CN115851492A

CN115851492A - 一种防治三七根腐病的合成菌群及其用途

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Publication number: CN115851492A
Application number: CN202211059747.5A
Authority: CN
Inventors: 朱书生; 郭存武; 杨敏; 梅星月; 江冰冰; 黄惠川; 刘屹湘; 叶辰; 何霞红; 朱有勇
Original assignee: Yunnan Agricultural University
Current assignee: Yunnan Agricultural University
Priority date: 2022-08-24
Filing date: 2022-08-31
Publication date: 2023-03-28
Anticipated expiration: 2042-08-31
Also published as: CN115851492B

Abstract

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种防治三七根腐病的合成菌群及其用途。本发明所述合成菌群由4株菌株构成，所述4株菌株分别为类芽孢杆菌属L_9‑17、芽孢杆菌属R_56‑S15、芽孢八叠球菌属T_56‑61和节杆菌属T_56‑58。本发明合成菌群的应用方法为合成菌群活化、发酵培养后施用于三七根部。本发明提供的合成菌群具有良好的防病和促生作用，可以拮抗三七根腐病原菌，提高三七植株的存苗率和发病率，同时可以显著增加连作土壤中三七植株根部生物量积累和三七总皂苷含量；本发明提供的合成菌群能有效将在连作土中三七的发病率控制在30％以下，明显缓解连作障碍。

Description

一种防治三七根腐病的合成菌群及其用途

本发明要求中国专利申请CN 202211021762.0的优先权，该优先权文件的说明书、说明书附图和权利要求书所记载的内容全文引入本发明的说明书并被作为本发明说明书原始记载的一部分。申请人进一步声明，申请人拥有基于该优先权文件修改本发明的说明书和权利要求书的权利

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种防治三七根腐病的合成菌群及其用途。

背景技术

三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)属五加科人参属植物，是我国特有的名贵中药材，具有散瘀止血，消肿定痛的功能，对治疗心脑血管疾病具有显著疗效。云南是三七的主产地和原产地。然而，三七生长存在严重的连作障碍问题，且由于连年大面积单一种植，连作障碍已严重影响三七的产量和品质。三七根际病原微生物的累积和根际菌群失衡引发更为严重的三七根腐病是造成三七连作障碍的重要诱因。化学药剂防治根腐病不仅难以定位根腐病菌且杀灭效果不佳导致防效差，同时会引发药材安全性和环境污染等问题。轮作能较好的克服连作障碍，但一般需要20年以上。因此，如何克服和缓解三七连作障碍，确保药品安全和缩短土地再植周期是实现三七产业可持续发展的关键。

应用生物防控作为防治土传病害的手段被认为可以避免以上化学防治出现的问题，同时改善土壤质量而值得期待的策略。利用植物的土壤根际微生物防治土传病害因避免化学防治出现的问题被广泛认可。但在实际应用中发现，单菌株生防制剂由于对病原菌的有限靶标，且在宿主根际定殖能力不足，导致生防效果不稳定，多菌株联合和人工合成菌群的应用能够进一步提升防治效果。利用前期实验和土壤微生物数据挖掘，获得了一个能够抵御三七病害的核心微生物群落，利用微生物培养组学的方法，从三七根际土壤中分离获得既能降促进三七生长又能拮抗三七根腐病原菌，还能促进三七皂苷合成的细菌菌株进行三七连作障碍的防治和连作土壤的改善。加大防治病害的功能核心微生物挖掘，构建抗病功能更为稳定的微生物合成菌群，能为保持土壤健康和缓解土壤病害提供可靠的生物防治策略。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一个由4株菌株构成的合成菌群，用以防治三七根腐病和缓解三七连作障碍导致其出苗率降低或发病率加重的问题。

具体地，通过以下几个方面的技术方案实现了本发明：

在第一个方面中，本发明利用土壤微生物相对丰度与植物病害的关联分析，挖掘到1个可能抵御三七根腐病的三七根际核心菌群。

本发明采用平板分离法从三七根际土壤中分离得到以上核心菌群中的4个属。利用微生物培养组学从土壤中分离到这4个属的29株土壤微生物，将4个属29个菌株进行菌株融合试验，筛选出能够融合的4个菌株(类芽孢杆菌属L_9-17(P)、芽孢杆菌属R_56-S15(B)、芽孢八叠球菌属T_56-61(S)、节杆菌属T_56-58(A))用于合成菌群构建，命名为BSPA，将以上4株菌株通过分子方法鉴定为命名为Paenibacillus sp.，Bacillus sp.、Sporosarcinasp.、Arthrobacter sp.。

上述4株菌株的保藏信息分别为：

所述类芽孢杆菌属L_9-17的保藏编号为CGMCC NO.25457，保藏日期为2022年08月01日，保藏地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101；

所述芽孢杆菌属R_56-S15的保藏编号为CGMCC NO.25459，保藏日期为2022年08月01日，保藏地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101；

所述芽孢八叠球菌属T_56-61的保藏编号为CGMCC NO.25460，保藏日期为2022年08月01日，保藏地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101；和

所述节杆菌属T_56-58的保藏编号为CGMCC NO.25458，保藏日期为2022年08月01日，保藏地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。

本发明提供的合成菌群BSPA对三七主要根腐病菌Cylindrocarpon destructans、Monographella cucumerina、Fusarium solani有较强的抑制活性，且抑制能力显著优于单个菌株B、S、P、A时。

优选地，在所述合成菌群中，所述类芽孢杆菌属L 9-17、所述芽孢杆菌属R_56-S15、所述芽孢八叠球菌属T_56-61和所述节杆菌属T_56-58的总活菌数比为1∶1∶1∶1。

在第二个方面中，本发明提供了一种复合菌剂，所述复合菌剂包含上述第一个方面所述的合成菌群。

在第三个方面中，本发明提供了上述第一个方面所述的复合菌群或者上述第二个方面所述的复合菌剂在促进三七生长方面的用途。

作为可选的方式，在上述用途中，所述用途为对三七根腐病菌产生拮抗作用，减少三七发病率发生。

作为可选的方式，在上述用途中，所述用途为增加总皂苷含量。

在第四个方面中，本发明提供了上述第一个方面所述的复合菌群或者上述第二个方面所述的复合菌剂在提升三七存苗率或提高三七根重方面的用途。

在第五个方面中，本发明提供了上述第一个方面所述的复合菌群或者上述第二个方面所述的复合菌剂在防治三七根腐病和缓解三七连作障碍方面的用途。

作为可选的方式，在上述用途中，所述合成菌群或所述复合菌剂的使用方法为将所述合成菌群活化、发酵培养后，施用于所述三七根部。

作为可选的方式，在上述用途中，所述施用时，所述合成菌群的总活菌数为10⁶-10⁸cfu/mL，优选为10⁸cfu/mL。

本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：

(1)本发明提供的合成菌群BSPA可以拮抗三七根腐病菌，对其抑制率可达58.83％，且抑制能力显著优于单个菌株B、S、P、A时。

(2)本发明可以显著提高连作土中三七的存苗率，显著增加连作土中三七的根部生物量。可显著提高三七的根干重、主根干重、须根干重，可以显著增加连作土中三七的皂苷含量。

附图说明

图1：单独4个菌株B、S、P、A与合成菌群BSPA对病原菌拮抗效果比较。

图2：连作土壤合成菌群处理后的存苗率和发病率评价。

图3：合成菌群BSPA处理对三七根部生物量的影响。

图4：合成菌群BSPA处理对三七总皂苷含量的影响。

具体实施方式

下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。

下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。

实施例1：

本实施例采用平板分离法从三七根际土壤中分离得到4个属(Paenibacillussp.，Bacillus sp.、Sporosarcina sp.、Arthrobacter sp.)共29株细菌。利用分子鉴定方法，采用引物27F和1492R引物(27F-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG和1492R-GGT TAC CTTTGT TAC GAC TT)进行分子扩增鉴定测序。测序完成后与NCBI网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)里面进行BLAST比对最终确定其亲缘关系，大于97％的相似度后选取列出的相似度最高的确定分类。后利用MEGA软件构建系统进化树。鉴定具体结果如下：

表1三七根际土壤中29株细菌的编号及鉴定结果

实施例2：

29株细菌菌株进行菌株融合试验，Sporosarcina(芽孢八迭球菌属)，类芽孢杆菌属分别只有1株拮抗细菌菌株，菌株编号分别为T_56-61和L_9-17。将Bacillus属4株和Arthrobacter属的23株的菌株分别与Sporosarcina(T_56-61)和Paenibacillus(L_9-17)属的菌株进行融合试验。Bacillus属中1株菌(编号为R_56-S15)能与Sporosarcina(T_56-61)和Paenibacillus(L_9-17)进行融合；Arthrobacter属中有两株菌(编号为T_56-58，TT_13-60)能与Sporosarcina(T_56-61)和Paenibacillus(L_9-17)。其中，T56-58和TT_13-60对三七病原菌RS006的抑制率进行比较，抑制率分别为31.69％和8.15％。根据拮抗细菌之间的融合的试验的结果，最终确定Bacillus、Sporosarcina，Paenibacillus，Arthrobacter四个细菌菌属筛选的代表菌株编号为：R_56-S15，T_56-61，L_9-17，T_56-58，下文中简称编号B，S，P，A。

菌株融合筛选试验方法：采用抑菌圈的方法，将目标细菌菌液用涂布器涂板在NA培养基上，再将其他细菌的菌液滴于已涂板的NA培养基上。放至细菌培养箱，待细菌长出来后，观察后滴的菌液是否出现抑菌圈，若出现抑菌圈则表示后滴的菌液抑制了目标菌液；若后滴的菌液未长，则说明目标菌液抑制了后滴的菌液；若后滴的菌液正常生长也未出现抑菌圈，则说明后滴的菌液与目标菌液相互之间没有拮抗关系。

表2菌株融合筛选试验结果

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注：Y表示菌株能在涂了Sporosarcina/Paenibacillus的培养基上生长(可融合)；N表示不能在涂了Sporosarcina/Paenibacillus的培养基上生长或者出现抑菌圈(不可融合)

用于合成BSPA菌群的4株菌株的保藏信息分别为：

实施例3：

本实施例涉及合成菌群BSPA对锈腐病菌的抑制作用。在以下实施例3-6中使用的合成菌群BSPA中，4个菌B、S、P、A的总活菌数比为1∶1∶1∶1。

本实施例中供试锈腐病菌(Cylindrocarpon destructans、Monographellacucumerina、Fusarium solani)由云南农业大学植保学院植物病理实验室提供。

具体方法如下：采用平板对峙培养法测定4个菌B、S、P、A和合成菌群BSPA对供试锈腐病菌菌丝生长的抑制活性。在超净工作台上将在PDA培养基上长好的供试锈腐病菌用直径为5mm的打孔器制成菌饼，然后将菌饼转至PDA培养基平板中央，再用无菌的牙签将分离纯化的蒙氏假单胞菌接种到距病原菌2.5cm处，设置4次重复，以只放病原菌菌饼的平板为对照，26℃恒温培养，待对照菌落长到培养基的2/3时，测量菌落直径，并按照以下供试计算抑菌率。抑菌率(％)＝[(对照菌落半径-对峙培养菌落半径)/对照菌落半径]×100％。

其中，PDA培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉18g，水1000mL。

得到如图1所示结果，与CK处理的对照菌落半径对比，4个菌B、S、P、A和合成菌群BSPA对3种三七根腐病病原菌均有拮抗效果(拮抗率)。

与单独的4个菌B、S、P、A相比，BSPA处理对根腐病菌Fusarium solani的拮抗活性有所增加。从15.19％提高到25.99％；其中BSPA处理与单独菌B、S相比，拮抗活性显著增加(表3)，表明了合成菌群具有优势。

与单独的4个菌B、S、P、A相比，BSPA处理对根腐病菌Cylindrocarpon destructans的拮抗活性有所增加。从4.99％提高到58.83％，其中BSPA处理与单独的菌B、S、A相比，拮抗活性显著增加(表3)，同样表明合成菌群的拮抗活性相比单独菌株具有优势。

与单独的菌B、S、A对比，BSPA处理对根腐病菌Monographellacucumerina的拮抗活性都也显著增加。从21.68％提高到58.83％(表3)。

表3单独4个菌B、S、P、A和合成菌群BSPA对3个根腐病原菌的拮抗率

注：表中不同的小写字母分别代表处理间(B、S、P、A、合成菌群BSPA处理间)存在显著性差异(P＜0.05，ANOVA，Duncan法)

实施例4：

本实施例合成菌群BSPA能显著提高三七的存苗率和显著降低三七的发病率，具体步骤如下：

分别设置连作土和灭菌土两种不同的土壤，使用红色塑料花盆(口径18cm，高度15.5cm)，每盆装入2.5L的土，每盆移栽10棵一年三七种苗，每种土壤设置3个处理(连作土对照、连作土灭菌处理、连作土接种合成菌群BSPA处理)，4个重复，1个对照(只进行NA液体培养基处理)，间隔15天处理一次细菌菌液，共处理3次，菌浓度1×10⁷CFU/mL-1×10⁸CFU/mL，每盆处理0.3L细菌菌液。

其中NA培养基配方为葡萄糖10g，蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，酵母浸膏1g，琼脂粉17g，水1000mL。

并每间隔一星期调查记录三七的存苗率及发病情况。

计算三七的出苗率及存苗率。

存苗率(％)＝存苗棵数/栽种棵数×100％

发病率(％)＝发病棵数/栽种棵数×100％

得到如图2所示结果，与连作土对照相比，连作土中接种合成菌群BSPA能显著提高土壤中三七的存苗率(图2A)，且能显著降低三七的发病率(图2B)。图中不同的小写字母分别代表处理间存在显著性差异(P＜0.05，ANOVA，Duncan法)。

实施例5：

本实施例检测合成菌群BSPA能显著提高连作土中三七根干重，具体步骤如下：

对3个不同细菌菌液处理3个处理(连作土对照、连作土灭菌、连作土接种合成菌群BSPA)的三七盆栽进行取样，将三七植株用自来水冲洗干净并用吸水纸擦干表面水份。三七植株50℃烘干至恒重，分别称量三七主根须根及总根干重。

得到如图3所示结果，与连作土对照相比，连作土中接种合成菌群BSPA能显著提高土壤中三七的根干重，包括主根的干重(图3A)和须根的干重(图3B)。图中不同的小写字母分别代表处理间存在显著性差异(P＜0.05，ANOVA，Duncan法)。

实施例6：

本实施例涉及合成菌群BSPA能显著提高连作土中三七的皂苷含量，具体步骤如下：

(1)三七植株样本获取

对3个不同细菌菌液处理3个处理(连作土对照、连作土灭菌、连作土接种合成菌群BSPA)的三七盆栽进行收获，三七植株洗净后60℃烘干至恒重。将三七总根用研磨机及研钵磨成粉并过100目网筛待用，用于三七皂苷的检测。

(2)三七皂苷提取液的制备

精确称取0.2g三七粉置于50mL离心管中，准确量取15mL 75％的甲醇25℃超声提取30min后，吸取上清液，10000rpm离心后立即过0.22μm滤膜放入棕色检测瓶中置于4℃冰箱保存用于HPLC检测。

(3)R1、Rg1、Re、Rb1和Rd的标准溶液制备。

精确称取对应标品到2mL容量瓶定容，将溶液按一定比例甲醇稀释，配制成5ppm、10ppm、25ppm、50ppm、100ppm、200ppm和500ppm的标准品溶液。所得标准品溶液用0.22μm滤膜过滤备用；

(4)HPLC检测条件

色谱柱(4.6mm×150mm，4μm，Agilent Poroshell 120EC-C18)；流动相A：乙腈；流动相B：水；流速1.0mL/min；柱温30℃；检测波长为203nm；进样体积为10μL。洗脱梯度：0-20min，82％B；20-40min，82-57％B；40-48min，57-45％B；48-54min，45％B；54-56min，45-5％B；56-71min，5％B；71-72min，5-82％B；72-74min，82％B。在此条件下，可实现5种主要皂苷(R1、Rg1、Re、Rb1和Rd)达到基线分离；

(5)使用HPLC进行检测，以色谱峰峰面积(Y)为纵坐标，样品浓度(X)为横坐标绘制标准曲线。根据标准曲线求出粗皂苷中各单体皂苷的浓度。

得到如图4所示结果，与连作土对照相比，连作土中进行合成菌群BSPA灌根后，显著提高连作土中三七的总皂苷含量。图中不同的小写字母分别代表处理间存在显著性差异(P＜0.05，ANOVA，Duncan法)。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims

1.一种防治三七根腐病的合成菌群，其特征在于：所述合成菌群由4株菌株构成，所述4株菌株分别为类芽孢杆菌属L_9-17、芽孢杆菌属R_56-S15、芽孢八叠球菌属T_56-61和节杆菌属T_56-58。

2.根据权利要求1所述的合成菌群，其特征在于：所述类芽孢杆菌属L_9-17的保藏编号为CGMCC NO.25457，保藏日期为2022年08月01日，保藏地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101；

3.一种复合菌剂，其特征在于：所述复合菌剂包含权利要求1或权利要求2所述的合成菌群。

4.权利要求1或权利要求2所述的复合菌群或者权利要求3所述的复合菌剂在促进三七生长方面的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述用途为对三七根腐病菌产生拮抗作用，减少三七发病率发生。

6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述用途为增加总皂苷含量。

7.权利要求1或权利要求2所述的复合菌群或者权利要求3所述的复合菌剂在提升三七存苗率或提高三七根重方面的用途。

8.权利要求1或权利要求2所述的复合菌群或者权利要求3所述的复合菌剂在防治三七根腐病和缓解三七连作障碍方面的用途。

9.根据权利要求4至8中任一项所述的用途，其特征在于：所述合成菌群或所述复合菌剂的使用方法为将所述合成菌群活化、发酵培养后，施用于所述三七根部。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述施用时，所述合成菌群的总活菌数为10⁶-10⁸cfu/mL。