CN113403237B

CN113403237B - 一种强化型微生物发酵制备硫酸庆大霉素及其应用方法

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Publication number: CN113403237B
Application number: CN202110851818.4A
Authority: CN
Inventors: 王云松; 史京波; 张梵; 杨翠霞; 袁帅妮
Original assignee: Qingdao Awyeth Biopharmaceutical Co ltd
Current assignee: Qingdao Awyeth Biopharmaceutical Co ltd
Priority date: 2021-07-27
Filing date: 2021-07-27
Publication date: 2021-12-28
Anticipated expiration: 2041-07-27
Also published as: CN113403237A

Abstract

本发明要求保护一种强化型微生物发酵制备硫酸庆大霉素及其应用方法，该强化型微生物工程菌为一株绛红色小单孢菌(Micromonospora purpurea)C2 1591菌株。本发明筛选得到的定向高产庆大霉素C2的工程菌可以定向高产庆大霉素C2，庆大霉素C2的组份比由原来的15％左右提高到现在的85％以上，实现了优化后的配方的发酵效价最高为1184U/mL，比原配方的效价提高了42％。经与出发菌株相比，庆大霉素C2产量提高了3倍，而且基本不含有其他的同型异构体或者杂质，节省了大量的成本，满足产业化要求。

Description

一种强化型微生物发酵制备硫酸庆大霉素及其应用方法

技术领域

本发明属于抗生素制药领域，涉及一种强化型微生物发酵制备硫酸庆大霉素及其应用方法，具体地说，本发明涉及一株定向高产庆大霉素C2的工程菌及其应用，应用于抗生素制造。

背景技术

庆大霉素最早是由Weinstein等于1963年发现的,它是小单孢菌产生的多组分的氨基糖苷类抗生素,包括C1,C2,C1a,C2a和C2b等组分。庆大霉素主要组分C1,C2和C1a在临床上被广泛使用,其中抗菌活性最高的是C1a,它是合成依替米星的前体,其次是C2b,又称之为沙加霉素。此类抗生素能够与细菌核糖体30S亚基上的16SrRNA结合,引起遗传密码的误读,从而阻断细菌蛋白质的合成,所以主要用于治疗细菌感染,尤其是革兰阴性菌引起的感染。然而,在实际使用过程中由于有很高的肾毒性,所以它们在临床上的应用受到限制。

为了更好的进行庆大霉素生物发酵的研究，目前已经测序并且公布了3株菌中的庆大霉素生物合成基因簇，其中一株是绛红色小单孢(GenBank Accession No.AJ575934)，另外两株是棘孢小单孢(GenBank Accession No.AY524043和AJ628149)。将这3个已报道的庆大霉素基因簇进行比对，发现其生物合成核心基因的大小和顺序完全一致，组织结构完全相同，表明该基因簇是通过水平基因转移而存在于不同菌株当中。庆大霉素属于4，6-二取代的氨基糖苷类抗生素，其核心结构是2-脱氧链霉胺。生物合成途径最早是由Testa和Tilley在研究一株产巴龙霉胺的绛红色小单孢突变株时提出来的，发现庆大霉素C1不能转化为其它物质，然而C2能够转化为C1，同时C1a能够转化为C2b。庆大霉素的生物合成途径大致可以分为两个主要的阶段：①庆大霉素前体A2的合成；②庆大霉素C族化合物的合成。在第②步过程中，其中一条预测的路径是庆大霉素A2在C-甲基转移酶的作用下形成G418，随后同样在脱氢酶和氨基转移酶的作用下形成JI-20B，接着在脱水酶的作用下，C-3'位和C-4'位发生还原脱氧反应形成了庆大霉素C2，其中一部分C2的C-6'位发生N-甲基化形成庆大霉素C1，另一部分C2通过差向异构化形成C2a,其中C2a与C2是一对差向异构体。因此在微生物发酵生产中这两种物质一直相伴而生，并不能将其进行有效的区分。

上述两种差向异构体药物化学结构相近，理化性质相似，从中分离单组份庆大霉素C2非常困难，导致庆大霉素C2供不应求，且生产成本居高不下，层析分离周期长，收率低，料耗大，污染严重，提取精制工艺复杂，而且产品质量不稳定，与庆大霉素C2结构相似的副产物庆大霉素C2a随时出现干扰，给产品质量控制造成了极大的不确定性，严重影响了药品的稳定性、安全性和有效性，是迫切需要解决的科学难题。

发明内容

本发明的目的在于提供一株定向高产庆大霉素C2的工程菌，该工程菌为经常压室温等离子诱变技术筛选获得的一株绛红色小单孢菌(Micromonospora purpurea)C2 1591菌株，已于2021年6月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏(其简称 CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.59450。

进一步的，本发明提供一种筛选定向高产庆大霉素C2的工程菌的常压室温等离子诱变操作步骤，所述步骤为：(1)菌种的培养；(2)常压室温等离子诱变；(3)高通量深孔板筛选；(4)复筛；(5)菌株遗传稳定性验证；(6)制种保藏。

进一步的，本发明提供一种利用筛选获得的定向高产庆大霉素C2的工程菌发酵制备庆大霉素C2的方法，所述方法为：将筛选获得的菌株C2 1591复苏后涂布于斜面平板，斜面30-37℃培养12～15d待生长成熟以后，将新鲜孢子接于种子培养基，置于30-37℃、摇床转速为 230r/min，培养12-48h左右；按5.0％的接种量转接到发酵培养基，置于30-37℃、摇床转速 230r/min，培养120-196h。

其中，斜面培养基：可溶性淀粉2.0％，L-天冬酰胺0.05％，K₂HPO₄ 0.05％，MgSO₄0.05％，NaCl 0.05％，KNO₃ 0.1％，CaCO₃ 0.1％，FeSO₄ 0.001％，琼脂2.0％，pH7.2～7.4。

种子培养基：可溶性淀粉1.5％，葡萄糖0.5％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.5％，(NH₄)₂SO₄ 0.05％， K₂HPO₄·3H₂O 0.05％，NaCl 0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，CaCO₃ 0.1％，pH7.2。

发酵培养基：可溶性淀粉2％，蔗糖0.5％，干酪素1.0％，玉米浆0.5％， MgSO₄·7H₂O 0.04％，FeSO₄·7H₂O 0.005％,CuSO₄·5H₂O 0.005％,CoCl₂·6H₂O 0.0005％，CaCO₃0.3％，pH7.2。

进一步的，本发明提供一种庆大霉素C2的分离纯化方法，所述方法为：将C2 1591菌株的发酵液3000-5000rpm离心5-15分钟，获得上清，加入H₂SO₄调整pH至2.0左右酸化液，再加入NaOH中和至pH6.8左右，得中和液，用732NH⁴⁺(Na⁺)型树脂搅拌下静态吸附5～6hr进行离子交换，饱和树脂离心分离以除去异物，对饱和树脂装柱7％HCl及NH₄Cl、去离子水洗至无Cl^-，再用0.5N氨水解吸后解吸液711-OH型脱色，对脱色液薄膜浓缩，所得浓缩液，继续用活性碳脱色过滤，吸附型大孔树脂分离、浓缩，采用溶媒梯度解析，获得主峰，经精制后即可得到组份含量≥95％的精制品。

本发明筛选得到的定向高产庆大霉素C2的工程菌可以定向高产庆大霉素C2，庆大霉素 C2的组份比由原来的15％左右提高到现在的85％以上，而且通过Plackett-Burman设计实现了优化后的配方的发酵效价最高为1184U/mL，比原配方的效价提高了42％。而且可以缩短了整个生产周期；提高了庆大霉素C2的纯度，降低了生产成本，极大地提高了庆大霉素C2 的生产能力。经与出发菌株相比，庆大霉素C2产量提高了3倍，而且基本不含有其他的同型异构体或者杂质，可以直接进行下游应用，不需要再进行复杂的生物转化和提纯，节省了大量的成本，满足产业化要求。

附图说明

图1突变前后庆大霉素C组分的色谱图，其中图A为出发菌株SD2020，图B为突变菌株 C2 1591菌株，其中，1：西索米星；2：庆大霉素C1a；3：庆大霉素C2；4：小诺霉素；5：庆大霉素C2a；6：庆大霉素C1。

实施例

实施例1常压室温等离子诱变技术筛选

1)以申请人菌种库中的庆大霉素生产菌株绛红小单孢菌SD2018为出发菌种，用灭菌后的1ml吸管吸取0.1ml接种于灭菌后的斜面培养基上进行斜面孢子培养，培养温度为35～37℃，静置，培养时间为4天，得到SD2020菌种的斜面孢子；

2)取1.0cm²步骤1)制备的斜面孢子加入灭菌的含5ml质量浓度0.9％的生理盐水的三角瓶中，震荡20min，得到孢子悬液；

3)取500μl步骤2)制备的孢子悬液，加入250μl质量浓度20％的氯化锂水溶液，250μl质量浓度0.9％的生理盐水，震荡混匀5min，得到含质量浓度5％氯化锂的孢子悬液；震荡混匀后用移液枪吸取20μl含质量浓度5％氯化锂的孢子悬液置于ARTP(常压室温等离子体)诱变育种仪的样品器中进行诱变，诱变时间设置为90秒，得到诱变后的孢子悬液；诱变条件为：工作功率120W，气源为Ar，气流量10L/min。诱变后的菌悬液适当稀释并涂布于分离平板，于30℃恒温培养15d左右，用于致死率计算和菌种筛选。

4)将分离到的单菌落经常规发酵的发酵液离心取上清液，加质量浓度20％硫酸溶液酸化至pH1.5～2.0，混匀静置20min，定性滤纸(中速)过滤，取10μl滤液进高效液相色谱仪检测发酵单位及组份，色谱条件：色谱柱：GRACE Apollo C18(4.6mm×250mm,5μm)；流动相： 0.2mol/L三氟乙酸溶液-甲醇(96:4,V/V)，流速0.6mL/min，柱温35℃，进样量25μL；ELSD 漂移管温度110℃，载气(氮气)流量2.5L/min，增益1。发现一株突变株的产物在C2峰有极特殊的增益，而在其他的C组分峰有明显的抑制(图1)，将其命名为C2 1591，并对其进行实验室保藏和生物保藏。

实施例2庆大霉素C2的高效发酵

Plackett-Burman设计法是20世纪中后期发展起来的一种近饱和的二水平试验设计方法。它基于非完全平衡块原理，能用最少试验次数估计出因素的主效应，从众多的考察因素中快速有效地筛选出最重要的几个因素以供进一步研究。该方法数据处理简单，与目前常用的部分因子试验和随机平衡试验相比，该法筛选重要因素最为高效和准确，因而在微生物培养条件优化中得到广泛应用，取得了较好的结果。实施例中拟通过DesignExpert7.0的Plackett-Burman实验设计对庆大霉素C2的发酵培养基配方中的诸多因素进行考察和评价，并从中筛选出若干个重要的影响因子，再通过正交实验进一步优化发酵培养基。

实施例中所使用的试剂、原料等都是本领域的常规选择，是已经成熟的、市售的产品，在此不再赘述其来源和具体纯度等信息。

将筛选获得的菌株C2 1591复苏后涂布于斜面平板，斜面37℃培养12d待生长成熟以后，将新鲜孢子接于种子培养基，置于37℃、摇床转速为230r/min，培养48h左右；按5.0％的接种量转接到发酵培养基，置于37℃、摇床转速230r/min，培养120h。

发酵培养基包括：可溶性淀粉，蔗糖，干酪素，玉米浆，MgSO₄·7H₂O， FeSO₄·7H₂O,CuSO₄·5H₂O,CoCl₂·6H₂O，CaCO₃。

根据发酵培养基中的9种成分筛选出显著影响因素，表中预留1个空项F(Dummy)作误差项，每个变量分别确定高、低两个水平(低水平即原培养基配方)，响应值为庆大霉素C2的效价；筛选出显著影响因素后利用正交实验对其进行进一步的优化(见表1)。

表1 Plackett-Burman实验设计因素水平表

编号	因素	高水平	低水平
				A	可溶性淀粉	6	2
B	蔗糖	2	0.5
				C	干酪素	4	1
D	玉米浆	1	0.5
				E	MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	0.1	0.04
F	FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	0.01	0.005
				G	CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O	0.01	0.005
H	CoCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O	0.001	0.0005
				I	CaCO<sub>3</sub>	1	0.3
J	空项	1	-1

根据表1的因素水平设置，选用了Plackett-Burman的PB设计表如表2，采用11组实验对初始发酵培养基的9个影响因子进行了效应评价，对庆大霉素C效价数据进行回归分析，得到各影响因子的偏回归系数及其显著性。之后根据Plackett-Burman筛选实验结果，采用四因素三水平正交表安排正交实验。

表2 Plackett-Burman实验安排和结果

将Plackett-Burman显著影响因素筛选实验与正交实验相结合对发酵培养基进行优化，最终确定最适发酵培养基为：可溶性淀粉3％，蔗糖0.7％，干酪素1.5％，玉米浆1％，MgSO₄·7H₂O 0.04％，FeSO₄·7H₂O 0.007％,CuSO₄·5H₂O 0.007％,CoCl₂·6H₂O 0.0005％，CaCO₃ 0.5％，pH7.2。将上述培养基配方与原发酵配方进行比较，优化后的配方的发酵效价最高为1184U/mL，比原配方的效价提高了42％，说明优化后的培养基配方能较明显的提高发酵效价。

实施例3庆大霉素C2的精制

利用上述发酵方法进行扩大培养，将扩大发酵后的发酵液加10％自来水稀释后，加入盐酸或者硫酸，酸化到pH1.0-3.0，充分搅拌1-4小时；然后用氢氧化钠溶液回调至pH5.0-7.0，投入732NH⁴⁺树脂静态吸附6-8小时。树脂投放量按5万u/mL左右计算。收集吸附饱和树脂，用自来水漂洗干净(无漂浮菌丝体为止)。饱和树脂装柱，用两倍饱和树脂体积的0.5M HCl 溶液酸洗饱和树脂，再用无离子水洗涤至中性，然后改用0.01％氨水进行碱洗，当流出液达 pH 9.0以上时，串联到等体积的711树脂柱上，改用4％的氨水进行洗脱，氨水用量为饱和树脂体积的8-10倍，洗脱时间控制在8-10小时，收集洗脱液。

洗脱液经薄膜浓缩到约25-30万u/mL，用浓硫酸调至pH5.5-6.0.活性炭脱色到透光度达92％以上，在搅拌下，缓慢向浓缩液中滴加入95％以上乙醇，进行结晶，静置过夜，收集过滤产物，85％乙醇溶液淋洗即得湿成品。湿成品经真空干燥(真空度500mmHg以上，温度600C，干燥6小时)，即得硫酸庆大霉素C2成品，收率85％以上。

对上述产品进行薄层色谱分析(TLC)(按照中华人民共和国药典(2010版)，展开剂系统配制如下，氯仿：甲醇：氨水(25％)＝1:1:1，配制15ml混合溶液，静置2h，取下层溶液作为展开剂)、高效液相色谱分析(HPLC)(参照中华人民共和国药典2005版。用碳十八硅胶为填充剂；以水-冰醋酸-甲醇(25:5:70)配制的庚烷磺酸钠溶液(0.02mol/L)为流动相；检测波长为330nm.取样品适量，加入适量的邻苯二甲醛和异丙醇，混匀后置于60℃水浴中加热15min，冷却，过滤，量取10μl注入高效液相色谱仪)、质谱分析(MS)(安捷伦6520四级杆飞行时间串联质谱仪，参数设置：ESI(+),100～800m/z；流速，8.0L·min-1；温度，350℃；喷雾器压力，2.07×105Pa；Vcap3500V；碰撞电压，135V)，综合TLC、HPLC和MS分析结果表明，工程菌C2 1591集中积累庆大霉素C2，微量C1a、C1和小诺霉素，而检测不到其他的代谢产物。经与出发菌株相比，出发菌株中庆大霉素C2的产量为298μg/mL，而C2 1591菌株中庆大霉素C2产量达到894μg/mL，比原始菌株庆大霉素C2产量提高了3倍，而且基本不含有其他的同型异构体或者杂质，可以直接进行下游应用，不需要再进行复杂的生物转化和提纯，节省了大量的成本，满足产业化要求。

Claims

1.一株庆大霉素C2的工程菌，该工程菌为经常压室温等离子诱变技术筛选获得的一株绛红色小单孢菌(Micromonospora purpurea)C2 1591菌株，保藏编号为CGMCC No.59450，已于2021年6月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏。

2.一种利用庆大霉素C2的工程菌发酵制备庆大霉素C2的方法，所述方法为：将权利要求1所述绛红色小单孢菌(Micromonospora purpurea)C2 1591菌株复苏后涂布于斜面平板，斜面30-37℃培养12～15d待生长成熟以后，将新鲜孢子接于种子培养基，置于30-37℃、摇床转速为230r/min，培养12-48h；按5.0％的接种量转接到发酵培养基，置于30-37℃、摇床转速230r/min，培养120-196h。

3.如权利要求2所述的一种利用筛选获得的庆大霉素C2的工程菌发酵制备庆大霉素C2的方法，其中斜面平板培养基：可溶性淀粉2.0％，L-天冬酰胺0.05％，K₂HPO₄ 0.05％，MgSO₄0.05％，NaCl 0.05％，KNO₃ 0.1％，CaCO₃ 0.1％，FeSO₄ 0.001％，琼脂2.0％，pH7.2～7.4；

种子培养基：可溶性淀粉1.5％，葡萄糖0.5％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.5％，(NH₄)₂SO₄0.05％，K₂HPO₄·3H₂O 0.05％，NaCl 0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，CaCO₃ 0.1％，pH7.2；

发酵培养基：发酵培养基：可溶性淀粉2-6％，蔗糖0.5-2％，干酪素1.0-4％，玉米浆0.5-1％，MgSO₄·7H₂O 0.04-0.1％，FeSO₄·7H₂O 0.005-0.01％,CuSO₄·5H₂O 0.005-0.01％,CoCl₂·6H₂O 0.0005-0.001％，CaCO₃ 0.3-1％，pH7.2。

4.如权利要求3所述一种利用筛选获得的庆大霉素C2的工程菌发酵制备庆大霉素C2的方法，其中可溶性淀粉3％，蔗糖0.7％，干酪素1.5％，玉米浆1％，MgSO₄·7H₂O 0.04％，FeSO₄·7H₂O 0.007％,CuSO₄·5H₂O 0.007％,CoCl₂·6H₂O 0.0005％，CaCO₃ 0.5％，pH7.2。

5.如权利要求2所述的一种利用筛选获得的庆大霉素C2的工程菌发酵制备庆大霉素C2的方法，其中还包括发酵结束后庆大霉素C2的分离纯化步骤，所述步骤为：将C2 1591菌株发酵后的发酵培养基3000-5000rpm离心5-15分钟，获得上清，加入H₂SO₄调整pH至2.0左右酸化液，再加入NaOH中和至pH6.8左右，得中和液，用732NH⁴⁺(Na⁺)型树脂搅拌下静态吸附5～6小时进行离子交换，饱和树脂离心分离以除去异物，对饱和树脂装柱7％HCl及NH₄Cl、去离子水洗至无Cl^-，再用0.5N氨水解吸后解吸液711-OH型脱色，对脱色液薄膜浓缩，所得浓缩液，继续用活性碳脱色过滤，吸附型大孔树脂分离、浓缩，采用溶媒梯度解析，获得主峰，经精制后即可得到组份含量≥95％的精制品。

6.如权利要求1所述的一株庆大霉素C2的工程菌在合成庆大霉素C2或其硫酸盐中的应用。