CN109749941B - 蝉拟青霉发酵培养基、蝉拟青霉发酵制备麦角甾醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供蝉拟青霉发酵培养基、蝉拟青霉发酵制备麦角甾醇的方法，其中该蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae)发酵培养基的原料组分包括笋头、磷酸二氢钾、硫酸亚铁和硫酸镁。该蝉拟青霉发酵培养基可作为蝉拟青霉制备麦角甾醇的发酵培养基；同时，该蝉拟青霉发酵培养基以笋头为主要原料，能够合理利用笋头资源，解决了食用或加工后绝大多数的笋头残渣被随意丢弃或进行简单填埋处理，造成资源浪费又带来了环境污染的问题，具有潜在经济价值,市场前景非常广阔。
Description
技术领域
本发明涉及药用真菌的深层发酵技术领域，特别涉及一种蝉拟青霉发酵培养基、一种蝉拟青霉发酵制备麦角甾醇的方法。
背景技术
《中药大辞典》中记载蝉拟青霉含有糖原、环肽类、甘露醇、核苷类、多种生物碱及麦角甾醇等多种活性成分，具有多方面药理作用。其中，麦角甾醇是细胞内各种膜结构的重要组成成分，对膜的完整性、渗透性、流动性及细胞活力等方面起重要作用，可以增强人体抵抗疾病的能力，具有明显的抑菌，预防心血管疾病，抗肿瘤，降血脂，延缓衰老等疗效；且麦角甾醇为维生素D2的前驱物，是合成维生素D2的前体和生产“可的松”、“黄体酮”、芸苔素内酯和抗癌药物等甾醇类药物的重要原料。
人们研究发现，将蝉拟青霉菌丝体进行发酵培养，可以从蝉拟青霉发酵产物中提取麦角甾醇。但在实际研究中发现，麦角甾醇产量受多种因素影响，其中蝉拟青霉的发酵培养基是主要的一个因素。目前，对于提高麦角甾醇产量的蝉拟青霉发酵培养基研究较少，仍然使用一些常规的蝉拟青霉发酵培养基，从而限制了的蝉拟青霉发酵制备麦角甾醇的技术发展。
中国专利CN104046570B专利名称《一种提高蝉拟青霉液体发酵产物产量及产物活性的方法》，公开了将由薏苡仁10-40重量份、黄芪10-40重量份、枸杞10-40重量份和白术10-40重量份组成的中药材经水溶液提取，得到中药复合水提液再将制备的中药复合水提液、白术内酯及吐温80加入发酵基础培养基中，得到蝉拟青霉发酵培养基。其通过添加特定种类的中药复合水提液、白术内酯及吐温80可显著提高蝉拟青霉的生物量和多糖产量，同时多糖的活性也有明显的增大。
中国专利CN106190865A专利名称为《一种提高蝉花真菌生物量和活性成分含量的液体发酵培养基配方》，公开了培养基组成包括蔗糖30-40g/L、蛋白胨15-25g/L、KH2PO40.5-1.5g/L和MgSO4·7H2O 0.5-1g/L。其通过对发酵培养基进行设计优化，获得了最佳的碳源、氮源和无机盐，及相应的浓度，可以大幅提高蝉花真菌的生物量和活性成分-虫草酸的含量。
综上所述，如何获得一种适用于蝉拟青霉发酵制备麦角甾醇的发酵培养基正是本领域行业的诉求。
发明内容
为解决背景技术提到的问题，本发明提供一种蝉拟青霉发酵培养基，所述蝉拟青霉发酵培养基的原料组分包括笋头、磷酸二氢钾、硫酸亚铁和硫酸镁。
进一步地，所述蝉拟青霉发酵培养基包括笋头100-500g/L、磷酸二氢钾1-4g/L、硫酸亚铁0.03-0.08g/L、硫酸镁0.6-1.5g/L，pH为5-8。
进一步地，所述蝉拟青霉发酵培养中的笋头由笋头残渣与水混合后粉碎制得。
本发明还提供一种蝉拟青霉发酵制备麦角甾醇的方法，包括如下步骤：
步骤一、将保藏的蝉拟青霉菌种接入活化培养基活化，备用；
步骤二、将步骤一已活化的蝉拟青霉菌种接入到上述蝉拟青霉发酵培养基中，经液体发酵，得发酵产物；
步骤三、将步骤二的发酵产物进行分离提纯获取麦角甾醇。
进一步地，步骤一的活化培养基由葡萄糖10-30g/L、蛋白胨5-15g/L、磷酸氢二钾0.5-2.0g/L、硫酸镁0.1-1.0g/L构成，pH为5-8。
进一步地，步骤三中发酵产物的分离提纯步骤为：将发酵产物高速离心，去上清液，再加入有机溶剂乙醇，室温下超声波浸提，获得浸提液；将浸提液高速离心，取上清液蒸发浓缩成膏状物，用环己烷溶解膏状物，再加入等体积的环己烷/乙醚混合试剂萃取，提取上层清液再次浓缩成膏状物；将膏状物置于快速纯化制备系统中，用乙醚/正己烷混合试剂洗脱，得到白色固体粉末即麦角甾醇。
本发明提供的蝉拟青霉发酵培养基可作为蝉拟青霉制备麦角甾醇的发酵培养基；同时，该蝉拟青霉发酵培养基以笋头为主要原料，能够合理利用笋头资源，解决了食用或加工后绝大多数的笋头残渣被随意丢弃或进行简单填埋处理，造成资源浪费又带来了环境污染的问题，具有潜在经济价值,市场前景非常广阔。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明实施例采用的实验药品与试剂说明如下：
硫酸亚铁：分析纯,天津市永大化学试剂有限公司；
磷酸二氢钾:分析纯,广东汕头金砂化工厂；
硫酸镁:分析纯,汕头市光华化学厂；
葡萄糖:分析纯,国药集团化学试剂有限公司；
蛋白胨:生物试剂,天津市致远化学试剂有限公司；
正己烷:分析纯,上海联试化工试剂有限公司；
乙醚:分析纯,国药集团化学试剂有限公司；
甲醇:分析纯,默克股份两合公司；
无水乙醇:分析纯,西陇科学股份有限公司；
硅胶H:200-300目,华中海威基因科技有限公司；
硅胶板:50×100mm,青岛海洋化工分厂；
麦角甾醇标准品:Dr.Ehrenstorfer GmbH；
本发明实施例采用设备说明如下：
恒温培养振荡器：ZWYR-G2402，上海智诚分析仪器制造有限公司；高压蒸汽灭菌锅：TOMY-SX-700，施都凯仪器设备有限公司；
粉碎机：CLF-10C，中国浙江省温岭市创力药材器械厂；
旋转蒸发仪：PRM-201D，上海普渡生化科技有限公司；
超声波清洗机：KQ5200DE，昆山市超生仪器有限公司；
移液枪：Research Plu，德国Eppendorf公司；
PH酸度计：S210-K，SevenCompact；
离心机：Sigma 3-18KS，德国西格玛奥德里奇；
电子天平：CP114，奥豪斯仪器(上海)有限公司；
生化培养箱：MI-80A，施都凯仪器设备有限公司；
LC/MS：6545Q-TOF，Aglilent Technologies；
快速纯化制备液相色谱：ISOLERA ONE，Biotage。
本发明提供实施例1-3的蝉拟青霉发酵培养基的组分配方如表1所示：
表1
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | |
| 笋头(g/L) | 100 | 300 | 500 |
| 磷酸二氢钾(g/L) | 2.5 | 4 | 1 |
| 硫酸亚铁(g/L) | 0.08 | 0.03 | 0.06 |
| 硫酸镁(g/L) | 0.6 | 1 | 1.5 |
| pH | 6.4 | 5.6 | 7.2 |
其中，笋头是由笋头残渣置粉碎机粉碎获得，由于其单独粉碎，粉碎不完全，故加入水与之混合后再粉碎，有助于笋头粉碎完全，实施例1-3的笋头：水配比＝1:3(重量比)；实施例1-3的蝉拟青霉发酵培养基均在高压蒸汽灭菌锅中以121℃，高温灭菌20min灭菌。
采用本发明实施例1-3的蝉拟青霉发酵培养基制备麦角甾醇，其制备步骤如下：
(1)菌种活化：将保藏的蝉拟青霉菌种接入已灭菌的装有50mL活化培养基的250mL三角瓶中，置于恒温振荡培养箱25℃、150r/min摇床培养36小时，使微生物活性恢复的同时恢复其优良的生产性能；其中，活化培养基组分为葡萄糖10-30g/L、蛋白胨5-15g/L、磷酸氢二钾0.5-2.0g/L、硫酸镁0.1-1.0g/L，pH调至5-8，且活化培养基经过在高压蒸汽灭菌锅中以115℃，高温灭菌30min。
(2)蝉拟青霉液体发酵：当活化培养基培养到36h后，将已活化好菌种接入已灭菌的装有50mL蝉拟青霉发酵培养基的250mL三角瓶中，接种量为0.5mL/瓶，置于25℃、120r/min摇床培养7d。
(3)发酵液的提取：将步骤(2)的发酵产物置于离心机中，4500rpm高速离心20min，去上清液；按1:4(体积比)加入有机溶剂乙醇，室温下超声波浸提1h后，4000rpm离心20min，取上清液放入50mL的Eppendorf管中，重复提取一次；收集两次上清液，用旋转蒸发仪浓缩至膏状。
(4)麦角甾醇浸膏的液-液萃取：用8倍体积(mL/g)环己烷溶解适量浸膏，加入等体积的环己烷/乙醚混合试剂萃取，上层清液用旋转蒸发仪浓缩；其中混合试剂组分配比为环己烷：乙醚(体积比为1:3)。
(5)麦角甾醇的分离纯化结晶：将步骤(4)最终获得的浓缩物置于快速纯化制备液相色谱进行处理，采用硅H(300目)，用乙醚：正己烷＝1:5(体积比)梯度洗脱到乙醚：正己烷＝1:3(体积比)，中压层析系统工业一体化设计，实时监测，根据不同色谱峰接收不同物质,不仅大大缩短了分离麦角甾醇时间,又保障其分离效果，最后用乙醚：正己烷＝1:1(体积比)结晶，重结晶，得到白色固体粉末，即麦角甾醇。
为了验证本发明实施例的蝉拟青霉发酵培养基制备麦角甾醇中，麦角甾醇为发酵产物，以实施例所用的笋头作为空白组，进行对比测试：
取等量的上述实施例1-3制备麦角甾醇过程中获得的发酵液，通过HPLC-PDA测定麦角甾醇的含量测定，并经LC/MS(麦角甾醇相对分子质量为396.65)进行确证所得到的产物为麦角甾醇；同样，将空白组的笋头粉碎水溶液通过HPLC-PDA测定笋头中的麦角甾醇含量，其测定结果如表2所示：
表2
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 空白组 | |
| 麦角甾醇含量(g/L) | 0.04757 | 0.03680 | 0.04257 | 0.00033 |
根据表2结果可知，实施例1-3的麦角甾醇含量均高于空白组，《猴头菌麦角甾醇高产菌株选育及深层培养条件的优化》文献报道其获得的麦角甾醇含量为0.006225g/L，实施例1-3同样高于该文献记载的麦角甾醇含量。其中实施例1的麦角甾醇含量为0.04757，其含量比笋头本底高140倍，比上述文献麦角甾醇的含量高7倍。从而证明了本发明的蝉拟青霉发酵培养基适用于蝉拟青霉制备麦角甾醇工艺中。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (1)
1.一种蝉拟青霉发酵培养基，其特征在于，所述蝉拟青霉发酵培养基由笋头100-500g/L、磷酸二氢钾1-4g/L、硫酸亚铁0.03-0.08g/L和硫酸镁0.6-1.5g/L组成，且pH为5-8；
所述蝉拟青霉发酵培养中的笋头由笋头残渣与水混合后粉碎制得。
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