CN111334439B - 一种麦角菌突变株及其在制备麦角酸发酵液中的应用 - Google Patents

一种麦角菌突变株及其在制备麦角酸发酵液中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种麦角菌突变株及其在制备麦角酸发酵液中的应用，先将麦角菌进行诱变，利用微生物代谢产物的反馈抑制机制，增加麦角菌对其自身代谢产物麦角酸的耐受性，提高麦角酸产量。本发明的生产工艺相对简单，改变小，成本低，是一种可以有效提高麦角酸发酵单位的方法。

Description

一种麦角菌突变株及其在制备麦角酸发酵液中的应用
技术领域
本发明涉及一种麦角菌突变株，具体涉及一种麦角菌突变株及其在制备麦角酸发酵液中的应用。属于医药生产技术领域。
背景技术
麦角菌(Claviceps purpurea(Fr.)Tul.)属于真菌界，子囊菌门，核菌纲，肉座菌目，麦角菌科，麦角菌属。此菌寄生在黑麦、小麦、大麦、燕麦、鹅冠草等禾本科植物上。麦角菌属于一种子囊菌，最喜寄生在黑麦、大麦等禾本科植物的子房里，发育形成坚硬、褐至黑色的角状菌核，人们把它叫做麦角。当人们吃了含有麦角的面粉后，便会中毒发病，开始四肢和肌肉抽筋，接着手足、乳房、牙齿感到麻木，然后这些部位的肌肉逐渐溃烂剥落，直至死亡，其状惨不忍睹。人们把这种病称为麦角病。家畜吃了感染麦角菌的禾本科牧草，也会引起严重的中毒。
麦角为名贵中药材，据分析其所含的生物碱多达12种，分为麦角胺、麦角毒碱、麦角新碱3大类。主要功能是引起肌肉痉挛收缩，故常用作妇产科药物，用作治疗产后出血的止血剂和促进子宫复原的收敛剂。
麦角酸是天然麦角生物碱的基本结构的一部分。它作为合成一些半合成麦角生物碱的中间体大规模制造，已发现这些半合成麦角生物碱可作为药品，例如尼麦角林、甲基麦角新碱、麦角溴烟酯和二甲麦角新碱。不仅用于改善严重老年人心理健康问题，血管引起的视网膜问题上成果斐然，而且在急性脑血管问题的治疗也有着突出的作用。
发明内容
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种麦角菌突变株及其在制备麦角酸发酵液中的应用。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
1、麦角菌突变株，该菌株为麦角菌(Claviceps purpurea)LA20190419-12，已于2020年3月16日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNO.19370。
2、上述麦角酸突变株在制备麦角酸发酵液中的应用。
3、利用上述麦角菌突变株发酵得到的一种麦角酸发酵液。
4、上述一种麦角酸发酵液的制备方法，先将麦角菌突变株接种于斜面培养基上，26～29℃培养7天，得到斜面菌丝，然后将斜面菌丝接种于种子培养基中，23～25℃摇床培养4天，得到种子培养液，最后将种子培养液接种于发酵培养基中，23～25℃摇床培养15天，即得所述的一种麦角酸发酵液；
其中，以重量百分数计，所述斜面培养基的配方组成如下：马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)：3.9％，酵母菌提取物0.05％，余量为水；
以重量百分数计，所述种子培养基的配方为：山梨醇5.0％，琥珀酸1.0％，大豆蛋白胨0.2％，磷酸氢二钾0.1％，消泡剂0.017％，余量为水；
以重量百分数计，所述发酵培养基的配方为：山梨醇8％，琥珀酸3.5％，酵母粉0.05％，硫酸亚铁0.002％，硫酸锌0.001％，玉米浆干粉1.8％，消泡剂0.05％，余量为水。
优选的，麦角菌突变株在斜面培养基上的接种量为0.2％，斜面菌丝在种子培养基中的接种量为6.7％，种子培养液在发酵培养基中的接种量为10％。
优选的，配制好的斜面培养基分装于250ml茄子瓶中，每个茄子瓶分装50ml，经湿热灭菌后，斜放凝固，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟。
优选的，配制好的种子培养基分别取60ml加入250ml摇瓶中，湿热灭菌，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟。
优选的，配制好的发酵培养基分别取30ml加入250ml摇瓶中，湿热灭菌，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟。
优选的，具体步骤如下：
1)将麦角菌LA20190419-12冷冻管菌丝，用灭菌后的1ml吸管吸取0.1ml接种于灭菌后的斜面培养基上进行培养，培养温度为26～29℃，静置，培养时间为7天，得到菌种LA20190419-12的斜面菌丝；
2)将步骤1)中得到的斜面菌丝用灭菌后的接种棒取4cm2，于生物安全柜上，分别接种于灭菌后的含60ml种子培养基的250ml摇瓶中，培养温度23～25℃，摇床转速220r/min，培养4天，得到种子培养液；
3)将步骤2)中得到的种子培养液，分别取3ml接种于灭菌后的含30ml发酵培养基的250ml摇瓶中，培养温度23～25℃，摇床转速220r/min，培养时间15天，即得所述的一种麦角酸发酵液。
本发明的有益效果：
本发明经现有的麦角菌诱变获得一种麦角菌突变株，并利用该菌株进行发酵制备麦角酸发酵液，在发酵过程中利用微生物代谢产物的反馈抑制机制，增加麦角菌对其自身代谢产物麦角酸的耐受性，提高麦角酸产量。
本发明生产工艺相对简单，易操作，成本低，与诱变前的原始菌株相比，利用本发明的麦角酸突变株进行发酵，大大提高了发酵液中的麦角酸发酵单位，提高麦角酸收率。
保藏信息
分类命名：麦角菌
拉丁文学名：Claviceps purpurea
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2020年3月16日
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
参考实施例：
麦角菌突变株LA20190419-12的制备方法
①以福安药业集团烟台只楚药业有限公司菌种库中的麦角酸生产菌株麦角菌LA20190115-9为出发菌种(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCCNO.3.996，中文名：麦角菌，拉丁名：Claviceps purpurea)，用灭菌后的1ml吸管吸取0.1ml接种于灭菌后的斜面培养基上进行斜面菌丝培养，培养温度为26～29℃，静置，培养时间为7天，得到LA20190115-9菌种的斜面菌丝；
斜面培养基的配方为：马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)：3.9％，酵母菌提取物0.05％，余量为水；配制好的斜面培养基分装于250ml茄子瓶中，每个茄子瓶分装50ml，经湿热灭菌后，斜放凝固，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟；
②取1.0cm2步骤1)制备的斜面菌丝加入灭菌的含5ml质量浓度0.9％的生理盐水的三角瓶中，震荡20min，得到菌丝悬液；
③取500μl步骤2)制备的菌丝悬液，加入250μl质量浓度10％的氯化锂水溶液，250μl质量浓度0.9％的生理盐水，震荡混匀5min，得到含质量浓度2.5％氯化锂的菌丝悬液；震荡混匀后用移液枪吸取20μl含质量浓度2.5％氯化锂的菌丝悬液置于ARTP(常压室温等离子体)诱变育种仪的样品器中进行诱变，诱变时间设置为30秒，得到诱变后的菌丝悬液；
④将步骤③制备的诱变后的菌丝悬液分别稀释至10-2、10-3、10-4、10-5，分别取稀释至10-2、10-3、10-4、10-5的稀释液100μl，涂布于分离培养基的双碟培养皿中，培养温度26～29℃，静置，培养时间7天，得到诱变后的单菌落；
分离培养基的配方为：马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)：3.9％，酵母菌提取物0.05％，麦角酸0.5％，余量为水；配制好的分离培养基经湿热灭菌后，分装于灭菌后的直径90mm的双碟培养皿中，每个双碟培养皿分装40ml，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟；
⑤使用灭菌后的接种棒分别挑取步骤④制备的诱变后的单菌落，并对每个单菌落编号，分别接种于灭菌后的含50ml斜面培养基的250ml茄子瓶斜面中，培养温度26～29℃，静置，培养时间7天，得到斜面菌丝，取4.0cm2斜面菌丝分别接种于灭菌后的含60ml种子培养基的250ml摇瓶中，培养温度23～25℃，摇床转速220r/min，培养4天，得到种子培养液，分别取3ml种子培养液接种于灭菌后的含30ml发酵培养基的250ml摇瓶中，培养温度23～25℃，摇床转速220r/min，培养时间15天，得到发酵液；
种子培养基的配方为：山梨醇5％，琥珀酸1％，大豆蛋白胨0.2％，磷酸氢二钾0.1％，消泡剂0.017％，余量为水；分别取60ml加入250ml摇瓶中，湿热灭菌，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟；
发酵培养基的配方为：山梨醇8％，琥珀酸3.5％，酵母粉0.05％，硫酸亚铁0.002％，硫酸锌0.001％，玉米浆干粉1.8％，消泡剂0.05％，余量为水；分别取30ml加入250ml摇瓶中，湿热灭菌，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟；
⑥取步骤⑤制备的发酵液2ml加1：1的乙腈水溶液8ml，震荡15min，定性滤纸(中速)过滤，取0.2ml滤液采用离心机1万转速离心10min，取上清液20μl进高效液相色谱仪检测发酵单位及组分。
液相条件：色谱柱为C18 250mm×4.6mm，5μm
柱温为50℃
检测波长为254nm
流速1.5ml/分钟；
流动相A：取1g磷酸二氢钠溶解于1000ml水中，用三乙胺调pH至8.0；
流动相B：乙腈：水＝3：1；
梯度表见表1。
表1.梯度表
时间(分钟) 流动性A％ 流动性B％
0 87 13
28 57 43
32 57 43
35 87 13
37 87 13
取20mg对照品，加入1：1的乙腈水溶解并稀释至100ml，摇匀，作为对照品溶液；
⑦根据步骤⑥高效液相色谱仪检测数据，选择发酵单位高、杂质低的单菌落菌种编号，得到突变菌株LA20190419-12斜面菌种；
⑧将步骤⑦制备的突变菌株LA20190419-12斜面菌种于生物安全柜上用接种棒全部刮下，移入灭菌后的装有150ml质量浓度20％甘油水溶液的250ml三角瓶中，摇匀，用灭菌后的10ml吸管吸取质量浓度20％甘油菌丝悬液6ml分装于灭菌后的10ml离心管内，塞好棉塞，置-80℃冰柜冷冻保存，得到麦角菌LA20190419-12冷冻管菌丝。
实施例1：
一种麦角酸发酵液的制备方法：
1)将参考实施例所得麦角菌LA20190419-12冷冻管菌丝，用灭菌后的1ml吸管吸取0.1ml接种于灭菌后的斜面培养基上进行培养，培养温度为27℃，静置，培养时间为7天，得到菌种LA20190419-12的斜面菌丝；
斜面培养基的配方为：马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)：3.9％，酵母菌提取物0.05％，余量为水；配制好的斜面培养基分装于250ml茄子瓶中，每个茄子瓶分装50ml，经湿热灭菌后，斜放凝固，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟；
2)将步骤1)中得到的斜面菌丝用灭菌后的接种棒取4cm2，于生物安全柜上，分别接种于灭菌后的含60ml种子培养基的250ml摇瓶中，培养温度23℃，摇床转速220r/min，培养4天，得到种子培养液；
种子培养基的配方为：山梨醇5％，琥珀酸1％，大豆蛋白胨0.2％，磷酸氢二钾0.1％，消泡剂0.017％，余量为水；分别取60ml加入250ml摇瓶中，湿热灭菌，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟；
3)将步骤2)中得到的种子培养液，分别取3ml接种于灭菌后的含30ml发酵培养基的250ml摇瓶中，培养温度23℃，摇床转速220r/min，培养时间15天，得到发酵液；
发酵培养基的配方为：山梨醇8％，琥珀酸3.5％，酵母粉0.05％，硫酸亚铁0.002％，硫酸锌0.001％，玉米浆干粉1.8％，消泡剂0.05％，余量为水；分别取30ml加入250ml摇瓶中，湿热灭菌，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟；
4)将步骤3)得到的发酵液分别取2ml加1：1的乙腈水溶液8ml，震荡15min，定性滤纸(中速)过滤，取0.2ml滤液采用离心机1万转速离心10min，取上清液20ul进高效液相色谱仪检测发酵单位及组分。
液相条件：色谱柱为C18 250mm×4.6mm，5um
柱温为50℃
检测波长为254nm
流速1.5ml/分钟；
梯度表见表1。
取20mg对照品，加入1：1的乙腈水溶解并稀释至100ml，摇匀，作为对照品溶液；
对照菌种为LA20190115-9，操作步骤同1)，2)，3)，4)。
突变菌种LA20190419-12与对照菌种LA20190115-9比较，发酵单位提高百分率，高效液相色谱法检测数据如表2。
表2.实施例1中LA20190419-12与LA20190115-9菌株发酵单位比较表
Figure GDA0003517325060000061
Figure GDA0003517325060000071
由表2可以看出，实施例1中突变菌种LA20190419-12的发酵单位较对照菌种LA20190115-9平均提高率达到46.3％，提高了麦角酸的收率。
实施例2：
1)将参考实施例所得麦角菌LA20190419-12冷冻管菌丝，用灭菌后的1ml吸管吸取0.1ml接种于灭菌后的斜面培养基上进行培养，培养温度为28℃，静置，培养时间为7天，得到菌种LA20190419-12的斜面菌丝；
斜面培养基的配方为：马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)：3.9％，酵母菌提取物0.05％，余量为水；配制好的斜面培养基分装于250ml茄子瓶中，每个茄子瓶分装50ml，经湿热灭菌后，斜放凝固，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟；
2)将步骤1)中得到的斜面菌丝用灭菌后的接种棒取4cm2，于生物安全柜上，分别接种于灭菌后的含60ml种子培养基的250ml摇瓶中，培养温度24℃，摇床转速220r/min，培养4天，得到种子培养液；
种子培养基的配方为：山梨醇5％，琥珀酸1.0％，大豆蛋白胨0.2％，磷酸氢二钾0.1％，消泡剂0.017％，余量为水；分别取60ml加入250ml摇瓶中，湿热灭菌，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟；
3)将步骤2)中得到的种子培养液，分别取3ml接种于灭菌后的含30ml发酵培养基的250ml摇瓶中，培养温度24℃，摇床转速220r/min，培养时间15天，得到发酵液；
发酵培养基的配方为：山梨醇8％，琥珀酸3.5％，酵母粉0.05％，硫酸亚铁0.002％，硫酸锌0.001％，玉米浆干粉1.8％，消泡剂0.05％，余量为水；分别取30ml加入250ml摇瓶中，湿热灭菌，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟；
4)将步骤3)得到的发酵液分别取2ml加1：1的乙腈水溶液8ml，震荡15min，定性滤纸(中速)过滤，取0.2ml滤液采用离心机1万转速离心10min，取上清液20μl进高效液相色谱仪检测发酵单位及组分。
液相条件：色谱柱为C18 250mm×4.6mm，5um
柱温为50℃
检测波长为254nm
流速1.5ml/分钟；
梯度表见表1。
取20mg对照品，加入1：1的乙腈水溶解并稀释至100ml，摇匀，作为对照品溶液；
对照菌种为LA20190115-9，操作步骤同1)，2)，3)，4)。
突变菌种LA20190419-12与对照菌种LA20190115-9比较，发酵单位提高百分率，高效液相色谱法检测数据如表3。
表3.实施例2中LA20190419-12与LA20190115-9菌株发酵单位比较表
Figure GDA0003517325060000081
由表3可以看出，实施例2中突变菌种LA20190419-12的发酵单位较对照菌种LA20190115-9平均提高率达到53.1％，极大的提高了麦角酸的收率。
实施例3：
1)将参考实施例所得麦角菌LA20190419-12冷冻管菌丝，用灭菌后的1ml吸管吸取0.1ml接种于灭菌后的斜面培养基上进行培养，培养温度为29℃，静置，培养时间为7天，得到菌种LA20190419-12的斜面菌丝；
斜面培养基的配方为：马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)：3.9％，酵母菌提取物0.05％，余量为水；配制好的斜面培养基分装于250ml茄子瓶中，每个茄子瓶分装50ml，经湿热灭菌后，斜放凝固，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟；
2)将步骤1)中得到的斜面菌丝用灭菌后的接种棒取4cm2，于生物安全柜上，分别接种于灭菌后的含60ml种子培养基的250ml摇瓶中，培养温度25℃，摇床转速220r/min，培养4天，得到种子培养液；
种子培养基的配方为：山梨醇5％，琥珀酸1％，大豆蛋白胨0.2％，磷酸氢二钾0.1％，消泡剂0.017％，余量为水；分别取60ml加入250ml摇瓶中，湿热灭菌，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟；
3)将步骤2)中得到的种子培养液，分别取3ml接种于灭菌后的含30ml发酵培养基的250ml摇瓶中，培养温度25℃，摇床转速220r/min，培养时间15天，得到发酵液；
发酵培养基的配方为：山梨醇8％，琥珀酸3.5％，酵母粉0.05％，硫酸亚铁0.002％，硫酸锌0.001％，玉米浆干粉1.8％，消泡剂0.05％，余量为水；分别取30ml加入250ml摇瓶中，湿热灭菌，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟；
4)将步骤3)得到的发酵液分别取2ml加1：1的乙腈水溶液8ml，震荡15min，定性滤纸(中速)过滤，取0.2ml滤液采用离心机1万转速离心10min，取上清液20ul进高效液相色谱仪检测发酵单位及组分。
液相条件：色谱柱为C18 250mm×4.6mm，5um
柱温为50℃
检测波长为254nm
流速1.5ml/分钟；
梯度表见表1。
取20mg对照品，加入1：1的乙腈水溶解并稀释至100ml，摇匀，作为对照品溶液；
对照菌种为LA20190115-9，操作步骤同1)，2)，3)，4)。
突变菌种LA20190419-12与对照菌种LA20190115-9比较，发酵单位提高百分率，高效液相色谱法检测数据如表4。
表4.实施例3中LA20190419-12与LA20190115-9菌株发酵单位比较表
Figure GDA0003517325060000091
由表4可以看出，实施例3中突变菌种LA20190419-12的发酵单位较对照菌种LA20190115-9平均提高率达到46.1％，提高了麦角酸的收率。
上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (8)

1.一种麦角菌突变株，其特征在于，该菌株为麦角菌（Claviceps purpurea）LA20190419-12，已于2020年3月16日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.19370。
2.权利要求1所述麦角酸突变株在制备麦角酸发酵液中的应用。
3.利用权利要求1所述麦角菌突变株发酵得到的一种麦角酸发酵液。
4.权利要求3所述一种麦角酸发酵液的制备方法，其特征在于，先将麦角菌突变株接种于斜面培养基上，26～29℃培养7天，得到斜面菌丝，然后将斜面菌丝接种于种子培养基中，23～25℃摇床培养4天，得到种子培养液，最后将种子培养液接种于发酵培养基中，23～25℃摇床培养15天，即得所述的一种麦角酸发酵液；
其中，以重量百分数计，所述斜面培养基的配方组成如下：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）3.9%，酵母菌提取物0.05%，余量为水；
以重量百分数计，所述种子培养基的配方为：山梨醇5.0%，琥珀酸1.0%，大豆蛋白胨0.2%，磷酸氢二钾0.1%，消泡剂0.017%，余量为水；
以重量百分数计，所述发酵培养基的配方为：山梨醇8%，琥珀酸3.5%，酵母粉0.05%，硫酸亚铁0.002%，硫酸锌0.001%，玉米浆干粉1.8%，消泡剂0.05%，余量为水。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，配制好的斜面培养基分装于250ml茄子瓶中，每个茄子瓶分装50ml，经湿热灭菌后，斜放凝固，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，配制好的种子培养基分别取60ml加入250ml摇瓶中，湿热灭菌，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，配制好的发酵培养基分别取30ml加入250ml摇瓶中，湿热灭菌，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
1）将麦角菌LA20190419-12冷冻管菌丝，用灭菌后的1ml吸管吸取0.1ml接种于灭菌后的斜面培养基上进行培养，培养温度为26～29℃，静置，培养时间为7天，得到菌种LA20190419-12的斜面菌丝；
2）将步骤1）中得到的斜面菌丝用灭菌后的接种棒取4cm2，于生物安全柜上，分别接种于灭菌后的含60ml种子培养基的250ml摇瓶中，培养温度23～25℃，摇床转速220r/min，培养4天，得到种子培养液；
3）将步骤2）中得到的种子培养液，分别取3ml接种于灭菌后的含30ml发酵培养基的250ml摇瓶中，培养温度23～25℃，摇床转速220r/min，培养时间15天，即得所述的一种麦角酸发酵液。
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