CN1923825B - 抗生素卡莫霉素A(Chemomycin A)及其制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新的卡莫霉素A(Chemomycin A)及其制备方法、以卡莫霉素A为活性成分的药物组合物以及卡莫霉素A在制备抗肿瘤药物中的应用，所说卡莫霉素A是由诺卡氏菌地中海康乐变株1747-64(Nocardia Mediterranei Var.Kanglensis 1747-64)培养物中分离得到的一种新角蒽环类抗生素(Angucycline)，体外活性实验结果表明，卡莫霉素A对YES-2人食道癌细胞和HCT116结肠癌细胞有较好的抗肿瘤活性，作为一种新的抗肿瘤药物，具有良好的开发前景。

Description

抗生素卡莫霉素A(Chemomycin A)及其制造方法

技术领域：

本发明涉及一种新的角蒽环类抗生素(Angucycline)卡莫霉素A及其制备方法、以卡莫霉素A为活性成分的药物组合物以及卡莫霉素A在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术：

迄今发现来源于微生物的抗生素已近万种，其中许多作为医药，农药已得到广泛应用。Angucycline是一类来源于微生物的次级代谢产物，20世纪60年代发现第一个此类抗生素。这是一类全新的四环结构化合物，其结构与蒽环类抗生素相似，具有蒽醌四环结构，所不同的是，四环中的A环以角的形式骈在其它三环上，组成一种不对称的四环结构。大部分Angucycline抗生素都具有不同程度的细胞毒活性，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的活性较弱，个别此类抗生素还具有酶抑制活性，抗病毒活性，受体拮抗活性和免疫抑制活性[杨建新.国外药学抗生素分册9(2)：98-109，1988]。由于这类抗生素具有广谱的生物学活性，它引起了世界上许多研究者的关注，并对这类抗生素进行了深入的研究。到目前为止，已经发现的Angucycline类抗生素有一百多个，但在Angucycline的B环6a和12a位含有环氧结构的只有少数几个抗生素[Rohr J，Nat ProdRep.9(2)：103-137，1992；Sasaki T，J.Antibiotics 41(7)：843-848，1988；Puder CJ，Antibiotics.53(4)：329-336，2000；Tsukuda E，J.Antibiotics 49(4)：333-339，1996]。

随着新抗生素大规模筛选研究不断向纵深发展，微生物发酵液中含量高、易分离的主组分抗生素大多已被分离出来，发现新抗生素的难度越来越大了。基于新来源新菌种产生新抗生素的机率大的观点，如今人们已将注意力集中在放线菌中稀有放线菌的研究上，把它作为开辟新抗生素筛选的重要途径之一。

本发明人在从稀有放线菌筛选抗肿瘤抗生素的过程中，分离得到具有抗肿瘤活性的Angucycline类抗生素-卡莫霉素A(Chemomycin A)，经光谱及质谱数据分析，确定卡莫霉素A(ChemomycinA)是一个全新结构的抗生素。该结构式与迄今已知结构的所有Angucycline类抗生素不同，目前尚未见到与卡莫霉素A具有相同结构的相关报道。迄今为止，已经发现的Angucycline类抗生素中，也未见到有Angucycline类抗生素成为抗肿瘤药物上市的。因此，卡莫霉素A(ChemomycinA)作为一个新结构抗肿瘤抗生素具有良好的研发应用前景。

本发明目的之一是，提供如式(1)所示结构的卡莫霉素A(ChemomycinA)；

本发明目的之二是，提供卡莫霉素A的制备方法；

本发明目的之三是，提供以卡莫霉素A为活性成分的药物组合物；

本发明目的之四是，提供卡莫霉素A及其组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

发明内容：

本发明提供了如式(1)所示结构的卡莫霉素A，

通过一系列光谱学分析，确定了卡莫霉素A的结构。

本发明所说的卡莫霉素A是一种白色粉末状物质，分子式为C₁₉H₂₀O₉，其特征为一种具有蒽醌环的四环结构，其中B环的C-6a和C-12a上有环氧结构；易溶于甲醇，氯仿，二甲亚砜等溶剂；具有旋光活性，其在氯仿中的比旋光度为+22.4°；当氯仿∶甲醇＝19∶1时，卡莫霉素A在硅胶板上的Rf＝0.24(表1)。

本发明所说卡莫霉素A是在从稀有放线菌筛选抗肿瘤抗生素的过程中，由诺卡氏菌地中海康乐变株1747-64(Nocardia mediterranei var.kanglensis 1747-64)培养物中分离得到的。所说产生菌已于2005年12月8日送交位于北京的“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”进行保藏，其保藏编号为：CGMCC No.1554。

为了获得卡莫霉素A及其抗肿瘤活性，本发明采取了以下技术路线与步骤：

1、卡莫霉素A的发酵及培养：首先是将生长于斜面的诺卡氏菌地中海康乐变株1747-64菌接种于种子培养基，在旋转摇床上培养，然后转入发酵培养基在往复振荡摇床上培养，收获发酵液；

2、卡莫霉素A的提取，分离：发酵培养物中，加入弱酸(如2N的盐酸等)，抽滤除去菌丝，得到上清液，再用非极性有机溶剂(如乙酸乙酯)萃取，减压浓缩得到浸膏。浸膏先经过硅胶柱层析，然后采用Sephadex LH-20对含有目标化合物的组分实施进一步分离，洗脱溶剂为甲醇。然后用制备型HPLC进行制备，冷冻干燥，最后得到白色粉末目标化合物卡莫霉素A；

3、卡莫霉素A的结构鉴定：根据UV、IR、HR-MS、¹H-NMR、¹³C-NMR、DEPT数据测试和¹H-¹H相关谱(¹H-¹H COSY)、¹H-¹³C相关谱(HSQC)以及反向检测远程¹H-¹³C异核多键相关谱(HMBC)的分析，确定了卡莫霉素A的结构；

4、卡莫霉素A的生物活性：采用MTT法进行了体外抗肿瘤活性试验，所选用的肿瘤细胞株分别为YES-2人食道癌细胞和HCT116人结肠癌细胞。研究结果表明，卡莫霉素A具有明显的抗肿瘤活性。

本发明还提供了卡莫霉素A的药物组合物。所说药物组合物，是以卡莫霉素A为活性成分，与药学上可接受的一种或多种载体所组成。

以上所说药学上可接受的载体是指，药学领域常规的药物载体，如稀释剂、赋形剂如水等；填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙等。此外，还可在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明还提供了所说化合物及其组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

发明效果：

本发明提供的结构式(1)所示化合物是一个新的Angucycline类抗生素卡莫霉素A(ChemomycinA)，经生物活性实验证明，该化合物具有较好的抗肿瘤作用，今后有望研制开发成为一个新的抗肿瘤抗生素。

附图说明：

图1-卡莫霉素A的紫外光谱；

图2-卡莫霉素A的红外光谱；

图3-卡莫霉素A的高分辨质谱；

图4-卡莫霉素A在CD₃OD中的¹H-NMR谱；

图5-卡莫霉素A在CD₃OD中的¹³C-NMR谱；

图6-卡莫霉素A在CD₃OD中的DEPT谱；

图7-卡莫霉素A在CD₃OD中的¹H-¹H COSY相关谱；

图8-卡莫霉素A在CD₃OD中的H-¹³C相关谱；

图9-卡莫霉素A在CD₃OD中的HMBC谱；

图10-卡莫霉素A在DMSO-d₆中的¹H-NMR谱；

图11-卡莫霉素A在DMSO-d₆中的¹³C-NMR谱；

图12-卡莫霉素A在DMSO-d₆中的DEPT谱；

图13-卡莫霉素A在DMSO-d₆中的¹H-¹H COSY相关谱

图14-卡莫霉素A在DMSO-d₆中的¹H-¹³C相关谱；

图15-卡莫霉素A在DMSO-d₆中的HMBC谱。

具体实施方案：

以下实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1：卡莫霉素A的发酵

将生长于斜面的(2％可溶性淀粉、1％KNO₃、0.05％NaCl、0.05％K₂HPO₄，、0.001％FeSO₄·7H₂O，、0.05％MgSO₄·7H₂O，、2％琼脂、pH7.0)Nocardiamediterranei var.kanglensis 1747-64菌接种于种子培养基(2％葡萄糖，1％黄豆粉，0.5％酵母粉，0.5％CaCO₃，pH6.5)50ml/250ml的摇瓶，在28℃于旋转摇床上培养48小时，然后以5％的接种量，转入发酵培养基(3％葡萄糖、1％花生饼粉、1％酵母粉、0.5％蛋白胨、0.1％CaCO₃，、pH6.5)100ml/500ml的三角瓶中，在28℃下于往复振荡摇床上培养72小时，收获发酵液共20L。

实施例2：卡莫霉素A的提取

发酵液用2N的HCl调pH至3～4，布氏漏斗里垫上滤纸抽滤，除去菌丝等，得到上清发酵液。用发酵液1/3体积的乙酸乙酯萃取三次，将三次萃取得到的乙酸乙酯合并后，加入无水硫酸钠干燥脱水，静置3～4小时，减压浓缩得到浸膏。

实施例3：卡莫霉素A的分离

浸膏先经过硅胶柱层析，以氯仿∶甲醇梯度洗脱进行初步分离，洗脱梯度分别为氯仿∶甲醇＝100∶1(共为202ml)，氯仿∶甲醇＝20∶1(共为300ml)，氯仿∶甲醇＝9∶1(共为200ml)，收集各个馏分，将含有目标化合物-卡莫霉素A的组分合并浓缩；然后采用Sephadex LH-20对含有目标化合物的组分实施进一步分离，洗脱溶剂为甲醇，流速为3ml/分钟，共用甲醇350ml，收集洗脱液中的各个组分，并将含有目标化合物(卡莫霉素A)的组分合并浓缩；然后再采用制备型HPLC进行制备，制备柱为Shimadzu公司的ODS柱(20mm×250mm，10μm)，流速为4ml/分钟，进样量为200ul，洗脱条件为55％CH₃OH-45％H₂O，温度为室温25℃，然后挥干溶剂，冷冻干燥，得到卡莫霉素A的白色粉末，纯度为98.25％，共40mg。

实施例4：卡莫霉素A的结构鉴定

根据UV(图1)、IR(图2)、HR-MS(图3)、¹H-NMR CD₃OD为溶剂(图4)、DMSO-d₆为溶剂(图10)、¹³C-NMR CD₃OD为溶剂(图5)、DMSO-d₆为溶剂(图11)、DEPT CD₃OD为溶剂(图6)、DMSO-d₆为溶剂(图12)数据和¹H-¹H COSY相关谱CD₃OD为溶剂(图7)、DMSO-d₆为溶剂(图13)、¹H-¹³C相关谱HSQC CD₃OD为溶剂(图8)、DMSO-d₆为溶剂(图14)以及反向检测远程¹H-¹³C异核多键相关谱HMBC CD₃OD为溶剂(图9)、DMSO-d₆为溶剂(图15)的分析结果，确定了卡莫霉素A的结构。

表1.卡莫霉素A的理化特性

本发明从¹H-NMR(图4)和(图10)，¹³C-NMR(图5)和(图11)，DEPT谱(图6)和(图12)及HSQC谱(图8)和(图14)可以得到卡莫霉素A的以下结构信息：19个碳信号，其中2个羰基碳，6个芳香碳，7个有羟基取代的碳，1个次甲基碳，2个亚甲基碳，1个甲基碳；在¹H-NMR DMSO-d₆(图10)中有6个羟基质子信号，化学位移分别为11.4(酚羟基质子)，7.2，6.6，6.2，5.4，5.1，但在¹H-NMR CD₃OD(图4)中，由于被氘代，看不见这六个质子信号；从IR谱(图2)中可以得到以下信息：羟基信号(3410cm^-1)，酮羰基信号1741cm^-1)，与羟基形成分子内氢键的羰基信号(1653cm^-1)，¹³C-NMR谱CD₃OD溶剂(图5)中，这两个羰基的化学位移分别为204.02和201.02，当在¹³C-NMR谱DMSO-d₆溶剂(图11)中，这两个羰基的化学位移分别为205.15和202.22；从¹H-NMR谱(图4)和(图10)中可以清楚的看见H-9，H-10，H-11构成一个ABX系统，化学位移分别为6.8，7.5，7.2；在CD₃OD溶剂中，C-8的化学位移为162.25，在DMSO-d₆溶剂中，C-8的化学位移为160.16，这就提示，C-8上连接有酚羟基，这个酚羟基的化学位移在DMSO-d₆中为11.4，并且与C-7的羰基形成氢键，这在HMBC谱CD₃OD为溶剂(图9)、DMSO-d₆为溶剂(图15)中可以得到佐证。通过化学位移的分析和不饱和度的计算，以及NMR数据与SF-2315B结构比较，确定了C，D环的结构。

从¹H-¹H COSY谱CD₃OD为溶剂(图7)、DMSO-d₆为溶剂(图13)和HMBC谱(图9)和(图15)中可以得到卡莫霉素A还有如下两个结构片断的存在，：(A)：⁶CH2-⁵CH2-^4aCH和(B)：^12bC(OH)-¹C(O)-²CH(OH)-(CH3)³C(OH)-⁴CH(OH)经过两种氘代溶剂(CD₃OD和DMSO-d₆)如下图所示HMBC的研究，确定卡莫霉素A的结构如式(1)所示。

卡莫霉素A在CD₃OD I和DMSO-d₆ II中的NMR数据如表2所示。

表2.卡莫霉素A在CD₃OD I和DMSO-d₆ II中的NMR数据

¹H-NMR(500MHz，δin ppm)，¹³C-NMR(125MHz，δin ppm)

实施例5：卡莫霉素A的生物活性

本发明采用MTT法进行体外抗肿瘤的活性试验，选用的细胞株为YES2人食管癌细胞和HCT116人结肠癌细胞。具体操作步骤是：将卡莫霉素A溶解在DMSO中，浓度范围为4ug/ml-128ug/ml。将处于对数生长期的YES2人食管癌细胞和HCT116结肠癌细胞经0.125％的胰酶消化，用RPMI 1640培养液稀释细胞至2500个/well，37℃，5％的CO₂培养箱中恒温培养3天，每孔加入MTT 20ul，37℃继续培养4小时，用酶联免疫分析仪在570nm下读取吸光度值。实验结果表明，卡莫霉素A具有较好的抗肿瘤活性，对YES2人食管癌细胞的IC₅₀为50ug/ml，对HCT116结肠癌细胞的IC₅₀为60ug/ml。

Claims (5)

1.一种抗生素卡莫霉素Chemomycin A，其结构如式(1)所示：

2.制备如权利要求1所述卡莫霉素Chemomycin A的方法，其特征是所说方法包括以下步骤：

1)将保藏编号为CGMCC No.1554的诺卡氏菌地中海康乐变株1747-64菌由斜面培养基即2％可溶性淀粉、1％KNO₃、0.05％NaCl、0.05％K₂HPO₄、0.001％FeSO₄·7H₂O、0.05％MgSO₄·7H₂O、2％琼脂、pH7.0，接种于种子培养基即2％葡萄糖、1％黄豆粉、0.5％酵母粉、0.5％CaCO₃、pH6.5进行培养；

2)将种子培养的菌种置于旋转摇床上培养，然后转入发酵培养基即3％葡萄糖、1％花生饼粉、1％酵母粉、0.5％蛋白胨、0.1％CaCO₃、pH6.5，在往复振荡摇床上28℃培养72小时，收获发酵液；

3)在发酵液中，加入2N的盐酸，抽滤除去菌丝，得到上清液，再用乙酸乙酯进行萃取，减压浓缩得到浸膏；浸膏先经硅胶柱层析，然后用SephadexLH-20对含有目标化合物的组分进一步分离，洗脱溶剂采用甲醇；最后用制备型HPLC进行制备，冷冻干燥，得到目标化合物卡莫霉素A；

4)根据UV、IR、HR-MS、分子式、¹H-NMR、¹³C-NMR、DEPT数据测试和¹H-¹H相关谱COSY、¹H-¹³C相关谱HSQC以及反向检测远程¹H-¹³C异核多键相关谱HMBC的分析，确定目标化合物卡莫霉素A的结构。

3.权利要求1所述卡莫霉素Chemomycin A的药物组合物，其特征是所说组合物系以卡莫霉素Chemomycin A为有效成分，与一种或多种药学上可接受的载体所组成。

4.权利要求1所述卡莫霉素Chemomycin A在制备抗肿瘤药物中的应用。

5.权利要求3所述组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

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