CN102978133A - 一种小单孢菌及利用该菌制备多种抗生素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种小单孢菌及利用该菌制备多种抗生素的方法。小单孢菌（Micromonospora rosaria）SCSIO N160能够产生大环内酯类抗生素rosamicin（1），6108B（2），M4365-A1（3）和M4365-G1（4），fluostatins类化合物fluostatinC（5），fluostatin D（6），fluostatinE（7），fluostatin F（8），fluostatin I（9），fluostatin J（10），fluostatin K（11）及kinamycin类抗生素rabelomycin（12）及benzo[b]fluorene类抗生素phenanthroviridone（13），可利用该菌制备这13种抗生素，因此为这13种抗生素的生产制备提供了新的方法。

Description

一种小单孢菌及利用该菌制备多种抗生素的方法
技术领域：
本发明属于工业微生物领域，具体涉及一种能产生多种抗生素的海洋来源放线菌菌株小单孢菌（Micromonospora rosaria）SCSIO N160及其利用该菌发酵制备的大环内酯类抗生素rosamicin，6108B，M4365-A1和M4365-G1，fluostatins类化合物fluostatinC，fluostatin D，fluostatin E，fluostatin F，fluostatin I，fluostatin J，fluostatin K，kinamycin类抗生素rabelomycin及benzo[b]fluorene类抗生素phenanthroviridone的方法。
背景技术：
化合物大环内酯类抗生素rosamicin（1），6108B（2），M4365-A1（3）和M4365-G1（4），fluostatins类化合物fluostatinC（5），fluostatin D（6），fluostatin E（7），fluostatin F（8）及kinamycin类抗生素rabelomycin（12）和benzo[b]fluorene类抗生素phenanthroviridone（13）的结构式如图1所示，图1中的数字代表的化合物与上述化合物括号后的数字相对应。
化合物rosamicin（1），6108B（2），M4365-A1（3）和M4365-G1（4）属于大环内酯类抗生素（macrolide antibiotics），该类抗生素具有广谱抗菌活性，尤其对于G+菌Staphylococcusaureus和Diplococcus pneumoniae有显著的抑制活性[Wagman GH,Waitz JA,Marquez J,et al.Anew Micromonospora-produced macrolide antibiotic,rosamicin.J Antibiot,1972,25:641-646.]。化合物fluostatinC（5），fluostatin D（6），fluostatin E（7），fluostatin F（8）均属于fluostatins类抗生素。rabelomycin（12）属于kinamycin类抗生素，具有很好的抗菌活性和细胞毒活性（表1）。phenanthroviridone（13）属于benzo[b]fluorene类抗生素，具有很好的抗菌活性和细胞毒活性（表1）。
表1：化合物12和13的抗菌活性与细胞毒活性
a顺铂，阳性对照。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种能产生大环内酯类抗生素rosamicin（1），6108B（2），M4365-A1（3）和M4365-G1（4），fluostatins类化合物fluostatinC（5），fluostatin D（6），fluostatinE（7），fluostatin F（8），fluostatin I（9），fluostatin J（10），fluostatin K（11）及另外两种抗生素rabelomycin（12）和phenanthroviridone（13）13种抗生素的海洋来源放线菌菌株小单孢菌（Micromonospora rosaria）SCSIO N160，该菌于2012年10月08日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国武汉武汉大学，其保藏编号为：CCTCC NO:M 2012392。
本发明的小单孢菌（Micromonospora rosaria）SCSIO N160是从我国南海北部(东经116°17.754′，北纬22°41.083′)水深30米的海底沉积物中分离获得，该菌的气生菌丝呈红色，孢子黑色，孢子丰富。通过常规方法PCR扩增该菌的16S rDNA，并测序，其序列如SEQ ID NO.1所示，提交到GenBank中，得到序列号JF508525。16S rDNA基因序列分析结果显示该菌株与Micromonospora rosaria DSM 803的相似度达到99%，通过邻接法清晰地揭示了该菌与一组Micromonospora属物种的系统进化关系（图2），表明该菌株属于Micromonospora属的一种。将该菌命名为小单孢菌（Micromonospora rosaria）SCSIO N160，于2012年10月08日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国武汉武汉大学，其保藏编号为：CCTCC NO:M 2012392。
本发明的第二个目的是提供一种制备抗生素rosamicin（1），6108B（2），M4365-A1（3），M4365-G1（4），fluostatinC（5），fluostatin D（6），fluostatin E（7），fluostatin F（8），fluostatinI（9），fluostatin J（10），fluostatin K（11），rabelomycin（12）和phenanthroviridone（13）的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（a）制备小单孢菌（Micromonospora rosaria）SCSIO N160的发酵培养物，将该发酵培养物的发酵液和菌丝体分开，发酵液经丁酮萃取，丁酮萃取层经过蒸馏浓缩后得到浸膏A；菌丝体先用丙酮浸提，浸提液回收丙酮后剩余的水相混合液用丁酮萃取，丁酮萃取层经过蒸馏浓缩后得到浸膏B；将浸膏A与B合并为浸膏C；
（b）浸膏C经硅胶柱层析，以体积比从100:0~0:100的氯仿-甲醇作为流动相梯度洗脱，氯仿-甲醇体积比为98:2梯度下洗脱下来的馏分Fr1，氯仿-甲醇体积比为95:5梯度下洗脱下来的馏分Fr.2，氯仿-甲醇体积比为90:10梯度下洗脱下来的馏分Fr.3，氯仿-甲醇体积比为50:50梯度下洗脱下来的馏分Fr.4；
馏分Fr.2经凝胶柱层析，用体积比为1:1的氯仿-甲醇作为流动相洗脱，得到馏分Fr.2-A至Fr.2-H，将馏分Fr.2-C经中压反相层析，以体积比从100:0~0:100的甲醇：水线性梯度洗脱，收集体积比甲醇：水=35：65的馏分得化合物rosamicin，将馏份Fr.2-D上中压反相柱，以体积比从100:0~0:100的甲醇：水线性梯度洗脱，收集体积比甲醇：水=40：60的馏分得化合物6108B，将馏份Fr.2-E用高压液相制备，流动相为体积比水：乙腈=70:30，纯化得到化合物M4365-A1，将馏分Fr.2-F用高压液相制备，流动相为体积比乙腈：水=72:28，纯化得化合物M4365-G1；
馏分Fr.1经凝胶柱层析，用体积比为1:1的氯仿-甲醇作为流动相洗脱，得到馏分Fr1-A，Fr1-B，Fr1-C，Fr1-D，Fr1-A经中压反相层析，用体积比100:0~0:100的甲醇：水线性梯度洗脱，收集体积比甲醇：水=58：42的馏分得化合物fluostatin I，收集体积比甲醇：水=50：50的馏分得Fr1-A-2，Fr1-A-2用高压液相制备，用体积比乙腈：水=80：20为流动相洗脱，纯化得化合物fluostatin C和化合物fluostatin E；Fr1-B用高压液相制备，用体积比乙腈：水=65:35为流动相，纯化得化合物fluostatin F和化合物rabelomycin；Fr1-C用硅胶柱层析，以体积比100:0~0:100的氯仿-甲醇作为流动相梯度洗脱，收集体积比氯仿：甲醇=60：40的馏分得Fr1-C-(3)，Fr1-C-(3)通过PTLC层析，以氯仿：丙酮体积比为65:35为展开剂展开，收集比移值为0.8的馏分，得化合物fluostatin D；Fr1-D以凝胶柱层析，用氯仿：甲醇体积比5:5洗脱，再用高压液相制备，用体积比乙腈：水=60:40为流动相，纯化得化合物fluostatin K、化合物fluostatin J和化合物phenanthroviridone。
所述的制备小单孢菌（Micromonospora rosaria）SCSIO N160的发酵培养物可以通过发酵小单孢菌的常规方法进行发酵，优选通过以下方法制备：将活化的小单孢菌SCSIO N160接入种子培养基中，28℃，200rpm，培养144h制得种子液，将种子液以10%的接种量接入到发酵培养基中，28℃，200rpm，振荡培养120h，而制得发酵培养物，所述的种子培养基和发酵培养基的配方都为每升培养基中含有：淀粉10g，葡萄糖20g，酵母粉10g，玉米粉3g，牛肉膏3g，MgSO4·7H2O 0.5g，K2HPO40.5g，CaCO32g，粗海盐30g，余量为水，pH 7.2。
本发明的第三个目的是提供小单孢菌（Micromonospora rosaria）SCSIO N160在制备抗生素rosamicin（1）、6108B（2）、M4365-A1（3）、M4365-G1（4）、fluostatinC（5）、fluostatin D（6）、fluostatin E（7）、fluostatin F（8）、fluostatin I（9）、fluostatin J（10）、fluostatin K（11）、rabelomycin（12）或phenanthroviridone（13）中的应用。
本发明的小单孢菌（Micromonospora rosaria）SCSIO N160能够产生大环内酯类抗生素rosamicin（1），6108B（2），M4365-A1（3）和M4365-G1（4），fluostatins类化合物fluostatinC（5），fluostatin D（6），fluostatin E（7），fluostatin F（8），fluostatin I（9），fluostatin J（10），fluostatin K（11）及kinamycin类抗生素rabelomycin（12）及benzo[b]fluorene类抗生素phenanthroviridone（13），可利用该菌制备这13种抗生素，因此为这13种抗生素的生产制备提供了新的方法。
本发明的小单孢菌（Micromonospora rosaria）SCSIO N160，于2012年10月08日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国武汉武汉大学，其保藏编号为：CCTCC NO:M 2012392。
附图说明：
图1是本发明的化合物：rosamicin（1）（R=CHO），6108B（2）（R=COOH），M4365-A1（3）（R=CH3）和M4365-G1（4），fluostatins类化合物fluostatinC（5），fluostatin D（6），fluostatinE（7），fluostatin F（8），fluostatin I（9），fluostatin J（10），fluostatin K（11），rabelomycin（12）和phenanthroviridone（13）13种抗生素的结构式；
图2是本发明的小单孢菌（Micromonospora rosaria）SCSIO N160系统进化树和基于16S rDNA序列的邻接法重建的与之亲缘关系最近的种。
图3是化合物9的COSY、HMBC（左）与NOESY（右）相关。
图4是化合物9在甲醇中的CD谱及(1R,2R,3R)-9(9a)和(1S,2S,3S)-9(9b)构型的ECD谱。
图5是化合物10的COSY、HMBC。
图6是化合物10在甲醇中的CD谱及(1R,2S,3S,14R)-10(10a)和(1R,2S,3S,14S)-10(10b)构型的ECD谱。
图7是化合物11的COSY、HMBC。
图8是化合物11在甲醇中的CD谱及(3R)-11(11a)和(3S)-11(11b)构型的ECD谱。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
一、Micromonospora rosaria SCSIO N160的分离纯化和鉴定
小单孢菌（Micromonospora rosaria）SCSIO N160鉴定中涉及的基因组DNA的分离，16SrDNA的PCR扩增，序列比对和系统进化树的建立方法等均参考文献[Tian X P，Zhi X Y，Qiu YQ,et al.Sciscionella marina gen.nov.,sp.nov.,a marine actinomycete isolated from a sediment inthe northern South China Sea.Int J Syst Evol Microbiol[J],2009,59(Pt 2):222-228]。
菌株来源：海洋放线菌小单孢菌（Micromonospora rosaria）SCSIO N160从我国南海北部(东经116°17.754′，北纬22°41.083′)水深30米的海底沉积物中分离获得。该菌的气生菌丝呈红色，孢子黑色，产孢丰富。
菌种鉴定：参考上述文献中的方法，PCR扩增小单孢菌（Micromonospora rosaria）SCSION160的16S rDNA并测序而后提交到GenBank中，得到序列号JF508525，其序列如SEQ ID NO.1所示。16S rDNA基因序列分析结果显示该菌与Micromonospora rosaria DSM 803的相似度达到99%。通过邻接法清晰地揭示了该菌与一组小单孢菌属物种的系统进化关系（图2），表明该株菌属于小单孢菌属的一种。因此将该菌命名为小单孢菌（Micromonospora rosaria）SCSION160，于2012年10月8日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M 2012392。
二、小单孢菌SCSIO N160的规模发酵
a)配制培养基：
种子培养基配制，每升种子培养基中含有：淀粉10g，葡萄糖20g，酵母粉10g，玉米粉3g，牛肉膏3g，MgSO4·7H2O 0.5g，K2HPO40.5g，CaCO32g，余量为海盐质量分数为3%的海水或陈海水，pH 7.2，115℃，灭菌30min，备用；
发酵培养基与种子培养基相同。
b)发酵：
种子培养：将在平板上活化的海洋来源的小单孢菌（Micromonospora rosaria）SCSIO N160接入种子培养基（800mL）中，28℃，200rpm，培养144h制得种子液；
规模发酵培养：
接种：将种子液以10%的接种量接入到发酵培养基中（8L），28℃，200rpm，培养120h，而制得小单孢菌（Micromonospora rosaria）SCSIO N160的发酵培养物。
三、海洋来源小单孢菌（Micromonospora rosaria）SCSIO N160所产抗生素的分离
1、发酵液的萃取
将规模发酵培养得到的小单孢菌SCSIO N160的发酵培养物先进行离心分离（3500r.min-1，8min），得到发酵液和菌丝体，发酵液用两倍体积丁酮萃取5次，减压蒸馏得发酵液提取物-浸膏A（4.5g），菌丝体用丙酮浸提3次，减压蒸馏后得水液混合物用两倍体积丁酮萃取4次，浓缩获得菌丝体提取物-浸膏B（2.0g）。将浸膏A与B合并为浸膏C（6.5g）。
2、抗生素的分离
(a)浸膏C经硅胶柱层析（300-400mesh），以体积比从100:0~0:100的氯仿-甲醇作为流动相梯度洗脱，氯仿-甲醇体积比为98:2梯度下洗脱下来的馏分Fr.1，氯仿-甲醇体积比为95:5梯度下洗脱下来的馏分Fr.2，氯仿-甲醇体积比为90:10梯度下洗脱下来的馏分Fr.3，氯仿-甲醇体积比为50:50梯度下洗脱下来的馏分Fr.4；
(b)馏分F r.2经凝胶sephadex LH-20柱层析，用体积比为1:1的氯仿-甲醇作为流动相洗脱，洗脱800ml，每100ml收集为一个馏分，先后依次得馏分Fr.2-A至Fr.2-H，把收集的第三个馏分Fr.2-C经中压反相层析（20×170mm），以体积比从100:0~0:100的甲醇：水线性梯度洗脱，收集体积比甲醇：水=35：65的馏分得化合物1（rosamicin），把收集的第四个馏份Fr.2-D上中压反相柱（20×85mm），以体积比从100:0~0:100的甲醇：水线性梯度洗脱，收集体积比甲醇：水=40：60的馏分得化合物2（6108B），把收集的第五个馏份Fr.2-E用高压液相制备[PhenomenexODS(250mm×10.0mm id,5μm;Phenomenex,USA]，流动相为水：乙腈（体积比70:30），流速为2.5ml/min，得化合物3（M4365-A1）（保留时间为17min），把收集的第六个馏分Fr.2-F用高压液相制备[Phenomenex ODS(250mm×10.0mm id,5μm;Phenomenex,USA]，流动相为乙腈：水（体积比72:28），流速为2.5ml/min，得化合物4（M4365-G1）（保留时间为20min）。
(c)馏分Fr1过凝胶sephadex LH20柱，用体积比为1:1的氯仿-甲醇作为流动相洗脱，洗脱400ml，每100ml收集为一个馏分，先后依次得到Fr1-A，Fr1-B，Fr1-C，Fr1-D，分别为300mg，124mg，195mg，144mg。Fr1-A经中压反相层析（20×170mm），用体积比100:0~0:100的甲醇：水线性梯度洗脱，收集体积比甲醇：水=58：42的馏分得化合物9（fluostatin I）(16.2mg)，收集体积比甲醇：水=50：50的馏分得Fr1-A-2，Fr1-A-2用高压液相制备[Phenomenex ODS(250mm×10.0mm id,5μm;Phenomenex,USA]，用乙腈：水（体积比80：20）为流动相洗脱，流速为2.5ml/min，得化合物5（fluostatin C）(10mg，保留时间为12min)及化合物7（fluostatin E）(3.2mg，保留时间为13.5min)。Fr1-B用高压液相制备[Phenomenex ODS(250mm×10.0mm id,5μm;Phenomenex,USA]，用乙腈：水（体积比65:35）为流动相，流速为2.5ml/min，洗脱得化合物8（fluostatin F）(3.2mg，保留时间为18min)和化合物12（rabelomycin）(5.0mg，保留时间为20min)。Fr1-C用硅胶柱层析（300~400mesh），以体积比100:0~0:100的氯仿-甲醇作为流动相梯度洗脱，收集体积比氯仿：甲醇=60：40的馏分得Fr1-C-(3)，Fr1-C-(3)通过PTLC（20×20cm，厚度0.4-0.5mm）层析，以氯仿（C）：丙酮（A）体积比为65:35为展开剂展开得化合物6（fluostatin D）(22mg，比移值为0.8)。Fr1-D以凝胶柱SephadexLH-20层析，用氯仿（C）：甲醇（M）5:5洗脱，洗脱200ml，每50ml收集为一个馏分，得Fr1-D-A，Fr1-D-B，Fr1-D-C，Fr1-D-D。Fr1-D-B用高压液相制备[Phenomenex ODS(250mm×10.0mm id,5μm;Phenomenex,USA]，用乙腈：水（体积比60:40）为流动相，流速为2.5ml/min，洗脱得化合物11（fluostatinK）(2.0mg，保留时间为18min)，Fr1-D-C用高压液相制备[Phenomenex ODS(250mm×10.0mm id,5μm;Phenomenex,USA]，用乙腈：水（体积比60:40）为流动相，流速为2.5ml/min，洗脱得化合物10（fluostatin J）(3.0mg，保留时间为20min),，Fr1-D-D用高压液相制备[Phenomenex ODS(250mm×10.0mm id,5μm;Phenomenex,USA]，用乙腈：水（体积比60:40）为流动相，流速为2.5ml/min，洗脱得化合物13（phenanthroviridone）(2.5mg，保留时间为14min)。
通过结构分析，对本发明的从小单孢菌SCSIO N160的发酵培养物中制备的13个化合物—化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8、化合物9、化合物10、化合物11、化合物12和化合物13进行鉴定，鉴定结果如下：
化合物1：白色粉末，ESI-MSm/z582[M+H]+，604[M+Na]+，确定其分子量为581。结合1H-NMR和13C-NMR分析，确定其分子式为C31H51NO9。1H-NMR(CDCl3,500MHz)δ:9.72(1H,s,H-20),6.54(1H,d,J=16.0Hz,H-11),6.44(1H,d,J=16.0Hz,H-10),4.87(1H,m,H-15),4.22(1H,d,J=7.5Hz,H-1'),3.90(1H,br d,J=10.0Hz,H-3),3.70(1H,br d,J=10.0Hz,H-5),3.45(1H,m,H-5'),3.19(1H,dd,J=10.0,7.5Hz,H-2'),3.07(1H,m,H-19a),2.82(1H,d,J=9.0Hz,H-13),2.65(1H,dd,J=17.0,10.0Hz,H-2a),2.56(1H,m,H-8),2.43-2.47(3H,m,H-6,H-19b,H-3'),2.27(6H,s,H-7',H-8'),2.09(1H,d,J=10.5Hz,H-2b),1.76-1.82(2H,m,H-16a,H-4),1.63-1.72(2H,m,H-7,H-4'a),1.48-1.54(2H,m,H-14,H-16b),1.42(3H,s,H-22),1.24(1H,m,H-4'b),1.19(3H,d,J=9.0Hz,H-6'),1.15(3H,d,J=7.0Hz,H-21),1.14(3H,d,J=2.5Hz,H-23),1.12(3H,d,J=7.5Hz,H-18),0.88(3H,d,J=7.0Hz,H-17);13C-NMR(CDCl3,125MHz,)δ:173.4(C,C-1),39.6(CH2,C-2),66.7(CH,C-3),41.2(CH,C-4),81.1(CH,C-5),31.1(CH,C-6),31.7(CH2,C-7),37.8(CH,C-8),200.4(C,C-9),122.7(CH,C-10),150.9(CH,C-11),59.7(C,C-12),67.9(CH,C-13),45.1(CH,C-14),76.8(CH,C-15),24.7(CH2,C-16),8.9(CH3,C-17),9.0(CH3,C-18),43.7(CH2,C-19),203.1(CH,C-20),17.4(CH3,C-21),15.0(CH3,C-22),14.5(CH3,C-23),104.3(CH,C-1'),70.3(CH,C-2′),65.7(CH,C-3′),28.4(CH2,C-4′),69.6(CH,C-5′),21.1(CH3,C-6′),40.2(CH3,C-7′,8′)。以上波谱数据与文献[Anzai Y，Sakai A,Li W,et al.Isolation andcharacterization of 23-O-mycinosyl-20-dihydro-rosamicin:a new rosamicin analogue derived fromengineered Micromonospora rosaria.J Antibiot,2010,63:325-328.]一致，故将化合物1鉴定为rosamicin，结构式如图1所示。
化合物2：白色粉末，ESI-MSm/z598[M+H]+，620[M+Na]+，提示其分子量为597。结合1H-NMR和13C-NMR分析，确定其分子式为C31H51NO10。1H-NMR(CD3OD,500MHz)δ:8.37(1H,s,H-20),6.73(1H,d,J=15.7Hz,H-11),6.48(1H,d,J=15.7Hz,H-10),4.86(1H,m,H-15),4.31(1H,d,J=6.6Hz,H-1′),3.97(1H,br d,J=10.0Hz,H-3),3.78(1H,br d,J=10.0Hz,H-5),3.43-3.49(2H,m,H-19a,H-5′),3.65(1H,m,H-13),2.93(1H,m,H-2′),2.92(1H,m,H-6),2.87(1H,m,H-19b),2.86(6H,s,H-7′,8′),2.67(1H,m,H-8,H-3′),2.38(1H,d,J=17.0Hz,H-2a),2.29(1H,d,J=17.0Hz,H-2b),2.03(1H,d,J=11.0Hz,H-4),1.84-1.97(3H,m,H-16a,H-4′a,H-7),1.79(1H,m,H-14),1.56(1H,m,H-16b),1.50(3H,s,H-22),1.47(1H,m,H-4′b),1.33(3H,d,J=6.0Hz,H-6′),1.20(3H,d,J=7.0Hz,H-21),1.15(3H,d,J=6.0Hz,H-23),1.10(3H,d,J=6.0Hz,H-18),0.93(3H,J=7.0Hz,H-17);13C-NMR(CD3OD,125MHz)δ:174.0(C,C-1),41.0(CH2,C-2),67.4(CH,C-3),42.7(CH,C-4),82.2(CH,C-5),32.5(CH,C-6),34.5(CH2,C-7),39.1(CH,C-8),203.4(C,C-9),124.5(CH,C-10),152.5(CH,C-11),61.2(C,C-12),69.0(CH,C-13),46.6(CH,C-14),78.0(CH,C-15),25.6(CH2,C-16),9.4(CH3,C-17),9.6(CH3,C-18),39.1(CH2,C-19),174.0(C,C-20),17.6(CH3,C-21),15.3(CH3,C-22),14.7(CH3,C-23)104.6(CH,C-1′),70.3(CH,C-2′),66.9(CH,C-3′),31.2(CH2,C-4′),69.6(CH,C-5′),21.0(CH3,C-6′),41.1(CH3,C-7′,8′)。以上波谱数据与文献[Nakajima S,Kojiri K,Morishima H,et al.New analogs ofrosaramicin isolated from a Micromonospora strain.II.Structure determination.J Antibiot,1990,43:1006-1009.]一致，故将化合物2鉴定为6108B，结构式如图1所示。
化合物3：白色粉末，ESI-MSm/z568[M+H]+，590[M+Na]+，提示其分子量为567。结合1H-NMR和13C-NMR分析，确定其分子式为C31H53NO8。1H-NMR(CD3OD,500MHz)δ:6.71(1H,J=15.6Hz,H-11),6.45(1H,J=15.7Hz,H-10),4.82(1H,m,H-15),4.36(1H,d,J=6.0Hz,H-1′),3.83(1H,m,H-5),3.80(1H,m,H-3),3.62-3.70(2H,m,H-5′,H-2′),3.43-3.47(2H,m,H-19a,H-13),2.89(6H,m,H-7′,H-8′),2.85(1H,m,H-3′),2.61-2.67(2H,m,H-19b,H-8),2.29(1H,m,H-2),2.06(1H,m,H-2),1.83-1.92(4H,m,H-6,H-4′a,H-7,H-16a),1.76(1H,m,H-4),1.67(1H,m,H-14),1.54(1H,m,H-4′b),1.49(3H,s,H-22),1.43(1H,m,H-16b),1.19(3H,d,J=7.0Hz,H-6′),1.14(3H,d,J=7.0Hz,H-23),1.11(3H,J=7.0Hz,H-18),0.89(3H,t,J=7.0Hz,H-20);13C-NMR(CD3OD,125MHz)δ:174.4(C,C-1),41.3(CH2,C-2),67.3(CH,C-3),46.7(CH,C-4),81.0(CH,C-5),42.3(CH,C-6),34.1(CH,C-7),49.0(CH,C-8),203.9(C,C-9),125.6(CH,C-10),152.1(CH,C-11),61.2(C,C-12),69.3(CH,C-13),40.6(CH,C-14),78.1(CH,C-15),22.2(CH2,C-16),9.5(CH3,C-17),9.9(CH3,C-18),25.6(CH2,C-19),12.5(CH3,C-20),17.0(CH3,C-21),15.3(CH3,C-22),14.6(CH3,C-23),104.7(CH,C-1′),70.4(CH,C-2′),67.1(CH,C-3′),31.2(CH,C-4′),69.6(CH,C-5′),21.1(CH3,C-6′),39.1(CH3,C-7′,8′)。以上波谱数据与文献[Puar MS,Schumacher D.Novel macrolides from Micromonospora rosaria.J Antibiot,1990,43:1497-1501.]一致，故将化合物3鉴定为M-4365A1，结构式如图1所示。
化合物4：白色粉末，ESI-MSm/z552[M+H]+，574[M+Na]+，提示其分子量为551。结合1H-NMR和13C-NMR分析，确定其分子式为C31H53NO7。1H-NMR(CD3OD,500MHz)δ:7.26(1H,d,J=15.0Hz,H-11),6.46(1H,d,J=15.0Hz,H-10),5.69(1H,d,J=10.0Hz,H-13),4.71(1H,m,H-15),4.33(1H,d,J=5.0Hz,H-1′),3.81(1H,br d,J=9.0Hz,H-3),3.74(1H,d,J=10.0Hz,H-5),3.67(1H,m,H-5′),3.42-3.44(1H,br s,H-19a,H-2′),2.90(1H,s,H-7′),2.81(1H,s,H-8′),2.66(1H,m,H-3′),2.52(1H,m,H-8),2.30(1H,br s,H-2),2.04-2.07(2H,m,H-2,H-19b),1.87(3H,s,H-22),1.74-1.79(3H,m,H-16a,H-14,H-6),1.61-1.64(2H,m,H-7,H-4′a),1.45-1.47(3H,m,H-4,H-16b,H-4′b),1.30(3H,s,H-6′),1.22(3H,d,J=7.0Hz,H-21),1.10(3H,d,J=6.5Hz,H-23),1.06(3H,d,J=7.0Hz,H-18),0.96(3H,t,J=7.5Hz,H-20),0.88(3H,t,J=7.0Hz,H-17);13C-NMR(CD3OD,125MHz)δ:175.0(C,C-1),41.2(CH,C-2),68.4(CH,C-3),46.5(CH,C-4),80.9(CH,C-5),40.1(CH,C-6),34.9(CH,C-7),49.0(CH,C-8),203.8(C,C-9),120.5(CH,C-10),149.7(CH,C-11),134.9(CH,C-12),147.8(CH,C-13),37.5(CH,C-14),80.1(CH,C-15),22.2(CH2,C-16),9.6(CH3,C-17),10.0(CH3,C-18),25.7(CH2,C-19),12.5(CH3,C-20),17.9(CH3,C-21),16.3(CH3,C-22),13.1(CH3,C-23),104.5(CH,C-1′),70.49(CH,C-2′),67.1(CH,C-3′),31.3(CH,C-4′),69.2(CH,C-5′),21.1(CH3,C-6′),42.4(CH,C-7′,8′)。以上波谱数据与文献[Puar MS,Schumacher D.Novel macrolides from Micromonospora rosaria.J Antibiot,1990,43:1497-1501.]一致，故将化合物4确定为M4365-G1，结构式如图1所示。
化合物5：红色粉末，ESI-MSm/z 323[M-H]-，645[2M-H]-，提示其分子量为324。结合1H-NMR和13C-NMR分析，确定其分子式为C18H12O6。以下是其NMR数据的归属：1H-NMR(CDCl3/CD3OD,500MHz)δH 7.43(1H,s,H-5),7.20(1H,dd,J=7.0,8.0Hz,H-8),7.15(1H,dd,J=0.5,7.0Hz,H-9),6.94(1H,dd,J=0.5,8.0Hz,H-10),6.01(1H,d,J=2.0Hz,H-1),3.81(1H,d,J=2.5Hz,H-2),1.60(3H,s,H-12).13C-NMR(CDCl3/CD3OD,125MHz)δc61.3(C-1),64.0(C-2),59.5(C-3),194.5(C-4),133.1(C-4a),122.3(C-5),152.7(C-6),136.4(C-6a),127.5(C-6b),152.9(C-7),125.1(C-8),132.5(C-9),117.4(C-10),136.9(C-10a),194.8(C-11),133.4(C-11a),132.6(C-11b),15.4(C-12)。以上波谱数据与文献[Schneider,K.;Nicholson,G.;Strobele,M,et al.The structures of fluostatins C,D and E,novel members of the fluostatin family.J Antibiot 2006,59,105-109.]一致，故将化合物5确定为fluostatin C，结构式如图1所示。
化合物6：红色粉末，ESI-MSm/z393[M-H]-，787[2M-H]-，提示其分子量为394。结合1H-NMR和13C-NMR分析，确定其分子式为C22H18O7。以下是其NMR数据的归属：1H-NMR(CDCl3/CD3OD,500MHz)δH7.45(1H,s,H-5),7.11(1H,m,H-10),7.10(1H,m,H-9),6.92(1H,d,J=8.0Hz,H-8),6.87(1H,d,J=2.0Hz,H-1),3.77(1H,d,J=2.0Hz,H-2),2.43(1H,m,H-14),1.52(3H,s,H-12),1.05(3H,d,J=7.0Hz,H-15),1.02(3H,d,J=7.0Hz,H-16).13C-NMR(CDCl3/CD3OD,125MHz)δc62.9(C-1),60.1(C-2),58.4(C-3),193.1(C-4),126.3(C-4a),121.2(C-5),150.9(C-6),135.3(C-6a),125.8(C-6b),150.9(C-7),123.9(C-8),131.5(C-9),116.9(C-10),135.4(C-10a),192.3(C-11),132.4(C-11a),132.0(C-11b),14.7(C-12),176.5(C-13),33.7(C-14),18.8(C-15),18.5(C-16)。以上波谱数据与文献[Schneider,K.;Nicholson,G.;Strobele,M,et al.The structures of fluostatins C,D and E,novel members of the fluostatin family.J Antibiot 2006,59,105-109.]一致，故将化合物6确定为fluostatin D，结构式如图1所示。
化合物7：红色粉末，ESI-MSm/z359[M-H]-，719[2M-H]-，提示其分子量为394。结合1H-NMR和13C-NMR分析，确定其分子式为C18H13ClO6。以下是其NMR数据的归属：1H-NMR(DMSO-d6,500MHz)δH 7.57(1H,s,H-5),7.33(1H,dd,J=7.5,7.5Hz,H-9),7.21(1H,dd,J=7.5Hz,H-10),7.11(1H,dd,J=7.5Hz,H-8),5.31(1H,d,J=3.0Hz,H-1),4.11(1H,d,J=3.0Hz,H-2),1.69(3H,s,H-12).13C-NMR(DMSO-d6,125MHz)δc76.1(C-1),65.6(C-2),65.5(C-3),190.6(C-4),130.5(C-4a),120.9(C-5),149.6(C-6),135.4(C-6a),125.1(C-6b),150.9(C-7),124.2(C-8),132.1(C-9),116.4(C-10),135.1(C-10a),192.1(C-11),132.6(C-11a),133.7(C-11b),23.4(C-12)。以上波谱数据与文献[Schneider,K.;Nicholson,G.;Strobele,M,et al.The structures offluostatins C,D and E,novel members of the fluostatin family.J Antibiot 2006,59,105-109.]一致，故将化合物7确定为fluostatin E，结构式如图1所示。
化合物8：红色粉末，ESI-MS m/z 337[M-H]-，提示其分子量为338。结合1H-NMR和13C-NMR分析，确定其分子式为C19H14O6。以下是其NMR数据的归属：1H NMR(DMSO-d6,500MHz)δH 7.41(1H,s,H-5),7.30(1H,dd,J=7.0,7.5Hz,H-9),7.19(1H,d,J=7.0Hz,H-10),7.09(1H,d,J=8.0Hz,H-8),5.77(1H,d,J=2.5Hz,H-1),4.15(1H,d,J=3.0Hz,H-2),3.40(3H,s,H-13),1.52(1H,s,H-12).13C-NMR(DMSO-d6,125MHz)δc67.4(C-1),59.4(C-2),57.8(C-3),193.5(C-4),131.9(C-4a),120.9(C-5),151.1(C-6),134.9(C-6a),128.1(C-6b),150.7(C-7),124.3(C-8),131.8(C-9),116.3(C-10),134.1(C-10a),192.5(C-11),132.2(C-11a),125.5(C-11b),14.4(C-12),56.9(C-13)。以上波谱数据与文献[Feng,Z.;Kim,J.H.;Brady，S.F.,Fluostatins producedby the heterologous expression of a TAR reassembled environmental DNA derived type II PKSgene cluster.JAm Chem Soc 2010,132,11902-3]一致，故将化合物8确定为fluostatin F，结构式如图1所示。
化合物9：化合物9为新化合物。其负源高分辨电喷雾质谱图显示准分子离子峰为m/z395.1162[M-H]-，对应分子式为C22H20O7（计算值为395.1131），不饱和度为13。分析化合物9的氢谱、碳谱（表2）发现其与已知化合物Fluostatin D（6）相似，不同之处在于，化合物9较之6少了一个不饱和度，同时发现化合物9中的一个sp3杂化的次甲基[δc44.1]取代了6中的一个连氧季碳，另外，与化合物6中C-2的化学位移[δc61.1]相比较，化合物9中C-2的化学位移[δc72.8]向低场位移了11.7ppm，这些证据表明，化合物6中原来位于C-2/C-3位的氧环断开，并且于C-2位形成羟基。在1H-1H COSY谱上观察到的H-2与H-3、H-3与H-12之间的相关及HMBC谱上观察到从H-3到C-1/C-2/C-4a和H-12到C-2/C-3/C-4的相关进一步确证了以上推论（图3）。根据以上的推论，确定了化合物9的平面结构。
化合物9的相对构型通过NOESY谱和偶合常数来推导，根据NOE谱中观测到的H-2到12-Me之间的相关，推测2-OH与12-Me位于异侧，在NOE谱中不能观测到H-1与12-Me之间的相关，提示它们可能位于异侧（图3）。H-1/H-23JH1-H2(3.0Hz)和H-2/H33JH2-H3(2.5Hz)间小的偶合常数确证了以上的推测。化合物9的绝对构型通过比较实验测定的CD谱（甲醇为溶剂）和计算的(1R,2R,3R)-9(9a)、(1S,2S,3S)-9(9b)ECD谱来确定。通过比较发现，实验测定的CD谱与9a的ECD谱几乎一致，都在200-250nm出现负的波谷，在280-350nm出现正的波峰（图4），所以化合物9的构型确定为1R,2R,3R，其结构式如图1的9所示，命名为fluostatin I。
化合物10：化合物10为新化合物。其负源高分辨电喷雾质谱图显示准分子离子峰为m/z407.1136[M-H]-，对应分子式为C23H20O7（计算值为407.1131），不饱和度为14。分析化合物10的氢谱、碳谱（表2）发现其亦与Fluostatin D（6）相似，区别在于，Fluostatin D（6）中的甲基信号[δH1.03(d,J=7.0Hz,Me-16),δC 18.5(q,C-16)]被乙基信号[δH0.80(t,J=7.5Hz,Me-16),1.35(m,H-15a),1.56(m,H-15b),δC 11.2(q,Me-16),26.4(t,C-15)]取代。在1H-1HCOSY谱中，观察到的从H-14到H-17（图5）的偶合及在HMBC相关中观察到的从H-16到C-14/C-15，从H-17到C-13/C-14/C-15相关确证了这种取代（图5）。根据以上分析，确立了化合物10的平面结构。
化合物10的相对构型根据H1与H2间的偶合常数[3JH1-H2(2.5Hz)]来推导得知（图5）。化合物5的绝对构型（C-1，C-2，C-3）通过比较实验测定的CD谱（甲醇为溶剂）与计算的(1R,2S,3S,14R)-10(10a)、(1S,2S,3S,14S)-10(10b)ECD谱来确定。通过计算发现化合物10的构型为1R,2S,3S时，C-14为R或S构型，其ECD谱几乎相同（图6）且与实验所测CD谱相似。这说明，化合物10中C-1，C-2和C-3的构型为1R,2S,3S，同时说明C-14位的构型对化合物10的ECD谱影响不大，由此确定化合物10的结构式如图1中的10所示，命名为Fluostatin J。
化合物11：化合物11为新化合物。其负源高分辨电喷雾质谱图显示准分子离子峰为m/z307.0641[M-H]-，对应分子式为C18H12O5（计算值为307.0606），不饱和度为13。分析化合物11的1H和13C NMR（表2），显示其与已知化合物fluostatin C(5)相似。两个化合物的不同之处在于fluostatin结构单元所连接的脂肪环。在fluostatin C中的两个含氧次甲基(δC 61.3,C-1,
表2：化合物9、10、11的NMR数据
Figure BDA00002418546500171
Figure BDA00002418546500181
a Measured in CD3OD,bMeasured in CDCl3/CD3OD,cMeasured in DMSO-d6.*interchangeable64.0,C-2)信号不能在化合物11中找到，反而，在化合物11中观察到一对烯键信号[δH6.29(d,J=10.0Hz,H-2),7.57(d,J=10.0Hz,H-1);δC 117.4(CH,C-1),141.2(CH,C-2)]，同时，C-3位的化学位移向低场移动了14.2ppm。根据以上观察，推测化合物fluostatin C中C-2，C-3间的氧环断裂，断裂形成的羟基连接到C-3，且fluostatin C中C-1的羟基与C-2的氢脱水形成双键。1H-1H COSY谱中H-1与H-2之间的相关以及在HMBC中观察到的从H-1到C-3、从H-2到C-4以及从12-Me到C-2/C-3的相关证实了以上推论（图7）。这样确定了化合物11的平面结构。
根据H-1与H-2间的偶合常数将C-1/C-2双键确定为Z型(ZΔ1,2J1,210.0Hz)，化合物11中sp3杂化的连氧碳C-3的绝对构型的确定是通过比较其实验测定的CD谱（甲醇为溶剂）与计算的(3R)-11(11a)和(3S)-11(11b)(图8)构型的ECD谱来确定。实测CD谱与计算的11b构型的ECD谱一致，故将化合物11中C-3的绝对构型确定为3S。由此确定化合物11的结构式如图1中的11所示，命名为Fluostatin K。
化合物12：红色粉末，ESI-MS m/z 361[M+Na]+、699[2M+Na]-，提示其分子量为338。结合1H-NMR和13C-NMR分析，确定其分子式为C19H14O6。以下是其NMR数据的归属：1H-NMR(DMSO-d6,500MHz)δH 7.79(1H,dd,J=8.0,6.5Hz,H10),7.48(1H,d,J=6.5Hz,H-11),7.35(1H,d,J=8.0Hz,H-9),7.15(1H,s,H-5),3.14(1H,d,J=16.5Hz,H-4a),2.99(1H,d,J=17.0Hz,H-4b),2.95(1H,d,J=14.0Hz,H-3a),2.68(1H,d,J=14.0Hz,H-3b),1.32(1H,s,H-14).13C-NMR(DMSO-d6,125MHz)δc183.3(C-1),43.4(C-2),70.9(C-3),53.1(C-4),137.5(C-4a),121.3(C-5),160.4(C-6),115.4(C-6a),190.9(C-7),135.4(C-7a),162.1(C-8),123.4(C-9),137.4(C-10),118.5(C-11),128.5(C-11a),195.6(C-12),116.6(C-12a),151.8(C-12b),29.4(C-13)。以上波谱数据与文献[Feng,Z.;Kim,J.H.;Brady，S.F.,Fluostatins produced by the heterologousexpression of a TAR reassembled environmental DNA derived type II PKS gene cluster.J Am ChemSoc 2010,132,11902-3]一致，故将化合物12确定为rabelomycin，结构式如图1所示。
化合物13：红色粉末，ESI-MS m/z 304[M-H]-，提示其分子量为305。结合1H-NMR和13C-NMR分析，确定其分子式为C18H11NO4。以下是其NMR数据的归属：1H NMR(CD3OD,500MHz)δH 9.45(1H,s,H-5),7.92(H11,d,J=7.5Hz,H-11),7.75(1H,dd,J=8.0,8.0Hz,H-10),7.42(1H,d,J=8.5Hz,H-9),7.46(1H,br s,H-4),2.56(3H,s,H-13).13C-NMR(CD3OD,125MHz)δc155.1(C-1),123.6(C-2),144.0(C-3),121.1(C-4),120.6(C-4a),160.2(C-5),132.5(C-6a),186.2(C-7),114.6(C-7a),162.1(C-8),125.7(C-9),137.0(C-10),121.4(C-11),133.6(C-11a),189.0(C-12),122.5(C-12a),145.0(C-12b),21.4(C-13)。以上波谱数据与文献[Frutos,；
Figure BDA00002418546500201
Atienza,C.;Echavarren,AM.,Synthesis of Benzo[b]phenanthridines and Related NaturallyOccurring 2-Aryl-1,4-naphthoquinones by Palladium-and Copper-Catalyzed Coupling ofOrganostannanes with Bromoquinones.Eur J Org Chem 2001,2001,163-171.]一致，故将化合物13确定为Phenanthroviridone，结构式如图1所示。
Figure IDA00002418547600011
Figure IDA00002418547600021

Claims (4)

1.小单孢菌（Micromonospora rosaria）SCSIO N160，其保藏编号为：CCTCC NO:M 2012392。
2.一种制备抗生素rosamicin，6108B，M4365-A1，M4365-G1，fluostatinC，fluostatin D，fluostatin E，fluostatin F，fluostatin I，fluostatin J，fluostatin K，rabelomycin和phenanthroviridone的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（a）制备权利要求1所述的小单孢菌（Micromonospora rosaria）SCSIO N160的发酵培养物，将该发酵培养物的发酵液和菌丝体分开，发酵液经丁酮萃取，丁酮萃取层经过蒸馏浓缩后得到浸膏A；菌丝体先用丙酮浸提，浸提液回收丙酮后剩余的水相混合液用丁酮萃取，丁酮萃取层经过蒸馏浓缩后得到浸膏B；将浸膏A与B合并为浸膏C；
（b）浸膏C经硅胶柱层析，以体积比从100:0~0:100的氯仿-甲醇作为流动相梯度洗脱，氯仿-甲醇体积比为98:2梯度下洗脱下来的馏分Fr1，氯仿-甲醇体积比为95:5梯度下洗脱下来的馏分Fr.2，氯仿-甲醇体积比为90:10梯度下洗脱下来的馏分Fr.3，氯仿-甲醇体积比为50:50梯度下洗脱下来的馏分Fr.4；
馏分Fr.2经凝胶柱层析，用体积比为1:1的氯仿-甲醇作为流动相洗脱，得到馏分Fr.2-A至Fr.2-H，将馏分Fr.2-C经中压反相层析，以体积比从100:0~0:100的甲醇：水线性梯度洗脱，收集体积比甲醇：水=35：65的馏分得化合物rosamicin，将馏份Fr.2-D上中压反相柱，以体积比从100:0~0:100的甲醇：水线性梯度洗脱，收集体积比甲醇：水=40：60的馏分得化合物6108B，将馏份Fr.2-E用高压液相制备，流动相为体积比水：乙腈=70:30，纯化得到化合物M4365-A1，将馏分Fr.2-F用高压液相制备，流动相为体积比乙腈：水=72:28，纯化得化合物M4365-G1；
馏分Fr.1经凝胶柱层析，用体积比为1:1的氯仿-甲醇作为流动相洗脱，得到馏分Fr1-A，Fr1-B，Fr1-C，Fr1-D，Fr1-A经中压反相层析，用体积比100:0~0:100的甲醇：水线性梯度洗脱，收集体积比甲醇：水=58：42的馏分得化合物fluostatin I，收集体积比甲醇：水=50：50的馏分得Fr1-A-2，Fr1-A-2用高压液相制备，用体积比乙腈：水=80：20为流动相洗脱，纯化得化合物fluostatin C和化合物fluostatin E；Fr1-B用高压液相制备，用体积比乙腈：水=65:35为流动相，纯化得化合物fluostatin F和化合物rabelomycin；Fr1-C用硅胶柱层析，以体积比100:0~0:100的氯仿-甲醇作为流动相梯度洗脱，收集体积比氯仿：甲醇=60：40的馏分得Fr1-C-(3)，Fr1-C-(3)通过PTLC层析，以氯仿：丙酮体积比为65:35为展开剂展开，收集比移值为0.8的馏分，得化合物fluostatin D；Fr1-D以凝胶柱层析，用氯仿：甲醇体积比5:5洗脱，再用高压液相制备，用体积比乙腈：水=60:40为流动相，纯化得化合物fluostatin K、化合物fluostatin J和化合物phenanthroviridone。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的制备小单孢菌（Micromonospora rosaria）SCSIO N160的发酵培养物是通过以下方法制备：将活化的小单孢菌SCSIO N160接入种子培养基中，28℃，200rpm，培养144h制得种子液，将种子液以10%的接种量接入到发酵培养基中，28℃，200rpm，振荡培养120h，而制得发酵培养物，所述的种子培养基和发酵培养基的配方都为每升培养基中含有：淀粉10g，葡萄糖20g，酵母粉10g，玉米粉3g，牛肉膏3g，MgSO4·7H2O 0.5g，K2HPO40.5g，CaCO32g，粗海盐30g，余量为水，pH 7.2。
4.权利要求1所述的小单孢菌（Micromonospora rosaria）SCSIO N160在制备抗生素rosamicin、6108B、M4365-A1、M4365-G1、fluostatinC、fluostatin D、fluostatin E、fluostatin F、fluostatinI、fluostatin J、fluostatin K、rabelomycin或phenanthroviridone中的应用。
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