CN101830884B - 一种大环内酯及其制备方法和抗菌用途 - Google Patents

一种大环内酯及其制备方法和抗菌用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大环内酯及其制备方法和抗菌用途。该大环内酯具有式(1)所示的结构，通过常压柱层析及一维、二维核磁共振波谱，从柳珊瑚共生细菌淀粉液化芽孢杆菌SCSIO00856 Bacillus amyloliquefaciens SCSIO 00856 CCTCC NO：M 209257发酵液中分离鉴定得到。通过体外活性筛选，发现本发明的式(1)所示的化合物能强烈抑制菌株大肠杆菌(Escherichia coli)，枯草杆菌(Bacillus subtilis)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的生长，其最低抑菌浓度为0.1μg/mL。

Description

一种大环内酯及其制备方法和抗菌用途
技术领域
本发明涉及一种新的大环内酯，具体来说涉及一种新的二十四元环内酯，以及这种大环内酯的制备方法及其在制备抗菌药物方面的应用。 
背景技术
海洋微生物由于所处环境的特殊性，可以产生独特的天然活性物质。从海洋微生物资源中发掘新药已成为新药研究的一个重要发展趋势，海洋微生物已是目前和将来很长一段时期内新的活性物质的重要源泉。有文献报道淀粉液化芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciensES-2能产抗菌脂肽(见参考文献1：孙力军，陆兆新，孙德坤.Bacillus amyloliquefaciensES-2液体发酵抗菌脂肽培养基及其主要影响因子筛选.食品工业科技，2008，5：60.)，并有多个macrolactins类型二十四元环内酯从Bacillus属不同种微生物中分离到，目前自然界中大概共发现19个macrolactins类化合物，包括macrolactins A-T，7-O-succinylmacrolactin A，7-O-succinyl macrolactin F，macrolactin S，7-O-malonyl macrolactinA，其中一些化合物显示强抗菌、抗肿瘤、抗病毒活性。 
发明内容
本发明的目的在于提供一个新的具有强抗菌作用的大环内酯，另一个目的是提供该大环内酯的制备方法，进一步的目的是提供该大环内酯在制备抗菌药物方面的应用。 
我们通过常压柱层析及一维、二维核磁共振波谱，从柳珊瑚共生细菌淀粉液化芽孢杆菌SCSIO 00856 Bacillus amyloliquefaciens SCSIO 00856CCTCC NO：M 209257发酵液中分离鉴定得到一个新的大环内酯，如式(1)所示，这个大环内酯对大肠杆菌(Escherichia coli)，枯草杆菌(Bacillus subtilis)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等细菌的生长都有强抑制作用，从而实现了本发明的目的。 
本发明的大环内酯由式(1)表示： 
Figure DEST_PATH_GSB00000171422900011
式(1) 
结构推定： 
式(1)的化合物，其ESIMS谱在m/z419[M+H]+处显示准分子离子峰，结合高分辨HRESIMS和13C NMR(DEPT)谱，推出其分子式为C24H34O6。13C NMR(DEPT)谱显示有24个碳信号，包括1个甲基，5个亚甲基，6对1，2-取代双键，5个被氧化次甲基和1个羧基[δc167.8]； 1H NMR谱显示有1个甲基[δH1.25(3H，d，J＝6.0Hz)]，12个烯氢，5个被氧化次甲基氢。将式(1)化合物的NMR数据和类似化合物的NMR数据(文献1.Lu，X.L.，Xu，Q.Z.，Shen，Y.H.，Liu，X.Y.，Jiao，B.H.，Zhang，W.D.，Ni，K.Y.Nat.Prod.Res.2008，22，342-347；2.Gustafson，K.，Roman，M.，Fenical，W.J.Am.Chem.Soc.1989，111，7519-7524.)相比较，表明式(1)的化合物是一个24元环内酯，其NMR数据与化合物macrolactin S(Lu，X.L.，Xu，Q.Z.，Shen，Y.H.，Liu，X.Y.，Jiao，B.H.，Zhang，W.D.，Ni，K.Y.Nat.Prod.Res.2008，22，342-347)很相似。二维核磁共振谱2D NMR(HSQC、HMBC、1H-1H COSY、NOESY)论证了式(1)的化合物中含有与macrolactin S相同骨架。然而，将式(1)的化合物与macrolactin S的NMR数据相比较，可以发现：在式(1)的化合物中，H-7(从δH4.18迁移到δH5.38)，C-7(从δc73.6迁移到δc75.7)，C-9(从δc127.3迁移到δc130.0)都向低场迁移了一些化学位移，而H-6(从δH2.47迁移到δH2.57)，C-5(从δc142.5迁移到δc140.3)，C-6(从δc42.6迁移到δC 39.7)都向高场迁移了一些化学位移，这说明C-7位置上的-OH取代是α-构型，而不是像化合物macrolactin S及其它类似化合物中C-7位置上的-OH取代为β-构型。因此，本发明的24元环内酯的结构式由式(1)表示，命名为macrolactin V。 
本发明式(1)所示的化合物的制备方法，包括以下的步骤： 
(1)制备淀粉液化芽孢杆菌SCSIO 00856 Bacillus amyloliquefaciens SCSIO 00856CCTCC NO：M 209257的发酵液； 
(2)将上述所得的淀粉液化芽孢杆菌SCSIO 00856 Bacillus amyloliquefaciens SCSIO00856 CCTCC NO：M 209257的发酵液用乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿溶剂萃取，浓缩得乙酸乙酯层、二氯甲烷层或氯仿层； 
(3)将上述乙酸乙酯层、二氯甲烷层或氯仿层进行硅胶柱层析，用氯仿-甲醇作为洗脱剂按照体积比100∶0到0∶100的变化进行梯度洗脱，收集用体积分数为8％甲醇的氯仿-甲醇为洗脱剂冲洗下来的组份，该组分经硅胶柱层析，用体积比从20∶1到10∶1变化的氯仿-甲醇溶剂系统冲洗，得粗品，粗品经纯化，得式(1)所示化合物的纯品。 
步骤(1)中所用菌株淀粉液化芽孢杆菌SCSIO 00856 Bacillus amyloliquefaciensSCSIO00856是从采自海南三亚的灯芯柳珊瑚Junceella juncea体内分离到的一株共生细菌。其分离方法是将采集到的新鲜灯芯柳珊瑚用无菌水清洗后，用灭菌刀刮下表面，将刮下的表面层打碎后用水连续稀释，然后用含有质量分数50％海水的土豆浸出物琼脂培养基在27℃下培养。 分离出的细菌形态为杆状，见图1。该菌株已于2009年11月5日保存在中国典型培养物保藏中心(地址：中国，武汉，武汉大学)，其简称为CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M 209257。经16S rRNA基因序列分析，发现该菌株与美国典型微生物菌种保藏中心(简称ATCC)的淀粉液化芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens ATCC 23350T的16S rRNA基因序列相似性为99.21％，故鉴定为淀粉液化芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens。 
步骤(1)中所述的发酵液可以将淀粉液化芽孢杆菌SCSIO 00856 Bacillusamyloliquefaciens SCSIO 00856 CCTCC NO：M 209257接种到淀粉液化芽孢杆菌适用的培养基中，在通常的发酵条件下制得，优选的制备方法是将液化芽孢杆菌SCSIO 00856 Bacillusamyloliquefaciens SCSIO 00856 CCTCC NO：M 209257接种到培养液中，发酵条件为27℃、转速150r/min、时间5天，获得种子液，将种子液再接种到含有培养液的发酵罐中，发酵条件为27℃、转速150r/min、压力0.1MPa、pH值7.3，发酵10天后收取发酵液，所述的培养液为每升培养液中含酵母膏4g、麦芽粉5g、葡萄糖4g、海盐18g，其余为水。 
本发明中步骤(2)中的萃取最好用乙酸乙酯萃取，所述的浓缩采用常规的方法例如减压浓缩，步骤(3)所述的纯化采用常规的方法例如色谱柱分离或重结晶等。 
通过体外活性筛选，发现本发明的式(1)所示的化合物能强烈抑制菌株大肠杆菌(Escherichia coli)，枯草杆菌(Bacillus subtilis)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的生长，其最低抑菌浓度为0.1μg/mL。 
由上述实验结果表明，本发明式(1)的化合物可应用于抗菌药物的制备，特别是在制备抗大肠杆菌(Escherichia coli)，枯草杆菌(Bacillus subtilis)或者金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)药物中的应用。 
附图说明
图1：Bacillus amyloliquefaciens SCSIO 00856的形状 
具体实施方式
以下的实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。 
实施例1： 
从平板中挑选淀粉液化芽孢杆菌SCSIO 00856 Bacillus amyloliquefaciens SCSIO00856 CCTCC NO：M 209257菌株的单菌落接种到2mL培养液中培养得2mL发酵液，所用的培养液是每升培养液中含酵母膏4g、麦芽粉5g、葡萄糖4g、海盐18g，发酵条件为27℃、转速150r/min、时间5天；将该2mL发酵液，再接种到含50mL培养液的250mL三角瓶中培养得50mL种子液，培养液组分和发酵条件同下：接着取上述种子液20mL接种到含400mL培养液的1L三角瓶中培养，培养液组分和发酵条件同上；最后将上述400mL发酵液接种到含120L培养液的200L发酵罐中，所用培养液与上述同，发酵条件为27℃、转速150 r/min、压力0.1MPa、pH值7.3，发酵10天后收取发酵液。 
将上述所得120L淀粉液化芽孢杆菌SCSIO 00856 Bacillus amyloliquefaciens SCSIO00856 CCTCC NO：M 209257发酵液用乙酸乙酯溶剂萃取，浓缩得乙酸乙酯层13.9g。用氯仿和甲醇的混合溶剂将乙酸乙酯层溶解拌硅胶，用500mL氯仿拌200g硅胶进行湿法装柱，以体积比从100∶0到0∶100变化的氯仿-甲醇溶剂系统梯度洗脱，其中用含8％甲醇的氯仿-甲醇溶剂冲洗得的组分F，该组分经硅胶柱层析，用体积比从20∶1到10∶1变化的氯仿-甲醇溶剂系统冲洗，浓缩，得粗品，将该粗品上半制备高效液相色谱柱HPLC(LunaTMC18(2)，250×10mm i.d.，5mL/min)，用甲醇-水(体积比65∶35)冲洗分离后，经过柱和重结晶纯化，得纯产物，得到的产物经光谱数据验证，证实是纯的式(1)所示的化合物。 
其核磁共振波谱(NMR)数据如下 
Macrolactin V：UV(MeOH)λmax(log e)229(4.57)，261(4.18)nm；1H-NMR(500MHz，CD3OD)：5.58(1H，d，J＝12.0Hz，H-C(2))，6.66(1H，dd，J＝11.5，11.5Hz，H-C(3))，7.25(1H，dd，J＝11.5，11.5Hz，H-C(4))，6.13(1H，m，H-C(5))，2.57(1H，m，H-C(6))，5.38(1H，m，H-C(7))，5.75(1H，dd，J＝7.5，15.0Hz，H-C(8))，5.58(1H，dd，J＝11.5，15.0Hz，H-C(9))，6.15(1H，m，H-C(10))，4.51(1H，m，H-C(12))，4.03(1H，m，H-C(13))，2.60(1H，m，H-C(14))，4.31(1H，m，H-C(15))，5.62(1H，m，H-C(16))，6.10(1H，dd，J＝10.5，15.0Hz，H-C(17))，5.57(1H，dd，J＝10.5，15.0Hz，H-C(18))，5.56(1H，m，H-C(19))，2.09，2.24(2H，m，H-C(20))，2.09，2.24(2H，m，H-C(20))，1.53(1H，m，H-C(21))，1.56，1.65(2H，m，H-C(22))，5.08(1H，m，H-C(23))，1.25(3H，d，J＝6.0Hz，H-C(24))；13C-NMR(125MHz，CD3OD)：167.8(s，C(1))，118.4(d，C(2))，145.0(d，C(3))，130.4(d，C(4))，140.3(d，C(5))，39.7(t，C(6))，75.7(d，C(7))，138.5(d，C(8))，130.0(d，C(9))，130.6(d，C(10))，132.8(d，C(11))，72.4(d，C(12))，72.9(d，C(13))，39.7(t，C(14))，69.0(d，C(15))，135.5(d，C(16))，130.7(d，C(17))，131.8(d，C(18))，133.8(d，C(19))，32.7(t，C(20))，25.5(t，C(21))，36.0(t，C(22))，71.7(d，C(23))，20.2(q，C(23))。 
实施例2：纸片法测试式(1)化合物抗菌实验。 
采用标准纸片法测试式(1)化合物的抗菌活性，具体方法参考文献[Acar，J.F.The discsusceptibilitv test.In：Lorian V(ed)Antibiotics in Laboratory Medicine.Williams&Wilkins，Baltimore，MD，1980，24-54]。 
简述如下：将四种菌株大肠杆菌(Escherichia coli)，苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis)，枯草杆菌(Bacillus subtilis)，金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus) 用营养培养基(0.3％酵母膏、0.5％蛋白胨)于30℃常规培养24小时，取200μL菌株发酵液平铺于营养琼脂培养板上(NA培养基：0.3％酵母膏、0.5％蛋白胨、1.5％琼脂)制得平板。用甲醇溶解式(1)化合物配制成1000μg/mL、500μg/mL、50μg/mL、0.5μg/mL、0.05μg/mL梯度浓度的待测样品，滴加50μL待测样品于直径6mm的滤纸片上，用10μg/纸片的链霉素为阳性对照物，待溶剂挥发干后将载样纸片放于上述制备好的培养板中，置于30℃培养箱中培养24小时，观察抑菌圈，得到式(1)化合物在25μg/纸片时大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为9.2、9.0、9.7mm，证明能抑制菌株大肠杆菌，枯草杆菌，金黄色葡萄球菌的生长，其最低抑菌浓度为0.1μg/mL。 

Claims (5)

1.下述式（1）表示的化合物：
Figure FDA00001707936900011
2.一种权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于包括以下的步骤：
（1）制备淀粉液化芽孢杆菌SCSIO 00856 Bacillus amyloliquefaciens SCSIO 00856CCTCC NO：M 209257的发酵液；
（2）将上述所得淀粉液化芽孢杆菌SCSIO 00856 Bacillus amyloliquefaciens SCSIO00856 CCTCC NO：M 209257发酵液用乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿溶剂萃取，浓缩得乙酸乙酯层、二氯甲烷层或氯仿层；
（3）将上述乙酸乙酯层、二氯甲烷层或氯仿层进行硅胶柱层析，用氯仿-甲醇为洗脱剂按照体积比100∶0到0∶100的变化进行梯度洗脱，收集用8%甲醇的氯仿-甲醇为洗脱剂冲洗下来的组分，该组分经硅胶柱层析，用体积比从20∶1到10∶1变化氯仿-甲醇溶剂系统冲洗，得粗品，粗品经纯化，得权利要求1所述的式（1）所示化合物的纯品。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的步骤（1）中制备所述的发酵液的方法是将淀粉液化芽孢杆菌SCSIO 00856 Bacillus amyloliquefaciens SCSIO 00856 CCTCCNO：M 209257接种到培养液中，发酵条件为27℃、转速150r/min、时间5天，获得种子液，将种子液再接种到装有培养液的发酵罐中，发酵条件为27℃、转速150r/min、压力0.1MPa、pH值7.3，发酵10天后收取发酵液，所述的培养液为每升培养液中含酵母膏4g、麦芽粉5g、葡萄糖4g、海盐18g，其余为水。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于步骤（2）中所述的浓缩为减压浓缩，步骤（3）中所述的纯化为色谱柱分离或重结晶。
5.权利要求1所述的化合物在制备抗大肠杆菌（Escherichia coli)，枯草杆菌（Bacillus subtilis）或者金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）药物中的应用。 
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