CN115537350B - 嗜麦芽寡养单胞菌yb-1573、生防菌剂及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种嗜麦芽寡养单胞菌YB‑1573、生防菌剂及其制备与应用，旨在解决小麦茎基腐病和玉米茎腐病缺乏有效的生物防治措施的技术问题。本发明从玉米种子中分离筛选得到嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）YB‑1573，保藏编号：CGMCC No.24703，该菌株能够诱导玉米和小麦植株的系统抗病性，对玉米茎腐病和小麦茎基腐病有较好的防治效果，同时能提高作物的产量和品质；利用本发明菌株制备的生防菌剂可以替代或减少化学农药使用，提高食品和生态环境安全，具有较好的经济和社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及生物防控技术领域，具体涉及一种嗜麦芽寡养单胞菌YB-1573、生防菌剂及其制备与应用。
背景技术
黄淮地区是我国小麦和玉米主产区，在国家粮食安全工作中具有重要地位。近年来，由于品种抗性较差、秸秆还田等因素的影响，该地区小麦茎基腐病和玉米茎腐病等土传病害逐年加重，损失严重，已成为威胁我国粮食安全生产的限制性因素。目前，这些病害的防控主要依靠化学农药。然而，化学农药的长期不合理使用会导致病原菌抗药性逐渐增强，施用剂量盲目增加，防治效果不理想，同时残留农药对食品安全和生态环境构成严重威胁。另外，由于开发安全、高效化学杀菌剂的成本高昂，投资风险巨大，近年来，登记用于防治小麦茎基腐病和玉米茎腐病的新型化学杀菌剂很少。
近年来，具有相对安全、无残留、环境友好等优点的生物农药产业不断增长，成为绿色农药发展的重点。基于微生物的生物防控技术被认为是未来控制作物土传病害的主要发展方向之一。因此，如何利用病原菌拮抗微生物进行生物防治，并进一步优化使用方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
公开于该背景技术部分的信息仅用于加深对本公开的背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成本领域技术人员所公知的现有技术。
发明内容
发明人通过研究发现，从玉米种子中分离到的内生菌—嗜麦芽寡养单胞菌株YB-1573，能够诱导玉米和小麦植株的系统抗病性，对玉米茎腐病和小麦茎基腐病具有较好的防治效果，且其能够促进作物的生长发育，还具有改善作物籽粒品质的作用。
根据本公开的一个方面，筛选得到一种嗜麦芽寡养单胞菌YB-1573，其分类命名为Stenotrophomonas maltophilia，于2022年 4 月 18 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101），其保藏编号为 CGMCC No. 24703。
根据本公开的另一个方面，提供一种含有所述嗜麦芽寡养单胞菌YB-1573或/和其代谢产物的生防菌剂。
根据本公开的另一个方面，提供一种生防菌剂的制备方法，包括如下步骤：
将所述嗜麦芽寡养单胞菌YB-1573接种于LB液体培养基，于28～30℃，180～200rpm条件下，培养18～24 h，至OD 600 nm 达至0.8～0.9，所得发酵菌液即为生防菌剂。
在本公开的一些实施例中，所述LB液体培养基含：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.0。
根据本公开的另一个方面，将所述嗜麦芽寡养单胞菌YB-1573或所述生防菌剂应用于小麦茎基腐病或玉米茎腐病的防治当中。
根据本公开的另一个方面，将所述嗜麦芽寡养单胞菌YB-1573或所述生防菌剂应用于促进植物生长中。
根据本公开的另一个方面，将所述嗜麦芽寡养单胞菌YB-1573或所述生防菌剂应用在作物产量的提高当中。
根据本公开的另一个方面，将所述嗜麦芽寡养单胞菌YB-1573或所述生防菌剂应用在作物籽粒品质改善、提高方面，例如，提高小麦的蛋白质含量、容重和湿面筋含量，并提高稳定时间和面团形成时间。
本申请实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
1. 目前利用嗜麦芽寡养单胞菌防治作物病害的研究报道较少，且尚未见用嗜麦芽寡养单胞菌防治层出镰孢菌（Fusarium proliferatum）引起的玉米茎腐病以及假禾谷镰孢（F. pseudograminearum）引起的小麦茎基腐病，且来源不同菌株的生物学特性、抗菌谱等存在明显差异，具有菌株特异性。本发明嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）YB-1573是从玉米种子中分离到的内生菌，该菌株能够诱导玉米和小麦植株的系统抗病性，对玉米茎腐病和小麦茎基腐病的室内防治效果分别达66.47%和68.90%，对小麦茎基腐病的田间防治效果达60.7%，同时能提高小麦的产量和品质。
2. 利用本发明菌株制备的生防菌剂可以替代或减少化学农药使用，提高食品和生态环境安全，具有较好的经济和社会效益。
附图说明
图1 为本申请一实施例中YB-1573菌株的鉴定；(a) YB-1573的菌落特征，（b）YB-1573的菌体形态，（c）YB-1573的革兰氏染色，（d）YB-1573菌株基于16S rDNA基因序列的系统发育树。
具体实施方式
在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂及原料如无特别说明，均为市售常规市售产品；所涉及的检测、测试、实验方法等，如无特别说明，均为本领域常规方法。
为了更好的理解本申请技术方案，下面将结合说明书附图以及具体的实施方式对上述技术方案进行详细的说明。
实施例一：菌株种类鉴定
从玉米种子上分离得到一株内生菌（2020年7月，梁娟分离于玉米，品种：B104），命名为YB-1573，在NA培养基上菌落为淡黄色透明状，表面光滑湿润，边缘规则；革兰氏染色阴性，菌体呈短杆状，无内生孢子（图1中a-c）。提取菌株DNA，测定YB-1573的16 S序列，与NCBI数据库进行BLAST比对分析，相似性最高的属种为嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia），序列相似度达到99%。从NCBI数据库下载其近缘序列构建系统发育树（见图1d），结果显示菌株YB-1573与嗜麦芽寡养单胞菌的亲缘关系最近，结合形态学鉴定，将菌株YB-1573鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌（S. maltophilia）。
实施例二：YB-1573菌剂的制备
挑取YB-1573菌株单菌落接种于LB液体培养基（配方：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.0），于28～30℃，180～200 rpm条件下培养18～24 h，培养液OD600 nm为0.8～0.9时即得生防菌剂。
实例三：YB-1573菌剂盆栽防病和促生能力验证试验
制备麦粒砂培养基，高压灭菌后，分别接种玉米茎腐病病原菌层出镰孢（Fpr）和小麦茎基腐病病原菌假禾谷镰孢（Fps），25℃培养10 d后，按照2%（wt）的量与无菌土混匀作为病土。分别用YB-1573生防菌剂 200 mL/kg玉米拌种处理，20 mL/kg小麦拌种处理，处理后的小麦和玉米种子分别播种于相应的病土中。播种30 d后，将小麦和玉米幼苗从土壤中取出，用清水冲洗根部，注、洗净擦干后分别统计鲜重、根长、株高，调查玉米茎腐病和小麦茎基腐病发病情况，计算病情指数和防治效果。采用SPSS 25.0 软件对试验数据进行单因素方差分析，利用Duncan氏新复极差法进行差异显著性检验。
表1 YB-1573菌株对玉米茎腐病的室内盆栽防治效果及对玉米植株生长的影响
。
表2 YB-1573菌株对小麦茎基腐病的室内盆栽防治效果及对小麦植株生长的影响
。
结果显示，YB-1573菌剂能够显著降低玉米茎腐病的发病指数，防治效果达66.47%。此外，YB-1573菌剂能够显著增高玉米的株高、根长和鲜重，分别比对照增加13.9%、13.9%和17.0%（表1）。由此可见，YB-1573菌剂对玉米具有较好的促生和防病效果。
此外，YB-1573菌剂也显著降低了小麦茎基腐病的发病指数，防治效果达68.90%，YB-1573菌株能够显著增高了小麦的株高、根长和鲜重，分别比对照增加11.6%、17.3%和33.3%（表2）。由此可见，YB-1573菌剂对小麦也具有较好的促生和防病效果。
实施例四：YB-1573菌剂对小麦和玉米植株防御酶活性的影响
制备麦粒砂培养基，高压灭菌后，分别接种玉米茎腐病病原菌层出镰孢（Fpr）和小麦茎基腐病病原菌假禾谷镰孢（Fps），25℃培养10 d后，按照2%（wt）的量与无菌土混匀作为病土。针对玉米，设置以下四个处理：
（1）YB-1573生防菌剂 200 mL/kg玉米拌种处理+无菌土；
（2）YB-1573生防菌剂 200 mL/kg玉米拌种处理+含Fpr的病土；
（3）清水拌种+含Fpr的病土；
（4）清水拌种+无菌土。
针对小麦，设置以下四个处理：
（1）YB-1573生防菌剂20 mL/kg小麦拌种处理+无菌土；
（2）YB-1573生防菌剂20 mL/kg小麦拌种处理+含Fps的病土；
（3）清水拌种+含Fps的病土；
（4）清水拌种+无菌土。
小麦和玉米播种30 d后，取不同处理的叶片测定PAL、PPO和SOD酶活性。
结果表明，单独接种生防菌YB-1573和小麦/玉米病原菌+ YB-1573混接两种处理方式均能显著提高小麦和玉米叶部PAL、PPO和SOD的活性（表3，4）。由此可见，YB-1573菌株能够诱导小麦和玉米的PAL、PPO和SOD活性，从而提高小麦和玉米的抗病能力。
表3 YB-1573处理对小麦防御酶的影响
。
表4 YB-1573处理对玉米防御酶的影响
。
实施例五：YB-1573菌剂对小麦茎基腐病的田间防效、小麦产量以及品质的影响
试验地点：河南省新乡市平原新区，试验地块常年种植小麦且茎基腐病发生较重，按照常规施底肥及追肥，整个生长期除试验外不使用其他杀菌剂。
小麦品种：郑麦369，播量15公斤/亩。
试验处理：处理为YB-1573菌剂20 ml/kg拌种、空白对照为种子不做任何处理，3个重复。
在小麦拔节期。每个小区采用五点取样法，每个点取25株苗，将植株连根挖出，保持根系完整，根据不同时期的分级标准进行分级调查，根据病情指数计算防治效果。同时调查单茎鲜重、株高和分蘖数。
病情分级标准：
0级：整株无变褐症状；1级：植株胚芽鞘或地中茎变褐；3级：第一叶鞘变褐；5级：第二叶鞘变褐；7级：植株第三叶鞘变褐或整株茎秆变褐发软；9级：植株死亡。
另外，在收获期进行测产，每小区5点取样，每点取1 m2小麦植株，实收测产，并折合每公顷产量，并计算增产率。小麦的蛋白质含量、容重和湿面筋含量，稳定时间以及面团形成时间等品质指标由农业农村部农产品质量监督检验测试中心（郑州）测定。
结果显示，与对照相比，YB-1573菌剂拌种处理能够显著降低小麦茎基腐病的病情指数，防治效果达60.7%。此外，YB-1573菌剂拌种处理也显著增加了小麦的单茎鲜重、分蘖数和株高（表5）。说明YB-1573菌剂对小麦具有较好的防病和促生效果。
YB-1573菌剂拌种处理的产量为607.0 kg/ma，对照产量为521.7 kg/ma，比对照增产13.8%。此外，测定了YB-1573菌剂拌种处理对小麦品质的影响。结果显示，与对照相比，YB-1573菌株能够显著提高小麦中的蛋白质含量、容重和湿面筋含量，并显著提高了稳定时间和面团形成时间（表6）。由此可见，YB-1573菌剂能够显著提高小麦的产量和品质。
表5 YB-1573菌剂对小麦茎基腐病的田间防效
。
表6 YB-1573菌剂对小麦产量及品质的影响
。
尽管已描述了本申请的一些优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若这些修改和变型属于本申请权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (8)
1.一种嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）YB-1573，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No. 24703。
2.一种生防菌剂，其特征在于，含权利要求1所述嗜麦芽寡养单胞菌YB-1573。
3.权利要求2所述生防菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将权利要求1所述嗜麦芽寡养单胞菌YB-1573接种于LB液体培养基，于28～30℃，180～200 rpm条件下，培养18～24 h，至OD600达至0.8～0.9，所得发酵菌液即为生防菌剂。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述LB液体培养基包括：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，pH 7.0。
5.权利要求1所述嗜麦芽寡养单胞菌YB-1573或权利要求2所述生防菌剂在防治小麦茎基腐病或玉米茎腐病中的应用。
6.权利要求1所述嗜麦芽寡养单胞菌YB-1573或权利要求2所述生防菌剂在促进小麦或玉米生长中的应用。
7.权利要求1所述嗜麦芽寡养单胞菌YB-1573或权利要求2所述生防菌剂在提高小麦或玉米产量中的应用。
8.权利要求1所述嗜麦芽寡养单胞菌YB-1573或权利要求2所述生防菌剂在提高小麦籽粒品质中的应用。
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| 产生ACC脱氨酶的PGPR种衣剂对黄瓜细菌性茎软腐病的防治效果;贺字典;闫立英;石延霞;李宝聚;高玉峰;张明珠;孙健;;中国生物防治学报;20171208(第06期);第817-825页 * |
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