CN117946934A

CN117946934A - 刺糖多孢菌菌株及其突变株

Info

Publication number: CN117946934A
Application number: CN202410176444.4A
Authority: CN
Inventors: 安子恒
Original assignee: Wuhan Hesheng Technology Co ltd
Current assignee: Wuhan Hesheng Technology Co ltd
Priority date: 2024-02-08
Filing date: 2024-02-08
Publication date: 2024-04-30

Abstract

本公开涉及分子遗传学领域，具体涉及一种高产多杀菌素的刺糖多孢菌菌株HS002，其保藏编号为CCTCC NO.M 20232700。本公开得到了高产的刺糖多孢菌菌株HS002，其产量达到7.49g/L，远高于现有技术中公开的多杀菌素高产菌株摇瓶产量。在菌株HS002的基础上通过复合诱变，获得了能够高效生产多杀菌素J和L的刺糖多孢菌突变株HS003，其突变氨基酸位点为A118V、I145V、Y261*、D269A、D270A、G271A、S272A、H273A、Y347*，通过定点突变获得了能够高效生产多杀菌素J和L的刺糖多孢菌突变株YC501‑1和YC501‑3‑9，其突变氨基酸位点分别为A118V、Y261*、D269A、D270A、G271A、S272A、H273A、Y347*。

Description

刺糖多孢菌菌株及其突变株

技术领域

本公开涉及分子遗传学领域，具体地，本公开涉及新的刺糖多孢菌菌株及其突变株。

背景技术

乙基多杀菌素(spinetoram)是经多杀菌素化学半合成得到的新一代大环内酯类抗生素，而多杀菌素(刺糖菌素或多杀霉素)是由刺糖多孢菌(Saccharopolysopraspinosa)经过有氧发酵产生，其具有独特的杀虫作用机制(针对昆虫的烟碱型乙酰胆碱受体以及γ-氨基丁酸受体)，杀虫谱广泛，同时在施用过程中不会对哺乳动物产生影响，被用于粮食储存及高附加值的作物的病虫害防治。由于多杀菌素同时具有化学农药的快速性以及生物农药的安全性，于1999年，获得了“美国总统绿色化学挑战奖”。2008年，陶氏公司推出了二代多杀菌素产品——乙基多杀菌素(spinetoram)，通过昆虫活性实验验证，乙基多杀菌素相较于多杀菌素对于多数昆虫的半数致死浓度(LC₅₀)降低3-16倍，兼具高活性与低残留特征，同年，乙基多杀菌素也获得了“美国总统绿色化学挑战奖”。

目前，乙基多杀菌素有两种合成策略，一是由多杀菌素A水解得到大环内酯，后经过选择性保护和脱保护，依次与3-乙氧基-2,4-二甲氧基鼠李糖和福乐糖胺反应，进而经过选择性还原得到，二是由多杀菌素J和L通过加乙基和氢化两步得到，后者化学合成步骤更为简单，而获得多杀菌素J和L的高效生产菌株便成为关键因素，这将显著提升此策略的成本优势。

因此，亟需开发多杀菌素J和L的高效生产菌株，来满足乙基多杀菌素的应用需求。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本公开的目的在于提供一种新的刺糖多孢菌菌株及其突变株。

在一方面，本公开提供了一种高产多杀菌素的刺糖多孢菌菌株HS002，其保藏编号为CCTCC NO.M 20232700。

在另一方面，本公开提供了一种前述的刺糖多孢菌株HS002在合成多杀菌素中的用途。

在另一方面，本公开提供了一种将产生多杀菌素的刺糖多孢菌菌株转化成产生乙基多杀菌素前体的突变菌株的方法，其包括定点突变所述刺糖多孢菌菌株中spnK基因的步骤，其中，所述定点突变的氨基酸位点选自下述中的一种或多种：A118V、Y261*、D269A、D270A、G271A、S272A、H273A和/或Y347*。

在另一方面，本公开提供了一种利用前述的方法制备得到的能够产生乙基多杀菌素前体的刺糖多孢菌突变株，其中，所述乙基多杀菌素前体包括多杀菌素J和多杀菌素L。

另一方面，本公开提供了一种前述方法、前述刺糖多孢菌突变株在合成乙基多杀菌素中的应用。

本公开的有益技术效果：

本公开得到了高产的刺糖多孢菌菌株HS002，其产量达到7.49g/L，相较于现有技术中公开的多杀菌素高产菌株摇瓶产量。在菌株HS002的基础上通过复合诱变，获得了能够高效生产多杀菌素J和L的刺糖多孢菌突变株HS003，通过定点突变获得了能够高效生产多杀菌素J和L的刺糖多孢菌突变株YC501-1和YC501-3-9，其突变氨基酸位点分别为A118V、Y261*、D269A、D270A、G271A、S272A、H273A、Y347*。

附图说明

图1示出了多杀菌素标准品与刺糖多孢菌HS002发酵液中多杀菌素A和D产物的一级精确分子量质谱图。

图2示出了刺糖多孢菌HS002和HS003发酵液的HPLC-UV检测色谱图。

图3示出了刺糖多孢菌HS002和HS003中2_277基因突变碱基比对结果。

图4示出了刺糖多孢菌HS002和HS003中2_277基因突变氨基酸比对结果。

具体实施方式

I.定义

在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、化学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本公开，下面提供相关术语的定义和解释。

本公开的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。在本公开中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

如本文所用的术语“或其组合”是指在所述术语之前列出的术语的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”旨在包括以下中的至少一者：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，并且如果顺序在特定上下文中重要的话，则还包括BA、CA、CB、ACB、CBA、BCA、BAC或CAB。继续此例子，明确包括含有一个或多个项或术语的重复的组合，诸如BB、AAA、AAB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。熟练技术人员将理解，除非从上下文中另外明显看出，否则通常对任何组合中的项或术语的数量没有限制。

在本文的描述中，涉及到“一些实施例”、“一些实施方式”或“一些实施方案”，其描述了所有可能实施例的子集，但是可以理解，“一些实施例”可以是所有可能实施例的相同子集或不同子集，并且可以在不冲突的情况下相互结合。

在本文的描述中，刺糖多孢菌能产生9种紧密相关的化合物混合物，通称为“多杀菌素”。在该混合物中，多杀菌素A和D是主要组分并且对关键昆虫目标具有最高活性。多杀菌素J和L(多杀菌素混合物中的两种次要组分)是乙基多杀菌素(第二代多杀菌素杀虫剂)的前体。本公开实施方案涉及诱变导致2_277基因突变将产生多杀菌素的菌株直接转化成产生乙基多杀菌素前体的菌株。

多杀菌素是Dow AgroSciences(Indianapolis,Ind.)生产的杀虫剂，其主要包含约85％多杀菌素A和约15％多杀菌素D。多杀菌素A和D是刺糖多孢菌发酵产生的天然产物，如美国专利US5362634中所披露。多杀菌素是几种可从Dow AgroSciences商购的杀虫制剂的活性成分，所述杀虫制剂包括TRACER^TM、SUCCESS^TM、SPINTOR^TM和CONSERVE^TM昆虫控制产品。例如，TRACER产品由约44％～约48％的多杀菌素(w/v)或者约4磅多杀菌素/加仑构成。呈颗粒和液体制剂形式的多杀菌素化合物对于控制蜘蛛、线虫和昆虫(具体为鳞翅目、缨翅目(Thysanopetera)和双翅目物种)具有确定的效用。

乙基多杀菌素是5,6-二氢-3'-乙氧基多杀菌素J(主要组分)和3'-乙氧基多杀菌素L的混合物，其由Dow AgroSciences生产。该混合物可通过下面方法制备：乙氧基化多杀菌素J和多杀菌素L的混合物，然后氢化。多杀菌素J及其3'-乙氧基衍生物的5,6双键的氢化比多杀菌素L及其3'-乙氧基衍生物的5,6双键的氢化容易得多，这是由于在多杀菌素L及其3'-乙氧基衍生物中C-5的甲基的空间位阻。参见美国专利US6001981。

如本文所用，“诱变”是指用人为的措施诱导微生物遗传基因产生变异，然后在产生变异的微生物中按照需要选育出新的优良菌株。

如本文所用，“定点突变”是一种特异性地取代、插入或缺失DNA序列中任何一个特定碱基的技术。该方法可用于常规克隆(引入或去除特定位点)、调控元件作图(突变报告构建体中的启动子/增强子)、蛋白质功能分析(进行丙氨酸扫描诱变或关键残基的靶向取代))，以及SNP分析(在质粒环境中引入自然发生的SNP)等。

如本文所用，“点突变”是指DNA序列中的单个碱基的置换，包括转换和颠换两种形式。前者是指一种嘌呤核苷酸置换为另一种嘌呤核苷酸或嘧啶核苷酸被另一种嘧啶核苷酸所置换(比如A＞G，C＞T)；后者是指嘌呤与嘧啶核苷酸之间的互换(比如A＞C，C＞G)。

II.具体实施方式

在一方面，本公开提供了一种高产多杀菌素的刺糖多孢菌株HS002，其保藏编号为CCTCC NO.M 20232700。

在一些实施方案中，所述多杀菌素包括多杀菌素A和多杀菌素D。

在另一方面，本公开提供了一种将产生多杀菌素的刺糖多孢菌菌株转化成产生乙基多杀菌素前体的突变菌株的方法，其包括定点突变刺糖多孢菌菌株中spnK基因的步骤，其中，所述定点突变的氨基酸位点选自下述中的一种或多种：A118V、Y261*、D269A、D270A、G271A、S272A、H273A和/或Y347*。

在一些实施方案中，所述定点突变的氨基酸位点为A118V、I145V、Y261*、D269A、D270A、G271A、S272A、H273A和Y347*。

在一些实施方案中，所述乙基多杀菌素前体包括多杀菌素J和多杀菌素L。

在一些实施方案中，本公开提供了一种将前述的刺糖多孢菌株HS002转化成产生乙基多杀菌素前体的突变菌株的方法，其包括定点突变刺糖多孢菌菌株中spnK基因的步骤，其中，所述定点突变的氨基酸位点选自下述中的一种或多种：A118V、Y261*、D269A、D270A、G271A、S272A、H273A和/或Y347*。

在一些实施方案中，所述定点突变的碱基对位点选自下述位点中的一种或多种：279、353、433、663、783、806、809、810、812、813、814、815、816、817、818、819和1041。

在一些实施方案中，所述定点突变的碱基位点为279。在一些实施方案中，所述定点突变的碱基位点为353。在一些实施方案中，所述定点突变的碱基位点为433。在一些实施方案中，所述定点突变的碱基位点为663。在一些实施方案中，所述定点突变的碱基位点为783。在一些实施方案中，所述定点突变的碱基位点为806。在一些实施方案中，所述定点突变的碱基位点为809。在一些实施方案中，所述定点突变的碱基位点为810。在一些实施方案中，所述定点突变的碱基位点为812。在一些实施方案中，所述定点突变的碱基位点为813。在一些实施方案中，所述定点突变的碱基位点为814。在一些实施方案中，所述定点突变的碱基位点为815。在一些实施方案中，所述定点突变的碱基位点为816。在一些实施方案中，所述定点突变的碱基位点为817。在一些实施方案中，所述定点突变的碱基位点为818。在一些实施方案中，所述定点突变的碱基位点为819。在一些实施方案中，所述定点突变的碱基位点为1041。

在一些实施方案中，所述定点突变的碱基位点为279、353、433、663、783、806、809、810、812、813、814、815、816、817、818、819和1041。

在一些实施方案中，所述定点突变的碱基位点为353、433、783、806、809、810、812、813、814、815、816、817、818、819和1041。

在一些实施方案中，所述突变株为HS003，其保藏编号为CCTCC NO.M 20232701。

在一些实施方案中，所述突变株选自下述中的任一种：

(1)所述突变株为YC501-1，其定点突变的碱基位点为353，氨基酸变化为A118V；或

(2)所述突变株为YC501-2，其定点突变的碱基位点为433，氨基酸变化为I145V；或

(3)所述突变株为YC501-3，其定点突变的碱基位点为783，氨基酸变化为Y261*；或

(4)所述突变株为YC501-4，其定点突变的碱基位点为806，氨基酸变化为D269A；或

(5)所述突变株为YC501-5，其定点突变的碱基位点为809和810，氨基酸变化为D270A；或

(6)所述突变株为YC501-6，其定点突变的碱基位点为812和813，氨基酸变化为G271A；或

(7)所述突变株为YC501-7，其定点突变的碱基位点为814、815和816，氨基酸变化为S272A；或

(8)所述突变株为YC501-8，其定点突变的碱基位点为817、818和819，氨基酸变化为H273A；或

(9)所述突变株为YC501-9，其定点突变的碱基位点为1041，氨基酸变化为Y347*。

在一些实施方案中，所述突变株为YC501-1，定点突变的碱基位点为353，氨基酸变化为A118V。在一些实施方案中，所述突变株为YC501-2，其定点突变的碱基位点为433，氨基酸变化为I145V。在一些实施方案中，所述突变株为YC501-3，定点突变的碱基位点为783，氨基酸变化为Y261*。在一些实施方案中，所述突变株为YC501-4，定点突变的碱基位点为806，氨基酸变化为D269A。在一些实施方案中，所述突变株为YC501-5，定点突变的碱基位点为809和810，氨基酸变化为D270A。在一些实施方案中，所述突变株为YC501-6，定点突变的碱基位点为812和813，氨基酸变化为G271A。在一些实施方案中，所述突变株为YC501-7，定点突变的碱基位点为814、815和816，氨基酸变化为S272A。在一些实施方案中，所述突变株为YC501-8，定点突变的碱基位点为817、818和819，氨基酸变化为H273A。在一些实施方案中，所述突变株为YC501-9，定点突变的碱基位点为1041，氨基酸变化为Y347*。

在另一方面，本公开提供了一种前述方法、前述刺糖多孢菌突变株在合成乙基多杀菌素中的应用。

下面，参考具体实施例更详细地描述本公开，然而，实施例仅用于说明目的，对于本公开不具有限制作用。下述实施例中所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1：多杀菌素菌株的分离与产物鉴定

(1)菌落分离

发明人于2022年3月在多个地区采集获得土壤样品，使用稀释平板培养方法进行单菌落的分离以获得放线菌。具体操作如下：称取1g的土壤，用10mL无菌水悬浮，之后加入10颗玻璃珠，震荡使其均匀分散，按照10倍的梯度进行逐级稀释，每个浓度的稀释液涂布10块含有50μg/mL甲氧苄啶(购自生工生物工程有限公司)和50μg/mL制霉菌素(购自Sigma-Aldrich)的分离培养基(1L蒸馏水中加入5g葡萄糖、3g酵母提取物、10g酶解酪蛋白(N-Zamine type A)、20g琼脂，pH 7.0)，其中，加入甲氧苄啶抑制革兰氏阴性菌生长、制霉菌素抑制真菌生长。最终选择有孢子产生的放线菌单菌落，共获得60株放线菌。

(2)刺糖多孢菌菌株的鉴定

使用16s rRNA扩增通用引物1(SEQ ID NO:1)和引物2(SEQ ID NO:2)对获得的60株放线菌进行16s rRNA序列PCR扩增，扩增片段经一代测序获得碱基信息，通过blast比对发现，其中一株放线菌的16s rRNA序列与Genbank Accession LC149867.1的序列相似性达到99.7％，其碱基序列如SEQ ID NO:3所示。因此，此菌株属于刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)，将其命名为刺糖多孢菌HS002(Saccharopolysporaspinosa HS002)。

(3)菌株发酵

种子培养基：每100mL蒸馏水中加入1g的葡萄糖、1g的酵母提取物、0.2g的N-Zamine typeA、2.5g的棉籽饼粉、2g的玉米淀粉、0.2g的七水硫酸镁、0.1g的硫酸铵，混合充分溶解后用NaOH调节pH为7.0；种子培养每瓶分装25mL种子培养基；121℃灭菌30min。

发酵培养基：每100mL蒸馏水中加入8g的葡萄糖、2g的棉籽饼粉、1g的蛋白粉、0.5g的酵母粉、0.4g的柠檬酸三钠、0.2g的磷酸氢二钾、0.2g的硫酸铵、5g的菜籽油；混合充分溶解后用NaOH调节pH为7.0，发酵培养每瓶分装25mL发酵培养基，每瓶加入0.075g碳酸钙；121℃灭菌30min。

发酵方法：将刺糖多孢菌HS002菌株涂布于ABB13平板(大豆蛋白胨0.5％，可溶性淀粉0.5％，碳酸钙0.3％，MOPS 0.21％，硫酸亚铁0.0012％，维生素B1 0.001％，琼脂2.0％)，30度静置培养9天，取1×1cm培养获得的菌落，接种于种子培养基，250rpm、28℃、60％的湿度下培养96h后，按1％的转接量转接至新的种子培养基，250rpm、28℃、60％的湿度下培养60h后，按5％的转接量转接到发酵培养基中，250rpm、28℃、湿度60％的条件下培养12天。

(4)菌株发酵产物确定

发酵液处理：发酵结束后的发酵液加入4倍体积的无水乙醇，震荡1h后，4000rpm离心15min，取上清液使用0.22μm滤膜过滤后进行产物检测。

高分辨质谱检测方法：液相系统：Thermo Scientific Ultimate 3000RSLC(HPG)色谱柱：Thermo Scientific Hypersil GOLD aQ(2.1*150mm,3μm)；流动相：甲醇：乙腈：水(含5mM的乙酸铵)＝45:45:10；流速0.2mL/min；等度洗脱15min；质谱检测范围：100-1200；正离子模式；扫描方式：Fullmsddms2。

多杀菌素标准品(购自Laboratory of the Government Chemist，英国)和刺糖多孢菌HS002发酵液的多杀菌素A(m/z＝732.4681[M+H]+)和D(m/z＝746.4837[M+H]+)产物经高分辨质谱检测的一级精确分子量质谱图如图1所示，通过图中发酵液样品与标准品的一级精确分子量比对证明：刺糖多孢菌HS002菌株可产生多杀菌素。

(5)菌株发酵产物定量分析

对处理后的发酵液使用HPLC-UV检测产物，检测方法：色谱柱：ChromCore PolarC18250×4.6mm 5μm；流速：1mL/min；进样量：10μL；柱温：25℃；检测波长：UV＝250nm；流动相：乙腈：甲醇：含有0.05％乙酸铵的水溶液＝45:45:10；等度洗脱20min。使用多杀菌素标准品制作标准曲线，计算得到刺糖多孢菌HS002菌株的多杀菌素产量为7.49g/L，此产量远高于文献或专利已报道的经过诱变等方法获得的多杀菌素高产菌株摇瓶产量(参见现有技术CN113444659B，其中多杀菌素的摇瓶产量为4g/L)，具备明显的应用价值。

刺糖多孢菌HS002菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏号：CCTCC NO.M 20232700。

实施例2：多杀菌素J和L合成菌株的获得

为了能获得高产多杀菌素J和L的菌株，发明人通过复合诱变刺糖多孢菌HS002菌株。

(1)诱变获得多杀菌素J和L合成菌株

第一轮诱变采用紫外诱变：将刺糖多孢菌HS002菌株的平板菌落用生理盐水制备成孢子悬液，脱脂棉过滤后调整孢子浓度为10^-6～10^-7个/mL，取单孢子悬液10mL于无菌的直径9cm平皿内，在暗室距15W紫外灯20cm处照射30s，避光冰浴1h，然后按照10倍递减进行逐级稀释涂板得到单菌落，刮取全部单菌落涂布于一个ABB13平板进行菌落复苏，复苏三代。第二轮诱变采用常压室温等离子体诱变：复苏后的平板菌落用0.8％的葡萄糖溶液制成孢子悬液，18mL孢子悬液转移至含有10颗玻璃珠的100mL三角瓶中，将其放置在30℃，120rpm/min的摇床上预萌发8h，萌发后的孢子涂布在无菌的载玻片上，使用常压室温等离子体诱变育种仪，功率120W，气量10SLM，处理时间60s的条件下进行样品处理后，将其转移至含有1mL无菌水的2mL离心管中，形成新的悬液，将其涂布到ABB13平板进行菌落复苏，复苏三代。第三轮诱变采用甲基磺酸乙酯诱变：常压室温等离子体诱变后的平板菌落用0.8％的葡萄糖溶液制成孢子悬液，18mL孢子悬液转移至含有10颗玻璃珠的100mL三角瓶中，将其放置在30℃，120rpm/min的摇床上预萌发8h，取4.5mL浓度为100mg/mL的甲基磺酸乙酯母液与预萌发的孢子混匀，将混匀的液体置于30℃，120rpm/min的摇床上反应60s，反应结束后取1mL反应液12000rpm/min离心2min，弃去上清，再加入1mL硫代硫酸钠溶液，12000rpm/min离心2min使其彻底终止反应，随后洗涤沉淀物将菌体重悬后取100μL涂布到平板上进行单菌落分离。

将分离的单菌落挑取于新的ABB13培养基平板生长，待生长9d后，刮取50个菌落于1mL水中，取菌悬液混合涂板，于新的ABB13培养基平板生长，待生长9d后，划取1cm*1cm左右大小的菌块于种子培养基中，按照实施例1中方法进行发酵和检测，检测其中是否合成m/z＝718.4525[M+H]⁺的产物(即多杀菌素J)，若没有，按照相同方法进行新一轮复合诱变，将检测到的组对应的菌落按照5株为一组进行发酵，选择其中可检测到的组，再单个菌株进行发酵，最终经两轮复合诱变共筛选了约6000个单菌落后，获得了1株出现m/z＝718.4525[M+H]⁺产物的菌株，将其命名为刺糖多孢菌HS003。

按照实施例1中方法进行发酵和产物检测，刺糖多孢菌HS002和HS003发酵液的HPLC-UV检测色谱图如图2所示，由图2可知，HS003发酵液与HS002相比，多杀菌素A和D的峰消失，在6.4min和7.0min出现两个明显的峰，将HS003发酵液进行板框过滤、柱层析及半制备色谱获得两个峰的纯品，用于核磁共振(NMR)分析，H谱和C谱综合分析显示：6.4min峰为多杀菌素J，7.0min峰为多杀菌素L，使用提纯的92％纯度的多杀菌素J作为标准品，通过HPLC-UV定量，HS003菌株的多杀菌素J产量为6.82g/L。

HS003菌株不能产生多杀菌素A，而产生了多杀菌素J，表明HS003菌株的2_277基因可能发生了突变，不能发挥其甲基化修饰功能，其中，2_277基因即为spnk基因。使用引物7和引物8扩增HS002和HS003菌株的2_277基因片段，测序比对发现2_277基因上产生了多位点突变，2_277基因突变碱基比对结果如图3所示，2_277基因突变氨基酸比对结果如图4所示。2_277基因的碱基序列由图3可知，突变碱基位点为：碱基对279位g→a、353位c→t、433位a→g、663位c→t、783位c→a、806位a→c、809位a→c、810位t→g、812位g→c、813位c→a、814位a→g、815位g→c、816位c→g、817位c→g、818位a→c、819位c→a、1041位c→a；突变氨基酸位点为A118V、I145V、Y261*、D269A、D270A、G271A、S272A、H273A、Y347*。

刺糖多孢菌HS003菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏号：CCTCC NO.M 20232701。

(2)突变位点的功能验证

为验证HS003菌株2_277基因上发生的突变的功能，我们构建了对应的单位点突变菌株(279位、663位碱基的突变未引起氨基酸的变化，因此前述两个位点不在验证范围内)。

2.1质粒构建

使用PCR扩增引物引入固定的点突变，具体操作如下：以刺糖多孢菌HS002基因组为模板，以引物3(SEQ ID NO:4)和引物4(SEQ ID NO:5)为引物扩增得到左同源臂片段，以引物5(SEQ ID NO:6)和引物6(SEQ ID NO:7)为引物扩增得到右同源臂片段；以刺糖多孢菌HS002基因组为模板，使用引物7(SEQ ID NO:8)和引物9(SEQ ID NO:10)扩增得到2_277片段1，使用引物10(SEQ ID NO:11)和引物8(SEQ ID NO:9)扩增得到2_277片段2，使用引物7和引物8对2_277片段1和2进行OE-PCR扩增得到含有目标突变位点的完整的2_277片段-1；扩增得到的左右同源臂片段、2_277片段-1与经过EcoRV/HindIII酶切后的pOJ260载体使用多片段一步法快速克隆试剂盒(翊圣生物科技有限公司，中国)进行组装，后转化入DH10B感受态细胞中得到转化子，转化子提取质粒进行酶切和测序验证，验证正确质粒命名为pYC501-1。

以刺糖多孢菌HS002基因组为模板，使用引物7和引物11(SEQ ID NO:12)扩增得到2_277片段3，使用引物12(SEQ ID NO:13)和引物8扩增得到2_277片段4，使用引物7和引物8对2_277片段3和4进行OE-PCR扩增得到含有目标突变位点的完整的2_277片段-2；上述同样方法扩增得到左右同源臂片段，进行片段组装和验证，验证正确质粒命名为pYC501-2。同样方法构建pYC501-3～9，其中引物13(SEQ ID NO:14)和引物14(SEQ ID NO:15)用于pYC501-3的2_277片段扩增，引物15(SEQ ID NO:16)和引物16(SEQ ID NO:17)用于pYC501-4的2_277片段扩增，引物17(SEQ ID NO:18)和引物18(SEQ ID NO:19)用于pYC501-5的2_277片段扩增，引物19(SEQ ID NO:20)和引物20(SEQ ID NO:21)用于pYC501-6的2_277片段扩增，引物21(SEQ ID NO:22)和引物22(SEQ ID NO:23)用于pYC501-7的2_277片段扩增，引物23(SEQ ID NO:24)和引物24(SEQ ID NO:25)用于pYC501-8的2_277片段扩增，引物25(SEQ IDNO:26)和引物26(SEQ ID NO:27)用于pYC501-9的2_277片段扩增。

2.2突变株的获得

ABB13平板培养9d的刺糖多孢菌HS002转接至50mL TSB培养基(购自Oxide)中，28℃，220rpm震荡培养48h后转接至50mL TSB培养基中，28℃，220rpm震荡培养24h，取1.5mL菌液于2mL离心管中，7000rpm离心10min，收集菌体，重复清洗两次，后重悬于500μL TSB培养基中，作为受体菌；将构建的质粒钙转化至ET12567/pUZ8002中，挑取含有目的质粒的大肠杆菌单克隆于10mL含有50μg/mL安普霉素、50μg/mL卡那霉素、34μg/mL氯霉素的LB中，28℃220rpm过夜培养，后按1％的比例转接，培养至OD₆₀₀ 0.6-0.8，取菌液1mL于2mL离心管中，4000rpm离心5min，收集菌体，重复清洗两次，将菌体重悬于1500μL TSB培养基中，作为供体菌；将供体菌与受体菌以4:1(即400μL:100μL)比例混合，均匀涂布于含有10mM Mg²⁺的ABB13平板上，置于28℃培养箱中培养24h，使用25μg/mL安普霉素和50μg/mL甲氧苄啶覆盖平板，28℃继续培养，7d长出接合子。

接合子在含有25μg/mL安普霉素的ABB13平板上培养，后在未添加抗生素的ABB13平板上传代培养，长出的单菌落在含25μg/mL安普霉素和未添加抗生素的ABB13平板上影印以验证抗性，选择安普霉素抗性失去的菌株提取基因组，使用引物7和引物8扩增获得2_277片段，测序以验证序列的正确性。

2.3突变株发酵及产物检测

按照实施例2中的方法进行突变株发酵和产物检测、定量，其中，突变株及对应的突变位点信息、发酵产量标注在表1中。

表1

注：*表示原始密码子突变为终止密码子。

综上，本公开得到了高产的刺糖多孢菌株HS002，其产量达到7.49g/L，相较于现有技术中公开的多杀菌素高产菌株摇瓶产量。在菌株HS002的基础上通过紫外诱变，获得了能够高效生产多杀菌素J和L的刺糖多孢菌突变株HS003，其突变氨基酸位点为A118V、I145V、Y261*、D269A、D270A、G271A、S272A、H273A、Y347*，在菌株HS002的基础上通过定点突变，获得了能够高效生产多杀菌素J和L的刺糖多孢菌突变株YC501-1和YC501-3-9，其突变氨基酸位点分别为A118V、Y261*、D269A、D270A、G271A、S272A、H273A、Y347*。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本公开的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本公开构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本公开的保护范围。因此，本公开专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列信息

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Claims

1.一种高产多杀菌素的刺糖多孢菌菌株HS002，其保藏编号为CCTCC NO.M 20232700，所述多杀菌素包括多杀菌素A和多杀菌素D。

2.权利要求1所述的刺糖多孢菌菌株HS002在合成多杀菌素中的用途。

3.一种将产生多杀菌素的刺糖多孢菌菌株转化成产生乙基多杀菌素前体的突变菌株的方法，其包括定点突变刺糖多孢菌菌株中spnK基因的步骤，其中，所述定点突变的氨基酸位点选自下述中的一种或多种：A118V、Y261*、D269A、D270A、G271A、S272A、H273A和/或Y347*。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述乙基多杀菌素前体包括多杀菌素J和多杀菌素L。

5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述产生多杀菌素的刺糖多孢菌菌株为菌株HS002。

6.根据权利要求3-5任一项所述的方法，其中，所述定点突变的碱基对位点选自下述位点中的一种或多种：279、353、433、663、783、806、809、810、812、813、814、815、816、817、818、819和/或1041。

7.根据权利要求3-6任一项所述的方法制备得到的能够产生乙基多杀菌素前体的刺糖多孢菌突变株，其中，所述乙基多杀菌素前体包括多杀菌素J和多杀菌素L。

8.根据权利要求7所述的刺糖多孢菌突变株，其中，所述突变株为HS003，其保藏编号为CCTCC NO.M 20232701。

9.根据权利要求7所述的刺糖多孢菌突变株，其中，所述突变株选自下述中的任一种：

(2)所述突变株为YC501-3，其定点突变的碱基位点为783，氨基酸变化为Y261*；或

(3)所述突变株为YC501-4，其定点突变的碱基位点为806，氨基酸变化为D269A；或

(4)所述突变株为YC501-5，其定点突变的碱基位点为809和810，氨基酸变化为D270A；或

(5)所述突变株为YC501-6，其定点突变的碱基位点为812和813，氨基酸变化为G271A；或

(6)所述突变株为YC501-7，其定点突变的碱基位点为814、815和816，氨基酸变化为S272A；或

(7)所述突变株为YC501-8，其定点突变的碱基位点为817、818和819，氨基酸变化为H273A；或

(8)所述突变株为YC501-9，其定点突变的碱基位点为1041，氨基酸变化为Y347*。

10.权利要求3-6任一项所述的方法、权利要求7-9所述的刺糖多孢菌突变株在合成乙基多杀菌素中的用途。