CN101928705A

CN101928705A - 改造真菌次级代谢的实验技术及其用途

Info

Publication number: CN101928705A
Application number: CN2010100001379A
Authority: CN
Inventors: 崔承彬; 卜秀嫣; 田从魁; 李长伟
Original assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Current assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority date: 2010-01-05
Filing date: 2010-01-05
Publication date: 2010-12-29

Abstract

本发明涉及改造真菌次级代谢的实验技术及其用途。具体地说，本发明涉及利用超声波和/或卡那霉素改造真菌次级代谢功能的实验技术方法，其是将原始真菌在水混悬液状态下超声波处理0.5分钟～5小时，再将超声波处理后的菌悬液置于0～8℃温度下处理2～50天的期间，并在该期间适时取样，经PDA平板涂板和反复的单菌落挑选与分离培养，纯化得到次级代谢功能获得改造的突变株。本发明还涉及该技术方法用于无活性真菌野生株的转化和筛选获取抗肿瘤活性突变株并供药源活性产物研究的用途。本发明的方法可以有效地用于从无活性真菌改造成为工业可用的真菌。

Description

改造真菌次级代谢的实验技术及其用途

技术领域：

本发明涉及真菌次级代谢功能改造相关实验技术，具体涉及利用超声波和卡那霉素改造真菌次级代谢功能的实验技术方法，以及该技术方法用于无活性真菌野生株的转化和筛选获取抗肿瘤活性突变株并供药源活性产物研究的用途。

背景技术：

微生物产物是新药及其先导结构的一个重要来源，而可分离培养微生物迄今一直是微生物药物及其先导结构的主要来源和主流研发资源。通常，在可分离培养微生物的药源菌株资源常规研发过程中，分离得到的绝大多数菌株往往因无活性而不能直接用于药源活性产物研究，因而被大量闲置或被选择销毁，造成前期投入的极大浪费和菌株资源开发利用效率严重低下。因此，如何将大量闲置无用的无活性菌株有效转化成活性菌株从而拓展药源微生物资源已成为重要研究课题。

近几年微生物基因组学研究结果表明，微生物基因组序列所含次级代谢产物生合成基因簇或基因远比其已知生产的产物多(如文献S.D.Bentley，et al.Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomycescoelicolor A3(2).Nature，2002，417：141-147；文献H.Ikeda，et al.Completegenome sequence and comparative analysis of the industrialmicroorganism Streptomyces avermitilis.Nat Biotechnol，2003，21(5)：526-531；文献M.0liynyk，et al.Complete genome sequence of theerythromycin-producing bacterium Sacchropolyspora erthraea NRRL23338.Nat Biotechnol，2007(4)：447-453；文献Y.0hnishi，et al.Genome sequenceof the streptomycin-producing microorganism Streptomyces griseus IFO13350.J Bcteriol，2008，190(11)：4050-4060等所记载)，因而具备合成更多次级产物的潜在能力(参见文献S.Donadio，et al.Impact of the firstStreptomyces genome sequence on the discovery and production ofbioactive substances.Appl Microbiol Biotechnol，2002，60：377-380以及文献H.B.Bode，et al.The impact of bacterial genomics on natural productresearch.Angew Chem Int Ed，2005，44(12)：6828-6846所记述相关内容)。因此，无活性菌株具有转化成活性菌株的基因组基础，只要所采用的方法得当，完全有可能实现有效转化并从中发现药源活性化合物，从而拓展药源微生物新菌株资源。这也正是下述无活性放线菌具有活性化转化潜能的基因组基础，而核糖体工程技术则是激发放线菌这种潜能的一种简便有效手段。

微生物核糖体具有调控次级代谢的功能，通过干预和改变核糖体这些功能，可改造微生物次级代谢，从而挖掘利用微生物的相关有用潜能。核糖体工程(参见文献K.Ochi，et al.Ribosome engineering and secondarymetabolite production.Advan Appl Microbiol，2004，56：155-184以及文献Ochi K.From microbial differentiation to ribosome engineering.BiosciBiotechnol Biochem，2007，71(6)：1373-1386记载)相关研究表明，无活性放线菌野生菌株可通过抗生素抗性筛选转化为活性突变株(参见文献“于志斌，等.利用核糖体工程技术开拓海洋微生物药用资源的研究.高技术通讯，2005，15(5)：87-90”以及文献“孙玉雯，等.海洋微生物的分离培养及其野生型与突变型抗肿瘤活性菌株的筛选.军事医学科学院院刊，2008，32(6)：532-536”的相关内容)，而转化获取的活性突变株可用于突变株新产药源活性产物研究，从而有效拓展微生物药源活性新菌株资源(参见文献“于志彬，等.用核糖体工程技术二次开发海洋微生物菌株资源的研究.高技术通讯，2006，16(11)：1190-1194”以及文献“韩晓，等.放线菌野生株代谢功能的核糖体工程改造与新产抗肿瘤活性产物研究.国际药学研究杂志，2009，36(6)：435-442&446”中相关内容)。

真菌是核糖体工程研究至今尚未触及的一类微生物，不仅与核糖体功能相关真菌核糖体工程研究至今未见文献报道，而且有关无活性真菌野生株的活性化转化相关研究尤其是有关本发明涉及的利用超声波和卡那霉素改造真菌次级代谢功能的实验技术方法及其用于无活性真菌野生株的转化和筛选获取抗肿瘤活性突变株并用于筛选药源活性产物的研究尚未见文献报道。

发明内容：

本发明的目的是提供一种有效的真菌次级代谢功能改造相关实验技术和/或方法。本发明人曾尝试采用常规核糖体工程实验技术方法，选用作用于核糖体的各种抗生素，对真菌探索开展了改造次级代谢功能相关抗性筛选实验。但由于细胞壁的特殊结构，作用于核糖体的抗生素无法透过真菌细胞壁进入到作用部位，因此利用常规的核糖体工程抗性筛选方法，根本无法筛选得到次级代谢功能获得改造的真菌抗生素抗性突变株。

在此基础上，本发明通过系统考查冷冻、高温、超声、微波、pH、乙酸乙酯、丙酮、DMSO、甲醇、乙醇、丁醇等多种理化学因素对真菌细胞壁膜通透性的影响以及组合链霉素、氯霉素、新霉素、利福平、庆大霉素、卡那霉素等多种抗生素和(或)亚硝基胍(NTG)、硫酸二乙酯(DES)、超声、微波、紫外等多种物理化学诱变因子共同作用对真菌次级代谢的影响，摸索到了可人为改造真菌次级代谢的组合实验条件，并建立了利用超声波和卡那霉素改造真菌次级代谢功能的相关实验技术方法。同时，利用该实验技术方法，成功转化无活性真菌野生菌株，高效筛选获得了具有抗肿瘤活性的活性突变株，同时还研究阐明了活性突变株新产活性产物。本发明的研究结果表明，本发明有关改造真菌次级代谢功能的实验技术方法可用于有效改造无活性真菌野生株的次级代谢功能，并从中高效转化获取药源活性突变株，从而有效拓展真菌药源活性新菌株资源，同时通过系统阐明突变株新产活性产物，还可以深入开发利用真菌药源活性新产物。本发明基于上述发现而得以完成。

概括地说，本发明提供以下各项：

项目1、一种改造真菌次级代谢功能的方法，其特征是，将原始真菌在水混悬液状态下超声波处理0.5分钟～5小时(例如0.5分钟～4小时，例如0.5分钟～3小时，例如0.5分钟～2小时，例如0.5分钟～1小时；例如1分钟～5小时，例如5分钟～5小时，例如10分钟～5小时，例如20分钟～5小时，例如30分钟～5小时，例如45分钟～5小时，例如1小时～5小时，例如1小时～4小时，例如1小时～3小时，例如1小时～2小时)，再将超声波处理后的菌悬液置于0～8℃温度下(例如0～8℃，例如0～6℃，例如0～5℃，例如0～4℃；例如1～8℃，例如2～8℃，例如3～8℃，例如3～7℃，例如3～6℃，例如3～5℃，例如约4℃，例如在约4℃冰箱中)处理2～50天(例如2～45天，例如2～40天，例如2～35天，例如2～30天，例如2～25天；例如3～50天，例如5～50天，例如7～50天，例如10～50天，例如15～50天，例如18～50天；例如3～45天，例如5～40天，例如10～30天，例如15～25天，例如约18天、约19天、约20天、约21天、约22天，特别是例如约20天)的期间，并在该期间适时取样(例如，取样间隔可以为1小时～20天，例如约1小时、约5小时、约10小时、约15小时、约20小时、约1天、约2天、约3天、约5天、约10天、约15天、约20天的间隔)，经PDA平板涂板和反复的单菌落挑选与分离培养，纯化得到次级代谢功能获得改造的突变株。

项目2、一种改造真菌次级代谢功能的方法，其特征是，将原始真菌在含有1～1000mg/mL(例如1～800mg/mL，例如1～600mg/mL，例如1～500mg/mL，例如1～400mg/mL，例如1～300mg/mL，例如1～200mg/mL，例如1～200mg/mL；例如1～1000mg/mL，例如2～800mg/mL，例如5～600mg/mL，例如10～500mg/mL，例如15～250mg/mL；例如2～750mg/mL，例如5～500mg/mL，例如10～250mg/mL，例如15～100mg/mL或15～75mg/mL或2～50mg/mL；例如约2mg/mL、约5mg/mL、约10mg/mL、约15mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约30mg/mL、约40mg/mL、约50mg/mL、约60mg/mL、约75mg/mL、约100mg/mL，例如20或50mg/mL)卡那霉素的水混悬液状态下于0～8℃温度下(例如0～8℃，例如0～6℃，例如0～5℃，例如0～4℃；例如1～8℃，例如2～8℃，例如3～8℃，例如3～7℃，例如3～6℃，例如3～5℃，例如约4℃，例如在约4℃冰箱中)处理2～50天(例如2～45天，例如2～40天，例如2～35天，例如2～30天，例如2～25天；例如3～50天，例如5～50天，例如7～50天，例如10～50天，例如15～50天，例如18～50天；例如3～45天，例如5～40天，例如10～30天，例如15～25天，例如约18天、约19天、约20天、约21天、约22天，特别是例如约20天)的期间，并在该期间适时取样(例如，取样间隔可以为1小时～20天，例如约1小时、约5小时、约10小时、约15小时、约20小时、约1天、约2天、约3天、约5天、约10天、约15天、约20天的间隔)，经PDA平板涂板和反复的单菌落挑选与分离培养，纯化得到次级代谢功能获得改造的突变株。

项目3、一种改造真菌次级代谢功能的方法，其特征是，将原始真菌在含有1～1000mg/mL(例如1～800mg/mL，例如1～600mg/mL，例如1～500mg/mL，例如1～400mg/mL，例如1～300mg/mL，例如1～200mg/mL，例如1～200mg/mL；例如1～1000mg/mL，例如2～800mg/mL，例如5～600mg/mL，例如10～500mg/mL，例如15～250mg/mL；例如2～750mg/mL，例如5～500mg/mL，例如10～250mg/mL，例如15～100mg/mL或15～75mg/mL或2～50mg/mL；例如约2mg/mL、约5mg/mL、约10mg/mL、约15mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约30mg/mL、约40mg/mL、约50mg/mL、约60mg/mL、约75mg/mL、约100mg/mL，例如20或50mg/mL)卡那霉素的水混悬液状态下首先超声波处理0.5分钟～5小时(例如0.5分钟～4小时，例如0.5分钟～3小时，例如0.5分钟～2小时，例如0.5分钟～1小时；例如1分钟～5小时，例如5分钟～5小时，例如10分钟～5小时，例如20分钟～5小时，例如30分钟～5小时，例如45分钟～5小时，例如1小时～5小时，例如1小时～4小时，例如1小时～3小时，例如1小时～2小时)，再将超声处理后的菌悬液置于0～8℃温度下(例如0～8℃，例如0～6℃，例如0～5℃，例如0～4℃；例如1～8℃，例如2～8℃，例如3～8℃，例如3～7℃，例如3～6℃，例如3～5℃，例如约4℃，例如在约4℃冰箱中)处理2～50天(例如2～45天，例如2～40天，例如2～35天，例如2～30天，例如2～25天；例如3～50天，例如5～50天，例如7～50天，例如10～50天，例如15～50天，例如18～50天；例如3～45天，例如5～40天，例如10～30天，例如15～25天，例如约18天、约19天、约20天、约21天、约22天，特别是例如约20天)的期间，并在该期间适时取样(例如，取样间隔可以为1小时～20天，例如约1小时、约5小时、约10小时、约15小时、约20小时、约1天、约2天、约3天、约5天、约10天、约15天、约20天的间隔)，经PDA平板涂板和反复的单菌落挑选与分离培养，纯化得到次级代谢功能获得改造的突变株。

项目4、改造真菌(例如真菌野生菌株，例如无活性的真菌野生菌株)的次级代谢功能并从中筛选获取抗肿瘤活性突变株的方法，其特征是，用项目1至3任一项所述方法首先获得次级代谢功能获得改造的突变株，再经突变株的抗肿瘤活性筛选，获得活性突变株。

项目5、项目1至4任一项所述方法获得的次级代谢功能经改造的真菌突变株新产活性产物的快速分离纯化制备方法，其特征是，分别发酵原始菌及其活性突变株，对所得发酵物用丙酮水溶液(例如丙酮体积百分数为30～95％、或为35～90％、或为40～85％、或为50～85％、或为55～80％、或为60％～80％的丙酮水溶液)提取，然后对该含水丙酮提取液减压回收丙酮，然后将残留水层用乙酸乙酯萃取，分别获得原始菌乙酸乙酯萃取物和含有突变株新产活性产物的突变株乙酸乙酯萃取物，然后对突变株乙酸乙酯萃取物的每一步分离操作均采用活性跟踪与化学检测分析结合、微量预试先导→放大实验制备的实验模式，通过与所述原始菌样品直接比较对照，从突变株发酵物样品中快速跟踪分离原始菌样品中没有的突变株新产活性产物。在一个实施方案中，所述的原始菌例如是G59。

项目6、项目1至4任一项所述方法获得的次级代谢功能经改造的真菌活性突变株用于制备突变株新产药源活性化合物的用途。

项目7、项目1至4任一项所述方法在用于转化无活性真菌野生株的次级代谢功能，从而将无活性真菌野生菌株作为原始菌资源以有效拓展药源活性新菌株资源的用途。

项目8、项目1至4任一项所述方法获得的次级代谢功能经改造的突变株。或者，项目8’、项目1至4任一项所述方法获得的次级代谢功能经改良的突变株。

项目9、说明书的全部实施例任一项所述的方法、过程、试验条件、检测方法、检测条件、所用菌株、获得的突变株、次级代谢产物、以及项目1至4任一项所述方法获得的式I化合物或式II化合物。在一个实施方案中，所述的方法、过程、试验条件、检测方法、检测条件、所用菌株、获得的突变株、次级代谢产物、以及项目1至4任一项所述方法获得的式I化合物或式II化合物如说明书所述。

下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

本发明的第一个方面涉及用超声波改造真菌次级代谢功能的实验技术方法，其特征是，将原始真菌在水混悬液状态下超声波处理0.5～60分钟，再将超声处理后的菌悬液置于4℃冰箱中处理20天，并在期间适时取样，经PDA平板涂板和反复的单菌落挑选与分离培养，纯化得到次级代谢功能获得改造的突变株。

本发明的第二个方面涉及用卡那霉素改造真菌次级代谢功能的实验技术方法，其特征是，将原始真菌在含有20或50mg/mL卡那霉素的水混悬液状态下于4℃冰箱中处理20天，并在期间适时取样，经PDA平板涂板和反复的单菌落挑选与分离培养，纯化得到次级代谢功能获得改造的突变株。

本发明的第三个方面涉及组合利用超声波和卡那霉素改造真菌次级代谢功能的实验技术方法，其特征是，将原始真菌在含有20或50mg/mL卡那霉素的水混悬液状态下首先超声波处理0.5～60分钟，再将超声处理后的菌悬液置于4℃冰箱中处理20天，并在期间适时取样，经PDA平板涂板和反复的单菌落挑选与分离培养，纯化得到次级代谢功能获得改造的突变株。

本发明的第四个方面涉及改造真菌(例如真菌野生菌株，例如无活性的真菌野生菌株)的次级代谢功能并从中筛选获取抗肿瘤活性突变株的实验技术方法，其特征是，利用上述本发明的第一方面至第三个方面所涉及的实验技术，首先获得次级代谢功能获得改造的突变株，再经突变株的抗肿瘤活性筛选，获得活性突变株。

本发明的第五个方面涉及活性突变株新产活性产物的发酵生产与可快速分离提纯的突变株新产活性产物的制备方法。所述可快速分离提纯的方法是，采用活性跟踪与化学检测分析结合、微量预试先导-放大实验制备的实验模式，通过将突变株发酵产物与原始菌发酵产物进行直接对照比较，在微量预试快速确定突变株新产活性产物的TLC斑点或HPLC洗脱峰的基础上，经TLC或HPLC指导下的放大实验制备，快速分离提纯原始菌发酵物中没有的突变株新产活性产物。

所述新产活性产物的制备方法是，通过活性突变株的发酵培养与发酵物的含水丙酮提取和减压回收丙酮，获得含有新产活性产物的水混悬液，再用分离手段，纯化制备其中所含突变株新产活性化合物。所述含水丙酮是60％～90％(v/v)的含水丙酮，所述分离手段包括天然产物化学领域的专业人士所熟知的液-液萃取、柱层析、薄层层析、高效液相层析及重结晶等。

本发明采用人白血病细胞K562，用MTT法测试评价了原始菌及其突变株发酵提取样品以及所得化合物的抗肿瘤活性，并经实验证实，用本发明实验技术方法由无活性真菌野生株转化获取的活性突变株样品及其新产活性化合物有明显的抗肿瘤活性，从而实验证实了，本发明的利用超声波和卡那霉素改造真菌次级代谢功能的实验技术方法可用于无活性真菌野生株的转化和筛选获取抗肿瘤活性突变株并供药源活性产物研究，因而具有有效拓展真菌药源活性新菌株资源的用途。

如本文使用的，术语“次级代谢”具有本领域公知的含义，例如是指在一定的生长时期(例如是在稳定生长期)，微生物以初级代谢产物为前体合成的对微生物本身的生命活动没有明确功能的物质的过程。如本文使用的，术语“原始真菌”具有本领域公知的含义，例如是指，包括但不限于，已知真菌、未知真菌、从天然来源的真菌、经人工突变的真菌、有活性真菌、无活性真菌等等；相对于用本发明方法经改造的真菌突变株而言，所述“原始真菌”可以理解为是该突变株的前体物。

本发明的方法可以有效地用于从一种真菌例如无活性真菌改造成为工业可用的真菌。

具体实施方式：

下列实施例将进一步说明本发明，但并不对本发明构成限制。

在以下实施例中，以下称为G59的菌株是从采自天津塘沽驴驹河渤海湾潮间带海泥样品(于2004年9月29日清晨4～7时趁退潮至纵深约5km处的潮间带采集)分离的海洋来源真菌野生菌株。所述G59菌株于2009年12月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.3560，建议的分类命名为产紫青霉，Penicillium purpurogenum。

在以下实施例中，以下称为真菌PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基的培养基组成是：葡萄糖2％、琼脂2％、NaCl 1.5％，用200g/L马铃薯的水煮液配制，调pH 6.0；以下称为真菌液体培养基的培养基组成是：葡萄糖2％、麦芽糖1％、甘露醇2％、谷氨酸1％、蛋白胨0.5％、酵母浸粉0.3％，用200g/L马铃薯的水煮液配制，调pH 6.0。

实施例1.G59超声诱变突变株的筛选获取与次级产物检测分析

真菌原始菌株G59的菌悬液制备

取原始菌G59适量，接种于PDA固体培养基上，28℃培养活化3～10天，待孢子形成，刮取孢子适量，置于装有10mL无菌水和玻璃珠的50mL三角瓶中，震荡打碎分散孢子，即成孢子悬浮液。取该悬浮液100μL，置于96孔板中，用酶标仪监测600nm波长下的OD值，用无菌水稀释至OD值达0.35。按照酶标仪监测下的稀释倍数，用无菌水将全部孢子悬液同倍比稀释，获得原始菌G59的菌悬液。

G59的超声诱变突变株筛选

超声诱变采用天津双龙责任有限公司产CX-300型超声清洗机，工作频率为30±2kHz，工作功率为300W。

将原始菌G59的菌悬液7份各2mL，分别超声0.5、1.0、1.5、5、10、30、60分钟，并将超声处理后的菌悬液进一步分别置于4℃冰箱中处理20天。期间，在被处理第1小时、第1、3、6、10、20天，取被处理菌悬液各90μL，分别涂布于PDA固体培养基上，28℃培养箱中培养5天。在培养过程中每天观察被试菌的生长情况，待菌落形成，适时挑取形态、菌体色泽或产物颜色等不同的单菌落，用PDA平板培养基反复划线培养、分离纯化，直至分离得到纯菌株。所得突变株接种于PDA试管斜面培养基上，4℃冰箱中保存并适时传代。

发酵培养与提取制备

原始菌G59及其突变株的发酵培养均采用真菌液体发酵培养基。将各菌株适量分别接种于含有200mL真菌液体培养基的500mL三角烧瓶中，于28℃、200rpm摇床发酵培养10～15天，根据微生物生长状况适时终止培养，下摇床得发酵液。发酵液中加2倍发酵液体积的丙酮，使丙酮的体积百分含量达约66％，超声破碎菌体，离心取上清液，减压浓缩至不含丙酮，用等体积EtOAc萃取，萃取液经减压浓缩回收EtOAc，冷冻干燥，得G59及其突变株的发酵提取样品。

突变株与原始菌形态比较

将原始菌G59及其突变株分别划线接种于PDA平板培养基上，28℃培养箱中培养5～7天，肉眼观察菌落形状、菌体色泽、产生色素颜色及其渗透培养基情况等形态与外观特征。

次级产物的薄层色谱检测分析

样品溶液配制：称取G59及其突变株的发酵提取样品适量，用甲醇分别配成10mg/mL的样品溶液，供次级产物检测分析使用。

薄层色谱条件：薄层色谱采用青岛海洋化工有限公司产硅胶GF254薄层板(20cm×10cm×0.25mm)，斑点采用254或365nm紫外线照射、硫酸铈钼酸铵试剂喷洒加热或喷洒三氯化铁试剂显色检测。点样用G59及其突变株发酵提取样品的上述10mg/mL甲醇溶液，展开剂分别采用环己烷-丙酮(3∶1、1∶1、1∶2)、氯仿-甲醇(20∶1、9∶1、8∶2、7∶3)、bp 60～90℃石油醚-丙酮(5∶1、2∶1、1∶1、1∶3)、bp 60～90℃石油醚-氯仿(4∶1、2∶1、1∶1、1∶2)、氯仿-丙酮(9∶1、7∶1、5∶1、1∶1)或氯仿-甲醇-氨水(27∶6∶1、90∶10∶2)等。

色谱实验方法：各薄层板均采用同一根毛细管点样，点上相同体积的G59及其突变株发酵提取样品溶液，各薄层板均点上原始菌G59的样品作为对照，待所点样品溶液斑点的溶剂充分挥干，置于用相应展开剂预饱和并装有适量展开剂的层析缸中，采用斜立薄层板展开方式进行薄层色谱层析分离。展开结束即刻取出薄层板，待溶剂挥干，采用上述显色方式检测薄层斑点，比较分析各突变株与原始菌G59以及各突变株之间次级产物薄层斑点的差异，判断是否为突变株新产次级产物斑点以及是否为不同突变株之间重复检测到的相同斑点。

实验结果

G59的超声诱变突变株筛选获取：原始菌G59经上述超声诱变处理后在PDA平板上生长受到明显抑制，形成为数有限、形态不同的菌落，可以挑取单菌落。因此，经超声和低温处理不同时间后的单菌落挑选与分离纯化实验，筛选获得了G59的超声诱变突变株共38株，具体结果详见表1。

表1 G59的超声诱变突变株筛选获取统计结果

突变株与原始菌形态、外观特征：所获取突变株无论在突变株之间还是与原始菌G59相比，所形成菌落的形态、表面形状与颜色，菌体色泽，产色素颜色及其渗透培养基情况等外观形态特征均有明显差异。

发酵提取样品中次级产物的薄层色谱检测：经对38株突变株与原始菌G59发酵样品的薄层色谱分析，从大多突变株发酵样品中检测到原始菌G59发酵样品中没有的次级产物斑点，特别地，从下述实施例2中所述14株抗肿瘤活性突变株尤其是10株高活性抗肿瘤活性突变株发酵样品中均检测到原始菌G59发酵样品中没有的且在各突变株样品之间呈现不同层析行为的次级产物斑点。

以上实验结果表明，上述对G59的超声诱变实验已改变了所获大多突变株的次级代谢功能，使次级产物发生了变化，从而实验证实了，本发明的超声诱变实验技术可以用于人为改造真菌的次级代谢功能。

实施例2.G59的超声诱变抗肿瘤活性突变株的筛选获取

实验菌株

原始菌G59以及在上述实施例1中通过超声诱变实验得到的38株G59的超声诱变突变株。

发酵培养与样品制备

发酵培养与样品提取制备：将原始菌G59与其突变株菌体适量分别接种于含有200mL真菌液体培养基的500mL三角烧瓶中，于28℃、200rpm摇床发酵10～15天，根据微生物生长状况适时终止培养，下摇床得发酵液。发酵液中加2倍发酵液体积的丙酮(丙酮的体积百分含量达约66％)，超声破碎菌体，离心取上清液，减压浓缩至不含丙酮，用等体积EtOAc萃取，萃取液经减压浓缩回收EtOAc，冷冻干燥，得G59及其突变株的发酵提取样品。

活性测试用样品溶液的配制：精密称量G59及其突变株的发酵提取样品适量，用甲醇分别配成100mg/mL和10mg/mL的样品溶液，供筛选抗肿瘤活性。

抗肿瘤活性筛选实验方法

细胞培养与传代维护：人白血病K562细胞用含10％胎牛血清和青霉素与链霉素各100μg/mL的RPMI-1640培养基，于37℃通入5％CO₂和95％空气的培养箱中常规培养和传代维护。

活性测试方法：收集对数生长期的K562细胞，用新鲜RPMI-1640培养基，配制成细胞密度为2×10⁵个/mL的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔200μL。将接种后的细胞于37℃、通入5％的CO₂和95％空气的细胞培养箱中培养4h后，每孔加2μL样品溶液，每个样品溶液设三个平行孔，同时设三孔阴性对照。加药后继续培养24h，培养结束后首先在光学显微镜下观察药物处理后引起的细胞形态变化，判断有无细胞凋亡、细胞坏死或细胞异形等形态特征，必要时拍照，继而每孔加入20μL MTT溶液(用0.01M的PBS液配制的5mg/mL的MTT溶液)，继续置于37℃培养箱中孵育4h。2000rpm离心10min，吸去孔内上清液。每孔加150μL DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分溶解，利用酶标仪在570nm处测定每孔溶液的OD值。

空白对照和样品组均分别取平均OD值，按如下公式计算样品对细胞增殖的抑制率：抑制率％＝(OD_空白对照-OD_样品)/OD_空白对照×100％。

必要时，相同试验分别独立进行三次，求算不同浓度样品对细胞增殖的平均抑制率，再利用Bliss法计算被试样品的半数抑制浓度IC₅₀。

实验结果

原始菌样品的活性测试结果：原始菌G59样品即使在1000μg/mL的高浓度下对K562细胞也不显示任何抗肿瘤活性，1000μg/mL和100μg/mL样品对K562细胞的抑制率分别为实验误差范围内的6.9％和4.8％。经数次反复传代，在用不同传代次数的菌株从发酵培养开始独立进行的反复的活性筛选中，G59样品1000μg/mL或100μg/mL对K562细胞的抑制率均在小于6.9％的实验误差范围内波动。

突变株样品的活性筛选统计结果：经对38株突变株样品的抗肿瘤活性筛选，对K562细胞有抗肿瘤作用的共有14株，其中100μg/mL样品对K562细胞的抑制率在30％～40％之间的活性突变株4株、抑制率大于40％的高活性突变株10株，具体统计结果详见表2。

表2 G59的超声诱变突变株对K562细胞的抗肿瘤活性筛选统计结果

本表数据系根据100μg/mL样品对K562细胞的抑制活性测试结果进行统计

显微镜下细胞形态检测结果：显微镜下观测到，K562细胞经原始菌G59样品1000μg/mL和100μg/mL或除14株活性菌株以外的无活性突变株样品100μg/mL处理24小时后细胞形态无显著变化，呈与空白对照细胞相同的形态特征，表明这些样品对K562细胞无影响。

而经14株具有抗肿瘤活性的活性突变株样品尤其是高活性突变株样品100μg/mL处理24小时后，有些样品处理的部分细胞的形态则与空白对照细胞相比发生了显著变化，有些呈胞体膨胀、细胞膜昏暗膨大、细胞质凝缩、部分胞膜破裂等典型的坏死性细胞形态特征，有些呈散碎的胞膜裹着的细胞碎片或雪花瓣状等典型的凋亡细胞形态特征，而有些则呈棒状或2联3联细胞体等异型形状，与下述MTT法活性测试结果吻合。

活性突变株的MTT法活性测试结果：对所获取的原始菌G59的38株超声诱变突变株，全部都分别进行了发酵培养与发酵样品的提取制备，并在此基础上利用所制备样品，采用MTT法，测试评价了全部样品100μg/mL对K562细胞的抗肿瘤作用。结果表明，在所获取的38株突变株中，14株为抗肿瘤活性突变株，其中100μg/mL样品对K562细胞的抑制率大于40％的有10株、抑制率在30％～40％之间的有4株，活性测试结果详见表3。

表3 G59及其超声诱变突变株样品的MTT法抗肿瘤活性测试结果

本表数据系100μg/mL样品对K562细胞的抑制活性测试结果

以上实验结果以及上述实施例1中所述原始菌G59及其突变株次级产物的薄层色谱检测分析结果表明，本发明的上述14株活性突变株已代谢产生了无活性原始真菌野生株G59所不生产的具有抗肿瘤活性的次级代谢产物，从而实验证实了，本发明的超声诱变实验技术方法可以成功改造无活性真菌野生株的代谢功能，并从中高效筛选获得抗肿瘤活性突变株，因而具有将无活性真菌野生菌株作为原始菌资源有效拓展药源活性新菌株资源的实际利用价值。

实施例3.G59的自发突变卡那霉素抗性突变株的筛选获取与次级产物检测分析

真菌原始菌株G59的菌悬液制备

G59自发突变卡那霉素抗性突变株筛选

取原始菌G59的菌悬液2份各2mL，加适量卡那霉素，配制分别含卡那霉素20mg/mL和50mg/mL的菌悬液，作被处理菌悬液。将该被处理菌悬液置于4℃冰箱中处理20天。期间在被处理第1小时、第1、3、6、10、20天，取被处理菌悬液各90μL，分别涂布于PDA固体培养基上，28℃培养箱中培养5天。在培养过程中每天观察被试菌的生长情况，待菌落形成，适时挑取形态、菌体色泽或产物颜色等不同的单菌落，用PDA平板培养基反复划线培养、分离纯化，直至分离得到纯菌株。所得突变株接种于PDA试管斜面培养基上，4℃冰箱中保存并适时传代。

发酵培养与提取制备

原始菌G59及其突变株的发酵培养均采用真菌液体发酵培养基。将各菌株适量分别接种于含有200mL真菌液体培养基的500mL三角烧瓶中，于28℃、200rpm摇床发酵培养10～15天，根据微生物生长状况适时终止培养，下摇床得发酵液。发酵液中加2倍发酵液体积的丙酮，使丙酮的体积百分含量达约66％，超声破碎菌体，离心取上清液，减压浓缩至不含丙酮，用相同体积EtOAc萃取，萃取液经减压浓缩回收EtOAc，冷冻干燥，得G59及其突变株的发酵提取样品。

突变株与原始菌形态比较

次级产物的薄层色谱检测分析

薄层色谱条件：采用与上述实施例1完全相同的薄层色谱条件。

色谱实验方法：采用与上述实施例1完全相同的色谱实验方法，经薄层展开和薄层斑点的显色检测，比较分析各突变株与原始菌G59以及各突变株之间次级产物薄层斑点的差异，判断是否为突变株新产次级产物斑点以及是否为不同突变株之间重复检测到的相同斑点。

实验结果

G59自发突变卡那霉素抗性突变株的筛选获取：原始菌G59经上述处理后在PDA平板上生长受到明显抑制，形成为数有限、形态不同的菌落，可以挑取单菌落。因此，经在不同浓度卡那霉素作用下低温处理不同时间后的单菌落挑选与分离纯化实验，筛选获得了G59的自发突变卡那霉素抗性突变株共20株，具体结果详见表4。

表4 G59的自发突变卡那霉素抗性突变株筛选统计结果

发酵提取样品中次级产物的薄层色谱检测：经对20株突变株与原始菌G59发酵样品的薄层色谱分析，从大多突变株发酵样品中检测到原始菌G59发酵样品中没有的次级产物斑点，特别地，从下述实施例4中所述7株抗肿瘤活性突变株发酵样品中均检测到原始菌G59发酵样品中没有的且在各突变株样品之间呈现不同层析行为的次级产物斑点。

以上实验结果表明，上述对G59的自发突变卡那霉素抗性筛选已改变了所获大多突变株的次级代谢功能，使次级产物发生了变化，从而实验证实了，本发明的卡那霉素抗性筛选实验技术可以用于人为改造真菌的次级代谢功能。

实施例4.G59的自发突变卡那霉素抗性抗肿瘤活性突变株的筛选获取

实验菌株

原始菌G59以及在上述实施例3中通过自发突变抗性筛选实验得到的20株G59的卡那霉素抗性突变株。

发酵培养与样品制备

发酵培养与样品提取制备：将原始菌G59与其突变株菌体适量分别接种于含有200mL真菌液体培养基的500mL三角烧瓶中，于28℃、200rpm摇床发酵10～15天，根据微生物生长状况适时终止培养，下摇床得发酵液。发酵液中加2倍发酵液体积的丙酮(丙酮的体积百分含量达约66％)，超声破碎菌体，离心取上清液，减压浓缩至不含丙酮，用相同体积EtOAc萃取，萃取液经减压浓缩回收EtOAc，冷冻干燥，得G59及其突变株的发酵提取样品。

活性测试用样品溶液的配制：精密称量G59及其突变株的发酵提取样品适量，用甲醇分别配成10mg/mL的样品溶液，供筛选抗肿瘤活性。

抗肿瘤活性筛选实验方法

活性测试方法：采用上述实施例2中所述MTT法抗肿瘤活性筛选方法，测试样品对K562细胞的抑制活性。

实验结果

突变株样品的活性筛选统计结果：经对20株突变株样品的抗肿瘤活性筛选，对K562细胞有抗肿瘤作用的共7株，其中100μg/mL样品对K562细胞的抑制率在30％～40％之间的活性突变株2株、抑制率大于40％的高活性突变株5株，具体统计结果详见表5。

表5自发突变卡那霉素抗性突变株的抗肿瘤活性筛选统计结果

显微镜下细胞形态检测结果：显微镜下观测到，K562细胞经原始菌G59样品1000μg/mL和100μg/mL或无活性突变株样品100μg/mL处理24小时后细胞形态无显著变化，呈与空白对照细胞相同的形态特征，表明这些样品对K562细胞无影响。而经活性突变株样品尤其是高活性突变株样品100μg/mL处理24小时后，有些样品处理的部分细胞的形态与空白对照细胞相比发生显著变化，有些呈胞体膨胀、细胞膜昏暗膨大、细胞质凝缩、部分胞膜破裂等典型的坏死性细胞形态特征，有些呈散碎的薄膜裹着的细胞碎片或雪花瓣状等典型的凋亡细胞形态特征，而有些则呈棒状或2联3联细胞体等异型形状，与下述MTT法活性测试结果吻合。

活性突变株的MTT法活性测试结果：对所获取的原始菌G59的20株自发突变卡那霉素抗性突变株，全部都分别进行了发酵培养与发酵样品的提取制备，并在此基础上利用所制备样品，采用MTT法，测试了全部样品100μg/mL对K562细胞的抗肿瘤作用。结果表明，在所获取的20株突变株中7株为抗肿瘤活性突变株，其中100μg/mL样品对K562细胞的抑制率大于40％的5株、抑制率在30％～40％之间的2株，活性测试结果详见表6。

表6 G59及其自发突变卡那霉素抗性突变株的抗肿瘤活性测试结果

本表数据系100μg/mL样品对K562细胞的抑制活性MTT法测试结果

以上实验结果以及上述实施例3中所述原始菌G59及其突变株次级产物的薄层色谱检测分析结果表明，本发明的上述7株活性突变株已代谢产生了无活性原始真菌野生株G59所不生产的具有抗肿瘤活性的次级代谢产物，从而实验证实了，本发明的卡那霉素抗性筛选实验技术可以改造无活性真菌野生株的代谢功能，并从中筛选获得抗肿瘤活性突变株，因而具有将无活性真菌野生菌株作为原始菌资源有效拓展药源活性新菌株资源的实际利用价值。

实施例5.G59的超声诱变卡那霉素抗性突变株的筛选获取与次级产物检测分析

真菌原始菌株G59的菌悬液制备

G59的超声诱变卡那霉素抗性突变株筛选

超声诱变采用天津双龙责任有限公司产CX-300型超声清洗机，工作频率为30±2kHz，工作功率为300W。取原始菌G59的菌悬液14份各2mL，加适量卡那霉素，分别配制含卡那霉素20mg/mL的菌悬液7份和含卡那霉素50mg/mL的菌悬液7份。将含卡那霉素20mg/mL和50mg/mL的菌悬液各7份分别超声0.5、1.0、1.5、5、10、30、60分钟，并将超声处理后的菌悬液分别置于4℃冰箱中进一步处理20天。期间在被处理第1小时、第1、3、6、10、20天，取被处理菌悬液各90μL，分别涂布于PDA固体培养基上，28℃培养箱中培养5天。在培养过程中每天观察被试菌的生长情况，待菌落形成后适时挑取形态、菌体色泽或产物颜色等不同的单菌落，用PDA平板培养基反复划线培养、分离纯化，直至分离得到纯菌株。所得突变株接种于PDA试管斜面培养基上，4℃冰箱中保存并适时传代。

发酵培养与提取制备

突变株与原始菌形态比较

次级产物的薄层色谱检测分析

色谱实验方法：采用与上述实施例完全相同的色谱实验方法，经薄层展开和薄层斑点的显色检测，比较分析各突变株与原始菌G59以及各突变株之间次级产物薄层斑点的差异，判断是否为突变株新产次级产物斑点以及是否为不同突变株之间重复检测到的相同斑点。

实验结果

G59的超声诱变卡那霉素抗性突变株的筛选获取：原始菌G59经上述处理后在PDA平板上生长受到明显抑制，形成为数有限、形态不同的菌落，可以挑取单菌落。因此，经在不同浓度卡那霉素存在下不同时间超声和低温处理后的单菌落挑选与分离纯化实验，筛选获得了G59的超声诱变卡那霉素抗性突变株共71株，具体结果详见表7。

表7 G59的超声诱变卡那霉素抗性突变株筛选统计结果

发酵提取样品中次级产物的薄层色谱检测：经对71株突变株与原始菌G59发酵样品的薄层色谱分析，从大多突变株发酵样品中检测到原始菌G59发酵样品中没有的次级产物斑点，特别地，从下述实施例6中所述25株抗肿瘤活性突变株发酵样品中均检测到原始菌G59发酵样品中没有的且在各突变株样品之间呈现不同层析行为的次级产物斑点。

以上实验结果表明，上述对G59的超声诱变卡那霉素抗性筛选已改变了所获大多突变株的次级代谢功能，使次级产物发生了变化，从而实验证实了，本发明的超声诱变卡那霉素抗性筛选实验技术可以用于人为改造真菌的次级代谢功能。

实施例6.G59的超声诱变卡那霉素抗性抗肿瘤活性突变株的筛选获取

实验菌株

原始菌G59以及在上述实施例5中通过超声诱变抗性筛选实验得到的71株G59的卡那霉素抗性突变株。

发酵培养与样品制备

抗肿瘤活性筛选实验方法

实验结果

原始菌样品的活性测试结果：原始菌G59样品即使在1000μg/mL的高浓度下对K562细胞也不显示任何抗肿瘤活性，在反复活性筛选中，1000μg/mL或100μg/mL的抑制率均小于6.9％。

突变株样品的活性筛选统计结果：经对71株突变株样品的抗肿瘤活性筛选，对K562细胞有抗肿瘤作用的共25株，其中100μg/mL样品对K562细胞的抑制率在30％～40％之间的活性突变株15株、抑制率大于40％的高活性突变株10株，具体统计结果详见表8。

表8 超声诱变卡那霉素抗性突变株的抗肿瘤活性筛选统计结果

显微镜下细胞形态检测结果：显微镜下观测到，K562细胞经原始菌G59样品或无活性突变株样品处理24小时后细胞形态无显著变化，呈与空白对照细胞相同的形态特征，表明这些样品对K562细胞无影响。而经活性突变株样品100μg/mL处理24小时后，部分细胞呈胞体膨胀、细胞膜昏暗膨大、细胞质凝缩、部分胞膜破裂等典型的坏死性细胞形态特征，有些呈散碎的薄膜裹着的细胞碎片或雪花瓣状等典型的凋亡细胞形态特征，而有些则呈棒状或2联3联细胞体等异型形状。

活性突变株的MTT法活性测试结果：在71株突变株中，25株为抗肿瘤活性突变株，其中100μg/mL样品对K562细胞的抑制率大于40％的10株、抑制率在30％～40％之间的15株，活性测试结果详见表9。

表9 G59及其超声诱变卡那霉素抗性突变株样品的抗肿瘤活性测试结果

本表数据系100μg/mL样品对K562细胞的抑制活性MTT法测试结果

以上实验结果以及上述实施例5中所述原始菌G59及其突变株次级产物的薄层色谱检测分析结果表明，本发明的上述25株活性突变株已代谢产生了无活性原始真菌野生株G59所不生产的具有抗肿瘤活性的次级代谢产物，从而实验证实了，本发明的超声诱变卡那霉素抗性筛选实验技术可以改造无活性真菌野生株的代谢功能，并从中高效筛选获得抗肿瘤活性突变株，因而具有将无活性真菌野生菌株作为原始菌资源有效拓展药源活性新菌株资源的实际利用价值。

实施例7.G59的超声诱变抗肿瘤活性突变株N3001d1-1新产的苯并γ吡喃酮类抗肿瘤活性产物研究

实验菌株

原始菌G59以及经上述实施例1中对无活性原始真菌野生株G59的超声诱变和实施例2中对所获突变株的抗肿瘤活性筛选实验，筛选获得的G59的超声诱变抗肿瘤活性突变株N3001d1-1。

在反复活性筛选中，原始菌G59的发酵粗提样品对K562细胞无任何抗肿瘤作用，1000μg/mL或100μg/mL样品对K562细胞的抑制率均在小于6.9％的实验误差范围内波动，而G59的超声诱变抗肿瘤活性突变株N3001d1-1的发酵粗提样品基本稳定重现抗肿瘤活性，如在上述实施例2中100μg/mL样品对K562细胞的抑制率为54.5％，而在以后的反复筛选中100μg/mL样品的抑制率一直大于50％。

发酵培养与样品制备

从保存在4℃冰箱中的PDA试管斜面，取G59的超声诱变突变株N3001d1-1适量，划线接种于PDA平板培养基上，28℃培养箱中活化培养5天，刮取PDA平板上新生孢子，用200mL无菌水配制成孢子悬液。将该孢子悬液每份2mL分别接种到100个内含200mL真菌液体培养基的500mL锥形瓶中，28℃、200rpm摇床发酵15天。将发酵物(约20L)经四层纱布过滤分为滤液和菌体两部分。滤液直接用等体积乙酸乙酯萃取3次，得滤液的乙酸乙酯萃取液。而菌体则加适量70％(v/v)丙酮水，超声破碎菌体提取，滤取含水丙酮，减压浓缩蒸去丙酮，残余水层用等体积乙酸乙酯萃取3次，得菌体提取物的乙酸乙酯萃取液。合并滤液和菌体来源乙酸乙酯萃取液，减压浓缩，得突变株N3001d1-1的乙酸乙酯浸膏(16g)，供在以下实验中跟踪分离突变株新产活性产物使用。此外，采用完全相同方法，经对G59的200mL发酵与提取操作，制得G59的乙酸乙酯浸膏(108mg)，供在以下实验中作为对照使用。

突变株N3001d1-1新产抗肿瘤活性产物的跟踪分离

在以下实验中，抗肿瘤活性筛选均采用上述实施例2中所述完全相同的实验方法，测试样品对K562细胞的抑制活性。以下所述每一步分离操作均采用抗肿瘤活性筛选与三氯化铁试剂喷雾显色的薄层色谱化学检测相结合、微量预试先导→放大实验制备的实验模式，通过与原始菌G59样品直接进行对照比较，跟踪分离原始菌G59样品中没有的突变株N3001d1-1新产酚酸类抗肿瘤活性产物。

将突变株N3001d1-1的乙酸乙酯浸膏(16g)用适量乙酸乙酯溶解，加35g硅胶(100～200目)吸附干燥，添加到装有105g硅胶(100-200目)的玻璃减压柱中，用二氯甲烷-甲醇(100∶0→0∶100)进行减压梯度洗脱。洗脱液每250mL为一个流份，共接86个流份，再根据硅胶薄层色谱检测结果，合并得到11个组分Fr-1～Fr-11。其中被二氯甲烷洗脱的组分Fr-2(1.4g)为活性组分，100μg/mL对K562细胞的抑制率为56.6％。组分Fr-2(1.4g)用适量二氯甲烷-甲醇(v/v＝1∶1)溶解，湿法上在二氯甲烷-甲醇(v/v＝1∶1)中预装的Sephadex LH-20柱(柱床：2×150cm)，用相同溶剂洗脱，根据薄层检测结果收集洗脱液合并浓缩，得8个组分Fr-21～Fr-28。将其中有活性的组分Fr-24(40mg)在二氯甲烷-甲醇(v/v＝1∶1)中反复重结晶，得到原始菌G59样品中没有的突变株N3001d1-1新产的苯并γ吡喃酮类抗肿瘤活性产物式I化合物(8mg)。

式I

式I中阿拉伯数字表示标位

式I化合物的波谱数据与抗肿瘤活性

式I化合物：无色针状结晶(二氯甲烷-甲醇)，正离子ESI-MS m/z：231[M+H]⁺，253[M+Na]⁺。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：12.16(1H，s，HO-10)，6.72(1H，br s，H-7)，6.62(1H，br s，H-9)，3.04(2H，m，H-2)，2.66(2H，m，H-3)，2.36(3H，s，H-14)。¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)δ：197.5(C-1)，189.7(C-4)，178.0(C-12)，161.8(C-10)，156.3(C-6)，148.2(C-8)，117.9(C-13)，114.2(C-9)，108.6(C-11)，108.0(C-7)，33.8(C-2)，26.1(C-3)，22.4(C-14)。

经抗肿瘤活性筛选，式I化合物对K562细胞呈一定抗肿瘤活性，100μg/mL的抑制率为37.9％。

综上，原始真菌野生株G59的发酵粗提样品即使在1000μg/mL的高浓度下对K562细胞也无任何抑制作用，而G59的超声诱变突变株N3001d1-1的发酵粗提样品对K562细胞有显著抗肿瘤活性，100μg/mL对K562细胞的抑制率达54.5％。本实施例从N3001d1-1的发酵物中经简单的几步提取分离和纯化精制操作便分离得到了对K562细胞有抗肿瘤活性的突变株N3001d1-1新产的苯并γ吡喃酮类抗肿瘤活性产物式I化合物。

以上实验结果表明，从无活性原始真菌野生株G59的超声诱变抗肿瘤活性突变株发酵物中可以比较容易地快速分离得到活性突变株新产抗肿瘤活性产物，从而实验证实了，本发明经对无活性真菌野生株G59的超声诱变获取的抗肿瘤活性突变株可作为活性菌株新资源用于药源活性新产物的深入研究，从而进一步实验证实了，本发明的实验技术方法具有将无活性真菌野生菌株作为原始菌资源有效拓展药源活性新菌株资源的实际利用价值。

实施例9.G59的超声诱变抗肿瘤活性突变株N3001d1-1新产的生物碱类抗肿瘤活性产物研究

实验菌株

发酵培养与样品制备

采用上述实施例8中所述完全相同的方法，经活性突变株N3001d1-1的15天摇床发酵(约20L)和提取操作，得突变株N3001d1-1的乙酸乙酯浸膏(17.2g)，供在以下实验中跟踪分离突变株新产活性产物使用。此外，采用完全相同方法，经对G59的200mL发酵与提取操作，制得G59的乙酸乙酯浸膏(110mg)，供在以下实验中作为对照使用。

突变株N3001d1-1新产抗肿瘤活性产物的跟踪分离

在以下实验中，抗肿瘤活性筛选均采用上述实施例2中所述完全相同的实验方法，测试样品对K562细胞的抑制活性。以下所述每一步分离操作均采用抗肿瘤活性筛选与碘-碘化铋钾试剂喷雾显色的薄层色谱化学检测相结合、微量预试先导→放大实验制备的实验模式，通过与原始菌G59样品直接进行对照比较，跟踪分离原始菌G59样品中没有的突变株N3001d1-1新产生物碱类抗肿瘤活性产物。

将突变株N3001d1-1的乙酸乙酯浸膏(17.2g)用适量乙酸乙酯溶解，加36g硅胶(100～200目)吸附干燥，添加到装有108g硅胶(100-200目)的玻璃减压柱中，用二氯甲烷-甲醇(100∶0→0∶100)进行减压梯度洗脱。洗脱液每250mL为一个流份，共接91个流份，再根据硅胶薄层色谱检测结果，合并得到共15个组分Fr-1～Fr-15。其中，被二氯甲烷-甲醇(98∶2→95∶5)洗脱的组分Fr-9(0.86g)为活性组分，100μg/mL对K562细胞的抑制率为72.8％。组分Fr-9(0.86g)用适量二氯甲烷-甲醇(v/v＝1∶1)溶解，湿法上在二氯甲烷-甲醇(v/v＝1∶1)中预装的Sephadex LH-20柱(柱床：2×150cm)，并用相同溶剂洗脱，根据薄层检测结果收集洗脱液合并浓缩，分为2个组分Fr-9-1～Fr-9-2。其中有活性的组分Fr-9-1(350mg)进一步用SephadexLH-20柱(柱床：2×150cm)进行反复的层析(二氯甲烷-甲醇v/v＝1∶1洗脱)分离和纯化，再经氯仿中重结晶精制，得到原始菌G59样品中没有的突变株N3001d1-1新产生物碱类抗肿瘤活性产物式II化合物(6mg)。

式II

式II中阿拉伯数字表示标位

式II化合物的波谱数据与抗肿瘤活性

式II化合物：白色针状结晶(氯仿)，[α]_D ³¹-151°(c 0.24，CHCl₃)。正离子ESI-MS m/z：444[M+H]⁺；负离子ESI-MS m/z：442[M-H]^-。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：8.01(1H，br s，H-7)，7.34-7.18(7H，m，H-8，H-10，H-14，H-15，H-16，H-17，H-18)，7.11(1H，td，J＝7.6，0.8Hz，H-9)，6.73(1H，br s，H-2)，6.01(1H，br s，H-5a)，5.69(1H，dd，J＝17.4，10.9Hz，H-20)，5.10(1H，d，J＝10.9Hz，Hcis-21)，5.08(1H，d，J＝17.4Hz，Htrans-21)，4.26(1H，dd，J＝8.1，3.1Hz，H-3)，3.73(1H，dd，J＝11.9，5.0Hz，H-11a)，3.39(1H，dd，J＝14.2，3.3Hz，Ha-12)，2.97(1H，dd，J＝14.2，8.1Hz，Hb-12)，2.65(3H，s，H₃-23)，2.47(1H，dd，J＝11.9，5.0Hz，Ha-11)，2.03(1H，t，J＝11.9Hz，Hb-11)，1.06(3H，s，H₃-19a)，0.94(3H，s，H₃-19b)。¹³C-NMR(100 MHz，CDCl₃)δ：170.0(C-22)，167.9(C-1)，164.4(C-4)，143.2(C-7a)，142.8(C-20)，135.2(C-13)，131.7(C-10a)，129.3(2C，C-14，18)，128.8(3C，C-15，17，18)，127.2(C-16)，124.3(2C，C-9，10)，118.7(C-7)，114.3(C-21)，79.1(C-5a)，60.8(C-10b)，58.8(C-11a)，55.8(C-3)，40.1(C-19)，36.9(C-12)，36.2(C-11)，23.5(C-23)，23.0(C-19b)，22.1(C-19a)。

经抗肿瘤活性筛选，式II化合物对K562细胞呈较强抗肿瘤活性，100μg/mL的抑制率为65.0％。

综上，原始真菌野生株G59的发酵粗提样品即使在1000μg/mL的高浓度下对K562细胞也无任何抑制作用，而G59的超声诱变突变株N3001d1-1的发酵粗提样品对K562细胞有显著抗肿瘤活性，100μg/mL抑制率达54.5％。本实施例从N3001d1-1的发酵物中经简单的几步提取分离和纯化精制操作便分离得到了对K562细胞有抗肿瘤活性的突变株N3001d1-1新产的生物碱类抗肿瘤活性产物式II化合物。

以上实验结果表明，从无活性原始真菌野生株G59的超声诱变抗肿瘤活性突变株发酵物中可以比较容易地快速分离得到活性突变株新产抗肿瘤活性产物，从而实验证实了，本发明经对无活性真菌野生株G59的超声诱变获取的抗肿瘤活性突变株可作为活性菌株新资源用于药源活性新产物的研究，从而进一步实验证实了，本发明的实验技术方法具有将无活性真菌野生菌株作为原始菌资源有效拓展药源活性新菌株资源的实际利用价值。

结论：

本发明的超声诱变实验技术以及自发突变和超声诱变抗生素抗性筛选实验技术对真菌次级代谢功能可实施成功改造，可用于无活性真菌野生株的有效转化和高效筛选获取抗肿瘤活性突变株，而所获得的活性突变株可供开展活性产物的深入研究，并从中发现突变株新产药源活性化合物。因此，本发明的实验技术方法具有将无活性真菌野生菌株作为原始菌资源有效拓展药源活性新菌株资源的实际利用价值。

Claims

1.一种改造真菌次级代谢功能的方法，其特征是，将原始真菌在水混悬液状态下超声波处理0.5分钟～5小时，再将超声波处理后的菌悬液置于0～8℃温度下处理2～50天的期间，并在该期间适时取样，经PDA平板涂板和反复的单菌落挑选与分离培养，纯化得到次级代谢功能获得改造的突变株。

2.一种改造真菌次级代谢功能的方法，其特征是，将原始真菌在含有1～1000mg/mL卡那霉素的水混悬液状态下于0～8℃温度下处理2～50天的期间，并在该期间适时取样，经PDA平板涂板和反复的单菌落挑选与分离培养，纯化得到次级代谢功能获得改造的突变株。

3.一种改造真菌次级代谢功能的方法，其特征是，将原始真菌在含有1～1000mg/mL卡那霉素的水混悬液状态下首先超声波处理0.5分钟～5小时，再将超声处理后的菌悬液置于0～8℃温度下处理2～50天的期间，并在该期间适时取样，经PDA平板涂板和反复的单菌落挑选与分离培养，纯化得到次级代谢功能获得改造的突变株。

4.改造真菌的次级代谢功能并从中筛选获取抗肿瘤活性突变株的方法，其特征是，用权利要求1至3任一项所述方法首先获得次级代谢功能获得改造的突变株，再经突变株的抗肿瘤活性筛选，获得活性突变株。

5.权利要求1至4任一项所述方法获得的次级代谢功能经改造的真菌突变株新产活性产物的快速分离纯化制备方法，其特征是，分别发酵原始菌及其活性突变株，对所得发酵物用丙酮水溶液提取，然后对该含水丙酮提取液减压回收丙酮，然后将残留水层用乙酸乙酯萃取，分别获得原始菌乙酸乙酯萃取物和含有突变株新产活性产物的突变株乙酸乙酯萃取物，然后对突变株乙酸乙酯萃取物的每一步分离操作均采用活性跟踪与化学检测分析结合、微量预试先导→放大实验制备的实验模式，通过与所述原始菌样品直接比较对照，从突变株发酵物样品中快速跟踪分离原始菌样品中没有的突变株新产活性产物。

6.权利要求1至4任一项所述方法获得的次级代谢功能经改造的真菌活性突变株用于制备突变株新产药源活性化合物的用途。

7.权利要求1至4任一项所述方法在用于转化无活性真菌野生株的次级代谢功能，从而将无活性真菌野生菌株作为原始菌资源以有效拓展药源活性新菌株资源的用途。

8.权利要求1至4任一项所述方法获得的次级代谢功能经改造的突变株；或者，权利要求1至4任一项所述方法获得的次级代谢功能经改良的突变株。

9.说明书的全部实施例任一项所述的方法、过程、试验条件、检测方法、检测条件、所用菌株、获得的突变株、次级代谢产物、以及权利要求1至4任一项所述方法获得的式I化合物或式II化合物，所述的方法、过程、试验条件、检测方法、检测条件、所用菌株、获得的突变株、次级代谢产物、以及权利要求1至4任一项所述方法获得的式I化合物或式II化合物如说明书所述。