CN109456383B - 一种20(R)-人参皂苷Rh1的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种20(R)‑人参皂苷Rh1的制备方法。本发明将灵芝菌种与三七进行发酵，利用灵芝复杂的酶系促使三七药材中原有的化学成分经过结构修饰或活性位点的改变，转化为20(R)‑人参皂苷Rh1，转化率高，可用于20(R)‑人参皂苷Rh1的大量制备。为后期药物开发和药理研究提供原料，对开发具有自主知识产权的新药具有了十分重要的研究意义和社会效益。同时，该方法具有反应快、专属性强、副反应少等优点，且反应条件温和可控，环保无污染。

Description

一种20(R)-人参皂苷Rh1的制备方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种20(R)-人参皂苷Rh1的制备方法。
背景技术
三七(Panax notoginseng)为五加科植物三七的干燥根及根茎，别名山漆、金不换、田漆、田三七、田七、参三七、血参、人参三七、滇三七等，主产于我国云南、广西等地。本品性温，味甘、微苦，无毒。三七生品能消肿止痛，散瘀止血，熟品能补血活血。三七用于治疗疾病已有悠久的历史，为我国常用的传统名贵药材之一。数千年来为中华民族的繁荣作出了巨大的贡献，并深受世界人民的关注与重视。
三七中的皂苷成分作为其主要药效物质成分，发挥着至关重要的作用，近年来已有学者采用不同的提取方法从三七不同部位中分离获得一些较为常见的活性皂苷类成分，如20人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb3、三七皂苷R1等。但三七中存在的皂苷种类及含量有限，其中20(R)-人参皂苷Rh1含量仅为0.0976％。而20(R)-人参皂苷Rh1是一种稀有皂苷，有研究表明具有更加显著的药理活性，药用及研究价值极高，但目前无法实现大量制备，因而无法为后期更深入的研究提供原料，严重影响了后期20(R)-人参皂苷Rh1药物开发和药理研究工作。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于提供一种20(R)--人参皂苷Rh1的制备方法。本发明提供的制备方法可明显提高20(R)-人参皂苷Rh1含量，实现20(R)-人参皂苷Rh1的大量制备。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种20(R)-人参皂苷Rh1的制备方法，包括：
步骤1：将灵芝菌种接入药用培养基培养，获得灵芝菌种子液；
步骤2：取三七药材烘干、粉碎、过筛，制得三七固体培养基；
步骤3：将步骤1所述灵芝菌种子液接种到步骤2所述的三七固体培养基中进行发酵，获得含20(R)-人参皂苷Rh1的发酵产物；
步骤4：所述发酵产物经提取、分离纯化，获得20(R)-人参皂苷Rh1。
本发明提供一种20(R)-人参皂苷Rh1的制备方法，包括：
步骤1：将灵芝菌种接入药用培养基培养，获得灵芝菌种子液；
步骤2：取三七药材烘干、粉碎、过筛，制得三七固体培养基；
步骤3：将步骤1所述灵芝菌种子液接种到步骤2所述的三七固体培养基中进行发酵，获得含20(R)-人参皂苷Rh1的发酵产物；
步骤4：所述发酵产物经提取、分离纯化，获得20(R)-人参皂苷Rh1；
所述提取为：将发酵产物以乙醇加热回流提取，提取液经石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇顺序萃取，收集乙酸乙酯层。
灵芝(Ganoderma lucidum)是一种珍贵的药用真菌，属于担子菌门，灵芝科，灵芝属。自古以来，灵芝被人们视为“仙草”，具有滋补强壮，扶正固本作用，长期以来被看作珍贵的中药材。
本发明所述制备方法以灵芝菌种为原料制备灵芝菌种子液，以三七为原料制备三七固体培养基，然后将灵芝菌种子液接种到三七固体培养基中进行发酵，利用灵芝复杂的酶系促使三七药材中原有的化学成分经过结构修饰或活性位点的改变，转化为20(R)-人参皂苷Rh1，经检测发酵产物中20(R)-人参皂苷Rh1含量达0.8013～0.9201％，相比三七药材中20(R)-人参皂苷Rh1含量(0.0976％)，提高近10倍，可用于20(R)-人参皂苷Rh1的大量制备。
本发明提供的制备方法可将三七中存在的原人参三醇型皂苷转化为20(R)-人参皂苷Rh1，转化机理见图1。
本发明所述制备方法步骤1利用药用培养基对灵芝菌种进行培养，其中，所述药用培养基配方为：葡萄糖1.9～2.1％，KH2PO40.09～0.11％，MgSO40.09～0.11％，蛋白胨0.45～0.55％，酵母粉0.18～0.22％，维生素B10.09～0.11％，余量为水。在一些具体实施例中，药用培养基配方为：葡萄糖2％，KH2PO40.1％，MgSO40.1％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.2％，维生素B10.1％，余量为水。
药用培养基按照上述配方进行配制，分装于250ml广口瓶中，包扎后置于压力蒸汽灭菌器中，于121℃灭菌30分钟。培养基冷却后在无菌操作台中接种灵芝菌种，接种的灵芝菌种为斜面菌种。
其中，对灵芝菌种进行培养的方式为恒温振荡培养，所述恒温振荡培养为：在转速为150r/min，温度为27～29℃，湿度为39～41％的条件下避光培养5～7天。在一些具体实施例中，恒温振荡培养为：在转速为150r/min，温度为28℃，湿度为40％的条件下避光培养5～7天。
本发明所述制备方法步骤2将三七药材于温度为70℃～75℃条件下烘干，粉碎，取过10目筛不过60目筛的粉末，制成三七固体培养基。所述三七药材经烘干、粉碎、过筛后还包括加入CaCO3水溶液和灭菌步骤。具体为：将三七药材于温度为70℃～75℃条件下烘干，粉碎，获得目数为10～60目的三七粉末，加水混合均匀后置于三角瓶内，121℃高压蒸汽灭菌两次，每次30分钟，制成三七固体培养基。其中，三七固体培养基的含水量为50～70％，优选为60％。
本发明所述制备方法步骤3将步骤1所述灵芝菌种子液接种到步骤2所述的三七固体培养基中进行发酵，利用灵芝复杂的酶系促使三七药材中原有的化学成分经过结构修饰或活性位点的改变，转化为20(R)-人参皂苷Rh1。其中，以ml/g计，灵芝菌种子液与三七固体培养基的体积质量比为0.5～1:1～1.5，发酵培养的温度为24～28℃。在一些具体实施例中，灵芝菌种子液与三七固体培养基的体积质量比为1:1，发酵培养的温度为28℃。在一些实施方案中，发酵培养的时间为35～45h。
本发明所述制备方法步骤4将发酵产物经提取、分离纯化，获得20(R)-人参皂苷Rh1。其中，所述提取为采用70％～75％乙醇加热回流提取，提取液脱溶后加水混悬，所得混悬液经石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇顺序萃取，收集乙酸乙酯层；所述70％～75％乙醇的质量为发酵产物质量的7～8倍，提取次数为3～4次。
其中，石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇的体积为所述混悬液体积的1～1.2倍。
具体地，分离纯化包括：取所述乙酸乙酯层浓缩，浓缩液以甲醇溶解后经硅胶色谱柱，二氯甲烷-甲醇洗脱，所得洗脱液依次经硅胶GF254薄层检识、开放式ODS色谱柱、甲醇洗脱、硅胶GF254薄层检识，以75％甲醇为流动相，经半制备液相获得20(R)-人参皂苷Rh1。
其中，所述浓缩至80℃-85℃相对密度为1.21-1.25。
所述硅胶色谱柱的硅胶粒度为100-200目，色谱柱口径8厘米，柱高75厘米。所述二氯甲烷-甲醇洗脱为梯度洗脱，二氯甲烷与甲醇体积比依次为：100:0、100:2、100:5、100:10、100:20、100:50。
所述开放式ODS柱以40-60umODS为填料，色谱柱口径为3厘米，柱高40厘米。
半制备液相为以75％甲醇为流动相，流速1.2ml/min，检测波长为203nm，收集保留时间为41min的组分。
本发明将灵芝菌种与三七进行发酵，利用灵芝复杂的酶系促使三七药材中原有的化学成分经过结构修饰或活性位点的改变，转化为20(R)-人参皂苷Rh1，转化率高，可用于20(R)-人参皂苷Rh1的大量制备，经检测，发酵产物的产率为65％～75％，其中发酵产物中20(R)-人参皂苷Rh1含量达0.8013～0.9201％，相比三七药材中20(R)-人参皂苷Rh1含量(0.0976％)，提高近10倍，为后期药物开发和药理研究提供原料，对开发具有自主知识产权的新药具有了十分重要的研究意义和社会效益。同时，该方法具有反应快、专属性强、副反应少等优点，且反应条件温和可控，环保无污染。
附图说明
图1示三七中原人参三醇型皂苷转化为20(R)-人参皂苷Rh1的转化机理图；
图2示20(R)-人参皂苷Rh1半制备高效液相色谱图。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种20(R)-人参皂苷Rh1的制备方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1本发明制备方法
(1)灵芝菌种子液的制备：培养基配方为葡萄糖2％，KH2PO40.1％，MgSO40.1％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.2％，维生素B10.1％，余量水，pH自然。以上物质置于大烧杯中，加入适量的水制成种子液，待种子液冷却后，分装于250ml广口瓶中，包扎后置于压力蒸汽灭菌器中，于121℃灭菌30分钟。待冷却后，在无菌操作台中用直径为1mm的接种环接入保存好的灵芝斜面3-4块菌种。将接有灵芝菌种的液体培养基放入恒温振荡培养箱中，以150r/min，28℃，湿度40％的条件下避光培养5-7天，待种子液澄清并有大量大小均匀星芒状菌球出现，获得灵芝菌种子液。
(2)三七固体培养基的制备：取三七药材，烘干，粉碎，收集过10目筛不过60目筛的粉末，加入水混合均匀后置于三角瓶内，121℃高压蒸汽灭菌两次，每次30分钟，制得含水量为50％～70％的三七固体培养基。
(3)发酵：在无菌操作台中将灵芝菌种子液接种到三七固体培养基中于恒温培养箱中避光发酵培养，至菌丝布满容器底部为止，将其取出并干燥，得到发酵产物。其中，以ml/g计，灵芝菌种子液与三七固体培养基的体积质量比为0.5～1:1～1.5，发酵培养的温度为24～28℃。
(4)提取：将步骤(3)发酵产物用8倍质量的70％乙醇加热回流提取3次，每次2.5小时，回收溶剂并挥干至无醇味后用适量水混悬，再经1.2倍体积石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇顺序萃取，收集乙酸乙酯层。
(5)分离纯化：取所述乙酸乙酯层浓缩，得到相对密度1.21-1.25(80℃-85℃)浸膏，取浸膏加入甲醇溶解，利用硅胶色谱柱梯度洗脱(二氯甲烷与甲醇体积比依次为：100:0、100:2、100:5、100:10、100:20、100:50)，洗脱液经硅胶GF254薄层检识得到富含20(R)-人参皂苷Rh1部分。再将此部分通过开放式ODS柱用不同浓度甲醇进行梯度洗脱(纯水→30％甲醇→50％甲醇→70％甲醇→纯甲醇)，洗脱液经硅胶GF254薄层检识再次得到富含20(R)-人参皂苷Rh1部分，将此部分通过半制备液相，以75％甲醇为流动相，流速1.2ml/min，检测波长为203nm，收集保留时间为41min的组分，得到化合物(半制备液相图谱见图2，保留时间为41.023所示的峰)。
该化合物为白色粉末，易溶于甲醇，10％的硫酸乙醇溶液显紫红色，Molish反应阳性，LiebeRmann-BuRchaRd反应阳性，推测其为三萜皂苷类化合物。
1H-NMR(CD3OD，500MHz)高场区给出8个甲基单峰信号，δH:0.95(3H，s，30-CH3)，1.00(3H，s，18-CH3)，1.01(3H，s，19-CH3)，1.10(3H，s，29-CH3)，1.11(3H，s，28-CH3)，1.33(3H，s，27-CH3)，1.62(3H，s，26-CH3)，1.67(3H，s，21-CH3)；3个连氧三级氢质子信号δH:3.26(2H，m，H-3，H-12)，4.09(1H，td，J＝10.0，5.0Hz，H-6)；13C-NMR(CD3OD，125MHz)谱图中给出36个碳信号，高场区给出8个甲基碳信号δC:17.3(C-18)，17.5(C-19)，22.5(C-21)，25.6(C-26)，17.4(C-27)，31.1(C-28)，15.8(C-29)，17.0(C-30)，连氧三级碳信号δC:78.8(C-3)，77.4(C-6)，71.4(C-12)；δC:61.5(C-5)为三醇型皂苷的特征信号，表明化合物同样为达玛烷三醇型三萜皂苷结构。
碳谱数据中给出一组葡萄糖的信号105.3(C-1')，75.2(C-2')，80.6(C-3')，71.6(C-4')，79.6(C-5')，62.6(C-6')，结合葡萄糖的端基质子信号4.35(1H，d，J＝5.0Hz，H-1')，及端基质子的耦合常数确定化合物连有一个β-D葡萄糖单元。将化合物的碳谱数据与文献中20(R)-人参皂苷Rh1的碳谱数据比较，几乎一致，综上分析，鉴定化合物为20(R)-人参皂苷Rh1，分子式为C36H62O9。
Figure BDA0001891860060000061
表1本实施例提取得到的化合物的1H-NMR(C5D5N,500MHz)与13C-NMR(C5D5N,150MHz)数据
Figure BDA0001891860060000071
实施例2不同菌种与三七发酵产物中20(R)-人参皂苷Rh1含量比较
利用十三种药用真菌(牛肝菌、木耳、香菇1500、平菇、杏鲍菇、大青菇、白灵菇、树鸡、树舌、云芝、灵芝、灰树花、白树花)分别接种到三七固体培养基中进行发酵，其他条件相同，参照实施例1步骤(1)～(3)，进行，其中，三七固体培养基含水量为60％，灵芝菌种子液V(ml)︰三七固体培养基m(g)＝1:1，发酵培养的温度为26℃。对固态培养基进行观察，结果见表2，检测发酵产物中Rh1含量，结果见表3。
表2不同菌种与三七发酵情况
菌种 第一周 第二周 第三周
牛肝菌 未发出 未发出 未发出
木耳 少量棕色瘤状菌球 菌球少量增多 无明显变化
香菇1500 少量白色菌毛 菌毛缓慢生长 无明显变化
平菇 少量白色菌毛 5cm直径菌丛 菌毛密布
杏鲍菇 长满菌球且球上针状菌丝 菌丛缓慢生长 菌毛基本布满
大青菇 稀松白色菌毛 少量白色菌毛 无明显变化
白灵菇 少量白色菌丝 菌毛缓慢生长 菌毛密布
树鸡 未发出 未发出 未发出
树舌 长出菌毛但未扩散 无明显变化 无明显变化
云芝 稀松白色菌毛 菌毛增多 菌毛密布有向瓶底扩散趋势
灵芝 密布白色菌毛 菌毛增多 菌毛密布并向瓶底扩散
灰树花 未发出 未发出 未发出
白树花 未发出 未发出 未发出
表3不同菌种与三七发酵产物中20(R)-人参皂苷Rh1含量％
20(R)-人参皂苷Rh<sub>1</sub>含量％
三七药材 0.0976
平菇与三七发酵产物 0.0910
杏鲍菇与三七发酵产物 0.1211
白灵菇与三七发酵产物 0.0876
云芝与三七发酵产物 0.1231
灵芝与三七发酵产物 0.8481
实施例3最佳工艺优化试验
本实施例采用正交试验对步骤(2)～(3)工艺条件进行优化，选取A三七固体培养基含水量(％)、B灵芝菌种子液V(ml)︰三七固体培养基m(g)、C发酵培养温度(℃)为影响因素，因素水平表见表4，正交试验结果见表5。
表4因素水平表
Figure BDA0001891860060000091
表5正交实验及结果
Figure BDA0001891860060000092
表6综合评分方差分析表
方差来源 偏差平方和 自由度 F值 显著性
A 0.024 2 53.669
B 0.078 2 170.196 *
C 0.004 2 5.270
D 0.002 2 8.927
F1-0.10(2,2)＝9.00F1-0.05(2,2)＝19.00F1-0.01(2.2)＝99.00
由以上结果可知，三个影响因素的主次顺序为：B灵芝菌种子液V(ml)︰三七固体培养基m(g)>A三七固体培养基含水量％>C发酵培养温度(℃)，其中，B因素：灵芝菌种子液V(ml)︰三七固体培养基m(g)对产物Rh1含量有显著影响。综合考虑，确定最佳发酵条件为：A2B2C3，即三七固体培养基含水量60％，灵芝菌种子液V(ml)︰三七固体培养基m(g)＝1:1，发酵培养温度28℃。
实施例4最佳工艺条件下制备20(R)-人参皂苷Rh1
(1)灵芝菌种子液的制备：培养基配方为葡萄糖2％，KH2PO4 0.1％，MgSO4 0.1％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.2％，维生素B1 0.1％，余量水，pH自然。以上物质置于大烧杯中，加入适量的水制成种子液，待种子液冷却后，分装于250ml广口瓶中，包扎后置于压力蒸汽灭菌器中，于121℃灭菌30分钟。待冷却后，在无菌操作台中用直径为1mm接种环接入保存好的灵芝斜面3-4块菌种，将接有灵芝菌种的液体培养基放入恒温振荡培养箱中，以150r/min，28℃，湿度40％的条件下避光培养5-7天，待种子液澄清并有大量大小均匀星芒状菌球出现，获得灵芝菌种子液。
(2)三七固体培养基的制备：取三七药材，烘干，粉碎，粉末过10目筛不过60目筛，加入CaCO3水溶液，混合均匀后置于三角瓶内，121℃高压蒸汽灭菌两次，每次30分钟，制得含水量为60％的三七固体培养基；其中，CaCO3的质量为三七药材质量的1.5％。
(3)发酵：在无菌操作台中将100ml灵芝菌种子液接种到100g三七固体培养基中于恒温培养箱中避光发酵培养，至菌丝布满容器底部为止，将其取出并干燥，得到发酵产物。其中，以ml/g计，灵芝菌种子液与三七固体培养基的体积质量比为1:1，发酵培养的温度为28℃。
(4)提取：将步骤(3)所得发酵产物用8倍量70％乙醇加热回流提取3次，每次2.5小时，回收溶剂并挥干至无醇味后用适量水混悬，再经1.2倍体积石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇顺序萃取，收集乙酸乙酯层。
本发明对各萃取层中Rh1含量进行了检测，结果见表7。
表7不同萃取溶剂中20(R)-人参皂苷Rh1含量(％)
样品 20(R)-人参皂苷Rh<sub>1</sub>含量％
石油醚层 0.0031
乙酸乙酯层 0.8828
水饱和正丁醇层 0.0106
(5)分离纯化：取所述乙酸乙酯层浓缩，得到相对密度1.21-1.25(80℃-85℃)浸膏，取浸膏加入甲醇溶解，利用硅胶色谱柱不同浓度二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，洗脱液经硅胶GF254薄层检识得到富含20(R)-人参皂苷Rh1部分。再将此部分通过开放式ODS柱用不同浓度甲醇进行梯度洗脱(纯水→30％甲醇→50％甲醇→70％甲醇→纯甲醇)，洗脱液经硅胶GF254薄层检识再次得到富含20(R)-人参皂苷Rh1部分，将此部分通过半制备液相，以75％甲醇为流动相，流速1.2ml/min，检测波长为203nm，收集保留时间为41min的组分，获得20(R)-人参皂苷Rh1单体化合物。
经检测，步骤(3)所得发酵产物中20(R)-人参皂苷Rh1含量为0.9201％。
实施例5 20(R)-人参皂苷Rh1的制备
(1)灵芝菌种子液的制备：培养基配方为葡萄糖2.1％，KH2PO40.09％，MgSO40.11％，蛋白胨0.45％，酵母粉0.22％，维生素B1 0.11％，余量水，pH自然。以上物质置于大烧杯中，加入适量的水制成种子液，待种子液冷却后，分装于250ml广口瓶中，包扎后置于压力蒸汽灭菌器中，于121℃灭菌30分钟。待冷却后，在无菌操作台中用直径为1mm接种环接入保存好的灵芝斜面3-4块菌种，将接有灵芝菌种的液体培养基放入恒温振荡培养箱中，以150r/min，28℃，湿度40％的条件下避光培养5-7天，待种子液澄清并有大量大小均匀星芒状菌球出现，获得灵芝菌种子液。
(2)三七固体培养基的制备：取三七药材，烘干，粉碎，粉末过10目筛不过60目筛，加入CaCO3水溶液，混合均匀后置于三角瓶内，121℃高压蒸汽灭菌两次，每次30分钟，制得含水量为70％的三七固体培养基；其中，CaCO3的质量为三七药材质量的1.5％。
(3)发酵：在无菌操作台中将100ml灵芝菌种子液接种到150g三七固体培养基中于恒温培养箱中避光发酵培养，至菌丝布满容器底部为止，将其取出并干燥，得到发酵产物。其中，以ml/g计，灵芝菌种子液与三七固体培养基的体积质量比为1:1.5，发酵培养的温度为26℃。
(4)提取：将步骤(3)所得发酵产物用8倍量70％乙醇加热回流提取3次，每次2.5小时，回收溶剂并挥干至无醇味后用适量水混悬，再经1.2倍体积石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇顺序萃取，收集乙酸乙酯层。
(5)分离纯化：取所述乙酸乙酯层浓缩，得到相对密度1.21-1.25(80℃-85℃)浸膏，取浸膏加入甲醇溶解，利用硅胶色谱柱不同浓度二氯甲烷-甲醇梯度梯度洗脱(二氯甲烷-甲醇体积比为：100:0、100:2、100:5、100:10、100:20、100:50)，洗脱液经硅胶GF254薄层检识得到富含20(R)-人参皂苷Rh1部分。再将此部分通过开放式ODS柱用不同浓度甲醇进行梯度洗脱(纯水→30％甲醇→50％甲醇→70％甲醇→纯甲醇)，洗脱液经硅胶GF254薄层检识再次得到富含20(R)-人参皂苷Rh1部分，将此部分通过半制备液相，以75％甲醇为流动相，流速1.2ml/min，检测波长为203nm，收集保留时间为41min的组分，获得20(R)-人参皂苷Rh1单体化合物。
经检测，步骤(3)发酵产物中20(R)-人参皂苷Rh1含量为0.8013％。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (7)

1.一种20（R）-人参皂苷Rh1的制备方法，其特征在于，包括：
步骤1：将灵芝菌种接入药用培养基培养，获得灵芝菌种子液；
步骤2：取三七药材烘干、粉碎、过筛，制得三七固体培养基；
步骤3：将步骤1所述灵芝菌种子液接种到步骤2所述的三七固体培养基中进行发酵，获得含20（R）-人参皂苷Rh1的发酵产物；
步骤4：所述发酵产物经提取、分离纯化，获得20（R）-人参皂苷Rh1；
所述提取为：将发酵产物以乙醇加热回流提取，提取液经石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇顺序萃取，收集乙酸乙酯层；
步骤4中所述提取为采用70%~75%乙醇加热回流提取，提取液脱溶后加水混悬，所得混悬液经石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇顺序萃取，收集乙酸乙酯层；所述70%~75%乙醇的质量为发酵产物质量的7~8倍，提取次数为3~4次；
步骤4中所述分离纯化包括：取所述乙酸乙酯层浓缩，浓缩液以甲醇溶解后经硅胶色谱柱，二氯甲烷-甲醇溶液洗脱，所得洗脱液依次经硅胶GF254薄层检识、开放式ODS色谱柱、甲醇洗脱、硅胶GF254薄层检识，获得含有20（R）-人参皂苷Rh1的部分，然后以75%甲醇为流动相，经半制备液相获得20（R）-人参皂苷Rh1；
所述二氯甲烷-甲醇洗脱为梯度洗脱，二氯甲烷与甲醇体积比依次为：100:0、100:2、100:5、100:10、100:20、100:50;
所述甲醇洗脱为：纯水→30%甲醇→50%甲醇→70%甲醇→纯甲醇。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤1中所述药用培养基配方为：葡萄糖1.9~2.1%，KH2PO4 0.09~0.11%，MgSO4 0.09~0.11%，蛋白胨0.45~0.55%，酵母粉0.18~0.22%，维生素B10.09~0.11%，余量为水。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤2中所述三七固体培养基的含水量为50~70%。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤2中所述烘干的温度为70℃~75℃，所述过筛为过10目筛不过60目筛。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，以ml/g计，步骤3中所述灵芝菌种子液与所述三七固体培养基的体积质量比为0.5~1:1~1.5。
6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤3中所述发酵的温度为24~28℃。
7.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述硅胶粒度为100-200目，色谱柱口径8厘米，柱高75厘米；所述开放式ODS柱以40-60umODS为填料，色谱柱口径为3厘米，柱高40厘米；所述半制备液相为以75%甲醇为流动相，流速1.2ml/min，检测波长为203nm，收集保留时间为41min的组分。
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