CN102731458A

CN102731458A - 双异戊烯基香豆素及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102731458A
Application number: CN201210242294XA
Authority: CN
Inventors: 罗雄明; 张偲; 尹浩; 李传荣; 李庆欣
Original assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2012-07-12
Filing date: 2012-07-12
Publication date: 2012-10-17
Anticipated expiration: 2032-07-12
Also published as: CN102731458B

Abstract

本发明公开了一种双异戊烯基香豆素及其制备方法和应用。本发明从大管（Micromelum falcatum）中分离得到一个新的化合物—如式（I）所示的双异戊烯基香豆素，该化合物对卤虫的LD₅₀值为25.5μg/mL，对藤壶幼虫的抗附着活性浓度IC₅₀是6.77μg/mL；对肺癌细胞HvEvc的平均半数抑制率IC₅₀为76.4μg/mL，因此可将该化合物用于制备抗卤虫药物、抗污损生物幼虫附着药物和抗肿瘤药物或作为前导化合物，具有广阔的应用前景。

Description

双异戊烯基香豆素及其制备方法和应用

技术领域：

本发明属于天然产物领域，具体涉及一个双异戊烯基香豆素及其制备方法和在制备抗癌药物、抗卤虫药物和抗污损生物幼虫附着药物方面的应用。

背景技术：

芸香科小芸木属大管(Micromelum falcatum)中曾经分离得到生物碱yuehchukene和5，6-pyranoglycozoline，香豆素micromelin，phebalosin和murpanidin等化合物。(参考文献：Kong YC，But PPH，Ng KH，Li Q，Cheng KF，Waterman PG，Biochem.Syst.Ecol.，1988，16：485)。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一个具有抗癌、抗卤虫和抗污损生物幼虫附着活性的双异戊烯基香豆素或其盐。

本发明的双异戊烯基香豆素或其盐，其结构式如式(I)所示：

本发明的第二个目的是提供如式(I)所示的双异戊烯基香豆素的制备方法，其特征在于，将大管(Micromelum falcatum)切碎，用乙醇或乙醇水溶液浸提，浸提液浓缩得到粗提取物，将粗提取物悬浮于水中，用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相浓缩得乙酸乙酯萃取物，将得到的乙酸乙酯萃取物进行硅胶柱层析，以石油醚/丙酮作为洗脱剂，从体积比9:1到3:7进行梯度洗脱，将体积比6:4梯度下洗脱的馏分点板，进行薄层层析，以体积比为9:1的氯仿/丙酮溶剂系统作为展开剂，将比移值为0.3的馏分合并，脱去色素即得如式（I）表示的双异戊烯基香豆素。

所述的浓缩可以采用常规的方法浓缩，例如减压浓缩等。

所述的脱去色素可采用常规的方法如凝胶色谱柱脱去色素等，优选经凝胶柱层析，以甲醇为洗脱剂脱去色素。

本发明通过实验发现，如式（I）所示的双异戊烯基香豆素对卤虫的LD₅₀值为25.5μg/mL；对藤壶幼虫的抗附着活性浓度IC₅₀分别是6.77μg/mL；对肺癌细胞HvEvc的平均半数抑制率IC₅₀为76.4μg/mL。

因此本发明的第三个目的是提供如式（I）所示的双异戊烯基香豆素或其盐在制备抗卤虫药物中的应用。

本发明的第四个目的是提供如式（I）所示的双异戊烯基香豆素在制备抗污损生物幼虫附着药物中的应用。

所述的污损生物幼虫优选为藤壶幼虫。

本发明的第五个目的是提供如式（I）所示的双异戊烯基香豆素在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述的抗肿瘤药物优选为抗肺癌药物。

本发明从大管（Micromelum falcatum）中分离得到一个新的化合物如式（I）所示的双异戊烯基香豆素，该化合物对卤虫的LD₅₀值为25.5μg/mL，对藤壶幼虫的抗附着活性浓度IC₅₀是6.77μg/mL；对肺癌细胞HvEvc的平均半数抑制率IC₅₀为76.4μg/mL，因此可将该化合物用于制备抗卤虫药物、抗污损生物幼虫附着药物和抗肿瘤药物或作为前导化合物，具有广阔的应用前景。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：双异戊烯基香豆素的分离和结构鉴定

以10kg大管树枝为原料，切碎后用体积分数95%的乙醇水溶液浸提，将提取液减压浓缩，得粗提取物。将粗提取物悬溶于2000mL水中，用等体积的乙酸乙酯2000mL萃取4次，合并萃取液减压浓缩得到乙酸乙酯萃取物113g，将乙酸乙酯萃取物进行常压硅胶柱层析（高1.5m，直径10cm的玻璃柱，硅胶200~300目），以石油醚/丙酮溶剂系统为洗脱液，从体积比9：1到3：7进行梯度洗脱，将体积比为6：4梯度洗脱的馏分点板，进行TLC(GF₂₅₄)分析，以体积比为9：1的氯仿/丙酮溶剂系统为展开液，将R_f值为0.30的馏分合并，上Sephadex LH-20凝胶柱层析以除色素，以甲醇为洗脱液冲洗（高1.0m，直径3cm的玻璃柱，纯甲醇洗脱），得到化合物1共7.2mg。

化合物1：外观为无色油状。高分辨质谱HREI-MS m/z 374.1728（C₂₁H₂₆O₆ ⁺[M]⁺，计算值：374.1724)。其氢谱(¹H-NMR)数据和碳谱(¹³C-NMR)数据见表1，这些数据都是以四甲基硅烷（TMS）为内标，分别在500MHz和125MHz的核磁共振仪上测定，溶剂都是CDCl₃，化学位移以ppm为单位，耦合常数J，单位为Hz。紫外UV：282.0,323.0nm表明具有7-甲基取代香豆素骨架，红外IR：3541,1739,1732,1604,1543,1450,1223cm^-1表明具有苯环、酯键和羟基。通过分析表1中一维和二维数据表明存在8位取代-7位甲氧基的香豆素基团，一个异戊烯基和一个△₁′-4′,5′-双氧取代异戊烯基。COSY谱相关表明H-4″(δ0.95)/H-3″(δ2.11)/H-2″(δ2.25)相关。HMBC谱表明H-2″与C-1″(δ173.2),C-3″(δ25.6),C-4″(δ22.1)和C-5″(δ22.1)相关，H-3″与C-1″,C-2″(δ43.4)，C-4″和C-5″相关，H-4″与C-2″，C-3″和C-5″相关，证明了具有异戊烯基。The COSY谱H-1′(δ6.92)/H-2′(δ6.67),H-2′/H-3′(δ2.85),H-3′/H-4′(δ4.32)和H-3′/H-5′(δ3.76)证明了△₁′-4′,5′-双氧取代异戊烯基。HMBC谱H-4′/C-1″(δ173.2)相关和H-1′/C-7/C-8/C-9相关表明以上三个基团通过C-1″/C-4′酯键和C-1′/C-8碳碳键相联，HMBC谱δ_H 3.92(3H,s)和C-7(δ160.6)证明甲氧基在C-7上，HMBC谱δ_H 3.56(3H,s)和C-5′(δ63.4)证明甲氧基在C-5′上，H-1′与H-2′间的耦合常数16.4Hz表明C-1′与C-2′是反式。因此，化合物1鉴定其结构式如式（I）所示。

表1：式(I)所述的化合物1的氢谱和碳谱数据

实施例2：细胞毒活性试验－卤虫生物致死法

取卤虫卵150mg置于500mL烧杯中，加入人工海水500mL，用一小充气泵缓缓充气，室温孵化24h，除去卵壳及未孵化的卵，卤虫幼虫继续培养24h，备用。

依照Solis的改良法，取96孔细胞培养板，每孔加200μL含10~15个卤虫幼虫的人工海水液，制成测试培养板。设置一个空白对照组和样品组，其中每组各设三个平行孔，在空白对照组加5μL二甲基亚砜溶液(DMSO)，样品组加入5μL的实施例1得到的化合物1溶液（将化合物1用二甲基亚砜溶解，配制成不同浓度），使的样品组中三个平行孔的化合物终浓度分别为500μg/mL、50μg/mL、5μg/mL，室温培养24h后，在双目解剖镜下检测计数卤虫死亡个体数目。卤虫生物致死活性用校正死亡率表示，按下列公式计算：校正死亡率＝（对照组存活率－处理组存活率）/对照组存活率×100％。并将校正死亡率输入SPSS计算软件，计算LC₅₀。结果得出，化合物1的平均LD₅₀值为25.5μg/mL。

实施例3：噻唑蓝(MTT)法测试化合物1的抗乳腺癌的活性试验

收集乳腺癌细胞（F10），接种100μL于96孔板中，每孔细胞数大约为1.0×10⁵个，孔板放入CO₂培养箱中，37℃，5%CO₂常规培养24小时。加入10倍稀释的，实施例1得到的化合物1的溶液（将化合物1用二甲基亚砜溶解，配制成20mg/mL）100μL，取3个平行，常规培养24小时，阴性对照不加药物。再吸出培养液，每孔加完全培养基150μL和浓度2mg/mL的MTT50μL,培养4小时后吸出液体，加DMSO150μL，振荡10min，酶标仪490nm下测定结果。计算细胞生长抑制率，计算公式如下：生长抑制率（%）＝[（A_阴性－A_试验）/(A_阴性－A_空白)]×100%。再利用SPSS软件计算，得出结构式如式(I)所示的化合物1对乳腺癌细胞的平均半数抑制率IC₅₀为大于200μg/mL，表现无明显活性。

实施例4：MTT法测试化合物1的抗肺癌活性试验

收集肺癌细胞HvEvc，接种100μL于96孔板中，每孔细胞数大约为1.0×10⁵个，孔板放入CO₂培养箱中，37℃，5%CO₂常规培养24小时。加入10倍稀释的，实施例1得到的化合物1的溶液（将化合物1用二甲基亚砜溶解，配制成20mg/mL）100μL，取3个平行，常规培养24小时，阴性对照不加药物。再吸出培养液，每孔加完全培养基150μL和浓度2mg/mL的MTT50μL，培养4小时后吸出液体，加DMSO150μL，振荡10min，酶标仪490nm下测定结果。按照实施例3的方法计算细胞生长抑制率，再利用SPSS软件计算，得出结构式如式(I)表示的化合物1对肺癌细胞的平均半数抑制率IC₅₀为76.4μg/mL，具有一定的细胞毒活性。

实施例5：抗污损生物幼虫的附着活性

采用24孔板测定实施例1得到化合物1的抗藤壶幼虫附着活性。

每个培养板孔中加入1mL含有10~15个成熟的藤壶幼虫的培养液，将实施例1得到的化合物1溶于DMSO，然后加入到培养板孔的含有10~15个成熟的藤壶幼虫的培养液中，使化合物1的终浓度分别为100μg/mL、10μg/mL、1.0μg/mL和0.1μg/mL，每个浓度3个平行，并以无菌海水做空白对照。将培养板置于室温下常规培养24小时，在解剖镜下统计附着的幼虫数，用SPSS程序进行统计分析。统计结果显示，化合物1在浓度100μg/mL、10μg/mL、1.0μg/mL和0.1μg/mL时对藤壶幼虫的平均附着率分别是11.4%，22.3%，46.5%，57.1%；空白对照组对藤壶幼虫的平均附着率为62.9%。根据幼虫附着抑制率＝（空白对照－附着率）/空白对照×100%的公式计算化合物1的抗幼虫附着活性，得出化合物1的抗藤壶幼虫附着活性浓度IC₅₀是6.77μg/mL，由此说明化合物1具有抗污损生物幼虫附着活性。

Claims

1.下述式（I）表示的双异戊烯基香豆素或其盐：

2.一种权利要求1所述的双异戊烯基香豆素的制备方法，其特征在于，将大管（Micromelumfalcatum）切碎，用乙醇或乙醇水溶液浸提，浸提液浓缩得到粗提取物，将粗提取物悬浮于水中，用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相浓缩得乙酸乙酯萃取物，将得到的乙酸乙酯萃取物进行硅胶柱层析，以石油醚/丙酮作为洗脱剂，从体积比9:1到3:7进行梯度洗脱，将体积比6:4梯度下洗脱的馏分点板，进行薄层层析，以体积比为9:1的氯仿/丙酮溶剂系统作为展开剂，将比移值为0.3的馏分合并，脱去色素即得如式（I）表示的双异戊烯基香豆素。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的浓缩为减压浓缩。

4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述的脱去色素是经凝胶柱层析，以甲醇为洗脱剂脱去色素。

5.权利要求1所述的双异戊烯基香豆素或其盐在制备抗卤虫药物中的应用。

6.权利要求1所述的双异戊烯基香豆素或其盐在制备抗污损生物幼虫附着药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的污损生物幼虫为藤壶幼虫。

8.权利要求1所述的双异戊烯基香豆素或其盐在制备抗肿瘤药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物为抗肺癌药物。