CN102041288B - 一种添加二甲基亚砜提高红霉素发酵的方法 - Google Patents

一种添加二甲基亚砜提高红霉素发酵的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种添加二甲基亚砜提高红霉素发酵的方法，具体步骤为：(1)菌种，(2)培养基，(3)摇瓶培养方法，种子培养：将种子液在34℃的摇床间培养48h，摇床转速为220～240r/min；摇瓶发酵培养：将接入种子液的发酵液在34℃的摇床间培养，摇床转速为220～240r/min，加入二甲基亚砜，浓度为0.08～0.56％，添加时间为0～120h；(4)罐发酵培养：将甘油管保藏的菌株按10％接种量接入装有60ml一级种子培养基的500ml一级种子瓶，(34±1)℃培养48h后，按相同接种量接入装量相同的500ml二级种子瓶中，同温培养24h，再按10％接种量接入装有10L发酵培养基的15L发酵罐中，培养7d。本发明的优点：提高的发酵效价，提高红霉素产量。

Description

一种添加二甲基亚砜提高红霉素发酵的方法
【技术领域】
本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种添加二甲基亚砜提高红霉素发酵的方法。
【背景技术】
红霉素(erythromycin，Er)是一类大环内酯类抗生素，包括红霉素A(ErA)、红霉素B(ErB)、红霉素C(ErC)、红霉素D(ErD)、红霉素E(ErE)和红霉素F(ErF)。在临床上具有广泛用途的是红霉素A，它的抑菌活性最高，最初从一种放线菌--红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)中分离出来。中国药典95版规定红霉素成品的生物效价按无水物计算每1mg效价不得少于920红霉素单位以控制其质量。
红霉素生物合成的一般途径如Fig.1。以丙酰CoA和甲基丙二酰CoA为起始原料，在聚酮合成酶(polyketide synthase，PKS)的催化下，经缩合、酮还原、脱水和烯还原等多轮循环生成红霉素母核6-脱氧-红霉内酯B(6-deoxycrythronolide B，6-dEB)，然后经母核大环C-6羟基化、C-3和C-5O-糖基化、C-3-O-糖基上C-3″-O-甲基化及C-12羟基化，完成红霉素母核的后修饰，形成红霉素A。红霉素A合成途径中有两步羟基化反应，即C-6位和C-12位，分别由羟化酶EryF和EryK催化，这两个酶的空间结构类似于一种细胞色素P450。对于羟基化反应，有文献报道小分子有机溶剂(如二甲基亚砜DMSO、丙酮、乙醇等)可使细胞色素P450酶mRNA量增加，实验证实，添加小分子有机溶剂二甲基亚砜和丙酮能提高细胞色素P450酶的表达量，促进红霉素合成。
Figure GSA00000084346100021
【发明内容】
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种添加二甲基亚砜提高红霉素发酵的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种添加二甲基亚砜提高红霉素发酵的方法，具体步骤为：
(1)菌种
红色糖多孢菌HD(Saccharopolyspora erythraea，HD)，本实验室保藏菌种，
参见申请人申请的中国发明专利CN101519637A；
淀粉、黄豆饼粉、糊精由河南天方药业集团提供，其余原料均为工业纯市售产品；
(2)培养基
摇瓶种子及罐一级种子培养基(％)可溶性淀粉2.0，糊精2.5，黄豆饼粉2.5，玉米浆0.8，硫酸铵0.18，氯化钠0.4，碳酸钙0.2，豆油0.2；装量30ml/250ml，消前pH 7.4；
摇瓶发酵培养基(％)：淀粉5.0，黄豆饼粉3.0，玉米浆0.4，硫酸铵0.15，碳酸钙0.4，豆油0.2，葡萄糖2.5，pH 7.0～7.2；
罐二级种子培养基(％)淀粉2.0，黄豆饼粉2.5，糊精2.5，玉米浆2.3，硫酸铵0.15，碳酸钙0.20，豆油0.2，消前pH 7.4；
罐发酵培养基(％)淀粉5.0，黄豆饼粉2.5，糊精2.5，玉米浆2.3，硫酸铵0.15，碳酸钙0.20，豆油0.2，消前pH 7.0～7.2；
(3)摇瓶培养方法
种子培养：将种子液在34℃的摇床间培养48h，摇床转速为220～240r/min；
摇瓶发酵培养：将接入种子液的发酵液在34℃的摇床间培养，摇床转速为220～240r/min，加入二甲基亚砜，浓度为0.08～0.56％，添加时间为0～120h；
所述的二甲基亚砜浓度优选为0.16％；
所述的培养时间优选为48h；
(4)罐发酵培养
将甘油管保藏的菌株按10％接种量接入装有60ml一级种子培养基的500ml一级种子瓶，(34+1)℃培养48h后，按相同接种量接入装量相同的500ml二级种子瓶中，同温培养24h，再按10％接种量接入装有10L发酵培养基的15L发酵罐中，培养7d；
本发明的二甲基亚砜也可以由丙酮，乙醇来代替，或者其他能提高P450酶的试剂等。
与现有技术相比，本发明的积极效果是：
由于二甲基亚砜是具有一定毒性的物质，浓度过高加入，效价显著下降，因此在合适的时间添加适量的二甲基亚砜才会在基本不影响菌体正常代谢的条件下提高的发酵效价。
48h向培养基中流加0.16％的二甲基亚砜，红霉素的效价达7916u/ml，比对照提高11.3％。进一步研究发现，二甲基亚砜可以提高羟基化酶P450单加氧酶的含量，从而提高红霉素产量。
【附图说明】
图1不同时间添加二甲基亚砜对红霉素效价的影响图；
图2二甲基亚砜添加浓度对红霉素发酵的影响图；
图3总糖的消耗曲线图；
图4菌浓变化曲线图；
图5二甲基亚砜对红霉素效价的影响图；
图6二甲基亚砜对P450单加氧酶含量的影响图。
【具体实施方式】
以下提供本发明一种添加二甲基亚砜提高红霉素发酵的方法的具体实施方式。
实施例1
一种添加二甲基亚砜提高红霉素发酵的方法，具体步骤为：
(1)菌种
红色糖多孢菌HD(Saccharopolyspora erythraea，HD)，本实验室保藏菌种，参见申请人申请的中国发明专利CN101519637A；
淀粉、黄豆饼粉、糊精由河南天方药业集团提供，其余原料均为工业纯市售产品；
(2)培养基
摇瓶种子及罐一级种子培养基(％)可溶性淀粉2.0，糊精2.5，黄豆饼粉2.5，玉米浆0.8，硫酸铵0.18，氯化钠0.4，碳酸钙0.2，豆油0.2；装量30ml/250ml，消前pH 7.4；
摇瓶发酵培养基(％)：淀粉5.0，黄豆饼粉3.0，玉米浆0.4，硫酸铵0.15，碳酸钙0.4，豆油0.2，葡萄糖25，pH 7.0～7.2；
罐二级种子培养基(％)淀粉2.0，黄豆饼粉2.5，糊精2.5，玉米浆2.3，硫酸铵0.15，碳酸钙0.20，豆油0.2，消前pH 7.4；
罐发酵培养基(％)淀粉5.0，黄豆饼粉2.5，糊精2.5，玉米浆2.3，硫酸铵0.15，碳酸钙0.20，豆油0.2，消前pH 7.0～7.2；
(3)摇瓶培养方法
种子培养：将种子液在34℃的摇床间培养48h，摇床转速为220～240r/min；
摇瓶发酵培养：将接入种子液的发酵液在34℃的摇床间培养，摇床转速为220～240r/min，加入二甲基亚砜，浓度为0.16％，培养时间为0h。
实施例2
摇瓶发酵培养时间为24h，其它同实施例1。
实施例3
摇瓶发酵培养时间为48h，其它同实施例1。
实施例4
摇瓶发酵培养时间为72h，其它同实施例1。
实施例5
摇瓶发酵培养时间为96h，其它同实施例1。
实施例6
摇瓶发酵培养时间为120h，其它同实施例1。
由图1可以看出，在发酵0h，48h，72h，120h添加0.16％的二甲基亚砜均使得最终效价提高，且48h添加二甲基亚砜使得红霉素产量最高。确定二甲基亚砜最优添加时间为48h。
实施例7
一种添加二甲基亚砜提高红霉素发酵的方法，具体步骤为：
(1)菌种
红色糖多孢菌HD(Saccharopolyspora erythraea，HD)，本实验室保藏菌种，参见申请人申请的中国发明专利CN101519637A；
淀粉、黄豆饼粉、糊精由河南天方药业集团提供，其余原料均为工业纯市售产品；
(2)培养基
摇瓶种子及罐一级种子培养基(％)可溶性淀粉2.0，糊精2.5，黄豆饼粉2.5，玉米浆0.8，硫酸铵0.18，氯化钠0.4，碳酸钙0.2，豆油0.2；装量30ml/250ml，消前pH 7.4；
摇瓶发酵培养基(％)：淀粉5.0，黄豆饼粉3.0，玉米浆0.4，硫酸铵0.15，碳酸钙0.4，豆油0.2，葡萄糖25，pH 7.0～7.2；
罐二级种子培养基(％)淀粉2.0，黄豆饼粉2.5，糊精2.5，玉米浆2.3，硫酸铵0.15，碳酸钙0.20，豆油0.2，消前pH 7.4；
罐发酵培养基(％)淀粉5.0，黄豆饼粉2.5，糊精2.5，玉米浆2.3，硫酸铵0.15，碳酸钙0.20，豆油0.2，消前pH 7.0～7.2；
(3)摇瓶培养方法
种子培养：将种子液在34℃的摇床间培养48h，摇床转速为220～240r/min；
摇瓶发酵培养：将接入种子液的发酵液在34℃的摇床间培养，摇床转速为220～240r/min，加入二甲基亚砜，浓度为0.08％，培养时间为48h。
实施例8
加入二甲基亚砜，浓度为0.16％，其它同实施例7。
实施例9
加入二甲基亚砜，浓度为0.24％，其它同实施例7。
实施例10
加入二甲基亚砜，浓度为0.32％，其它同实施例7。
实施例11
加入二甲基亚砜，浓度为0.40％，其它同实施例7。
实施例12
加入二甲基亚砜，浓度为0.48％，其它同实施例7。
实施例13
加入二甲基亚砜，浓度为0.56％，其它同实施例7。
由图2可知，二甲基亚砜添加浓度低于0.32％时，红霉素效价有所提高，最高可比对照增加13％。添加中等浓度的二甲基亚砜，效价与对照样品比较同样有所增加，但增加幅度不大。当添加0.56％的二甲基亚砜时，效价降低，可能是因为高浓度的二甲基亚砜抑制了菌体生长，导致红霉素合成下降，最终确定二甲基亚砜的最佳添加浓度为0.16％，效价提高13％。
实施例14
在15L FUS-15L(A)发酵罐上运用复合培养基进行验证。于48h流加0.16％(V/V)的二甲基亚砜，研究添加二甲基亚砜对红霉素合成代谢的影响。
二甲基亚砜对菌体糖耗速率的影响：由图3所示，以上结果显示，二甲基亚砜罐的糖耗速率总体都比对照罐高，平均在1.0g/l/h。对照罐的糖耗在0.6g/L/h上下波动。在115h左右二甲基亚砜罐的糖耗速率出现最低值，只有0.29g/L/h，结合图4可以看出此时菌浓也下降到最低值，可能此时发酵液中营养物质大部分被消耗，导致部分菌体自溶，因而糖耗也相应降低。127h左右对照罐的糖耗又回到0.6g/L/h。
从图4对照罐的菌浓在接种后31h达到40％，二甲基亚砜罐的菌浓比对照稍低，为32％。随着发酵不断进行，由于补料、取样等因素使得发酵后期对照罐的菌浓维持在60％左右，条件罐在55％左右。可见，流加此浓度的二甲基亚砜不会对红色糖多孢菌产生大的毒性。
二甲基亚砜对红霉素效价的影响：
由图5所示，对照罐和二甲基亚砜罐67h的起步效价都在3000U/mL左右，但对照罐在72h后效价增长缓慢，最终效价为7132U/mL。而二甲基亚砜罐虽然在72～100h效价增长比对照罐缓慢，但在100h后增长速度明显，最终效价达到7961U/mL，比对照罐提高了11％。
二甲基亚砜对P450单加氧酶含量的影响：
添加二甲基亚砜对P450单加氧酶含量的影响进行了研究，在最优添加时间48h和添加量0.16％下添加二甲基亚砜，每隔一段时间取样分析，对P450单加氧酶含量的影响见图6。
图6显示，对照样品的P450酶含量在96h达到最高值，此时是红霉素合成的最佳时期。在整个发酵过程中，添加了二甲基亚砜的条件样品中P450酶的含量基本上或多或少地高于对照样品的。直到发酵结束，条件样品的P450酶含量达0.825nmol/mg，比对照样品的0.430nmol/mg提高了0.395nmol/mg。
另外，本发明的二甲基亚砜也可以由丙酮，乙醇来代替，或者其他能提高P450酶的试剂等，其它过程同二甲基亚砜。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。

Claims (1)

1.一种添加二甲基亚砜提高红霉素发酵的方法，其特征在于，具体步骤为：
（1）菌种
菌种为红色糖多孢菌HD；
（2）培养基
摇瓶种子培养基：可溶性淀粉2.0%，糊精2.5%，黄豆饼粉2.5%，玉米浆0.8%，硫酸铵0.18%，氯化钠0.4%，碳酸钙0.2%，豆油0.2%；装量30ml/250ml，消前pH7.4；
摇瓶发酵培养基：淀粉5.0%，黄豆饼粉3.0%，玉米浆0.4%，硫酸铵0.15%，碳酸钙0.4%，豆油0.2%，葡萄糖2.5%，pH7.0～7.2；
（3）摇瓶培养方法
种子培养：将种子液在34℃的摇床间培养48h，摇床转速为220～240r/min；
摇瓶发酵培养：将接入种子液的发酵液在34℃的摇床间培养，摇床转速为220～240r/min，在发酵的第48小时添加0.16％的二甲基亚砜DMSO，持续作用至发酵的第180h。
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