiene 50 \mug/ml tioestreptona y se
deja crecer durante tres días a 30ºC. 20 ml de este cultivo de
semilla se usan para inocular 400 ml de medio
sacarosa-succinato que contienen 50 \mug/ml
tioestreptona, 0,1 mg/ml de ácido 4-pentinoico y 0,1
mg/ml de ácido
3-tetradecilsulfanil-propionico en
un matraz de 2L con un muelle sencillo para reducir la aglutinación,
se agita a 300 revoluciones por minuto. Después de 6 días el caldo
se filtró, se ajustó a pH 3 y se extrajo tres veces con un volumen
igual de acetato de etilo. El disolvente se eliminó por evaporación.
El análisis de ácido diquetida se hizo por GC-MS
equipada con una columna quiral
(Hydrodex-\beta-PM, ID 25 m x 0,25
mm (Machery-Nagel GmbH & CoKG, Alemania))
usando 4 estereoisómeros sintéticos del ácido diquetida como
estándares. El compuesto producido se identificó como ácido (2R,
3S)-2-metilo-3-hidroxi-pentanoico.
Aproximadamente 5 \mug del plásmido pIBO1S se
transforman en protoplastos de ORF5 de S. erythraea y se
aíslan las colonias estables resistentes a la tioestreptona. A
partir de diversas colonias, se obtiene el ADN total y se analiza
por hibridación Southern, para confirmar que el plásmido se ha
integrado en el módulo 2 de eryAI.
Se inocula ORF5/pIB015 de S. erythraea en
caldo de soja tríptico que contiene 50 \mug/ml de tioestreptona y
se deja crecer durante tres días a 30ºC. 20 ml de este cultivo de
semilla se usan para inocular 400 ml de medio
sacarosa-succinato que contienen 50 \mug/ml de
tioestreptona en un matraz de 2L con un muelle sencillo para
reducir la aglutinación, se agita a 300 revoluciones por minuto.
Después de 6 días, el caldo se filtró y se extrajo tres veces con
un volumen igual de acetato de etilo. El disolvente se analizó por
ESMS. Se descubrieron los siguientes compuestos:
El plásmido pIB016 es un vector derivado de
pCJR24 que contiene una sintasa diquetida con LD, KS2, AT2, KR2,
ACP2/6 y TE. El plásmido pIB016 se obtiene vía varios plásmidos
intermedios como sigue (Figura 18).
El plásmido pIB009 se digirió con HindIII para
eliminar un fragmento de 4,4 kbp, y se rehibridó. La mezcla de
hibridación se transformó en DH 10B de E. coli. El plásmido
deseado (9,2 kbp) se identificó por su modelo de restricción y se
denominó pIB012.
El plásmido pIB012 se digirió con NdeI y XbaI, y
el inserto de 6,8 kbp se clonó en pCJR24 que había sido digerido
con NdeI y XbaI. La mezcla de hibridación se transformó en DH 10B de
E. coli. El plásmido deseado (9,2 kbp) se identificó por su
modelo de restricción y se denominó pIB016.
Aproximadamente 5 \mug del plásmido pIB016 se
transforman en protoplastos de ORF5 de S. erythraea y se
aíslan las colonias estables resistentes a la tioestreptona. A
partir de diversas colonias, se obtiene el ADN total y se analiza
por hibridación Southern, para confirmar que el plásmido se ha
integrado en el módulo 2 de eryAI.
Se inocula ORF5/pIB016 de S. erythraea en
caldo de soja tríptico que contiene 50 \mug/ml de tioestreptona y
se deja crecer durante tres días a 30ºC. 20 ml de este cultivo de
semilla se usan para inocular 400 ml de medio
sacarosa-succinato que contienen 50 \mug/ml de
tioestreptona en un matraz de 2L con un muelle sencillo para
reducir la aglutinación, se agita a 300 revoluciones por minuto.
Después de 6 días, el caldo se filtró y se extrajo tres veces con
un volumen igual de acetato de etilo. El extracto se analizó por
ESMS. Se descubrieron los siguientes compuestos:
El plásmido pJLK1S es un plásmido basado en
pCJR24 que contiene un gen de PKS que comprende el módulo de carga
de ery, el primer y el segundo módulos de extensión de la PKS de ery
y la tioesterasa de terminación de cadena de ery salvo que el
segmento de ADN entre el extremo de la aciltransferasa y el
principio de ACP del segundo módulo de extensión ery ha sido
sustituido por el segmento equivalente del módulo 13 de la PKS de
rap. Se construyó vía varios plásmidos intermedios como sigue
(Figura 19).
Se amplificó el fragmento de ADN de
aproximadamente 0,46 kbp del gen eryAI de S. erythraea por
PCR usando como cebadores los oligonucleótidos sintéticos:
5'-GGAGTACTGCGAGGGCGTGGGCAT-3' y
5'-CACCTAG
GACCGCTTCCCAGTCGACC-3' y el plásmido pNTEPH como plantilla. El producto PCR se trata con la polinucleótido T4 quinasa y luego se hibrida con el plásmido pUC18, que había sido linearizado mediante digestión con SmaI y luego se había tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de hibridación se usó para transformar DH1OB de E. coli y se comprobó el contenido de plásmido de las colonias individuales. El plásmido deseado pJLKO1 se identificó por su modelo de restricción y secuenciación de ADN.
GACCGCTTCCCAGTCGACC-3' y el plásmido pNTEPH como plantilla. El producto PCR se trata con la polinucleótido T4 quinasa y luego se hibrida con el plásmido pUC18, que había sido linearizado mediante digestión con SmaI y luego se había tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de hibridación se usó para transformar DH1OB de E. coli y se comprobó el contenido de plásmido de las colonias individuales. El plásmido deseado pJLKO1 se identificó por su modelo de restricción y secuenciación de ADN.
Se amplificó el fragmento de ADN de
aproximadamente 1,47 kbp del gen erykI de S. erythraea por
PCR usando como cebadores los oligonucleótidos sintéticos:
5'-TACCTAGGCCGGGCCGGACTGGTCGACCTGCCGGGTT-3'
y
5'-ATCCTCAGGCTCTCCGTCTCCGGTTCTCC-3'
y el plásmido pNTEPH como plantilla. El producto PCR se trata con la
polinucleótido T4 quinasa y luego se hibrida con el plásmido pUC18,
que había sido linearizado mediante digestión con SmaI y luego se
había tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de hibridación se
usó para transformar DH1OB de E. coli y se comprobó el
contenido de plásmido de las colonias individuales. El plásmido
deseado pJLK08 se identificó por su modelo de restricción y
secuenciación de ADN.
Se amplificó el fragmento de ADN de
aproximadamente 1,12 kbp del gen eryAI de S. erythraea por
PCR usando como cebadores los oligonucleótidos sintéticos:
5'-TACCTGAGGGACCGGCTAGCGGGTCTGCCGCGTG-3'
y
5'-CTTCTAGACTATGAATTCCCTCCGCCCAGC-3'
y el plásmido pNTEPH como plantilla. El producto PCR se trata con
la polinucleótido T4 quinasa y luego se hibrida con el plásmido
pUC18, que había sido linearizado mediante digestión con SmaI y
luego se había tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de
hibridación se usó para transformar DH1OB de E. coli y se
comprobó el contenido de plásmido de las colonias individuales. El
plásmido deseado pJLK09 se identificó por su modelo de restricción
y secuenciación de ADN.
El plásmido pJLK08 se digirió con PstI y Bsu36I
y el inserto se hibridó con el plásmido pJLK09 que había sido
digerido con PstI y Bsu36I. La mezcla de hibridación se usó para
transformar DH1OB de E. coli y se comprobó el contenido de
plásmido de las colonias individuales. El plásmido deseado pJLK10 se
identificó por su modelo de restricción.
El plásmido pJLK01 se digirió con PstI y AvrII y
el inserto se hibridó con el plásmido pJLK10 que había sido
digerido con PstI y AvrII. La mezcla de hibridación se usó para
transformar DH1OB de E. coli y se comprobó el contenido de
plásmido de las colonias individuales. El plásmido deseado pJLK11 se
identificó por su modelo de restricción.
El plásmido pJLK11 se digirió con ScaI y el
fragmento de 4,7 kbp se hibridó con el plásmido pCJR34 que había
sido digerido con ScaI. La mezcla de hibridación se usó para
transformar DH1OB de E. coli y se comprobó el contenido de
plásmido de las colonias individuales. El plásmido deseado pJLK12 se
identificó por su modelo de restricción. El pCJR34 se construyó del
modo siguiente. El pNTEP2 se digirió con NdeI y XbaI y se clonó en
pUC19 que había sido previamente digerido con NdeI y XbaI. El
plásmido deseado pCJR34 se identificó por su modelo de
restricción.
El plásmido pJLK12 se digirió con NdeI y XbaI y
el fragmento de 11,2 kbp se hibridó con el plásmido pCJR24 que
había sido digerido con NdeI y XbaI. La mezcla de hibridación se usó
para transformar DH1OB de E. coli y se comprobó el contenido
de plásmido de las colonias individuales. El plásmido deseado pJLK13
se identificó por su modelo de restricción.
El ADN de aproximadamente 3,3 kbp del gen rapC
de S. hygroscopicus que codificaba el bucle de reducción del
módulo 13 se amplificó por PCR usando como cebadores los
oligonucleótidos sintéticos:
5'-CGCCTAGGCACCAC
CACAACCCGGGTACTGGACC-3' y 5'-TAGCTAGCCGGGCGCTCAGGGGCTGCGAGCCGACCT-3' y el cósmido cos 31 (Schwecke, T. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7839-7843) como plantilla. El producto PCR se trata con la polinucleótido T4 quinasa y luego se hibrida con el plásmido pUC18, que había sido linearizado mediante digestión con SmaI y luego se había tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de hibridación se usó para transformar DH1OB de E. coli y se comprobó el contenido de plásmido de las colonias individuales. El plásmido deseado pJLKl4 se identificó por su modelo de restricción y secuenciación de ADN.
CACAACCCGGGTACTGGACC-3' y 5'-TAGCTAGCCGGGCGCTCAGGGGCTGCGAGCCGACCT-3' y el cósmido cos 31 (Schwecke, T. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7839-7843) como plantilla. El producto PCR se trata con la polinucleótido T4 quinasa y luego se hibrida con el plásmido pUC18, que había sido linearizado mediante digestión con SmaI y luego se había tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de hibridación se usó para transformar DH1OB de E. coli y se comprobó el contenido de plásmido de las colonias individuales. El plásmido deseado pJLKl4 se identificó por su modelo de restricción y secuenciación de ADN.
El plásmido pJLK14 se digirió con AvrII y NheI y
el fragmento de 3,3 kbp se hibridó con el plásmido pJLK13 que había
sido digerido con AvrII y NheI. La mezcla de hibridación se usó para
transformar DH1OB de E. coli y se comprobó el contenido de
plásmido de las colonias individuales. El plásmido deseado pJLK15 se
identificó por su modelo de restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
Aproximadamente 5 \mug del plásmido pJLK15 se
transforman en protoplastos de JC2 de S. erythraea y se
aíslan las colonias estables resistentes a la tioestreptona. A
partir de diversas colonias, se obtiene el ADN total y se analiza
por hibridación Southern, para confirmar que el plásmido se ha
integrado en el TE. El JC2/pJLK15 se inocula en caldo de soja
tríptico que contiene 50 \mug/ml de tioestreptona y se deja crecer
durante tres días a 30ºC. 20 ml de este cultivo de semilla se usan
para inocular 400 ml de medio sacarosa-succinato
que contienen 50 \mug/ml de tioestreptona en un matraz de 2L con
un muelle sencillo para reducir la aglutinación, se agita a 300
revoluciones por minuto. Después de 6 días, el caldo se filtró, se
ajustó a pH 3 y se extrajo tres veces con un volumen igual de
acetato de etilo. El disolvente se eliminó por evaporación y el
residuo se disolvió en metanol (5 ml) y se analizó mediante
espectroscopia de masas por electropulverización. Los productos
principales se identificaron como \delta-lactona
del ácido (2R, 4R,
5R)-2,4-dimetil-5-hidroxi-hexanoico
(C_{8}H_{14}O_{2}; MH^{+}: calc. 143,1072, encontrado
143,110; MNa^{+}: calc. 165,0891, encontrado 165,093) y como
\delta-lactona del ácido (2R, 4R,
5R)-2,4-dimetil-5-hidroxi-n-heptanoico
(C_{8}H_{14}O_{2}; MH^{+}: calc. 156,1150, encontrado
156,118; MNa^{+}: calc. 178,0970, encontrado 178,099).
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pJLK18 es un plásmido basado en
pCJR24 que contiene un gen PKS que comprende el módulo de carga de
ery, el primer y el segundo módulo de extensión de la PKS de ery y
la tioesterasa terminadora de cadena de ery salvo que el segmento
de ADN entre el final de la aciltransferasa y el principio de ACP
del segundo módulo de extensión ery ha sido sustituido por el
segmento equivalente del módulo 4 de la PKS de rap. Se construyó
vía varios plásmidos intermedios como sigue (Figura 20).
Se amplificó por PCR el fragmento de ADN de
aproximadamente 2,8 kbp del gen rapA de S. hygroscopicus que
codificaba el bucle de reducción del módulo 4 usando como cebadores
los oligonucleótidos sintéticos: 5'-CCTAGGCAC
CACCACGGCCCGGGTGCTGGACCTT-3' y 5'-CCTCAGGCTGTCACCGGTAGAGGCGGCCCT-3' y el cósmido cos 25 (Schwecke, T. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7839-7843) como plantilla. El producto PCR se trata con la polinucleótido T4 quinasa y luego se hibrida con el plásmido pUCl8, que había sido linearizado mediante digestión con SmaI y luego se había tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de hibridación se usó para transformar DH1OB de E. coli y se comprobó el contenido de plásmido de las colonias individuales. El plásmido deseado pJLK16 se identificó por su modelo de restricción y secuenciación de ADN.
CACCACGGCCCGGGTGCTGGACCTT-3' y 5'-CCTCAGGCTGTCACCGGTAGAGGCGGCCCT-3' y el cósmido cos 25 (Schwecke, T. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7839-7843) como plantilla. El producto PCR se trata con la polinucleótido T4 quinasa y luego se hibrida con el plásmido pUCl8, que había sido linearizado mediante digestión con SmaI y luego se había tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de hibridación se usó para transformar DH1OB de E. coli y se comprobó el contenido de plásmido de las colonias individuales. El plásmido deseado pJLK16 se identificó por su modelo de restricción y secuenciación de ADN.
El plásmido pJLK16 se digirió con AvrII y Bsu36I
y el fragmento de 2,8 kbp se hibridó con el plásmido pJLKl2 que
había sido digerido con AvrII y Bsu36I. La mezcla de hibridación se
usó para transformar DH1OB de E. coli y se comprobó el
contenido de plásmido de las colonias individuales. El plásmido
deseado pJLK17 se identificó por su modelo de restricción.
\newpage
El plásmido pJLK17 se digirió con NdeI y XbaI y
el fragmento de 11,2 kbp se hibridó con el plásmido pCJR24 que
había sido digerido con NdeI y XbaI. La mezcla de hibridación se usó
para transformar DH1OB de E. coli y se comprobó el contenido
de plásmido de las colonias individuales. El plásmido deseado pJLK18
se identificó por su modelo de restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
Aproximadamente 5 \mug del plásmido pJLK18 se
usan para transformar protoplastos de JC2 de S. erythraea y
se aíslan las colonias estables resistentes a la tioestreptona. A
partir de diversas colonias, se obtiene el ADN total y se analiza
por hibridación Southern, para confirmar que el plásmido se ha
integrado en el TE. El JC2/pJLK18 de S. erythraea se inocula
en caldo de soja tríptico que contiene 50 \mug/ml de tioestreptona
y se deja crecer durante tres días a 30ºC. 20 ml de este cultivo de
semilla se usan para inocular 400 ml de medio
sacarosa-succinato que contienen 50 \mug/ml de
tioestreptona, 0,1 mg/ml de ácido 4-pentinoico y 0,1
mg/ml de ácido
3-tetradecilsulfanil-propionico en
un matraz de 2L con un muelle sencillo para reducir la aglutinación,
se agita a 300 revoluciones por minuto. Después de 6 días, el caldo
se filtró, se ajustó a pH 3 y se extrajo tres veces con un volumen
igual de acetato de etilo. El disolvente se eliminó por evaporación
y el residuo se disolvió en metanol (5 ml) y se analizó mediante
espectroscopia de masas por electropulverización. Los productos
principales se identificaron como ácido (E, 4R,
5R)-2,4-dimetil-5-hidroxi-n-2-hexenoico
(C_{8}H_{14}O_{3}; MH^{+}: calc. 159,1021, encontrado
159,098; MNa^{+}: calc. 181,0841, encontrado 181,079) y ácido (E,
4R,
5R)-2,4-dimetil-5-hidroxi-n-2-heptenoico
(C_{9}H_{16}O_{2}; MH^{+}: calc. 173,1178, encontrado
173,118; MNa^{+}: calc. 195,0997, encontrado 195,104).
\vskip1.000000\baselineskip
Para la amplificación por PCR de un fragmento de
ADN de aproximadamente 1,3 kbp para el plásmido pJLKl9, se usaron
los siguientes oligonucleótidos sintéticos como cebadores:
5'-GTCAAGCTTCGGGGTGAGCGGGACGAA-3' y
5'-ATCCTAGGACCGCTTCCCAGTCGACCGCGACA-3'.
La PCR se realizó en pNTEPH como plantilla. El producto PCR se
trata con la polinucleótido T4 quinasa y luego se hibrida con el
plásmido pUCl8, que había sido linearizado mediante digestión con
SmaI y luego se había tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de
hibridación se usó para transformar DH1OB de E. coli y se
comprobó el contenido de plásmido de las colonias individuales. El
plásmido deseado pJKLl9 se identificó por su modelo de
restricción.
El plásmido pIBO11 se digirió con HindIII y NdeI
y el fragmento de 2,9 kbp se clonó en pJKL19 que había sido
digerido con HindIII y NdeI. La mezcla de hibridación se usó para
transformar DH1OB de E. coli y se comprobó el contenido de
plásmido de las colonias individuales. El plásmido deseado pJKL20 se
identificó por su modelo de restricción.
El plásmido pJKL20 se digirió con AvrII y NdeI
clonado en pJLK15 que había sido digerido con AvrII y NdeI. La
mezcla de hibridación se usó para transformar DH1OB de E.
coli y se comprobó el contenido de plásmido de las colonias
individuales. El plásmido deseado pJKL21 se identificó por su modelo
de restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
Aproximadamente 5 \mug del plásmido pJKL21 se
transforman en protoplastos de JC2 y se aíslan las colonias
estables resistentes a la tioestreptona. A partir de diversas
colonias, se obtiene el ADN total y se analiza por hibridación
Southern, para confirmar que el plásmido se ha integrado en la
tioesterasa. El JC2/pJKL21 se inocula en caldo de soja tríptico que
contiene 50 \mug/ml de tioestreptona y se deja crecer durante tres
días a 30ºC. 20 ml de este cultivo de semilla se usan para inocular
400 ml de medio sacarosa-succinato que contienen 50
\mug/ml de tioestreptona, 0,1 mg/ml de ácido
4-pentinoico y 0,1 mg/ml de ácido
3-tetradecilsulfanil-propionico en
un matraz de 2L con un muelle sencillo para reducir la aglutinación,
se agita a 300 revoluciones por minuto. Después de 6 días, el caldo
se filtró, el pH se ajustó a pH 3 y se extrajo 3 veces con un
volumen igual de acetato de etilo. El disolvente se eliminó por
evaporación y el residuo se disolvió en metanol (5 ml) y se analizó
mediante espectroscopia de masas por electropulverización. Los
productos principales se identificaron como ácido
(2R)-2-metil-butanoico
(C_{5}H_{10}O_{2}; MH^{+}: calc. 103,0759, encontrado
103,071; MNa^{+}: calc. 125,0578, encontrado 125,052) y como
ácido (2R)-2-metil-
pentanoico.
pentanoico.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pJKL20 se digirió con AvrII y NdeI
clonado en pJLK18 que había sido digerido con AvrII y NdeI. La
mezcla de hibridación se usó para transformar DH1OB de E.
coli y se comprobó el contenido de plásmido de las colonias
individuales. El plásmido deseado pJKL22 se identificó por su modelo
de restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
Aproximadamente 5 \mug del plásmido pJKL22 se
transforman en protoplastos de JC2 y se aíslan las colonias
estables resistentes a la tioestreptona. A partir de diversas
colonias, se obtiene el ADN total y se analiza por hibridación
Southern, para confirmar que el plásmido se ha integrado en la
tioesterasa.
El JC2/pJKL22 se inocula en caldo de soja
tríptico que contiene 50 \mug/ml de tioestreptona y se deja crecer
durante tres días a 30ºC. 20 ml de este cultivo de semilla se usan
para inocular 400 ml de medio sacarosa-succinato
que contienen 50 \mug/ml de tioestreptona, 0,1 mg/ml de ácido
4-pentinoico y 0,1 mg/ml de ácido
3-tetradecilsulfanil-propionico en
un matraz de 2L con un muelle sencillo para reducir la aglutinación,
se agita a 300 revoluciones por minuto. Después de 6 días el caldo
se filtró, el pH se ajustó a pH 3 y se extrajo 3 veces con un
volumen igual de acetato de etilo. El disolvente se eliminó por
evaporación y el residuo se disolvió en metanol (5 ml) y se analizó
mediante espectroscopia de masas por electropulverización. Los
productos principales se identificaron como ácido
(E)-2-metil-butenoico
(C_{5}H_{8}O_{2}; MH^{+}: calc. 101,0602, encontrado
101,062; MNa^{+}: calc. 123,0422, encontrado 123,043) y ácido
(E)-2-metil-pentenoico
(C_{6}H_{10}O_{2}; MH^{+}: calc. 115,0759, encontrado
115,077; MNa^{+}: calc. 137,0578, encontrado 137,058).
\vskip1.000000\baselineskip
Para la construcción del plásmido
pKR1-0, un derivado de pCJR24 que codifica una
sintasa cetolactona, se construyeron diversos plásmidos intermedios
(Figura 22).
El segmento de 1,4 kbp del plásmido pNTEP2 que
contenía del nucleótido 9838 al 11214 (que codificaba los
aminoácidos del 3279 al final de DEBSI-TE) se
amplifica por PCR con los dos oligonucleótidos sintéticos siguientes
como cebadores
5'-GCCACTAGTGTGGCGTGGGGGCTGTGGG-3' y
5'-TGAATTCCCTCCGCCCAGCCAGGCGTCG
AT-3' y el plásmido pNTEP2 como plantilla. El producto PCR se reparó por el final y se hibridó con el plásmido pUC18, que había sido linearizado mediante digestión con SmaI y luego se había tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de hibridación se usó para transformar DH1OB de E. coli y se comprobó el contenido de plásmido de las colonias individuales. El plásmido deseado p37, en el que fue introducido un sitio SpeI en el extremo 5' final de este fragmento, se identificó por su modelo de restricción y por secuenciación de ADN.
AT-3' y el plásmido pNTEP2 como plantilla. El producto PCR se reparó por el final y se hibridó con el plásmido pUC18, que había sido linearizado mediante digestión con SmaI y luego se había tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de hibridación se usó para transformar DH1OB de E. coli y se comprobó el contenido de plásmido de las colonias individuales. El plásmido deseado p37, en el que fue introducido un sitio SpeI en el extremo 5' final de este fragmento, se identificó por su modelo de restricción y por secuenciación de ADN.
El plásmido p37 se digirió con EcoRI y KpnI y el
fragmento de 1,4 se hibridó a pNTEP2 previamente digerido con EcoRI
y KpnI. La mezcla de hibridación se usó para transformar DH1OB de
E. coli y se comprobó el contenido de plásmido de las
colonias individuales. El plásmido deseado p37N se identificó por su
modelo de restricción.
El segmento de ADN de 1,1 kbp del gen eryAI de
S. erythraea que se extiende desde el nucleótido 8202 al
nucleótido 9306 se amplificó por PCR usando como cebadores los
oligonucleótidos sintéticos: 5'-CCTGGAGTACTGC
GAGGGCGTG-3' y 5'-CTGACTAGTGGCGGTGACGTGGGCGGGGGAAA-3' y el plásmido pNTEP2 como plantilla. El producto PCR se reparó por el final y se hibridó con el plásmido pUCl8, que había sido linearizado mediante digestión con SmaI y luego se había tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de hibridación se usó para transformar DH1OB de E. coli y se comprobaron las colonias individuales según su contenido de plásmido. El plásmido deseado pSCA7, en el que un sitio SpeI se ha introducido en el extremo 3' final de este producto PCR, se identificó por su modelo de restricción y por la secuenciación de ADN.
GAGGGCGTG-3' y 5'-CTGACTAGTGGCGGTGACGTGGGCGGGGGAAA-3' y el plásmido pNTEP2 como plantilla. El producto PCR se reparó por el final y se hibridó con el plásmido pUCl8, que había sido linearizado mediante digestión con SmaI y luego se había tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de hibridación se usó para transformar DH1OB de E. coli y se comprobaron las colonias individuales según su contenido de plásmido. El plásmido deseado pSCA7, en el que un sitio SpeI se ha introducido en el extremo 3' final de este producto PCR, se identificó por su modelo de restricción y por la secuenciación de ADN.
El plásmido p37N se digirió con SpeI e HindIII y
el fragmento de 1,4 kbp se hibridó con el plásmido pSCA7
previamente digerido con SpeI e HindIII. La mezcla de hibridación se
usó para transformar DH1OB de E. coli y se comprobó el
contenido de plásmido de las colonias individuales. El plásmido
deseado pSH se identificó por su modelo de restricción.
El plásmido pNTEP2 se digirió con BglII e
HindIII y el inserto de 11,2 kbp se hibridó al plásmido pUCl8
digerido con BamHI e HindIII. La mezcla de hibridación se usó para
transformar DH1OB de E. coli y se comprobó el contenido de
plásmido de las colonias individuales. El plásmido deseado pUCTE se
identificó por su modelo de restricción.
El fragmento de restricción de 3,9 kbp de ScaI
de pUCTE se sustituyó por el fragmento de restricción de 3,4 kbp de
ScaI de pSH. El plásmido deseado pUC1-0 se
identificó por su modelo de restricción.
El NdeI de 10,7 kbp y el fragmento de
restricción de XbaI de pUC1-0 se hibridó a pCJR24
digerido con NdeI y XbaI. La mezcla de hibridación se usó para
transformar DH1OB de E. coli y las colonias individuales
fueron comprobadas según su contenido de plásmido. El plásmido
deseado pKR1-0 se identificó por su modelo de
restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
Aproximadamente 5 \mug del plásmido
pKR1-0 se usaron para transformar protoplastos de
JC2 de S. erythraea y se aislaron las colonias estables
resistentes a la tioestreptona. A partir de diversas colonias, se
obtuvo el ADN total y se analizó por hibridación Southern, para
confirmar que el plásmido se había integrado específicamente en la
parte del gen eryAIII que codificaba la tioesterasa/ciclasa del
extremo C-terminal, mediante recombinación
homóloga. Dicho clon se seleccionó y se denominó
JC2/pKR1-0 de S. erythraea.
Se inoculó JC2/pKR1-0 de S.
erythraea en medio sacarosa-succinato que
contiene 10 \mug/ml de tioestreptona y se deja crecer durante
cuatro días a 30ºC. Después de este tiempo, el caldo se filtra para
eliminar micelios y luego se extrae dos veces con acetato de etilo.
Los extractos de acetato de etilo combinados se analizan por
cromatografía de gases, espectrometría de masas y RMN y se encuentra
que los productos principales eran \delta-lactona
del ácido (2R, 4R,
5R)-2,4-dimetil-3-ceto-5-hidroxi-n-hexanoico
y \delta-lactona del ácido (2R, 4R,
5R)-2,4-dimetil-3-ceto-5-hidroxi-n-heptanoico
con rendimientos totales de 20 mg/L para cada lactona.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la construcción de una cepa de S.
erythraea que produce quetolidas, la construcción del plásmido
pKETO requirió la construcción de los siguientes plásmidos
intermedios (Figura 23).
El segmento de 1,9 kbp de pUCI-0
del nucleótido 8715 al 10645 se amplificó por PCR usando como
cebadores los oligonucleótidos sintéticos:
5'-CCCCTGCAGCCGGACCGCACCACCCCTCGTGACGA-3'
y 5'-CTTCTAGAC
TATGAATTCCCTCCGCCCAGC y el ADN de pUCI-0 como plantilla. El producto PCR se reparó por el final y se hibridó con el plásmido pUC18, que había sido linearizado mediante digestión con SmaI y se había tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de hibridación se usó para transformar DH1OB de E. coli y se comprobó el contenido de plásmido de las colonias individuales. El plásmido deseado, denominado PI-0, se identificó por análisis de restricción y secuenciación de ADN.
TATGAATTCCCTCCGCCCAGC y el ADN de pUCI-0 como plantilla. El producto PCR se reparó por el final y se hibridó con el plásmido pUC18, que había sido linearizado mediante digestión con SmaI y se había tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de hibridación se usó para transformar DH1OB de E. coli y se comprobó el contenido de plásmido de las colonias individuales. El plásmido deseado, denominado PI-0, se identificó por análisis de restricción y secuenciación de ADN.
El segmento de 60bp de eryAIII del nucleótido
7006 al 7066 se amplificó por PCR usando como cebadores los
oligonucleótidos sintéticos:
5'-GGCGGAACGTCTTCCCGGCGGCACCT-3' y
5'-CCCCTGCAGCCAGTACCGCTG
GGGCTCGAA-3' y pEXDB3 (Roberts, G. A., et al. (1993) Eur. J. Biochem. 214:305-311) como plantilla. El producto PCR se reparó por el final y se hibridó con el plásmido pUC18, que había sido linearizado mediante digestión con SmaI y luego se había tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de hibridación se usó para transformar DH1OB de E. coli y se comprobó el contenido de plásmido de las colonias individuales. El plásmido deseado, denominado PD3P, se identificó por análisis de restricción y secuenciación de ADN.
GGGCTCGAA-3' y pEXDB3 (Roberts, G. A., et al. (1993) Eur. J. Biochem. 214:305-311) como plantilla. El producto PCR se reparó por el final y se hibridó con el plásmido pUC18, que había sido linearizado mediante digestión con SmaI y luego se había tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de hibridación se usó para transformar DH1OB de E. coli y se comprobó el contenido de plásmido de las colonias individuales. El plásmido deseado, denominado PD3P, se identificó por análisis de restricción y secuenciación de ADN.
El fragmento de restricción de 0,1 kbp de EcoRI
y PstI de pX3 se hibridó con pT7-18 digerido con
EcoRI y PstI. La mezcla de hibridación se usó para transformar
DH1OB de E. coli y se comprobó el contenido de plásmido de
las colonias individuales. El plásmido deseado, denominado PT3, se
identificó por análisis de restricción.
El fragmento de 1,9 kbp de PstI y
pI-0 se hibridó a pT3 digerido con PstI. La mezcla
de hibridación se usó para transformar DH1OB de E. coli y se
comprobó el contenido de plásmido de las colonias individuales. El
plásmido deseado, denominado PT31-0, se identificó
mediante análisis de restricción.
El fragmento de restricción de 3,3 kbp de XmnI
de pEXDB3 (Roberts, G. A., et al. (1993) Eur. J.
Biochem. 214:305311) se sustituyó por el fragmento de
restricción de 2,7 kbp de XmnI de pT31-0. El
plásmido deseado pD31-0 se identificó mediante
análisis de restricción.
El plásmido pD31-0 se digirió
con BglII y el fragmento de 11,3 kbp se hibridó a pIJ702 que había
sido linearizado mediante digestión con BglII. La mezcla de
hibridación se usó para transformar DH1OB de E. coli y las
colonias individuales se comprobaron según su contenido de plásmido.
El plásmido deseado, denominado PKETO, se identificó mediante
análisis de restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
Aproximadamente 5 \mug del plásmido pKETO
aislado de DH1OB de E. coli se usaron para transformar
protoplastos de NRRL2338 de S. erythraea y se aislaron las
colonias estables resistentes a la tioestreptona. A partir de
diversas colonias, se obtuvo el ADN total y se analizó por
hibridación Southern, para confirmar que el plásmido se había
integrado específicamente en el gen eryAIII mediante recombinación
homóloga. Dicho clon se seleccionó y se denominó NRRL2338/pKETO de
S. erythraea.
Se inoculó NRRL2338/pKETO de S. erythraea
en medio sacarosa-succinato que contenía 10
\mug/ml de tioestreptona y se dejó crecer durante cuatro días a
30ºC. Después de este tiempo, el caldo se filtra para eliminar los
micelios, el sobrenadante se ajusta a pH 9,5 y luego se extrae dos
veces con volúmenes iguales de acetato de etilo. Los extractos de
acetato de etilo combinados se evaporaron hasta secarse, el residuo
se llevó a metanol (5 mL) y luego se analizó por HPLC y MS por
electropulverización. Se encontró que el producto principal es la
3-quetolida esperada con un rendimiento aproximado
de 10 mg/L. El análisis del espectro de masas por
electropulverización muestra que el aducto de protón para este
compuesto muestra una masa MH^{+} de 558,4, que se confirmó por
análisis de masas exacto; MH^{+} requiere 558,36418
C_{29}H_{52}O_{9}N, observado 558,36427.
El plásmido pMO7 (como el plásmido pM0107
también descrito en este documento) es un plásmido basado en SCP2*
que contiene un gen de PKS que comprende el módulo de carga de ery,
el primer y segundo módulo de extensión de la PKS de ery y
tioesterasa terminadora de cadena de ery, salvo que el segmento de
ADN que codifica la metilmalonil-CoA:ACP
aciltransferasa dentro del primer módulo de extensión de ery ha sido
específicamente sustituido por el ADN que codifica la
malonil-CoA:ACP aciltransferasa del módulo 13 de la
PKS de rap. Se construyó vía varios plásmidos intermedios como
sigue (Figura 24).
El segmento de ADN de aproximadamente 1,3 kbp
del gen eryAI de S. erythraea que se extiende desde el
nucleótido 1948 al nucleótido 3273 de eryAI (Donadio, S. et
al. Science (1991) 252:675-679) se
amplificó por PCR empleando como cebadores los oligonucleótidos
sintéticos:
5'-CATGCTCGAGCTCTCCTGGGAAGT-3' y
5'-CAACCCTGGC
CAGGGAAGACGAAGACGG-3', y el plásmido pNTEP2 (Ejemplo 5) como plantilla. El producto PCR se reparó por el final y se hibridó con el plásmido pUC18, que había sido linearizado mediante digestión con SmaI y luego se había tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de hibridación se usó para transformar TG1 recO de E. coli y se comprobó el contenido de plásmido de las colonias individuales. El plásmido deseado pMO1 (3,9 kbp), en el que el sitio StuI que linda con el inserto está adyacente al sitio HindIII en el polienlazante, se identificó por su modelo de restricción.
CAGGGAAGACGAAGACGG-3', y el plásmido pNTEP2 (Ejemplo 5) como plantilla. El producto PCR se reparó por el final y se hibridó con el plásmido pUC18, que había sido linearizado mediante digestión con SmaI y luego se había tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de hibridación se usó para transformar TG1 recO de E. coli y se comprobó el contenido de plásmido de las colonias individuales. El plásmido deseado pMO1 (3,9 kbp), en el que el sitio StuI que linda con el inserto está adyacente al sitio HindIII en el polienlazante, se identificó por su modelo de restricción.
El segmento de ADN de aproximadamente 0,85 kbp
del gen rapA de S. hygroscopicus, que se extiende desde el
nucleótido 1643 al nucleótido 2486 de rapA, se amplificó por PCR
empleando como cebadores los oligonucleótidos siguientes:
5'-TTCCCTGGCCAGGGGTCGCAGCGTG-3' y
5'-CACCTAGGACCGCGGACCACTCGAC-3', y
el ADN del bacteriófago recombinante _-1E
(Schwecke, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995)
92:7839-7843) como plantilla. El producto
PCR se reparó por el final y se hibridó con el plásmido pUC18, que
había sido linearizado mediante digestión con SmaI y luego se había
tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de hibridación se usó para
transformar TG1 recO de E. coli y se comprobó el contenido
de plásmido de las colonias individuales. El plásmido deseado pMO2
(3,5 kbp) se identificó por su modelo de restricción.
El segmento de ADN de aproximadamente 1,7 kbp
del gen eryAI de S. erythraea que se extiende desde el
nucleótido 4128 al nucleótido 5928 de eryAI, se amplificó por PCR
empleando como cebadores los oligonucleótidos sintéticos:
5'-TGGCCAGGGAGTCGGTGCACCTAGGCA-3' y
5'-GCCGACAGCGAGTCGACGCCGAGTT-3' y el
plásmido pNTEP2 como plantilla. El producto PCR se reparó por el
final y se hibridó con el plásmido pUC18, que había sido linearizado
mediante digestión con SmaI y luego se había tratado con fosfatasa
alcalina. La mezcla de hibridación se usó para transformar TG1 recO
de E. coli y se comprobó el contenido de plásmido de las
colonias individuales. El plásmido deseado pMO3 (4,4 kbp), en el
que los sitios BalI y AvrII están adyacentes al sitio HindIII del
polienlazante, se identificó por su modelo de restricción.
El plásmido pMO1 se digirió con HindIII y BalI y
el inserto de 1,3 kbp se hibridó con el plásmido pMO3 que había
sido digerido con HindIII y BalI. La mezcla de hibridación se usó
para transformar TG1 recO de E. coli y se comprobó el
contenido de plásmido de las colonias individuales. El plásmido
deseado pMO4 (5,6 kbp) se identificó por su modelo de
restricción.
El plásmido pMO4 se digirió con StuI y el
inserto de 3,0 kbp se hibridó con el plásmido pNTEP2 que había sido
digerido con StuI y el vector se purificó por electroforesis de gel
para eliminar el inserto de 3,8 kbp. La mezcla de hibridación se
transformó en TG1 recO de E. coli y se comprobó el contenido
de plásmido de las colonias individuales. El plásmido deseado pMO5
(12,8 kbp) se identificó por su modelo de restricción.
El plásmido pMO2 se digirió con BalI y AvrII y
el inserto se hibridó con el plásmido pMO5 que había sido digerido
con BalI y AvrII. La mezcla de hibridación se usó para transformar
TG1 recO de E. coli y se comprobó el contenido de plásmido
de las colonias individuales. El plásmido deseado pMO6 (13,5 kbp) se
identificó por su modelo de restricción.
El plásmido pMO6 se digirió con NdeI y XbaI y el
inserto se hibridó con el plásmido pRM52 (Ejemplo 4) que había sido
digerido con NdeI y XbaI y se purifica por electroforesis de gel. La
mezcla de hibridación se transformó en TG1 recO de E. coli y
se comprobaron las colonias individuales según su contenido de
plásmido. El plásmido deseado pMO7 (también denominado pRMAT2) se
identificó por su modelo de restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pMO7 que había sido aislado de
ET12567 de E. coli (MacNeil, D. J. et al. Gene
(1992) 111:61-68) se transformó en
protoplastos de CH999 de S. coelicolor y se aislaron las
colonias estables resistentes a la tioestreptona. Se comprobó el
contenido de plásmido de las colonias individuales y la presencia
del plásmido pMO7 se confirmó por su modelo de restricción.
Se inoculó CH999/pMO7 de S. coelicolor en
medio YEME que contenía 50 \mug/ml de tioestreptona y se dejó
crecer durante cinco días a 28-30ºC. Después de este
tiempo, el caldo se filtró para eliminar los micelios y el pH se
ajustó a pH 3. El caldo se extrajo dos veces con dos volúmenes de
acetato de etilo y los extractos de acetato de etilo combinados se
lavaron con un volumen igual de cloruro de sodio saturado, se
secaron sobre sulfato de sodio anhidro, y el acetato de etilo se
eliminó bajo presión reducida, para dar el producto a granel de
aproximadamente 200 mg. Este se digirió con 2 ml de metanol y se
mezcló con 0,5 g del gel de sílice seco y luego se sometió a
cromatografía súbita en una columna del mismo material (1 cm x 15
cm). La columna se eluyó con éter de dietilo, y se recuperaron
fracciones de 10 ml cada una. Las fracciones 4-8 se
reunieron y el éter de dietilo se evaporó para dejar
aproximadamente 10 mg de residuo aceitoso que contenía los
compuestos del interés. Éstos fueron purificados después por hplc
en una columna de fase inversa de octadecil-sílice
(10 mm x 25 cm) eluída a un caudal de 2 ml/minuto primero con una
mezcla isocrática de agua/metanol 75:25 (vol/vol) durante cinco
minutos, luego con un gradiente lineal de metanol creciente,
alcanzando agua/metanol 55/45 (vol/vol) después de 30 minutos.
Después de aproximadamente 11 minutos, las fracciones se reunieron
conteniendo, como componente minoritario, (Ac)
4-nor-TKL (R_{1}=Me, R_{2}=H,
R_{3}=Me) y después de aproximadamente 18 minutos las fracciones
se reunieron conteniendo, como componente principal,
4-nor-TKL (R_{1}=Me, R_{2}=H,
R_{3}=Et).
El espectro ^{1}H de
4-nor-TKL se determinó usando un
espectrómetro RMN AM-400 de Bruker. Encontrado: H
(400 MHz, CDCl_{3}) 4,18 (1H, dtd, 11,8, 6,1, 2,9 Hz,
H-5), 3,75 (1H, ddd, 11,0, 10,0, 4,0 Hz,
H-3), 2,35 (1H, dq, 10,0, 7,0 Hz,
H-2), 2,20 (1H, ddd, 13,3, 4,0, 2,9 Hz,
H-4eq), 1,6-1,88 (3H, m,
2xH-6, H-4ax), 1,41 (1H, d, 7,0 Hz,
CH3-3'), 1,01 (1H, t, 7,5 Hz, CH3-7)
ppm.
El espectro de RMN ^{13}C de
4-nor-TKL también se determinó (100
MHz, CDCl_{3}): 173,3 (C-1), 77,7
(C-5), 70,4 (C-3), 45,1 (C2), 37,7
(C-4), 28,8 (C-6), 13,5
(C-3'), 9,1 (C-7).
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pMO6 se digirió con NdeI y XbaI y el
inserto se hibridó con el plásmido pCJR101 (Ejemplo 2) que había
sido digerido con NdeI y XbaI y se purificó por electroforesis de
gel. La mezcla de hibridación se transformó en TG1 recO de E.
coli y se comprobó el contenido de plásmido de las colonias
individuales. El plásmido deseado pMO107 se identificó por su
modelo de restricción.
Se preparó JC2/pM0107 de S. erythraea por
técnicas estándares (c.f. el ejemplo 26 (i)) y se inoculó en medio
sacarosa-succinato que contenía 50 \mug/ml de
tioestreptona y se permitió crecer durante
tres-cinco días a 28-30ºC.
Después de este tiempo, el caldo se filtró para
eliminar los micelios y el pH se ajustó a pH 3. El caldo se extrajo
tres veces con el cuarto de volúmenes de acetato de etilo y los
extractos de acetato de etilo combinados se secaron sobre sulfato
de sodio anhidro, y el acetato de etilo se eliminó bajo presión
reducida, para dar aproximadamente 10 mg/L del producto a granel.
Este se digirió con 2 ml de metanol y se mezcló con 0,5 g del gel
de sílice seco y luego se sometió a cromatografía súbita en una
columna del mismo material (1 cm x 15 cm). La columna se eluyó con
éter de dietilo, y se recuperaron fracciones de 10 ml cada una. Las
fracciones 4-8 se reunieron, y el éter de dietilo
se evaporó para dejar aproximadamente 15 mg del residuo aceitoso que
contiene los compuestos de interés. Éstos fueron purificados
después por hplc en una columna de fase inversa de
octadecil-sílice (10 mm x 25 cm) eluída a un caudal
de 2 ml/minuto primero con una mezcla isocrática de agua/metanol
75:25 (vol/vol) durante cinco minutos, luego con un gradiente lineal
de metanol creciente, alcanzando agua/metanol 55/45 (vol/vol)
después de 30 minutos. Después de aproximadamente 11 minutos, las
fracciones se reunieron conteniendo, como componente minoritario,
(Ac)4-nor-TKL y
después
de aproximadamente 18 minutos las fracciones se reunieron conteniendo, como componente principal, 4-nor-TKL.
de aproximadamente 18 minutos las fracciones se reunieron conteniendo, como componente principal, 4-nor-TKL.
Los espectros ^{1}H y ^{13}C de
4-nor-TKL y (Ac)
4-nor-TKL purificado eran idénticos
con los espectros obtenidos para el material auténtico.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pCJR26 es un plásmido basado en
SCP2* que contiene un gen de PKS que comprende el módulo de carga
de ery, el primer y segundo módulo de extensión de la PKS de ery y
la tioesterasa terminadora de cadena de ery, salvo que el segmento
de ADN que codifica la metilmalonil-CoA:ACP
aciltransferasa dentro del primer módulo de extensión ha sido
específicamente sustituido por el ADN que codifica la
malonil-CoA:ACP aciltransferasa del módulo 2 de la
PKS de rap. Se construyó como sigue (Figura 25):
El plásmido pMO6 se digirió con NdeI y XbaI y el
inserto se hibridó con el plásmido pCJR24, que había sido digerido
con NdeI y XbaI y se purifica por electroforesis de gel. La mezcla
de hibridación se transformó en TG1 recO de E. coli y se
comprobó el contenido de plásmido de las colonias individuales. El
plásmido deseado pCJR26 se identificó por su modelo de
restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pCJR26 se usó para transformar
protoplastos de JC2 de S. erythraea. Se seleccionaron las
colonias resistentes a la tioestreptona en medio R2T20 que contiene
10 \mug/ml de tioestreptona. Se probaron varios clones para
detectar la presencia de pCJR26 integrado en el cromosoma, por
hibridación por transferencia Southern de su ADN genómico con el
gen DEBS1-TE marcado con DIG. Un clon con una copia
integrada de pCJR26 se cultivó en medio SSM, conteniendo 5
\mug/ml de tioestreptona y se dejó crecer durante siete días a
28-30ºC. Después de este tiempo, el caldo se filtró
para eliminar los micelios y el pH se ajustó a pH=3. El caldo se
extrajo dos veces con dos volúmenes de acetato de etilo y los
extractos de acetato de etilo combinados se lavaron con un volumen
igual de cloruro de sodio saturado, se secaron sobre sulfato de
sodio anhidro, y el acetato de etilo se eliminó bajo presión
reducida, para dar aproximadamente 500 mg del producto a granel. Se
mostró que los productos eran
(Ac)4-nor-TKL y
4-nor-TKL:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron aproximadamente 5 \mug de ADN de
pCJR49 para transformar protoplastos de NRRL2338 de S.
erythraea para dar una cepa en la cual el plásmido está
integrado en el cromosoma. A partir de diversas colonias, se obtuvo
el ADN total y se analizó por hibridación Southern para confirmar
que el plásmido se había integrado en el módulo 2 de EryAI para dar
una nueva ruta biosintética de macrólido. Otras integraciones habían
ocurrido para dar secuencias de plásmido repetidas. Se inoculó NRRL
2338/pCJR49 de S. erythraea en caldo de soja tríptico que
contenía 5 \mug/ml de tioestreptona y se incubó a 30ºC durante
tres días. 100 ml de este cultivo de semilla se usaron para
inocular 2 litros de medio sacarosa-succinato
definido que contenía 5 \mug/ml de tioestreptona en 5x matraces
de 2 litros cada uno que contenía 500 ml de medio con 2 muelles para
ayudar a la dispersión y se agitó a 300 revoluciones por minuto.
Después de unos 5 días más de crecimiento, los cultivos se
centrifugaron y el pH del sobrenadante se ajustó a pH 9. El
sobrenadante se extrajo entonces tres veces con un volumen igual de
acetato de etilo y el disolvente se eliminó por evaporación. Los
productos se analizaron por HPLC/MS y se identificaron dos
macrólidos como los análogos de eritromicina:
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.900000\baselineskip
El plásmido pC-ATX es un
plásmido basado en SCP2* que contiene un gen de PKS que comprende el
módulo de carga de ery, el primer y segundo módulo de extensión de
la PKS de ery y la tioesterasa terminadora de cadena de ery, salvo
que el segmento de ADN que codifica la
metilmalonil-CoA:ACP aciltransferasa dentro del
primer módulo de extensión ha sido específicamente sustituido por
el ADN que codifica la malonil-CoA:ACP
aciltransferasa de un supuesto grupo de genes de PKS tipo I
clonados a partir de ATCC 14513 de Streptomyces cinnamonensis
(productor de poliéter poliquétido monensina). Se construyó vía
varios plásmidos intermedios como sigue (Figura 26).
La biblioteca genómica de ATCC 14513 de
Streptomyces cinnamonensis (el productor de monensina) fue
construida a partir de los fragmentos de Sau3A de tamaño
35-45 kbp fraccionados del ADN cromosómico hibridado
en el vector del cósmido pWE15 linearizado con BamHI y tratado con
fosfatasa alcalina. La mezcla de hibridación se empaquetó en
partículas \lambda usando extractos de empaquetamiento Gigapack, y
se transfectó en NMlblue de E. coli. Aproximadamente 600
colonias de la biblioteca se cultivaron en la superficie de una
membrana de nilón, se dividieron, y su ADN se reticuló a la membrana
por irradiación UV. La membrana se usó posteriormente para el
procedimiento de proyección. El inserto de pMO8 que comprende el
dominio de cetosintasa del módulo 2 de DEBS se marcó por la
preparación aleatoria en presencia de 33PaATP y se usó como una
sonda para la hibridación del ADN. La sonda se hibridó durante 16 h
a 68ºC en tampón 4,0xSSC y posteriormente se lavó durante 1 h a
68ºC en tampón de 0,8xSSC. Tres clones positivos se aislaron. El ADN
de los insertos de los tres clones se secuenció por el final a
partir de los sitios de cebado presentes de T3 y T7 en el vector
pWIS15. Una región homóloga a los dominios de la cetosintasa tipo I
y malonil-CoA:ACP aciltransferasa se descubrió en
la secuencia de ADN del sitio de cebado T7 usando el clon 2
(denominado pSCIN02) como plantilla. La secuenciación de ADN
parcial del dominio de malonil-CoA:ACP
aciltransferasa (denominado ATX) reveló que un motivo de secuencia
ajeno en la supuesta parte de reconocimiento del sustrato del
dominio que era sustancialmente diferente de CoA:ACP
aciltransferasas específica de malonato o de metilmalonato antes
descrita (Haydock, S.F. et al., FEBS (1995)
374:246-248)
El segmento de ADN de aproximadamente 0,9 kbp
del dominio ATX se amplificó por PCR empleando como cebadores los
oligonucleótidos siguientes:
5'-CTGGCCAGGGCGCGCAATGGCCGAGCAT-3' y
5'-CCCTAG
GAGTCGCCGGCAGTCCAGCGCGGCGCCC-3' usando el ADN del cósmido pSCIN02 como plantilla. El producto PCR se reparó por el final y se hibridó con el plásmido pUC18, que había sido linearizado mediante digestión con SmaI y que luego se había tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de hibridación se usó para transformar TGI recO de E. coli y se comprobó el contenido de plásmido de las colonias individuales. El plásmido deseado pM033 (3,5 kbp) se identificó por su modelo de restricción.
GAGTCGCCGGCAGTCCAGCGCGGCGCCC-3' usando el ADN del cósmido pSCIN02 como plantilla. El producto PCR se reparó por el final y se hibridó con el plásmido pUC18, que había sido linearizado mediante digestión con SmaI y que luego se había tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de hibridación se usó para transformar TGI recO de E. coli y se comprobó el contenido de plásmido de las colonias individuales. El plásmido deseado pM033 (3,5 kbp) se identificó por su modelo de restricción.
El plásmido pM034 es un derivado de pMO6 con un
sitio de policlonación insertado después del codón de terminación
del gen D1-AT2 insertado. El plásmido pMO6 se
digirió con EcoRI e HindIII y se hibridó con dos oligonucleótidos
que forman la región bicatenaria del sitio de policlonación:
5'-AATTCATAACTAGTAGGAGGTCTGGCCATCTAGA-3'
y 5'-TCGAAGATCTACCGGTCTGGAGGATGAT
CAATAC-3'.
CAATAC-3'.
La mezcla se hibridó y se transformó en TGI de
E. coli. Las colonias individuales se comprobaron según su
contenido de plásmido. El plásmido deseado pM034 (13,5 kbp) se
identificó por su modelo de restricción.
El plásmido pro35 es un derivado de pM034 que
contiene el gen de TKLS-AT2 y un gen de
crotonil-CoA-reductasa acoplado por
translación de Streptomyces collinus (Wallace et al.,
E. J. Biochem. (1995) 233: 954-962).
El gen de crotonil-CoA-reductasa se
escindió del plásmido pZYB3 (obsequio del catedrático K. Reynolds)
como un fragmento de NdeI-BamHI, que se trata con
nucleasa de alubia mung para producir extremos romos y se hibridó
en pM034 antes cortado con SpeI y igualmente terminado en romo
usando la nucleasa de alubia mung. La mezcla de hibridación se usó
para transformar TG1 recO de E. coli y se comprobó el
contenido de plásmido de las colonias individuales. El plásmido
deseado pMO35 (14,2 kbp), con la orientación correcta del gen de
crotonil-CoA-cetoreductasa, se
identificó por su modelo de restricción.
El plásmido pMO33 se digirió con BalI y AvrII y
el inserto se hibridó con el plásmido pro35 que había sido digerido
con BalI y AvrII. La mezcla de hibridación se usó para transformar
TG1 recO de E. coli y las colonias individuales se
comprobaron según su contenido de plásmido. El plásmido deseado
pM036 (13,5 kbp) se identificó por su modelo de restricción.
\global\parskip1.000000\baselineskip
El plásmido pM036 se digirió con NdeI y XbaI y
el inserto se hibridó con el plásmido pCJR29, que había sido
digerido con NdeI y XbaI y se purificó por electroforesis de gel. La
mezcla de hibridación se transformó en TG1 recO de E. coli y
las colonias individuales se comprobaron según su contenido de
plásmido. El plásmido deseado pC-ATX se identificó
por su modelo de restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pC-ATX se usó para
transformar protoplastos de JC2 de S. erythraea. Se
seleccionaron las colonias resistentes a la tioestreptona en medio
R2T20 que contenía 10 \mug/ml de tioestreptona. Se probaron varios
clones para detectar la presencia de pC-ATX
integrado en el cromosoma, mediante hibridación por transferencia
Southern de su ADN genómico con ADN marcado con DIG que codifica el
gen de DEBS1-TE.
Un clon con una copia integrada de
pC-ATX se cultivó en medio SSM, que contenía 5
\mug/ml de tioestreptona, y se dejó crecer durante siete días a
28-30ºC. Después de este tiempo, el caldo se filtró
para eliminar los micelios y el pH se ajustó a pH=3. El caldo se
extrajo dos veces con dos volúmenes de acetato de etilo y los
extractos de acetato de etilo combinados se lavaron con un volumen
igual de cloruro de sodio saturado, se secaron sobre sulfato de
sodio anhidro, y el acetato de etilo se eliminó bajo presión
reducida, para dar aproximadamente 500 mg del producto a granel.
Los productos se caracterizaron por cromatografía de gases,
espectrometría de masas y RMN, y se mostró que eran
\delta-lactona del ácido (2S, 3R, 4S,
SR)-2-metil-4-etil-3,5-dihidroxi-n-hexanoico
y \delta-lactona del ácido (2S, 3R, 4S,
5R)-2-metil-4-etil-3,5-dihidroxi-n-heptanoico:
Se usaron aproximadamente 5 \mug de ADN de
pC-ATX para transformar protoplastos de NRRL2338 de
S. erythraea para dar una cepa en la cual el plásmido está
integrado en el cromosoma. A partir de diversas colonias, se obtuvo
el ADN total y se analizó por hibridación Southern para confirmar
que el plásmido se había integrado en el módulo 2 de EryAI para dar
una nueva ruta biosintética de macrólidos. Otras integraciones
habían ocurrido para dar secuencias de plásmido repetidas. Se
inoculó NRRL2338/pC-ATX de S. erythraea en
caldo de soja tríptico que contenía 5 \mug/ml de tioestreptona y
se incubó a 30ºC durante tres días. Se usaron 100 ml de este
cultivo de semilla para inocular 2 litros de medio definido de
sacarosa-succinato definido que contiene 5
\mug/ml de tioestreptona en 5x matraces de 2 litros cada uno que
contiene medio de 500 ml con 2 muelles para ayudar a la dispersión
y se agitó a 300 revoluciones por minuto. Después de unos 5 días
más de crecimiento, los cultivos se centrifugaron y el pH del
sobrenadante se ajustó a pH 9. El sobrenadante se extrajo entonces
tres veces con un volumen igual de acetato de etilo y el disolvente
se eliminó mediante evaporación. Los productos se analizaron por
HPLC/MS y se identificaron dos productos macrólidos:
El plásmido pC-AT12 es un
plásmido basado en SCP2* que contiene un gen de PKS que comprende el
módulo de carga de ery, el primer y segundo módulo de extensión de
la PKS de ery y la tioesterasa terminadora de cadena de ery, salvo
que el segmento de ADN que codifica la
metilmalonil-CoA:ACP aciltransferasa dentro del
segundo módulo de extensión ha sido específicamente sustituido por
el ADN que codifica la malonil-CoA:ACP
aciltransferasa del módulo 2 de la PKS de rap. Se construyó vía
varios plásmidos intermedios como sigue (Figura 27).
El segmento de ADN de aproximadamente 1,0 kbp
del gen de eryAI de S. erythraea que se extiende desde el
nucleótido 6696 al nucleótido 7707 de eryAI (Donadio. S. et
al., Science (1991) 252, 675-679)
se amplificó por PCR empleando como cebadores oligonucleótidos
sintéticos:
5'-GGCGGGTCCGGAGGTGTTCACCGAGTT-3' y
5'-ACCTTGGCCAGGGAAGACGAACACTGA-3',
y el plásmido pNTEp2 como plantilla. El producto PCR se reparó por
el final y se hibridó con el plásmido pUC18, que había sido
linearizado mediante digestión con SmaI y luego se había tratado con
fosfatasa alcalina. La mezcla de hibridación se usó para
transformar TG1 recO de E. coli y se comprobó el contenido de
plásmido de las colonias individuales. El plásmido deseado pMO25
(3,6 kbp), en el que el sitio StuI que linda con el inserto es
adyacente al sitio HindIII en el polienlazante, se identificó por su
modelo de restricción.
El segmento de ADN de aproximadamente 0,6 kbp
del gen de eryAI de S. erythraea que se extiende desde el
nucleótido 8660 al nucleótido 9258 de eryAI, se amplificó por PCR
empleando como cebadores los oligonucleótidos sintéticos:
5'-TCCTAGGCCGGGCCGGACTGGTCGACCTGCCGGGTT-3'
y 5'-AAACACCGCGACCTGGTCCTCC
GAGC-3', y el plásmido pNTEP2 como plantilla. El producto PCR se reparó por el final y se hibridó con el plásmido pUC1B, que había sido linearizado mediante digestión con SmaI y luego se había tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de hibridación se usó para transformar TG1 recO de E. coli y se comprobó el contenido de plásmido de las colonias individuales. El plásmido deseado pM026 (3,2 kbp), en el que el sitio AvrII es adyacente al sitio HindIII del polienlazante, se identificó por su modelo de restricción.
GAGC-3', y el plásmido pNTEP2 como plantilla. El producto PCR se reparó por el final y se hibridó con el plásmido pUC1B, que había sido linearizado mediante digestión con SmaI y luego se había tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de hibridación se usó para transformar TG1 recO de E. coli y se comprobó el contenido de plásmido de las colonias individuales. El plásmido deseado pM026 (3,2 kbp), en el que el sitio AvrII es adyacente al sitio HindIII del polienlazante, se identificó por su modelo de restricción.
El plásmido pMO25 se digirió con EcoRI y BalI y
el inserto de 1,0 kbp se hibridó con el plásmido pMO2 que había
sido digerido con EcoRI y BalI. La mezcla de hibridación se usó para
transformar TG1 recO de E. coli y se comprobó el contenido
de plásmido de las colonias individuales. El plásmido deseado pMO27
(4,4 kbp) se identificó por su modelo de restricción.
El plásmido pMO26 se digirió con AvrII e HindIII
y el inserto de 0,6 kbp se hibridó con el plásmido pMC27 que había
sido digerido con AvrII e HindIII. La mezcla de hibridación se usó
para transformar TG1 recO de E. coli y se comprobaron las
colonias individuales según su contenido de plásmido. El plásmido
deseado pMO32 (5,1 kbp) se identificó por su modelo de
restricción.
El plásmido pMO32 se digirió con BspEI y SexAI y
el inserto de 2,7 kbp se hibridó con el plásmido pNTEP2 que había
sido digerido con las mismas dos enzimas y se purificó por
electroforesis de gel para eliminar el inserto de 2,8 kbp. La
mezcla de hibridación se transformó en TG1 recO de E. coli y
se comprobó el contenido de plásmido de las colonias individuales.
El plásmido pMO33 (12,8 kbp) se identificó por su modelo de
restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pMO33 se digirió con NdeI y XbaI y
el inserto se hibridó con el plásmido pCJR29, que había sido
digerido con NdeI y XbaI y se purificó por electroforesis de gel. La
mezcla de hibridación se transformó en TG1 recO de E. coli y
se comprobó el contenido de plásmido de las colonias individuales.
El plásmido deseado pC-ATl2 se identificó por su
modelo de restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pC-AT12 se usó para
transformar protoplastos de JC2 de S. erythraea. Se
seleccionaron las colonias resistentes a tioestreptona en medio
R2T20 que contiene 10 \mug/ml de tioestreptona. Se probaron
varios clones para detectar la presencia de pC-AT12
integrado en el cromosoma, mediante hibridación por transferencia
Southern de su ADN genómico con ADN marcado con DIG que codifica el
gen de DEBS1-TE.
Un clon con una copia integrada de
pC-AT12 se cultivó en medio SSM, que contenía 5
\mug/ml de tioestreptona y se dejó crecer durante siete días a
28-30ºC. Después de este tiempo, el caldo se filtró
para eliminar los micelios y el pH se ajustó a pH=3. El caldo se
extrajo dos veces con dos volúmenes de acetato de etilo y los
extractos de acetato de etilo combinados se lavaron con un volumen
igual de cloruro de sodio saturado, se secaron sobre sulfato de
sodio anhidro, y el acetato de etilo se eliminó bajo presión
reducida, para dar aproximadamente 500 mg del producto a granel. Se
mostró que los productos eran \delta-lactona del
ácido (3R, 4S,
5R)-4-metil-3,5-dihidroxi-n-hexanoico
y \delta-lactona del ácido (3R, 4S,
SR)-4-metil-3,5-dihidroxi-n-heptanoico:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron aproximadamente 5 \mug de ADN de
pC-AT12 para transformar protoplastos de NRRL2338 de
S. erythraea para dar una cepa en la cual el plásmido está
integrado en el cromosoma. A partir de diversas colonias, se obtuvo
el ADN total y se analizó por hibridación Southern para confirmar
que el plásmido ha integrado 3' del módulo 2 de EryAI para dar una
nueva ruta biosintética de macrólidos. Otras integraciones habían
ocurrido para dar secuencias de plásmido repetidas. Se inoculó
NRRL2338/pC-AT12 de S. erythraea en caldo de
soja tríptico que contenía 5 \mug/ml de tioestreptona y se incubó
a 30ºC durante tres días. Se usaron 100 ml de este cultivo de
semilla para inocular 2 litros de medio
sacarosa-succinato definido que contenía 5 \mug/ml
ml de tioestreptona en 5x matraces de 2 litros cada uno que
contenían 500 ml de medio con 2 muelles para ayudar a la dispersión
y se agitó a 300 revoluciones por minuto. Después de unos 5 días más
del crecimiento, los cultivos se centrifugaron y el pH del
sobrenadante se ajustó a pH 9. El sobrenadante se extrajo entonces
tres veces con un volumen igual de acetato de etilo y el disolvente
se eliminó mediante evaporación. Los productos se analizaron por
HPLC/MS y se identificaron dos productos de macrólido:
\vskip1.000000\baselineskip
El pCJR49 es un plásmido basado en pCJR24que
contenía un gen de DEBS1-TE mutante que no tiene
ninguna cetoreductasa en el módulo 2, y el dominio AT en el módulo
2 ha sido sustituido por RAPS AT2 a fin de incorporar un extendedor
de malonilo en vez de un extendedor de metilmalonilo en el segundo
módulo (Figura 28).
El pMO32 se digirió con BspE I y SexA I y el
fragmento que contenía el AT del módulo 2 de RAP se clonó en
pUC1-O que había sido previamente digerido con BspE
I y SexA I, para producir el plásmido pCJR43.
El pCJR43 se digirió con Nde I y Xba I y el
fragmento que contiene al mutante el gen de DEBS1-TE
se clonó en pCJR24 que había sido previamente digerido con Nde I y
Xba I, para producir el plásmido pCJR49. El pCJR49 se confirmó por
la correlación de la enzima de restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
i) Se usaron aproximadamente 5 \mug de ADN de
pCJR49 para transformar protoplastos de JC2 de S. erythraea
para dar una cepa en la cual el plásmido está integrado en el
cromosoma. A partir de diversas colonias, se obtiene el ADN total y
se analiza por hibridación Southern para confirmar que el plásmido
se ha integrado en el eryTE. El JC2/pCJR49 de S. erythraea
se inocula en caldo de soja tríptico que contiene 5 \mug/ml de
tioestreptona y se incuba a 30ºC durante tres días. Se usaron 100 ml
de este cultivo de semilla para inocular 2 litros de medio
sacarosa-succinato definido que contiene 5 \mug/ml
de tioestreptona en 5x matraces de 2 litros conteniendo cada uno
500 ml de medio con 2 muelles para ayudar a la dispersión y se agitó
a 300 revoluciones por minuto. Después de unos 5 días más de
crecimiento, los cultivos se centrifugaron y el pH del sobrenadante
se ajustó a pH 3. El sobrenadante se extrajo entonces tres veces con
un volumen igual de acetato de etilo y el disolvente se eliminó
mediante evaporación. Los productos se disolvieron en metanol y se
analizaron por GC-MS en un Sistema GCQ
Finnegan-MAT.
Este análisis indicó que por comparación a
estándares sintéticos, estaban presentes dos nuevas lactonas. Estos
productos eran \delta-lactona del ácido (4S,
5R)-4-metil-3-ceto-5-hidroxihexanoico
y \delta-lactona del ácido (4S,
5R)-4-metil-3-ceto-5-hidroxiheptanoico:
Se usaron 5 \mug de ADN de pCJR49 para
transformar protoplastos de NRRL2338 de S. erythraea para dar
una cepa en la cual el plásmido está integrado en el cromosoma. A
partir de diversas colonias, se obtiene el ADN total y se analiza
por hibridación Southern para confirmar que el plásmido ha integrado
en el módulo 2 de EryAI para dar una nueva ruta biosintética de
macrólidos. Otras integraciones habían ocurrido para dar secuencias
de plásmido repetidas. El /pCJR49 de S. erythraea se inocula
en caldo de soja tríptico que contiene 5 \mug/ml de tioestreptona
y se incuba a 30ºC durante tres días. Se usaron 100 ml de este
cultivo de semilla para inocular 2 litros de medio
sacarosa-succinato definido que contiene 5 \mug/ml
de tioestreptona en 5x matraces de 2 litros que contiene cada uno
500 ml de medio con 2 muelles para ayudar a la dispersión y se
agita a 300 revoluciones por minuto. Después de unos 5 días más de
crecimiento, los cultivos se centrifugaron y el pH del sobrenadante
se ajustó a pH 9. El sobrenadante se extrajo entonces tres veces con
un volumen igual de acetato de etilo y el disolvente se eliminó
mediante evaporación. Los productos se analizaron por HPLC/MS y se
identificaron dos macrólidos:
El plásmido pCART11 es un plásmido basado en
pRM52 que contiene un gen de PKS que comprende el módulo de carga
de avermectina, módulos 5 y 6 de la PKS de ery, y la tioesterasa
terminadora de cadena de ery. Se construyó vía varios plásmidos
intermedios como sigue.
El plásmido pARLD se digirió con BamHI y BglII y
el inserto de 1,70 kbp se hibridó con el plásmido pEXD3 que había
sido digerido con BglII. La mezcla de hibridación se usó para
transformar TG1 recO de E. coli y se comprobó el contenido
de plásmido de las colonias individuales. El plásmido deseado pCAR1
se identificó por su modelo de restricción.
El segmento de ADN de 250 bp del gen de eryAIII
de S. erythraea que se extiende desde el nucleótido 4807 al
nucleótido 5052 de eryAIII, se amplificó por PCR empleando como
cebadores los oligonucleótidos sintéticos:
5'-TTTGCTAGCGATCGTCGGCATGGCGTGCCGGTT3' y
5'-CCCACGAGATCTCCAGCATGATCC-3'.
El plásmido pEXD3 se usó como plantilla. El
producto PCR se reparó por el final y se hibridó con pUCl8, que
había sido linearizado mediante digestión con SmaI y luego se había
tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de hibridación se usó
para transformar TG1 recO de E. coli y se comprobó el
contenido de plásmido de las colonias individuales. El plásmido
deseado pCAR5 en el que el sitio NheI está adyacente al sitio EcoRI
del polienlazante, se identificó por su modelo de restricción y
análisis de secuencia.
El plásmido pCAR5 se digirió con NheI y BglII y
el inserto de 250 bp se hibridó con el plásmido pCAR1 que había
sido digerido con NheI y BglII. La mezcla de hibridación se usó para
transformar TG1 recO de E. coli y se comprobó el contenido
de plásmido de las colonias individuales. El plásmido deseado pCAR2
se identificó por su modelo de restricción.
El plásmido pARTr se digirió con XbaI y el gen
de tetraciclina de 1,20 kbp se hibridó con el plásmido pCAR2 que
había sido digerido con XbaI. La mezcla de hibridación se usó para
transformar TG1 recO de E. coli y se comprobó el contenido
de plásmido de las colonias individuales. El plásmido deseado pCAR21
se identificó por su modelo de restricción.
El plásmido pCAR21 se digirió con PacI y PstI y
el inserto de 13,0 kbp se hibridó con el plásmido pRM52 que había
sido digerido con PacI y NsiI. La mezcla de hibridación se usó para
transformar TG1 recO de E. coli y se comprobó el contenido
de plásmido de las colonias individuales. El plásmido deseado pCART3
se identificó por su modelo de restricción.
\global\parskip0.900000\baselineskip
El plásmido pARTr se digirió con XbaI y el gen
de tetraciclina de 1,20 kbp se hibridó con el plásmido pIGI que
había sido digerido con XbaI. La mezcla de hibridación se usó para
transformar TG1 recO de E. coli y se comprobó el contenido
de plásmido de las colonias individuales. El plásmido pIGlet deseado
se identificó por su modelo de restricción.
El plásmido pCAR21 se digirió con NheI y el
inserto de 12,0 kbp se hibridó con el plásmido pIGlet que había
sido digerido con NheI. La mezcla de hibridación se usó para
transformar TG1 recO de E. coli y se comprobaron las
colonias individuales resistentes a la actividad de tetraciclina
según su contenido de plásmido. El plásmido deseado pCART11 se
identificó por su modelo de restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
Aproximadamente 5-10 \mug de
pCART11, aislado de TG1 recO, se transformaron en NRRL2338 de S.
erythraea y se aislaron las colonias estables resistentes a la
tioestreptona.
Se realizó una fermentación de 5 ml de
NRRL2338/pCART11 de S. erythraea en medio TSB y después de
dos días a 30ºC, se usó el micelio para inocular 50 ml de medio
sacarosa-succinato que contiene tioestreptona (50
\mug/ml). Después del crecimiento a 30ºC durante cuatro días, todo
el caldo se extrajo dos veces con un volumen igual de acetato de
etilo. El disolvente se concentró y la mezcla se analizó en
GC-MS. Se identificaron los compuestos
siguientes.
El plásmido pARE24 es un plásmido basado de
pCJR24 que contiene un gen de PKS que comprende el módulo de carga
de ery, los módulos 5 y 6 de la PKS de ery, y la tioesterasa
terminadora de cadena de ery. Se construyó como sigue (Figura
30).
El plásmido pCAR21 se digirió con PacI y XbaI y
el inserto de 13,0 kbp se hibridó con el plásmido pCJR24 que había
sido digerido con PacI y XbaI. La mezcla de hibridación se usó para
transformar TG1 recO de E. coli y se comprobó el contenido
de plásmido de las colonias individuales. El plásmido deseado pARE24
se identificó por su modelo de restricción.
Aproximadamente 5-10 \mug de
pARE24, aislado de TG1 recO se transformaron en NRRL2338 de S.
erythraea y se aislaron las colonias estables resistentes a la
tioestreptona.
Se realizó una fermentación de 5 ml de
NRRL2338/pARIS24 de S. erythraea en medio TSB y después de
dos días a 30ºC, se usó el micelio para inocular 50 ml de medio
sacarosa-succinato que contiene tioestreptona (50
\mug/ml). Después del crecimiento a 30ºC durante cuatro días, todo
el caldo se extrajo dos veces con un volumen igual de acetato de
etilo. El disolvente se concentró y la mezcla se analizó en
GC-MS. Se identificaron los compuestos
siguientes.
\global\parskip1.000000\baselineskip
El plásmido pARA24 es un plásmido basado en
pCJR24 que contiene un gen de PKS que comprende el módulo de carga
de avermectina, los módulos 5 y 6 de la PKS de ery, y la tioesterasa
terminadora de cadena de ery. Se construyó como sigue.
El plásmido pIG1 se digirió con PacI y NheI y el
inserto de 1,70 kbp se hibridó con el plásmido pARIS24 que había
sido digerido con PacI y NheI. La mezcla de hibridación se usó para
transformar TG1 recO de E. coli y se comprobó el contenido
de plásmido de las colonias individuales. El plásmido deseado pARA24
se identificó por su modelo de restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
Aproximadamente 5-10 \mug de
pARA24, aislado de TG1 recO, se transformaron en NRRL2338 de S.
erythraea y se aislaron las colonias estables resistentes a la
tioestreptona.
Se realizó una fermentación de 5 ml de
NRRL2338/pARA24 de S. erythraea en medio TSB y después de dos
días a 30ºC, el micelio se usó para inocular 50 ml de medio
sacarosa-succinato que contiene tioestreptona (50
\mug/ml). Después del crecimiento a 30ºC durante cuatro días,
todo el caldo se extrajo dos veces con un volumen igual de acetato
de etilo. El disolvente se concentró y la mezcla se analizó en
GC-MS. Se identificaron los compuestos
siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pARL3 es un plásmido basado en
pCJR24 que contiene un gen de PKS que comprende el módulo de carga
de ery, los módulos 5 y 6 de la PKS de ery, y la tioesterasa de ery.
La unión entre el módulo de carga y el dominio de KS5 se hace en el
mismo borde del extremo N-terminal de KS5. Se
construyó vía varios plásmidos intermedios como sigue (Figura
31):
El segmento de ADN de 450 bp del gen de eryAI de
S. erythraea que se extiende desde el nucleótido 1 al
nucleótido 10631 de eryAI, se amplificó por PCR empleando como
cebadores los oligonucleótidos sintéticos: (las bases en negrita
denotan los sitios de la enzima de restricción).
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pARE24 se usó como plantilla. El
producto PCR se reparó por el final y se hibridó con pUC18, que
había sido linearizado mediante digestión con SmaI y que luego se
había tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de hibridación se
usó para transformar TG1 recO de E. coli y se comprobó el
contenido de plásmido de las colonias individuales. El plásmido
deseado pARL1, en el que el sitio NheI es adyacente al sitio EcoRI
del polienlazante, se identificó por su modelo de restricción y
análisis de secuencia.
El plásmido pARL1 se digirió con NheI y SphI y
el inserto de 450 bp se hibridó con el plásmido pARE24 que había
sido digerido con NheI y SphI. La mezcla de hibridación se usó para
transformar TG1 recO de E. coli y se comprobó el contenido
de plásmido de las colonias individuales. El plásmido deseado pARL2
se identificó por su modelo de restricción.
Se sintetizaron los siguientes oligonucleótidos
sintéticos complementarios para cuando se hibridaran, tendrían el
modelo necesario en los extremos 5' y 3' que es producido por la
acción de HpaI y NheI respectivamente
5'-AACCCGCGCGCGGACCAACGAAGCGGCGCCCGGCGAACCG-3'
y 5'-CTAGCGGTTCGCCGGGCGCCGCT
TCGTTGGTCCGCGCGCGGGTT-3'
TCGTTGGTCCGCGCGCGGGTT-3'
Los oligonucleótidos sintéticos se hibridaron
para dar el ADN bicatenario que se hibridó con el plásmido pARL2
que había sido digerido con NheI y HpaI. La mezcla de hibridación se
usó para transformar TG1 recO de E. coli y se comprobó el
contenido de plásmido de las colonias individuales. El plásmido
deseado pARL3 se identificó por su modelo de restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
Aproximadamente 5-10 \mug de
pARL3, aislado de TG1 recO, se transformaron en JC2 de S.
erythraea y se aislaron las colonias estables resistentes a la
tioestreptona. Se realizó una fermentación de 5 ml de
JC2-pARL3 en medio TSB y después de dos días a
30ºC, el micelio se usó para inocular 50 ml de medio
sacarosa-succinato que contiene tioestreptona (50
\mug/ml). Después del crecimiento a 30ºC durante cuatro días, todo
el caldo se extrajo dos veces con un volumen igual de acetato de
etilo. El disolvente se concentró y la mezcla se analizó en
GC-MS. Se identificaron los compuestos
siguientes:
La construcción de ERMD1 de S. erythraea,
que lleva un gen de PKS híbrida en el cual el didominio de carga de
avr se sustituye por el didominio de carga de ery de NRRL 2338 de
S. erythraea.
El plásmido pCRabc (Ejemplo 9) se linearizó con
BamHI y se hibridó a pIJ702 previamente digerido con BglII. La
mezcla contenía el plásmido deseado pAVLD (Figura 32). La mezcla de
hibridación se transformó en TG1 recO de E. coli y se
comprobó el contenido de plásmido de las colonias individuales. El
plásmido deseado pAVLD se identificó por su modelo de restricción
(Figura 32).
Aproximadamente 5-10 \mug de
pAVLD, aislado de TGIrecO de E. coli (pAVLD), se
transformaron en NRRL2338 de S. erythraea y se aislaron las
colonias estables resistentes a la tioestreptona. Una de estas
colonias se seleccionó y el ADN total se digirió con PstI y se
analizó por hibridación Southern empleando como sonda el inserto
del plásmido pCRc que contiene el fragmento del gen de ery AI que
codifica el dominio de cetosintasa KS1. El análisis mostró
fragmentos de PstI positivamente hibridizante de 8,5 kbp, 4,8 kbp y
33 kbp, indicando que la presencia de dos copias recíprocamente
integradas de pAVLD (Figura 33).
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó una fermentación de 50 ml de ERMD1 de
S. erythraea en medio de agua del grifo y después de 4 días
a 30ºC el micelio se cosechó y se usó para inocular 1,5 litros de
medio sacarosa-succinato que contiene tioestreptona
(50 g/ml).
Después del crecimiento a 30ºC durante 4 días,
todo el caldo se extrajo dos veces con un volumen igual de acetato
de etilo.
Los extractos combinados se concentraron bajo
presión reducida y se sometieron dos veces a cromatografía de capa
delgada preparatoria en placas de sílice (20 x 20 cm) eluídas con
cloroformo/metanol/0,88 amoníaco 8:2:0,01 (por vol). Los productos
se separaron por hplc en una columna de fase inversa desactivada de
C18 PhaseSep S5odS (octadecil-sílice) 6 (4,6 mm x
250 mm), se eluyeron con metanol/acetato de amonio al 0,5% (70:30
(vol/vol), a 1 ml/min. Las fracciones se reunieron entre 7 y 11
minutos a partir de tres inyecciones separadas, y las fracciones
reunidas se inyectaron de nuevo en diez inyecciones separadas. El
orden de elución de la columna fue: análogos de eritromicina B,
seguido de análogos de eritromicina D y análogos de eritromicina A.
Los análogos B y D aparecieron después de 8-10
minutos, el análogo de eritromicina A 3-4 minutos
más tarde. Los análogos que contienen una unidad iniciadora
C-4 (isobutirilo) se eluyen antes, con los análogos
con la unidad iniciadora C-5
(2-metilbutirilo) que aparece varios minutos más
tarde, aunque se superpongan el C-4 tardío (análogo
de eryA) y C-5 temprano (análogos de eritromicinas
B y D). La MS de alta resolución dio resultados para los análogos
de C-4 eryA, eryB y eryD, y para los análogos
C-5 de eryA y eryB, que corresponden estrechamente a
aquellos calculados:
En estos experimentos las eritromicinas
naturales estaban presentes sólo en cantidades bajas o no
detectables, y no había ninguna cantidad detectable de análogos de
eryC. La proporción de concentración total de compuestos
C-4/C-5 en el caldo de fermentación,
como se evalúa por ESMS de extractos de acetato de etilo de caldos,
estaba entre 4:1 y 6:1 a favor de los compuestos
C-4. La proporción de análogos A:B:D es variable,
aproximadamente 15:60:25, pero con una proporción creciente de
análogos A según procede la fermentación. El rendimiento total de
eritromicinas es aproximadamente 400 \mug/litro.
\vskip1.000000\baselineskip
Aproximadamente 5 \mug del plásmido pRMTE
(Ejemplo 6), aislado de TGI recO de E. coli (pRMTE), se
transformaron en protoplastos de NRRL2338 de S. erythraea y
se aislaron las colonias estables resistentes a la tioestreptona.
Uno de éstos se seleccionó y se denominó NRRL2338/pRMTE de S.
erythraea.
Se cultivó NRRL2338/pRMTE de S. erythraea
en sacarosa y medio succinato que contiene 50 \mug/ml de
tioestreptona a 28-30ºC. Después de 3 días, todo el
caldo se extrajo dos veces con un volumen igual de acetato de etilo,
los extractos de acetato de etilo combinados se lavaron con una
disolución de cloruro de sodio saturada, se secaron sobre sulfato
de sodio anhidro y se concentraron bajo la presión reducida.
El examen del extracto por cromatografía de capa
fina en placas de sílice eluídas con
isopropil-eter:metanol:hi-
dróxido de amonio 75:35:1 (por volumen) mostró la presencia de varios componentes. La espectrometría de masas por electropulverización de los extractos reveló la presencia de una mezcla de eritromicina A, eritronolida B (EB) y B 6-desoxieritronolida (6-DEB), junto con cantidades menores de (Ac)-6-DEB como su aducto de sodio, (Ac)-EB como su aducto de Na (411,1), y EB como su aducto de Na (424,1), y también TKL (m/e 159,1). El rendimiento de eritromicina A más eritronolida B era aproximadamente 500 mg/L de medio, comparado con aproximadamente 50 mg/L producido por NRRL2338 de S. erythraea fermentado en condiciones idénticas. Las células de NRRL2338/pRMTE de S. erythraea cosechadas a partir del caldo de fermentación después de 3 días se rompieron y su contenido en proteína se examinó por electroforesis de gel de dodecil-sulfato de sodio/poliacrilamida. Se observaron tres bandas de peso molecular alto, correspondiente a las subunidades multienzimáticas de PKS de eritromicina DEBS1, DEBS2 y DEBS3, aproximadamente diez veces más intensas que la misma banda de proteína vista a partir de extractos celulares de NRRL2338 de S. erythraea preparado por el mismo procedimiento (Caffrey, P. et al. FEBS Letters (1992) 304:225-228).
dróxido de amonio 75:35:1 (por volumen) mostró la presencia de varios componentes. La espectrometría de masas por electropulverización de los extractos reveló la presencia de una mezcla de eritromicina A, eritronolida B (EB) y B 6-desoxieritronolida (6-DEB), junto con cantidades menores de (Ac)-6-DEB como su aducto de sodio, (Ac)-EB como su aducto de Na (411,1), y EB como su aducto de Na (424,1), y también TKL (m/e 159,1). El rendimiento de eritromicina A más eritronolida B era aproximadamente 500 mg/L de medio, comparado con aproximadamente 50 mg/L producido por NRRL2338 de S. erythraea fermentado en condiciones idénticas. Las células de NRRL2338/pRMTE de S. erythraea cosechadas a partir del caldo de fermentación después de 3 días se rompieron y su contenido en proteína se examinó por electroforesis de gel de dodecil-sulfato de sodio/poliacrilamida. Se observaron tres bandas de peso molecular alto, correspondiente a las subunidades multienzimáticas de PKS de eritromicina DEBS1, DEBS2 y DEBS3, aproximadamente diez veces más intensas que la misma banda de proteína vista a partir de extractos celulares de NRRL2338 de S. erythraea preparado por el mismo procedimiento (Caffrey, P. et al. FEBS Letters (1992) 304:225-228).
Se realizó una fermentación idéntica de
NRRL2338/pRMTE de S. erythraea salvo que el medio se
suplementó con propionato de potasio 5 mM. Después de tres días, el
caldo se extrajo con acetato de etilo como antes, y los extractos
de acetato de etilo combinados se secaron sobre sulfato de sodio
anhidro y se concentraron. La TLC preparatoria usando el sistema
isopropil-éter:metanol:hidróxido de amonio 75:35:1 (por volumen)
separó los dos componentes principales. La TLC analítica mostró que
el componente de dirección más rápido (Rf 0,8) tiene la misma
movilidad que el 6-DEB auténtico; y el material de
migración más lento fue una mezcla aproximadamente igual de un
componente de Rf 0,63, co-migrando con una muestra
auténtica de TKL; y un componente de Rf 0,60, con la misma
movilidad que una muestra auténtica de EB. La espectrometría de
masas por electropulverización (ESMS) en un espectrómetro de masas
VG BioQ operado en el modo de ión positivo mostró que el componente
de Rf 0,75 tenía una m/e 387,4, como se requiere para
6-DEB. La ESMS de la mezcla de los componentes con
los valores de Rf 0,60 y 0,63 confirmó la presencia de TKL y
EB.
\vskip1.000000\baselineskip
Aproximadamente 5 \mug del plásmido pRMTE se
transformaron en protoplastos de TER43 de S. erythraea
(Cortes, J. et al., Science (1995)
268:1487-1489) y se aislaron las colonias
estables resistentes a la tioestreptona. Uno de éstos se seleccionó
y se denominó TER43/pRMTE de S. erythraea.
Se inoculó TER43/pRMTE de S. erythraea en
1L de medio sacarosa-succinato y se dejó crecer
durante 3 días a 28-30ºC. Después de 3 días, el
caldo se extrajo dos veces con un volumen igual de acetato de etilo,
y los extractos de acetato de etilo combinados se secaron sobre
sulfato de sodio anhidro y se concentraron. El análisis del
extracto por espectrometría de masas por electropulverización
(operado en el modo de ión positivo) mostró la presencia de TKL
(m/e 173,1) y de (Ac)-TKL (m/e 159,1). El
rendimiento combinado de triquetida lactonas fue 100 mg/L,
comparado con 10 mg/L obtenidos por la fermentación de TER43 de
S. erythraea en condiciones idénticas. Las células de
TER43/pRMTE de S. erythraea, cosechadas a partir del caldo de
fermentación después de 3 días, se rompieron y su contenido en
proteína se examinó por electroforesis de gel de
dodecil-sulfato de sodio/poliacrilamida. Una banda
de peso molecular alto, correspondiente a la subunidad de
eritromicina de PKS DEBS1 con el dominio de tioesterasa adjunto
(Cortes, J. et al. Science (1995)
268:1487-1489) se observó, aproximadamente
diez veces más intensa que la misma banda de proteína vista a partir
de extractos celulares de S. erythraea preparados por el
mismo procedimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Aproximadamente 25 g del plásmido pCJRTE
(pCJR30) se transforman en protoplastos de NRRL2338 de S.
erythraea y se aíslan las colonias estables resistentes a la
tioestreptona. A partir de diversas colonias, se obtiene el ADN
total y se analiza por hibridación Southern, para confirmar que el
plásmido se ha integrado específicamente en los genes eryA mediante
recombinación homóloga, para colocar los genes eryA residentes bajo
el control del promotor actI derivado del plásmido pCJRTE (pCJR30),
mientras que el gen DEBS1-TE llevado por el plásmido
entrante se coloca mediante el acontecimiento de integración bajo
el control del promotor eryA cromosómico.
Se inocula NRRL2338/pCJRTE de S.
erythraea (pCJR30) en medio sacarosa-succinato
que contiene 50 \mug/ml de tioestreptona y se deja crecer durante
cuatro días a 30ºC. Después de este tiempo, el caldo se filtra para
eliminar los micelios y luego se extrae dos veces con un volumen
igual de acetato de etilo. Los extractos de acetato de etilo
combinados se analizan por espectrometría de masas y se encuentra
que la mezcla contiene la eritromicina A, acompañado por
6-DEB, (Ac)-DEB, TKL y
(Ac)-TKL, en cantidades totales de 100 mg/L, o 5
veces la cantidad total de eritromicinas y los precursores de
eritromicinas que se obtienen usando NRRL2338 de S.
erythraea en las mismas condiciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Aproximadamente 5 \mug del plásmido pCJRTE
(pCJR30) se transforman en protoplastos de S. erythraea JC2
y se aíslan las colonias estables resistentes a la tioestreptona. A
partir de diversas colonias, se obtiene el ADN total y se analiza
por hibridación Southern, para confirmar que el plásmido se ha
integrado específicamente en la parte del gen de eryAIII que
codifica la tioesterasa/ciclasa del extremo
C-terminal, mediante recombinación homóloga.
Se inocula JC2/pCJRTE de S. erythraea
(pCJR30) en medio sacarosa-succinato que contiene 50
\mug/ml de tioestreptona y se deja crecer durante cuatro días a
30ºC. Después de este tiempo, el caldo se filtra para eliminar los
micelios y luego se extrae dos veces con un volumen igual de acetato
de etilo. Los extractos de acetato de etilo combinados se analizan
por espectrometría de masas y RMN y se encuentra que el producto
principal es TKL, y el producto minoritario (Ac)TKL, en
rendimientos totales (100 mg/L) 10 veces mayor que el obtenido
usando TER43 de S. erythraea.
\vskip1.000000\baselineskip
Aproximadamente 5 \mug del plásmido pIG1 se
transforman en protoplastos de NRRL2338 de S. erythraea y se
aíslan las colonias estables resistentes a la tioestreptona. A
partir de diversas colonias, se obtiene el ADN total y se analiza
por hibridación Southern, para confirmar que el plásmido se ha
integrado específicamente en la parte del gen de eryAIII que
codifica la tioesterasa/ciclasa del extremo
C-terminal, mediante recombinación homóloga.
Se inocula NRRL/pIG1 de S. erythraea en
medio de agua del grifo que contiene 50 \mug/ml de tioestreptona
y se deja crecer durante cuatro días a 30ºC. Después de esto, se
usan 20 ml de micelio para sembrar 500 ml de medio
sacarosa-succinato que contienen 50 \mug/ml de
tioestreptona, en un matraz de 2L con un muelle sencillo para
reducir la aglutinación, se agita a 280 revoluciones por minuto.
Después de entre 3,5 y 6 días, el caldo se filtra para eliminar los
micelios y luego se extrae tres veces con un cuarto volumen de
acetato de etilo. Los extractos de acetato de etilo combinados se
secan sobre sulfato de sodio anhidro y el disolvente se elimina por
evaporación. El análisis de la mezcla de producto usando GC y MS
electropulverización reveló que de un total de 5-6
mg/L de productos de macrólido de 14 miembros, el componente
principal fue (s-pent)-eritromicina
D (aproximadamente 1,5 mg/L), siendo otros componentes presentes
(s-pent)-eritromicina B y
(s-pent)-eritromicina A;
(i-but)-eritromicinas A, B y D; y
pequeñas cantidades de las eritromicinas naturales A, B y D. Los
extractos también contuvieron cantidades significativas (11 mg/l)
de las TKL: (s-pent)-TKL (5 mg/l),
(i-but)-TKL y TKL. (NB
s-pent e i-but indicaban las cadenas
secundarias 1-metilpropilo e isopropilo,
respectivamente, correspondiente al uso de sustratos iniciadores
s-2-metilbutilo e
i-butanoilo).
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron durante una noche 3 ml de cultivo
ATCC 6633 de Bacillus subtilis a 30ºC en caldo nutritivo
(Difco). Se sembraron 200 ml de agar-agar nutritivo
al 1,5% (difco) a 46ºC con 1 ml de cultivo de B. subtilis y
se vertió inmediatamente en placas petri (25 ml/placa). Después de
secar las placas en una mampara de flujo laminar durante 15
minutos, los pocillos (0,4 mm de diámetro) se cortaron usando un
perforador de corcho y se añadieron 20 microlitros del compuesto de
prueba en forma de una disolución en etanol (5-10
mg/L) a cada pocillo. Las placas se guardaron a 4ºC durante
5-7 horas para permitir que el compuesto se
difundiera, y las placas se incubaron después durante una noche a
30ºC. Las zonas claras de inhibición del crecimiento fueron vistas
tanto con (i-but)- como con
(s-pent)-eritromicina A.
Aunque la presente invención sea ilustrada
mediante los ejemplos expuestos anteriormente, no se deberían
considerar como una limitación del alcance de la invención. Las
anteriores descripciones ilustran primero, cómo un promotor
específico para un grupo de genes de PKS Tipo II, conectado a su gen
activador cognado específico, al contrario de lo que se esperaba,
puede usarse para conseguir una expresión controlada y potenciada de
genes de PKS Tipo 1 en un huésped heterólogo. Los ejemplos de estos
huéspedes que se proporcionan son S. erythraea y S.
avermitilis, pero será evidente para los expertos en la técnica
que huéspedes alternativos, representados por una amplia variedad
de actinomicetos, servirán igualmente como huéspedes de la
expresión. Del mismo modo, aunque se han usado el promotor actI y
su gen activador cognado actII-orf4 en estos
Ejemplos, será evidente para los expertos en la técnica que se
conocen y que están caracterizadas otras combinaciones del gen
promotor/activador de PKS Tipo II que serán igualmente eficaces en
la dirección de la expresión controlada y potenciada de genes de
PKS Tipo 1 en células heterólogas representadas a partir de una
amplia variedad de actinomicetos. Los ejemplos de tales
combinaciones de gen promotor/activador incluyen a los promotores
del grupo de genes dnr y al gen activador dnrI del grupo de genes
daunorubicina de Streptomyces peucetius: (Madduri, R. y
Hutchinson, C.R. J. Bacteriol (1995)
177:1208-1215) y el promotor del gen redX y
el gen activador redD del grupo de genes de undecilprodigiosina de
S. coelicolor (Takano, E. et al. Mol.
Microbiol. (1992) 2: 2797-2804).
En segundo lugar, las anteriores descripciones
ilustran por primera vez la construcción de genes de PKS Tipo I
híbrida y su uso para obtener nuevos productos poliquétidos de
utilidad como intermedios sintéticos quirales o como materiales
bioactivos como antibióticos. Los genes de PKS híbrida se han
construido mediante la sustitución de módulos de carga, o mediante
la sustitución de dominios individuales en los módulos de extensión;
o mediante la sustitución de módulos enteros. Así, el reemplazo del
módulo de carga de ery por el módulo de carga de avr se ha descrito
en este documento para obtener tanto nuevos análogos de eritromicina
como triquetida lactonas. Se sobrentiende fácilmente por los
expertos en la técnica que pueden obtenerse otras modificaciones del
módulo de carga de ery mediante su reemplazo por el módulo de carga
de otros grupos de genes de PKS Tipo I. Los ejemplos de tales
modificaciones incluyen el reemplazo con el módulo de carga de la
PKS de rap; y con el módulo de carga de la PKS productora de FK506.
Tales modificaciones conducirán a la síntesis de poliquétidos
específicamente modificados en su unidad iniciadora.
Los expertos en la técnica saben que el módulo
de carga de avr es capaz de aceptar una amplia variedad de ácidos
carboxílicos artificiales como unidades iniciadoras alternativas,
cuando éstos son incluidos en el medio de fermentación. Por lo
tanto, a la luz de la presente invención, es evidente que además de
la síntesis de nuevos derivados de eritromicina A en los cuales el
sustituyente C-13 es isopropilo o
sec-butilo en vez de etilo, que se ha mostrado en
este documento, pueden obtenerse muchos otros nuevos derivados de
eritromicina A alimentando con los ácidos carboxílicos artificiales
apropiados (o los compuestos convertibles en éstos mediante la
fermentación) a una cepa apropiada que aloja la PKS híbrida, tales
ácidos carboxílicos artificiales que tienen en general la fórmula
R-COOH, donde R es un grupo
alfa-ramificado, y donde el carbono que soporta el
grupo -COOH también se une a al menos otros dos átomos o grupos
además del hidrógeno, siendo los ácidos carboxílico artificiales
preferidos aquellos descritos para la producción de avermectinas
artificiales en la patente europea EP 214,731, 18 de marzo de 1987,
Pfizer). Los nuevos análogos que resultan de la eritromicina A se
convierten, mediante procedimientos muy conocidos en la técnica, en
otros nuevos derivados semisintéticos de eritromicina A, de
considerable utilidad en el tratamiento de las infecciones
bacterianas, incluyendo, por ejemplo, las quetolidas y azalidas.
Estos son nuevos materiales quirales de potencial utilidad en la
síntesis química de valiosos productos bioactivos. Los productos
que son macrólidos de 14 miembros son nuevos análogos de
eritromicina A que son agentes antibacterianos muy valiosos que
tienen las mismas dianas microbianos que las eritromicinas
conocidas y los derivados semisintéticos de eritromicinas conocidas,
como las quetolidas descritas en las patentes francesas N^{os}.
2697523 (06/05/94) Roussel Uclaf; 269724 (06/05/94) Roussel Uclaf;
y 2702480 (16/09/94) Roussel Uclaf.
Será evidente para los expertos en la técnica
que el reemplazo del módulo de carga de ery por el módulo de carga
de la PKS de rap también conducirá a nuevos análogos útiles de la
eritromicina A, en el que la unidad iniciadora del propionato
natural es sustituida por una unidad iniciadora del ácido
cicloalquilcarboxílico. Otros ejemplos de la formación de dicha PKS
Tipo I híbrida incluyen, pero no están limitados, al reemplazo del
módulo de carga de rap en Streptomyces hygroscopicus por el
módulo de carga de avr, conduciendo a la formación de rapamicinas
artificiales; y el reemplazo del módulo de carga de avr en
Streptomyces avermitilis por el módulo de carga de rap,
conduciendo a la formación de otros ejemplos de avermectinas
artificiales. La presente invención también abarca a mutantes en
los que más de una de las manipulaciones genéticas descritas en los
ejemplos son combinadas.
A la luz de la presente invención, también será
evidente que las modificaciones en la especificidad del módulo de
carga de una PKS Tipo I pueden o bien ser conseguidas mediante la
mutación de los genes que codifican el módulo de carga natural, y
luego seleccionando según la especificidad modificada deseada, como
poniendo en práctica, por ejemplo, la técnica del barajado de genes
in vitro (Stemmer, W. P. Nature (1994)
370:389-391).
Los ejemplos expuestos anteriormente también
muestran la construcción y el uso de un vector de plásmido de
número de copia bajo pCJR101 como un vector para la administración
de genes de PKS en huéspedes de actinomicetos adecuados. El
plásmido pCJR101 se deriva del plásmido SCP2* (Bibb, M. J. y
Hopwood, D. A. J. Gen. Microbiol. (1977)
154:155-166) encontrado en la cepa M110 de
Streptomyces coelicolor depositada, por ejemplo, en el
Laboratorio de Investigación Northern Regional, Peoria, Illinois,
EE.UU. con el número de entrada NRRL 15041. El plásmido SCP2* se ha
usado previamente en la construcción de varios vectores útiles tales
como pIJ2839 (Ingram, C. et al. J. Bacteriol. (1989)
171:6617-6624); el plásmido pHJL197 (Larson,
J. L. y Hershberger, C. L. J. Bacteriol. (1983)
157:314-317) y pRM5 (McDaniel, R. et
al. Science (1993) 262:1546-1550).
Será evidente para los expertos en la técnica que éstos u otro
plásmidos basados en SCP2* pueden ser sustituidos por pCJR101
directamente o después de la modificación del vector para presentar
al promotor adecuado unido a los genes de PKS, como se demuestra
por el uso del plásmido pRM5 en varios Ejemplos descritos en este
documento. Los vectores con número de copia alto, tales como el
plásmido pGM8 (Muth, G. et al. Mol. Gen. Genet.
(1989) 219:341-350) derivado del plásmido
pGS5 de Streptomyces ghanaensis, son también adecuados como
sustitutos de pCJR101, ya que son vectores integrantes, tales como
el plásmido pSAM2 (Murakami, T. et al. J. Bacteriol.
(1989) 171:1459-14??). Los expertos en la
técnica apreciarán fácilmente el carácter versátil de los intentos
para aumentar la tasa de biosíntesis de poliquétidos complejos
naturales o artificiales tales como macrólidos y poliéteres a
través del uso heterólogo de genes activadores de PKS tipo II y sus
promotores cognados como se describe en este documento, en
numerosos derivados de vectores conocidos en la técnica como útiles
para la ingeniería genética en actinomicetos.
En la construcción de genes de PKS Tipo I
híbrida, los Ejemplos muestran cómo los genes estructurales que
codifican tanto los componentes donantes como aceptadores de PKS
pueden empalmarse juntos para crear catalizadores funcionales
capaces de originar la síntesis de nuevos poliquétidos. La presente
invención muestra que sobre la elección donde se hará la unión
entre el ADN donante y aceptador, sorprendentemente, no es necesario
limitar la elección a posiciones conocidas o predeterminadas para
estar entre dominios en las denominadas regiones enlazantes. En
cambio, se prefiere que las uniones estén en las regiones limítrofes
de los dominios (particularmente los dominios KS o AT), donde las
secuencias están muy conservadas. Además, se tolera la creación de
uniones que conducen a cambios conservadores de la secuencia de
aminoácidos en tales uniones en el producto génico. También es
evidente que con el fin de crear un híbrido, los módulos de PKS
pueden ser combinados a partir de dos o más PKS naturales. En los
ejemplos dados en este documento, el ADN donante se empalma en el
ADN aceptador en una posición diversa en el dominio de la proteína
portadora de acilo (ACP) o en el dominio de la cetosintasa (KS) de
un módulo. Sin embargo, se apreciará que lo más ventajoso es
seleccionar una posición para cada unión que esté dentro de un
dominio, y cerca de un borde, de modo que la especificidad del
módulo quimérico sea fácilmente previsible, y de modo que sea
reducida al mínimo la perturbación de su funcionamiento
apropiado.
Será fácilmente apreciado a la luz de la
presente invención que puede construirse una PKS híbrida
seleccionando trozos de ADN que codifiquen respectivamente un
módulo de carga, un número variable de módulos de extensión hasta
al menos seis en número y un dominio de tioesterasa liberador de
cadena; y concadenando el ADN, usando procedimientos estándares, en
el orden que se requiera para que los productos génicos funcionen.
Nota: Las PKS híbridas con (digamos) 6 módulos pueden ser parte de
un ensamblaje de sintasas que conducen a un producto producido por
muchos más de 6 módulos de extensión. También será fácilmente
evidente para los expertos en la técnica que pueden ser
constituidos los fragmentos de ADN con un tamaño de módulo en más de
una forma. Por lo tanto, la presente invención incluye la
construcción de PKS híbridas funcionales ejemplificadas por el
constructo que contiene las actividades siguientes en una cadena
polipeptídica sola:
ATO-ACPO-KS1-[ATR1-DHR1-ERR1-KRR1-ACPR1-KSR2]-AT2-KR2-ACP2-TE
donde las actividades mostradas en
corchetes se derivan de los módulos 1 y 2 de la PKS de rap, y el
resto se deriva del módulo de carga, módulos de extensión 1 y 2, y
la tioesterasa terminadora de cadena de DEBS1. En tales
constructos, cada dominio de cetosintasa se mantiene junto con ACP,
AT y los dominios reductores del módulo que lo precede en las PKS
naturales de las cuales se derivan, en vez de con las actividades de
su propio módulo. Serán fácilmente evidentes para los expertos en
la técnica otras disposiciones alternativas, pero igualmente
funcionales, de los componentes básicos de ADN con el tamaño de
módulo para la construcción de PKS
híbridas.
Claims (21)
1. Un gen de poliquétido sintasa ("PKS")
híbrida que comprende:
- (i)
- una primera parte de ácido nucleico o partes que codifican un módulo de carga, y opcionalmente también la cetosintasa (KS) en el principio del primer módulo de extensión siguiente, de una primera PKS tipo I; y
- (ii)
- una segunda parte de ácido nucleico o partes que codifican al menos un dominio de un módulo de extensión de PKS tipo I de una segunda PKS tipo I,
en el que el módulo de carga, y opcionalmente
también la cetosintasa (KS) en el principio del siguiente primer
módulo de extensión, es de una PKS tipo I diferente a todos los
módulos de extensión del gen de PKS híbrida.
2. Un gen de PKS híbrida que comprende una
primera parte de ácido nucleico o partes de una primera PKS tipo I,
y una segunda parte de ácido nucleico o partes de una segunda PKS
tipo I que es diferente de dicha primera PKS en la que:
- (i)
- dicha primera parte de ácido nucleico o partes codifican un módulo de carga de dicha primera PKS tipo I y opcionalmente el dominio de cetosintasa del primer módulo de extensión de dicha primera PKS tipo I;
- (ii)
- dicha segunda parte de ácido nucleico o partes codifican al menos un dominio de un módulo de extensión de PKS tipo I de dicha segunda PKS tipo I; y
en el que el sitio de empalme entre la primera
parte de ácido nucleico y la segunda parte de ácido nucleico está
localizado en la región enlazante entre el módulo de carga y el
dominio de KS del primer módulo de extensión de la segunda PKS tipo
I, en el principio del dominio de KS del primer módulo de extensión
de la segunda PKS tipo I, en la región del final del dominio de KS
del primer módulo de extensión de la primera PKS tipo I o en la
región enlazante entre el dominio de KS del primer módulo de
extensión de la primera PKS tipo I y el dominio AT del primer
módulo de extensión de la segunda PKS tipo I.
3. Un gen de PKS híbrida según la
reivindicación 1 ó 2, en el que dicho módulo de carga comprende una
aciltransferasa y una proteína portadora de acilo.
4. Un gen de PKS híbrida según cualquiera de
reivindicaciones 1-3, en el que dicha primera parte
de ácido nucleico o partes codifican dicho módulo de carga
sólo.
5. Un gen de PKS híbrida según cualquiera de
las reivindicaciones 1-3, en el que en dicha primera
PKS tipo I, dicho módulo de carga es seguido de un módulo de
extensión que comienza con un dominio de cetosintasa ("KS"); y
dicha primera parte de ácido nucleico codifica dicho módulo de carga
junto con sólo dicho dominio de cetosintasa ("KS") de dicho
módulo de extensión de la primera PKS.
6. Un gen de PKS híbrida según cualquiera de
las reivindicaciones 1-5, en el que dicho módulo de
carga es capaz de cargar un sustrato para producir una unidad
iniciadora diferente de una unidad iniciadora de un poliquétido
como se produce por dicha segunda PKS tipo I.
7. Una PKS híbrida según cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, en la que dicho módulo de
carga es capaz de cargar cualquiera de una multiplicidad de
unidades iniciadoras diferentes.
8. Un gen de PKS híbrida según la
reivindicación 7, en el que dicho módulo de carga es un módulo de
carga de avr.
9. Un gen de PKS híbrida según la
reivindicación 1 ó 2, en el que dicho módulo de carga es un módulo
de carga de rap.
10. Un gen de PKS híbrida según la
reivindicación 1 ó 2, en el que dicho módulo de carga es un módulo
de carga productor de FK506.
11. Un gen de PKS híbrida según cualquier
reivindicación precedente, en el que al menos una de dichas partes
de ácido nucleico codifica un módulo combinatorio, es decir una
parte de ácido nucleico que se extiende en la primera o la segunda
PKS tipo I entre dominios correspondientes de dos módulos
naturales.
12. Un gen de PKS híbrida según cualquier
reivindicación precedente, incluyendo el ácido nucleico que codifica
una enzima terminadora de cadena, además de la tioesterasa.
13. El ácido nucleico que codifica un gen según
cualquiera de las reivindicaciones 1-12
operativamente unido a un promotor de PKS tipo II.
\newpage
14. El ácido nucleico que codifica un gen según
la reivindicación 13, en el que el promotor está acompañado por su
gen activador natural.
15. El ácido nucleico según la reivindicación
13, en el que el promotor es act I de S. coelicolor.
16. El ácido nucleico según la reivindicación
15, en el que el promotor está acompañado por el activador
ActII-orf4 de S. coelicolor.
17. Una poliquétido sintasa híbrida como la
codificada por un gen según cualquiera de las reivindicaciones
1-12.
18. Un vector que incluye un gen o ácido
nucleico según cualquiera de las reivindicaciones
1-16.
19. Una bacteria filamentosa transformada que
contiene un gen o ácido nucleico según cualquiera de las
reivindicaciones 1-15 y capaz de expresar una
poliquétido sintasa codificada por éste.
20. Un método para producir una bacteria
filamentosa transformada como se define en la reivindicación 19 que
comprende la etapa de introducir un plásmido que contiene el ADN
'donante' en una célula huésped en condiciones tal que hay
recombinación homóloga con el ADN de la PKS cromosómico
heterólogo.
21. Un método para preparar un poliquétido
cultivando la bacteria filamentosa de la reivindicación 19.
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