CN112353801B - 一种去甲哈尔满在制备群体感应抑制剂中的应用及菌株 - Google Patents

一种去甲哈尔满在制备群体感应抑制剂中的应用及菌株 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种去甲哈尔满在制备群体感应抑制剂中的应用及菌株，本发明海洋细菌40DY182次级代谢产物中有去甲哈尔满，能较好的抑制紫色杆菌紫色素的产生以及生物被膜的形成；耐药性铜绿假单胞菌绿脓菌素产生减少，生物被膜形成受到抑制，在浓度增大时，与对细菌群体感应系统活性的抑制效果增强。

Description

一种去甲哈尔满在制备群体感应抑制剂中的应用及菌株
(一)技术领域
本发明涉及一种9H-吡啶[3,4-b]吲哚的应用，特别涉及一种9H-吡啶[3,4-b]吲哚在群体感应系统中的应用，所述9H-吡啶[3,4-b]吲哚由海洋来源的海洋细菌(Microbacterium oleivorans)40DY182经发酵培养分离纯化获得。
(二)背景技术
临床上出现多重耐药菌株使得新型抗生素研究越来越困难，研发难度增大、周期变长、作用效率低下和细菌产生耐药性的时间越来越短等问题，使得细菌耐药性成为越来越严重的世界性难题。为了克服这些问题，寻找可替代的新型抗菌物质、解决细菌耐药性问题已在研究界受到广泛关注。目前抗菌的一种新策略是群体感应抑制策略。细菌在生长繁殖过程中，会根据环境的变化分泌一些特定的信号分子到周围环境中去，根据这些信号分子的变化来检测所处环境中自身或者其他微生物种群的变化情况，科学家们称这种信号分子为自诱导物(auto inducer,AI)。细菌不断地向外界分泌信号分子，在一定的时期达到一个阈值，细菌就会调整各自体内相关系统来应对这种生存环境的改变，这一调控系统被称为细菌群体感应系统。目前的研究表明，多数细菌毒力的形成、发展及功能调节需要群体感应系统调控。因此通过抑制细菌群体感应，能够降低细菌毒力的产生，且由于缺少竞争性生存压力，细菌不易诱导耐药性突变。这种群体感应抑制剂可以单独使用，也可以作为抗生素的辅助治疗剂达到防治细菌感染的目的。
本发明首次从海洋细菌(Microbacterium oleivorans)40DY182中获得化合物norharmane，并且首次研究该化合物的群体感应抑制活性，目前未见该化合物具有抑制紫色杆菌和铜绿假单胞菌群体感应活性的报道。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种9H-吡啶[3,4-b]吲哚在制备群体感应抑制剂中的应用，9H-吡啶[3,4-b]吲哚由海洋细菌(Microbacterium oleivorans)40DY182发酵分离纯化得到，具有抑制紫色杆菌和耐药性铜绿假单胞菌群体感应系统活性，该类化合物在不抑制致病菌菌体生长的范围内能够显著的降低相关致病因子的表达，降低细菌的毒力，可用于防治具有群体感应系统的细菌感染。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种式(Ⅰ)所示去甲哈尔满(norharmane)在制备群体感应抑制剂中的应用，所述去甲哈尔满亦为9H-吡啶[3,4-b]吲哚(9H-Pyrido[3,4-b]indole)。
Figure BDA0002626693860000021
进一步，所述去甲哈尔满为紫色杆菌或铜绿假单胞菌的群体感应抑制剂，所述紫色杆菌为紫色杆菌(C.violaceum)ATCC 12472，所述铜绿假单胞菌为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)C218，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期2020年5月13日，保藏编号GDMCC No：61027，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编510075。
所述去甲哈尔满为紫色杆菌紫色素产生抑制剂、紫色杆菌生物被膜形成抑制剂、铜绿假单胞菌绿脓菌素产生抑制剂或铜绿假单胞菌生物被膜形成抑制剂。
本发明还提供一种式(Ⅰ)所示norharmane的制备方法，所述方法按如下步骤进行：
(1)将海洋细菌(Microbacterium oleivorans)40DY182经发酵培养获得的发酵液过滤除去菌体，滤液加入等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯相减压浓缩至干，得到粗提物；
(2)将粗提物利用高效液相制备色谱分离，选择甲醇-水作为洗脱溶剂，0～30min从10％到100％线性梯度增加甲醇，分别收集0-6min、6-12min、12-16min、16-20min、20-25min、25-30min流出液，得到6个馏分，分别标记为流出液A、流出液B、流出液C、流出液D、流出液E、流出液F；高效液相制备色谱柱：Phenomenex USA,Luna10μm C18，250*21.2mm；流动相：甲醇-水；流速：5mL/min；检测波长：210nm；进样量1mL，粗提取物的浓度100mg/mL；
(3)取步骤(2)流出液E利用高效液相制备色谱分离，选择甲醇-水作为洗脱溶剂，0～30min从30％到100％线性梯度增加甲醇，分别收集0-7min、7-14min、14-18min、18-25min、25-30min流出液，得到5个馏分；分别标记为流出液A1、流出液B1、流出液C1、流出液D1、流出液E1；高效液相制备色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18 5μm 250*9.4mm；流动相：甲醇-水；流速：2mL/min；检测波长：210nm；进样量20μL，组分E浓度20mg/mL；
(4)取步骤(3)流出液A1利用高效液相制备色谱进一步纯化，选择甲醇-水作为洗脱溶剂，0～135min从20％到100％线性梯度增加甲醇，收集22min出现的峰，并浓缩至干，得到式(Ⅰ)所示norharmane；高效液相制备色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18 5μm 250*9.4mm；流动相：甲醇-水；流速：2mL/min；检测波长：210nm；进样量20μL，组分A1浓度20mg/mL。
进一步，所述发酵液的制备方法为：将海洋细菌40DY182接种至斜面YP固体培养基，在30℃恒温培养箱中培养过夜，获得斜面菌体；YP海水固体培养基：酵母提取物1g/L，蛋白胨5g/L，海盐22.5g/L，琼脂15g/L，溶剂为去离子水，121℃，灭菌20min；
再将斜面菌体接种至YP海水液体培养基，在30℃恒温摇床中，180rpm振荡培养过夜，获得种子液；YP海水液体培养基：酵母提取物1g/L，蛋白胨5g/L，海盐22.5g/L，溶剂为去离子水，121℃，灭菌20min；
将种子液以体积浓度2.5％的接种量接种至YP海水液体培养基中，30℃、压力0.1MPa发酵培养2天，获得发酵液。
本发明还提供一种用于制备式(Ⅰ)所示化合物的海洋细菌(Microbacteriumoleivorans)40DY182，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期2018年7月13日，保藏编号GDMCC No：60414，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编510075。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
(1)通过本发明发现了海洋细菌40DY182次级代谢产物中有化合物norharmane。
(2)化合物norharmane能较好的抑制紫色素的产生以及生物被膜的形成；耐药性铜绿假单胞菌绿脓菌素产生减少，生物被膜形成受到抑制。
(3)通过本发明的化合物norharmane在浓度增大时，与对细菌群体感应系统活性的抑制效果增强。
(四)附图说明
图1为化合物norharmane在不同浓度条件下对紫色杆菌紫色素产生的抑制率图。
图2为化合物norharmane在不同浓度条件下对紫色杆菌生物被膜形成的影响。
图3为化合物norharmane在不同浓度条件下对耐药性铜绿假单胞菌绿脓菌素产生的抑制率图。
图4为化合物norharmane在不同浓度条件下对耐药性铜绿假单胞菌生物被膜形成的抑制图。
图5为化合物norharmane结构式。
图6为海洋细菌(Microbacterium oleivorans)40DY182的平板图片。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。
本发明实施例所用培养基组成：
YP海水培养基：酵母提取物1g/L，蛋白胨5g/L，海盐22.5g/L，去离子水1L；121℃，灭菌20min。
YP海水固体培养基：酵母提取物1g/L，蛋白胨5g/L，海盐22.5g/L，琼脂15g/L，去离子水1L；121℃，灭菌20min。
MM培养基：K2SO4 2g/L，K2HPO4 3g/L，NH4Cl 5g/L，MgSO4·7H2O 80mg/L，CaCl2100mg/L，葡萄糖2.5g/L，去离子水1L，pH 7.4；121℃，灭菌20min。
LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH7.2-7.4；121℃，灭菌20min。
LB固体培养基(平板)：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L，琼脂15g/L，溶剂为去离子水，pH 7.2-7.4；121℃，灭菌20min。
实施例1、菌株40DY182分离提取及鉴定
1、菌株40DY182初筛
采集西太平洋下5591m泥土样品，采用涂布平板法分离微生物菌株。取0.5g泥土样品，加入4.5mL无菌水，记为样品1，混匀后静止2h。取0.5mL样品1加入4.5mL无菌水，记为样品2，混匀后静止2h。取0.5mL样品2加入4.5mL无菌水，记为样品3，混匀后静止2h。取样品1，2，3分别涂布平板接种于YP海水固体培养基、MM及LB固体培养基中，于30℃恒温培养箱中培养7d，每个菌株保存3个平板待用。观察菌株形态并记录。
2、复筛
挑取初筛中菌落成型且单一的菌体至YP海水固体培养基平板上，30℃培养3d，挑取成型且单一的菌落，记为菌株40DY182。
3、菌株鉴定
菌株40DY182菌体呈黄色，表面光滑。菌株40DY182经16S rRNA基因分析，核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
根据16S rRNA序列(如SEQ ID NO.1所示)，结合生态特征，将菌株40DY182鉴定为海洋细菌(Microbacterium oleivorans)，命名为海洋细菌(Microbacterium oleivorans)40DY182，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期2018年7月13日，保藏编号GDMCCNo：60414，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编510075。
测得基因序列(SEQ ID NO.1)为：
TGGATCAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGCAACCTGCCCTTGACTCTGGGATAAGCGCTGGAAACGGCGTCTAATACCGGATATGAGCTGCGATCGCATGGTCAGCAGTTGGAAAGATTTTTCGGTCTGGGATGGGCTCACGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAAAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCTGCTGTGAAATCCCGAGGCTCAACCTCGGGTCTGCAGTG。
实施例2、菌株C218获取及鉴定
菌株C218由浙江大学医学院附属第二医院李江涛提供。
根据16S rRNA序列(如SEQ ID NO.2所示)，结合生态特征，将菌株C218鉴定为铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)C218，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期2020年5月13日，保藏编号GDMCC No：61027，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编510075。
测得基因序列(SEQ ID NO.2)为：
CCTTGCGGTTAGACTAGCTACTTCTGGAGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTGACATTCTGATTCACGATTACTAGCGATTCCGACTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGGACTACGATCGGTTTTATGGGATTAGCTCCACCTCGCGGCTTGGCAACCCTTTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCCCACCCGAGGTGCTGGTAACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTACGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTCTGAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTCAGCATGTCAAGGCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGACTTATCGCGTTAGCTGCGCCACTAAGATCTCAAGGATCCCAACGGCTAGTCGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTCAGTGTCAGTATCAGTCCAGGTGGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTTCCTATATCTACGCATTTCACCGCTACACAGGAAATTCCACCACCCTCTACCGTACTCTAGCTCAGTAGTTTTGGATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATTTCACATCCAACTTGCTGAACCACCTACGCGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTTCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGAAGTTAGCCGGTGCTTATTCTGTTGGTAACGTCAAAACAGCAAGGTATTAACTTACTGCCCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTTTACAATCCGAAGACCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGACTGATCATCCTCTCAGACCAGTTACGGATCGTCGCCTTGGTAGGCCTTTACCCCACCAACTAGCTAATCCGACCTAGGCTCATCTGATAGCGTGAGGTCCGAAGATCCCCCACTTTCTCCCTCAGGACGTATGCGGTATTAGCGCCCGTTTCCGGACGTT。
实施例3、化合物norharmane的提取鉴定
1、粗提物制备
将海洋细菌40DY182接种至YP海水固体斜面培养基，在30℃恒温培养箱中培养过夜，获得斜面菌体；YP海水固体培养基：酵母提取物1g/L，蛋白胨5g/L，海盐22.5g/L，琼脂15g/L，溶剂为去离子水，121℃，灭菌20min；
再将斜面菌体接种至YP海水液体培养基，在30℃恒温摇床中，180rpm振荡培养过夜，获得种子液；YP海水固体培养基：酵母提取物1g/L，蛋白胨5g/L，海盐22.5g/L，琼脂15g/L，溶剂为去离子水，121℃，灭菌20min；
将种子液以体积浓度2.5％的接种量接种至装有YP海水液体培养基的100L发酵罐中，30℃、压力为0.1Mpa发酵培养2天，培养一罐，共获得发酵液80L。发酵完成后，发酵液使用陶瓷膜过滤去除菌体，得到不含菌体的发酵液，加入等体积的乙酸乙酯，在分液漏斗中振荡萃取3次，将乙酸乙酯相减压浓缩至干，得到褐色粗提物10g。
2、化合物的初步分离纯化
将粗提物利用高效液相制备色谱分离，选择甲醇-水作为洗脱溶剂，0～30min从10％到100％线性梯度增加甲醇(10％-100％)，分别在0-6min、6-12min、12-16min、16-20min、20-25min、25-30min集流出液，得到6个馏分。分别标记为流出液A、流出液B、流出液C、流出液D、流出液E、流出液F；高效液相制备色谱柱：Phenomenex USA,Luna 10μm C18，250*21.2mm；流动相：甲醇-水；流速：5mL/min；检测波长：210nm；进样量1mL，粗提取物的浓度100mg/mL；
3、粗分物的活性实验
将步骤2获得流出液A、流出液B、流出液C、流出液D、流出液E、流出液F分别浓缩至干，分别获得组分A、组分B、组分C、组分D、组分E、组分F，以甲醇溶解成50mg/mL的溶液，分别获得组分A溶液、组分B溶液、组分C溶液、组分D溶液、组分E溶液、组分F溶液，用群体感应筛选模型检测各组分活性，具体操作：
将活化的紫色杆菌(C.violaceum)ATCC 12472菌种接种到LB液体培养基中，30℃，180rpm过夜培养，获得紫色杆菌ATCC 12472菌液，备用。将15ml融化的LB固体培养基冷却至40℃，加入100μL过夜培养的紫色杆菌ATCC 12472菌液，混匀后倒在新鲜LB平板上，制成双层平板。待平板凝固后，于30℃恒温培养箱培养1h。将培养好的平板用打孔器打孔，每个孔内分别加入20μL(每孔1mg)的组分A溶液、组分B溶液、组分C溶液、组分D溶液、组分E溶液、组分F溶液，并由10μL甲醇作为阴性对照，三个平行平板，排除偶然误差因素。放入30℃恒温培养箱中培养24h，观察实验结果。若菌液具有群体感应抑制活性，则加样孔周围应有浑浊但不透明的圆圈，圆圈直径越大即为活性越强。结果表明，组分E具有群体感应抑制活性。
LB固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、琼脂18g/L，溶剂为去离子水，pH 7.2-7.4；121℃，灭菌20min。
4、分离化合物
取步骤2制备的流出液E利用高效液相制备色谱分离，选择甲醇-水作为洗脱溶剂，0～30min从30％到100％线性梯度增加甲醇，分别在0-7min、7-14min、14-18min、18-25min、25-30min收集流出液，得到5个馏分。分别标记为流出液A1、流出液B1、流出液C1、流出液D1、流出液E1；高效液相制备色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C185μm 250*9.4mm；流动相：甲醇-水；流速：2mL/min；检测波长：210nm；进样量20μL，组分E浓度20mg/mL。
取流出液A1利用高效液相制备色谱进一步纯化，0～135min从20％到100％线性梯度增加甲醇，收集22min出现的峰，并浓缩至干，得到产物15mg；高效液相制备色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18 5μm 250*9.4mm；流动相：甲醇-水；流速：2mL/min；检测波长：210nm；进样量20μL，组分A1浓度20mg/mL。
5、化合物鉴定
利用核磁共振(1H-NMR、13C-NMR)对产物进行结构鉴定，将核磁共振谱信号1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)、13C-NMR(125MHz，DMSO-d6)进行汇总。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.62(s,1H),8.92(d,J＝0.96Hz,1H),8.34(d,J＝5.18,1H),8.24(m,1H),8.12(dd,J＝5.22,1.09,1H),7.61(m,J＝8.19,2H),7.24(m,1H)。13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ140.52,138.11,135.97,134.02,128.09,127.42,121.78,120.60,119.23,114.63,111.94。通过波谱解析推测及文献对比，产物为9H-Pyrido[3,4-b]indole(norharmane)，分子量为168.0757，分子式为C11H8N2，化学结构式如下：
Figure BDA0002626693860000081
实施例4、化合物norharmane对细菌群体感应调控的毒力的影响
1、化合物norharmane对紫色杆菌的影响
(1)培养基
LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH7.2-7.4；121℃，灭菌20min。
(2)化合物norharmane对紫色杆菌紫色素产生的影响
将紫色杆菌(C.violaceum)ATCC 12472菌种接种到LB液体培养基中，30℃，180rpm培养24h，培养液用新鲜LB液体培养基以体积比1:10000比例稀释后，分装8组，每组3个平行，取6组分别加入不同浓度的norharmane甲醇溶液，使norharmane的终浓度分别为2.5，5，7.5，10，12.5，15μg/mL，以等体积甲醇作为阴性对照，以等体积的无菌水作为空白对照。30℃，180rpm培养18h，取1mL菌液，12000rpm离心10min，弃上清，加入1mL二甲基亚砜(DMSO)，充分振荡使紫色素完全溶解，12000rpm离心10min，吸取上清液检测OD585，结果如图1所示，化合物norharmane对紫色杆菌紫色素的产生有抑制作用，抑制率与浓度呈正比。
紫色素抑制率计算公式如下：
Figure BDA0002626693860000091
(3)化合物norharmane对紫色杆菌生物被膜形成的影响
采用结晶紫染色法分析紫色杆菌形成的生物被膜，具体步骤如下：将紫色杆菌(C.violaceum)ATCC 12472菌种接种到LB液体培养基中，30℃，180rpm培养24h，培养液用新鲜LB液体培养基以体积比1:10000比例稀释后，以每孔190μL的量加入到圆底96孔板中，每孔再加入10μL norharmane甲醇溶液，使最终浓度为2.5、5、7.5、10、12.5、15μg/mL，以等体积甲醇作为阴性对照，以等体积的无菌水作为空白对照，每组3个平行。30℃静置培养24h。24h后取出，除去上层浮游细菌后用去离子水清洗2次。37℃干燥固定后加入200μL的0.2％结晶紫溶液(w/v)，静置染色15min后，用去离子水清洗未结合的结晶紫2次，干燥后用150μL33％冰醋酸溶解。测定OD595，结果如图2所示，化合物norharmane对紫色杆菌生物被膜的形成有抑制作用，抑制率与浓度呈正比。
生物被膜抑制率计算公式如下：
Figure BDA0002626693860000092
2、化合物norharmane对耐药性铜绿假单胞菌的影响
(1)培养基
LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH7.2-7.4；121℃，灭菌20min。
(2)化合物norharmane对耐药性铜绿假单胞菌绿脓菌素产生的影响
将耐药铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)C218接种至LB液体培养基，37℃，180rpm，培养24h，培养液用新鲜LB液体培养基以体积比1:10000比例稀释后，分装6组，每组3个平行。取4组分别加入不同浓度norharmane甲醇溶液，使norharmane的终浓度分别为10，20，30，40μg/mL，以等体积甲醇作为阴性对照组，以等体积的无菌蒸馏水作为空白对照。30℃、180rpm培养18h后，取1mL菌液，12000rpm离心10min，吸取上清液600μL，加入1mL氯仿进行抽提，充分抽提后，取600μL氯仿层转入新的离心管中，并加入200μL 0.2M的盐酸混合反应；充分混合后，12000rpm离心10min收集水相。测定OD520，结果如图3所示，化合物norharmane对铜绿假单胞菌绿脓菌素的产生有抑制作用，抑制率与浓度呈正比。
绿脓菌素抑制率计算公式如下：
Figure BDA0002626693860000101
(3)化合物norharmane对耐药性铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响
将耐药铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)C218接种至LB液体培养基，37℃，180rpm，培养24h，培养液用新鲜LB液体培养基以体积比1:10000比例稀释后，取190μL加入到圆底96孔板中，并加入10μL norharmane甲醇溶液，使最终浓度为10，20，30，40μg/mL，以等体积甲醇作为阴性对照，以等体积的无菌水作为空白对照，每组3个平行。37℃静置培养24h。24h后取出，除去上层浮游细菌后用去离子水清洗2次。37℃干燥固定后加入200μL的0.2％结晶紫溶液(w/v)，静置染色15min后，用去离子水清洗未结合的结晶紫2次，干燥后用150μL 33％冰醋酸溶解。测定OD595，结果如图4所示，化合物norharmane对铜绿假单胞菌生物被膜的形成有抑制作用，抑制率与浓度呈正比。
生物被膜抑制率计算公式如下：
Figure BDA0002626693860000102
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、简化、应用均应为等效的置换条件，都包括在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种去甲哈尔满在制备群体感应抑制剂中的应用及菌株
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 527
<212> DNA
<213> 海洋细菌(Microbacterium oleivorans)
<400> 1
tggatcagtg gcgaacgggt gagtaacacg tgagcaacct gcccttgact ctgggataag 60
cgctggaaac ggcgtctaat accggatatg agctgcgatc gcatggtcag cagttggaaa 120
gatttttcgg tctgggatgg gctcacggcc tatcagcttg ttggtgaggt aatggctcac 180
caaggcgtcg acgggtagcc ggcctgagag ggtgaccggc cacactggga ctgagacacg 240
gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca caatgggcga aagcctgatg 300
cagcaacgcc gcgtgaggga tgacggcctt cgggttgtaa acctctttta gcagggaaga 360
agcgaaagtg acggtacctg cagaaaaagc gccggctaac tacgtgccag cagccgcggt 420
aatacgtagg gcgcaagcgt tatccggaat tattgggcgt aaagagctcg taggcggttt 480
gtcgcgtctg ctgtgaaatc ccgaggctca acctcgggtc tgcagtg 527
<210> 2
<211> 1305
<212> DNA
<213> 铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)
<400> 2
ccttgcggtt agactagcta cttctggagc aacccactcc catggtgtga cgggcggtgt 60
gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgtga cattctgatt cacgattact agcgattccg 120
acttcacgca gtcgagttgc agactgcgat ccggactacg atcggtttta tgggattagc 180
tccacctcgc ggcttggcaa ccctttgtac cgaccattgt agcacgtgtg tagccctggc 240
cgtaagggcc atgatgactt gacgtcatcc ccaccttcct ccggtttgtc accggcagtc 300
tccttagagt gcccacccga ggtgctggta actaaggaca agggttgcgc tcgttacggg 360
acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacagcca tgcagcacct gtgtctgagt 420
tcccgaaggc accaatccat ctctggaaag ttctcagcat gtcaaggcca ggtaaggttc 480
ttcgcgttgc ttcgaattaa accacatgct ccaccgcttg tgcgggcccc cgtcaattca 540
tttgagtttt aaccttgcgg ccgtactccc caggcggtcg acttatcgcg ttagctgcgc 600
cactaagatc tcaaggatcc caacggctag tcgacatcgt ttacggcgtg gactaccagg 660
gtatctaatc ctgtttgctc cccacgcttt cgcacctcag tgtcagtatc agtccaggtg 720
gtcgccttcg ccactggtgt tccttcctat atctacgcat ttcaccgcta cacaggaaat 780
tccaccaccc tctaccgtac tctagctcag tagttttgga tgcagttccc aggttgagcc 840
cggggatttc acatccaact tgctgaacca cctacgcgcg ctttacgccc agtaattccg 900
attaacgctt gcacccttcg tattaccgcg gctgctggca cgaagttagc cggtgcttat 960
tctgttggta acgtcaaaac agcaaggtat taacttactg cccttcctcc caacttaaag 1020
tgctttacaa tccgaagacc ttcttcacac acgcggcatg gctggatcag gctttcgccc 1080
attgtccaat attccccact gctgcctccc gtaggagtct ggaccgtgtc tcagttccag 1140
tgtgactgat catcctctca gaccagttac ggatcgtcgc cttggtaggc ctttacccca 1200
ccaactagct aatccgacct aggctcatct gatagcgtga ggtccgaaga tcccccactt 1260
tctccctcag gacgtatgcg gtattagcgc ccgtttccgg acgtt 1305

Claims (6)

1.一种海洋细菌(Microbacterium oleivorans)40DY182，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期2018年7月13日，保藏编号GDMCC No：60414，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编510075。
2.一种权利要求1所述海洋细菌40DY182在制备去甲哈尔满中的应用，其特征在于式(Ⅰ)所示去甲哈尔满按如下方法制备：
(1)将海洋细菌(Microbacterium oleivorans)GDMCC No：60414经发酵培养获得的发酵液过滤除去菌体，滤液加入等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯相减压浓缩至干，得到粗提物；
(2)将步骤(1)粗提物利用高效液相制备色谱分离，选择甲醇-水作为洗脱溶剂，0～30min从10％到100％线性梯度增加甲醇，分别收集0-6min、6-12min、12-16min、16-20min、20-25min、25-30min流出液，得到6个馏分，分别标记为流出液A、流出液B、流出液C、流出液D、流出液E、流出液F；
(3)取步骤(2)流出液E利用高效液相制备色谱分离，选择甲醇-水作为洗脱溶剂，0～30min从30％到100％线性梯度增加甲醇，分别收集0-7min、7-14min、14-18min、18-25min、25-30min流出液，得到5个馏分，分别标记为流出液A1、流出液B1、流出液C1、流出液D1、流出液E1；
(4)取步骤(3)流出液A1利用高效液相制备色谱进一步纯化，选择甲醇-水作为洗脱溶剂，0～135min从20％到100％线性梯度增加甲醇浓度，收集22min出现的峰，并浓缩至干，得到式(Ⅰ)所示化合物；
Figure FDA0003305701860000011
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(2)高效液相制备色谱柱：PhenomenexUSA,Luna 10μm C18，250*21.2mm；流动相：甲醇-水；流速：5mL/min；检测波长：210nm；进样量1mL，粗提取物的浓度100mg/mL。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于步骤(3)高效液相制备色谱柱：AgilentEclipse XDB-C18 5μm 250*9.4mm；流动相：甲醇-水；流速：2mL/min；检测波长：210nm；进样量20μL，组分E的浓度20mg/mL。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于步骤(4)高效液相制备色谱柱：AgilentEclipse XDB-C18 5μm 250*9.4mm；流动相：甲醇-水；流速：2mL/min；检测波长：210nm；进样量20μL，组分A1浓度20mg/mL。
6.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述发酵液的制备方法为：将海洋细菌GDMCCNo：60414接种至斜面YP海水固体培养基，在30℃恒温培养箱中培养过夜，获得斜面菌体；YP海水固体培养基：酵母提取物1g/L，蛋白胨5g/L，海盐22.5g/L，琼脂15g/L，溶剂为去离子水，121℃，灭菌20min；
再将斜面菌体接种至YP海水液体培养基，在30℃恒温摇床中，180rpm振荡培养过夜，获得种子液；YP海水培养基：酵母提取物1g/L，蛋白胨5g/L，海盐22.5g/L，溶剂为去离子水，121℃，灭菌20min；
将种子液以体积浓度2.5％的接种量接种至YP海水液体培养基中，30℃、压力0.1MPa培养，获得发酵液。
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