CN102277301B

CN102277301B - 一株绿青色拟青霉及其应用

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Publication number: CN102277301B
Application number: CN2010101993831A
Authority: CN
Inventors: 江正强; 郭洋; 闫巧娟; 徐忠义
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2010-06-10
Filing date: 2010-06-10
Publication date: 2012-11-21
Anticipated expiration: 2030-06-10
Also published as: CN102277301A

Abstract

本发明公开了一株绿青色拟青霉及其应用。该绿青色拟青霉菌株为绿青色拟青霉(Paecilomyces aerugineus)GY701其保藏编号为CGMCC NO.2733。本发明采用微生物发酵法利用单糖、淀粉生产苹果酸以及利用廉价的纤维质原料生产丙酮酸，原料来源丰富，大大降低了生产成本，有效的解决了目前工业应用化学合成法面临的化石资源短缺、生产成本高，条件要求苛刻以及对环境污染等问题。该方法较目前工业采取的化学合成法具有操作简便、条件温和、对环境无污染、成本低廉、安全性好等优点。

Description

一株绿青色拟青霉及其应用

技术领域

本发明涉及一株绿青色拟青霉及其应用。

背景技术

苹果酸(Malic acid)化学名称为2-羟基-γ-二酸。成品为白色结晶体或结晶状粉末，有较强的吸湿性和特殊愉快的酸味。苹果酸是一种重要的天然有机酸，广泛存在于水果与蔬菜中，是继柠檬酸、乳酸之后的世界第三大酸味添加剂。它在食品工业、临床医药、化学工业和饲料工业等领域中的应用很活跃且十分重要。苹果酸是一种低热量的理想食品添加剂，具有口感柔和，风味独特的特点，可用于食品的酸味剂和保鲜剂。与柠檬酸相比产生热量更低，口味更好，且不损伤口腔和牙齿。美国和欧洲软饮料使用的酸味剂中，已减少柠檬酸用量，增加苹果酸的用量，并有逐渐替代柠檬酸的势头，是目前世界食品工业中用量最大和发展前景较好的有机酸之一。

苹果酸的生产方法主要有发酵法和转化法。化学合成法生产的苹果酸在应用上受到限制。转化法主要是固定化酶和固定化细胞转化，即以富马酸为底物转化成苹果酸。20世纪80年代末以来，无论是对固定化酶还是固定化细胞转化的工艺都获得突破，并成功应用于工业化生产。专利号CN91103606.7的专利公开了一种用固定化细胞以富马酸为原料生产L-苹果酸的方法。将发酵得到的微生物细胞用多孔珍珠岩粉吸附，再用聚乙烯醇包埋，低温固化。固定化细胞的延胡索酸酶回收率90％以上，产物对底物的转化率80％以上。专利号为CN92107642.8的专利中公开了一种用酶工程技术制备苹果酸的方法。将富马酸钠通过酶促转化、转晶、酸化、浓缩、干燥等方法，得到一种质量稳定，纯度高，与天然苹果酸特性相同的苹果酸，用于食品、工业、医药化工等领域。

然而高纯度化学合成的的富马酸价格较高，生产污染大，产品中杂酸偏高。相比之下糖质原料发酵法具有原料来源丰富、产品成本低廉、杂酸质量分数低、食用安全性高等优点，微生物发酵法生产L-苹果酸受到国内外越来越多的关注。

1991年Battat等，以16L搅拌罐发酵，黄曲霉(Aspergillus)在为发酵菌种，搅拌转速350r/min、添加Fe²⁺12mg/L、氮271mg/L、磷酸盐1.5mol/L和9％的碳酸钙条件下，发酵192h，利用120g/L葡萄糖产113g/L苹果酸(Battat E，Peleg Y，BercovitzA et al.Optimization of L-malic acid production Aspergiullsflavus in a stirred fermentor[J].Biotechnology and Bioengineering，1991，27：1108～1116)。国内1994年，金其荣等分离得到利用糖质或淀粉的黄曲霉菌株AspergillusUVT3，经诱变及优化工艺条件后，在500L发酵罐中以大米为原料，通风发酵140h，连续5批的产酸量为44g/L-49.5g/L(金其荣，许赣荣，吴燕萍.直接发酵法与酶转化法生产L-苹果酸的比较[J].食品科学，1994，169(1)：25～28)。专利号为CN94105633.3的专利中公开了L-苹果酸高产突变株曲霉(Aspergillus)N1-14′及利用该菌株生产L-苹果酸的方法，该发明提供的曲霉N1-14′CCTCCM94103能够直接发酵糖质原料产生L-苹果酸，该产酸菌株在20m³罐上，发酵糖质原料100-120h，产酸75-85g/L，产酸速率0.65-0.71g/(1.h)，对糖转化率65％-68％。

目前国内外利用发酵法生产苹果酸多采用黄曲霉为发酵菌种，然而某些黄曲霉的代谢产物黄曲霉毒素毒性大致癌性强，发酵产物存在安全问题。申请号为200810018924的专利中公开了一种利用米根霉发酵产L-苹果酸的工艺，包括米根霉孢子悬浮液的制备、种子培养以及发酵生产L-苹果酸，并在发酵过程中向发酵培养基中添加Fe³⁺、Mn²⁺、Cr³⁺、Co²⁺、Al³⁺、Cr⁶⁺中的一种或几种，以改变米根霉的传统代谢途径，使其发酵主要产物为L-苹果酸。该方法可以使产物L-苹果酸从安全菌种米根霉发酵的副产物变成主产物，避免了使用致癌菌种黄曲霉发酵生产L-苹果酸的不安全性。

丙酮酸(Pyruvic acid)又名2-氧代丙酸，有乙酸气味和愉快的酸味，丙酮酸不仅在生物能量代谢中具有十分重要的作用，而且是合成多种有用化合物的前体，参与整个生物体基本代谢的中间产物，是最重要的α-氧代羧酸之一。它在制药、日用化工、农用化学品等工业和科学研究中有着广泛的用途。在制药工业中，丙酮酸可用于酶法合成多种氨基酸、系列酶蛋白抑制剂、镇静剂、辛可芬等。尤其是近年来，研究发现丙酮酸能够加速人体中脂肪酸的代谢，具有独特的减肥效果，可用做减肥保健药。

丙酮酸的工业生产仍主要采用Howard和Fraser等开发的酒石酸脱水脱羧法。该法虽然操作简单易行，但存在底物转化率低、成本高、环境污染严重等缺点。相比之下，采用酶法转化或微生物发酵生产丙酮酸(盐)是降低成本的有效方法(BesnainouB，Giani D，Sahut C.Method for producing pyruvic acid by fermentation.US patent4918013，1990)，其最主要的优点是成本低廉、产品质量高、对环境友好等。通常有三种利用生物技术生产丙酮酸的方法(Li Y，Chen J，Lun S Y.Biotechnological productionofpyruvic acid[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2001，57：451～459)，即：直接发酵法，休止细胞法和酶转化法。当然直接发酵法不但能够大大降低生产成本而且产品的光学纯度很高。然而，由于丙酮酸是细胞代谢的中间产物，一般很难获得能够大量积累丙酮酸的菌株，因此研究学者也一直在筛选和鉴定高产量丙酮酸的菌株。

能够以糖质原料发酵生产丙酮酸的微生物包括细菌、放线菌和酵母。在酵母中研究的菌株有假丝酵母(Candida)、球拟酵母(Torulopsis)、德巴利酵母(Debaryomyces)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。T.glabrata是研究的最多、也是目前工业化生产上所用的菌株。在一般条件下，T.glabrata对葡萄糖的丙酮酸产率比较低为0.41g/g，菌株诱变后丙酮酸产率能提高到0.54g/g(Yonehara T，Yomoto K.Microbialproduction of pyruvic acid and its enhancement by thiamine.JP patent，62201589，1987)。1994年，Yokota等选育出硫辛酸营养缺陷性的菌株E.coli W1485lip2，这株菌培养32h，丙酮酸产率达0.51g/g，而以该菌株为出发菌株构建的F1-ATP酶活性的E.coli TBLA-1培养24h，丙酮酸产率达0.6g/g(Yokota A，Shimizu H，Terasawa Y. Pyruvic acidproduction by a lipoic acid auxotroph of Escherichia coli W1485[J].Applied Microbiologyand Biotechnology，1994，41：638～643)。日本在1992年已经实现了发酵法生产丙酮酸的工业化，目前的发酵罐规模已经放大到50m³。

在我国，虽然生物合成丙酮酸的技术研究起步比较晚，但发展非常迅速，其中采用微生物发酵法生产丙酮酸的技术正在积极实施工业化生产。申请号为02113142的专利公开了一种乙酸渗漏型丙酮酸高产菌及其选育方法和用该菌发酵法生产丙酮酸。该发明的菌种以一种光滑球拟酵母(Torlopsis glabrata)WSH-LQ307为出发菌株，经亚硝基胍(NTG)诱变，在培养基中添加以乙酸为补充碳源选育而得到。LQ307生产丙酮酸的能力强且稳定，以乙酸为补充碳源时，摇瓶培养48小时，丙酮酸产量为46.2g/L。5L发酵罐发酵64h，丙酮酸的产量达到了68.7g/L，对葡萄糖的转化率为0.651g/g。300L发酵罐发酵65h，丙酮酸产量为63.8g/L，对葡萄糖的转化率为0.588g/g。

尽管现已对丙酮酸生产菌的选育改良、发酵过程的优化控制进行了广泛的研究，今后还应在丙酮酸生产菌产酸能力和稳定性方面、对高浓度丙酮酸耐受性方面以及廉价底物(如糖蜜、淀粉、纤维材料)等的利用能力方面有所提高。

发明内容

本发明的一个目的是提供一株绿青色拟青霉。

本发明所提供的绿青色拟青霉是绿青色拟青霉(Paecilomyces aerugineus)GY701其保藏编号为CGMCC NO.2733。

本发明的另一个目的是提供一种制备苹果酸的方法。

本发明所提供的制备苹果酸的方法是发酵绿青色拟青霉(Paecilomyces aerugineus)GY701CGMCC NO.2733，得到苹果酸。

上述制备苹果酸的方法中，所述发酵中使用的培养基为如下1)或2)或3)所示：

1)由碳源、氮源、无机盐和水组成；

2)由碳源、氮源、无机盐、氨基酸和水组成；

3)由碳源、氮源、无机盐、维生素和水组成；

所述碳源为如下中的至少一种：葡萄糖、木糖、淀粉、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、甘露糖和果糖；

所述氮源为如下中的至少一种：硫酸铵和豆粕粉的混合物、硫酸铵和酵母膏的混合物、尿素、硫酸铵、氯化铵、蛋白胨、豆粕粉、酵母膏和玉米浆；

所述无机盐为如下中的至少一种：磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锌和碳酸钙；

所述氨基酸为如下中的至少一种：精氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、胱氨酸、色氨酸、羟脯氨酸、酪氨酸、精氨酸单盐酸、缬氨酸、白氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、天门冬氨酸和苏氨酸；

所述维生素为如下中的至少一种：叶酸、核黄素、维生素B5、抗坏血酸、烟酸和维生素B6；

所述1)或2)或3)所示培养基中，所述碳源在所述培养基中的浓度为40g/L-120g/L或60g/L-80g/L，具体为60g/L或80g/L；

所述1)或2)或3)所示培养基中，所述氮源在所述培养基中的浓度为0.5g/L-3.0g/L，优选为2.0g/L；

所述2)所示培养基中，所述氨基酸在所述培养基中的浓度为0.1g/L-1.5g/L，具体为0.1g/L、0.3g/L、0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L；

所述1)或2)或3)所示培养基中，所述KH₂PO₄在培养基中的浓度为0.1g/L-1.0g/L，具体为0.3g/L；所述MgSO₄·7H₂O在培养基中的浓度为0.1g/L-1.0g/L，具体为0.25g/L；所述ZnSO₄·7H₂O在培养基中的浓度为0.01g/L-0.1g/L，具体为0.08g/L；所述CaCO₃在培养基中的浓度为65g/L-75g/L，具体为70g/L。

上述制备苹果酸的方法中，所述1)所示培养基为如下Ⅰ或Ⅱ所示：

Ⅰ、所述碳源为如下中的至少一种：葡萄糖、木糖、淀粉、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、甘露糖和果糖；所述氮源为氯化铵；所述无机盐为KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、ZnSO₄·7H₂O和CaCO₃：

Ⅱ、所述碳源为蔗糖；所述氮源为如下中的至少一种：硫酸铵和豆粕粉的混合物、硫酸铵和酵母膏的混合物、尿素、硫酸铵、氯化铵、蛋白胨、豆粕粉、酵母膏和玉米浆；所述无机盐为KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、ZnSO₄·7H₂O和CaCO₃；

所述2)所示培养基中，所述碳源为蔗糖；所述氮源为硫酸铵；所述氨基酸为组氨酸；所述无机盐为KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、ZnSO₄·7H₂O和CaCO₃。

上述制备苹果酸的方法中，所述1)或2)或3)所示培养基的pH值为5.0-6.0，具体为5.5。

上述制备丙酮酸的方法中，所述发酵的条件为：温度为30℃-40℃，以150rpm-200rpm的转速震荡，时间为72小时-160小时；所述温度具体为35℃，所述时间具体为120小时，所述震荡转速具体为180rpm；旋转半径为12mm。

本发明的最后一个目的是提供一种制备丙酮酸的方法。

本发明所提供的制备丙酮酸的方法，是发酵绿青色拟青霉(Paecilomycesaerugineus)GY701CGMCC NO.2733，得到丙酮酸。

上述制备丙酮酸的方法中，所述发酵中使用的培养基为如下1)或2)所示：

1)由碳源、氮源、无机盐和水组成；

2)由氨基酸或其盐、碳源、氮源、无机盐和水组成；

所述碳源为如下中的至少一种：麦秆、玉米皮、甘蔗渣、玉米芯、花生壳、稻壳、玉米苞皮、高粱秆、稻草和甜菜渣；

所述氮源为蛋白胨和/或酵母膏；

所述无机盐为如下中的至少一种：硫酸镁、氯化钙和硫酸亚铁；

所述氨基酸为如下中的至少一种：精氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、胱氨酸、色氨酸、羟脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、白氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、天门冬氨酸；

所述氨基酸为如下中的至少一种：精氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、胱氨酸、色氨酸、羟脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、白氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、精氨酸单盐酸、天门冬氨酸；

所述1)或2)所示培养基中，所述碳源在所述培养基中的浓度为20g/L-40g/L，具体为30g/L；

所述1)或2)所示培养基中，所述氮源为蛋白胨和酵母膏；所述蛋白胨在所述培养基中的浓度为5g/L-20.0g/L，具体为10.0g/L；所述酵母膏在所述培养基中的浓度为5g/L-20g/L，具体为10.0g/L；

所述2)所示培养基中，所述氨基酸或其盐在所述培养基中的浓度为1g/L-3g/L，具体为1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L、3g/L；

所述1)或2)所示培养基中，所述FeSO₄在培养基中的浓度为0.1g/L-1.0g/L，具体为0.3g/L；所述MgSO₄·7H₂O在培养基中的浓度为0.1g/L-1.0g/L，具体为0.3g/L；所述CaCl₂在培养基中的浓度为0.1g/L-1.0g/L，具体为0.3g/L。

上述制备丙酮酸的方法中，所述1)或2)所示培养基中，所述碳源的粒径为10目-80目，具体为10-20目、20-40目、40-60目、60-80目和80目以下。

上述制备丙酮酸的方法中，所述1)所示培养基为如下Ⅰ或Ⅱ所示：

Ⅰ、所述碳源选自麦秆、玉米皮、甘蔗渣、玉米芯、花生壳、稻壳、玉米苞皮、高粱秆、稻草和甜菜渣；所述氮源为蛋白胨和酵母膏；所述碳源的粒径为40-60目；

Ⅱ、所述碳源为玉米芯；所述氮源为蛋白胨和酵母膏；所述玉米芯的粒径大小为10目-80目，具体为10-20目、20-40目、40-60目、60-80目和80目以下；

所述2)所示培养基中，所述碳源为玉米芯；所述氮源为蛋白胨和酵母膏；所述氨基酸盐为精氨酸单盐酸；所述玉米芯的粒径为10目-20目。

现有技术中能够大量积累丙酮酸的菌种不多，目前研究最多的菌种是球拟酵母，尚未有绿青色拟青霉利用纤维质材料发酵产丙酮酸的研究。大多发酵法生产苹果酸以黄曲霉居多，也有研究发现米曲霉、米根霉发酵产苹果酸，尚未有绿青色拟青霉能利用糖质发酵产苹果酸的研究。

本发明以绿青色拟青霉(Paecilomyces aerugineus)GY701进行发酵，可分别利用多种糖质原料摇瓶发酵产苹果酸及利用纤维质材料发酵产丙酮酸，产物纯度高，副产物少，易于分离。本发明采用微生物发酵法利用单糖、淀粉生产苹果酸以及利用廉价的纤维质原料生产丙酮酸，原料来源丰富，大大降低了生产成本，有效的解决了目前工业应用化学合成法面临的化石资源短缺、生产成本高，条件要求苛刻以及对环境污染严重等问题。该方法较目前工业采取的化学合成法具有操作简便、条件温和、对环境无污染、成本低廉、安全性好等优点。

附图说明

图1为菌株GY701利用不同碳源产丙酮酸情况

图2为玉米芯不同目数对菌株GY701发酵产丙酮酸的影响

图3为精氨酸单盐酸浓度对菌株GY701发酵产丙酮酸的影响

图4为GY70118S rDNA基因序列系统发育树

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、菌的分离与鉴定

一、菌的分离

本发明所提供的绿青色拟青霉(Paecilomyces aerugineus)GY701是从云南丽江土样中筛选得到的。

取约1g土样溶于1mL水中，混匀后取100μL混合液于单菌落分离培养基上，用涂布棒涂抹均匀，30℃恒温培养箱中培养约3d后观察。根据变色圈与菌落直径之比(即HC值)，初步比较出各菌株产酸能力的相对高低。

单菌落分离培养基：PDA培养基中添加0.1g/L脱氧胆酸钠和0.1g/L溴甲酚绿。

二、菌的鉴定

形态特征：菌株GY701菌丝体生长初期为白色，短小而致密。菌体在生长过程产大量的孢子，孢子极易脱落，2d后中部菌丝逐渐变为淡绿色粉状物，经镜检全为孢子，无菌丝，成熟孢子呈墨绿色。菌体生长约5d后孢子层面出现凹陷，且凹陷处有小水珠。GY701的孢子在40x电镜下的孢子形态为串珠状椭球形，可以明显看到它的分支状的产孢结构，呈现出典型的拟青霉产孢结构的特点。

菌株GY701的18S rDNA全长序列为SEQ ID NO：1所示。该菌株的18S rDNA与其它菌株的18S rDNA一起构建的系统进化树如图4所示。

综合以上鉴定结果，菌株GY701为绿青色拟青霉(Paecilomyces aerugineus)。

该菌株绿青色拟青霉(Paecilomyces aerugineus)GY701已于2008年11月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC NO.2733。

实施例2、制备苹果酸

一、利用不同碳源发酵产苹果酸

1、菌种活化：

将绿青色拟青霉(Paecilomyces aerugineus)GY701接于PDA培养基上，在30℃培养箱中培养6天；

2、发酵：

从平板培养基中切下约1cm²的菌落块接入发酵培养基中，置于温度35℃，转速180rpm的摇床(旋转半径为12mm)，培养120小时，得到发酵液；将容器内的所有物质记作发酵液；

将所得发酵液用等体积1mol/L的硫酸水溶液沉淀其中的钙离子，12000rpm离心10min，取上清，稀释，即为检测样品。

发酵培养基Ⅰ按照如下方法配制：将60g碳源、2.0g氯化铵、0.3g KH₂PO₄、0.25g MgSO₄·7H₂O和0.08g ZnSO₄·7H₂O溶于水中，用水补足体积至1升。70g CaCO₃单独灭菌，接种时加入培养基中用于调节产酸过程中的pH，同时它也参与产酸过程的代谢循环。发酵培养基的初始pH值为5.5。

碳源分别为：葡萄糖、木糖、淀粉、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、甘露糖、果糖。

发酵液中苹果酸的含量检测：采用高效液相色谱法。具体的检测条件：色谱柱为迪马公司的C18反相柱，250×4.6(5μm)，流动相采用0.005mol/L的H₂SO₄水溶液，流速0.8ml/min，检测波长210nm，进样量20μl，柱温为室温，流动相使用前通过了0.45μm孔径的合成纤维素酯膜进行抽滤。苹果酸标准品购自Sigma公司，产品目录号为112577。在如上色谱条件下，苹果酸标准品的保留时间为7.6min，检测样品中苹果酸的保留时间为7.6min。

发酵液中残糖的检测方法采用高效液相色谱法。具体的检测条件即色谱柱为Waters的D-氨基柱，250×4.6(5μm)，流动相采用乙腈与水的混合溶液(75∶25)(w/w)，流速1ml/min，进样量20μl，柱温为40℃，流动相使用前经过超声波排除气泡。

转化率的计算公式：有机酸产量(g/L)与消耗的糖量(g/L)(初始糖量减去发酵后残糖量)之比。

实验设3次重复，结果如表1所示。绿青色拟青霉能够利用多种糖质和淀粉类原料产苹果酸。从产酸量和转化率来看，绿青色拟青霉GY701几乎不利用半乳糖产酸。并且其利用淀粉和甘露糖产酸能力也较弱，苹果酸产量不超过10g/L。蔗糖和木糖较其他种类的糖产酸量和转化率均较高，检测发酵液中的苹果酸浓度为20-30g/L。

表1绿青色拟青霉GY701利用不同碳源产苹果酸情况(g/L发酵液)

二、改变氮源种类后利用蔗糖发酵产苹果酸

1、菌种活化：方法与本实施例实验一种所述方法一致。

2、发酵：

发酵培养基按照如下方法配制：将80g蔗糖、2.0g氮源、0.3g KH₂PO₄、0.25gMgSO₄·7H₂O和0.08g ZnSO₄·7H₂O溶于水中，用水补足体积至1升，70g CaCO₃单独灭菌，接种时加入培养基中用于调节产酸过程中的Ph，发酵培养基的初始pH值为5.5。

氮源分别为：尿素、硫酸铵、氯化铵、蛋白胨、豆粕粉、酵母膏、玉米浆、硫酸铵+豆粕粉(质量比同单一氮源时，即硫酸铵2.0g，豆粕粉2.0g)、硫酸铵+酵母膏(质量比同单一碳源时，即硫酸铵2.0g，酵母膏2.0g)。

蛋白胨购自OXOID，产品目录号为LP0042；豆粕粉购自朝阳大地农产品加工有限公司，酵母膏购自OXOID，产品目录号位LP0021；玉米浆购自山东邹平鹤伴山生物科技有限公司。

按照本实施例实验一中所述方法检测苹果酸的量和残糖含量。

实验设3次重复，结果取平均值±标准差。结果如表2所示，改变氮源种类，尝试添加了7种单一氮源尿素、氯化铵、硫酸铵、豆饼粉、蛋白胨、酵母膏、玉米浆和2种复合氮源。氮源的复合对于菌株产酸反而产生了抑制作用。单一氮源中以硫酸铵替代原来的氯化铵作为氮源时，产量提高到25-35g/L，硫酸铵较氯化铵更适合作为菌种拟青霉GY701产酸的氮源。

表2绿青色拟青霉GY701利用不同氮源产苹果酸情况(g/L发酵液)

三、添加组氨酸后利用蔗糖发酵产苹果酸

1、菌种活化：方法与本实施例实验一中所述方法所述一致。

2、发酵：

从平板培养基中切下约1cm²的菌落块接入发酵培养基中，置于温度35℃，转速180rpm的摇床，培养120小时，得到发酵液；将容器内的所有物质记作发酵液；

发酵培养基按照如下方法配制：将80g蔗糖、2.0g硫酸铵、0.3g KH₂PO₄、0.25gMgSO₄·7H₂O和0.08g ZnSO₄·7H₂O和不同质量的组氨酸溶于水中，用水补足体积至1升，70g CaCO₃单独灭菌，接种时加入培养基中用于调节产酸过程中的pH。发酵培养基的初始pH值为5.5。

添加的组氨酸的量分别为：0.1g、0.3g、0.5g、1.0g、1.5g。

实验设3次重复，结果取平均值±标准差。结果如表3所示，氨基酸和维生素在微生物的代谢循环中会起到激活或是抑制相关代谢酶活性的作用。组氨酸的添加对绿青色拟青霉发酵蔗糖产苹果酸有较大的促进作用，调节添加组氨酸的浓度，使其添加范围为0.1-1.5g/L，由表3可以看出当组氨酸的添加量为0.5g/L时，菌株产酸量达35-45g/L，转化率达到30-50％。

表3、不同组氨酸浓度对绿青色拟青霉GY701产苹果酸的影响(g/L发酵液)

实施例3、制备丙酮酸

一、利用不同纤维质材料发酵产丙酮酸

1、菌株活化

2、发酵：

将所得发酵液12000rpm离心10min，取上清，稀释，即为检测样品。

发酵培养基按照如下方法配制：将30g碳源、10.0g蛋白胨、10.0g酵母膏、0.3gFeSO₄、0.3g MgSO₄·7H₂O和0.3g CaCl₂溶于水中，用水补足体积至1升。

碳源分别为：麦秆、玉米皮、甘蔗渣、玉米芯、花生壳、稻壳、玉米苞皮、高粱秆、稻草、甜菜渣；均为40-60目。

麦秆购自河南新乡；玉米皮购自山东龙力生物科技有限公司；甘蔗渣购自广西龙州南华；玉米芯购自山东龙力生物科技有限公司；高粱秆购自辽宁盘锦；稻草购自辽宁盘锦；甜菜渣购自黑龙江肇源。

3、丙酮酸的检测方法：采用高效液相色谱法。具体的检测条件即色谱柱为迪马公司的C18反相柱，250×4.6(5μm)，流动相采用0.005mol/L的H2SO4水溶液，流速0.8ml/min，检测波长210nm，进样量20μl，柱温为室温，流动相使用前通过了0.45μm孔径的合成纤维素酯膜进行抽滤。丙酮酸标准品购自国药集团化学试剂有限公司，产品目录号为30161435。在如上色谱条件下，丙酮酸标准品的保留时间为6.7min，检测样品中丙酮酸的保留时间为6.7min。

实验设3次重复，结果取平均值±标准差。结果如图1所示，在不同的培养基条件下，菌株GY701直接以纤维质材料为碳源发酵产丙酮酸。选取了40-60目的各种不同的纤维质材料为碳源，以绿青色拟青霉GY701为发酵菌株在上述发酵条件下发酵约5d，以玉米芯为碳源较其他纤维质材料产丙酮酸产量为最高，为125±1.76g/kg玉米芯。

玉米芯产酸量为125±1.76g/kg玉米芯；花生壳产酸量为10±1.53g/kg花生壳；玉米皮产酸量为87±1.06g/kg玉米皮；高粱杆产酸量为27±1.23g/kg高粱杆；稻草产酸量为29±2.16g/kg稻草；麦秆产酸量为97±0.8g/kg麦秆；甜菜渣产酸量为82±1.5g/kg甜菜渣；蔗渣产酸量为46±0.8g/kg蔗渣。

二、改变玉米芯目数后利用玉米芯发酵产丙酮酸

1、菌株活化：将绿青色拟青霉(Paecilomyces aerugineus)GY701接于PDA培养基上，在30℃培养箱中培养6天；

2、发酵：

发酵培养基按照如下方法配制：将30g玉米芯、10.0g蛋白胨、10.0g酵母膏、0.3g FeSO₄、0.3g MgSO₄·7H₂O和0.3g CaCl₂溶于水中，用水补足体积至1升。

根据玉米芯的粒径不同划分为不同的培养基，分别进行实验；玉米芯的粒径分别是如下：10-20目、20-40目、40-60目、60-80目、80目以下。

按照本实施例实验一中所述方法检测丙酮酸含量。

实验设3次重复，结果取平均值±标准差。结果如图2所示，玉米芯不同的目数对发酵产酸有很大的影响，目数决定纤维质材料接触的比表面积，从而影响菌株的发酵特性。选取不同的玉米芯目数10-80目，考察玉米芯目数对产丙酮酸的影响，当玉米芯目数在10-20目间的时候，产酸量有明显提高，产量约220-250g/kg玉米芯。绿青色拟青霉GY701偏于利用较大粒度的纤维质材料发酵产丙酮酸。

10-20目：产量约233±2.23g/kg玉米芯；20-40目：产量为229±3.67g/kg玉米芯；

40-60目：产量为125±1.76g/kg玉米芯；60-80目：产量为112±2.73g/kg玉米芯；

80目下：产量为81±2.16g/kg玉米芯；

三、添加精氨酸单盐酸后利用蔗糖发酵产丙酮酸

1、菌株活化：方法与本实施例实验一中所述一致。

2、发酵：

发酵培养基按照如下方法配制：将30g玉米芯(10-20目)、10.0g蛋白胨、10.0g酵母膏、0.3g FeSO₄、0.3g MgSO₄·7H₂O、0.3g CaCl₂和不同质量的精氨酸单盐酸(又称盐酸精氨酸)溶于水中，用水补足体积至1升。

精氨酸单盐酸的添加量分别为：1g、1.5g、2g、2.5g、3g。

按照本实施例实验一中所述方法检测丙酮酸的量。

实验设3次重复，结果取平均值±标准差。结果如图3所示，由于氨基酸和维生素在微生物的代谢循环中会起到激活或是抑制相关代谢酶活性的作用，添加微量的氨基酸到培养基中，会对微生物产酸有一定的影响作用。精氨酸单盐酸的添加对促进绿青色拟青霉GY701产酸影响较大，调整精氨酸单盐酸的浓度，在添加范围为1-3g/L下研究其对产丙酮酸产酸的影响。丙酮酸产量在添加2.5g/L精氨酸单盐酸后可提高到250-300g/kg玉米芯。

添加1g/L精氨酸单盐酸：产量271±2.4g/kg玉米芯；添加1.5g/L精氨酸单盐酸：产量为276±2.8g/kg玉米芯；添加2g/L精氨酸单盐酸：产量为283±1.6g/kg玉米芯；添加2.5g/L精氨酸单盐酸：产量为289±2.6g/kg玉米芯；添加3g/L精氨酸单盐酸：产量为255±1.8g/kg玉米芯。

序列表

<110>中国农业大学

<120>一株绿青色拟青霉及其应用

<160>1

<210>1

<211>1720

<212>DNA

<213>绿青色拟青霉(Paecilomyces aerugineus)

<400>1

ttccctctat agcctagttt gccatagttc tctgcaggaa atgactgttg ccagtcaaat 60

cctactgatc ccatatgctc actataacca ttcaatcggt agtagcgacg ggcggtgtgt 120

acaaagggca gggacgtaat caacgcaagc tgatgacttg cgcttactag gaattcctcg 180

ttgaagagca ataattacaa tgctctatcc ccagcacgat gaagtttcaa aagtttaccc 240

agaccttccg gccaaggtta taaactcgct gacttcatca gtgtagcgcg cgtgcggccc 300

agaacatcta agggcatcac agacctgtta ttgcctaaaa cttccttcgg cttgaagccg 360

atagtctctc taagaagcca gttaaatatt aaatataaac caacccgaaa gagttagcct 420

gtctaattag cagaataagg tctcgttcgt tatcggaatt aaccagacaa atcactccac 480

gaactaagaa cggccatgca ccaccaccca tagaatctag aaagagcttt caatctgtca 540

atccttacta tgtctggacc tggtgagttt ccccgtgttg agtcaaatta agccgcaggc 600

tccactcctg gtggtgccct tccgtcaatt cctttaagtt tcagccttgc gtcccatact 660

ccccccagaa cccaaaaact ttactttcgc taagatgctg agcgagtcat aataaacacg 720

cccaatctct agtcggcata gtttgtggtt aagactacga cggtatctaa tcgtcttcga 780

tcccttaact ttagaccttg atcaatgaaa acgtcccggg tcaaatgctt tcgcagtagt 840

ttgtcttcgg tcaatccaag aatttcacct ctagcgacca aatacaaatg cccctaaccg 900

tttctattca tcattactga agtacctaaa ccaacgaaaa taggactaaa gtcatatttc 960

attattccat gctaacacat tcaagcttaa aagcctgctt taaacactct gatttgctca 1020

tggtaattgt ccagaaaacc ctagccacga ggactaggag tcaatggacg tggagtctcc 1080

ggcagcaatg agcttggtca atgaagacca ggccactacg ccggtaagac taaagtttga 1140

ctacggacgt tttaactgca acaactttaa tatacgctat tggagctgga attaccgcgg 1200

ctgctggcac cagacttgcc ctccaattga tcctcgttaa gggatttaaa ttgtactcat 1260

tccaattgca agaccttaaa ggccctgcat tgttatgtat tgtcactacc tccccgtgtc 1320

gggattgggt aatttgcgcg cctgctgcct tccttggatg tggtagccgt ttctcaggct 1380

ccctctccgg aatcgaaccc taattccccg ttacccgttg taggcattgt aagcctctat 1440

cttacaatct caaccatgat agggcagaaa atcgagtgga ccgtcgccgg cacaaggcca 1500

tgcgatccgc ttaattatta tgattcacca agaaacaggt tttaccccgc gttggtttta 1560

tctaataagt gcaccccttc gtaagtcagg gcttttttgc atgtattagc tctagaatta 1620

ccacggttat ccaagtagta aagaatttaa cacgtagatc ataactgatt taatgagcca 1680

ttcgcagttt cacaatataa agtattaact agaagcgcca 1720

Claims

1.绿青色拟青霉(Paecilomyces aerugineus)GY701其保藏编号为CGMCC NO.2733。

2.一种制备苹果酸的方法，是发酵绿青色拟青霉(Paecilomyces aerugineus)GY701CGMCC NO.2733，得到苹果酸；所述发酵中使用的培养基为如下1)或2)或3)所示：

1)由碳源、氮源、无机盐和水组成；

2)由碳源、氮源、无机盐、氨基酸和水组成；

3)由碳源、氮源、无机盐、维生素和水组成；

所述1)或2)或3)所示培养基中，所述碳源在所述培养基中的浓度为40g/L-120g/L；

所述1)或2)或3)所示培养基中，所述氮源在所述培养基中的浓度为0.5g/L-3.0g/L；

所述2)所示培养基中，所述氨基酸在所述培养基中的浓度为0.1g/L-1.5g/L；

所述1)或2)或3)所示培养基中，所述KH₂P0₄在培养基中的浓度为0.1g/L-1.0g/L；所述MgSO₄·7H₂O在培养基中的浓度为0.1g/L-1.0g/L，；所述ZnSO₄·7H₂O在培养基中的浓度为0.01g/L-0.1g/L；所述CaCO₃在培养基中的浓度为65g/L-75g/L；

所述发酵的条件为：温度为30℃-40℃，以150rpm-200rpm的转速震荡，时间为72小时-160小时。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述1)或2)或3)所示培养基中，所述碳源在所述培养基中的浓度为60g/L-80g/L；

所述1)或2)或3)所示培养基中，所述氮源在所述培养基中的浓度为2.0g/L；

所述2)所示培养基中，所述氨基酸在所述培养基中的浓度为为0.1g/L、0.3g/L、0.5g/L、1.0g/L或1.5g/L；

所述1)或2)或3)所示培养基中，所述KH₂PO₄在培养基中的浓度为为0.3g/L；所述MgSO₄·7H₂O在培养基中的浓度为为0.25g/L；所述ZnSO₄·7H₂O在培养基中的浓度为0.08g/L；所述CaCO₃在培养基中的浓度为70g/L。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述1)或2)或3)所示培养基中，所述碳源在所述培养基中的浓度为60g/L或80g/L。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述1)所示培养基为如下I或II所示：

I、所述碳源为如下中的至少一种：葡萄糖、木糖、淀粉、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、甘露糖和果糖；所述氮源为氯化铵；所述无机盐为KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、ZnSO₄·7H₂O和CaCO₃；

II、所述碳源为蔗糖；所述氮源为如下中的至少一种：硫酸铵和豆粕粉的混合物、硫酸铵和酵母膏的混合物、尿素、硫酸铵、氯化铵、蛋白胨、豆粕粉、酵母膏和玉米浆；所述无机盐为KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、ZnSO₄·7H₂O和CaCO₃；

6.根据权利要求2-5中任一所述的方法，其特征在于：所述1)或2)或3)所示培养基的pH值为5.0-6.0；所述发酵的条件为：温度为35℃，时间为120小时，震荡转速为180rpm；旋转半径为12mm。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：，所述1)或2)或3)所示培养基的pH值为5.5。

8.一种制备丙酮酸的方法，是发酵绿青色拟青霉(Paecilomyces aerugineus)GY701CGMCC NO.2733，得到丙酮酸；所述发酵中使用的培养基为如下1)或2)所示：

1)由碳源、氮源、无机盐和水组成；

2)由氨基酸或其盐、碳源、氮源、无机盐和水组成；

所述氮源为蛋白胨和/或酵母膏；

所述1)或2)所示培养基中，所述碳源在所述培养基中的浓度为20g/L-40g/L；

所述1)或2)所示培养基中；所述蛋白胨在所述培养基中的浓度为5g/L-20.0g/L，；所述酵母膏在所述培养基中的浓度为5g/L-20g/L；

所述2)所示培养基中，所述氨基酸或其盐在所述培养基中的浓度为1g/L-3g/L，；

所述1)或2)所示培养基中，所述FeSO₄在培养基中的浓度为0.1g/L-1.0g/L，；所述MgSO₄·7H₂O在培养基中的浓度为0.1g/L-1.0g/L；所述CaCl₂在培养基中的浓度为0.1g/L-1.0g/L；

所述发酵的条件为：温度为30℃-40℃，以150rpm-200rpm的转速震荡，时间为72小时-160小时；

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述1)或2)所示培养基中，所述碳源在所述培养基中的浓度为30g/L；

所述1)或2)所示培养基中；所述蛋白胨在所述培养基中的浓度为10.0g/L；所述酵母膏在所述培养基中的浓度为10.0g/L；

所述2)所示培养基中，所述氨基酸或其盐在所述培养基中的浓度为1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L或3g/L；

所述1)或2)所示培养基中，所述FeSO₄在培养基中的浓度为0.3g/L；所述MgSO₄·7H₂O在培养基中的浓度为0.3g/L；所述CaCl₂在培养基中的浓度为0.3g/L。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述1)或2)所示培养基中，所述碳源的粒径为10目以下。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述1)或2)所示培养基中，所述碳源的粒径为10-20目、20-40目、40-60目、60-80目或80目以下。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述1)所示培养基为如下I或II所示：

I、所述碳源选自麦秆、玉米皮、甘蔗渣、玉米芯、花生壳、稻壳、玉米苞皮、高粱秆、稻草和甜菜渣；所述氮源为蛋白胨和酵母膏；所述碳源的粒径为40-60目；

II、所述碳源为玉米芯；所述氮源为蛋白胨和酵母膏；所述玉米芯的粒径大小为10目以下，具体为10-20目、20-40目、40-60目、60-80目和80目以下；

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述II中，所述玉米芯的粒径大小为10-20目、20-40目、40-60目、60-80目或80目以下。

14.根据权利要求8-13中任一所述的方法，其特征在于：所述发酵的条件为：温度为35℃，时间为120小时，震荡转速具体为180rpm；旋转半径为12mm。