CN110452940A - 一种链霉菌的次级代谢产物的分离提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于代谢产物提取技术领域，公开了一种链霉菌的次级代谢产物的分离提取方法，利用HP‑20树脂柱洗脱发酵液、硅胶柱和Sephadex LH‑20凝胶柱层析分离、(半)制备高效液相分析与纯化化合物；运用现代仪器波谱分析技术如核磁共振、高分辨质谱等对单体化合物进行结构鉴定。本发明将从土样中分离得到的具有抗菌及抗肿瘤细胞活性的放线菌进行发酵，对其产生的代谢产物和部分产物生物活性进行归纳研究，丰富了微生物化合物多样性；为其他放线菌产活性物质的研究与发掘提供了参考与理论基础；同时，也为探索开发活性天然化合物及商业用药提供了前提。

Description

一种链霉菌的次级代谢产物的分离提取方法
技术领域
本发明属于代谢产物提取技术领域，尤其涉及一种链霉菌的次级代谢产物的分离提取方法。
背景技术
目前，最接近的现有技术：
由于抗生素的滥用以及抗药性菌株的不断出现，以及临床上使用的抗癌药及抗生素60％～70％均出自或来源于其前体天然产物，使得人们一直致力于发掘寻找新型活性物质，而放线菌是公认的产生活性物质微生物中最大的类群，也是研究较多的一类，但由于研究手段和方法的限制，分离到的放线菌仅占土壤中所有放线菌的10％。其中产生物活性物质尤其是抗生素的链霉菌占了众多放线菌的一半，且广泛应用于医药和农业领域，然而不同菌株在产化合物上有所差异。一直以来从具有抗菌抗肿瘤活性放线菌中发现具有结构新颖的化合物屡见不鲜。
综上所述，现有技术存在的问题是：从微生物中分离结构新颖的活性化合物越来越难，亟需开发能够更快更准备分离鉴定新颖化合物的方法。
发明内容
针对现有技术存在的问题，探索与研究具有结构新颖的天然产物，为研发新型的、种类更多的前导药物提供可靠参考与依据，本发明提供了一种链霉菌的次级代谢产物的分离提取方法。
本发明是这样实现的，一种链霉菌的次级代谢产物的分离提取方法，包括以下步骤：
步骤一，发酵培养：按接种量5％(V/V)，将培养24–48h种子培养基接种到20L摇瓶发酵的发酵培养基；装量为250mL/1L摇瓶，28℃，250rpm摇瓶发酵培养7d。
步骤二，将发酵后的20L发酵液通过真空抽滤，使得菌丝体和上清液分离，分开后的菌体用3L去离子水冲洗；再用3L乙醇室温搅拌浸泡12h后离心，取上清液。
步骤三，将HP-20树脂装入树脂柱，上清液加入到HP-20树脂柱进行动态吸附2次；吸附后用5L去离子水去除树脂上多余糖分，6L乙醇洗脱树脂，得到乙醇洗脱液。
步骤四，浸提液和乙醇洗脱液分别在55℃下浓缩至干；取浓缩样品少量溶解，TLC薄层层析；将两份浓缩样混合在一起，得到总发酵粗提取膏体24.6g。
步骤五，将步骤四所得发酵粗提物经100-200目硅胶柱层析，以氯仿/甲醇梯度洗脱，TLC薄层层析检测。
步骤六，将相似流份合并浓缩后，进行LH-20凝胶柱层析，以甲醇/氯仿进行洗脱，经TLC薄层层析检测，再浓缩。
步骤七，样品通过制备高效液相、半制备高效液相反向色谱进行化合物分离纯化，得7个化合物。
进一步，所述步骤一种子培养基组分及pH包括：Yeast Extract 0.4％，MaltExtract 1.0％，葡萄糖0.4％，可溶性淀粉2.0％，ISP3/ISP4微液1.0ml/L，CaCO30.2％，pH7.2-7.4。
进一步，所述发酵培养基组分及pH包括：可溶性淀粉2％，棉籽饼粉1％，YeastExtract 0.5％，麦芽糊精2.0％，Malt Extract 0.5％，CaCO3 0.2％，MgSO4·7H2O 0.2％，NaCl 0.2％，pH 7.0-7.2。
进一步，所述步骤三树脂柱规格为8×120cm，装量为1L。
进一步，所述步骤五氯仿/甲醇为100:0/50:50，v/v；所述步骤六甲醇/氯仿均为1:1，v/v。
进一步，所述步骤七化合物1-7的HPLC分离条件如表1所示：
表1化合物1-7的HPLC分离条件
本发明的另一目的在于提供由所述链霉菌的次级代谢产物的分离提取方法提取的化合物，其特征在于，所述化合物分子式为C17H25NO4，是戊二酰亚胺类化合物；无色油状物质，紫外吸收UV(EtOH)λmax nm(logε):230(4.06)，比旋光度红外吸收IR(KBr)表明含有3349cm-1，酰亚胺基2930cm-1，HR-ESI-MS m/z 308.1857[M+H]+，分子量为307Da。
进一步，所述化合物的1H-NMR(400MHz，in CDCl3)谱给出5个烯族质子信号[δH5.22(1H,d,J＝9.7Hz)、δH 5.55m,δH 5.83(1H,d,J＝11.7Hz),δH6.26(1H,d,J＝15.56Hz),δH 6.84m]；1个烯甲基质子信号[δH 1.87(3H,s)]；2个脂肪族双峰甲基信号[δH 1.20(3H,d,J＝6.8Hz)，δH 1.77(3H,d,J＝1.5Hz)]。13C NMR和DEPT135谱给出了17个碳信号，它们分别为1个羰基碳信号(δC200.1)，2个酰胺羰基碳信号(δC 175.4,175.9),5个sp2次甲基碳信号(δC125.1,128.5,130.6,133.0,143.6)，1个sp2季碳信号(δC 135.1)，3个亚甲基碳信号(δC37.1,38.2,39.6)，3个甲基碳信号(δC 14.7,16.4,17.2)。
进一步，所述化合物通过在H-3′/H2-1/H-2,H-8/H-9/H3-10的1H-1H COSY相关性证明了C-3′到C-2和C-8到C-10三个结构单元，从H-2,H-6到C-4，从H3-11到C-4,C-5,C-6，从H3-12到C-6,C-7,C-8的HMBC信号可以确定C-3′–C-10的信号连接。两个酰胺羰基碳(δC 175.4,δC 175.9)和四个质子对亚甲基信号δH 2.33(1H,m),2.34(1H,m),2.42(1H,m),2.46(1H,m)存在HMBC信号，同时，这四个质子对亚甲基信号δH 2.33(1H,m),2.34(1H,m),2.42(1H,m),2.46(1H,m)和δH 2.33(1H,m)存在1H-1H COSY信号；
1H NMR(400MHz,CDCl3)数据δ6.84(1H,，m)；6.26(1H,d,J＝15.56Hz)；5.83(1H,d,J＝11.7Hz)；5.55(1H,m)；5.22(1H,d,J＝9.7Hz)；3.60(1H,m)；2.55(1H,d,J＝5.7Hz)；2.46(1H,m)；2.42(1H,m)；2.34(1H,m)；2.33(3H,m)；1.87(3H,s)；1.77(3H,d,J＝1.5Hz)；1.20(3H,d,J＝6.8Hz)；
13C-NMR(100MHz,in CDCl3)数据δ200.1(C–4)；175.9(C–5′)；175.4(C–1′)；143.6(C–2)；135.1(C–7)；133.0(C–6)；130.6(C–3)；128.5(C–8)；125.1(C–9)；45.0(C–5)；39.6(C–2′)；38.2(C–4′)；37.1(C–1)；32.0(C–3′)；17.2(C–12)；16.4(C–11)；14.7(C–10)。
本发明的另一目的在于提供一种由所述化合物制备的抗肿瘤活性的化合物。
本发明的另一目的在于提供一种由权利要求6～8任意一项所述化合物制备的抗病毒的化合物。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明快速准确的分离并鉴定了获得的化合物，丰富了微生物天然化合物多样性。为其他放线菌产活性物质的研究与发掘提供了参考与理论基础，同时，也为探索开发活性天然化合物及商业用药提供了前提。
附图说明
图1是本发明实施例提供的链霉菌的次级代谢产物的分离提取方法流程图。
图2是本发明实施例提供的化合物4的关键1H-1H COSY和HMBC相关谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种链霉菌的次级代谢产物的分离提取方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的链霉菌的次级代谢产物的分离提取方法包括以下步骤：
S101：发酵培养：按接种量5％(V/V)，将培养24–48h种子培养基接种到20L摇瓶发酵的发酵培养基；装量为250mL/1L摇瓶，28℃，250rpm摇瓶发酵培养7d。
S102：将发酵后的20L发酵液通过真空抽滤，使得菌丝体和上清液分离，分开后的菌体用去离子水(3L)冲洗；再用乙醇(3L)室温搅拌浸泡12h后离心，取上清液。
S103：将HP-20树脂装入树脂柱(规格为8×120cm，装量为1L)，上清液加入到HP-20树脂柱进行动态吸附2次；吸附后用5L去离子水去除树脂上多余糖分，乙醇(6L)洗脱树脂，得到乙醇洗脱液。
S104：浸提液和乙醇洗脱液分别在55℃下浓缩至干；取浓缩样品少量溶解，TLC薄层层析；将两份浓缩样混合在一起，得到总发酵粗提取膏体24.6g。
S105：将步骤四所得发酵粗提物经100-200目硅胶柱层析，以氯仿/甲醇(＝100:0/50:50，v/v)梯度洗脱，TLC薄层层析检测。
S106：将相似流份合并浓缩后，进行LH-20凝胶柱层析，以甲醇/氯仿(1:1，v/v)进行洗脱，经TLC薄层层析检测，再浓缩。
S107：样品通过制备高效液相、半制备高效液相反向色谱进行化合物分离纯化，得7个化合物。
进一步，所述S101种子培养基组分及pH包括：Yeast Extract 0.4％，MaltExtract 1.0％，葡萄糖0.4％，可溶性淀粉2.0％，ISP3/ISP4微液1.0ml/L，CaCO30.2％，pH7.2-7.4。
进一步，所述发酵培养基组分及pH包括：可溶性淀粉2％，棉籽饼粉1％，YeastExtract 0.5％，麦芽糊精2.0％，Malt Extract 0.5％，CaCO3 0.2％，MgSO4·7H2O 0.2％，NaCl 0.2％，pH 7.0-7.2。
进一步，所述S103树脂柱规格为8×120cm，装量为1L。
进一步，所述S105氯仿/甲醇为100:0/50:50，v/v；所述S106甲醇/氯仿为1:1，v/v。
进一步，所述S107化合物1-7的HPLC分离条件如表1所示：
表1化合物1-7的HPLC分离条件
进一步，运用核磁共振NMR和高分辨质谱HRESIMS，旋光，红外光谱IR和紫外光谱UV等现代仪器分析技术对得到单体化合物1-7进行结构鉴定，结果显示：化合物4为新化合物，其余均为已知化合物。
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。
1、仪器与材料
超净工作台YJ-875形(苏州净化设备厂)，37℃，5％CO2恒温培养箱(德国BinDer公司)，摇床(New Brunswick Scientific)，恒温恒湿培养箱(德国Binder公司)，pH计(上海精密科学仪器有限公司)，薄层层析硅胶板(烟台市化学工业研究所)，YB102电子天平(上海海康电子仪器厂)，Diaion HP-20树脂(Mitsubishi Chemical Corporation)，Sephadex LH-20(GE Healthcare)，旋转蒸发仪(日本EYELA公司)，半制备形液相色谱仪(Agilent 1100,Zorbax SB-C18,5μm,250x 9.4mmi.d)，制备形液相色谱仪(Shimadzu LC-8A,Shimadzu-C18,5μm,250x 20mmi.d)，超导核磁共振仪(Bruker DRX-400)。色谱用试剂购自美国Fisher公司，其他试剂为市售分析纯。
菌株是放线菌属Streptomyces sp.TZ16，购买编号ATCC 39077。供试指示菌菌株菌(白色念珠菌(Candia albicans)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、大豆菌核致病菌(Sclerotinia sclerotiorum))来自台州职业技术学院。
2、发酵培养
按接种量5％(V/V)，将培养24–48h种子培养基(Yeast Extract 0.4％，MaltExtract 1.0％，葡萄糖0.4％，可溶性淀粉2.0％，ISP3/ISP4微液1.0ml/L，CaCO3 0.2％，pH7.2-7.4)接种到20L摇瓶发酵的发酵培养基(可溶性淀粉2％，棉籽饼粉1％，Yeast Extract0.5％，麦芽糊精2.0％，Malt Extract 0.5％，CaCO30.2％，MgSO4·7H2O 0.2％，NaCl0.2％，pH 7.0-7.2)，装量为250mL/1L摇瓶，28℃，250rpm摇瓶发酵培养7d。
3、分离与提取
将发酵后的20L发酵液通过真空抽滤，使得菌丝体和上清液分离，分开后的菌体用去离子水(3L)冲洗，再用乙醇(3L)室温搅拌浸泡12h后离心，取上清。将HP-20树脂装入树脂柱(规格为8×120cm，装量为1L)，上清液加入到HP-20树脂柱进行动态吸附2次，吸附后用5L去离子水去除树脂上多余糖分，乙醇(6L)洗脱树脂，得到乙醇洗脱液。浸提液和乙醇洗脱液分别在55℃下浓缩至干，取浓缩样品少量溶解，TLC薄层层析，结果显示两份样品主点大体一致，因此将两份浓缩样混合在一起，得到总发酵粗提取膏体24.6g。
将发酵粗提物(24.6g)经硅胶(100-200目)柱层析，以氯仿/甲醇(＝100:0/50:50，v/v)梯度洗脱，TLC薄层层析检测，将相似流份合并浓缩后，进行LH-20凝胶柱层析(直径5.2cm，柱高120cm)，以甲醇/氯仿(1:1，v/v)进行洗脱，经TLC薄层层析检测，再浓缩，样品通过制备高效液相、半制备高效液相反向色谱进行化合物分离纯化(分离制备条件见表1)，得7个化合物。
表1化合物1-7的HPLC分离条件
4、结构鉴定
运用核磁共振NMR和高分辨质谱HRESIMS，旋光，红外光谱IR和紫外光谱UV等现代仪器分析技术对得到单体化合物进行结构确定。对于简单常见鉴定化合物，可将其与已知类似化合物的1H-NMR数据图谱对比，质谱分析便可初步推断该化合物结构，分子式等。不常见图谱结构，通过核磁共振NMR进行DEPT135，1H-1H COSY，HSQC，HMBC，NOESY信号扫描、全谱分析，结合高分辨质谱MS，旋光度，IR和UV对化合物进行结构鉴定，推断其分子量及分子式，继而确定化合物结构，SciFinder Scholar检索，可以确定化合物是否是结构新颖化合物。化合物名称、分子式与结构见表2。
表2化合物1-7名称、分子式与结构
化合物1：分子式为C17H25NO5，无色油状物质，紫外吸收UV(EtOH)λmax nm(logε):276nm(4.10)，比旋光度(c 0.03,EtOH)；红外吸收IR(KBr)表明存在羟基(3419cm-1)和羰基(1684cm-1)。HR-ESI-MS m/z 346.1625[M+Na]+；分子量为323Da。1H NMR(400MHz,CDCl3)数据δ7.06(1H,s)；6.99(1H,s)；5.63(1H,d,J＝8.2Hz)；4.66(2H,m)；4.20(1H,m)；2.98(1H,dd，J＝16.2Hz,7.6Hz)；2.81(1H,dd，J＝16.2Hz,4.6Hz)；2.75(1H,m)；2.68(1H,m)；2.38(2H,m)；2.36(1H,m)；1.95(3H,s)；1.92(3H,s)；1.56(1H,m)；1.51(1H,m)；1.28(3H,d,J＝6.3Hz)；
13C-NMR(100MHz,in CDCl3)数据δ203.2(C–4)；175.6(C–1’)；175.5(C–5′)；144.7(C–6)；140.4(C–8)；137.2(C–5)；133.5(C–7)；66.8(C–2)；65.2(C–9)；46.3(C–3)；42.9(C–1)；39.2(C–4′)；38.0(C–2′)；28.7(C–3′)；23.4(C–10)；16.7(C–12)；13.2(C–11)。该化合物的1H和13C NMR数据与文献《Two new glutarimide antibiotics from Streptomycessp.HS-NF-780》中化合物hydroxyiso-9-methylstreptimidone核磁数据进行对比发现基本一致，确定为戊二酰亚胺类化合物。
化合物2:分子式C17H25NO4，浅黄色油状物质；ESI-MS(positive)m/z 307.99[M-H]-；分子量307Da。1H NMR(400MHz,CDCl3)数据δ5.74(1H,d，J＝11.7Hz)；5.42(1H,m)；5.12(1H,d,J＝19.6Hz)；4.08(1H，m)；3.62(1H，m)；2.70(2H，m)；2.64(1H，m)；2.55(1H，m)；2.40(1H，m)；2.24(2H，m)；1.80(3H,d,J＝1.2Hz)；1.72(3H,dd,J＝7.2,1.7Hz)；1.54(1H，m)；1.29(1H，m)；1.11(3H,d,J＝6.8Hz)。综上数据，解析出化合物2的结构，通过SciFinderScholar检索，化合物的13C-NMR和1H-NMR谱核磁数据与已知报道文献《Isolation,structure determination and biological activity of a new glutarimideantibiotic，S632A3》中化合物9-methylstreptimidone的核磁数据基本一致。
化合物3：分子式C23H35NO9，无色油状物质，紫外吸收UV(EtOH)λmax nm(logε):233(4.02)，比旋光度(c 0.03,EtOH)；红外吸收IR(KBr)表明存在羟基(3447cm-1)，酰亚胺(3197cm-1)和羰基(1689cm-1)。高分辩质谱图HR-ESI-MS m/z 492.2207[M+Na]+，分子量为469Da。1H NMR(400MHz,CDCl3)数据δ5.82(1H,br d,J＝11.6Hz)；5.48(1H,m)；5.19(1H,br d,J＝9.8Hz)；4.87(1H,d,J＝3.9Hz)；4.19(1H,m)；3.78(1H,dd,J＝11.9,2.1Hz)；3.64(1H,dd,J＝11.9,5.3Hz)；3.57(1H,m)；3.55(1H,m)；3.52(1H,m)；3.34(1H,m)；3.27(1H,t,J＝12.4Hz)；2.96(1H,dd,J＝17.6,4.6Hz)；2.77(1H,m)；2.72(1H,dd,J＝17.6,7.5Hz)；2.60(1H,m)；2.35(1H,m)；2.31(2H,m)；1.86(3H,d,J＝1.2Hz)；1.77(3H,dd,J＝7.2,2.6Hz)；1.73(1H,m)；1.50(1H,m)；1.14(3H,d,J＝6.8Hz)。
13C-NMR(100MHz,in CDCl3)数据δ212.1(C–4)；175.4(C–1′，5′)；136.7(C–7)；134.1(C–8)；129.7(C–6)；125.8(C–9)；99.1(C–1″)；75.0(C–5″)；74.5(C–4″)；73.2(C–2″)；72.6(C–2)；71.6(C–3″)；62.5(C–6″)；48.2(C–5)；44.8(C–3)；41.4(C–1)；39.2(C–2′)；37.9(C–4′)；28.2(C–3′)；17.5(C–12)；16.7(C–11)；15.0(C–10)。
综上所述，经SciFinder网络检索，发现该化合物的1H和13C NMR数据与文献《Twonew glutarimide antibiotics from Streptomyces sp.HS-NF-780》中化合物9-methylstreptimidone 2-α-D-glucopyranoside核磁数据基本一致，为连接糖基的戊二酰亚胺类化合物，确定戊二酰亚胺类化合物。
化合物:4：分子式为C17H25NO4，无色油状物质，紫外吸收UV(EtOH)λmax nm(logε):230(4.06)，比旋光度(c 0.03,EtOH)；红外吸收IR(KBr)表明含有(3349cm-1)，酰亚胺基(2930cm-1)，HR-ESI-MS m/z 308.1857[M+H]+，分子量为307Da。
化合物4的1H-NMR(400MHz，in CDCl3)谱给出5个烯族质子信号[δH 5.22(1H,d,J＝9.7Hz)、δH 5.55m,δH 5.83(1H,d,J＝11.7Hz),δH 6.26(1H,d,J＝15.56Hz),δH 6.84m]；1个烯甲基质子信号[δH 1.87(3H,s)]；2个脂肪族双峰甲基信号[δH 1.20(3H,d,J＝6.8Hz)，δH1.77(3H,d,J＝1.5Hz)]。13C NMR和DEPT135谱给出了17个碳信号，它们分别为1个羰基碳信号(δC 200.1)，2个酰胺羰基碳信号(δC 175.4,175.9),5个sp2次甲基碳信号(δC 125.1,128.5,130.6,133.0,143.6)，1个sp2季碳信号(δC 135.1)，3个亚甲基碳信号(δC 37.1,38.2,39.6)，3个甲基碳信号(δC 14.7,16.4,17.2)。
化合物4通过在H-3′/H2-1/H-2,H-8/H-9/H3-10的1H-1H COSY相关性证明了C-3′到C-2和C-8到C-10三个结构单元，从H-2,H-6到C-4，从H3-11到C-4,C-5,C-6，从H3-12到C-6,C-7,C-8的HMBC信号可以确定C-3′–C-10的信号连接。两个酰胺羰基碳(δC 175.4,δC 175.9)和四个质子对亚甲基信号δH 2.33(1H,m),2.34(1H,m),2.42(1H,m),2.46(1H,m)存在HMBC信号，同时，这四个质子对亚甲基信号δH 2.33(1H,m),2.34(1H,m),2.42(1H,m),2.46(1H,m)和δH 2.33(1H,m)存在1H-1H COSY信号。
1H NMR(400MHz,CDCl3)数据δ6.84(1H,，m)；6.26(1H,d,J＝15.56Hz)；5.83(1H,d,J＝11.7Hz)；5.55(1H,m)；5.22(1H,d,J＝9.7Hz)；3.60(1H,m)；2.55(1H,d,J＝5.7Hz)；2.46(1H,m)；2.42(1H,m)；2.34(1H,m)；2.33(3H,m)；1.87(3H,s)；1.77(3H,d,J＝1.5Hz)；1.20(3H,d,J＝6.8Hz)。
13C-NMR(100MHz,in CDCl3)数据δ200.1(C–4)；175.9(C–5′)；175.4(C–1′)；143.6(C–2)；135.1(C–7)；133.0(C–6)；130.6(C–3)；128.5(C–8)；125.1(C–9)；45.0(C–5)；39.6(C–2′)；38.2(C–4′)；37.1(C–1)；32.0(C–3′)；17.2(C–12)；16.4(C–11)；14.7(C–10)。
综上数据，解析出化合物4的结构，通过SciFinder检索，未发现该化合物的相关报道，表明这是一个新的戊二酰亚胺类化合物，命名为：(5E,9E,11E)-3-(2-amino-2-oxoethyl)-8,10-dimethyl-7-oxotrideca-5,9,11-trienoic acid。
化合物5：分子式C17H25NO5，浅黄色油状物质；ESI-MS m/z 322.12[M-H]-，分子量为323Da。1H-NMR(400MHz,CD3OD)数据δ5.29(1H,dm,J＝9.8,1.3Hz)；4.09(1H，m)；3.42(1H,dq,J＝9.8,6.8Hz)；3.35(1H,dd,J＝4.2,1.3Hz)；3.19(1H,dq,J＝4.2,5.3Hz)；2.76(2H，m)；2.54(2H,d,J＝5.3Hz)；2.48(1H，m)；2.31(2H，m)；1.74(3H,dd,J＝1.3Hz)；1.58(1H,ddd,J＝13.9,10.5,4.8Hz)；1.30(1H,ddd,J＝13.9,8.7,2.6Hz)；1.18(3H,d,J＝6.8Hz)；1.12(3H,d,J＝5.3Hz)；
根据1H-NMR和ESI-MS图谱解析出化合物5的结构，通过SciFinder Scholar检索，与文献《New glutarimide antibiotics，S-632-B1 and B2.I.Taxonomy of producingstrain，fermentation and biological properties》中化合物进行数据对比，确定化合物5为已知的戊二酰亚胺类化合物。
化合物6：分子式C17H25NO5，为无色油状物质；ESI-MS m/z 322[M-H]-，分子量为323Da。
1H-NMR(400MHz,CD3OD)数据δ6.94(1H,d,J＝10.0Hz)；5.66(1H,d,J＝7.8Hz)；4.62(1H，m)；4.48(1H,d,J＝6.3,5.1Hz)；3.18(1H,dd,J＝18.0,6.5Hz)；2.88(1H,dd,J＝18.0,5.6Hz)；2.67(1H,dd,J＝16.0,6.0Hz)；2.61(1H,m)；2.34(2H,d,J＝7.1Hz)；2.33(1H,dd,J＝16.0,8.0Hz)；1.82(2H，t,J＝6.7Hz)；1.69(3H,s)；1.64(3H,s)；1.57(3H,s)。根据1H-NMR和ESI-MS图谱解析出化合物的结构，通过SciFinder Scholar检索发现为已知的戊二酰亚胺类化合物2-(2-((3E,5E)-7-hydroxy-3,5-dimethyl-2-oxoocta-3,5-dien-1-yl)-6-oxotetrahydro-2H-pyran-4-yl)acetamide，且与文献《Two new glutarimideantibiotics from Streptomyces sp.HS-NF-780》、《Isolation,structuredetermination and biological activities of a novel antifungal antibiotic,S-632-C,closely related to glutarimide antibiotics》中化合物相似。
化合物7：分子式C14H16N2O3，无色无定型固体；ESI-MS m/z 261[M+H]+，分子量为260Da。1H-NMR(400MHz,acetone-d6)数据δ7.08(1H,s)；7.06(1H,s)；6.74(1H,s)；6.72(1H,s)；6.11(1H,s)；4.22(1H,dd,J＝2.9,9.6Hz)；4.08(1H,m)；3.57(2H,m)；3.42(2H,dd,J＝11.0,14.0Hz)；2.32(1H,m)；1.96(1H,m)；1.85(2H,m)；根据1H-NMR和ESI-MS图谱，推导出化合物7的结构，通过SciFinder Scholar检索，发现化合物7与文献《Conformational studyof the jet-cooled diketopiperazine peptide cyclo tyrosyl-prolyl》中化合物核磁数据基本一致，为环二肽类化合物。
5、抗菌活性评价
对未曾报道抗菌活性化合物1,3,4进行白色念珠菌，表皮葡萄球菌，大豆菌核的生长活性抑制试验，结果显示化合物1对大豆菌核致病菌表现出一定的抑菌活性，对白色念珠菌表现出微弱的抑菌活性；化合物3对表皮葡萄球菌表现出微弱的抑菌活性。化合物4对白色念珠菌及大豆菌核致病菌表现出一定的抑菌活性，抑菌活性结果见表3。
表3化合物1,3,4的抑菌活性
注：“-”表示无活性
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种链霉菌的次级代谢产物的分离提取方法，其特征在于，所述链霉菌的次级代谢产物的分离提取方法包括以下步骤：
步骤一，按接种量5％V/V，将培养24–48h种子培养基接种到20L摇瓶发酵的发酵培养基；装量为250mL/1L摇瓶，28℃，250rpm摇瓶发酵培养7d；
步骤二，将发酵后的20L发酵液通过真空抽滤，使得菌丝体和上清液分离，分开后的菌体用3L去离子水冲洗；再用3L乙醇室温搅拌浸泡12h后离心，取上清液；
步骤三，将HP-20树脂装入树脂柱，上清液加入到HP-20树脂柱进行动态吸附2次；吸附后用5L去离子水去除树脂上多余糖分，6L乙醇洗脱树脂，得到乙醇洗脱液；
步骤四，浸提液和乙醇洗脱液分别在55℃下浓缩至干；取浓缩样品少量溶解，TLC薄层层析；将两份浓缩样混合在一起，得到总发酵粗提取膏体24.6g；
步骤五，将步骤四所得发酵粗提物经100-200目硅胶柱层析，以氯仿/甲醇梯度洗脱，TLC薄层层析检测；
步骤六，将相似流份合并浓缩后，进行LH-20凝胶柱层析，以甲醇/氯仿进行洗脱，经TLC薄层层析检测，再浓缩；
步骤七，样品通过制备高效液相、半制备高效液相反向色谱进行化合物分离纯化，得7个化合物。
2.如权利要求1中所述的链霉菌的次级代谢产物的分离提取方法，其特征在于，所述步骤一种子培养基组分及pH包括：Yeast Extract 0.4％，Malt Extract 1.0％，葡萄糖0.4％，可溶性淀粉2.0％，ISP3/ISP4微液1.0ml/L，CaCO3 0.2％，pH 7.2-7.4；
所述发酵培养基组分及pH包括：可溶性淀粉2％，棉籽饼粉1％，Yeast Extract 0.5％，麦芽糊精2.0％，Malt Extract 0.5％，CaCO3 0.2％，MgSO4·7H2O 0.2％，NaCl 0.2％，pH7.0-7.2。
3.如权利要求1中所述的链霉菌的次级代谢产物的分离提取方法，其特征在于，所述步骤三树脂柱规格为8×120cm，装量为1L。
4.如权利要求1中所述的链霉菌的次级代谢产物的分离提取方法，其特征在于，所述步骤五氯仿/甲醇为100:0/50:50，v/v；所述步骤六甲醇/氯仿均为1:1，v/v。
5.如权利要求1中所述的链霉菌的次级代谢产物的分离提取方法，其特征在于，所述步骤七化合物1-7的HPLC分离条件：
化合物1，乙腈25％，水75％，检测波长220nm，流速1.5ml/min，保留时间20.06min，重量23.5mg；
化合物2，乙腈30％，水70％，检测波长220nm，流速1.5ml/min，保留时间24.68min，重量18.0mg；
化合物3，乙腈25％，水75％，检测波长220nm，流速1.5ml/min，保留时间20.13min，重量20.4mg；
化合物4，乙腈40％水60％，检测波长220nm，流速1.5ml/min，保留时间26.02min，重量14.2mg；
化合物5，乙腈30％，水70％，检测波长220nm，流速1.5ml/min，保留时间22.79min，重量15.6mg；
化合物6，乙腈20％，水80％，检测波长220nm，流速1.5ml/min，保留时间25.57min，重量10.2mg；
化合物7，乙腈35％，水65％，检测波长220nm，流速1.5ml/min，保留时间25.68min，重量5.8mg。
6.一种由权利要求1～5任意一项所述链霉菌的次级代谢产物的分离提取方法提取的化合物，其特征在于，所述化合物分子式为C17H25NO4，是戊二酰亚胺类化合物；无色油状物质，紫外吸收UV(EtOH)λmax nm(logε):230(4.06)，比旋光度红外吸收IR(KBr)表明含有3349cm-1，酰亚胺基2930cm-1，HR-ESI-MSm/z 308.1857[M+H]+，分子量为307Da。
7.如权利要求6所述的化合物，其特征在于，所述化合物的1H-NMR(400MHz，in CDCl3)谱给出5个烯族质子信号[δH 5.22(1H,d,J＝9.7Hz)、δH 5.55m,δH 5.83(1H,d,J＝11.7Hz),δH6.26(1H,d,J＝15.56Hz),δH 6.84m]；1个烯甲基质子信号[δH 1.87(3H,s)]；2个脂肪族双峰甲基信号[δH 1.20(3H,d,J＝6.8Hz)，δH 1.77(3H,d,J＝1.5Hz)]；13C NMR和DEPT135谱给出了17个碳信号，它们分别为1个羰基碳信号(δC 200.1)，2个酰胺羰基碳信号(δC 175.4,175.9),5个sp2次甲基碳信号(δC 125.1,128.5,130.6,133.0,143.6)，1个sp2季碳信号(δC135.1)，3个亚甲基碳信号(δC 37.1,38.2,39.6)，3个甲基碳信号(δC 14.7,16.4,17.2)。
8.如权利要求6所述的化合物，其特征在于，所述化合物通过在H-3′/H2-1/H-2,H-8/H-9/H3-10的1H-1H COSY相关性证明了C-3′到C-2和C-8到C-10三个结构单元，从H-2,H-6到C-4，从H3-11到C-4,C-5,C-6，从H3-12到C-6,C-7,C-8的HMBC信号可以确定C-3′–C-10的信号连接；两个酰胺羰基碳(δC 175.4,δC 175.9)和四个质子对亚甲基信号δH 2.33(1H,m),2.34(1H,m),2.42(1H,m),2.46(1H,m)存在HMBC信号，同时，这四个质子对亚甲基信号δH 2.33(1H,m),2.34(1H,m),2.42(1H,m),2.46(1H,m)和δH 2.33(1H,m)存在1H-1H COSY信号；
1H NMR(400MHz,CDCl3)数据δ6.84(1H,，m)；6.26(1H,d,J＝15.56Hz)；5.83(1H,d,J＝11.7Hz)；5.55(1H,m)；5.22(1H,d,J＝9.7Hz)；3.60(1H,m)；2.55(1H,d,J＝5.7Hz)；2.46(1H,m)；2.42(1H,m)；2.34(1H,m)；2.33(3H,m)；1.87(3H,s)；1.77(3H,d,J＝1.5Hz)；1.20(3H,d,J＝6.8Hz)；
13C-NMR(100MHz,in CDCl3)数据δ200.1(C–4)；175.9(C–5′)；175.4(C–1′)；143.6(C–2)；135.1(C–7)；133.0(C–6)；130.6(C–3)；128.5(C–8)；125.1(C–9)；45.0(C–5)；39.6(C–2′)；38.2(C–4′)；37.1(C–1)；32.0(C–3′)；17.2(C–12)；16.4(C–11)；14.7(C–10)。
9.一种由权利要求6～8任意一项所述化合物制备的抗肿瘤活性的化合物。
10.一种由权利要求6～8任意一项所述化合物制备的抗病毒的化合物。
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