CN104876984A

CN104876984A - 一株高产洋橄榄叶素类化合物的菌株及该类化合物的制备方法与应用

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Publication number: CN104876984A
Application number: CN201510260295.0A
Authority: CN
Inventors: 洪葵; 韩莹; 田二丽; 马敏; 邓子新
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2015-05-20
Filing date: 2015-05-20
Publication date: 2015-09-02
Anticipated expiration: 2035-05-20
Also published as: CN104876984B

Abstract

本发明公开了一株高产洋橄榄叶素类化合物的菌株及该类化合物的制备方法与应用。本发明菌株为保藏编号为CCTCC NO：M2015276的链霉菌219807，该菌株能够生产2-甲基洋橄榄叶素、2-甲基-11,11'-O-二甲基洋橄榄叶素、13'-去2-脱氧岩藻糖-13'-O-甲基洋橄榄叶素、洋橄榄叶素、11-O-甲基洋橄榄叶素、11,11'-O-二甲基洋橄榄叶素、14'-去乙基-14'-甲基洋橄榄叶素或11',12'-脱水洋橄榄叶素等洋橄榄叶素衍生物，洋橄榄叶素的产量达到4486mg/L。这些洋橄榄叶素衍生物对子宫颈癌细胞Hela和乳腺癌细胞MCF-7有很强的抑制作用，可用于制备抗肿瘤药物。

Description

一株高产洋橄榄叶素类化合物的菌株及该类化合物的制备方法与应用

技术领域

本发明属于微生物药物领域，具体涉及一株高产洋橄榄叶素类化合物的菌株及该类化合物的制备方法与应用。

背景技术

红树林是位于海洋与陆地之间的特殊生态系统，近年来从该环境中分离到了很多放线菌新种和新型化合物，这使得红树林放线菌资源的研究越来越受到人们的重视。

洋橄榄叶素(elaiophylin)是一个具有C₂-对称性的十六元环大环双内酯抗生素，文献报道该化合物具有抗革兰氏阳性菌(包括MRSA、VRE等)和抗部分真菌的活性；增强雷帕霉素抗白色念珠菌的活性；抗寄生虫活性；抗肿瘤活性，能诱导细胞凋亡，抑制细胞周期等；用作免疫抑制剂，能抑制NO合成，产生抗炎作用；作为瘤胃动物增长促进剂；用作植物生长抑制剂及作为P-typease专一性抑制剂(K⁺依赖性ATP酶)用于研究ATPase的作用机制等。

迄今报道的洋橄榄叶素产生菌均为链霉菌，包括生孢链霉菌(S.melanosoprus)、吸水链霉菌(S.hygroscopicus)、白色链霉菌(S.albus)、紫黑链霉菌(S.violaceoniger)、假轮枝链霉菌(S.pseudoverticillus)、小小链霉菌(S.parvullus)等。目前，产量最高的发酵方法是以吸水链霉菌作为发酵菌种，最高发酵产量为2120mg/L。

发明内容

本发明的目的之一是提供三个新的洋橄榄叶素衍生物。

本发明的目的之二是提供一种高产洋橄榄叶素衍生物的链霉菌。

本发明的目的之三是提供一种利用所述链霉菌制备洋橄榄叶素衍生物的方法。

本发明的目的之四是提供洋橄榄叶素衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种洋橄榄叶素衍生物，为2-甲基洋橄榄叶素、2-甲基-11,11'-O-二甲基洋橄榄叶素或13'-去2-脱氧岩藻糖-13'-O-甲基洋橄榄叶素。其中，2-甲基洋橄榄叶素为式Ⅰ所示化合物1，其分子式为C₅₅H₉₀O₁₈，分子量为1038.6；

2-甲基-11,11'-O-二甲基洋橄榄叶素为式Ⅱ所示化合物2，其分子式为C₅₇H₉₄O₁₈，分子量为1066.6；

13'-去2-脱氧岩藻糖-13'-O-甲基洋橄榄叶素为式Ⅲ所示化合物3，其分子式为C₄₉H₈₀O₁₅，分子量为908.6。

一种高产洋橄榄叶素衍生物的链霉菌，为保藏编号为CCTCC NO：M 2015276的链霉菌219807(Streptomyces sp.219807)。链霉菌219807从采自中国海南省三亚红树林的土壤样品中分离得到，经分类学研究和分子生物学研究鉴定为链霉菌(Streptomyces sp.)，并保藏于中国典型培养物保藏中心(保藏编号：CCTCC NO：M 2015276；分类命名：链霉菌219807Streptomyces sp.219807；保藏日期：2015年05月04日；保藏地址：中国武汉、武汉大学)。该菌株的16S rRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述的链霉菌219807生产的洋橄榄叶素衍生物包括上述式Ⅰ-Ⅲ所示的化合物1-3和下述式Ⅳ所示的化合物4-7、式Ⅴ所示的化合物8：

化合物4-8分别为：洋橄榄叶素、11-O-甲基洋橄榄叶素、11,11'-O-二甲基洋橄榄叶素、14'-去乙基-14'-甲基洋橄榄叶素、11',12'-脱水洋橄榄叶素。

一种利用链霉菌219807制备所述洋橄榄叶素衍生物(化合物1-8)的方法，包括如下步骤：

(1)将链霉菌219807经平板活化后接种于ISP2液体培养基中培养，再转接到DO培养基中进行发酵；所述的DO培养基的配方为：葡萄糖10g/L，糊精25g/L，燕麦粉20g/L，棉籽饼粉10g/L，鱼粉5g/L，酵母提取物2g/L，CaCO₃ 3g/L，pH值为6.0。

(2)将步骤(1)获得的发酵液经固液分离后，菌丝体用丙酮超声破碎提取，减压浓缩至不含丙酮后，用乙酸乙酯萃取，浓缩得粗提物。

(3)将步骤(2)获得的粗提物在硅胶中用环己烷和丙酮组成的洗脱液进行洗脱，收集洗脱液。

(4)将步骤(3)获得的含有目的化合物的洗脱液浓缩，通过半制备液相分离纯化得到化合物1-8。

步骤(3)中所述的硅胶优选为300-400目的硅胶。

优选的，所述的利用链霉菌219807制备所述洋橄榄叶素衍生物(化合物1-8)的方法，包括如下步骤：

(1)将链霉菌219807经平板活化后接种于ISP2液体培养基中，28℃、220r/min振荡培养3d，再以10％的接种量接种到DO培养基中，28℃、220r/min振荡培养8d。

(2)将步骤(1)获得的发酵液经固液分离后，菌丝体用丙酮超声破碎提取三次，合并提取液，减压浓缩至不含丙酮后，用等量乙酸乙酯萃取三次，得菌丝体提取物的乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干得粗提物。

(3)将步骤(2)获得的粗取物在硅胶中进行梯度洗脱，依次用体积比分别为9:1、7:1、5:1、3:1、7:3、3:2、1:1、2:3、1:3、1:5的环己烷和丙酮组成的十个洗脱液进行洗脱，依次获得十个洗脱液洗出的组分。

(4)将步骤(3)获得含有目的化合物的各组分减压浓缩或合并后减压浓缩，再进行C18半制备液相分离纯化，得到化合物1-8。

步骤(2)和(4)中所述减压浓缩的温度为35-37℃。

本发明采用MTT法测试了所述洋橄榄叶素及其衍生物(化合物1-8)对子宫颈癌细胞Hela和乳腺癌细胞MCF-7的50％抑制浓度(IC₅₀)。实验结果显示洋橄榄叶素及其衍生物对所试验的肿瘤细胞具有显著的抗肿瘤活性。表明所述洋橄榄叶素衍生物可用作制备抗肿瘤药物。而以所述洋橄榄叶素衍生物作为活性成分，与药学上可接受的一种或多种载体、赋形剂或辅料配伍，可制成抗肿瘤的药物组合物。所述药物及药物组合物可用于肿瘤相关疾病的治疗。所述化合物也可与已知药物组成复方制剂用于肿瘤相关疾病的治疗。

本发明中经链霉菌219807发酵制备式Ⅰ-Ⅴ所示洋橄榄叶素衍生物的方法，可适用于其它能产生此类化合物的任何微生物。

本发明中还包括式Ⅳ、式Ⅵ、式Ⅶ所示其它洋橄榄叶素衍生物，在制备抗肿瘤药物中的应用。

式Ⅳ、式Ⅵ、式Ⅶ中的取代基团如下：

R₁，R₂＝氢或羟基包括但不限于甲氧基、乙氧基等C1～C5烷氧基取代基，乙烯氧基、丙烯氧基等C2～C6烯氧基取代基，C2～C6炔氧基、C3～C6环烷氧基、甲酰氧基、乙酰氧基等C1～C5酰氧基；苯氧基等C6～C12芳环氧基；

C-11－C-12：可以是单键或双键；

C-11'－C-12'：可以是单键或双键；

R₃＝R₄＝氢或甲基，包括但不限于乙基、丙基等C2～C5饱和烷基取代基，乙烯、丙烯等C2～C6烯基取代基，C2～C6炔基、C3～C6环烷基；

R₅＝氢，包括但不限于甲基、乙基、丙基等C1～C5饱和烷基取代基，乙烯、丙烯等C2～C6烯基取代基，C2～C6炔基、C3～C6环烷基、甲酰基、乙酰基等C1～C5酰基；苯基等C6～C12芳环基团；

R₆＝氢，包括但不限于甲基、乙基、丙基等C1～C5饱和烷基取代基，乙烯、丙烯等C2～C6烯基取代基，C2～C6炔基、C3～C6环烷基、甲酰基、乙酰基等C1～C5酰基；苯基等C6～C12芳环基团。

而以所述洋橄榄叶素衍生物作为活性成分，与药学上可接受的一种或多种载体、赋形剂或辅料配伍，可制成抗肿瘤的药物组合物。所述药物及药物组合物可用于肿瘤相关疾病的治疗。所述化合物也可与已知药物组成复方制剂用于肿瘤相关疾病的治疗。

本发明中所述的链霉菌219807(保藏编号为CCTCC NO.M2015276的中国海南省三亚红树林土壤放线菌链霉菌)是一株高产洋橄榄叶素的菌株，产量达到4486mg/L。

附图说明

图1是2-甲基洋橄榄叶素(化合物1)的高分辨质谱图。

图2是2-甲基洋橄榄叶素(化合物1)的¹H-NMR谱。

图3是2-甲基洋橄榄叶素(化合物1)的¹³C-NMR谱。

图4是2-甲基-11,11'-O-二甲基洋橄榄叶素(化合物2)的高分辨质谱图。

图5是2-甲基-11,11'-O-二甲基洋橄榄叶素(化合物2)的¹H-NMR谱。

图6是2-甲基-11,11'-O-二甲基洋橄榄叶素(化合物2)的¹³C-NMR谱。

图7是13'-去2-脱氧岩藻糖-13'-O-甲基洋橄榄叶素(化合物3)的高分辨质谱图。

图8是13'-去2-脱氧岩藻糖-13'-O-甲基洋橄榄叶素(化合物3)的¹H-NMR谱。

图9是13'-去2-脱氧岩藻糖-13'-O-甲基洋橄榄叶素(化合物3)的¹³C-NMR谱。

图10是洋橄榄叶素标准曲线图。

具体实施方式

以下实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

实施例1链霉菌219807的分离、鉴定与保藏

从采自中国海南省三亚红树林的土壤样品中分离得到菌株219807，并经分类学研究和分子生物学研究鉴定为链霉菌(Streptomyces sp.)，并保藏于中国典型培养物保藏中心(保藏编号：CCTCC NO：M 2015276；分类命名：链霉菌219807Streptomyces sp.219807；保藏日期：2015年05月04日；保藏地址：中国武汉、武汉大学)。链霉菌219807的16S rRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2链霉菌219807大量发酵及其发酵物样品前处理方法

将链霉菌219807经平板活化后接种于ISP2液体培养基中，28℃、220r/min振荡培养3d，按照10％接种量接种到5L DO培养基中，28℃、220r/min振荡培养8d，获得发酵液。将发酵液经固液分离后，菌丝体用丙酮超声破碎提取，减压浓缩至不含丙酮后，用乙酸乙酯萃取，浓缩得粗提物。所述的ISP2液体培养基的配方为：葡萄糖4g/L，酵母提取物4g/L，麦芽提取物10g/L，pH值为7.2；所述的DO培养基的配方为：葡萄糖10g/L，糊精25g/L，燕麦粉20g/L，棉籽饼粉10g/L，鱼粉5g/L，酵母提取物2g/L，CaCO₃ 3g/L，pH值为6.0。

实施例3化合物的分离及结构确认

(1)化合物分离

将实施例2中获得的粗提物溶于适量甲醇后拌入硅胶，采用干法上样在300～400目的硅胶中进行梯度洗脱，依次用体积比分别为9:1、7:1、5:1、3:1、7:3、3:2、1:1、2:3、1:3、1:5的环己烷和丙酮组成的十个洗脱液进行洗脱，每个梯度洗脱体积为1.5L，合并体积比为1:1和2:3的洗脱液，减压浓缩，再将减压浓缩后的合并组分进行C18半制备液相分离纯化，半制备条件为H₂O(A)/CH₃CN(B)：0-12min，流动相B的比例为79％；12-13min，流动相B的比例为79％-90％；13-29min，流动相B的比例为90％；29-30min，流动相B的比例为90％-79％；30-38min，流动相B的比例为79％；共计采集信号38min(流速3.0mL/min)。在5.5min得到组分1，14.1min得到组分2，19.0min得到组分3，26.9min得到组分4，34.0min得到组分5，37.2min得到组分6，共得到以上6个组分。其中，组分1为式Ⅳ所示化合物4(洋橄榄叶素，75.3mg)、组分2为式Ⅳ所示化合物5(11-O-甲基洋橄榄叶素，170.2mg)、组分5为式Ⅳ所示化合物6(11,11'-O-二甲基洋橄榄叶素，386.2mg)；将组分3再经半制备液相分离纯化，半制备条件为H₂O(A)/CH₃CN(B)：0-10min，流动相B的比例为64％；10-11min，流动相B的比例为64％-92％；11-21min，流动相B的比例为92％；21-22min，流动相B的比例为92％-64％；22-25min，流动相B的比例为64％；共计采集信号25min(流速3.0mL/min)，在10.0min得到式Ⅴ所示化合物8(11',12'-脱水洋橄榄叶素，2.8mg)。将组分4再经半制备液相分离纯化，半制备条件为H₂O(A)/CH₃CN(B)：0-10min，流动相B的比例为53％；10-11min，流动相B的比例为53％-100％；11-16min，流动相B的比例为100％；16-17min，流动相B的比例为100％-53％；17-20min，流动相B的比例为53％；共计采集信号20min(流速3.0mL/min)，在10.5min得到式Ⅳ所示化合物7(14'-去乙基-14'-甲基洋橄榄叶素，15.2mg)。将组分6再经半制备液相分离纯化，半制备条件为H₂O(A)/CH₃CN(B)：0-4min，流动相B的比例为80％；4-5min，流动相B的比例为80％-87％；5-12min，流动相B的比例为87％；12-13min，流动相B的比例为87％-99％；13-25min，流动相B的比例为99％；25-26min，流动相B的比例为99％-80％；26-30min，流动相B的比例为80％；共计采集信号30min(流速3.0mL/min)，在13.1min，得到式Ⅰ所示化合物1(2-甲基洋橄榄叶素，5.1mg)；在28.4min得到式Ⅱ所示化合物2(2-甲基-11,11'-O-二甲基洋橄榄叶素，25.7mg)。将体积比为7:3的洗脱液减压浓缩，再经半制备液相分离纯化，半制备条件为H₂O(A)/CH₃CN(B)：0-5min，流动相B的比例为65％；5-6min，流动相B的比例为65％-80％；6-14min，流动相B的比例为80％；14-15min，流动相B的比例为80％-95％；15-19min，流动相B的比例为95％；19-20min，流动相B的比例为95％-100％；20-31min，流动相B的比例为100％；31-32min，流动相B的比例为100％-65％；32-35min，流动相B的比例为65％；共计采集信号35min(流速3.0mL/min)，在23.6min，得到式Ⅲ所示化合物3(13'-去2-脱氧岩藻糖-13'-O-甲基洋橄榄叶素，2.8mg)。

(2)结构确认

通过UV、IR、MS和NMR多种波谱学手段，确定了上述化合物的结构。其中，化合物1的质谱图、¹H-NMR谱和¹³C-NMR谱如图1-3所示，化合物2的质谱图、¹H-NMR谱和¹³C-NMR谱如图4-6所示，化合物3的质谱图、¹H-NMR谱和¹³C-NMR谱如图7-9所示。

a)式Ⅰ所示化合物1：2-甲基洋橄榄叶素的结构鉴定

化合物1，白色针状结晶，负离子模式HRESI-MS给出准分子离子峰m/z 1073.5798(calcd[M+Cl]^-1073.5816)，确定其分子式为C₅₅H₉₀O₁₈，不饱和度为11，比从该发酵液中同时分离得到的洋橄榄叶素分子式多了一个亚甲基单元。化合物1在254nm处有最大紫外吸收，红外光谱显示分子中可能含有羟基(3427.47、2931.91cm^-1)、酯基(1695.60cm^-1)、共轭双键(1636.76、1460.29、1382.89cm^-1)。比较化合物1和洋橄榄叶素的¹H、¹³C-NMR谱数据，发现它们非常相似，但化合物1信号更复杂，推测化合物1可能为洋橄榄叶素的不对称衍生物。二者最明显的不同是¹H-NMR谱中化合物1比洋橄榄叶素少了一个烯氢信号，但多了一个甲基信号δ1.87(3H,s)，¹³C-NMR谱中，化合物1比洋橄榄叶素多了一个季碳δ126.43和一个甲基信号δ12.77。HMBC谱中，烯烃信号δ6.78(1H,d,J＝11.55Hz,H-3')，δ6.24(1H,dd,J＝14.80,11.70Hz,H-4')，甲基信号δ1.87(3H,s,H-28')均与季碳δ126.43(C-2')相关；此外，甲基信号δ1.87(3H,s,H-28')还与羰基碳δ171.68(C-1')、烯碳δ138.98(C-3')相关。由此可知，化合物1与洋橄榄叶素相比，其C-2'位是一个甲基取代了烯烃氢，从而推测出化合物1的结构。分析化合物1的2D-NMR(¹H-¹H COSY、HSQC、HMBC)图谱，证明上述推测正确。最后，将化合物1的CD谱与文献(Wu C,Tan Y,Gan M,Wang Y,Guan Y,Hu X,Zhou H,Shang X,You X,Yang Z,Xiao C.Identification of elaiophylin derivatives from themarine-derived actinomycete Streptomyces sp.7-145using PCR-based screening.J.Nat.Prod.2013,76(11),2153-2157.)报道的11',12'-脱水洋橄榄叶素的CD谱图进行比较，发现两个化合物的CD谱高度重合，并由于它们共同的生源途径，说明这两个化合物有相同的绝对构型，确定了化合物1的结构。化合物1为新化合物，结构如式Ⅰ所示，命名为2-甲基洋橄榄叶素(2-methylelaiophylin)。

2-甲基洋橄榄叶素(化合物1)的理化性质与波谱数据如下：

白色针状结晶；

旋光度：

分子式：C₅₅H₉₀O₁₈；

分子量：1038.6；

HRESI-MS(m/z)：1073.5798[M+Cl]^-(Calcd.For：1073.5816)；

最大紫外吸收为254nm；

红外光谱数据：

3427.47，2977.55，2931.91，1695.60，1636.76，1460.29，1382.89，1221.47，1182.72，1090.58，981.98，817.08，745.71，706.68，639.83cm^-1；

¹H和¹³C-NMR数据(CDCl₃，500和125MHz)见表1。

b)式Ⅱ所示化合物2：2-甲基-11,11'-O-二甲基洋橄榄叶素的结构鉴定

化合物2，白色针状结晶，正离子模式HRESI-MS给出准分子离子峰m/z 1089.6336(calcdcalcd[M+Na]⁺1089.6338)，确定其分子式为C₅₇H₉₄O₁₈，不饱和度为11，比化合物1多了2个亚甲基单元，且与化合物1有相同的紫外吸收和红外谱图。将化合物2与化合物1的¹H、¹³C-NMR谱数据进行比较，发现它们非常相似，唯一的区别在于¹H-NMR谱中，化合物2比化合物1多了两个甲氧基信号δ3.01(6H,s)，相应的¹³C-NMR谱中也多了两个甲氧基碳信号δ46.68。HMBC谱中，甲氧基δ3.01(6H,s,H-28,H-28')与δ103.44(C-11,C-11')相关，说明这两个甲氧基连接在C-11、C-11'上。分析化合物2的¹H-¹H COSY、HSQC、HMBC图谱，证实了上述推断。比较化合物2与化合物1的CD图谱，发现两个化合物的CD谱高度重合，因此化合物2与化合物1有相同的绝对构型，确定了化合物2的结构。化合物2为新化合物，结构如式Ⅱ所示，命名为2-甲基-11,11'-O-二甲基洋橄榄叶素(2-methyl-11,11'-O-dimethylelaiophylin)。

2-甲基-11,11'-O-二甲基洋橄榄叶素(化合物2)的理化性质与波谱数据如下：

白色针状结晶；

旋光度：

分子式：C₅₇H₉₄O₁₈；

分子量：1066.6；

HRESI-MS(m/z)：1089.6336(calcd[M+Na]⁺1089.6338)；

最大紫外吸收为254nm；

红外光谱数据：

3448.03，2977.55，2931.73，1700.54，1637.32，1461.56，1381.29，1223.47，1185.00，1089.39，981.70，807.53，743.87，708.52cm^-1；

¹H和¹³C-NMR数据(CDCl₃，500和125MHz)见表2。

c)式Ⅲ所示化合物3：13'-去2-脱氧岩藻糖-13'-O-甲基洋橄榄叶素的结构鉴定

化合物3，白色针状结晶，负离子模式HRESI-MS给出准分子离子峰m/z 943.5183(calcd[M+Cl]^–943.5186)，确定其分子式为C₄₉H₈₀O₁₅，不饱和度为10。最大紫外吸收波长在252nm处，表明分子中可能有α、β、γ、δ-不饱和内酯结构的存在。此外，红外光谱显示分子中可能含有羟基(3523.45、3445.12、3333.82、2931.27cm^-1)、酯基(1699.01cm^-1)、共轭双键(1636.07、1458.81、1382.24cm^-1)，推测化合物3可能为洋橄榄叶素的衍生物。比较两者的¹H、¹³C-NMR谱，发现化合物3中少了一个2-脱氧岩藻糖，但¹H-NMR谱中多了一个δ3.34(3H,s)信号，相对应地¹³C-NMR谱中多了一个δ56.66的甲基碳信号，因而推测化合物3中C-13'取代的是一个甲氧基而不同于洋橄榄叶素中C-13'被一个2-脱氧岩藻糖取代。通过查阅文献(BindseilKU,Zeeck A.Chemistry of unusual macrolides.1.Preparation of the aglycons of concanamycin Aand elaiophylin.J.org.chem.1993,58(20),5487-5492.；Yamada T,Kikuchi T,Tanaka R,NumataA.Halichoblelides B and C,potent cytotoxic macrolides from a Streptomyces species separatedfrom a marine fish.Tetrahedron Lett.2012,53(23),2842–2846.)，发现这类较洋橄榄叶素(elaiophylin)少了一个2-脱氧岩藻糖的衍生物目前只发现了两个，halichoblelide B和halichoblelide C。将化合物3与已知化合物halichoblelide B进行比较，二者非常相似，但化合物3比halichoblelide B少了两个甲氧基，通过分析化合物3的2D-NMR图谱，证实是halichoblelide B的C-11、C-11'位上的甲氧基在化合物3中为羟基取代。比较化合物3与halichoblelide B的CD图谱，发现两个化合物的CD谱高度重合，因此化合物3与halichoblelideB有相同的绝对构型，确定了化合物3的结构。化合物3为新化合物，结构如式Ⅲ所示，命名为13'-去2-脱氧岩藻糖-13'-O-甲基洋橄榄叶素(13'-de-2-deoxy-L-fucose-13'-O-methylelaiophylin)。

13'-去2-脱氧岩藻糖-13'-O-甲基洋橄榄叶素(化合物3)的理化性质与波谱数据如下：

白色针状结晶；

旋光度：

分子式：C₄₉H₈₀O₁₅；

分子量：908.6；

HRESI-MS(m/z)：943.5183(calcd[M+Cl]^–943.5186)；

最大紫外吸收为252nm；

红外光谱数据：

3523.45，3445.12，3333.82，2977.55，2931.27，1699.01，1636.07，1458.81，1382.24，1302.76，1222.97，1184.72，1088.43，981.94，807.71，743.96，695.70，641.59，567.22cm^-1；

¹H和¹³C-NMR数据(CDCl₃，500和125MHz)见表3。

d)式Ⅳ所示化合物4：洋橄榄叶素的结构鉴定

化合物4为白色针状结晶，正离子HRESI-MS m/z 1047.5890(calcd[M+Na]⁺1047.5868)，分子式为C₅₄H₈₈O₁₈。UV(MeOH)λ_max 252nm。¹H和¹³C-NMR数据(CD₃OD，400和100MHz)与现有报道的洋橄榄叶素数据一致，因此化合物4的结构确定为洋橄榄叶素。

e)式Ⅳ所示化合物5：11-O-甲基洋橄榄叶素的结构鉴定

化合物5为白色针状结晶，正离子HRESI-MS m/z 1061.5786(calcd[M+Na]⁺1061.6025)，分子式为C₅₅H₉₀O₁₈。UV(MeOH)λ_max 252nm。¹H和¹³C-NMR数据(CD₃OD，400和100MHz)与现有报道的11-O-甲基洋橄榄叶素数据一致，因此化合物5的结构确定为11-O-甲基洋橄榄叶素。

f)式Ⅳ所示化合物6：11,11'-O-二甲基洋橄榄叶素的结构鉴定

化合物6为白色针状结晶，正离子HRESI-MS m/z 1075.5898(calcd[M+Na]⁺1075.6181)，分子式为C₅₆H₉₂O₁₈。UV(MeOH)λ_max 252nm。¹H和¹³C-NMR数据与现有报道的11,11'-O-二甲基洋橄榄叶素数据一致，因此化合物6的结构确定为11,11'-O-二甲基洋橄榄叶素。

g)式Ⅳ所示化合物7：14'-去乙基-14'-甲基洋橄榄叶素的结构鉴定

化合物7为白色针状结晶，正离子HRESI-MS m/z 1033.4126(calcd[M+Na]⁺1033.5712)，分子式为C₅₃H₈₆O₁₈。UV(MeOH)λ_max 252nm。¹H和¹³C-NMR数据与现有报道的14'-去乙基-14'-甲基洋橄榄叶素数据一致，因此化合物7的结构确定为14'-去乙基-14'-甲基洋橄榄叶素。

h)式Ⅴ所示化合物8：11',12'-脱水洋橄榄叶素的结构鉴定

化合物8为白色针状结晶，正离子HRESI-MS m/z 1029.3929(calcd[M+Na]⁺1029.5763)，分子式为C₅₄H₈₆O₁₇。UV(MeOH)λ_max 252nm。¹H和¹³C-NMR数据(CDCl₃，500和125MHz)与现有报道的11',12'-脱水洋橄榄叶素数据一致，因此化合物8的结构确定为11',12'-脱水洋橄榄叶素。

表1.化合物1的¹H和¹³C-NMR数据(CDCl₃，500和125MHz)

表2.化合物2的¹H和¹³C-NMR数据(CDCl₃，500和125MHz)

表3.化合物3的¹H和¹³C-NMR数据(CDCl₃，500和125MHz)

实施例4洋橄榄叶素衍生物抗肿瘤活性试验

1、试剂来源：RPMI1640培养基购自美国GIBCO公司，胎牛血清购自杭州四季青生物制品厂，胰酶消化液购自美国Sigma-Aldrich公司，MTT购自美国Sigma-Aldrich公司。

2、细胞株：子宫颈癌细胞Hela和乳腺癌细胞MCF-7。

3、活性评价试验方法参考文献Mosmann,T.Rapid colorimetric assay for cellular growthand survival:application to proliferation and cytotoxicity assays.J.Immunol.Methods.1983,65(1-2),55-63.优化步骤后进行，具体步骤如下：

(1)样品配制：化合物1-8各称取0.2mg，用DMSO依次稀释到浓度为1.4mg/mL、0.7mg/mL、0.35mg/mL、0.175mg/mL、0.0875mg/mL、0.04375mg/mL、0.021875mg/mL、0.0109375mg/mL，作为待测样品；取5-氟尿嘧啶4mg，用DMSO依次稀释到浓度为40mg/mL、20mg/mL、10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.3125mg/mL，作为阳性对照；DMSO作为阴性对照。

(2)实验步骤：取对数生长的Hela细胞(MCF-7细胞)，用胰酶消化液消化后吹打成悬液，以5×10⁴个/mL的密度接种于96孔板，每孔190μL。待24h细胞完全贴壁后，各孔相应的加入经培养液稀释10倍后的待测样品10μL(阴性对照孔中加入稀释10倍的DMSO，阳性对照孔加入稀释10倍的5-氟尿嘧啶)，每个样品重复三次。培养24h后每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL)，继续培养4h，终止培养。吸去培养液，每孔加入100μL DMSO，振荡10min后在酶标仪570nm处测量各孔吸光值，设置参比波长690nm，根据如下公式整理数据：

肿瘤细胞生长抑制率(％)＝(1-OD_待测样品/OD_阴性对照)×100％。

4、实验结果

用上述方法，式Ⅰ-Ⅴ所示洋橄榄叶素衍生物1-8以及对照样品对Hela细胞和MCF-7细胞的IC₅₀值见表4(其中化合物4、5、6在MeOH中容易相互转化，导致化合物5和6在分离纯化后又转变为3个化合物的混合物)。实验结果表明，洋橄榄叶素及其衍生物对所试验的肿瘤细胞具有显著的抗肿瘤活性。式Ⅰ-Ⅴ所示洋橄榄叶素及其衍生物可用作制备抗肿瘤药物，或以其为活性成分，与药学上可接受的一种或多种载体、赋形剂或辅料配伍，制成抗肿瘤的药物组合物。

表4.洋橄榄叶素及其衍生物对Hela和MCF-7细胞的抑制活性

实施例5链霉菌219807中洋橄榄叶素含量测定

(1)洋橄榄叶素标准曲线的绘制

将洋橄榄叶素用CH₃CN依次稀释到浓度为1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL、0.03125mg/mL、0.015625mg/mL。对各浓度的样品进行HPLC检测(HPLC条件：0-40min 85％CH₃CN，检测波长252nm，进样量30μL)，根据HPLC检测的结果，以峰面积为纵坐标，洋橄榄叶素的浓度(mg/mL)为横坐标，绘制标准曲线，如图10所示，R²＝0.9993，表明标准品浓度与峰面积的相关性良好，可作为定量标准。

(2)链霉菌219807的发酵及其发酵物样品前处理方法

将链霉菌219807经平板活化后接种于ISP2液体培养基中，28℃、220r/min振荡培养3d，按照10％接种量接种到50mL DO培养基中，28℃、220r/min振荡培养8d，获得发酵液。发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，35℃减压浓缩至干得粗提取物。所述的ISP2液体培养基的配方为：葡萄糖4g/L，酵母提取物4g/L，麦芽提取物10g/L，pH值为7.2；所述的DO培养基的配方为：葡萄糖10g/L，糊精25g/L，燕麦粉20g/L，棉籽饼粉10g/L，鱼粉5g/L，酵母提取物2g/L，CaCO₃ 3g/L，pH值为6.0。

(3)洋橄榄叶素含量测定

粗提物进行HPLC检测，计算出Streptomyces sp.219807中洋橄榄叶素产量为4486mg/L。

上述实施例说明链霉菌219807通过发酵可以生成式Ⅰ-Ⅴ所示洋橄榄叶素衍生物，该类化合物具有显著的抗肿瘤活性，可作为抗肿瘤药物用于肿瘤相关疾病的治疗。所述的链霉菌219807(保藏编号为CCTCC NO：M 2015276的中国海南省三亚红树林土壤放线菌链霉菌)是一株高产洋橄榄叶素的菌株，产量达到4486mg/L。

Claims

1.一种洋橄榄叶素衍生物，其特征在于：为式Ⅰ所示的2-甲基洋橄榄叶素、式Ⅱ所示的2-甲基-11,11'-O-二甲基洋橄榄叶素或式Ⅲ所示的13'-去2-脱氧岩藻糖-13'-O-甲基洋橄榄叶素：

2.一种高产洋橄榄叶素衍生物的链霉菌，其特征在于：为保藏编号为CCTCC NO：M2015276的链霉菌219807；所述的洋橄榄叶素衍生物包括权利要求1所述的2-甲基洋橄榄叶素、2-甲基-11,11'-O-二甲基洋橄榄叶素、13'-去2-脱氧岩藻糖-13'-O-甲基洋橄榄叶素和洋橄榄叶素、11-O-甲基洋橄榄叶素、11,11'-O-二甲基洋橄榄叶素、14'-去乙基-14'-甲基洋橄榄叶素、11',12'-脱水洋橄榄叶素。

3.权利要求2所述的链霉菌在制备洋橄榄叶素衍生物中的应用。

4.一种利用权利要求2所述的链霉菌制备洋橄榄叶素衍生物的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将链霉菌219807经平板活化后接种于ISP2液体培养基中培养，再转接到DO培养基中进行发酵；所述的DO培养基的配方为：葡萄糖10g/L，糊精25g/L，燕麦粉20g/L，棉籽饼粉10g/L，鱼粉5g/L，酵母提取物2g/L，CaCO₃ 3g/L，pH值为6.0；

(2)将步骤(1)获得的发酵液经固液分离后，菌丝体用丙酮超声破碎提取，减压浓缩至不含丙酮后，用乙酸乙酯萃取，浓缩得粗提物；

(3)将步骤(2)获得的粗提物在硅胶中用环己烷和丙酮组成的洗脱液进行洗脱，收集洗脱液；

(4)将步骤(3)获得的含有目的化合物的洗脱液浓缩，通过半制备液相分离纯化得到洋橄榄叶素衍生物。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将链霉菌219807经平板活化后接种于ISP2液体培养基中，28℃、220r/min振荡培养3d，再以10％的接种量接种到DO培养基中，28℃、220r/min振荡培养8d；

(2)将步骤(1)获得的发酵液经固液分离后，菌丝体用丙酮超声破碎提取三次，合并提取液，减压浓缩至不含丙酮后，用等量乙酸乙酯萃取三次，得菌丝体提取物的乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干得粗提物；

(3)将步骤(2)获得的粗取物在硅胶中进行梯度洗脱，依次用体积比分别为9:1、7:1、5:1、3:1、7:3、3:2、1:1、2:3、1:3、1:5的环己烷和丙酮组成的十个洗脱液进行洗脱，依次获得十个洗脱液洗出的组分；

(4)将步骤(3)获得含有目的化合物的各组分减压浓缩或合并后减压浓缩，再进行C18半制备液相分离纯化，得到洋橄榄叶素衍生物。

6.权利要求2所述的链霉菌在制备抗肿瘤药物中的应用。

7.洋橄榄叶素衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的洋橄榄叶素衍生物为2-甲基洋橄榄叶素、2-甲基-11,11'-O-二甲基洋橄榄叶素、13'-去2-脱氧岩藻糖-13'-O-甲基洋橄榄叶素、洋橄榄叶素、11-O-甲基洋橄榄叶素、11,11'-O-二甲基洋橄榄叶素、14'-去乙基-14'-甲基洋橄榄叶素、11',12'-脱水洋橄榄叶素或式Ⅳ、式Ⅵ或式Ⅶ所示的洋橄榄叶素衍生物：

式Ⅳ、式Ⅵ、式Ⅶ中的取代基团如下：

R₁、R₂：氢、羟基、C1～C5烷氧基取代基、C2～C6烯氧基取代基、C1～C5酰氧基或C6～C12芳环氧基；

C-11－C-12：单键或双键；

C-11'－C-12'：单键或双键；

R₃、R₄：氢、甲基、C2～C5饱和烷基取代基、C2～C6烯基取代基、C2～C6炔基或C3～C6环烷基；

R₅：氢、C1～C5饱和烷基取代基、C2～C6烯基取代基、C2～C6炔基、C3～C6环烷基、C1～C5酰基或C6～C12芳环基团；

R₆：氢、C1～C5饱和烷基取代基、C2～C6烯基取代基、C2～C6炔基、C3～C6环烷基、C1～C5酰基或C6～C12芳环基团。

9.一种抗肿瘤药物，其特征在于：包含权利要求8所述的洋橄榄叶素衍生物。

10.一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于：包含权利要求8所述的洋橄榄叶素衍生物与其药学上可接受的一种或多种载体、赋形剂或辅料。