CN102747115A - 发酵生产抗生素calicheamicinγ1I的发酵培养基及发酵方法和用途 - Google Patents
发酵生产抗生素calicheamicinγ1I的发酵培养基及发酵方法和用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种发酵生产抗生素calicheamicinγ1I的发酵培养基，其包括有机碳源和有机氮源，按所述发酵培养基的总体积计，所述有机碳源的含量为5-130g/L，优选为20-110g/L；所述有机氮源的含量为2-150g/L，优选为4-60g/L，更优选为15-40g/L；所述有机碳源为蔗糖、糖蜜、甘油和玉米淀粉中的一种或多种；所述有机氮源包括细豆柏和/或玉米浆粉。本发明还提供了用该发酵培养基发酵生产抗生素calicheamicinγ1I的方法以及该发酵培养基的用途。本发明的发酵培养基能够大幅提供calicheamicinγ1I的发酵单位，提高生产效率，降低生产成本，适用于calicheamicinγ1I的规模化生产。
Description
技术领域
本发明属于工业微生物技术领域，特别涉及一种用棘孢小单孢菌发酵生产抗生素calicheamicinγ1I的新发酵培养基，还涉及用该发酵培养基发酵生产抗生素calicheamicinγ1I的方法以及该发酵培养基的用途。
背景技术
1987年，美国氰胺公司(CYANAMID)的Lederle实验室从德克萨斯州的生硝或白垩土壤中分离出棘孢小单孢菌(Micromonospora echinosporasp.calichensis)，并在含有溴或碘的培养基中对其进行发酵后获得了7种不同的活性化合物，主要包括：Calicheamicin β1Br、γ1Br、α2I、α3I、β1I、γ1I和δ1I，这种抗肿瘤抗生素属于烯二炔类抗生素，能够通过断裂细胞DNA，对细胞产生不可恢复的损伤，从而杀死癌细胞。其中Calicheamicinγ1I的抗癌活性最高。
由于烯二炔类抗生素的毒性较大，因此在很长一段时间内未受到医药界的重视，但是随着单克隆抗体技术的不断成熟，惠氏公司(现辉瑞公司)将重组人源化CD33单克隆抗体与抗肿瘤抗生素Calicheamicinγ1I连接制备出吉妥单抗Mylotarg(gemtuzumab ozogamicin)，这一研究成果大大的激发医药行业对于单抗药物的研究。在这一研究中，抗肿瘤抗生素Calicheamicinγ1I仅仅作为“弹头药物”，而CD33单克隆抗体则具有导向功能。因此如果将抗肿瘤抗生素Calicheamicinγ1I与不同的单克隆抗体连接很可能制备出新的抗肿瘤药物。
因此，抗肿瘤抗生素Calicheamicinγ1I的微生物发酵工艺也倍受医药行业的关注。目前，Calicheamicinγ1I主要由辉瑞制药公司通过发酵进行生产，但其报道的发酵配方仅仅简单的碳氮源培养基，培养温度为28℃，培养时间144h。由于其发酵培养基种的营养成分仅为简单的碳氮源培养基，菌体活力较差，发酵单位较低，而且Calicheamicinγ1I主要是通过断裂DNA产生作用，菌株的自身耐受性较低，因此其报道的最高发酵单位为10mg/L。中国北京协和医学院又发现了一株新的产生Calicheamicinγ1I的小单孢菌C3509，但是其并未报道相关的产量。
发明内容
本发明所要解决的技术问题就是针对现有的利用棘孢小单孢菌发酵生产抗生素calicheamicinγ1I的发酵培养基发酵单位较低，产率低等缺陷，提供了一种新的用于棘孢小单孢菌发酵生产抗生素calicheamicinγ1I的发酵培养基以及相应的发酵方法和用途，从而提高calicheamicinγ1I的发酵单位，提高生产效率，降低生产成本。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：一种用于棘孢小单孢菌发酵生产抗生素calicheamicinγ1I的发酵培养基，其包括有机碳源和有机氮源，按所述发酵培养基的总体积计，所述有机碳源的含量为5-130g/L，优选20-110g/L；所述有机氮源的含量为2-150g/L，优选为4-60g/L，更优选为15-40g/L；所述有机碳源为蔗糖、糖蜜、甘油和玉米淀粉中的一种或多种；所述有机氮源包括细豆柏和/或玉米浆粉。
在本发明一较佳的实施方式中，所述的有机碳源为混合物A或混合物B，所述混合物A为由蔗糖和糖蜜组成的混合物，所述混合物B为由蔗糖、糖蜜和甘油组成的混合物。此时，所述混合物A或混合物B的含量较佳地为5-70g/L，更佳地为20-70g/L。在所述混合物A或混合物B中，所述蔗糖的含量较佳地为5-40g/L；所述糖蜜的含量较佳地为5-20g/L；所述甘油的含量较佳地为5-10g/L；所述含量皆按所述发酵培养基的总体积计。
在本发明另一较佳的实施方式中，所述的有机碳源为组分1与玉米淀粉的混合物。所述组分1为由蔗糖、糖蜜和甘油中的一种或多种组成的混合物，较佳地为混合物A或混合物B。所述混合物A为由蔗糖和糖蜜组成的混合物，所述混合物B为由蔗糖、糖蜜和甘油组成的混合物。此时，所述组分1的含量较佳地为5-70g/L；玉米淀粉的含量较佳地为5-60g/L。在所述混合物A或混合物B中，所述蔗糖的含量较佳地为5-40g/L；所述糖蜜的含量较佳地为5-20g/L；所述甘油的含量较佳地为5-10g/L；所述含量皆按所述发酵培养基的总体积计。
在本发明的发酵培养基中，所述的有机氮源较佳地还包括黄豆饼粉和/或蛋白胨。所述黄豆饼粉的含量较佳地为5-60g/L，所述蛋白胨的含量较佳地为5-60g/L。其中，所述的黄豆饼粉较佳地选自本领域常用的各种黄豆饼粉，较佳地为热榨黄豆饼粉和/或冷榨黄豆饼粉。所述热榨黄豆饼粉的含量较佳地为2-30g/L，所述冷榨黄豆饼粉的含量较佳地为2-30g/L。所述蛋白胨较佳地选自本领域各种常用的蛋白胨，较佳地为胰蛋白胨、大豆蛋白胨和鱼胨中的一种或多种。所述胰蛋白胨的含量较佳地为5-20g/L，所述大豆蛋白胨的含量较佳地为5-20g/L，所述鱼胨的含量较佳地为5-20g/L；所述含量皆按所述发酵培养基的总体积计。
在本发明一较佳的实施方式中，所述的有机氮源还包括氨基酸，进一步补充氮源。所述的氨基酸可选用本领域常用的各种氨基酸，较佳地为异亮氨酸、亮氨酸和精氨酸中的一种或多种，更佳地为异亮氨酸。所述氨基酸的含量为本领域的常规含量，较佳地为0.5-2.0g/L，更佳地为0.5-1.0g/L；所述含量皆按所述发酵培养基的总体积计。
在本发明一较佳的实施方式中，所述的有机氮源包括组分2和细豆柏。所述组分2为所述黄豆饼粉、所述玉米浆粉和所述蛋白胨中的一种或多种，较佳地为所述黄豆饼粉、所述玉米浆粉和所述蛋白胨。其中，所述组分2的含量较佳地为6-130g/L，更佳地为10-45g/L；所述细豆柏的含量较佳地为2-20g/L，更佳地为4-15g/L；所述组分2中，所述黄豆饼粉的含量较佳地为2-60g/L，更佳地为4-15g/L；所述玉米浆粉的含量较佳地为2-20g/L，更佳地为4-15g/L；所述蛋白胨的含量较佳地为2-50g/L，更佳地为4-15g/L；所述含量皆按所述发酵培养基的总体积计。更佳地，所述发酵培养基中还包括氨基酸0.5-2.0g/L，优选0.5-1.0g/L。所述含量皆按所述发酵培养基的总体积计。
较佳地，所述的发酵培养基还包括按所述发酵培养基的总体积计为0.1-0.4g/L的无机氮源。所述的无机氮源可为本领域培养基中常用的无机氮源，如KNO3和/或(NH4)2SO4。
在本发明一较佳的实施方式中，所述的发酵培养基包括有机碳源、有机氮源以及无机氮源，其中所述有机碳源为组分120-70g/L和玉米淀粉5-60g/L；所述有机氮源为组分210-45g/L、细豆柏2-20g/L和0.5-2.0g/L氨基酸，所述无机氮源为0.1-0.4g/L KNO3，所述含量皆按所述发酵培养基的总体积计。
在本发明的发酵培养基中，为了增加一些酶的活性，较佳地还进一步包含常见的可以增加酶活性的金属离子。所述的金属离子优选锰离子、锌离子、镁离子和亚铁离子中的一种或多种，更佳地为镁离子和亚铁离子，最佳地为锰离子、锌离子、镁离子和亚铁离子。所述锰离子可以本领域培养基原料的常规形式添加，如MnCl2·4H2O。所述锌离子可以本领域培养基原料的常规形式添加，如ZnSO4。所述镁离子可以本领域培养基原料的常规形式添加，如MgSO4·7H2O。所述亚铁离子可以本领域培养基原料的常规形式添加，如FeSO4·7H2O。所述金属离子的含量为本领域中可以增加酶活性的金属离子的常规含量，较佳地为0.1-1.2g/L，所述含量按所述发酵培养基的总体积计。
本发明的发酵培养基中，如常规的棘孢小单孢菌的发酵培养基一样，较佳的还进一步含有矿物质。所述的矿物质一般作为pH调节剂、提供calicheamicinγ1I分子结构中硫元素的硫源以及提供calicheamicinγ1I分子结构中碘元素的碘源中的一种或多种。所述的pH调节剂较佳地为1.0-4.0g/L的CaCO3。所述硫源为常规的发酵培养基中用于提供硫元素的硫源，较佳地为Na2SO4、Na2S2O3、Na2SO3和Na2S中的一种或者多种，所述硫源的含量较佳地为0.1-0.15g/L。所述碘源为常规的发酵培养基中用于提供碘元素的碘源，较佳地为KI，其中KI的含量较佳地为0.1-0.5g/L；所述含量皆按所述发酵培养基的总体积计。
本发明的发酵培养基如常规的棘孢小单孢菌的发酵培养基一样，较佳地还可以含有消泡剂。消泡剂的用量为常规用量。
在本发明一较佳的实施方式中，所述的发酵培养基包含有所述有机碳源、所述有机氮源、所述无机氮源、所述碘源、亚铁离子、镁离子和pH调节剂；较佳地还包括所述硫源。
在本发明一更佳的实施方式中，所述的发酵培养基包含有所述有机碳源、所述有机氮源、所述无机氮源、所述碘源以及所述硫源；其中，
所述的有机碳源为5-70g/L所述组分1以及5-60g/L玉米淀粉；
所述的有机氮源为所述组分2和细豆柏，或为所述组分2、细豆柏和氨基酸；所述细豆柏的含量为2-20g/L，较佳地为4-15g/L；所述氨基酸较佳地为异亮氨酸；所述异亮氨酸的含量为0.5-2.0g/L，较佳地为0.5-1.0g/L；
所述无机氮源为0.1-0.4g/L硝酸钾；
所述的碘源为0.1-0.5g/L KI；
所述的硫源为0.1-0.15g/L Na2S2O3；
较佳地还包括0.1-0.3g/L亚铁离子和0.1-0.3g/L镁离子；所述含量皆按所述发酵培养基的总体积计。
本发明的一最佳的实施方式中，本发明的发酵培养基包含：蔗糖5-40g/L；糖蜜5-20g/L；甘油5-10g/L；玉米淀粉5-60g/L；黄豆饼粉2-60g/L，较佳地为4-15g/L；玉米浆粉2-20g/L，较佳地为4-15g/L；胰蛋白胨4-20g/L；细豆柏2-20g/L，较佳地为4-15g/L；异亮氨酸0.5-2.0g/L；KNO3 0.1-0.3g/L；MgSO4·7H2O 0.1-0.3g/L；FeSO4·7H2O 0.1-0.3g/L；MnCl2·4H2O 0.1-0.3g/L；ZnSO4 0.1-0.3g/L；Na2S2O3 0.1-0.15g/L；CaCO31.0-4.0g/L；以及KI 0.1-0.3g/L；所述含量皆按所述发酵培养基的总体积计。
本发明的发酵培养基的pH值较佳地为pH5.0-8.0，更佳地是pH5.5-7.5。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是：一种抗生素calicheamicinγ1I的发酵生产方法，其包括步骤：
(a)将棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora sp.calichensis)的种子液接种于发酵培养基中进行液体发酵培养，所述的发酵培养基是如上所述的任一项发酵培养基；
(b)从发酵液中分离出抗生素calicheamicinγ1I。
在步骤(a)中，所述的棘孢小单孢菌(Micromonospora echinosporasp.calichensis)较佳地为棘孢小单孢菌NRRL-18149。
在步骤(a)中，所述的棘孢小单孢菌的种子液是按常规的方法将棘孢小单孢菌在种子培养基中培养而得到的。所述的种子培养基可以是现有的棘孢小单孢菌的种子培养基，较佳选自Medium S培养基。种子培养的温度较佳的是25-32℃。所述种子液的接种量是本领域的常规接种量，一般为10％-15％(v/v)。
在步骤(a)中，所述发酵培养的温度是此类发酵培养的常规温度，较佳地为20-40℃，更佳地为25-32℃。所述发酵培养的时间是此类发酵培养的常规时间，较佳地为5-7天。
在步骤(b)中，从发酵液中分离出calicheamicinγ1I的方法可以是常规的方法，将发酵液用等体积乙酸乙酯与发酵液混合超声，离心取上清液即可。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之三是：所述的发酵培养基在将棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora sp.calichensis)发酵转化成抗生素calicheamicinγ1I中的用途。所述的棘孢小单孢菌较佳地为棘孢小单孢菌NRRL-18149。
本发明中，上述优选条件在符合本领域常识的基础上可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。
本发明中，上述优选条件在符合本领域常识的基础上可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明的积极进步效果在于：
本发明提供了一种有利于棘孢小单孢菌高效发酵生产抗生素calicheamicinγ1I的发酵培养基以及相应的发酵方法和用途。通过优选发酵培养基的碳氮源成分及配比，优化培养温度、pH等发酵参数，从而大大提高calicheamicinγ1I的产量。本发明提供的calicheamicinγ1I的发酵生产方法提高了calicheamicinγ1I的发酵单位，适用于calicheamicinγ1I的规模化生产。
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
对比实施例1
取一株棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora sp.calichensis)NRRL-18149划线于斜面培养基，28℃培养4d后接种于摇瓶种子培养基，装液量为20ml/250ml，于30℃，250rpm的旋转式摇床培养48h。种子液以10％(v/v)接种量接种于装液量为20ml的250ml发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度30℃，发酵周期6d。发酵结束后将发酵液用等体积乙酸乙酯与发酵液混合超声，离心取上清液即可。
其中所用的斜面培养基组成：ISP2培养基，组分为葡萄糖4.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，麦芽浸粉10.0g/L，琼脂粉20g/L，pH7.2。
所用的种子培养基组成：Medium S培养基，组分为蔗糖5.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，胰蛋白胨5.0g/L，牛肉膏3.0g/L，麦芽糊精24.0g/L，CaCO34.0g/L，pH7.2。
发酵培养基的组成：蔗糖20.0g/L，糖蜜5.0g/L，胰蛋白胨4.0g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，KI 0.1g/L，CaCO3 2.5g/L，pH7.2。此实施例为初始发酵培养基，以后的所有培养基优化均以此培养基作为对照，此培养基calicheamicinγ1I产量定为100％。HPLC测定，calicheamicinγ1I产量为10mg/L。
实施例1
发酵培养基组成：蔗糖20.0g/L，糖蜜5.0g/L，玉米浆粉4.0g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，KI 0.1g/L，CaCO3 2.5g/L，pH7.2。
按对比实施例中1制得的种子液以10％(v/v)接种量接种于装液量为20ml的250ml发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度30℃，发酵周期6d，其他条件同对比实施例1。calicheamicinγ1I产量为119％。
实施例2
发酵培养基组成：蔗糖18.0g/L，糖蜜7.0g/L，细豆柏4.0g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，KI 0.1g/L，CaCO3 2.5g/L，pH7.2。
按对比实施例中1制得的种子液以10％(v/v)接种量接种于装液量为20ml的250ml发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度30℃，发酵周期6d，其他条件同对比实施例1。calicheamicinγ1I产量为121％。
实施例3
发酵培养基组成：蔗糖22.0g/L，糖蜜8.0g/L，玉米浆粉4.0g/L，细豆柏4.0g/L，冷榨黄豆饼粉4.0g/L，胰蛋白胨4.0g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，KI 0.1g/L，CaCO3 2.5g/L，pH7.2。
按对比实施例中1制得的种子液以10％(v/v)接种量接种于装液量为20ml的250ml发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度30℃，发酵周期6d，其他条件同对比实施例1。calicheamicinγ1I产量为125％。
实施例4
发酵培养基组成：蔗糖20.0g/L，糖蜜5.0g/L，玉米浆粉4.0g/L，细豆柏8.0g/L，冷榨黄豆饼粉8.0g/L，胰蛋白胨8.0g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，KI 0.1g/L，CaCO3 2.5g/L，pH7.2。
按对比实施例中1制得的种子液以10％(v/v)接种量接种于装液量为20ml的250ml发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度30℃，发酵周期6d，其他条件同对比实施例1。calicheamicinγ1I产量为136％。
实施例5
发酵培养基组成：蔗糖20.0g/L，糖蜜5.0g/L，玉米浆粉20.0g/L，细豆柏20.0g/L，冷榨黄豆饼粉30.0g/L，热榨黄豆饼粉30.0g/L，胰蛋白胨20.0g/L，鱼胨20.0g/L，大豆蛋白胨10.0g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，KI 0.1g/L，CaCO3 2.5g/L，pH7.2。
按对比实施例中1制得的种子液以10％(v/v)接种量接种于装液量为20ml的250ml发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度30℃，发酵周期6d，其他条件同对比实施例1。calicheamicinγ1I产量为112％。
实施例6
发酵培养基组成：蔗糖20.0g/L，糖蜜5.0g/L，玉米浆粉8.0g/L，细豆柏12.0g/L，冷榨黄豆饼粉4.0g/L，胰蛋白胨8.0g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，KI 0.1g/L，CaCO3 2.5g/L，pH7.2。
按对比实施例中1制得的种子液以10％(v/v)接种量接种于装液量为20ml的250ml发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度30℃，发酵周期6d，其他条件同对比实施例1。calicheamicinγ1I产量为144％。
实施例7
发酵培养基组成：蔗糖20.0g/L，糖蜜5.0g/L，玉米浆粉10.0g/L，细豆柏4.0g/L，冷榨黄豆饼粉4.0g/L，胰蛋白胨12.0g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，KI 0.1g/L，CaCO3 2.5g/L，pH7.2。
按对比实施例中1制得的种子液以10％(v/v)接种量接种于装液量为20ml的250ml发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度30℃，发酵周期6d，其他条件同对比实施例1。calicheamicinγ1I产量为128％。
实施例8
发酵培养基组成：蔗糖20.0g/L，糖蜜5.0g/L，玉米浆粉8.0g/L，细豆柏7.0g/L，冷榨黄豆饼粉11.0g/L，胰蛋白胨4.0g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，KI 0.1g/L，CaCO3 2.5g/L，pH7.2。
按对比实施例中1制得的种子液以10％(v/v)接种量接种于装液量为20ml的250ml发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度30℃，发酵周期6d，其他条件同对比实施例1。calicheamicinγ1I产量为135％。
实施例9
发酵培养基组成：蔗糖20.0g/L，糖蜜5.0g/L，玉米浆粉9.0g/L，细豆柏8.0g/L，冷榨黄豆饼粉4.0g/L，胰蛋白胨12.0g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，KI 0.1g/L，CaCO3 2.5g/L，pH7.2。
按对比实施例中1制得的种子液以10％(v/v)接种量接种于装液量为20ml的250ml发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度30℃，发酵周期6d，其他条件同对比实施例1。calicheamicinγ1I产量为150％。
实施例10
发酵培养基组成：蔗糖20.0g/L，糖蜜5.0g/L，玉米浆粉12.0g/L，细豆柏12.0g/L，冷榨黄豆饼粉7.0g/L，胰蛋白胨8.0g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，KI 0.1g/L，CaCO3 2.5g/L，pH7.2。
按对比实施例中1制得的种子液以10％(v/v)接种量接种于装液量为20ml的250ml发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度30℃，发酵周期6d，其他条件同对比实施例1。calicheamicinγ1I产量为154％。
实施例11
发酵培养基组成：蔗糖20.0g/L，糖蜜5.0g/L，玉米浆粉20g/L，细豆柏18g/L，冷榨黄豆饼粉10.0g/L，胰蛋白胨12g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，KI 0.1g/L，CaCO3 2.5g/L，pH7.2。
按对比实施例中1制得的种子液以10％(v/v)接种量接种于装液量为20ml的250ml发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度30℃，发酵周期6d，其他条件同对比实施例1。calicheamicinγ1I产量为119％。
实施例12
发酵培养基组成：蔗糖30.0g/L，糖蜜5.0g/L，玉米浆粉12.0g/L，细豆柏12.0g/L，冷榨黄豆饼粉4.0g/L，胰蛋白胨9.0g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，KI 0.1g/L，CaCO3 2.5g/L，pH7.2。
按对比实施例中1制得的种子液以10％(v/v)接种量接种于装液量为20ml的250ml发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度30℃，发酵周期6d，其他条件同对比实施例1。calicheamicinγ1I产量为143％。
实施例13
发酵培养基组成：蔗糖5.0g/L，玉米浆粉12.0g/L，细豆柏12.0g/L，冷榨黄豆饼粉4.0g/L，胰蛋白胨8.0g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，KI 0.1g/L，CaCO3 2.5g/L，pH7.2。
按对比实施例中1制得的种子液以10％(v/v)接种量接种于装液量为20ml的250ml发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度30℃，发酵周期6d，其他条件同对比实施例1。calicheamicinγ1I产量为123％。
实施例14
发酵培养基组成：蔗糖10.0g/L，玉米浆粉12.0g/L，细豆柏12.0g/L，冷榨黄豆饼粉4.0g/L，胰蛋白胨8.0g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，KI 0.1g/L，CaCO3 2.5g/L，pH7.2。
按对比实施例中1制得的种子液以10％(v/v)接种量接种于装液量为20ml的250ml发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度30℃，发酵周期6d，其他条件同对比实施例1。calicheamicinγ1I产量为126％。
实施例15
发酵培养基组成：蔗糖20.0g/L，糖蜜15.0g/L，玉米浆粉12.0g/L，细豆柏12.0g/L，冷榨黄豆饼粉4.0g/L，胰蛋白胨8.0g/L，FeSO4·7H2O0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，KI 0.1g/L，CaCO3 2.5g/L，pH7.2。
按对比实施例中1制得的种子液以10％(v/v)接种量接种于装液量为20ml的250ml发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度30℃，发酵周期6d，其他条件同对比实施例1。calicheamicinγ1I产量为132％。
实施例16
发酵培养基组成：蔗糖20.0g/L，糖蜜5.0g/L，甘油5.0g/L，玉米浆粉12.0g/L，细豆柏12.0g/L，冷榨黄豆饼粉4.0g/L，胰蛋白胨8.0g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，KI 0.1g/L，CaCO3 2.5g/L，pH7.2。
按对比实施例中1制得的种子液以10％(v/v)接种量接种于装液量为20ml的250ml发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度30℃，发酵周期6d，其他条件同对比实施例1。calicheamicinγ1I产量为160％。
实施例17
发酵培养基组成：蔗糖40.0g/L，糖蜜20.0g/L，甘油10.0g/L，玉米淀粉60g/L，玉米浆粉12.0g/L，细豆柏12.0g/L，冷榨黄豆饼粉4.0g/L，胰蛋白胨8.0g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，KI 0.1g/L，CaCO32.5g/L，pH7.2。
按对比实施例中1制得的种子液以10％(v/v)接种量接种于装液量为20ml的250ml发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度30℃，发酵周期6d，其他条件同对比实施例1。calicheamicinγ1I产量为172％。
实施例18
发酵培养基组成：蔗糖20.0g/L，糖蜜10.0g/L，甘油5.0g/L，玉米淀粉5g/L，玉米浆粉12.0g/L，细豆柏12.0g/L，冷榨黄豆饼粉4.0g/L，胰蛋白胨8.0g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，KI 0.1g/L，CaCO32.5g/L，pH7.2。
按对比实施例中1制得的种子液以10％(v/v)接种量接种于装液量为20ml的250ml发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度30℃，发酵周期6d，其他条件同对比实施例1。calicheamicinγ1I产量为148％。
实施例19
发酵培养基组成：蔗糖18.0g/L，糖蜜5.0g/L，甘油5.0g/L，玉米淀粉50.0g/L，玉米浆粉12.0g/L，细豆柏12.0g/L，冷榨黄豆饼粉4.0g/L，胰蛋白胨8.0g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，KI 0.1g/L，CaCO32.5g/L，pH7.2。
按对比实施例中1制得的种子液以10％(v/v)接种量接种于装液量为20ml的250ml发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度30℃，发酵周期6d，其他条件同对比实施例1。calicheamicinγ1I产量为192％。
实施例20
发酵培养基组成：蔗糖40.0g/L，糖蜜20.0g/L，甘油10.0g/L，玉米淀粉40.0g/L，玉米浆粉12.0g/L，细豆柏12.0g/L，冷榨黄豆饼粉4.0g/L，胰蛋白胨8.0g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，KI 0.1g/L，CaCO3 2.5g/L，pH7.2。
按对比实施例中1制得的种子液以10％(v/v)接种量接种于装液量为20ml的250ml发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度30℃，发酵周期6d，其他条件同对比实施例1。calicheamicinγ1I产量为172％。
实施例21
发酵培养基组成：蔗糖20.0g/L，糖蜜5.0g/L，甘油6.0g/L，玉米淀粉50.0g/L，玉米浆粉12.0g/L，细豆柏12.0g/L，冷榨黄豆饼粉4.0g/L，胰蛋白胨8.0g/L，异亮氨酸1.0g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，KI 0.1g/L，CaCO3 2.5g/L，pH7.2。
按对比实施例中1制得的种子液以10％(v/v)接种量接种于装液量为20ml的250ml发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度30℃，发酵周期6d，其他条件同对比实施例1。calicheamicinγ1I产量为210％。
实施例22
发酵培养基组成：蔗糖20.0g/L，糖蜜8.0g/L，甘油5.0g/L，玉米淀粉50.0g/L，玉米浆粉12.0g/L，细豆柏12.0g/L，冷榨黄豆饼粉4.0g/L，胰蛋白胨8.0g/L，亮氨酸1.0g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，KI0.1g/L，CaCO3 2.5g/L，pH7.2。
按对比实施例中1制得的种子液以10％(v/v)接种量接种于装液量为20ml的250ml发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度30℃，发酵周期6d，其他条件同对比实施例1。calicheamicinγ1I产量为153％。
实施例23
发酵培养基组成：蔗糖15.0g/L，糖蜜5.0g/L，甘油5.0g/L，玉米淀粉50.0g/L，玉米浆粉12.0g/L，细豆柏12.0g/L，冷榨黄豆饼粉4.0g/L，胰蛋白胨8.0g/L，精氨酸1.0g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，KI0.1g/L，CaCO3 2.5g/L，pH7.2。
按对比实施例中1制得的种子液以10％(v/v)接种量接种于装液量为20ml的250ml发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度30℃，发酵周期6d，其他条件同对比实施例1。calicheamicinγ1I产量为127％。
实施例24
发酵培养基组成：蔗糖20.0g/L，糖蜜5.0g/L，甘油5.0g/L，玉米淀粉50.0g/L，玉米浆粉12.0g/L，细豆柏12.0g/L，冷榨黄豆饼粉4.0g/L，胰蛋白胨8.0g/L，异亮氨酸2.0g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，KI 0.1g/L，CaCO3 2.5g/L，pH7.2。
按对比实施例中1制得的种子液以10％(v/v)接种量接种于装液量为20ml的250ml发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度30℃，发酵周期6d，其他条件同对比实施例1。calicheamicinγ1I产量为192％。
实施例25
发酵培养基组成：蔗糖5.0g/L，玉米浆粉12.0g/L，细豆柏12.0g/L，冷榨黄豆饼粉4.0g/L，胰蛋白胨8.0g/L，异亮氨酸0.5g/L，FeSO4·7H2O0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，KI 0.1g/L，CaCO3 2.5g/L，pH7.2。
按对比实施例中1制得的种子液以10％(v/v)接种量接种于装液量为20ml的250ml发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度30℃，发酵周期6d，其他条件同对比实施例1。calicheamicinγ1I产量为148％。
实施例26
发酵培养基组成：蔗糖20.0g/L，糖蜜5.0g/L，甘油5.0g/L，玉米淀粉50.0g/L，玉米浆粉12.0g/L，细豆柏12.0g/L，冷榨黄豆饼粉4.0g/L，胰蛋白胨8.0g/L，异亮氨酸1.0g/L，Na2SO4 0.15g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，KI 0.1g/L，CaCO3 2.5g/L，pH7.2。
按对比实施例中1制得的种子液以10％(v/v)接种量接种于装液量为20ml的250ml发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度30℃，发酵周期6d，其他条件同对比实施例1。calicheamicinγ1I产量为208％。
实施例27
发酵培养基组成：蔗糖20.0g/L，糖蜜5.0g/L，甘油5.0g/L，玉米淀粉50.0g/L，玉米浆粉12.0g/L，细豆柏12.0g/L，冷榨黄豆饼粉4.0g/L，胰蛋白胨8.0g/L，异亮氨酸1.0g/L，Na2S2O3 0.15g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，KI 0.1g/L，CaCO3 2.5g/L，pH7.2。
按对比实施例中1制得的种子液以10％(v/v)接种量接种于装液量为20ml的250ml发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度30℃，发酵周期6d，其他条件同对比实施例1。calicheamicinγ1I产量为235％。
实施例28
发酵培养基组成：蔗糖12.0g/L，糖蜜5.0g/L，甘油5.0g/L，玉米淀粉50.0g/L，玉米浆粉12.0g/L，细豆柏12.0g/L，冷榨黄豆饼粉4.0g/L，胰蛋白胨8.0g/L，异亮氨酸1.0g/L，KNO3 0.15g/L，Na2S2O3 0.15g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，KI 0.1g/L，CaCO3 2.5g/L，pH7.2。
按对比实施例中1制得的种子液以10％(v/v)接种量接种于装液量为20ml的250ml发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度30℃，发酵周期6d，其他条件同对比实施例1。calicheamicinγ1I产量为248％。
实施例29
发酵培养基组成：蔗糖20.0g/L，糖蜜5.0g/L，甘油5.0g/L，玉米淀粉50.0g/L，玉米浆粉12.0g/L，细豆柏12.0g/L，冷榨黄豆饼粉4.0g/L，胰蛋白胨8.0g/L，异亮氨酸1.0g/L，KNO3 0.4g/L，Na2S2O3 0.15g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，KI 0.1g/L，CaCO3 2.5g/L，pH7.2。
按对比实施例中1制得的种子液以10％(v/v)接种量接种于装液量为20ml的250ml发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度30℃，发酵周期6d，其他条件同对比实施例1。calicheamicinγ1I产量为228％。
实施例30
发酵培养基组成：蔗糖20.0g/L，糖蜜5.0g/L，甘油5.0g/L，玉米淀粉50.0g/L，玉米浆粉12.0g/L，细豆柏12.0g/L，冷榨黄豆饼粉4.0g/L，胰蛋白胨8.0g/L，异亮氨酸1.0g/L，(NH4)2SO4 0.15g/L，Na2S2O3 0.15g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，KI 0.1g/L，CaCO3 2.5g/L，pH7.2。
按对比实施例中1制得的种子液以10％(v/v)接种量接种于装液量为20ml的250ml发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度30℃，发酵周期6d，其他条件同对比实施例1。calicheamicinγ1I产量为225％。
实施例31
发酵培养基组成：蔗糖20.0g/L，糖蜜5.0g/L，甘油5.0g/L，玉米淀粉50.0g/L，玉米浆粉12.0g/L，细豆柏12.0g/L，冷榨黄豆饼粉4.0g/L，胰蛋白胨8.0g/L，异亮氨酸1.0g/L，KNO3 0.15g/L，Na2S2O3 0.15g/L，MnCl2·4H2O 0.2g/L，ZnSO4 0.25g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，KI 0.1g/L，CaCO3 2.5g/L，pH7.2。
按对比实施例中1制得的种子液以10％(v/v)接种量接种于装液量为20ml的250ml发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度30℃，发酵周期6d，其他条件同对比实施例1。calicheamicinγ1I产量为257％。
实施例32
发酵培养基组成：蔗糖20.0g/L，糖蜜5.0g/L，甘油5.0g/L，玉米淀粉50.0g/L，玉米浆粉12.0g/L，细豆柏12.0g/L，冷榨黄豆饼粉4.0g/L，胰蛋白胨8.0g/L，异亮氨酸1.0g/L，KNO3 0.15g/L，Na2S2O3 0.15g/L，MnCl2·4H2O 0.4g/L，ZnSO4 0.35g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.35g/L，KI 0.1g/L，CaCO3 2.5g/L，pH7.2。
按对比实施例中1制得的种子液以10％(v/v)接种量接种于装液量为20ml的250ml发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度30℃，发酵周期6d，其他条件同对比实施例1。calicheamicinγ1I产量为245％。
实施例33
发酵培养基组成：蔗糖20.0g/L，糖蜜5.0g/L，甘油5.0g/L，玉米淀粉50.0g/L，玉米浆粉12.0g/L，细豆柏12.0g/L，冷榨黄豆饼粉4.0g/L，胰蛋白胨8.0g/L，异亮氨酸1.0g/L，KNO3 0.15g/L，Na2S2O3 0.15g/L，MnCl2·4H2O 0.4g/L，ZnSO4 0.35g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.35g/L，KI 0.1g/L，CaCO3 2.5g/L，pH5。
按对比实施例中1制得的种子液以10％(v/v)接种量接种于装液量为20ml的250ml发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度30℃，发酵周期6d，其他条件同对比实施例1。calicheamicinγ1I产量为228％。
实施例34
发酵培养基组成：蔗糖20.0g/L，糖蜜5.0g/L，甘油5.0g/L，玉米淀粉50.0g/L，玉米浆粉12.0g/L，细豆柏12.0g/L，冷榨黄豆饼粉4.0g/L，胰蛋白胨8.0g/L，异亮氨酸1.0g/L，KNO3 0.15g/L，Na2S2O3 0.15g/L，MnCl2·4H2O 0.4g/L，ZnSO4 0.35g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.35g/L，KI 0.1g/L，CaCO3 2.5g/L，pH8.0。
按对比实施例中1制得的种子液以10％(v/v)接种量接种于装液量为20ml的250ml发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度30℃，发酵周期6d，其他条件同对比实施例1。calicheamicinγ1I产量为213％。
Claims (15)
1.一种发酵生产抗生素calicheamicinγ1I的发酵培养基，其特征在于：其包括有机碳源和有机氮源，按所述发酵培养基的总体积计，所述有机碳源的含量为5-130g/L，优选为20-110g/L；所述有机氮源的含量为2-150g/L，优选为4-60g/L，更优选为15-40g/L；所述有机碳源为蔗糖、糖蜜、甘油和玉米淀粉中的一种或多种；所述有机氮源包括细豆柏和/或玉米浆粉。
2.如权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于：所述有机碳源为混合物A或混合物B，其中，所述混合物A为由蔗糖和糖蜜组成的混合物，所述混合物B为由蔗糖、糖蜜和甘油组成的混合物；所述混合物A或混合物B的含量较佳地为5-70g/L，更佳地为20-70g/L；所述含量皆按所述发酵培养基的总体积计。
3.如权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于：所述有机碳源为组分1与玉米淀粉的混合物；所述组分1为蔗糖、糖蜜和甘油中的一种或多种，较佳地为混合物A或混合物B；此时，所述组分1的含量较佳地为5-70g/L，更佳地为20-70g/L；玉米淀粉的含量较佳地为5-60g/L；所述混合物A或混合物B同权利要求3所述；所述含量皆按所述发酵培养基的总体积计。
4.如权利要求2或3所述的发酵培养基，其特征在于：在所述混合物A或混合物B中，蔗糖的含量为5-40g/L；糖蜜的含量为5-20g/L；甘油的含量为5-10g/L；所述含量皆按所述发酵培养基的总体积计。
5.如权利要求1-4中任一项所述的发酵培养基，其特征在于：所述的有机氮源还包括黄豆饼粉和/或蛋白胨；所述黄豆饼粉的含量较佳地为5-60g/L，所述蛋白胨的含量较佳地为5-60g/L；所述黄豆饼粉较佳地为热榨黄豆饼粉和/或冷榨黄豆饼粉；所述热榨黄豆饼粉的含量较佳地为2-30g/L，所述冷榨黄豆饼粉的含量较佳地为2-30g/L；所述蛋白胨较佳地为胰蛋白胨、大豆蛋白胨和鱼胨中的一种或多种；所述胰蛋白胨的含量较佳地为5-20g/L，所述大豆蛋白胨的含量较佳地为5-20g/L，所述鱼胨的含量较佳地为5-20g/L；所述含量皆按所述发酵培养基的总体积计。
6.如权利要求5所述的发酵培养基，其特征在于：所述有机氮源还包括氨基酸，所述氨基酸较佳地为异亮氨酸、亮氨酸和精氨酸中的一种或多种；所述氨基酸的含量较佳地为0.5-2.0g/L，更佳地为0.5-1.0g/L；所述含量皆按所述发酵培养基的总体积计。
7.如权利要求5或6所述的发酵培养基，其特征在于：所述有机氮源包括组分2和细豆柏，较佳地还包括所述氨基酸；所述组分2为所述黄豆饼粉、所述玉米浆粉和所述蛋白胨中的一种或多种，较佳地为所述黄豆饼粉、所述玉米浆粉和所述蛋白胨；其中，所述组分2的含量较佳地为6-130g/L，更佳地为10-45g/L；所述细豆柏的含量较佳地为2-20g/L，更佳地为4-15g/L；所述组分2中，所述黄豆饼粉的含量较佳地为2-60g/L，更佳地为4-15g/L；所述玉米浆粉的含量2-20g/L，更佳地为4-15g/L；所述蛋白胨的含量较佳地为2-50g/L，更佳地为4-15g/L。
8.如权利要求1-7中任一项所述的发酵培养基，其特征在于：所述发酵培养基还包括按所述发酵培养基的总体积计为0.1-0.4g/L的无机氮源；所述无机氮源较佳地为KNO3和/或(NH4)2SO4。
9.如权利要求8所述的发酵培养基，其特征在于：所述发酵培养基包括有机碳源、有机氮源以及无机氮源，所述有机碳源为所述组分120-70g/L和玉米淀粉5-60g/L；所述有机氮源为所述组分210-45g/L、细豆柏2-20g/L和所述氨基酸0.5-2.0g/L，所述无机氮源为KNO3 0.1-0.4g/L；所述含量皆按所述发酵培养基的总体积计。
10.如权利要求1-9中任一项所述的发酵培养基，其特征在于：所述发酵培养基中还包括可增加酶活性的金属离子、矿物质和消泡剂中的一种或多种；所述可增加酶活性的金属离子优选锰离子、锌离子、镁离子和亚铁离子中的一种或多种；所述锰离子较佳地以MnCl2·4H2O的形式添加，所述锌离子较佳地以ZnSO4的形式添加，所述镁离子较佳地以MgSO4·7H2O的形式添加，所述亚铁离子较佳地以FeSO4·7H2O的形式添加；所述可增加酶活性的金属离子的含量较佳地为0.1-1.2g/L；所述矿物质包括pH调节剂、硫源和碘源中的一种或多种；所述pH调节剂较佳地为1.0-4.0g/L的CaCO3；所述硫源较佳地为Na2SO4、Na2S2O3、Na2SO3和Na2S中的一种或者多种，所述硫源的含量较佳地为0.1-0.15g/L；所述碘源较佳地为KI，KI的含量较佳地为0.1-0.5g/L；所述含量皆按所述发酵培养基的总体积计。
11.如权利要求10所述的发酵培养基，其特征在于：所述的发酵培养基包含：蔗糖5-40g/L；糖蜜5-20g/L；甘油5-10g/L；玉米淀粉5-60g/L；黄豆饼粉2-60g/L，较佳地为4-15g/L；玉米浆粉2-20g/L，较佳地为4-15g/L；胰蛋白胨4-20g/L；细豆柏2-20g/L，较佳地为4-15g/L；异亮氨酸0.5-2.0g/L；KNO3 0.1-0.3g/L；MgSO4·7H2O 0.1-0.3g/L；FeSO4·7H2O 0.1-0.3g/L；MnCl2·4H2O 0.1-0.3g/L；ZnSO4 0.1-0.3g/L；Na2S2O3 0.1-0.15g/L；CaCO3 1.0-4.0g/L；以及KI 0.1-0.3g/L；所述含量皆按所述发酵培养基的总体积计。
12.如权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于：所述发酵培养基的pH值为pH5.0-8.0，较佳地为pH5.5-7.5。
13.一种抗生素calicheamicinγ1I的发酵生产方法，其特征在于：其包括下述步骤：
(a)将棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora sp.calichensis)的种子液接种于权利要求1-12中任一项所述的发酵培养基中进行液体发酵培养，所述的发酵培养基是如上所述的任一项发酵培养基；
(b)从发酵液中分离出抗生素calicheamicinγ1I，即可。
14.如权利要求13所述的发酵生产方法，其特征在于：在步骤(a)中，所述的棘孢小单孢菌为棘孢小单孢菌NRRL-18149；所述棘孢小单孢菌的种子液为将棘孢小单孢菌在种子培养基中培养得到，所述种子培养基较佳地为Medium S培养基；种子培养的温度较佳为25-32℃；所述种子液的接种量为体积百分比10％-15％；发酵培养的温度为20-40℃，较佳地为25-32℃；发酵培养的时间为5-7天。
15.如权利要求1-12中任一项所述的发酵培养基在将棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora sp.calichensis)发酵转化成抗生素calicheamicinγ1I中的用途，所述的棘孢小单孢菌较佳地为棘孢小单孢菌NRRL-18149。
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