CN102732580A - 一种制备高效抗肿瘤抗生素卡里奇霉素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种发酵高产抗肿瘤抗生素卡里奇霉素的方法。发明采用棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)在添加不同种类大孔吸附树脂的发酵培养基中发酵生产卡里奇霉素。本发明工艺稳定，发酵产量有显著提高。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药领域，具体而言，本发明涉及一种发酵高产抗肿瘤抗生素卡里奇霉素的方法。
背景技术
卡里奇霉素(calicheamicin)是一种烯二炔类抗生素，其产生菌棘孢小单孢菌(M.echinospora)在液体深层发酵过程中，产生的主要有效成分为卡里奇霉素γ1 1。卡里奇霉素具有很强的细胞毒性和抗肿瘤活性，能够嵌入DNA双螺旋的小沟中，引起DNA双链断裂从而杀死细胞。卡里奇霉素对多种肿瘤细胞均有强烈的杀伤作用，是迄今为止发现的活性最强的一类抗肿瘤抗生素。由于卡里奇霉素抗肿瘤作用极强，分子较小，已被作为一种单克隆抗体的“弹头”应用于临床。其中以CLM作为“弹头”的靶向治疗药物吉妥单抗Gemtuzumab ozogamicin(别名：GO，Mylotarg，CMA-676)已被FDA批准用于治疗急性髓细胞白血病。卡里奇霉素的结构式如下：
式一中的X为卤素取代基，R为含碳侧链。它的几种主要同类化合物见表1：
表1
有关报道卡里奇霉素的文献有美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.，1987，109：3464-3466；J.Am.Chem.Soc.，1987，109：3466-3468)以及日本抗生素杂志(J.Antibiotics.，1989，42：558-563；J.Antibiotics.，1989，42：1070-1087.)等。中国专利有CN 101591632A。这些文献报道了卡里奇霉素的理化性质、生物活性、菌种筛选、发酵与分离纯化等内容。但根据文献描述的培养条件进行发酵生产，其受生产菌的特性和发酵工艺、控制条件的影响，尤其是产物具有高毒性，产物合成对菌体代谢抑制显著，使其生物合成基因得不到充分表达，导致卡里奇霉素产量低、成本高，难以形成产业化。
发明内容
本发明提供了一种发酵高产抗肿瘤抗生素卡里奇霉素的方法。本发明采用棘孢小单孢菌(M.echinospora)在添加一定量的大孔吸附树脂的发酵培养基中，通过液体深层发酵生产卡里奇霉素。本发明采用的棘孢小单孢菌(M.echinospora)为M.echinospora NRRL15839，NRRL 15975，NRRL 18149(可参见The Journal ofAntibiotics，July 1989，Vol.XL II NO.7，1070)。本发明采用添加一种特定的大孔吸附树脂，并适当优化部分工艺条件；由于添加的大孔吸附树脂能够吸附产物，从而解除有毒代谢产物对细胞的毒害作用，有助于目标组分卡里奇霉素γ1 I的生物合成，使卡里奇霉素生物合成水平是原工艺的6倍，且工艺稳定，为该产品的产业化开发打好基础。
本发明涉及的斜面孢子制备，种子液的制备与发酵培养的生产工艺过程如下：
产孢培养基的制备
本发明的斜面孢子培养基可以是高氏一号培养基、国际链霉菌计划培养基2(ISP2)、国际链霉菌计划培养基4(ISP4)等，优选ISP2培养基。
斜面孢子的制备
将固体培养基在ISP2，在120-122℃条件下消毒20分钟后，冷却制成斜面，将菌种涂布于斜面培养基上，最佳培养温度28±2℃，最佳培养时间10-14天。
种子的制备
本发明的种子培养基含有的碳源包括淀粉、糊精、葡萄糖、工业糖蜜、甘油、蔗糖、乳糖、麦芽糖等；可利用氮源包括酵母抽提物、牛肉浸膏、胰蛋白胨、蛋白胨、黄豆饼粉、棉籽饼粉、花生饼粉、麸质粉、玉米浆干粉、麸皮、氯化铵、硝酸铵、硫酸铵等，培养基于120-122℃下消毒20分钟，冷却后，将斜面孢子悬浮液接种到种子培养基内，进行培养。摇瓶装液量为摇瓶体积的10％(体积百分比)，以8层纱布或棉塞为过滤介质，摇瓶转速为200-250rpm；种子罐装液量为罐体积的70％(体积百分比)，通气量为0.8-1vvm，搅拌转速为150-250rpm，培养温度为20-37℃，最优培养温度为28±2℃，培养时间为36-48小时，种子成熟菌丝浓度为15-20％。
发酵液制备
本发明的发酵培养基含有：
(1)碳源选自淀粉、糊精、葡萄糖、工业糖蜜、甘油、蔗糖、乳糖、麦芽糖或其混合物，优选麦芽糊精、葡萄糖、淀粉；
(2)氮源选自酵母抽提物、牛肉浸膏、胰蛋白胨、蛋白胨、黄豆饼粉、棉籽饼粉、花生饼粉、麸质粉、玉米浆干粉、麸皮、氯化铵、硝酸铵、硫酸铵或其混合物，优选酵母抽提物、牛肉膏、胰蛋白胨；
(3)微量元素混合液，合适的微量元素包括FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、CaCO3等；
(4)芳香环上卤代物碘的前体，优选KI；
(5)大孔吸附树脂。
在优选的实施例中，大孔吸附树脂优选聚苯乙烯系非极性大孔吸附树脂、聚苯乙烯系弱极性大孔吸附树脂、聚苯乙烯系中等极性大孔吸附树脂；其中聚苯乙烯系非极性大孔吸附树脂型号优选HZ-803、LX-18、HZ-16、HP-20、HZ-818、HP-21、HZ-820、LX-1180、XAD-1600；其中聚苯乙烯系弱极性大孔吸附树脂型号优选HZ-801、H-41、H-60，更优选H-60；其中聚苯乙烯系中等极性大孔吸附树脂型号优选HZ-806。
在优选的实施例中，大孔吸附树脂的添加量占培养基的量为10-50g/L。
摇瓶发酵培养基装液量为摇瓶体积的8-15％(体积百分比)，发酵罐装量为罐体积的60-70％(体积百分比)，发酵培养基于120-122℃下消毒20-30分钟，冷却后，以接种量3-10％(体积百分比)接入种子液。摇瓶培养转速为200-250rpm，以8层纱布或棉塞为过滤介质；发酵罐发酵搅拌转速为150-250rpm，通气量为0.8-1.0vvm。培养温度为28±2℃，发酵周期为8-10天。
卡里奇霉素发酵单位的测定
样品的处理：发酵液加入等体积的乙酸乙酯振荡提取30分钟，离心收集上层有机相，用氮气吹干乙酸乙酯，再加入等体积的乙腈溶解，过滤，滤液用高效液相分析。
高效液相条件：Agilent 1200液相系统和Agilent ZORBAX SB-C18(5μm，250mm×4.6mm)色谱柱，流动相为0.01M甲酸铵∶95％乙腈＝45∶55(v/v)，检测波长为230nm，洗脱流速为1.0ml·min-1，进样量为10μL。
本发明与原工艺相比具有以下优点：
1.提高发酵单位。本发明添加的大孔吸附树脂能够解除有毒代谢产物对细胞的毒害作用，从而有利于产物的生物合成，使卡里奇霉素生物合成水平是原工艺的6倍，且工艺稳定；
2.降低杂质含量。本发明添加的KI前体能够有效降低发酵液中其他卤代物杂质的含量，如γ1 Br、β1 Br等，简化了后续分离提取工艺，有利于提取收率和产品质量的提高，也有利于降低能耗和减少环境污染。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1制备卡里奇霉素
(1)斜面孢子的制备与培养
斜面孢子培养基配方(g/L)：酵母抽提物4，麦芽抽提物10，葡萄糖4，琼脂20，消前pH7.2，试管30×200mm，装量20mL，经121℃灭菌20分钟后，冷却到50-60℃摆斜面，接入孢子经28±1℃培养12-14天后，孢子成熟。
(2)种子液的制备与培养
种子培养基配方(g/L)：可溶性淀粉24，葡萄糖5，蛋白胨5，黄豆饼粉3，CaCO3 4，消前pH 7.0，摇瓶装液量为250mL三角瓶装25mL，经121℃灭菌20分钟。孢子接种量为105-106c.f.u./mL，培养温度28±1℃，250rpm，摇床振荡培养36-48小时，这时培养液pH7.0-7.5，菌丝浓度为10-15％(体积百分比)。
(3)卡里奇霉素发酵培养基的制备与培养
发酵培养基配方(g/L)：葡萄糖5，麦芽糊精24，酵母抽提物5，牛肉膏3，胰蛋白胨5，FeSO4·7H2O 0.1，MgSO4·7H2O 0.2，KI 0.1，CaCO3 4，H-60树脂30g/L(备注：消前每个摇瓶分别称量)，消前pH7.0，摇瓶装液量为250mL三角瓶装25mL，经121℃灭菌20分钟。将种子液以5-10％(体积百分比)的接种量接入，在28±1℃，250rpm摇床振荡培养7-9天，发酵结束后用HPLC测卡里奇霉素单位，测得单位为60mg/L。
实施例2制备卡里奇霉素
斜面孢子的制备与种子液的制备见实施例1，发酵培养基配方参见实施例1，其中树脂更换为H-41树脂30g/L，发酵培养条件见实施例1，卡里奇霉素产量为40mg/L。
实施例3制备卡里奇霉素
斜面孢子的制备与种子液的制备见实施例1，发酵培养基配方参见实施例1，其中树脂更换为HZ-803树脂30g/L，发酵培养条件见实施例1，卡里奇霉素产量为10mg/L。
实施例4制备卡里奇霉素
斜面孢子的制备与种子液的制备见实施例1，发酵培养基配方参见实施例1，其中树脂更换为LX-18树脂30g/L，发酵培养条件见实施例1，卡里奇霉素产量为20mg/L。
实施例5制备卡里奇霉素
斜面孢子的制备与种子液的制备见实施例1，发酵培养基配方参见实施例1，其中树脂更换为HZ-801树脂30g/L，发酵培养条件见实施例1，卡里奇霉素产量为30mg/L。
实施例6制备卡里奇霉素
斜面孢子的制备与种子液的制备见实施例1，发酵培养基配方参见实施例1，其中树脂更换为LX-1180树脂30g/L，发酵培养条件见实施例1，卡里奇霉素产量为20mg/L。
实施例7制备卡里奇霉素
斜面孢子的制备与种子液的制备见实施例1，发酵培养基配方参见实施例1，其中树脂更换为HZ-16树脂30g/L，发酵培养条件见实施例1，卡里奇霉素产量为15mg/L。
实施例8制备卡里奇霉素
斜面孢子的制备与种子液的制备见实施例1，发酵培养基配方参见实施例1，其中树脂更换为HZ-806树脂30g/L，发酵培养条件见实施例1，卡里奇霉素产量为15mg/L。
实施例9制备卡里奇霉素
斜面孢子的制备与种子液的制备见实施例1，发酵培养基配方参见实施例1，其中树脂更换为HP-20树脂30g/L，发酵培养条件见实施例1，卡里奇霉素产量为30mg/L。
实施例10制备卡里奇霉素
斜面孢子的制备与种子液的制备见实施例1，发酵培养基配方参见实施例1，其中树脂更换为XAD-1600树脂30g/L，发酵培养条件见实施例1，卡里奇霉素产量为40mg/L。
实施例11制备卡里奇霉素
斜面孢子的制备与种子液的制备见实施例1，发酵培养基配方参见实施例1，其中树脂更换为HZ-818树脂30g/L，发酵培养条件见实施例1，卡里奇霉素产量为20mg/L。
实施例12制备卡里奇霉素
斜面孢子的制备与种子液的制备见实施例1，发酵培养基配方参见实施例1，其中树脂更换为HP-21树脂30g/L，发酵培养条件见实施例1，卡里奇霉素产量为30mg/L。
实施例13制备卡里奇霉素
斜面孢子的制备与种子液的制备见实施例1，发酵培养基配方参见实施例1，其中树脂更换为HZ-820树脂30g/L，发酵培养条件见实施例1，卡里奇霉素产量为40mg/L。
实施例14制备卡里奇霉素
斜面孢子的制备与种子液的制备见实施例1，发酵培养基配方参见实施例1，其中树脂更换为HZ-820树脂10g/L，发酵培养条件见实施例1，卡里奇霉素产量为30mg/L。
实施例15制备卡里奇霉素
斜面孢子的制备与种子液的制备见实施例1，发酵培养基配方参见实施例1，其中树脂更换为HZ-820树脂50g/L，发酵培养条件见实施例1，卡里奇霉素产量为25mg/L。
实施例16制备卡里奇霉素
斜面孢子的制备与种子液的制备见实施例1，发酵培养基配方参见实施例1，其中树脂更换为H-60树脂10g/L，发酵培养条件见实施例1，卡里奇霉素产量为50mg/L。
实施例17制备卡里奇霉素
斜面孢子的制备与种子液的制备见实施例1，发酵培养基配方参见实施例1，其中树脂更换为H-60树脂50g/L，发酵培养条件见实施例1，卡里奇霉素产量为45mg/L。
实施例18制备卡里奇霉素
斜面孢子的制备与种子液的制备见实施例1，发酵培养基配方参见实施例1，其中树脂更换为HZ-806树脂10g/L，发酵培养条件见实施例1，卡里奇霉素产量为10mg/L。
实施例19制备卡里奇霉素
斜面孢子的制备与种子液的制备见实施例1，发酵培养基配方参见实施例1，其中树脂更换为HZ-806树脂50g/L，发酵培养条件见实施例1，卡里奇霉素产量为10mg/L。
Claims (7)
1.一种发酵制备卡里奇霉素的方法，其特征在于：包括采用棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)在含有碳源、氮源、大孔吸附树脂以及前体物KI的发酵培养基中发酵的步骤。
2.根据权利要求1的制备方法，其中所述的大孔吸附树脂选自聚苯乙烯系非极性大孔吸附树脂、聚苯乙烯系弱极性大孔吸附树脂、聚苯乙烯系中等极性大孔吸附树脂。
3.根据权利要求2的制备方法，其中所述的聚苯乙烯系非极性大孔吸附树脂型号选自HZ-803、LX-18、HZ-16、HP-20、HZ-818、HP-21、HZ-820、LX-1180、XAD-1600。
4.根据权利要求2的制备方法，其中所述的聚苯乙烯系弱极性大孔吸附树脂型号选自HZ-801、H-41、H-60，优选H-60。
5.根据权利要求2的制备方法，其中所述的聚苯乙烯系中等极性大孔吸附树脂型号选自HZ-806。
6.根据权利要求1-5的制备方法，其中所述的大孔吸附树脂的添加量占培养基的量为10-50g/L。
7.根据权利要求1-5之一的制备方法，发酵培养基中可利用的碳源选自淀粉、糊精、葡萄糖、工业糖蜜、甘油、蔗糖、乳糖、麦芽糖或其混合物；可利用的氮源选自酵母抽提物、牛肉浸膏、胰蛋白胨、蛋白胨、黄豆饼粉、棉籽饼粉、花生饼粉、麸质粉、玉米浆干粉、麸皮、氯化铵、硝酸铵、硫酸铵或其混合物。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20121017 |