CN103484515B - 一种红霉素链霉菌发酵生产红霉素的培养基和培养方法 - Google Patents
一种红霉素链霉菌发酵生产红霉素的培养基和培养方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种红霉素链霉菌发酵生产红霉素的新型培养基和培养方法,其一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基中均含有甘蔗糖蜜、啤酒酵母干渣和蚯蚓粉。本发明通过采用甘蔗糖蜜替代葡萄糖;啤酒酵母干渣和蚯蚓粉代替黄豆粉、蛋白胨、花生饼粉和玉米浆,优化其培养基配方,从而解决了原辅料的成本问题,并且最大限度的降低原辅料来源不受环境影响,保证其供应充足,实现红霉素稳定、高效的生产。同时利用该培养基可提高发酵单位、缩短发酵周期、提高红霉素A组分。
Description
技术领域
本发明属于发酵技术领域,特别是涉及一种红霉素链霉菌发酵生产红霉素的培养基和培养方法。
背景技术
红霉素是大环内酯类抗生素,抗菌谱与青霉素相似。
目前,国内生产厂家使用红色链霉素,采用三级发酵的模式生产红霉素。其种子培养基、发酵培养基主要采用淀粉和葡萄糖作为碳源;豆饼粉、花生饼粉、玉米浆或蛋白胨作为氮源,使用常规原辅料发酵生产红霉素存在的主要问题:
1发酵成本高。采用该配方,其原辅料的消耗占到生产成本的65%左右。
2增加企业的采购成本。红霉素种子培养基、发酵培养基氮源组成至少在3种以上,增加了企业的采购工作量和采购成本。
3一级种子培养的接种量较大。国内部分厂家的红霉素生产规模可以达到万吨/年,其一级种子培养发酵罐的体积超过了5m3,常规配方的一级种子培养接种量为1.5~2L/M3,增加了菌种研究人员的工作强度和工作量。
4种子培养的周期长。常规配方的红霉素种子培养周期为35~40h。
5红霉素发酵单位较低。使用常规原辅料的培养基,红霉素的发酵单位一般在8000~9000u/ml。
6常规培养基在灭菌过程中,部分葡萄糖在高温状态容易碳化,使种子液和发酵液的颜色变深,降低培养基质量,影响种子培养和发酵培养的效果。
7红霉素A组分偏低。使用常规原辅料的培养基,红霉素A的组分一般控制在62~68%。
8)发酵过程中,还需补入氨基酸。随着发酵时间的延长,发酵液中的氨基酸含量降低,需要补入氨基酸。
发明内容
本发明目的就在于克服上述现有技术的缺陷,提供一种减少接种量,有效提高发酵单位,缩短发酵周期,同时最大限度的降低原辅料用量,降低生产成本,且原辅料来源不受环境影响,保证其供应充足,实现红霉素稳定、高效地生产的培养基。
本发明的另一目的是提供利用上述培养基生产红霉素的培养方法。
为实现上述目的所采取的技术方案为:
一种红霉素链霉菌发酵生产红霉素的培养基,包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基,其特征在于上述一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基中均含有甘蔗糖蜜、啤酒酵母干渣和蚯蚓粉。
所述一级种子培养基的组成为:甘蔗糖蜜15~20g/L、油5~10ml/L、啤酒酵母干渣20~25g/L、蚯蚓粉8~12g/L、硫酸铵0.03~0.05g/L、氯化钠0.9~1g/L、轻质碳酸钙0.2~0.4g/L、硅油消泡剂0.01~0.03g/L。
所述二级种子培养基的组成为:甘蔗糖蜜25~30g/L、油12~16ml/L、啤酒酵母干渣25~30g/L、蚯蚓粉11~17g/L、硫酸铵0.06~0.08g/L、氯化钠0.9~1g/L、轻质碳酸钙0.4~0.6g/L、硅油消泡剂0.02~0.04g/L。
所述发酵培养基的组成为:甘蔗糖蜜25~35g/L、油10~15ml/L、啤酒酵母干渣30~35g/L、蚯蚓粉15~20g/L、硫酸铵0.07~0.09g/L、氯化钠0.9~1g/L、轻质碳酸钙0.4~0.6g/L、S-腺苷甲硫氨酸1~5g/L、氯化钴0.006~0.008g/L硫酸镁0.04~0.05g/L、硫酸锌0.03~0.05g/L、硫酸铜0.06~0.08g/L、硅油消泡剂0.02~0.03g/L。
所述啤酒酵母干渣的质量要求为:
蛋白质含量≥45%;磷含量≥60ug/ml;水分≤5%;灰分≤5%;碳水化合物≥12%;干渣颗粒通过60目筛的数量≥80%。
所述蚯蚓粉的质量要求:蛋白质含量≥60%;水分≤10%;粒度能通过80目筛。
所述甘蔗糖蜜在使用前进行预处理,预处理过程为:
1)甘蔗糖蜜中加入饮用水,使其粘度控制在100cp以下;
2)加热升温至30~35℃,
3)超滤,超滤膜材料为醋酸纤维素或聚氧乙烯,超滤过程中,物料的流量控制在4~5L/min,超滤压力控制在0.2MPa
4)加入蔗糖转化酶,蔗糖转化酶用量(g)=蔗糖甜蜜重量(kg)×0.35。
一种红霉素链霉菌利用上述一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基发酵生产红霉素的培养方法,其特征在于其工艺步骤为:首先将已经培养好的红霉素链霉菌母瓶发酵液按照0.8~1L/m3接种量接入一级种子培养基中进行一级种子培养,至菌体浓度35~40%、pH值7~8、培养周期为20~25h时转移到二级种子培养基中进行二级种子培养,至菌体浓度35~40%、pH值7~8、培养周期为22~27h时转移至发酵培养基中培养,至发酵单位在11000u/ml以上且每6~8h检测的发酵单位相差300u/ml以内、菌体浓度35~40%、发酵周期为150~160h、pH值6~8、氨基氮5~10mg/100ml、总糖0~5g/100ml时终止发酵。
所述一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基在使用前首先进行灭菌,其中
灭菌后的一级种子培养基的质量要求:氨基氮50~60mg/100ml、溶磷>50ug/ml、总糖30~40g/100ml、pH6.5~7.5;
灭菌后的二级种子培养基的质量要求:氨基氮60~70mg/100ml、溶磷>50ug/ml、总糖30~40g/100ml、pH:6.5~7.5;
灭菌后的发酵培养基的质量要求:氨基氮50~60mg/100ml、溶磷>60ug/ml、总糖40~50g/100ml、pH:6~7。
所述一级种子培养条件为:
1)罐压:控制在0.04~0.06MPa,
2)罐温:发酵前5h,罐温控制在31~32℃;6h至一级种子培养结束,罐温控制在33~34℃,
3)空气流量:0~5h,100~150m3/h;6h至一级种子培养结束:200~250m3/h,
4)pH:控制在7~8,
5)搅拌转速:0~5h,采用气流搅拌;6h至一级种子培养结束:采用机械搅拌,转速控制在110r/min。
所述二级种子培养条件为:
1)罐压:控制在0.04~0.06MPa,
2)罐温:发酵前5h,罐温控制在31~32℃;6h至二级种子培养结束,罐温控制在33~34℃,
3)空气流量:0~5h,300~350m3/h;6h至二级种子培养结束:350~400m3/h,
4)pH:控制在7~8,
5)搅拌转速:0~5h,采用气流搅拌;6h至一级种子培养结束:采用机械搅拌,转速控制在100r/min。
所述发酵培养条件为:
1)pH控制:控制在6~8;
2)无菌检查:发酵过程中进行菌检,要求无其它杂菌;
3)空气流量:0~15h:1000m3/h;16h~发酵结束:800m3/h;
4)溶氧控制:
0~30h:溶氧浓度不得低于60%;
31~120h:溶氧浓度控制在30~50%;
121h~放罐:溶氧浓度控制在40%以上;
5)搅拌转速:
0~30h:搅拌转速80~90r/min;
31~120h:搅拌转速100~110r/min;
121h~放罐:搅拌转速70~80r/min;
6)培养温度:
0~30h:34~35.0℃;
31~100h:32~33℃;
101h~放罐:30~31℃。
7)罐压:罐压控制在0.04~0.06MPa。
在发酵过程中进行补料,包括补糖、补水、补入正丙醇和补油,其中
1)补糖控制:当pH>7.3时,采用流加法,补入粘度在500~600cp的甘蔗糖蜜溶液,当pH达到6.9时,停止补料;
2)补水:
120h之前,当菌体浓度超过40%,采用流加法补入饮用水,控制其菌体浓度在35~40%,
120h至发酵结束:当菌体浓度超过35%,补入饮用水,控制其菌体浓度在30~35%;
3)补入正丙醇:发酵周期在30h、50h、90h、110h、130h分别加入已灭菌的正丙醇,其加入量为发酵液体积的0.1~0.2%;
4)补油:采用流加法补油,发酵至15h开始补豆油,具体控制如下:
10~80h:15~20L/h;
81~120h:30~35L/h;
121h~放罐:不补油。
上述油可以是豆油、玉米油或菜籽油。
本发明的技术优势为:
1)发酵成本低。首先啤酒酵母干渣、蚯蚓粉由于产量较大,市场价格较低,便于采购,其次使用啤酒酵母干渣、蚯蚓粉代替了常规种子培养基、发酵培养基中的氮源,减少了氮源的用量,降低了采购和生产成本,减少因原料质量影响种子液和发酵液质量的不利因素。
2)蛋白质和氨基酸含量较高,本发明培养基中的的总生物素含量高于常规培养基。根据相关文献报道,红霉素发酵过程中,蛋白质和氨基酸对其产量和组分影响较大,本发明培养基中的蛋白质含量达到55%以上,氨基酸含量明显高于常规种子培养基配方,有利于改善红霉素链霉菌菌丝形态;提高种子培养的质量。
不同原辅料的氨基氮含量对比表
本发明培养基与常规培养基中总生物素含量对比表
3)使用5m3以上的发酵罐作为种子罐,常规种子培养周期为35~40h。使用本发明种子培养基,其种子培养周期为20~23h,提高种子培养的工作效率。
4)使用本发明一级种子培养基,其接种量为0.8~1L/m3,相对于常规种子培养基,其接种量减少了30%以上,减轻了菌种研究人员的工作强度。
5)采用本发明培养基,红霉素的发酵单位达到11000u/ml以上;红霉素A组分90~92%;红霉素D组分<3%。
6)避免了发酵液高温灭菌过程中出现的碳化现象,提高了发酵液的质量。
具体实施方式
下面用实例予以说明本发明,应该理解的是,实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。
下述实施例的菌种选用红霉素链霉菌:生产使用的菌种来源为母瓶发酵液。母瓶发酵液质量:pH7~8;镜检无杂菌;摇瓶发酵单位6000~7000u/ml。
实施例1
啤酒酵母干渣质量:
蛋白质57.5%;磷87.4ug/ml;水分4.2%;灰分4.1%;碳水化合物12.8%;通过60目筛的数量为84.7%。
蚯蚓粉质量:
蛋白质63.7%;水分8.4%,全部通过80目筛。
配制5m3一级种子液,其中甘蔗糖蜜75kg、豆油25L、啤酒酵母干渣100kg、蚯蚓粉40kg、硫酸铵0.15kg、氯化钠4.5kg、轻质碳酸钙1kg、硅油消泡剂0.05kg。
配制20m3二级种子液,其中甘蔗糖蜜500kg、豆油240L、啤酒酵母干渣500kg、蚯蚓粉220kg、硫酸铵1.2kg、氯化钠18kg、轻质碳酸钙8kg、硅油消泡剂0.4kg。
配制180m3发酵培养基的组成为:甘蔗糖蜜3960kg、豆油1800L、啤酒酵母干渣5400kg、蚯蚓粉2700kg、硫酸铵12.6kg、氯化钠162kg、轻质碳酸钙72kg、S-腺苷甲硫氨酸180kg、氯化钴1.08kg、硫酸镁7.2kg、硫酸锌5.4kg、硫酸铜10.8kg、硅油消泡剂3.6kg。
以上甘蔗糖蜜使用前进行了预处理,加入饮用水,粘度为91cp;加热升温至30~31℃,采用超滤的方法进行过滤。超滤膜材料可以选择醋酸纤维素。超滤过程中,物料的流量控制在4~5L/min,超滤压力控制在0.2MPa。超滤结束后,加入蔗糖转化酶,加入量按照蔗糖转化酶用量(g)=蔗糖甜蜜重量(kg)×0.35的量添加。
一级种子培养基灭菌并冷却至30.4℃,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的红霉素链霉菌母瓶发酵液接入一级种子罐进行培养,接种量控制在4L。灭菌后的一级种子培养基的氨基氮52.1mg/100ml、溶磷67.2ug/ml、总糖31.8g/100ml、pH6.8。一级种子培养过程中,罐压控制在0.04~0.06MPa;种子培养前5h,罐温控制在31~32℃;6h至一级种子培养结束,罐温控制在33~34℃;空气流量:0~5h,100m3/h;6h至一级种子培养结束:200m3/h。一级种子培养过程中,pH控制在7~8;0~5h,采用气流搅拌代替机械搅拌;6h至一级种子培养结束:启动机械搅拌,转速控制在110r/min。一级种子培养结束,菌体浓度37.2%;pH值7.3;无其它杂菌污染;培养周期为20h。
二级种子培养基灭菌,冷却至30~32℃,并用无菌空气保压,灭菌后的二级种子培养基氨基氮61.4mg/100ml、溶磷66.7ug/ml、总糖31.5g/100ml、pH6.7。然后将一级种子液全部移入二级种子罐进行培养。二级种子培养过程中,罐压控制在0.04~0.06MPa;发酵前5h,罐温控制在31~32℃;6h至二级种子培养结束,罐温控制在33~34℃。0~5h,空气流量控制在300m3/h;6h至二级种子培养结束,空气流量控制在350m3/h;pH控制在7~8;0~5h,采用气流搅拌代替机械搅拌;6h至一级种子培养结束,启动机械搅拌,转速控制在100r/min。二级种子培养结束,菌体浓度35.3%;pH值7.1;无其它杂菌污染;培养周期为22h。
发酵培养基灭菌,冷却,并用无菌空气保压。灭菌后的发酵培养基氨基氮53.7mg/100ml、溶磷63.4ug/ml、总糖42.5g/100ml、pH6.4。将二级种子液全部移入发酵罐进行培养,pH控制在6~8;发酵过程中进行菌检,要求无其它杂菌;0~15h空气流量控制在1000m3/h;16h~发酵结束控制在800m3/h;0~30h:溶氧浓度不得低于60%;31~120h:溶氧浓度控制在30~50%;121h~放罐:溶氧浓度控制在40%以上;0~30h:搅拌转速80~90r/min;31~120h:搅拌转速100~110r/min;121h~放罐:搅拌转速70~80r/min;0~30h:34~35℃;31~100h:32~33℃;101h~放罐:30~31℃;发酵过程中,罐压控制在0.04~0.06MPa。发酵培养结束,菌体浓度36.2%;发酵单位在11800u/ml;发酵周期为152h;pH值6.7;氨基氮8.7mg/100ml;总糖4.1g/100ml;红霉素A组分90.3%;红霉素D组分2.6%。
上述发酵过程中根据情况进行补料。
实施例2
啤酒酵母干渣质量:
蛋白质54.3%;磷85.1ug/ml;水分4.6%;灰分3.8%;碳水化合物13.5%;通过60目筛的数量为82.7%。
蚯蚓粉质量:
蛋白质62.1%;水分8.2%,全部通过80目筛。
配制5m3一级种子液,其中甘蔗糖蜜80kg、玉米油30L、啤酒酵母干渣105kg、蚯蚓粉45kg、硫酸铵0.15kg、氯化钠5kg、轻质碳酸钙1.5kg、硅油消泡剂0.1kg。
配制20m3二级种子液,其中甘蔗糖蜜520kg、玉米油260L、啤酒酵母干渣520kg、蚯蚓粉240kg、硫酸铵1.4kg、氯化钠20kg、轻质碳酸钙10kg、硅油消泡剂0.6kg。
配制180m3上述发酵培养基的组成为:甘蔗糖蜜4860kg、玉米油1980L、啤酒酵母干渣5760kg、蚯蚓粉2880kg、硫酸铵14.4kg、氯化钠171kg、轻质碳酸钙81kg、S-腺苷甲硫氨酸360kg、氯化钴1.17kg、硫酸镁8.1kg、硫酸锌7.2kg、硫酸铜11.7kg、硅油消泡剂4.5kg。
以上甘蔗糖蜜的总用量为5460kg,甘蔗糖蜜使用前进行了预处理,加入饮用水,粘度为86cp;加热升温至30~31℃,采用超滤的方法进行过滤。超滤膜材料可以选择醋酸纤维素。超滤过程中,物料的流量控制在4~5L/min,超滤压力控制在0.2MPa。超滤结束后,加入蔗糖转化酶,加入量为1.91kg。
一级种子培养基灭菌并冷却至31℃,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的红霉素链霉菌母瓶发酵液接入一级种子罐进行培养,接种量控制在4.5L。灭菌后的一级种子培养基的氨基氮53.8mg/100ml、溶磷69.1ug/ml、总糖32.5g/100ml、pH6.9。一级种子培养过程中,罐压控制在0.04~0.06MPa;种子培养前5h,罐温控制在31~32℃;6h至一级种子培养结束,罐温控制在33~34℃;空气流量:0~5h,100m3/h;6h至一级种子培养结束:200m3/h。一级种子培养过程中,pH控制在7~8;0~5h,采用气流搅拌代替机械搅拌;6h至一级种子培养结束:启动机械搅拌,转速控制在110r/min。一级种子培养结束,菌体浓度38.1%;pH值7.4;无其它杂菌污染;培养周期为21.2h。
二级种子培养基灭菌,冷却至30.8℃,并用无菌空气保压,灭菌后的二级种子培养基氨基氮62.1mg/100ml、溶磷68.2ug/ml、总糖33.2g/100ml、pH6.9。然后将一级种子液全部移入二级种子罐进行培养。二级种子培养过程中,罐压控制在0.04~0.06MPa;发酵前5h,罐温控制在31~32℃;6h至二级种子培养结束,罐温控制在33~34℃。空气流量:0~5h,空气流量控制在300m3/h;6h至二级种子培养结束,空气流量控制在350m3/h;pH控制在7~8;0~5h,采用气流搅拌代替机械搅拌;6h至一级种子培养结束,启动机械搅拌,转速控制在100r/min。二级种子培养结束,菌体浓度36.4%;pH值7.2;无其它杂菌污染;培养周期为23h。
发酵培养基灭菌,冷却,并用无菌空气保压。灭菌后的发酵培养基氨基氮54.9mg/100ml、溶磷65.1ug/ml、总糖44.1g/100ml、pH6.3。将二级种子液全部移入发酵罐进行培养,pH控制在6~8;发酵过程中进行菌检,要求无其它杂菌;0~15h空气流量控制在1000m3/h;16h~发酵结束控制在800m3/h;0~30h:溶氧浓度不得低于60%;31~120h:溶氧浓度控制在30~50%;121h~放罐:溶氧浓度控制在40%以上;0~30h:搅拌转速80~90r/min;31~120h:搅拌转速100~110r/min;121h~放罐:搅拌转速70~80r/min;0~30h:34~35℃;31~100h:32~33℃;101h~放罐:30~31℃;发酵过程中,罐压控制在0.04~0.06MPa。发酵培养结束,菌体浓度36.2%;发酵单位在11912u/ml;发酵周期为153h;pH值7.1;氨基氮8.1mg/100ml;总糖3.5g/100ml;红霉素A组分90.5%;红霉素D组分2.4%。
上述发酵过程中根据情况进行补料。
实施例3
啤酒酵母干渣质量:
蛋白质54.9%;磷84.8ug/ml;水分4.5%;灰分3.9%;碳水化合物13.8%;通过60目筛的数量为83%。
蚯蚓粉质量:
蛋白质62.4%;水分8.5%,全部通过80目筛。
配制5m3一级种子液,其中甘蔗糖蜜85kg、菜籽油35L、啤酒酵母干渣115kg、蚯蚓粉50kg、硫酸铵0.20kg、氯化钠5kg、轻质碳酸钙1.5kg、硅油消泡剂0.1kg。
配制20m3二级种子液,其中甘蔗糖蜜540kg、菜籽油280L、啤酒酵母干渣540kg、蚯蚓粉260kg、硫酸铵1.44kg、氯化钠19kg、轻质碳酸钙10.4kg、硅油消泡剂0.61kg。
配制180m3上述发酵培养基的组成为:甘蔗糖蜜5040kg、菜籽油2340L、啤酒酵母干渣5940kg、蚯蚓粉3060kg、硫酸铵14.4kg、氯化钠172kg、轻质碳酸钙90kg、S-腺苷甲硫氨酸540kg、氯化钴1.26kg、硫酸镁8.2kg、硫酸锌7.4kg、硫酸铜12.6kg、硅油消泡剂4.6kg。
以上甘蔗糖蜜的总用量为5665kg,甘蔗糖蜜使用前进行了预处理,加入饮用水,粘度为80cp;加热升温至30~31℃,采用超滤的方法进行过滤。超滤膜材料可以选择醋酸纤维素。超滤过程中,物料的流量控制在4~5L/min,超滤压力控制在0.2MPa。超滤结束后,加入蔗糖转化酶,加入量为1.98kg。
一级种子培养基灭菌并冷却至30.9℃,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的红霉素链霉菌母瓶发酵液接入一级种子罐进行培养,接种量控制在4.5L。灭菌后的一级种子培养基的氨基氮55.2mg/100ml、溶磷72.4ug/ml、总糖34.9g/100ml、pH7.1。一级种子培养过程中,罐压控制在0.04~0.06MPa;种子培养前5h,罐温控制在31~32℃;6h至一级种子培养结束,罐温控制在33~34℃;空气流量:0~5h,100m3/h;6h至一级种子培养结束:200m3/h。一级种子培养过程中,pH控制在7~8;0~5h,采用气流搅拌代替机械搅拌;6h至一级种子培养结束:启动机械搅拌,转速控制在110r/min。一级种子培养结束,菌体浓度38.7%;pH值7.4;无其它杂菌污染;培养周期为22h。
二级种子培养基灭菌,冷却至31℃,并用无菌空气保压,灭菌后的二级种子培养基氨基氮64.3mg/100ml、溶磷70.5ug/ml、总糖35.1g/100ml、pH7.0。然后将一级种子液全部移入二级种子罐进行培养。二级种子培养过程中,罐压控制在0.04~0.06MPa;发酵前5h,罐温控制在31~32℃;6h至二级种子培养结束,罐温控制在33~34℃。0~5h,空气流量控制在300m3/h;6h至二级种子培养结束,空气流量控制在350m3/h;pH控制在7~8;0~5h,采用气流搅拌代替机械搅拌;6h至一级种子培养结束,启动机械搅拌,转速控制在100r/min。二级种子培养结束,菌体浓度37.6%;pH值7.3;无其它杂菌污染;培养周期为24h。
发酵培养基灭菌,冷却,并用无菌空气保压。灭菌后的发酵培养基氨基氮55.7mg/100ml、溶磷67.3ug/ml、总糖46.8g/100ml、pH6.5。将二级种子液全部移入发酵罐进行培养,pH控制在6~8;发酵过程中进行菌检,要求无其它杂菌;0~15h空气流量控制在1000m3/h;16h~发酵结束控制在800m3/h;0~30h:溶氧浓度不得低于60%;31~120h:溶氧浓度控制在30~50%;121h~放罐:溶氧浓度控制在40%以上;0~30h:搅拌转速80~90r/min;31~120h:搅拌转速100~110r/min;121h~放罐:搅拌转速70~80r/min;0~30h:34~35℃;31~100h:32~33℃;101h~放罐:30~31℃;发酵过程中,罐压控制在0.04~0.06MPa。发酵培养结束,菌体浓度36.9%;发酵单位在12086u/ml;发酵周期为157h;pH值7.2;氨基氮6.5mg/100ml;总糖2.4g/100ml;红霉素A组分91.5%;红霉素D组分1.2%。
上述发酵过程中根据情况进行补料。
实施例4
啤酒酵母干渣质量:
蛋白质54.9%;磷80.2ug/ml;水分4.6%;灰分4.2%;碳水化合物13.6%;通过60目筛的数量为82%。
蚯蚓粉质量:
蛋白质62.1%;水分8.3%,全部通过80目筛。
配制5m3一级种子液,其中甘蔗糖蜜90kg、豆油40L、啤酒酵母干渣120kg、蚯蚓粉55kg、硫酸铵0.21kg、氯化钠4.8kg、轻质碳酸钙1.75kg、硅油消泡剂0.12kg。
配制20m3二级种子液,其中甘蔗糖蜜560kg、豆油300L、啤酒酵母干渣560kg、蚯蚓粉280kg、硫酸铵1.54kg、氯化钠19kg、轻质碳酸钙11kg、硅油消泡剂0.7kg。
配制180m3上述发酵培养基的组成为:甘蔗糖蜜5400kg、豆油2520L、啤酒酵母干渣6120kg、蚯蚓粉3240kg、硫酸铵15.5kg、氯化钠173kg、轻质碳酸钙100kg、S-腺苷甲硫氨酸720kg、氯化钴1.35kg、硫酸镁8.2kg、硫酸锌8.1kg、硫酸铜13.9kg、硅油消泡剂5kg。
以上甘蔗糖蜜的总用量为6050kg,甘蔗糖蜜使用前进行了预处理,加入饮用水,粘度为80cp;加热升温至30~31℃,采用超滤的方法进行过滤。超滤膜材料可以选择聚氧乙烯。超滤过程中,物料的流量控制在4~5L/min,超滤压力控制在0.2MPa。超滤结束后,加入蔗糖转化酶,加入量为2.1kg。
一级种子培养基灭菌并冷却至31℃,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的红霉素链霉菌母瓶发酵液接入一级种子罐进行培养,接种量控制在4.6L。灭菌后的一级种子培养基的氨基氮56.9mg/100ml、溶磷73.1ug/ml、总糖36.7g/100ml、pH7。一级种子培养过程中,罐压控制在0.04~0.06MPa;种子培养前5h,罐温控制在31~32℃;6h至一级种子培养结束,罐温控制在33~34℃;空气流量:0~5h,100m3/h;6h至一级种子培养结束:200m3/h。一级种子培养过程中,pH控制在7~8;0~5h,采用气流搅拌代替机械搅拌;6h至一级种子培养结束:启动机械搅拌,转速控制在110r/min。一级种子培养结束,菌体浓度38.7%;pH值7.5;无其它杂菌污染;培养周期为24h。
二级种子培养基灭菌,冷却至31.4℃,并用无菌空气保压,灭菌后的二级种子培养基氨基氮66.1mg/100ml、溶磷72.2ug/ml、总糖37.2g/100ml、pH6.9。然后将一级种子液全部移入二级种子罐进行培养。二级种子培养过程中,罐压控制在0.04~0.06MPa;发酵前5h,罐温控制在31~32℃;6h至二级种子培养结束,罐温控制在33~34℃。空气流量:0~5h,空气流量控制在300m3/h;6h至二级种子培养结束,空气流量控制在350m3/h;pH控制在7~8;0~5h,采用气流搅拌代替机械搅拌;6h至一级种子培养结束,启动机械搅拌,转速控制在100r/min。二级种子培养结束,菌体浓度38.4%;pH值7.4;无其它杂菌污染;培养周期为25.8h。
发酵培养基灭菌,冷却,并用无菌空气保压。灭菌后的发酵培养基氨基氮56.3mg/100ml、溶磷69.1ug/ml、总糖48g/100ml、pH6.4。将二级种子液全部移入发酵罐进行培养,pH控制在6~8;发酵过程中进行菌检,要求无其它杂菌;0~15h空气流量控制在1000m3/h;16h~发酵结束控制在800m3/h;0~30h:溶氧浓度不得低于60%;31~120h:溶氧浓度控制在30~50%;121h~放罐:溶氧浓度控制在40%以上;0~30h:搅拌转速80~90r/min;31~120h:搅拌转速100~110r/min;121h~放罐:搅拌转速70~80r/min;0~30h:34~35℃;31~100h:32~33℃;101h~放罐:30~31℃;发酵过程中,罐压控制在0.04~0.06MPa。发酵培养结束,菌体浓度37.7%;发酵单位在12001u/ml;发酵周期为158h;pH值7.1;氨基氮6mg/100ml;总糖2g/100ml;红霉素A组分91.1%;红霉素D组分1.5%。
上述发酵过程中根据情况进行补料。
实施例5
啤酒酵母干渣质量:
蛋白质52.3%;磷79.7ug/ml;水分4.3%;灰分4.1%;碳水化合物14.2%;通过60目筛的数量为85%。
蚯蚓粉质量:
蛋白质61.3%;水分8.2%,全部通过80目筛。
配制5m3一级种子液,其中甘蔗糖蜜100kg、玉米油50L、啤酒酵母干渣125kg、蚯蚓粉60kg、硫酸铵0.25kg、氯化钠5kg、轻质碳酸钙2kg、硅油消泡剂0.15kg。
配制20m3二级种子液,其中甘蔗糖蜜600kg、玉米油320L、啤酒酵母干渣600kg、蚯蚓粉340kg、硫酸铵1.6kg、氯化钠20kg、轻质碳酸钙12kg、硅油消泡剂0.8kg。
配制180m3上述发酵培养基的组成为:甘蔗糖蜜6300kg、玉米油2700L、啤酒酵母干渣6300kg、蚯蚓粉3600kg、硫酸铵16.2kg、氯化钠180kg、轻质碳酸钙108kg、S-腺苷甲硫氨酸900kg、氯化钴1.44kg、硫酸镁9kg、硫酸锌9kg、硫酸铜14.4kg、硅油消泡剂5.4kg。
以上甘蔗糖蜜的总用量为7000kg,甘蔗糖蜜使用前进行了预处理,加入饮用水,粘度为82cp;加热升温至30~31℃,采用超滤的方法进行过滤。超滤膜材料可以选择聚氧乙烯。超滤过程中,物料的流量控制在4~5L/min,超滤压力控制在0.2MPa。超滤结束后,加入蔗糖转化酶,加入量为2.45kg。
一级种子培养基灭菌并冷却至31.8℃,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的红霉素链霉菌母瓶发酵液接入一级种子罐进行培养,接种量控制在5L。灭菌后的一级种子培养基的氨基氮58.6mg/100ml、溶磷76.4ug/ml、总糖39.4g/100ml、pH6.7。一级种子培养过程中,罐压控制在0.04~0.06MPa;种子培养前5h,罐温控制在31~32℃;6h至一级种子培养结束,罐温控制在33~34℃;空气流量:0~5h,100m3/h;6h至一级种子培养结束:200m3/h。一级种子培养过程中,pH控制在7~8;0~5h,采用气流搅拌代替机械搅拌;6h至一级种子培养结束:启动机械搅拌,转速控制在110r/min。一级种子培养结束,菌体浓度39.1%;pH值7.5;无其它杂菌污染;培养周期为25h。
二级种子培养基灭菌,冷却至31.8℃,并用无菌空气保压,灭菌后的二级种子培养基氨基氮68.2mg/100ml、溶磷75.8ug/ml、总糖38.9g/100ml、pH6.6。然后将一级种子液全部移入二级种子罐进行培养。二级种子培养过程中,罐压控制在0.04~0.06MPa;发酵前5h,罐温控制在31~32℃;6h至二级种子培养结束,罐温控制在33~34℃。空气流量:0~5h,空气流量控制在300m3/h;6h至二级种子培养结束,空气流量控制在350m3/h;pH控制在7~8;0~5h,采用气流搅拌代替机械搅拌;6h至一级种子培养结束,启动机械搅拌,转速控制在100r/min。二级种子培养结束,菌体浓度39.3%;pH值7.2;无其它杂菌污染;培养周期为27h。
发酵培养基灭菌,冷却,并用无菌空气保压。灭菌后的发酵培养基氨基氮59.4mg/100ml、溶磷73.3ug/ml、总糖49.8g/100ml、pH6.2。将二级种子液全部移入发酵罐进行培养,pH控制在6~8;发酵过程中进行菌检,要求无其它杂菌;0~15h空气流量控制在1000m3/h;16h~发酵结束控制在800m3/h;0~30h:溶氧浓度不得低于60%;31~120h:溶氧浓度控制在30~50%;121h~放罐:溶氧浓度控制在40%以上;0~30h:搅拌转速80~90r/min;31~120h:搅拌转速100~110r/min;121h~放罐:搅拌转速70~80r/min;0~30h:34~35℃;31~100h:32~33℃;101h~放罐:30~31℃;发酵过程中,罐压控制在0.04~0.06MPa。发酵培养结束,菌体浓度38.9%;发酵单位在11954u/ml;发酵周期为160h;pH值6.9;氨基氮5.1mg/100ml;总糖1.8g/100ml;红霉素A组分90.7%;红霉素D组分1.9%。
上述发酵过程中根据情况进行补料。
上述实施例1-5中补料控制按照下述方式实现:
1)补糖控制:当pH>7.3时,采用流加法,补入粘度控制在500~600cp并经过膜过滤的甘蔗糖蜜溶液,当pH达到6.9时,停止补料。
2)补水:发酵过程中,按照工艺要求必须定时补入一定量的已灭菌的饮用水,其目的是控制菌体浓度,有利于代谢产物的生成。采用流加法进行补水。120h之前,当菌体浓度超过40%,补入饮用水,控制其菌体浓度在35~40%。120h至发酵结束:当菌体浓度超过40%,补入饮用水,控制其菌体浓度在35~40%;
3)补入正丙醇:发酵周期在30h、50h、90h、110h、130h分别加入已灭菌的正丙醇,其加入量为发酵液体积的0.1~0.2%。
4)补油:采用流加法补油,发酵至15h开始补豆油,具体控制如下:
10~80h:15~20L/h;
81~120h:30~35L/h;
121h~放罐:不补油。
对比实施例
配制5m3一级种子液,淀粉78kg、豆油27L、黄豆粉100kg、玉米浆40kg、蛋白胨80kg、硫酸铵0.14kg、氯化钠4.5kg、轻质碳酸钙1.3kg、硅油消泡剂0.06kg。
配制20m3二级种子液,淀粉510kg、豆油250L、黄豆粉520kg、玉米浆230kg、蛋白胨340kg、硫酸铵1.3kg、氯化钠18.5kg、轻质碳酸钙8.2kg、硅油消泡剂0.44kg。
配制180m3发酵培养基,淀粉4100kg、豆油1900L、黄豆粉5500kg、玉米浆2800kg、硫酸铵12.8kg、氯化钠162kg、轻质碳酸钙72.8kg、甜菜碱260kg、氯化钴1.1kg、硫酸镁7.5kg、硫酸锌5.6kg、硫酸铜11kg、硅油消泡剂4kg。
一级种子培养基灭菌并冷却至31.3℃,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的红霉素链霉菌母瓶发酵液接入一级种子罐进行培养,接种量控制在8L。灭菌后的一级种子培养基的氨基氮46.3mg/100ml、溶磷52.8ug/ml、总糖24.7g/100ml、pH7.1。一级种子培养过程中,罐压控制在0.04~0.06MPa;种子培养前5h,罐温控制在31~32℃;6h至一级种子培养结束,罐温控制在33~34℃;空气流量:0~5h,100m3/h;6h至一级种子培养结束:200m3/h。一级种子培养过程中,pH控制在7~8;0~5h,采用气流搅拌代替机械搅拌;6h至一级种子培养结束:启动机械搅拌,转速控制在110r/min。一级种子培养结束,菌体浓度30.1%;pH值7.1;无其它杂菌污染;培养周期为35h。
二级种子培养基灭菌,冷却至30~32℃,并用无菌空气保压,灭菌后的二级种子培养基氨基氮53.4mg/100ml、溶磷52.6ug/ml、总糖26.8g/100ml、pH6.9。然后将一级种子液全部移入二级种子罐进行培养。二级种子培养过程中,罐压控制在0.04~0.06MPa;发酵前5h,罐温控制在31~32℃;6h至二级种子培养结束,罐温控制在33~34℃。0~5h,空气流量控制在300m3/h;6h至二级种子培养结束,空气流量控制在350m3/h;pH控制在7~8;0~5h,采用气流搅拌代替机械搅拌;6h至一级种子培养结束,启动机械搅拌,转速控制在100r/min。二级种子培养结束,菌体浓度30.2%;pH值7.3;无其它杂菌污染;培养周期为36h。
发酵培养基灭菌,冷却,并用无菌空气保压。灭菌后的发酵培养基氨基氮43.6mg/100ml、溶磷52.8ug/ml、总糖34.2g/100ml、pH6.7。将二级种子液全部移入发酵罐进行培养,pH控制在6~8;发酵过程中进行菌检,要求无其它杂菌;0~15h空气流量控制在1000m3/h;16h~发酵结束控制在800m3/h;0~30h:溶氧浓度不得低于60%;31~120h:溶氧浓度控制在30~50%;121h~放罐:溶氧浓度控制在40%以上;0~30h:搅拌转速80~90r/min;31~120h:搅拌转速100~110r/min;121h~放罐:搅拌转速70~80r/min;0~30h:34~35℃;31~100h:32~33℃;101h~放罐:30~31℃;发酵过程中,罐压控制在0.04~0.06MPa。发酵培养结束,菌体浓度32.1%;发酵单位在9347u/ml;发酵周期为160h;pH值6.9;氨基氮4.8mg/100ml;总糖1.8g/100ml;红霉素A组分81.3%;红霉素D组分5.2%。
Claims (7)
1.一种红霉素链霉菌发酵生产红霉素的培养基,包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基,其特征在于上述一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基中均含有甘蔗糖蜜、啤酒酵母干渣和蚯蚓粉;
所述一级种子培养基的组成为:甘蔗糖蜜15~20g/L、油5~10ml/L、啤酒酵母干渣20~25g/L、蚯蚓粉8~12g/L、硫酸铵0.03~0.05g/L、氯化钠0.9~1g/L、轻质碳酸钙0.2~0.4g/L、硅油消泡剂0.01~0.03g/L;
所述二级种子培养基的组成为:甘蔗糖蜜25~30g/L、油12~16ml/L、啤酒酵母干渣25~30g/L、蚯蚓粉11~17g/L、硫酸铵0.06~0.08g/L、氯化钠0.9~1g/L、轻质碳酸钙0.4~0.6g/L、硅油消泡剂0.02~0.04g/L;
所述发酵培养基的组成为:甘蔗糖蜜25~35g/L、油10~15ml/L、啤酒酵母干渣30~35g/L、蚯蚓粉15~20g/L、硫酸铵0.07~0.09g/L、氯化钠0.9~1g/L、轻质碳酸钙0.4~0.6g/L、S-腺苷甲硫氨酸1~5g/L、氯化钴0.006~0.008g/L硫酸镁0.04~0.05g/L、硫酸锌0.03~0.05g/L、硫酸铜0.06~0.08g/L、硅油消泡剂0.02~0.03g/L;
所述啤酒酵母干渣的质量要求为:
蛋白质含量≥45%;磷含量≥60ug/ml;水分≤5%;灰分≤5%;碳水化合物≥12%;干渣颗粒通过60目筛的数量≥80%;
所述蚯蚓粉的质量要求:蛋白质含量≥60%;水分≤10%;粒度能通过80目筛;
所述甘蔗糖蜜在使用前进行预处理,预处理过程为:
1)甘蔗糖蜜中加入饮用水,使其粘度控制在100cp以下,
2)加热升温至30~35℃,
3)超滤,超滤膜材料为醋酸纤维素或聚氧乙烯,超滤过程中,物料的流量控制在4~5L/min,超滤压力控制在0.2MPa,
4)加入蔗糖转化酶,蔗糖转化酶用量g=蔗糖甜蜜重量kg×0.35。
2.一种红霉素链霉菌利用权利要求1培养基发酵生产红霉素的培养方法,其特征在于其工艺步骤为:首先将已经培养好的红霉素链霉菌母瓶发酵液按照0.8~1L/m3接种量接入一级种子培养基中进行一级种子培养,至菌体浓度35~40%、pH值7~8、培养周期为20~25h时转移到二级种子培养基中进行二级种子培养,至菌体浓度35~40%、pH值7~8、培养周期为22~27h时转移至发酵培养基中培养,至发酵单位在11000u/ml以上且每6~8h检测的发酵单位相差300u/ml以内、菌体浓度35~40%、发酵周期为150~160h时终止发酵。
3.按照权利要求2所述的培养方法,其特征在于所述一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基在使用前首先进行灭菌,其中
灭菌后的一级种子培养基的质量要求:氨基氮50~60mg/100ml、溶磷>50ug/ml、总糖30~40g/100ml、pH6.5~7.5;
灭菌后的二级种子培养基的质量要求:氨基氮60~70mg/100ml、溶磷>50ug/ml、总糖30~40g/100ml、pH:6.5~7.5;
灭菌后的发酵培养基的质量要求:氨基氮50~60mg/100ml、溶磷>60ug/ml、总糖40~50g/100ml、pH:6~7。
4.按照权利要求2所述的培养方法,其特征在于所述一级种子培养条件为:
1)罐压:控制在0.04~0.06MPa,
2)罐温:发酵前5h,罐温控制在31~32℃;6h至一级种子培养结束,罐温控制在33~34℃,
3)空气流量:0~5h,100~150m3/h;6h至一级种子培养结束:200~250m3/h,
4)pH:控制在7~8,
5)搅拌转速:0~5h,采用气流搅拌;6h至一级种子培养结束:采用机械搅拌,转速控制在110r/min。
5.按照权利要求2所述的培养方法,其特征在于所述二级种子培养条件为:
1)罐压:控制在0.04~0.06MPa,
2)罐温:发酵前5h,罐温控制在31~32℃;6h至二级种子培养结束,罐温控制在33~34℃,
3)空气流量:0~5h,300~350m3/h;6h至二级种子培养结束:350~400m3/h,
4)pH:控制在7~8,
5)搅拌转速:0~5h,采用气流搅拌;6h至一级种子培养结束:采用机械搅拌,转速控制在100r/min。
6.按照权利要求2所述的培养方法,其特征在于所述发酵培养条件为:
1)pH控制:控制在6~8;
2)无菌检查:发酵过程中进行菌检,要求无其它杂菌;
3)空气流量:0~15h:1000m3/h;16h~发酵结束:800m3/h;
4)溶氧控制:
0~30h:溶氧浓度不得低于60%;
31~120h:溶氧浓度控制在30~50%;
121h~放罐:溶氧浓度控制在40%以上;
搅拌转速:
0~30h:搅拌转速80~90r/min;
31~120h:搅拌转速100~110r/min;
121h~放罐:搅拌转速70~80r/min;
6)培养温度:
0~30h:34~35.0℃;
31~100h:32~33℃;
101h~放罐:30~31℃;
7)罐压:罐压控制在0.04~0.06MPa。
7.按照权利要求2所述的培养方法,其特征在于在发酵过程中进行补料,包括补糖、补水、补入正丙醇和补油,其中
1)补糖控制:当pH>7.3时,采用流加法,补入粘度在500~600cp的甘蔗糖蜜溶液,当pH达到6.9时,停止补料;
2)补水:
120h之前,当菌体浓度超过40%,采用流加法补入饮用水,控制其菌体浓度在35~40%;
120h至发酵结束:当菌体浓度超过35%,补入饮用水,控制其菌体浓度在30~35%;
3)补入正丙醇:发酵周期在30h、50h、90h、110h、130h分别加入已灭菌的正丙醇,其加入量为发酵液体积的0.1~0.2%;
4)补油:采用流加法补油,发酵至15h开始补豆油,具体控制如下:
15~80h:15~20L/h;
81~120h:30~35L/h;
121h~放罐:不补油。
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金霉素链霉菌发酵培养基的优化;高山等;《湖北民族学院学报(自然科学版)》;20100630;第28卷(第2期);211-215页 * |
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