CN110564650B - 一种蒙氏假单胞菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种蒙氏假单胞菌及其应用，所述蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM‑41保藏号为CGMCC No.18491；其应用方法为将蒙氏假单胞菌PM‑41活化、发酵培养后施用于三七根部。本发明提供的蒙氏假单胞菌PM‑41具有良好的防病和促生作用，可以拮抗三七锈腐病菌，减少三七锈腐病的发生，同时可以降解三七分泌的自毒物质，特别是对皂苷Rg1和Rb1，在接菌192小时后浓度大幅降低，且降解率达到15％以上；本发明提供的蒙氏假单胞菌PM‑41能有效提高在连作土中三七的出苗率至20％以上，明显缓解连作障碍。

Description

一种蒙氏假单胞菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种蒙氏假单胞菌及其应用。
背景技术
三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)属五加科人参属植物，是我国特有的名贵中药材，具有散瘀止血，消肿定痛的功能，对治疗心脑血管疾病具有显著疗效。云南是三七的主产地和原产地。然而，三七生长存在严重的连作障碍问题，且由于连年大面积单一种植，连作障碍已严重影响三七的产量和品质。三七根系分泌的皂苷类化合物是造成三七连作障碍的重要诱因。目前生产中主要通过化学农药和轮作倒茬来缓解连作障碍，但农药的大量使用不但未明显地减轻连作障碍，反而导致严重的农药残留和重金属超标等药品安全问题。轮作能较好的克服连作障碍，但三七轮作期限一般需要20年以上。随着市场对三七需求量的不断增加和新垦地的减少，三七种植逐渐从道地产区向非道地产区转移，严重影响三七药材的道地性和原产地保护。因此，如何克服三七连作障碍，确保药品安全和缩短土地再植周期是实现三七产业可持续发展的关键。
前期研究表明，化感自毒是造成连作障碍的主要原因之一。三七根系分泌的皂苷类自毒物质一方面不仅能抑制三七种子萌发和幼苗生长，还能导致三七根系坏死，细胞壁降解，有利于土壤中根腐病菌的侵染；另一方面这些分泌在土壤中的自毒皂苷类化合物还能明显促进三七根腐病菌茄腐镰刀菌、锈腐病菌和恶疫霉菌的生长和致病。导致植物化感自毒的次生代谢产物如酚类化合物、萜类化合物、含氮有机物等，采用常规的物理化学方式处理很难起到明显的效果，且容易产生二次污染，因此微生物作为绿色高效的处理方式受到越来越多学者的关注，利用从三七根际土壤中分离到的既能降解皂苷类自毒物质又能拮抗锈腐病菌的细菌菌株进行三七连作障碍的防治是最具潜力的生物防治方法。应用化学农药防治植物病害在农业生产中发挥着重要作用，但是由于化学农药的大量使用导致的农药残留、环境污染和抗药性等问题日益凸显，生物防治因其环境友好、无农药残留等优点已成为当前国内外防治植物土传病害的研究热点，将逐步取代传统的化学防治手段，具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明提供一种蒙氏假单胞菌及其应用，用以解决现有技术中三七连作障碍导致其产量和品质下降的问题。
第一方面，本发明提供一种蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41，其保藏信息如下：保藏编号为CGMCC No.18491；分类命名为：蒙氏假单胞菌Pseudomonasmonteilii；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101；保藏日期为2019年9月16日。
本发明采用平板分离法从健康三七根际土壤中分离得到一种蒙氏假单胞菌，命名为Pseudomonas monteilii PM-41，通过培养特征、显微形态特征、生理生化特征和遗传特征，确定蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41符合蒙氏假单胞菌株的特征。
本发明提供的蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41能利用α-D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露醇、醋竹桃霉素、利福霉素SV、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸、L-组胺、林肯霉素、盐酸胍、硫酸四癸钠、D-葡糖酸、粘酸、奎宁酸、万古霉素、四唑蓝、四唑紫、柠檬酸、L-苹果酸、γ-氨基丁酸、溴酸钠。
本发明提供的蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41：对三七主要根腐病菌锈腐病菌有较强的抑制活性，对三七主要的皂苷类自毒物质(R1、Rg1、Re、Rb1和Rd)均存在较明显的降解，尤其是对皂苷Rg1和Rb1具有显著的降解活性。
进一步地，本发明提供的蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)可以制备成菌剂。
第二方面，本发明提供上述蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41或菌剂在促进三七生长方面的应用。
进一步地，应用具体为对三七锈腐病菌产生拮抗作用，减少三七锈腐病的发生。
进一步地，应用具体为降解三七分泌到根际的皂苷类自毒物质，具体为R1、Rg1、Re、Rb1和Rd。
本发明提供上述蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41或菌剂在提升三七的出苗率方面的应用。
本发明提供上述蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41或菌剂在提升三七的根重方面的应用。
更进一步，应用方法具体为将蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41活化、发酵培养后施用于三七根部。施用时总活菌数为106～108cfu/mL，优选为108cfu/mL。
本发明提供一种蒙氏假单胞菌及其应用，具有如下有益效果：
(1)本发明提供的蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41可以拮抗三七锈腐病菌，对其抑制率可达46％；
(2)可以显著降解三七分泌的皂苷类自毒物质(R1、Rg1、Re、Rb1和Rd)，192小时降解率可达15％以上；
(3)显著增加连作土中三七种子的出苗率，从10％提高至20％；
(4)显著增加三七的存苗率，从34％提升至51％，同时不同程度地增加三七整株和根部重量。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41的菌落图；
图2为本发明实施例1提供的蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)革兰氏染色图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
若未特别指明，实施例中所用技术手段均为本领域技术人员熟知的常规手段，所用原料均为市售产品。
实施例1
本实施例采用平板分离法从健康三七根际土壤中分离得到一种蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41，并对其形态、生理生化特征进行鉴定，具体结果如下：该菌为革兰氏阴性菌，无芽孢短杆状、菌落白色、表面光滑隆起、边缘不规则。该菌利用α-D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露醇、醋竹桃霉素、利福霉素SV、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸、L-组胺、林肯霉素、盐酸胍、硫酸四癸钠、D-葡糖酸、粘酸、奎宁酸、万古霉素、四唑蓝、四唑紫、柠檬酸、L-苹果酸、γ-氨基丁酸、溴酸钠，符合蒙氏假单胞菌的形态及生理生化特征。
本实施例提供的蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41对三七主要根腐病菌锈腐病菌有较强的抑制活性，对三七主要的皂苷类自毒物质(R1、Rg1、Re、Rb1和Rd)均存在较明显的降解，尤其是对皂苷Rg1和Rb1具有显著的降解活性。
该蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41保藏信息如下：保藏编号为CGMCC No.18491；分类命名为：蒙氏假单胞菌Pseudomonas monteilii；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101；保藏日期为2019年9月16日。
图1为本实施例提供的蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41菌落图。
图2为本实施例提供的蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41革兰氏染色图，在革兰氏染色实验中染成红色，属于革兰氏阴性菌。
实施例2
本实施例涉及检测蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41对锈腐病菌的抑制作用。
本实施例中供试锈腐病菌(Cylindrocarpon destructans)由云南农业大学植保学院植物病理实验室提供。
具体方法如下：
采用平板对峙培养法测定蒙氏假单胞菌PM-41对供试锈腐病菌菌丝生长的抑制活性。在超净工作台上将在PDA培养基上长好的供试锈腐病菌用直径为5mm的打孔器制成菌饼，然后将菌饼转至PDA培养基平板中央，再用无菌的牙签将分离纯化的蒙氏假单胞菌接种到距病原菌2.5cm处，设置4次重复，以只放病原菌菌饼的平板为对照，26℃恒温培养，待对照菌落长到培养基的2/3时，测量菌落直径，并按照以下供试计算抑菌率。抑菌率(％)＝[(对照菌落半径-对峙培养菌落半径)/对照菌落半径]×100％。
其中，PDA培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉18g，水1000mL。
将蒙氏假单胞菌PM-41单菌落在1％粗皂苷培养基上直接划线，置于28～30℃恒温培养，能生长的为耐皂苷细菌。
其中，粗皂苷培养基配方为：3g NaNO3，1g KH2PO4，0.5g KCl，0.5g MgSO4·7H2O，0.01gFeSO4·7H2O，10g粗皂苷，17g琼脂，1000mL蒸馏水，溶解，混匀，用1mol/L NaOH溶液调pH至7.0。
得到如表1所示结果，蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41具有明显的耐皂苷性，对供试锈腐病菌抑制率达到46％以上。
表1蒙氏假单胞菌PM-41耐皂苷及抑菌能力测定
Figure BDA0002221487890000051
实施例3
本实施例检测蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41对皂苷类自毒物质的降解能力，具体步骤如下：
(1)用接种环挑取纯化好的单一蒙氏假单胞菌PM-41菌株，接种到50mL的NA液体培养基中，放置在28℃、150r/min的摇床上培养过夜；然后，取100μL菌液加入到200mL以三七粗皂苷为唯一碳源的液体培养基中(三七粗皂苷1g/L)，以不加入菌液的处理作为空白对照，置于摇床上振荡培养(28℃、150r/min)，每一处理设置3次重复，培养96h、144h和192h分别取样测定。
其中NA培养基配方为葡萄糖10g，蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，酵母浸膏1g，琼脂粉17g，水1000mL。
(2)从每瓶摇培液中取100mL液体(包括空白对照)加入等体积甲醇，摇匀，20℃超声20min，静置5min后取200mL混合液用0.22μm的微孔滤膜真空抽滤，将抽滤好的溶液用旋转蒸发仪40℃旋转蒸发直到将甲醇蒸发干；最后，取20mL溶液放入-20℃冰箱冷冻过夜，再放入冷冻干燥机中干燥48h。待溶液干燥后，加入20ml、70％的色谱甲醇纯超声溶解，充分摇匀后取10ml溶液到15ml离心管中离心(4℃、9000r/min)5min，离心后取上面的澄清液1.5mL用0.22μm的尼龙滤膜过滤3次，将滤液置于4℃保存备用。
(3)利用HPLC检测不同处理中主要皂苷物质的含量，并计算接菌处理中主要皂苷类自毒物质的降解率。
HPLC检测条件为：色谱柱(4.6mm×150mm，4μm，Agilent Poroshell120EC-C18)；流动相A：乙腈；流动相B：水；流速1.0mL/min；柱温30℃；检测波长为203nm；进样体积为10μL。洗脱梯度：0～20min，82％B；20～40min，82～57％B；40～48min，57～45％B；48～54min，45％B；54～56min，45～5％B；56～71min，5％B；71～72min，5～82％B；72～74min，82％B。在此条件下，可实现5种主要皂苷达到基线分离。
降解率(％)＝(未接菌培养液的皂苷含量-接菌培养液皂苷含量)/未接菌培养液的皂苷含量×100％。
结果得到如表2所示结果，蒙氏假单胞菌PM-41对三七主要的皂苷类自毒物质(R1、Rg1、Re、Rb1和Rd)均存在明显的降解作用，尤其对皂苷Rg1和Rb1具有显著的降解活性。
表2 PM-41接种不同时间对皂苷类自毒物质的降解作用
Figure BDA0002221487890000071
实施例4
本实施例检测蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41对连作土中三七出苗的促进作用，具体步骤如下：
(1)土壤配制以连作三七土：林下土：珍珠岩：草炭＝4：4：1：1充分混匀，分装于200ml灭菌组培瓶中，每瓶50g备用。
(2)三七种子消毒三七种子用1％NaClO溶液消毒3min，用灭菌水冲洗净，备用。
(3)在装有土的组培瓶中种入消毒过的三七种子，每瓶10棵，然后将蒙氏假单胞菌PM-41在平板上活化48h后，用灭菌水冲洗，将各菌液稀释至106/ml接种于组培瓶中，每瓶20ml，以加入相同体积的灭菌水作为对照，每个处理12瓶。放入培养室(26℃，8h光照16h黑暗)中培养，培养3个月后，测量记录植株的出苗率。
表3蒙氏假单胞菌PM-41对三七种子出苗的影响
Figure BDA0002221487890000081
实施例5
本实施例涉及蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41对田间一年生三七存苗和生长的促进作用，具体步骤如下：
(1)菌液制备
将蒙氏假单胞菌PM-41于KB固体培养基上活化，挑取单菌落于KB液体发酵培养基中160rpm、28℃振荡培养48h，将发酵液稀释至OD600＝0.3用于后续田间灌根。
其中KB固体培养基每1L培养基配方为：20g蛋白胨，10mL甘油，1.5gK2HPO4·3H20，1.5g MgSO4·7H2O，17g琼脂，1000mL蒸馏水，pH 7.0。
(2)菌液灌根
试验安排在寻甸大河桥农场三七种植棚中进行。每个小区面积为1.5m×1.0m＝1.5m2，每个处理3个重复，各小区随机分布。2018年4月开始试验，菌液每个月连续灌3次，中间间隔一个月。
(3)试验调查
11月取样调查，测量记录植株的存苗率、植株地上部和地下部鲜重、植株地上部和地下部干重和存苗率。
结果得到如表4所示结果，蒙氏假单胞菌PM-41灌根后，三七存苗率显著上升，整株以及根部的重量均显著上升。
表4蒙氏假单胞菌PM-41对三七存苗和生长的影响
Figure BDA0002221487890000082
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41，其特征在于，保藏号为：CGMCCNo.18491。
2.含有权利要求1所述蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41的菌剂。
3.权利要求1所述的蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41或权利要求2所述的菌剂在促进三七生长方面的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，具体为对三七锈腐病菌产生拮抗作用，减少三七锈腐病的发生。
5.权利要求1所述的蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41或权利要求2所述的菌剂在降解三七分泌的皂苷类自毒物质R1、Rg1、Re、Rb1和Rd中的应用。
6.权利要求1所述的蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41或权利要求2所述的菌剂在提升三七的出苗率方面的应用。
7.权利要求1所述的蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41或权利要求2所述的菌剂在提高三七根重方面中的应用。
8.根据权利要求3-7任一项所述的应用，其特征在于，具体为将蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41活化、发酵培养后施用于三七根部。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，施用时蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41的活菌浓度为106～108cfu/mL。
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