CN110358718B - 主产庆大霉素C1a工程菌的构建及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明采用传统育种与分子育种相结合的技巧，首先敲除genK关键基因，阻断庆大霉素C1方向的代谢流，获得绛红色小单孢工程菌Gb1088，不再合成庆大霉素C1代谢途径的各组分C1，C2，C2a和G418；然后构建genL基因敲除绛红色小单孢工程菌Gb1098。该菌株不合成庆大霉素C2b，也不合成庆大霉素C1代谢流的C1，C2，C2a和G418组分，专一性地合成庆大霉素C1a。绛红色小单孢工程菌Gb1098新物种，其发酵单位达到1098单位/mL，组分单一，提取精制方便，不涉及层析分离，大大方便了产业化生产庆大霉素C1a的要求，解决了产业化中国际上还未解决的关键技术难题，满足产业化要求。

Description

主产庆大霉素C1a工程菌的构建及其应用

技术领域

本发明属生物制药领域，涉及氨基糖苷类抗生素产业化关键技术的发明，具体涉及主产庆大霉素C1a工程菌的构建及其应用。

背景技术

庆大霉素属多组分抗感染药品，各个组分生理活性不同，疗效也不同，因此，药物学家一直期盼并强调获得单组份药品，应用于临床；但由于氨糖结构相似，分离纯化极其困难；因此需要解决获得单组份的产业化新物种；不过，到目前为止，要获得单组份庆大霉素产业化菌株，仍然是国际性难题。本发明采用传统育种与分子育种相结合的方法，在获得代谢流主导流向庆大霉素C1a的基础上，深入阐明与绛红糖胺C6’-N-甲基化相关的DNA序列，然后引入分子生物学操作技术，对涉及代谢流的基因组进行优化，阻断绛红糖胺C6’的N-甲基化，达到满足主产庆大霉素C1a（图1）的产业化新物种，解决了产业化中的关键技术问题，应用于生产。

氨基寡糖是重要的抗感染药物，具有重要的临床应用价值，独特的抗菌活性。经半个多世纪的长期临床应用与考验，获得了良好信誉，经久不衰，成为抗感染药物的主要类别之一。大多数氨基寡糖药物含有二到四个糖基，每个糖基被一到两个氨基修饰，整个氨基寡糖分子的氨基必须在4-6个之间。氨基太少，抗感染活性偏低；氨基太多，毒性太大，满足不了临床安全性的要求。如卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素、西索米星，G418，G52，链霉素，核糖霉素，新霉素和利维霉素等。

庆大霉素产生菌主要是小单孢菌，生物合成途径复杂，组分多种多样，有A，B，C等不同类别，研究最多的是C组分及其生物合成与基因组学。A，B组分以抗原虫为主，C组分以抗菌为主。不同组分有着不同的用途，堪称全身是宝。

庆大霉素C族复合物，包括：C1a、C1、C2、C2a和C2b等，各个组分差异仅仅在甲基化的多少，以及甲基化的位点。不同位点的甲基化，以及甲基化的多少，影响着其关键的生理活性，甚至副作用。庆大霉素C1a其抗菌活性比其它组分高，又是进一步开发半合成抗生素（依替米星）的母体，因此备受关注。

但是，由于糖类研究至今仍然是生命科学的难题。庆大霉素C族抗生素属氨糖类，因此，同样属国际性难题，产业化上遇到的问题，至今无法解决。尽管临床用药一直强调单组份，但唯有庆大霉素，至今各国药典仍然以庆大霉素C多组份复合物作为使用控制标准。这主要是由于庆大霉素C组分结构类似，分离纯化困难，要制备单组份庆大霉素C产品，满足不了最基本的药物经济学要求。

近来，随着生命科学及其生物药物技术的发展，庆大霉素生物合成基因的研究，取得了一定的进展。庆大霉素生物合成的研究，已经进入了与基因组关联的新阶段，部分阐明了庆大霉素生物合成中与甲基化有关的关键基因，但不是全部。构建庆大霉素C族单组份产业化新物种，仍然面临很多困难。

构建阻断庆大霉素C1代谢途径的工作已经完成。但是，构建主产单一组分庆大霉素C2、C2a、C1的新物种仍然没有见到报道。构建阻断庆大霉素C1代谢途径，获得导向庆大霉素C1a代谢途径的工作已经实现，但面临着庆大霉素C1a与C2b，难以分离的产业化技术难题，以及庆大霉素C1a发酵单位达不到产业化要求的困境。

本发明采用以筛选庆大霉素C1a代谢途径为主的绛红色小单孢菌Gb1068作为基因组优化的策略，阐明了其远离庆大霉素生物合成基因簇，与绛红糖胺C6’-N-甲基化相关的DNA序列（见附件DNA序列4829bp），揭示了其独特的遗传特性（4829bp），最后引入分子生物学操作技术，阻断了其绛红糖胺C6’的N-甲基化，彻底阻止了庆大霉素C2b的合成，获得了满足产业化要求的、易于分离得到单一组分庆大霉素C1a的新物种（绛红色小单孢菌Gb1098），应用于产业化。

发明内容

本发明的目的在于采用传统育种方法，筛选代谢流以产庆大霉素C1a为主的绛红色小单孢菌突变株Gb1068，其遗传特性标记见附件1（特征DNA序列4829bp）；借助分子生物学技术，敲除庆大霉素生物合成基因簇上的genK基因，阻断庆大霉素C1代谢流的生物合成，得到绛红色小单孢菌变种Gb1088；最后，通过构建基因文库，利用生物信息学技术，阐明与绛红糖胺C6’-N-甲基化有关的功能基因序列（附件1的特征DNA序列4829bp），灭活其N-甲基化功能，最后筛选到绛红色小单孢工程菌变种Gb1098（Micromonospora purpurea variantGb1098）。其特征是主产庆大霉素C1a，不再合成庆大霉素C2b，也不再合成庆大霉素C1代谢途径的各组分，包括C1，C2，C2a和G418等等，提取精制方便，不涉及层析分离，大大方便了产业化生产庆大霉素C1a的要求，解决了产业化中的关键技术难题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

筛选一株主产庆大霉素C1a的绛红色小单孢菌(Micromonospora purpurea)Gb1068，敲除庆大霉素生物合成基因簇上的genK基因和 genL基因，构建得到专一性合成庆大霉素C1a的绛红色小单孢工程菌Gb1098；所述绛红色小单孢菌(Micromonospora purpurea) Gb1098已于2019年07月04日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保存，保藏编号为CGMCC No.18078。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为中国，北京，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

所述绛红色小单孢菌(Micromonospora purpurea) Gb1098构建方法如下：

（1）筛选代谢流以庆大霉素C1a为主的绛红色小单孢菌Gb1068；

（2）敲除genK基因，构建绛红色小单孢菌Gb1088；

（3）构建敲除genL基因的穿梭载体，导入Gb1088，通过抗性筛选接合子，获得同源重组单交换绛红色小单孢菌Gb10881；

（4）通过平板影印法，从单交换突变株Gb10881中，筛选得到同源重组双交换菌株Gb1098；

（5）菌株鉴定。

进一步地，将绛红色小单孢菌(Micromonospora purpurea) Gb1098应用于发酵生产庆大霉素C1a中。

本发明的优点在于：本发明菌株不合成庆大霉素C2b，也不合成庆大霉素C1代谢流的C1，C2，C2a和G418组分，专一性地合成庆大霉素C1a。绛红色小单孢工程菌Gb1098新物种，其发酵单位达到1098单位/mL，组分单一，提取精制方便，不涉及层析分离，大大方便了产业化生产庆大霉素C1a的要求，解决了产业化中国际上还未解决的关键技术难题，满足产业化要求。

附图说明

图1 庆大霉素C（gentamicin C1a）化学结构。

图2 特征DNA序列示意图（4829 bp）。

图3 敲除CD3-DNA序列（717 bp）示意图。

图4 重组质粒pKL1002示意图。

图5 工程菌Gb1098代谢产物的TLC检测结果，其中1：庆大霉素标准品；2，3：Gb1098代谢产物；4：Gb1088代谢产物。

图6 工程菌Gb1098代谢产物的质谱分析结果。

具体实施方式

实施例1

获取代谢流以庆大霉素C1a菌株的选育

以庆大霉素产生菌G1008为出发菌株，经传统方法筛选，分离单菌落，摇瓶发酵，发酵液点板，挥发性碘气显影，结合发酵单位生物效价检测，从2568个单菌落中筛选得到代谢流以庆大霉素C1a为主的绛红色小单孢菌变种，其中一株命名为绛红色小单孢菌Gb1068。

实施例2

构建绛红色小单孢菌变种Gb1068基因文库，筛选与绛红糖胺C6’-N-甲基化相关的DNA序列SEQ ID NO.1，。其特征DNA序列为4829bp，其中包括关键基因CD3（genL）。该遗传特征的DNA序列远离庆大霉素生物合成基因簇。

实施例3

参照参考文献【Wenrong Hong*. Lingbin Yan. Identification of gntK, agene required for the methylation of purpurosamine C-6′ in gentamicinbiosynthesis. J. Gen. Appl. Microbiol., 58, 349-356 (2012).】，敲除genK基因，获得阻断庆大霉素C1代谢流工程菌：绛红色小单孢菌Gb1088（简称Gb1088）。

实施例4

工程菌绛红色小单孢菌Gb1098的构建。

1，特征DNA序列的功能分析。利用生物信息学技术，对特征DNA序列进行分析，结果如图2所示。其中CD3（genL）与甲基化有关。

2，同源重组质粒pKL1002的构建。

根据特征DNA序列，设计三对引物（P1-P2，P3-P4，P5-P6），见表1。三对引物的位置见图3。

表1 引物

以pKC1139作为穿梭载体，安普霉素抗性基因aac（3）IV作为筛选标记，设计用于扩增CD3上下游同源交换臂的两对引物P1/P2（1961bp）和P3/P4（1568bp），构建同源重组质粒pKL1002（图4）。具体过程如下：

以特征DNA序列（附件1）为模板，用引物P1/P2和P3/P4依次扩增CD3的上游同源交换臂JB1（1961bp）和下游同源交换臂JB2（1568bp），PCR产物经电泳检测，与预测吻合。

PCR扩增产物经电泳检测后，用回收试剂盒回收目标条带JB1和JB2，于37℃条件下，用Xba I和EcoR I对回收得到的JB1片段进行双酶切；用Xba I和HindIII对回收的JB2片段进行双酶切。酶切样品经电泳检测，回收目的条带。

质粒pKC1139经Xba I和EcoR I双酶切后回收6446bp的片段，并与回收得到的JB1片段以1:4比例混合，16℃过夜酶连。酶连反应后，转化大肠杆菌Top 10感受态细胞，在含有Apr的LB固体培养基上过夜培养，挑取克隆子接种于LB液体培养基中富集培养，提取其质粒并酶切验证，得到与pKC1139载体相连的重组质粒，命名为pKCJB1。

质粒pKCJB1经Xba I和Hind III双酶切后，回收8393bp的长片段，与回收得到的JB2片段以1:6比例混合，16℃过夜酶连。然后转化大肠杆菌Top 10感受态细胞，在含有Apr的LB固体培养基上过夜培养，挑取克隆子，接种于装有LB液体培养基的试管中富集培养，提取其质粒并酶切验证，得到重组质粒pKL1002。质粒pKL1002经EcoR I和Hind III双酶切，得到6419bp和3888bp两条带；经EcoR I和Xho I双酶切，得到5760bp、2878bp和1669bp三条带；经Xho I和Hind III双酶切，得到4750bp、4547bp和1010bp三条带；经Pst I单酶切，得到9437bp和870bp两条带。反复验证，条带大小与理论相符，证明质粒pKL1002构建与预测吻合（图4）。

3 工程菌绛红色小单孢菌Gb1098的构建

单交换突变株的筛选

将构建好的穿梭质粒pKL1002转化大肠杆菌ET12567（pUZ8002）感受态细胞，得到供体菌株ET12567（pUZ8002/ pKL1002）。刮取小单孢菌Gb1088在斜面上长势良好的孢子，预萌发后得到受体菌，通过接合转移，把供体菌所携带的重组质粒pKL002导入小单孢菌Gb1088中，6天后，筛选获得具有Apr抗性的突变株。将接合子转点至含有Apr和萘啶酸的培养基上，连续传代3次后，排除假阳性接合子。挑取一株长势较好的突变株，提取其基因组DNA，根据CD3基因同源重组原理，设计引物P5/P6（表1），用于验证单双交换突变株。结果扩增出1506bp和787bp两条片段，经电泳检测，实际条带大小与理论吻合，说明质粒pKL1002已成功整合至小单孢菌Gb1088的基因组中，将该单交换突变株命名为小单孢菌Gb10881。

双交换突变株Gb1098的筛选

将单交换突变株Gb10881，接至种子培养基中，松弛培养5代后，从第6代开始对种子液进行单菌落分离，纯化直至第12代。利用平板影印法，挑取平板上的单菌落分别接种至含有Apr的抗性平板和无Apr的普通平板上，37℃培养5天后，通过筛选获得对Apr敏感的突变株。利用引物P5/P6对突变株进行孢子PCR初检，得到一株目的条带与理论相符的突变株，命名为绛红色小单孢工程菌Gb1098（简称Gb1098）。提取其基因组DNA，经PCR扩增后，电泳检测得到一条787bp的目的条带，与理论预测吻合，回收该目的条带，经测序比对，该突变株为目标菌株（绛红色小单孢工程菌Gb1098）。

实施例5

工程菌Gb1098代谢产物分析

1 工程菌Gb1098的发酵

种子培养基：葡萄糖0.5wt%，玉米淀粉2.0 wt %，玉米粉1.0 wt %，蛋白胨0.4 wt%，黄豆饼粉0.5 wt %， CaCO₃ 0.5 wt %，pH7.0。

发酵培养基：淀粉4.0 wt %，玉米粉1.5 wt %，蛋白胨0.6 wt %，花生饼粉1.0 wt%， NH₄Cl 0.2 wt %，CaCO₃ 0.6 wt %，pH7.0。

绛红色小单孢菌Gb1098的发酵。工程菌Gb1098沙土管接转接到斜面培养基，在35℃下培养12天，取生长良好的斜面，刮取孢子到种子培养基。于350rpm/min，35℃摇床培养36小时，然后按10%的接种量转接于发酵培养基（装量为100mL/1000mL三角瓶），35℃摇床发酵110 h(转速为350rpm)。

10立方米发酵罐生产，搅拌转速220转/分钟，通气量1：0.6~1.2 (M³ /M³·min)，培养基，培养温度，接种量比例，发酵时间等发酵条件与摇瓶发酵相同，最终发酵水平达1098单位/mL。

2 代谢产物提取

A、粗提

发酵液稀释后，酸化到pH1.0，半小时后，用碱回调到pH6.8，按每毫升树脂交换5万单位庆大霉素计算，投入732-NH₄ ⁺树脂静态吸附4小时。收集吸附饱和树脂，用0.01M HCl溶液酸洗饱和树脂，再用无离子水洗涤至中性，再用pH7.5氨水进行碱洗，碱洗体积不少于饱和树脂体积的10倍。然后串联到等体积的711树脂柱上，收集树脱液。

B、精制

洗脱液经薄膜浓缩到约300000ug/mL，用浓硫酸调至pH5.8~6.0，加3%活性炭脱色，透光度达92%以上，过滤去除固体物，得透明澄清溶液。在搅拌下，缓慢向浓缩液中滴加92%以上乙醇，进行过夜析出，之后经离心分离，80%乙醇溶液淋洗，得湿成品。经真空干燥（真空度700mmHg以上，温度600℃，干燥12小时），得代谢产物精制品。

3 工程菌Gb1098代谢产物分析

工程菌Gb1098发酵代谢产物， 经TLC分析，结果见图5。硅胶GF254薄层层析，展开剂为氯仿：甲醇：氨水（1：1：1）（体积比），混匀取下层作为展开剂。从图5可以看出，工程菌Gb1088，虽然主产庆大霉素C1a，但还有不少的庆大霉素C2b（图5第4道）；而工程菌Gb1098的代谢产物（图5第3,4道），已经不见庆大霉素C2b组分了，获得了高质量的主产庆大霉素C1a新物种。

工程菌Gb1098代谢产物，经电喷雾电离质谱 （ESI/MS）分析，使用Agilent 6520四极杆-飞行时间质谱仪。该Q-TOP-MS扫描范围设定在正离子模式m/z 100~800，干燥气体为N2，流速为8mL/min，温度为350℃；雾化压力为2.07×105 Pa，毛细管电压为3500V，碎裂电压为135V，MS数据分析使用安捷伦MassHunter软件进行（B.04.00）定性，结果如下（图6）。从图6 质谱图可以看出，工程菌Gb1098代谢产物不再合成庆大霉素C2b，主要代谢产物为庆大霉素C1a，彻底阻断了庆大霉素C2b的合成，满足产业化要求。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州市鼓楼区荣德生物科技有限公司

<120> 主产庆大霉素C1a工程菌的构建及其应用

<130> 7

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 4829

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttagaattca gcaggcgggc ctcgtcgaga aagcgttccc ggaccgcagt cgtggtgcca 60

gttctcggcc aacaccttga tcgcgaccga ggagccgagg accgggtcgt ggcccagcca 120

gaccgtcgcg aacgagcccg cgccgagcag ccgctcgatc cggtacggcc cgatccgttc 180

cgggctggtc accgcaccac ccccgccacc ggttccgccc gccccccgcc accggctcgc 240

ccggcaccgc cagcggttcc gcccggcacc gccgcccgac acgttccggc tcgacagtag 300

acggaccggc gagccgacgg cggcaccccg ccggtgacac gtgcgccacg caccatcggc 360

agggaacaca ctgatgcatg ccgcacgacg atgtatcgct ggacaatggt gtgtggcaca 420

cagtatcgtg tgacgcatgg tcagcgatga gatcctgcga acgcacctcc aggagttgcg 480

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gctgctgcaa cggctctccg cccacggctt cccggtcgac gccaacacgc tctacccgct 600

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cgacctctcc accgtgcaga cctcactgac cggactgatc gaaggagtcg cccgatgacg 780

tccctgaccg accggtacct cgccgccacc ctgcgctcgg tgccggtcgc gcggcgcgag 840

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tgaccgtgtc accgaccatg gggatcgacg gacccggcgc caccgcccga ccggtgcaca 1860

tttcctggcc gggtggactg gccgaacact ctggacagtg gccggacgac gcccagatca 1920

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cgtacccctc gtacatgatc gtctggtagt cggcgccgcc ggcctccagg ccggagccac 4620

gcttgacggc gcggtcgatg ttgtcgttgg gtacggagtt cttcttcgcc ttctggatgg 4680

cgtcgaagag cgtcgggtta ccggccggat cgccgccgcc ggtccgggcc gccacctcga 4740

cgttcttgat gagcttggcg aacatcttgc cgcgcttggc gtcgatgacg gccttcttgt 4800

gcttggtggt cgcccacttt aagcttccc 4829

<210> 2

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttagaattca gcaggcgggc ctcgtcgaga aagcgtt 37

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggtctagaga tcggagatgc tcaagatgg 29

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tttctagatc tactccgtcg gcgagtcg 28

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gggaagctta aagtgggcga ccaccaagca caagaag 37

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttcgagatcg tcaagtaccg ggtc 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggatgatgat ggagatgggc ttcg 24

Claims (2)

1.一株主产庆大霉素C1a的工程菌绛红色小单孢菌(Micromonospora purpurea)Gb1098，其特征在于，敲除庆大霉素生物合成基因簇上的genK基因和 genL基因，筛选得到专一性合成庆大霉素C1a的绛红色小单孢工程菌Gb1098；所述绛红色小单孢菌(Micromonospora purpurea) Gb1098已于2019年07月04日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保存，保藏编号为CGMCC No.18078。

2.如权利要求1所述的主产庆大霉素C1a的工程菌绛红色小单孢菌(Micromonospora purpurea) Gb1098在发酵生产庆大霉素C1a中的应用。

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