CN107488609A - 一种链霉菌及其代谢物的制备方法与应用 - Google Patents
一种链霉菌及其代谢物的制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种链霉菌及链霉菌代谢物的制备方法，链霉菌为Ah11601，保藏编号为CGMCC No.11363，链霉菌Ah11601代谢物的制备方法，主要包含以下步骤：链霉菌Ah11601的培养、链霉菌Ah11601的液体发酵、链霉菌Ah11601代谢物的制备，本发明技术方案提供了一种链霉菌，本链霉菌的代谢物对玉米小斑病菌丝生长和孢子萌发具有明显的抑制作用，可以将本链霉菌的代谢物用于防治玉米小斑病菌丝和孢子，避免了农药的使用，不会造成玉米内农药残留，更不会造成玉米小斑病菌的抗药性，健康环保。
Description
技术领域
本发明属于生物农药领域，更具体的说涉及一种对多种植物病原真菌具有抑菌活性的链霉菌及其代谢物的制备方法与应用。
背景技术
植物真菌病害影响农作物生长，严重可引起作物死亡，造成减产甚至绝收等重大损失。防治植物真菌病害，通常采用化学防治、培育抗病品种以及生物防治等方法。其中化学防治由于其效果快，被广泛使用，由此造成病原菌抗性增强、农药残留、环境污染等负面影响。
放线菌是一类具有复杂形态分化的革兰氏阳性细菌，广泛分布在各种环境中，其产生的农用抗生素具有高效、低残留和环境友好等优点。而链霉菌作为放线菌中最大的一个类群，是抗生素的重要生物来源。因而，从环境中分离具有农用活性的链霉菌，仍是微生物农药开发的一个重要途径和选择。
发明内容
本发明的目的在于提供一种链霉菌及其代谢物的制备方法与应用，本链霉菌代谢物对玉米小斑菌孢子具有显著抑作用。
本发明技术方案提供的一种链霉菌，为链霉菌(Streptomyces albogriseus)Ah11601，已于2015年9月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.11363。
本发明技术方案还提供链霉菌Ah11601代谢物的制备方法，主要包含以下步骤：
（1）链霉菌Ah11601的培养
使用高氏一号培养基制备试管斜面培养基，在试管斜面培养基上接种链霉菌Ah11601，于28℃环境中培养7天，至菌丝和孢子成熟；
（2）链霉菌Ah11601的液体发酵
A、链霉菌Ah11601种子液的制备：将试管斜面培养基上的孢子接入液体发酵培养基，于28℃下以120rpm的转速下培养48小时，得到链霉菌Ah11601种子液；
B、链霉菌Ah11601的发酵：将链霉菌Ah11601种子液以体积百分比10％的接种量接到新的液体发酵培养基中，于28℃下以160rpm的转速发酵96小时后，温度调整至24℃，再以120rpm的转速发酵72小时，得到链霉菌Ah11601发酵液；
（3）链霉菌Ah11601代谢物的制备
A、将链霉菌Ah11601的发酵液通过200～300目双层纱布过滤，得上清液和菌丝体；
B、将上清液分别依次充分进行微滤、超滤和纳滤，得到纳滤保留液；
C、将纳滤保留液按照1：15～20比例用大孔树脂NAK-2吸附，用比例为100：0～0：100的乙醇～水梯度洗脱，用比例为50：50的乙醇～水洗脱液减压浓缩，得到黄色膏状物；
D、将黄色膏状物通过200目硅胶柱层析进行分离，黄色膏状物与硅胶柱按照1：4～5的比例进行层析，层析后进行洗脱，洗脱液为比例2：1：1的正丁醇：冰醋酸：水的混合液，洗脱流速为1mL／min，每5mL为1个收集单位，单独收集第26～34收集单位液体；
E、通过高效液相色谱对单独收集的第26～34收集单位液体进行分析，色谱条件为色谱柱为反相C18柱，流动相为甲醇：水＝25：75，流速1mL／min，波长254nm，可见第26～34收集单位链霉菌Ah11601代谢物对玉米小班菌孢子具有显著抑制作用。
优选的，所述高氏一号培养基组成为：可溶性淀粉20g、硝酸钾1g、氯化钠0.5g、三水合磷酸氢二钾0.5g、七水硫酸镁0.05g、七水合硫酸亚铁0.01g、琼脂20g、水1000ml，调节高氏一号培养基pH 值为7.2～7.4，并置于于121℃下灭菌20min。
优选的，所述液体发酵培养基组成为：酵母粉10g、蛋白胨5g、可溶性淀粉20g、碳酸钙2g、硝酸钾2g、三水合磷酸氢二钾0.5g、七水硫酸镁0.5g、七水合硫酸亚铁0.01g、水1000ml，调节液体发酵培养基pH 值为7.2～7.4，并在121℃环境下灭菌30min。
本发明技术方案还提供链霉菌Ah11601的代谢物的应用，将步骤C中单独收集第26～34收集单位得到的链霉菌Ah11601代谢物用水稀释100倍后，直接喷洒至玉米叶上，对玉米小斑病菌丝生长和孢子萌发具有明显的抑制作用。
本发明技术有益效果：
本发明技术方案提供了一种链霉菌，本链霉菌的代谢物对玉米小斑病菌丝生长和孢子萌发具有明显的抑制作用，可以将本链霉菌的代谢物用于防治玉米小斑病菌丝和孢子，避免了农药的使用，不会造成玉米内农药残留，更不会造成玉米小斑病菌的抗药性，健康环保。
附图说明
图1是实施例1中的链霉菌Ah11601对玉米小斑菌的拮抗图，
图2是实施例1中的链霉菌Ah11601在高氏一号培养基菌丝形态及孢子形态图，
图3是实施例2中的链霉菌Ah11601发酵液对玉米小班菌孢子萌发抑制图，
图4是实施例2中的链霉菌Ah11601发酵液粗提物的紫外吸收图，
图5是实施例2中的链霉菌Ah11601发酵液活性物质液相检测图。
具体实施方式
为便于本领域技术人员理解本发明技术方案，现结合说明书附图对本发明技术方案做进一步的说明。
实施例1：链霉菌Ah11601的分离、筛选及鉴定
从安徽省萧县皇藏峪国家森林公园土壤分离的多株放线菌中，采用抑菌圈法筛选得到对玉米小斑菌有明显的抑制作用链霉菌Ah11601，对该菌株进行分类鉴定，具体如下：
（1）菌株的形态特征
将链霉菌Ah11601菌株接种于高氏一号培养基，28℃插片培养，分别在第7天、14天、28天观察菌体的形态特征，发现高氏一号培养基长势良好，菌丝体初为白色，后变为灰白，最后变为深灰色；菌落表面干燥，正反面颜色不一致；气生菌丝丰富，多分枝；基内菌丝有分支、无横隔、无断裂；孢子丝长而弯曲，孢子圆形，表面光滑。
（2）菌株的培养特征
将链霉菌Ah11601接种在高氏一号培养基、ISTP2、ISTP3、ISTP4、ISTP5、ISTP6、ISTP7培养基上，28℃培养，分别于第7天、14天、28天观察菌株在各种培养基上的培养特征、生长情况及颜色变化，取成熟期的颜色作为定种的依据。如下表1所示。
表1：
| 培养基 | 生长状况 | 气生菌丝 | 基内菌丝 | 可溶性色素 |
| 高氏一号 | ++ | 灰白色 | 浅灰色 | 无 |
| ISTP2 | ++ | 深灰色 | 灰色 | 无 |
| ISTP3 | + | 深灰色 | 灰色 | 无 |
| ISTP4 | + | 深灰色 | 灰色 | 无 |
| ISTP5 | ++ | 深灰色 | 灰色 | 无 |
| ISTP6 | +++ | 浅灰色 | 浅灰色 | 无 |
| ISTP7 | +++ | 浅灰色 | 灰色 | 无 |
上表中：“+”表示可以生长，“++”表示中等生长，“+++”表示生长很好
（3）16S rDNA序列测定及分析
链霉菌Ah11601的16S rDNA 核苷酸全序列总长为1436bp，序列如下所示：ATGCAAGTCGAACGATGAACCTCCTTCGGGAGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATATGACACGGGGTCGCATGATCTCCGTGTGGAAAGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAGTGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAGAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGATGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTGGGCGACATTCCACGTCGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAAACCGTGGAGACACGGTCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCTTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAATCGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAA
根据系统发育树及形态特征比较分析，鉴定该菌株为白浅灰链霉菌（Streptomycesalbogriseus）。
所述菌株于菌种命名为Ah11601，于2015年9月11日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号：CGMCC No.11363。
实施例2：制备对玉米小斑菌孢子有显著抑制作用的链霉菌Ah11601的代谢物
（1）链霉菌Ah11601的培养
使用高氏一号培养基制备试管斜面培养基，在试管斜面培养基上接种链霉菌Ah11601，于28℃环境中培养7天，至菌丝和孢子成熟；
其中，高氏一号培养基组成为：可溶性淀粉20g、硝酸钾1g、氯化钠0.5g、三水合磷酸氢二钾0.5g、七水硫酸镁0.05g、七水合硫酸亚铁0.01g、琼脂20g、水1000ml，调节高氏一号培养基pH 值为7.2～7.4，并置于于121℃下灭菌20min；
（2）链霉菌Ah11601的液体发酵
A、链霉菌Ah11601种子液的制备：将试管斜面培养基上的孢子接入液体发酵培养基，于28℃下以120rpm的转速下培养48小时，得到链霉菌Ah11601种子液；
其中，液体发酵培养基组成为：酵母粉10g、蛋白胨5g、可溶性淀粉20g、碳酸钙2g、硝酸钾2g、三水合磷酸氢二钾0.5g、七水硫酸镁0.5g、七水合硫酸亚铁0.01g、水1000ml，调节液体发酵培养基pH 值为7.2～7.4，并在121℃环境下灭菌30min；
B、链霉菌Ah11601的发酵：将链霉菌Ah11601种子液以体积百分比10％的接种量接到新的液体发酵培养基中，于28℃下以160rpm的转速发酵96小时后，温度调整至24℃，再以120rpm的转速发酵72小时，得到链霉菌Ah11601发酵液；
（3）链霉菌Ah11601代谢物的制备
A、将链霉菌Ah11601的发酵液通过200～300目双层纱布过滤，得上清液和菌丝体；
B、将上清液分别依次充分进行微滤、超滤和纳滤，得到纳滤保留液；
C、将纳滤保留液按照1：15～20（g/ml）比例用大孔树脂NAK-2吸附，用比例为100：0～0：100的乙醇～水梯度洗脱，用比例为50：50的乙醇～水洗脱液减压浓缩，得到黄色膏状物，即为链霉菌Ah11601发酵液的粗提物，紫外扫描发现该物质在190nm、305nm、310nm有吸收，扫描图见图4，检测发现该组分对玉米小斑菌孢子抑制作用最强，即为对玉米小斑菌孢子有显著抑制作用的链霉菌Ah11601代谢物；
D、将黄色膏状粗提物通过200目硅胶柱层析进行分离，黄色膏状粗提物与硅胶柱按照1：4～5的比例进行层析，层析后进行洗脱，洗脱液为比例2：1：1的正丁醇：冰醋酸：水的混合液，洗脱流速为1mL／min，每5mL为1个收集单位，单独收集第26～34收集单位液体，本区间内的液体对玉米小斑菌孢子有显著抑制作用；
E、通过高效液相色谱对单独收集的第26～34收集单位液体进行分析，色谱条件为色谱柱为反相C18柱，流动相为甲醇：水＝25：75，流速1mL／min，波长254nm，可见第26～34收集单位链霉菌Ah11601代谢物对玉米小班菌孢子具有显著抑制作用。
实施例3：对玉米小斑菌孢子萌发抑制实验
取链霉菌Ah11601发酵液5ml，100000r／min离心10min，上清液过0.22μm滤膜过滤，取滤液20μl滴加到凹面载玻片上，滴加玉米小斑菌孢子悬液100μl，置于保湿培养皿中，24℃培养12h，镜检休眠孢子萌发情况，重复3次，无菌水为空百对照，结果显示对玉米小斑菌孢子萌发抑制率为97.4%。
实施例4：链霉菌Ah11601代谢物应用
将步骤C中单独收集第26～34收集单位得到的链霉菌Ah11601代谢物用水稀释100倍后，直接喷洒至玉米叶上，对玉米小斑病菌丝生长和孢子萌发具有明显的抑制作用。
在说明书附图中，图1 是实施例1 中的链霉菌Ah11601对玉米小斑菌的拮抗图，图1的A中，向玉米小斑菌内接种了链霉菌Ah11601，玉米小斑菌被抑制，生长较少，而图1的B中，未向小斑菌内接种了链霉菌Ah11601，玉米小斑菌生长快速，且数量大；图2 是实施例1中的链霉菌Ah11601在高氏培养基菌丝形态及孢子形态图，图2的L、M、N中分别为菌株Ah11601接种于高氏1号培养基后，第7天、14天、28天观察到的菌体的形态特征，图2的J、K分别为放线菌在高氏一号培养基上的生长图正面和反面，图3 是实施例2 中的链霉菌Ah11601发酵液对玉米小班菌孢子萌发抑制图，图3的O中为在凹面载玻片上滴加了链霉菌Ah11601发酵液，图3的P中未滴加的链霉菌Ah11601发酵液，明显可见O中玉米小班菌孢子被抑制。
本发明技术方案在上面结合附图对发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性改进，或未经改进将发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。
ATGCAAGTCGAACGATGAACCTCCTTCGGGAGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATATGACACGGGGTCGCATGATCTCCGTGTGGAAAGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAGTGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAGAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGATGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTGGGCGACATTCCACGTCGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAAACCGTGGAGACACGGTCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCTTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAATCGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAA
Claims (5)
1.一种链霉菌，其特征在于，链霉菌为Ah11601，已于2015年9月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.11363。
2.权利要求1所述的链霉菌Ah11601代谢物的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
（1）链霉菌Ah11601的培养
使用高氏一号培养基制备试管斜面培养基，在试管斜面培养基上接种链霉菌Ah11601，于28℃环境中培养7天，至菌丝和孢子成熟；
（2）链霉菌Ah11601的液体发酵
A、链霉菌Ah11601种子液的制备：将试管斜面培养基上的孢子接入液体发酵培养基，于28℃下以120rpm的转速下培养48小时，得到链霉菌Ah11601种子液；
B、链霉菌Ah11601的发酵：将链霉菌Ah11601种子液以体积百分比10％的接种量接到新的液体发酵培养基中，于28℃下以160rpm的转速发酵96小时后，温度调整至24℃，再以120rpm的转速发酵72小时，得到链霉菌Ah11601发酵液；
（3）链霉菌Ah11601代谢物的制备
A、将链霉菌Ah11601的发酵液通过200～300目双层纱布过滤，得上清液和菌丝体；
B、将上清液分别依次充分进行微滤、超滤和纳滤，得到纳滤保留液；
C、将纳滤保留液按照1：15～20比例用大孔树脂NAK-2吸附，用比例为100：0～0：100的乙醇～水梯度洗脱，用比例为50：50的乙醇～水洗脱液减压浓缩，得到黄色膏状物；
D、将黄色膏状物通过200目硅胶柱层析进行分离，黄色膏状物与硅胶柱按照1：4～5的比例进行层析，层析后进行洗脱，洗脱液为比例2：1：1的正丁醇：冰醋酸：水的混合液，洗脱流速为1mL／min，每5mL为1个收集单位，单独收集第26～34收集单位液体；
E、通过高效液相色谱对单独收集的第26～34收集单位液体进行分析，色谱条件为色谱柱为反相C18柱，流动相为甲醇：水＝25：75，流速1mL／min，波长254nm，可见第26～34收集单位链霉菌Ah11601代谢物对玉米小班菌孢子具有显著抑制作用。
3.根据权利要求2所述的链霉菌Ah11601的代谢物的制备方法，其特征在于，所述高氏一号培养基组成为：可溶性淀粉20g、硝酸钾1g、氯化钠0.5g、三水合磷酸氢二钾0.5g、七水硫酸镁0.05g、七水合硫酸亚铁0.01g、琼脂20g、水1000ml，调节高氏一号培养基pH 值为7.2～7.4，并置于于121℃下灭菌20min。
4.根据权利要求2所述的链霉菌Ah11601的代谢物的制备方法，其特征在于，所述液体发酵培养基组成为：酵母粉10g、蛋白胨5g、可溶性淀粉20g、碳酸钙2g、硝酸钾2g、三水合磷酸氢二钾0.5g、七水硫酸镁0.5g、七水合硫酸亚铁0.01g、水1000ml，调节液体发酵培养基pH值为7.2～7.4，并在121℃环境下灭菌30min。
5.权利要求2所述的链霉菌Ah11601的代谢物的应用，其特征在于，将步骤C中单独收集第26～34收集单位得到的链霉菌Ah11601代谢物用水稀释100倍后，直接喷洒至玉米叶上。
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