CN101519637B - 一种红色糖多孢菌及其发酵生产红霉素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种红色糖多孢菌及其发酵生产红霉素的方法，红色糖多孢菌Saccharopolyspora erythraea HD03，保藏单位是中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为GMCC No.2916；其具体步骤为，从保藏斜面挖块1cm×1cm或甘油管，接种于灭过菌的种子培养基，温度32～34℃，摇床转速220～240r/min，培养44～48h；然后再以3～10％接种量接入灭过菌的发酵培养基中，温度32～34℃，摇床转速220～240r/min，培养6～7day，在20～24小时添加前体正丙醇，在发酵中后期添加甲基化试剂和羟基化试剂；得到红霉素。本发明的优点：在发酵过程中添加甲基化试剂和羟基化试剂，提高红霉素合成过程中前体的甲基化作用和羟基化作用，减少副产物的积累，提高主产物的产量。
Description
【技术领域】
本发明涉及红霉素技术领域，具体地说，是一种红色糖多孢菌及其发酵生产红霉素的方法，涉及菌种为红色糖多孢菌Saccharopolyspora erythraeaHD03 CGMCC No.2916。
【背景技术】
红霉素(erythromycin，Er)是由红色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)合成的次级代谢产物，为14元大环内酯类抗生素。红霉素具有广谱抗菌作用，对革兰氏阳性细菌、抗酸杆菌、立克次氏体及大病毒有抗菌活性，是治疗耐药性金黄色葡萄球菌感染和溶血性链球菌感染所引起疾病的首选药物，临床上可用于对青霉素过敏的患者。20世纪90年代以来，国际市场上红霉素畅销，其产量有较大幅度增长，成为世界抗生素市场上第三大类药物。
红霉素是多组分的抗生素。临床上具有广泛用途的是红霉素A(ErA)，它的抑菌活性最高。红霉素B(ErB)、红霉素C(ErC)为杂质。ErC的抗菌活性小，毒性却是A的2倍。在红霉素发酵液中，除了有抑菌活性的红霉素A主组分，同时存在红霉素B，C等杂质组分，杂质组分的存在不仅降低了红霉素A的得率，增加了发酵液后提取的压力，增加了产品的生产成本。
从红霉素的结构上得出，ErA、ErB与ErC在结构式上的差异仅在于红霉内酯环C12和碳霉糖3”位连接的基团不同。红霉素B与红霉素A相比，C12连接的是-H而非-OH；红霉素C与红霉素A相比，C3”接的是-OH而非-OCH3。
红霉素的生物合成可分为两部分：大环内酯环的合成和大环内酯环的后修饰。以丙酸和甲基丙二酸的活性形式丙酰CoA和甲基丙二酰CoA为原料，经缩合、酮还原、脱水和烯还原等多轮循环合成大环内酯环6-脱氧红霉内酯B(6-deoxycrythronolide B，6-dEB)，6-dEB在羟化酶(eryF)、糖基转移酶作用下，先后在C-6位形成羟基，C-3位、C-5位接上L-mycarose(碳霉糖)和D-desosamine(去氧二甲氨基己糖，红霉糖胺)，形成红霉素生物合成过程中的第一个具有生物活性的红霉素D(ErD)。
ErD沿两条分支途径转化为红霉素A：在eryK的作用下，先羟基化生成ErC，然后在eryG的作用下甲基化，生成ErA；或在eryG的作用下，先甲基化生成ErB，然后在eryK的作用下羟基化，生成ErA。研究表明，eryK对ErD的催化能力较ErB高1200～1900倍，故ErC是主要的合成途径，ErB是支路合成途径。
ErD转化为ErA的程度和速度极大程度上取决于培养液的溶氧。EryK蛋白类似于细胞色素P450，属单加氧酶，氧含量的增加可提高EryK的羟基化作用。培养液中溶解氧的浓度维持在40％以上时，蛋白质EryK能保证90％的ErD羟基化转化为ErA。但是尽管高溶氧浓度是必须的，胞内高的糖苷配基流量也会导致ErD中间体转化成ErB这一支路产物。
【发明内容】
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种红色糖多孢菌及其发酵生产红霉素的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明在于提供一种红色糖多孢菌Saccharopolyspora erythraea HD03GMCC No.2916；该红霉菌株的保藏单位是中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏日期为2009年2月20日，由华东理工大学生物系发酵实验室培养制得。
一种利用红色糖多孢菌及其发酵生产红霉素的方法，具体步骤为，包含培养和发酵两个阶段，从保藏斜面挖块1cm×1cm或甘油管，接种于灭过菌的种子培养基，温度32～34℃，摇床转速220～240r/min，培养44～48h；然后再以3～10％接种量接入灭过菌的发酵培养基中，温度32～34℃，摇床转速220～240r/min，培养6～7day，在20～24小时添加前体正丙醇，在发酵中后期添加甲基化试剂和羟基化试剂；得到红霉素；
所述的种子培养基组份为：淀粉0.2g/l，黄豆饼粉0.25g/l，糊精0.25g/l，玉米浆0.08g/l，硫酸铵0.03g/l，氯化钠0.04g/l，碳酸钙0.02g/l，豆油0.04g/l，余量为自来水；
所述的发酵培养基组份为：淀粉0.5g/l，黄豆饼粉0.6g/l，糊精0.1g/l，玉米浆0.2g/l，硫酸铵0.03g/l，氯化钠0.02g/l，碳酸钙0.03g/l，豆油0.06g/l，余量为自来水；
所述的甲基化试剂选自甲硫氨酸，叶酸，甜菜碱或者氯化胆碱中的一种；
所述的羟基化试剂包括表面活性剂和氧载体，如Tween80，Tween85，Triton100，正十二烷，蓖麻油。
在本发明中，发酵液化学效价的测定：
发酵液经过滤后用蒸馏水稀释至200～300U/mL，在干燥的10mL容量瓶中加入4mL 10mol/L磷酸溶液及0.8mL稀释液，混匀后在沸水浴中保温三分钟，冷却后定容至10mL，在485nm处比色，以蒸馏水作空白；测出的吸光度值代入公式(1-1)；
红霉素效价(U/mL)＝712.08×OD485+30.092 (1-1)
在本发明中，红霉素组分含量测定：
采用HPLC法，使用Waters公司HPLC设备(717 plus Autosampler，2487Dual absorbance detector，1525 Binary HPI C pump)，采用反相柱C18柱RP-C18(250mm×4.6mm，5μm)，以乙腈(色谱纯)∶0.5％磷酸二氢铵缓冲液＝35∶65为流动相，流速为1mL/min，在215nm处检测，柱温为35℃，定量分析样品中红霉素A、B、C，进样量：10μL。
与现有技术相比，本发明的积极效果是：
(1)本发明是基于发酵过程中添加甲基化试剂和羟基化试剂，提高红霉素合成过程中前体的甲基化作用和羟基化作用，减少副产物的积累，提高主产物的产量；
(2)本发明使用的甲基化试剂包括所有能在生物体内提高甲基供应的试剂，包括甲硫氨酸，叶酸，氯化胆碱，甜菜碱等，提高红霉素合成途径的甲基化作用，提高经EryC到EryA或EryD到EryB的途径流量；
(3)本发明使用的羟基化试剂包括所有能提高发酵液供氧能力的试剂，如表面活性剂，氧载体等，包括吐温，曲拉通，正十二烷，蓖麻油等，提高红霉素合成途径的甲基化作用，提高经EryD到EryC或EryB到EryA的途径流量。
【具体实施方式】
以下提供本发明一种红色糖多孢菌及其发酵生产红霉素的方法的具体实施方式。
在本发明的实施例中，所述的种子培养基组份为：淀粉2.0g，黄豆饼粉2.5g，糊精2.5g，玉米浆0.8g，硫酸铵0.3g，氯化钠0.4g，碳酸钙0.2g，豆油0.4g，用自来水定容至100mL；
所述的发酵培养基组份为：淀粉5.0g，黄豆饼粉6.0g，糊精1.0g，玉米浆2.0g，硫酸铵0.3g，氯化钠0.2g，碳酸钙0.3g，豆油0.6g，用自来水定容至100mL。
实施例1
将培养良好的种子培养液按照10％接种量接入含有25mL发酵培养基的250mL中三角瓶中，培养温度34℃，摇床转速240r/min，培养24h时添加前体正丙醇300μL，96h添加吐温-80 15μL，7天后放瓶效价6838U/mL，EryA含量为88.4％，EryB含量为6.7％，EryC含量为7％。不添加吐温-80的对照效价为6130U/mL，EryA含量为63.7％，EryB含量为29.6％，EryC含量为6.7％。
实施例2
将培养良好的种子培养液按照8％接种量接入含有25mL发酵培养基的250mL中三角瓶中，培养温度34℃，摇床转速240r/min，培养24h时添加前体正丙醇300μL，96h添加吐温-85 120μL，7天后放瓶效价5642U/mL，EryA含量为68.1％，EryB含量为18.1％，EryC含量为13.7％。不添加吐温-85的对照效价为5347U/mL，EryA含量为63.3％，EryB含量为23.7％，EryC含量为13.0％。
实施例3
将培养良好的种子培养液按照8％接种量接入含有25mL发酵培养基的250mL中三角瓶中，培养温度34℃，摇床转速240r/min，培养24h时添加前体正丙醇300μL，96h添加曲拉通-100 60μL，7天后放瓶效价6239U/mL，EryA含量为71％，EryB含量为17.4％，EryC含量为11.5％。不添加曲拉通-100的对照效价为5216U/mL，EryA含量为64％，EryB含量为26.4％，EryC含量为9.7％。
实施例4
将培养良好的种子培养液按照10％接种量接入含有25mL发酵培养基的250mL中三角瓶中，培养温度34℃，摇床转速240r/min，培养24h时添加前体正丙醇300μL，120h添加氯化胆碱20mg，7天后放瓶效价6393U/mL，EryA含量为84.4％，EryB含量为10.2％，EryC含量为5.4％。不添加氯化胆碱的对照效价为6125U/mL，EryA含量为77.2％，EryB含量为13.8％，EryC含量为9.1％。
实施例5
将培养良好的种子培养液按照10％接种量接入含有25mL发酵培养基的250mL中三角瓶中，培养温度34℃，摇床转速240r/min，培养24h时添加前体正丙醇300μL，120h添加甜菜碱25mg，7天后放瓶效价6084U/mL，EryA含量为76.6％，EryB含量为15.7％，EryC含量为7.7％。不添加甜菜碱的对照效价为6125U/mL，EryA含量为77.2％，EryB含量为13.8％，EryC含量为9.1％。
实施例6
将培养良好的种子培养液按照8％接种量接入含有25mL发酵培养基的250mL中三角瓶中，培养温度34℃，摇床转速240r/min，培养24h时添加前体正丙醇300μL，96h添加吐温-80 15μL，120h添加氯化胆碱20mg，7天后放瓶效价6127U/mL，EryA含量为83.5％，EryB含量为9.7％，EryC含量为6.9％。不添加吐温-80和氯化胆碱的对照效价为5347U/mL，EryA含量为63.3％，EryB含量为23.7％，EryC含量为13.0％。
实施例7
将培养良好的种子培养液按照8％接种量接入含有25mL发酵培养基的250mL中三角瓶中，培养温度34℃，摇床转速240r/min，培养24h时添加前体正丙醇300μL，96h添加吐温-85 120μL，120h添加氯化胆碱20mg，7天后放瓶效价5735U/mL，EryA含量为75.3％，EryB含量为15.2％，EryC含量为9.5％。不添加吐温-85和氯化胆碱的对照效价为5347U/mL，EryA含量为63.3％，EryB含量为23.7％，EryC含量为13.0％。
实施例8
将培养良好的种子培养液按照8％接种量接入含有25mL发酵培养基的250mL中三角瓶中，培养温度34℃，摇床转速240r/min，培养24h时添加前体正丙醇300μL，96h添加曲拉通-100 60μL，120h添加氯化胆碱20mg，7天后放瓶效价5543U/mL，EryA含量为89.4％，EryB含量为1.9％，EryC含量为8.7％。不添加曲拉通-100和氯化胆碱的对照效价为4808U/mL，EryA含量为79％，EryB含量为8.8％，EryC含量为12.4％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。
Claims (6)
1.一种红色糖多孢菌，其特征在于，红色糖多孢菌Saccharopolysporaerythraea HD03，保藏单位是中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2916。
2.一种利用如权利要求1所述的红色糖多孢菌发酵生产红霉素的方法，其特征在于，具体步骤为，包含培养和发酵两个阶段，从保藏斜面挖块1cm×1cm或甘油管，接种于灭过菌的种子培养基，温度32～34℃，摇床转速220～240r/min，培养44～48h；再以3～10％接种量接入灭过菌的发酵培养基中，温度32～34℃，摇床转速220～240r/min，培养6～7day，在20～24小时添加前体正丙醇，在发酵中后期添加甲基化试剂和羟基化试剂；得到红霉素。
3.如权利要求2所述的一种红色糖多孢菌发酵生产红霉素的方法，其特征在于，所述的种子培养基组份为：淀粉0.2g/l，黄豆饼粉0.25g/l，糊精0.25g/l，玉米浆0.08g/l，硫酸铵0.03g/l，氯化钠0.04g/l，碳酸钙0.02g/l，豆油0.04g/l，余量为自来水。
4.如权利要求2所述的一种红色糖多孢菌发酵生产红霉素的方法，其特征在于，所述的发酵培养基组份为：淀粉0.5g/l，黄豆饼粉0.6g/l，糊精0.1g/l，玉米浆0.2g/l，硫酸铵0.03g/l，氯化钠0.02g/l，碳酸钙0.03g/l，豆油0.06g/l，余量为自来水。
5.如权利要求2所述的一种红色糖多孢菌发酵生产红霉素的方法，其特征在于，所述的甲基化试剂选自甲硫氨酸，叶酸，甜菜碱或者氯化胆碱中的一种。
6.如权利要求2所述的一种红色糖多孢菌发酵生产红霉素的方法，其特征在于，所述的羟基化试剂包括表面活性剂和氧载体。
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