CN111304129B - 一种绛红小单孢菌突变型菌株、制备方法以及在硫酸庆大霉素制备中的应用 - Google Patents

一种绛红小单孢菌突变型菌株、制备方法以及在硫酸庆大霉素制备中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种绛红小单孢菌突变型菌株、制备方法以及在硫酸庆大霉素制备中的应用，能够明显提高发酵单位，降低硫酸庆大霉素产品的杂质，符合《中国药典》(2015版)的要求。改进前硫酸庆大霉素的发酵单位<2000u/ml；生产的硫酸庆大霉素产品其产品总杂＞11％，西索米星＞9％，小诺霉素＞2.5％。本发明硫酸庆大霉素的发酵单位>4500u/ml，平均为5007u/ml，较改进前提高176％；生产的硫酸庆大霉素产品其产品总杂＜5％，平均为3.06％，较改进前降低75％；西索米星＜2％，平均为1.55％，较改进前降低84％；小诺霉素＜2.5％，平均为2.37％，较改进前降低9％。

Description

一种绛红小单孢菌突变型菌株、制备方法以及在硫酸庆大霉 素制备中的应用
技术领域
本发明涉及一种绛红小单孢菌突变型菌株，具体涉及一种绛红小单孢菌突变型菌株、制备方法以及在硫酸庆大霉素制备中的应用。属于抗生素发酵技术领域。
背景技术
硫酸庆大霉素为氨基糖苷类抗生素，对各种革兰阴性细菌及革兰阳性细菌都有良好抗菌作用。硫酸庆大霉素的作用机制是与细菌核糖体30S亚单位结合，抑制细菌蛋白质的合成；使用现有庆大霉素菌种及生产配方进行发酵生产，发酵单位低，产品杂质高，很难符合《中国药典》2015版的要求。
发明内容
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种绛红小单孢菌突变型菌株、制备方法以及在硫酸庆大霉素制备中的应用，以解决硫酸庆大霉素传统生产中存在的发酵单位低、杂质高等问题。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
1、一种绛红小单孢菌突变型菌株，该菌株为绛红色小单孢菌(Micromonosporapurpurea)CH20190225-107，已于2019年12月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.19254。
2、上述一种绛红小单孢菌突变型菌株的制备方法，先将绛红小单孢菌GM20190109-15(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC11015，中文名：绛红小单胞菌，拉丁名：Micromonosporapurpurea)制备成孢子悬液，然后利用ARTP(常压室温等离子体)诱变育种仪进行诱变并培养成诱变后的单菌落，再筛选在波长325nm下吸收峰高的单菌落，接种培养得发酵液，选择发酵单位高、杂质低的单菌落菌种，后处理即得所述的绛红小单孢菌突变型菌株CH20190225-107冷冻管孢子。
优选的，具体步骤如下：
1)以福安药业集团烟台只楚药业有限公司菌种库中的庆大霉素生产菌株绛红小单孢菌GM20190109-15为出发菌种，用灭菌后的1ml吸管吸取0.1ml接种于灭菌后的斜面培养基上进行斜面孢子培养，培养温度为35～37℃，静置，培养时间为4天，得到GM20190109-15菌种的斜面孢子；
2)取1.0cm2步骤1)制备的斜面孢子加入灭菌的含5ml质量浓度0.9％的生理盐水的三角瓶中，震荡20min，得到孢子悬液；
3)取500μl步骤2)制备的孢子悬液，加入250μl质量浓度20％的氯化锂水溶液，250μl质量浓度0.9％的生理盐水，震荡混匀5min，得到含质量浓度5％氯化锂的孢子悬液；震荡混匀后用移液枪吸取20μl含质量浓度5％氯化锂的孢子悬液置于ARTP(常压室温等离子体)诱变育种仪的样品器中进行诱变，诱变时间设置为60秒，得到诱变后的孢子悬液；
4)将步骤3)制备的诱变后的孢子悬液分别稀释至10-4、10-5、10-6、10-7，分别取稀释至10-4、10-5、10-6、10-7的稀释液100μl，涂布于含有分离培养基的双碟培养皿中，培养温度35～37℃，静置，培养时间4天，得到诱变后的单菌落；
5)使用灭菌后的牙签分别挑取步骤4)制备的诱变后的单菌落，并对每个单菌落编号，分别接种于灭菌后的含种子培养基的24孔板每个孔中，每个孔的编号与单菌落编号对应，培养温度35～37℃，摇床转速220r/min，培养42小时，将24孔板每个孔中的种子培养液分别取0.3ml接种于灭菌后的含斜面培养基的24孔板每个孔中和灭菌后的含发酵培养基的24孔板每个孔中，每个孔的编号与单菌落编号对应，接种后的含斜面培养基的24孔板，培养温度35～37℃，静置，培养4天，留种待用，接种后的含发酵培养基的24孔板，培养温度35～37℃，摇床转速220r/min，培养时间120小时，将发酵24孔板每个孔中的发酵液用20％浓硫酸酸化至pH1.5～2.0，混匀静置20min，在孔板离心机上以3000转/分钟离心5分钟，分别取每个孔中的上清液20μl置于96孔板对应的孔中，96孔板每个孔中加入160μl OPA(邻苯二甲醛)衍生试剂、820μl纯化水，60℃水浴15min，置酶标仪上检测，得到在波长325nm下吸收峰高的单菌落编号；
6)根据步骤5)得到吸收峰高的单菌落编号找到步骤5)制备的含斜面培养基的24孔板对应的单菌落菌种，将单菌落菌种分别取1.0cm2接种于灭菌后的含60ml斜面培养基的250ml茄子瓶斜面中，培养温度35～37℃，静置，培养时间4天，得到斜面孢子，取1.0cm2斜面孢子分别接种于灭菌后的含100ml种子培养基的750ml摇瓶中，培养温度35～37℃，摇床转速220r/min，培养42小时，得到种子培养液，分别取10ml种子培养液接种于灭菌后的含100ml发酵培养基的750ml摇瓶中，培养温度35～37℃，摇床转速220r/min，培养时间120小时，得到发酵液；
7)将步骤6)制备的发酵液加质量浓度20％硫酸溶液酸化至pH1.5～2.0，混匀静置20min，定性滤纸(中速)过滤，取0.2ml滤液进高效液相色谱仪检测发酵单位及组份，液相条件：色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18，柱温为30℃，流动相为甲醇：水相：乙酸＝710：240：50(体积比)，流速1.5ml/min，检测波长为330nm；
8)根据步骤7)高效液相色谱仪检测数据，选择发酵单位高、杂质低的单菌落菌种编号，根据编号找到对应的步骤6)制备的斜面孢子，得到突变菌株CH20190225-107斜面孢子；
9)将步骤8)制备的突变菌株CH20190225-107斜面孢子于生物安全柜上用接种棒全部刮下，移入灭菌后的装有100ml质量浓度20％甘油水溶液的250ml三角瓶中，搅匀后用灭菌后的10ml吸管吸取质量浓度20％甘油孢子悬液8ml分装于灭菌后的10ml离心管内，塞好棉塞，置-80℃冰柜冷冻保存，得到绛红小单孢菌CH20190225-107冷冻管孢子。
进一步优选的，步骤1)中，以重量百分比计，所述斜面培养基的配方为：可溶性淀粉1.2％，葡萄糖0.6％，碳酸钙0.06％，酵母浸出粉0.25％，琼脂1.8％，余量为水；配制好的斜面培养基分装于250ml茄子瓶中，每个茄子瓶分装60ml，经湿热灭菌后，斜放凝固，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟。
进一步优选的，步骤4)中，以重量百分比计，所述分离培养基的配方为：可溶性淀粉1.2％，葡萄糖0.6％，碳酸钙0.06％，酵母浸出粉0.25％，琼脂1.8％，余量为水；配制好的分离培养基经湿热灭菌后，分装于灭菌后的直径90mm的双碟培养皿中，每个双碟培养皿分装40ml，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟。
进一步优选的，步骤4)中，由绛红小单孢菌GM20190109-15为出发菌株，经ARTP(常压室温等离子体)和氯化锂诱变产生的突变株，菌落为棕色，边缘无明显色圈，在孢子斜面培养基上生长周期为4天。
进一步优选的，步骤5)中，以重量百分比计，所述种子培养基的配方为：淀粉3.0％，豆粉2.0％，硫酸亚铁0.0005％，氯化钴0.0003％，碳酸钙0.3％，消泡剂0.03％，余量为水；分别取3ml加入24孔板的每个孔中，湿热灭菌，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟。
进一步优选的，步骤5)中，以重量百分比计，所述发酵培养基的配方为：淀粉7.5％，玉米蛋白粉3.5％，豆粉5.0％，硫酸亚铁0.0015％，氯化钴0.0008％，碳酸钙0.45％，消泡剂0.06％，余量为水，分别取3ml加入24孔板的每个孔中，湿热灭菌，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟。
进一步优选的，步骤5)中，OPA(邻苯二甲醛)衍生试剂是通过以下方法配制得到的：称取2.5g OPA加入12.5ml甲醇中溶解，加入237.5ml 0.4mol/L硼酸(pH 10.4)和5ml巯基乙酸，使用质量浓度45％氢氧化钠溶液调节pH至10.4。
进一步优选的，步骤6)中，以重量百分比计，所述斜面培养基的配方为：可溶性淀粉1.2％，葡萄糖0.6％，碳酸钙0.06％，酵母浸出粉0.25％，琼脂1.8％，余量为水；分别取3ml加入24孔板的每个孔中，经湿热灭菌后，斜放凝固，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟。
进一步优选的，步骤6)中，以重量百分比计，所述种子培养基的配方为：淀粉3.0％，豆粉2.0％，硫酸亚铁0.0005％，氯化钴0.0003％，碳酸钙0.3％，消泡剂0.03％，余量为水；分别取100ml加入750ml摇瓶中，湿热灭菌，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟。
进一步优选的，步骤6)中，以重量百分比计，所述发酵培养基的配方为：淀粉7.5％，玉米蛋白粉3.5％，豆粉5.0％，硫酸亚铁0.0015％，氯化钴0.0008％，碳酸钙0.45％，消泡剂0.06％，余量为水；分别取100ml加入750ml摇瓶中，湿热灭菌，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟。
3、上述一种绛红小单孢菌突变型菌株在硫酸庆大霉素制备中的应用。
4、一种硫酸庆大霉素的制备方法，先利用绛红小单孢菌突变型菌株CH20190225-107进行孢子培养得到代2孢子斜面，然后经三次扩大培养得到三级种子培养物，接着进行发酵培养获得庆大霉素发酵产物，后处理即得一种硫酸庆大霉素产品。
优选的，具体步骤如下：
1)将绛红小单孢菌CH20190225-107冷冻管孢子，用灭菌后的1ml吸管吸取0.1ml接种于灭菌后的斜面培养基上进行孢子培养，培养温度为35～37℃，静置，培养时间为4天，得到代1孢子斜面，取代1孢子斜面1.0cm2接种于灭菌后的斜面培养基上进行孢子培养，培养温度为35～37℃，静置，培养时间为4天，得到代2孢子斜面；
2)将步骤1)中得到的代2孢子斜面，于生物安全柜上，将孢子全部刮下，置于灭菌后的纯化水中混合均匀，按照1g孢子加10ml纯化水的比例制成孢子悬液，孢子悬液置于一级种子培养基中进行扩大培养，孢子悬液接入量为一级种子培养基体积的千分之一，培养温度为34～36℃，培养时间为72小时，得到一级种子培养物；
3)将步骤2)得到的一级种子培养物置于灭菌后的二级种子培养基中进行扩大培养，一级种子培养物接入量为二级种子罐培养基体积的20％，培养温度为34～36℃，培养时间为45小时，得到二级种子培养物；
4)将步骤3)得到的二级种子培养物置于灭菌后的三级种子培养基中进行扩大培养，二级种子培养物接入量为三级种子罐培养基体积的100％，培养温度为34～36℃，培养时间为20小时，得到三级种子培养物；
5)将步骤4)得到的三级种子培养物置于灭菌后的发酵培养基中进行培养，三级种子培养物接入量为发酵培养基体积的100％，培养温度为34～36℃，发酵培养20小时后开始补入灭菌后的732树脂，732树脂补入量为发酵液体积的7％，培养时间为200～250小时，得到庆大霉素发酵产物；
6)将步骤5)得到的庆大霉素发酵产物进行过筛处理，得到吸附庆大霉素的732饱和树脂；
7)将步骤6)得到的庆大霉素饱和树脂上柱去除Ca2+、Mg2+、Cl-，以质量浓度4.5％的氨水进行解析，解析液进行超滤脱色，得到去除离子和脱色的庆大霉素溶液；
8)将步骤7)得到的去除离子和脱色的庆大霉素溶液进行纳滤浓缩和薄膜浓缩，得到庆大霉素浓缩液；
9)得到的庆大霉素浓缩液加入硫酸溶液后制得硫酸庆大霉素；
10)将步骤9)得到硫酸庆大霉素通过喷雾干燥制得硫酸庆大霉素成品。
进一步优选的，步骤1)中，以重量百分比计，所述斜面培养基的配方为：可溶性淀粉1.2％，葡萄糖0.6％，碳酸钙0.06％，酵母浸出粉0.25％，琼脂1.8％，余量为水；配制好的斜面培养基分装于250ml茄子瓶中，每个茄子瓶分装60ml，经湿热灭菌后，斜放凝固，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟。
进一步优选的，步骤2)中，以重量百分比计，所述一级种子培养基的配方为：淀粉3.0％，豆粉2.0％，硫酸亚铁0.0005％，氯化钴0.0003％，碳酸钙0.3％，消泡剂0.03％，余量为水。
进一步优选的，步骤3)中，以重量百分比计，所述二级种子培养基的配方为：淀粉5.5％，玉米蛋白粉2.0％，豆粉3.5％，硫酸亚铁0.001％，氯化钴0.0004％，碳酸钙0.4％，消泡剂0.04％，余量为水。
进一步优选的，步骤4)中，以重量百分比计，所述三级种子培养基的配方为：淀粉5.5％，玉米蛋白粉2.0％，豆粉3.5％，硫酸亚铁0.001％，氯化钴0.0004％，碳酸钙0.4％，消泡剂0.04％，余量为水。
进一步优选的，步骤5)中，以重量百分比计，所述发酵培养基的配方为：淀粉7.5％，玉米蛋白粉3.5％，豆粉5.0％，硫酸亚铁0.0015％，氯化钴0.0008％，碳酸钙0.45％，消泡剂0.06％，余量为水；所用的732树脂为001×7强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂。
进一步优选的，步骤6)中，所述饱和树脂是指每毫升树脂吸附了8.5万单位庆大霉素得到的树脂。
进一步优选的，步骤7)中，去除Ca2+、Mg2+、Cl-的柱子为Φ1m高2m柱，解析液进行超滤脱色，流速4.0吨/小时。
进一步优选的，步骤8)中，得到去除离子和脱色的庆大霉素溶液，纳滤浓缩的浓缩量为10吨/小时，浓缩至原来体积的1/5，薄膜浓缩的浓缩量为1.5吨/小时，浓缩至原来体积的1/8。
进一步优选的，步骤9)中，硫酸的质量浓度为>98％，调至pH5.3。
进一步优选的，步骤10)中，喷雾干燥的条件为进风温度120～140℃，出风温度85℃，喷速80～120L/h。
本发明的有益效果：
本发明经诱变筛选获得了一种绛红小单孢菌突变型菌株，并将其用于硫酸庆大霉素的制备，能够明显提高发酵单位，降低硫酸庆大霉素产品的杂质，符合《中国药典》(2015版)的要求。改进前硫酸庆大霉素的发酵单位<2000u/ml；生产的硫酸庆大霉素产品其产品总杂＞11％，西索米星＞9％，小诺霉素＞2.5％。本发明硫酸庆大霉素的发酵单位>4500u/ml，平均为5007u/ml，较改进前提高176％；生产的硫酸庆大霉素产品其产品总杂＜5％，平均为3.06％，较改进前降低75％；西索米星＜2％，平均为1.55％，较改进前降低84％；小诺霉素＜2.5％，平均为2.37％，较改进前降低9％。
在硫酸庆大霉素的制备过程中，对各种培养基的配方组成以及各种工艺参数进行了调整，与现有技术相比，本发明的技术改进主要包括以下10点：
1)斜面培养基中所用物料增加了葡萄糖、酵母浸出粉，去掉了氯化钠、硝酸钾、磷酸氢二钾、硫酸镁，并且各种物料的配比不同；改进前斜面培养基配方按重量百分比计为：可溶性淀粉1.0％，氯化钠0.05％，硝酸钾0.1％，碳酸钙0.1％，磷酸氢二钾0.02％，麸皮1.8％，硫酸镁0.02％，琼脂2.0％，余量为水，改进后斜面培养基配方按重量百分比计为：可溶性淀粉1.2％，葡萄糖0.6％，碳酸钙0.06％，酵母浸出粉0.25％，琼脂1.8％，余量为水；
2)一级种子培养基中所用物料增加了硫酸亚铁，去掉了玉米粉、硝酸钾、蛋白胨，并且各种物料的配比不同；改进前一级种子培养基配方按重量百分比计为：淀粉1.5％，玉米粉1.5％，豆粉1.0％，硝酸钾0.05％，蛋白胨0.2％，二氯化钴0.0005％，余量为水，改进后一级种子培养基配方按重量百分比计为：淀粉3.0％，豆粉2.0％，硫酸亚铁0.0005％，氯化钴0.0003％，碳酸钙0.3％，消泡剂0.03％，余量为水；
3)二级种子培养基中所用物料增加了硫酸亚铁、玉米蛋白粉，去掉了玉米粉、硝酸钾、蛋白胨，并且各种物料的配比不同；改进前二级种子培养基配方按重量百分比计为：淀粉4.3％，豆粉2.9％，玉米粉1.0％，蛋白胨0.7％，氯化钴0.001％，硫酸铵0.1％，硝酸钾0.01％，碳酸钙0.58％，淀粉酶0.00075％，消泡剂0.0125％，余量为水，改进后二级种子培养基配方按重量百分比计为：淀粉5.5％，玉米蛋白粉2.0％，豆粉3.5％，硫酸亚铁0.001％，氯化钴0.0004％，碳酸钙0.4％，消泡剂0.04％，余量为水；
4)三级种子培养基中所用物料增加了硫酸亚铁、玉米蛋白粉，去掉了玉米粉、硝酸钾、蛋白胨，并且各种物料的配比不同；改进前三级种子培养基配方按重量百分比计为：淀粉4.3％，豆粉2.9％，玉米粉1.0％，蛋白胨0.7％，氯化钴0.001％，硫酸铵0.1％，硝酸钾0.01％，碳酸钙0.58％，淀粉酶0.00075％，消泡剂0.0125％，余量为水，改进后三级种子培养基配方按重量百分比计为：淀粉5.5％，玉米蛋白粉2.0％，豆粉3.5％，硫酸亚铁0.001％，氯化钴0.0004％，碳酸钙0.4％，消泡剂0.04％，余量为水；
5)发酵培养基中所用物料增加了硫酸亚铁、玉米蛋白粉，去掉了玉米粉、硝酸钾、硫酸铵、蛋白胨，并且各种物料的配比不同；改进前发酵培养基配方按重量百分比计为：淀粉4.5％，豆粉3.5％，玉米粉1.0％，碳酸钙0.7％，蛋白胨0.3％，二氯化钴0.0015％，硝酸钾0.01％，硫酸铵0.1％，泡敌0.01％，余量为水，改进后发酵培养基配方按重量百分比计为：淀粉7.5％，玉米蛋白粉3.5％，豆粉5.0％，硫酸亚铁0.0015％，氯化钴0.0008％，碳酸钙0.45％，消泡剂0.06％，余量为水；
6)发酵过程中补入732树脂吸附庆大霉素，732树脂补入量为发酵液体积的7％；改进前发酵液放罐后酸化、中和、加732树脂吸附庆大霉素，所用酸碱污染大，改进后发酵过程中补入732树脂吸附庆大霉素，732树脂补入量为发酵液体积的7％，去掉了发酵液放罐后酸化、中和、加732树脂吸附庆大霉素步骤，避免了酸碱污染；
7)发酵周期由＜120小时增加到＞200小时；改进前发酵周期平均为99小时，改进后发酵周期平均为224小时，发酵废液排放量减少60％以上；
8)解析液脱色步骤采用超滤脱色，去掉了711树脂脱色；改进前采用711树脂脱色，所用酸碱污染大，改进后采用超滤代替711树脂脱色，避免了酸碱污染；
9)浓缩步骤增加了纳滤浓缩；改进前全部采用薄膜浓缩，能耗大，改进后85％用纳滤浓缩，15％用薄膜浓缩，浓缩能耗降低70％以上；
10)改进前使用原菌种GM20190109-15，采用原发酵工艺，发酵单位平均为1813u/ml，生产的硫酸庆大霉素产品其产品总杂平均为12.32％，西索米星平均为9.95％，小诺霉素平均为2.60％。
改进后使用新菌种CH20190225-107，采用本专利发酵工艺，发酵单位平均为5007u/ml，较改进前提高176％，生产的硫酸庆大霉素产品其产品总杂平均为3.06％，较改进前降低75％，西索米星平均为1.55％，较改进前降低84％，小诺霉素平均为2.37％，较改进前降低9％；
具体验证数据如表1和表2所示，表1为改进前使用常规出发菌种GM20190109-15，采用常规发酵工艺生产硫酸庆大霉素的三批60吨大罐的产品数据，表2为本发明使用本专利菌种CH20190225-107，采用本专利发酵工艺，生产硫酸庆大霉素的三批60吨大罐的产品数据。
表1.使用常规出发菌种GM20190109-15，采用常规发酵工艺，硫酸庆大霉素生产产品数据
Figure BDA0002405526870000071
Figure BDA0002405526870000081
表2.使用本发明菌种CH20190225-107，采用本发明发酵工艺，硫酸庆大霉素生产产品数据
罐1(实施例1) 罐2(实施例2) 罐3(实施例3) 平均
发酵周期(小时) 217 232 223 224
发酵单位(u/ml) 4800 5260 4960 5007
总杂(％) 3.33 2.95 2.89 3.06
西索米星(％) 1.83 1.42 1.39 1.55
小诺霉素(％) 2.58 2.23 2.31 2.37
保藏信息
分类命名：绛红色小单孢菌
拉丁文学名：Micromonosporapurpurea
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2019年12月30日
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
参考实施例：
一种绛红小单孢菌突变型菌株的制备方法，具体步骤如下：
1)以福安药业集团烟台只楚药业有限公司菌种库中的庆大霉素生产菌株绛红小单孢菌GM20190109-15为出发菌种，用灭菌后的1ml吸管吸取0.1ml接种于灭菌后的斜面培养基上进行斜面孢子培养，培养温度为35℃，静置，培养时间为4天，得到GM20190109-15菌种的斜面孢子；
2)取1.0cm2步骤1)制备的斜面孢子加入灭菌的含5ml质量浓度0.9％的生理盐水的三角瓶中，震荡20min，得到孢子悬液；
3)取500μl步骤2)制备的孢子悬液，加入250μl质量浓度20％的氯化锂水溶液，250μl质量浓度0.9％的生理盐水，震荡混匀5min，得到含质量浓度5％氯化锂的孢子悬液；震荡混匀后用移液枪吸取20μl含质量浓度5％氯化锂的孢子悬液置于ARTP(常压室温等离子体)诱变育种仪的样品器中进行诱变，诱变时间设置为60秒，得到诱变后的孢子悬液；
4)将步骤3)制备的诱变后的孢子悬液分别稀释至10-4、10-5、10-6、10-7，分别取稀释至10-4、10-5、10-6、10-7的稀释液100μl，涂布于含有分离培养基的双碟培养皿中，培养温度37℃，静置，培养时间4天，得到诱变后的单菌落；
5)使用灭菌后的牙签分别挑取步骤4)制备的诱变后的单菌落，并对每个单菌落编号，分别接种于灭菌后的含种子培养基的24孔板每个孔中，每个孔的编号与单菌落编号对应，培养温度36℃，摇床转速220r/min，培养42小时，将24孔板每个孔中的种子培养液分别取0.3ml接种于灭菌后的含斜面培养基的24孔板每个孔中和灭菌后的含发酵培养基的24孔板每个孔中，每个孔的编号与单菌落编号对应，接种后的含斜面培养基的24孔板，培养温度36℃，静置，培养4天，留种待用，接种后的含发酵培养基的24孔板，培养温度36℃，摇床转速220r/min，培养时间120小时，将发酵24孔板每个孔中的发酵液用20％浓硫酸酸化至PH2.0，混匀静置20min，在孔板离心机上以3000转/分钟离心5分钟，分别取每个孔中的上清液20μl置于96孔板对应的孔中，96孔板每个孔中加入160μl OPA(邻苯二甲醛)衍生试剂、820μl纯化水，60℃水浴15min，置酶标仪上检测，得到在波长325nm下吸收峰高的单菌落编号；
6)根据步骤5)得到吸收峰高的单菌落编号找到步骤5)制备的含斜面培养基的24孔板对应的单菌落菌种，将单菌落菌种分别取1.0cm2接种于灭菌后的含60ml斜面培养基的250ml茄子瓶斜面中，培养温度36℃，静置，培养时间4天，得到斜面孢子，取1.0cm2斜面孢子分别接种于灭菌后的含100ml种子培养基的750ml摇瓶中，培养温度36℃，摇床转速220r/min，培养42小时，得到种子培养液，分别取10ml种子培养液接种于灭菌后的含100ml发酵培养基的750ml摇瓶中，培养温度36℃，摇床转速220r/min，培养时间120小时，得到发酵液；
7)将步骤6)制备的发酵液加质量浓度20％硫酸溶液酸化至PH 2.0，混匀静置20min，定性滤纸(中速)过滤，取0.2ml滤液进高效液相色谱仪检测发酵单位及组份，液相条件：色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18，柱温为30℃，流动相为甲醇：水相：乙酸＝710：240：50(体积比)，流速1.5ml/min，检测波长为330nm；
8)根据步骤7)高效液相色谱仪检测数据，选择发酵单位高、杂质低的单菌落菌种编号，根据编号找到对应的步骤6)制备的斜面孢子，得到突变菌株CH20190225-107斜面孢子；
9)将步骤8)制备的突变菌株CH20190225-107斜面孢子于生物安全柜上用接种棒全部刮下，移入灭菌后的装有100ml质量浓度20％甘油水溶液的250ml三角瓶中，搅匀后用灭菌后的10ml吸管吸取质量浓度20％甘油孢子悬液8ml分装于灭菌后的10ml离心管内，塞好棉塞，置-80℃冰柜冷冻保存，得到绛红小单孢菌CH20190225-107冷冻管孢子。
其中，步骤1)中，以重量百分比计，所述斜面培养基的配方为：可溶性淀粉1.2％，葡萄糖0.6％，碳酸钙0.06％，酵母浸出粉0.25％，琼脂1.8％，余量为水；配制好的斜面培养基分装于250ml茄子瓶中，每个茄子瓶分装60ml，经湿热灭菌后，斜放凝固，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟。
步骤4)中，以重量百分比计，所述分离培养基的配方为：可溶性淀粉1.2％，葡萄糖0.6％，碳酸钙0.06％，酵母浸出粉0.25％，琼脂1.8％，余量为水；配制好的分离培养基经湿热灭菌后，分装于灭菌后的直径90mm的双碟培养皿中，每个双碟培养皿分装40ml，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟。
步骤4)中，由绛红小单孢菌GM20190109-15为出发菌株，经ARTP(常压室温等离子体)和氯化锂诱变产生的突变株，菌落为棕色，边缘无明显色圈，在孢子斜面培养基上生长周期为4天。
步骤5)中，以重量百分比计，所述种子培养基的配方为：淀粉3.0％，豆粉2.0％，硫酸亚铁0.0005％，氯化钴0.0003％，碳酸钙0.3％，消泡剂0.03％，余量为水；分别取3ml加入24孔板的每个孔中，湿热灭菌，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟。
步骤5)中，以重量百分比计，所述发酵培养基的配方为：淀粉7.5％，玉米蛋白粉3.5％，豆粉5.0％，硫酸亚铁0.0015％，氯化钴0.0008％，碳酸钙0.45％，消泡剂0.06％，余量为水，分别取3ml加入24孔板的每个孔中，湿热灭菌，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟。
步骤5)中，OPA(邻苯二甲醛)衍生试剂是通过以下方法配制得到的：称取2.5g OPA加入12.5ml甲醇中溶解，加入237.5ml 0.4mol/L硼酸(pH 10.4)和5ml巯基乙酸，使用质量浓度45％氢氧化钠溶液调节pH至10.4。
步骤6)中，以重量百分比计，所述斜面培养基的配方为：可溶性淀粉1.2％，葡萄糖0.6％，碳酸钙0.06％，酵母浸出粉0.25％，琼脂1.8％，余量为水；分别取3ml加入24孔板的每个孔中，经湿热灭菌后，斜放凝固，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟。
步骤6)中，以重量百分比计，所述种子培养基的配方为：淀粉3.0％，豆粉2.0％，硫酸亚铁0.0005％，氯化钴0.0003％，碳酸钙0.3％，消泡剂0.03％，余量为水；分别取100ml加入750ml摇瓶中，湿热灭菌，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟。
步骤6)中，以重量百分比计，所述发酵培养基的配方为：淀粉7.5％，玉米蛋白粉3.5％，豆粉5.0％，硫酸亚铁0.0015％，氯化钴0.0008％，碳酸钙0.45％，消泡剂0.06％，余量为水；分别取100ml加入750ml摇瓶中，湿热灭菌，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟。
实施例1：
一种硫酸庆大霉素的制备方法，具体步骤如下：
1)将参考实施例所得绛红小单孢菌CH20190225-107冷冻管孢子，用灭菌后的1ml吸管吸取0.1ml接种于灭菌后的斜面培养基上进行孢子培养，培养温度为36℃，静置，培养时间为4天，得到代1孢子斜面，取代1孢子斜面1.0cm2接种于灭菌后的斜面培养基上进行孢子培养，培养温度为36℃，静置，培养时间为4天，得到代2孢子斜面；
2)将步骤1)中得到的代2孢子斜面，于生物安全柜上，将孢子全部刮下，置于灭菌后的纯化水中混合均匀，按照1g孢子加10ml纯化水的比例制成孢子悬液，孢子悬液置于一级种子培养基中进行扩大培养，孢子悬液接入量为一级种子培养基体积的千分之一，培养温度为36℃，培养时间为72小时，得到一级种子培养物；
3)将步骤2)得到的一级种子培养物置于灭菌后的二级种子培养基中进行扩大培养，一级种子培养物接入量为二级种子罐培养基体积的20％，培养温度为36℃，培养时间为45小时，得到二级种子培养物；
4)将步骤3)得到的二级种子培养物置于灭菌后的三级种子培养基中进行扩大培养，二级种子培养物接入量为三级种子罐培养基体积的100％，培养温度为36℃，培养时间为20小时，得到三级种子培养物；
5)将步骤4)得到的三级种子培养物置于灭菌后的发酵培养基中进行培养，三级种子培养物接入量为发酵培养基体积的100％，培养温度为36℃，发酵培养20小时后开始补入灭菌后的732树脂，732树脂补入量为发酵液体积的7％，培养时间为200小时，得到庆大霉素发酵产物；
6)将步骤5)得到的庆大霉素发酵产物进行过筛处理，得到吸附庆大霉素的732饱和树脂；
7)将步骤6)得到的庆大霉素饱和树脂上柱去除Ca2+、Mg2+、Cl-，以质量浓度4.5％的氨水进行解析，解析液进行超滤脱色，得到去除离子和脱色的庆大霉素溶液；
8)将步骤7)得到的去除离子和脱色的庆大霉素溶液进行纳滤浓缩和薄膜浓缩，得到庆大霉素浓缩液；
9)得到的庆大霉素浓缩液加入硫酸溶液后制得硫酸庆大霉素；
10)将步骤9)得到硫酸庆大霉素通过喷雾干燥制得硫酸庆大霉素成品。
其中，步骤1)中，以重量百分比计，所述斜面培养基的配方为：可溶性淀粉1.2％，葡萄糖0.6％，碳酸钙0.06％，酵母浸出粉0.25％，琼脂1.8％，余量为水；配制好的斜面培养基分装于250ml茄子瓶中，每个茄子瓶分装60ml，经湿热灭菌后，斜放凝固，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟。
步骤2)中，以重量百分比计，所述一级种子培养基的配方为：淀粉3.0％，豆粉2.0％，硫酸亚铁0.0005％，氯化钴0.0003％，碳酸钙0.3％，消泡剂0.03％，余量为水。
步骤3)中，以重量百分比计，所述二级种子培养基的配方为：淀粉5.5％，玉米蛋白粉2.0％，豆粉3.5％，硫酸亚铁0.001％，氯化钴0.0004％，碳酸钙0.4％，消泡剂0.04％，余量为水。
步骤4)中，以重量百分比计，所述三级种子培养基的配方为：淀粉5.5％，玉米蛋白粉2.0％，豆粉3.5％，硫酸亚铁0.001％，氯化钴0.0004％，碳酸钙0.4％，消泡剂0.04％，余量为水。
步骤5)中，以重量百分比计，所述发酵培养基的配方为：淀粉7.5％，玉米蛋白粉3.5％，豆粉5.0％，硫酸亚铁0.0015％，氯化钴0.0008％，碳酸钙0.45％，消泡剂0.06％，余量为水；所用的732树脂为001×7强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂。
步骤6)中，所述饱和树脂是指每毫升树脂吸附了8.5万单位庆大霉素得到的树脂。
步骤7)中，去除Ca2+、Mg2+、Cl-的柱子为Φ1m高2m柱，解析液进行超滤脱色，流速4.0吨/小时。
步骤8)中，得到去除离子和脱色的庆大霉素溶液，纳滤浓缩的浓缩量为10吨/小时，浓缩至原来体积的1/5，薄膜浓缩的浓缩量为1.5吨/小时，浓缩至原来体积的1/8。
步骤9)中，硫酸的质量浓度为>98％，调至pH5.3。
步骤10)中，喷雾干燥的条件为进风温度135℃，出风温度85℃，喷速80L/h。
实施例1硫酸庆大霉素生产数据见表3。
表3.硫酸庆大霉素生产数据
60吨发酵罐生产指标 60吨发酵罐生产数据
发酵周期(小时) 217
发酵单位(u/ml) 4800
总杂(％) 3.33
西索米星(％) 1.83
小诺霉素(％) 2.58
实施例2：
一种硫酸庆大霉素的制备方法，具体步骤如下：
1)将参考实施例所得绛红小单孢菌CH20190225-107冷冻管孢子，用灭菌后的1ml吸管吸取0.1ml接种于灭菌后的斜面培养基上进行孢子培养，培养温度为36℃，静置，培养时间为4天，得到代1孢子斜面，取代1孢子斜面1.0cm2接种于灭菌后的斜面培养基上进行孢子培养，培养温度为36℃，静置，培养时间为4天，得到代2孢子斜面；
2)将步骤1)中得到的代2孢子斜面，于生物安全柜上，将孢子全部刮下，置于灭菌后的纯化水中混合均匀，按照1g孢子加10ml纯化水的比例制成孢子悬液，孢子悬液置于一级种子培养基中进行扩大培养，孢子悬液接入量为一级种子培养基体积的千分之一，培养温度为35℃，培养时间为72小时，得到一级种子培养物；
3)将步骤2)得到的一级种子培养物置于灭菌后的二级种子培养基中进行扩大培养，一级种子培养物接入量为二级种子罐培养基体积的20％，培养温度为35℃，培养时间为45小时，得到二级种子培养物；
4)将步骤3)得到的二级种子培养物置于灭菌后的三级种子培养基中进行扩大培养，二级种子培养物接入量为三级种子罐培养基体积的100％，培养温度为35℃，培养时间为20小时，得到三级种子培养物；
5)将步骤4)得到的三级种子培养物置于灭菌后的发酵培养基中进行培养，三级种子培养物接入量为发酵培养基体积的100％，培养温度为35℃，发酵培养20小时后开始补入灭菌后的732树脂，732树脂补入量为发酵液体积的7％，培养时间为200小时，得到庆大霉素发酵产物；
6)将步骤5)得到的庆大霉素发酵产物进行过筛处理，得到吸附庆大霉素的732饱和树脂；
7)将步骤6)得到的庆大霉素饱和树脂上柱去除Ca2+、Mg2+、Cl-，以质量浓度4.5％的氨水进行解析，解析液进行超滤脱色，得到去除离子和脱色的庆大霉素溶液；
8)将步骤7)得到的去除离子和脱色的庆大霉素溶液进行纳滤浓缩和薄膜浓缩，得到庆大霉素浓缩液；
9)得到的庆大霉素浓缩液加入硫酸溶液后制得硫酸庆大霉素；
10)将步骤9)得到硫酸庆大霉素通过喷雾干燥制得硫酸庆大霉素成品。
其中，步骤1)中，以重量百分比计，所述斜面培养基的配方为：可溶性淀粉1.2％，葡萄糖0.6％，碳酸钙0.06％，酵母浸出粉0.25％，琼脂1.8％，余量为水；配制好的斜面培养基分装于250ml茄子瓶中，每个茄子瓶分装60ml，经湿热灭菌后，斜放凝固，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟。
步骤2)中，以重量百分比计，所述一级种子培养基的配方为：淀粉3.0％，豆粉2.0％，硫酸亚铁0.0005％，氯化钴0.0003％，碳酸钙0.3％，消泡剂0.03％，余量为水。
步骤3)中，以重量百分比计，所述二级种子培养基的配方为：淀粉5.5％，玉米蛋白粉2.0％，豆粉3.5％，硫酸亚铁0.001％，氯化钴0.0004％，碳酸钙0.4％，消泡剂0.04％，余量为水。
步骤4)中，以重量百分比计，所述三级种子培养基的配方为：淀粉5.5％，玉米蛋白粉2.0％，豆粉3.5％，硫酸亚铁0.001％，氯化钴0.0004％，碳酸钙0.4％，消泡剂0.04％，余量为水。
步骤5)中，以重量百分比计，所述发酵培养基的配方为：淀粉7.5％，玉米蛋白粉3.5％，豆粉5.0％，硫酸亚铁0.0015％，氯化钴0.0008％，碳酸钙0.45％，消泡剂0.06％，余量为水；所用的732树脂为001×7强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂。
步骤6)中，所述饱和树脂是指每毫升树脂吸附了8.5万单位庆大霉素得到的树脂。
步骤7)中，去除Ca2+、Mg2+、Cl-的柱子为Φ1m高2m柱，解析液进行超滤脱色，流速4.0吨/小时。
步骤8)中，得到去除离子和脱色的庆大霉素溶液，纳滤浓缩的浓缩量为10吨/小时，浓缩至原来体积的1/5，薄膜浓缩的浓缩量为1.5吨/小时，浓缩至原来体积的1/8。
步骤9)中，硫酸的质量浓度为>98％，调至pH5.3。
步骤10)中，喷雾干燥的条件为进风温度135℃，出风温度85℃，喷速80L/h。
实施例2硫酸庆大霉素生产数据见表4。
表4.硫酸庆大霉素生产数据
60吨发酵罐生产指标 60吨发酵罐生产数据
发酵周期(小时) 232
发酵单位(u/ml) 5260
总杂(％) 2.95
西索米星(％) 1.42
小诺霉素(％) 2.23
实施例3：
一种硫酸庆大霉素的制备方法，具体步骤如下：
1)将参考实施例所得绛红小单孢菌CH20190225-107冷冻管孢子，用灭菌后的1ml吸管吸取0.1ml接种于灭菌后的斜面培养基上进行孢子培养，培养温度为36℃，静置，培养时间为4天，得到代1孢子斜面，取代1孢子斜面1.0cm2接种于灭菌后的斜面培养基上进行孢子培养，培养温度为36℃，静置，培养时间为4天，得到代2孢子斜面；
2)将步骤1)中得到的代2孢子斜面，于生物安全柜上，将孢子全部刮下，置于灭菌后的纯化水中混合均匀，按照1g孢子加10ml纯化水的比例制成孢子悬液，孢子悬液置于一级种子培养基中进行扩大培养，孢子悬液接入量为一级种子培养基体积的千分之一，培养温度为34℃，培养时间为72小时，得到一级种子培养物；
3)将步骤2)得到的一级种子培养物置于灭菌后的二级种子培养基中进行扩大培养，一级种子培养物接入量为二级种子罐培养基体积的20％，培养温度为34℃，培养时间为45小时，得到二级种子培养物；
4)将步骤3)得到的二级种子培养物置于灭菌后的三级种子培养基中进行扩大培养，二级种子培养物接入量为三级种子罐培养基体积的100％，培养温度为34℃，培养时间为20小时，得到三级种子培养物；
5)将步骤4)得到的三级种子培养物置于灭菌后的发酵培养基中进行培养，三级种子培养物接入量为发酵培养基体积的100％，培养温度为34℃，发酵培养20小时后开始补入灭菌后的732树脂，732树脂补入量为发酵液体积的7％，培养时间为200小时，得到庆大霉素发酵产物；
6)将步骤5)得到的庆大霉素发酵产物进行过筛处理，得到吸附庆大霉素的732饱和树脂；
7)将步骤6)得到的庆大霉素饱和树脂上柱去除Ca2+、Mg2+、Cl-，以质量浓度4.5％的氨水进行解析，解析液进行超滤脱色，得到去除离子和脱色的庆大霉素溶液；
8)将步骤7)得到的去除离子和脱色的庆大霉素溶液进行纳滤浓缩和薄膜浓缩，得到庆大霉素浓缩液；
9)得到的庆大霉素浓缩液加入硫酸溶液后制得硫酸庆大霉素；
10)将步骤9)得到硫酸庆大霉素通过喷雾干燥制得硫酸庆大霉素成品。
其中，步骤1)中，以重量百分比计，所述斜面培养基的配方为：可溶性淀粉1.2％，葡萄糖0.6％，碳酸钙0.06％，酵母浸出粉0.25％，琼脂1.8％，余量为水；配制好的斜面培养基分装于250ml茄子瓶中，每个茄子瓶分装60ml，经湿热灭菌后，斜放凝固，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟。
步骤2)中，以重量百分比计，所述一级种子培养基的配方为：淀粉3.0％，豆粉2.0％，硫酸亚铁0.0005％，氯化钴0.0003％，碳酸钙0.3％，消泡剂0.03％，余量为水。
步骤3)中，以重量百分比计，所述二级种子培养基的配方为：淀粉5.5％，玉米蛋白粉2.0％，豆粉3.5％，硫酸亚铁0.001％，氯化钴0.0004％，碳酸钙0.4％，消泡剂0.04％，余量为水。
步骤4)中，以重量百分比计，所述三级种子培养基的配方为：淀粉5.5％，玉米蛋白粉2.0％，豆粉3.5％，硫酸亚铁0.001％，氯化钴0.0004％，碳酸钙0.4％，消泡剂0.04％，余量为水。
步骤5)中，以重量百分比计，所述发酵培养基的配方为：淀粉7.5％，玉米蛋白粉3.5％，豆粉5.0％，硫酸亚铁0.0015％，氯化钴0.0008％，碳酸钙0.45％，消泡剂0.06％，余量为水；所用的732树脂为001×7强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂。
步骤6)中，所述饱和树脂是指每毫升树脂吸附了8.5万单位庆大霉素得到的树脂。
步骤7)中，去除Ca2+、Mg2+、Cl-的柱子为Φ1m高2m柱，解析液进行超滤脱色，流速4.0吨/小时。
步骤8)中，得到去除离子和脱色的庆大霉素溶液，纳滤浓缩的浓缩量为10吨/小时，浓缩至原来体积的1/5，薄膜浓缩的浓缩量为1.5吨/小时，浓缩至原来体积的1/8。
步骤9)中，硫酸的质1浓度为>98％，调至pH5.3。
步骤10)中，喷雾干燥的条件为进风温度135℃，出风温度85℃，喷速80L/h。
实施例3硫酸庆大霉素生产数据见表5。
表5.硫酸庆大霉素生产数据
60吨发酵罐生产指标 60吨发酵罐生产数据
发酵周期(小时) 223
发酵单位(u/ml) 4960
总杂 2.89
西索米星 1.39
小诺霉素 2.31
上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (2)

1.一种硫酸庆大霉素的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)将绛红小单孢菌CH20190225-107冷冻管孢子，用灭菌后的1ml吸管吸取0.1ml接种于灭菌后的斜面培养基上进行孢子培养，培养温度为35～37℃，静置，培养时间为4天，得到代1孢子斜面，取代1孢子斜面1.0cm2接种于灭菌后的斜面培养基上进行孢子培养，培养温度为35～37℃，静置，培养时间为4天，得到代2孢子斜面；
2)将步骤1)中得到的代2孢子斜面，于生物安全柜上，将孢子全部刮下，置于灭菌后的纯化水中混合均匀，按照1g孢子加10ml纯化水的比例制成孢子悬液，孢子悬液置于一级种子培养基中进行扩大培养，孢子悬液接入量为一级种子培养基体积的千分之一，培养温度为34～36℃，培养时间为72小时，得到一级种子培养物；
3)将步骤2)得到的一级种子培养物置于灭菌后的二级种子培养基中进行扩大培养，一级种子培养物接入量为二级种子罐培养基体积的20％，培养温度为34～36℃，培养时间为45小时，得到二级种子培养物；
4)将步骤3)得到的二级种子培养物置于灭菌后的三级种子培养基中进行扩大培养，二级种子培养物接入量为三级种子罐培养基体积的100％，培养温度为34～36℃，培养时间为20小时，得到三级种子培养物；
5)将步骤4)得到的三级种子培养物置于灭菌后的发酵培养基中进行培养，三级种子培养物接入量为发酵培养基体积的100％，培养温度为34～36℃，发酵培养20小时后开始补入灭菌后的732树脂，732树脂补入量为发酵液体积的7％，培养时间为200～250小时，得到庆大霉素发酵产物；
6)将步骤5)得到的庆大霉素发酵产物进行过筛处理，得到吸附庆大霉素的732饱和树脂；
7)将步骤6)得到的庆大霉素饱和树脂上柱去除Ca2+、Mg2+、Cl-，以质量浓度4.5％的氨水进行解析，解析液进行超滤脱色，得到去除离子和脱色的庆大霉素溶液；
8)将步骤7)得到的去除离子和脱色的庆大霉素溶液进行纳滤浓缩和薄膜浓缩，得到庆大霉素浓缩液；
9)得到的庆大霉素浓缩液加入硫酸溶液后制得硫酸庆大霉素；
10)将步骤9)得到硫酸庆大霉素通过喷雾干燥制得硫酸庆大霉素成品；
步骤1)中，绛红小单孢菌(Micromonospora purpurea)CH20190225-107，已于2019年12月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNO.19254；
步骤1)中，以重量百分比计，所述斜面培养基的配方为：可溶性淀粉1.2％，葡萄糖0.6％，碳酸钙0.06％，酵母浸出粉0.25％，琼脂1.8％，余量为水；配制好的斜面培养基分装于250ml茄子瓶中，每个茄子瓶分装60ml，经湿热灭菌后，斜放凝固，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟；
步骤2)中，以重量百分比计，所述一级种子培养基的配方为：淀粉3.0％，豆粉2.0％，硫酸亚铁0.0005％，氯化钴0.0003％，碳酸钙0.3％，消泡剂0.03％，余量为水；
步骤3)中，以重量百分比计，所述二级种子培养基的配方为：淀粉5.5％，玉米蛋白粉2.0％，豆粉3.5％，硫酸亚铁0.001％，氯化钴0.0004％，碳酸钙0.4％，消泡剂0.04％，余量为水；
步骤4)中，以重量百分比计，所述三级种子培养基的配方为：淀粉5.5％，玉米蛋白粉2.0％，豆粉3.5％，硫酸亚铁0.001％，氯化钴0.0004％，碳酸钙0.4％，消泡剂0.04％，余量为水；
步骤5)中，以重量百分比计，所述发酵培养基的配方为：淀粉7.5％，玉米蛋白粉3.5％，豆粉5.0％，硫酸亚铁0.0015％，氯化钴0.0008％，碳酸钙0.45％，消泡剂0.06％，余量为水；所用的732树脂为001×7强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤10)中，喷雾干燥的条件为进风温度120～140℃，出风温度85℃，喷速80～120L/h。
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