CN1923825B - 抗生素卡莫霉素A(Chemomycin A)及其制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新的卡莫霉素A(Chemomycin A)及其制备方法、以卡莫霉素A为活性成分的药物组合物以及卡莫霉素A在制备抗肿瘤药物中的应用,所说卡莫霉素A是由诺卡氏菌地中海康乐变株1747-64(Nocardia Mediterranei Var.Kanglensis 1747-64)培养物中分离得到的一种新角蒽环类抗生素(Angucycline),体外活性实验结果表明,卡莫霉素A对YES-2人食道癌细胞和HCT116结肠癌细胞有较好的抗肿瘤活性,作为一种新的抗肿瘤药物,具有良好的开发前景。
Description
技术领域:
本发明涉及一种新的角蒽环类抗生素(Angucycline)卡莫霉素A及其制备方法、以卡莫霉素A为活性成分的药物组合物以及卡莫霉素A在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术:
迄今发现来源于微生物的抗生素已近万种,其中许多作为医药,农药已得到广泛应用。Angucycline是一类来源于微生物的次级代谢产物,20世纪60年代发现第一个此类抗生素。这是一类全新的四环结构化合物,其结构与蒽环类抗生素相似,具有蒽醌四环结构,所不同的是,四环中的A环以角的形式骈在其它三环上,组成一种不对称的四环结构。大部分Angucycline抗生素都具有不同程度的细胞毒活性,对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的活性较弱,个别此类抗生素还具有酶抑制活性,抗病毒活性,受体拮抗活性和免疫抑制活性[杨建新.国外药学抗生素分册9(2):98-109,1988]。由于这类抗生素具有广谱的生物学活性,它引起了世界上许多研究者的关注,并对这类抗生素进行了深入的研究。到目前为止,已经发现的Angucycline类抗生素有一百多个,但在Angucycline的B环6a和12a位含有环氧结构的只有少数几个抗生素[Rohr J,Nat ProdRep.9(2):103-137,1992;Sasaki T,J.Antibiotics 41(7):843-848,1988;Puder CJ,Antibiotics.53(4):329-336,2000;Tsukuda E,J.Antibiotics 49(4):333-339,1996]。
随着新抗生素大规模筛选研究不断向纵深发展,微生物发酵液中含量高、易分离的主组分抗生素大多已被分离出来,发现新抗生素的难度越来越大了。基于新来源新菌种产生新抗生素的机率大的观点,如今人们已将注意力集中在放线菌中稀有放线菌的研究上,把它作为开辟新抗生素筛选的重要途径之一。
本发明人在从稀有放线菌筛选抗肿瘤抗生素的过程中,分离得到具有抗肿瘤活性的Angucycline类抗生素-卡莫霉素A(Chemomycin A),经光谱及质谱数据分析,确定卡莫霉素A(ChemomycinA)是一个全新结构的抗生素。该结构式与迄今已知结构的所有Angucycline类抗生素不同,目前尚未见到与卡莫霉素A具有相同结构的相关报道。迄今为止,已经发现的Angucycline类抗生素中,也未见到有Angucycline类抗生素成为抗肿瘤药物上市的。因此,卡莫霉素A(ChemomycinA)作为一个新结构抗肿瘤抗生素具有良好的研发应用前景。
本发明目的之一是,提供如式(1)所示结构的卡莫霉素A(ChemomycinA);
本发明目的之二是,提供卡莫霉素A的制备方法;
本发明目的之三是,提供以卡莫霉素A为活性成分的药物组合物;
本发明目的之四是,提供卡莫霉素A及其组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
发明内容:
本发明提供了如式(1)所示结构的卡莫霉素A,
通过一系列光谱学分析,确定了卡莫霉素A的结构。
本发明所说的卡莫霉素A是一种白色粉末状物质,分子式为C19H20O9,其特征为一种具有蒽醌环的四环结构,其中B环的C-6a和C-12a上有环氧结构;易溶于甲醇,氯仿,二甲亚砜等溶剂;具有旋光活性,其在氯仿中的比旋光度为+22.4°;当氯仿∶甲醇=19∶1时,卡莫霉素A在硅胶板上的Rf=0.24(表1)。
本发明所说卡莫霉素A是在从稀有放线菌筛选抗肿瘤抗生素的过程中,由诺卡氏菌地中海康乐变株1747-64(Nocardia mediterranei var.kanglensis 1747-64)培养物中分离得到的。所说产生菌已于2005年12月8日送交位于北京的“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”进行保藏,其保藏编号为:CGMCC No.1554。
为了获得卡莫霉素A及其抗肿瘤活性,本发明采取了以下技术路线与步骤:
1、卡莫霉素A的发酵及培养:首先是将生长于斜面的诺卡氏菌地中海康乐变株1747-64菌接种于种子培养基,在旋转摇床上培养,然后转入发酵培养基在往复振荡摇床上培养,收获发酵液;
2、卡莫霉素A的提取,分离:发酵培养物中,加入弱酸(如2N的盐酸等),抽滤除去菌丝,得到上清液,再用非极性有机溶剂(如乙酸乙酯)萃取,减压浓缩得到浸膏。浸膏先经过硅胶柱层析,然后采用Sephadex LH-20对含有目标化合物的组分实施进一步分离,洗脱溶剂为甲醇。然后用制备型HPLC进行制备,冷冻干燥,最后得到白色粉末目标化合物卡莫霉素A;
3、卡莫霉素A的结构鉴定:根据UV、IR、HR-MS、1H-NMR、13C-NMR、DEPT数据测试和1H-1H相关谱(1H-1H COSY)、1H-13C相关谱(HSQC)以及反向检测远程1H-13C异核多键相关谱(HMBC)的分析,确定了卡莫霉素A的结构;
4、卡莫霉素A的生物活性:采用MTT法进行了体外抗肿瘤活性试验,所选用的肿瘤细胞株分别为YES-2人食道癌细胞和HCT116人结肠癌细胞。研究结果表明,卡莫霉素A具有明显的抗肿瘤活性。
本发明还提供了卡莫霉素A的药物组合物。所说药物组合物,是以卡莫霉素A为活性成分,与药学上可接受的一种或多种载体所组成。
以上所说药学上可接受的载体是指,药学领域常规的药物载体,如稀释剂、赋形剂如水等;填充剂如淀粉、蔗糖等;粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮;湿润剂如甘油;崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠;吸收促进剂如季铵化合物;表面活性剂如十六烷醇;润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙等。此外,还可在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
本发明还提供了所说化合物及其组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
发明效果:
本发明提供的结构式(1)所示化合物是一个新的Angucycline类抗生素卡莫霉素A(ChemomycinA),经生物活性实验证明,该化合物具有较好的抗肿瘤作用,今后有望研制开发成为一个新的抗肿瘤抗生素。
附图说明:
图1-卡莫霉素A的紫外光谱;
图2-卡莫霉素A的红外光谱;
图3-卡莫霉素A的高分辨质谱;
图4-卡莫霉素A在CD3OD中的1H-NMR谱;
图5-卡莫霉素A在CD3OD中的13C-NMR谱;
图6-卡莫霉素A在CD3OD中的DEPT谱;
图7-卡莫霉素A在CD3OD中的1H-1H COSY相关谱;
图8-卡莫霉素A在CD3OD中的H-13C相关谱;
图9-卡莫霉素A在CD3OD中的HMBC谱;
图10-卡莫霉素A在DMSO-d6中的1H-NMR谱;
图11-卡莫霉素A在DMSO-d6中的13C-NMR谱;
图12-卡莫霉素A在DMSO-d6中的DEPT谱;
图13-卡莫霉素A在DMSO-d6中的1H-1H COSY相关谱
图14-卡莫霉素A在DMSO-d6中的1H-13C相关谱;
图15-卡莫霉素A在DMSO-d6中的HMBC谱。
具体实施方案:
以下实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明,但不以任何方式限制本发明。
实施例1:卡莫霉素A的发酵
将生长于斜面的(2%可溶性淀粉、1%KNO3、0.05%NaCl、0.05%K2HPO4,、0.001%FeSO4·7H2O,、0.05%MgSO4·7H2O,、2%琼脂、pH7.0)Nocardiamediterranei var.kanglensis 1747-64菌接种于种子培养基(2%葡萄糖,1%黄豆粉,0.5%酵母粉,0.5%CaCO3,pH6.5)50ml/250ml的摇瓶,在28℃于旋转摇床上培养48小时,然后以5%的接种量,转入发酵培养基(3%葡萄糖、1%花生饼粉、1%酵母粉、0.5%蛋白胨、0.1%CaCO3,、pH6.5)100ml/500ml的三角瓶中,在28℃下于往复振荡摇床上培养72小时,收获发酵液共20L。
实施例2:卡莫霉素A的提取
发酵液用2N的HCl调pH至3~4,布氏漏斗里垫上滤纸抽滤,除去菌丝等,得到上清发酵液。用发酵液1/3体积的乙酸乙酯萃取三次,将三次萃取得到的乙酸乙酯合并后,加入无水硫酸钠干燥脱水,静置3~4小时,减压浓缩得到浸膏。
实施例3:卡莫霉素A的分离
浸膏先经过硅胶柱层析,以氯仿∶甲醇梯度洗脱进行初步分离,洗脱梯度分别为氯仿∶甲醇=100∶1(共为202ml),氯仿∶甲醇=20∶1(共为300ml),氯仿∶甲醇=9∶1(共为200ml),收集各个馏分,将含有目标化合物-卡莫霉素A的组分合并浓缩;然后采用Sephadex LH-20对含有目标化合物的组分实施进一步分离,洗脱溶剂为甲醇,流速为3ml/分钟,共用甲醇350ml,收集洗脱液中的各个组分,并将含有目标化合物(卡莫霉素A)的组分合并浓缩;然后再采用制备型HPLC进行制备,制备柱为Shimadzu公司的ODS柱(20mm×250mm,10μm),流速为4ml/分钟,进样量为200ul,洗脱条件为55%CH3OH-45%H2O,温度为室温25℃,然后挥干溶剂,冷冻干燥,得到卡莫霉素A的白色粉末,纯度为98.25%,共40mg。
实施例4:卡莫霉素A的结构鉴定
根据UV(图1)、IR(图2)、HR-MS(图3)、1H-NMR CD3OD为溶剂(图4)、DMSO-d6为溶剂(图10)、13C-NMR CD3OD为溶剂(图5)、DMSO-d6为溶剂(图11)、DEPT CD3OD为溶剂(图6)、DMSO-d6为溶剂(图12)数据和1H-1H COSY相关谱CD3OD为溶剂(图7)、DMSO-d6为溶剂(图13)、1H-13C相关谱HSQC CD3OD为溶剂(图8)、DMSO-d6为溶剂(图14)以及反向检测远程1H-13C异核多键相关谱HMBC CD3OD为溶剂(图9)、DMSO-d6为溶剂(图15)的分析结果,确定了卡莫霉素A的结构。
表1.卡莫霉素A的理化特性
本发明从1H-NMR(图4)和(图10),13C-NMR(图5)和(图11),DEPT谱(图6)和(图12)及HSQC谱(图8)和(图14)可以得到卡莫霉素A的以下结构信息:19个碳信号,其中2个羰基碳,6个芳香碳,7个有羟基取代的碳,1个次甲基碳,2个亚甲基碳,1个甲基碳;在1H-NMR DMSO-d6(图10)中有6个羟基质子信号,化学位移分别为11.4(酚羟基质子),7.2,6.6,6.2,5.4,5.1,但在1H-NMR CD3OD(图4)中,由于被氘代,看不见这六个质子信号;从IR谱(图2)中可以得到以下信息:羟基信号(3410cm-1),酮羰基信号1741cm-1),与羟基形成分子内氢键的羰基信号(1653cm-1),13C-NMR谱CD3OD溶剂(图5)中,这两个羰基的化学位移分别为204.02和201.02,当在13C-NMR谱DMSO-d6溶剂(图11)中,这两个羰基的化学位移分别为205.15和202.22;从1H-NMR谱(图4)和(图10)中可以清楚的看见H-9,H-10,H-11构成一个ABX系统,化学位移分别为6.8,7.5,7.2;在CD3OD溶剂中,C-8的化学位移为162.25,在DMSO-d6溶剂中,C-8的化学位移为160.16,这就提示,C-8上连接有酚羟基,这个酚羟基的化学位移在DMSO-d6中为11.4,并且与C-7的羰基形成氢键,这在HMBC谱CD3OD为溶剂(图9)、DMSO-d6为溶剂(图15)中可以得到佐证。通过化学位移的分析和不饱和度的计算,以及NMR数据与SF-2315B结构比较,确定了C,D环的结构。
从1H-1H COSY谱CD3OD为溶剂(图7)、DMSO-d6为溶剂(图13)和HMBC谱(图9)和(图15)中可以得到卡莫霉素A还有如下两个结构片断的存在,:(A):6CH2-5CH2-4aCH和(B):12bC(OH)-1C(O)-2CH(OH)-(CH3)3C(OH)-4CH(OH)经过两种氘代溶剂(CD3OD和DMSO-d6)如下图所示HMBC的研究,确定卡莫霉素A的结构如式(1)所示。
卡莫霉素A在CD3OD I和DMSO-d6 II中的NMR数据如表2所示。
表2.卡莫霉素A在CD3OD I和DMSO-d6 II中的NMR数据
1H-NMR(500MHz,δin ppm),13C-NMR(125MHz,δin ppm)
实施例5:卡莫霉素A的生物活性
本发明采用MTT法进行体外抗肿瘤的活性试验,选用的细胞株为YES2人食管癌细胞和HCT116人结肠癌细胞。具体操作步骤是:将卡莫霉素A溶解在DMSO中,浓度范围为4ug/ml-128ug/ml。将处于对数生长期的YES2人食管癌细胞和HCT116结肠癌细胞经0.125%的胰酶消化,用RPMI 1640培养液稀释细胞至2500个/well,37℃,5%的CO2培养箱中恒温培养3天,每孔加入MTT 20ul,37℃继续培养4小时,用酶联免疫分析仪在570nm下读取吸光度值。实验结果表明,卡莫霉素A具有较好的抗肿瘤活性,对YES2人食管癌细胞的IC50为50ug/ml,对HCT116结肠癌细胞的IC50为60ug/ml。
Claims (5)
2.制备如权利要求1所述卡莫霉素Chemomycin A的方法,其特征是所说方法包括以下步骤:
1)将保藏编号为CGMCC No.1554的诺卡氏菌地中海康乐变株1747-64菌由斜面培养基即2%可溶性淀粉、1%KNO3、0.05%NaCl、0.05%K2HPO4、0.001%FeSO4·7H2O、0.05%MgSO4·7H2O、2%琼脂、pH7.0,接种于种子培养基即2%葡萄糖、1%黄豆粉、0.5%酵母粉、0.5%CaCO3、pH6.5进行培养;
2)将种子培养的菌种置于旋转摇床上培养,然后转入发酵培养基即3%葡萄糖、1%花生饼粉、1%酵母粉、0.5%蛋白胨、0.1%CaCO3、pH6.5,在往复振荡摇床上28℃培养72小时,收获发酵液;
3)在发酵液中,加入2N的盐酸,抽滤除去菌丝,得到上清液,再用乙酸乙酯进行萃取,减压浓缩得到浸膏;浸膏先经硅胶柱层析,然后用SephadexLH-20对含有目标化合物的组分进一步分离,洗脱溶剂采用甲醇;最后用制备型HPLC进行制备,冷冻干燥,得到目标化合物卡莫霉素A;
4)根据UV、IR、HR-MS、分子式、1H-NMR、13C-NMR、DEPT数据测试和1H-1H相关谱COSY、1H-13C相关谱HSQC以及反向检测远程1H-13C异核多键相关谱HMBC的分析,确定目标化合物卡莫霉素A的结构。
3.权利要求1所述卡莫霉素Chemomycin A的药物组合物,其特征是所说组合物系以卡莫霉素Chemomycin A为有效成分,与一种或多种药学上可接受的载体所组成。
4.权利要求1所述卡莫霉素Chemomycin A在制备抗肿瘤药物中的应用。
5.权利要求3所述组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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