CN113717914B

CN113717914B - 高效同源重组的拟无枝酸菌工程菌株、其构建方法及应用

Info

Publication number: CN113717914B
Application number: CN202111116446.7A
Authority: CN
Inventors: 孟永宏; 强珊; 郭建琦; 牛永洁; 杨璐
Original assignee: Shaanxi Healthful Biological Engineering Co ltd
Current assignee: Shaanxi Healthful Biological Engineering Co ltd
Priority date: 2021-09-23
Filing date: 2021-09-23
Publication date: 2022-08-02
Anticipated expiration: 2041-09-23
Also published as: CN113717914A

Abstract

高效同源重组的拟无枝酸菌工程菌株、其构建方法及应用。本发明提供ku1和/或ku2基因缺失在提高拟无枝酸菌(Amycolatopsissp.)的同源重组效率中的应用，本发明还提供高效同源重组的拟无枝酸菌工程菌株，所述拟无枝酸菌工程菌株缺失了拟无枝酸菌的ku1基因和/或ku2基因，本发明还提供所述菌株的构建方法及应用。本发明通过实验验证了缺失ku1基因、ku2基因或同时缺失ku1基因和ku2基因均能显著提高拟无枝酸菌的同源重组效率。其中，ku1基因缺失的工程菌株的同源重组效率达到95％，具有最突出的效果。

Description

高效同源重组的拟无枝酸菌工程菌株、其构建方法及应用

【技术领域】

本发明属于基因工程技术领域。更具体地，本发明涉及一种高效同源重组高效的拟无枝酸菌工程菌株，还涉及所述工程菌株的构建方法及应用。

【背景技术】

香兰素又称香草醛(3-甲氧基-4-羟基苯甲醛)，是世界上使用最广泛的调味料之一，在食品、药品、化妆品、农业等领域被广泛应用。香兰素可由天然底物阿魏酸生物转化而来，拟无枝酸菌属被报道能够利用阿魏酸生产香兰素，具有非常好的产业化应用价值。但是由于同源同组效率低，使得基因打靶等遗传操作难度大，限制了香兰素合成中的代谢工程改造，这可能与拟无枝酸菌的GC含量高、质粒转化后非同源DNA整合频率高等有关。因此，开发一种遗传操作高效的拟无枝酸菌底盘细胞及其方法具有重要的应用价值。

基因打靶技术是现代分子生物学的一个重要研究手段，通常是指利用同源重组的方法将含已知序列的外源DNA片段与生物体基因组发生结合，整合至受体染色体特异性靶位点上。该技术可增加外源DNA片段，或者删除同源臂之间DNA片段，可以用于基因敲除、基因替换和外源基因定点过表达等多种遗传改造。因此，基因打靶技术在代谢工程改造研究中发挥着非常重要的作用。在拟无枝酸菌中DNA双链断裂修复主要依靠非同源末端连接途径(Non-homologous End Joining，NHEJ)，导致外源DNA主要以随机插入方式整合至基因组染色体上，同源重组效率低下，严重制约了基因打靶技术在拟无枝酸菌中的应用。因此一种高效的基因打靶技术将为拟无枝酸菌菌株基因工程改造提供重要技术支持。

【发明内容】

本发明的目的是通过基因改造提供一种高效同源重组的拟无枝酸菌工程菌株，还提供所述工程菌株的构建方法及应用。

本发明的思路是研究ku1基因或ku2基因与拟无枝酸菌在同源重组实验的有效率关系，确认ku1基因或ku2基因的敲除在提高拟无枝酸菌的同源重组效率的意义。

基于此，本发明提供ku1基因缺失在提高拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)的同源重组效率中的应用。在本发明中，所述ku1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

另一方面，本发明还提供ku2基因缺失在提高拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)的同源重组效率中的应用。所述ku2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供高效同源重组的拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)工程菌株，所述拟无枝酸菌工程菌株缺失了拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)的ku1基因和/或ku2基因。

在本发明中，所述ku1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述ku2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

进一步地，本发明还包括上述拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)工程菌株的构建方法，所述方法包括以下步骤：

(1)

分别用ku1-U-FOR/ku1-U-REV与ku1-D-FOR/ku1-D-REV和/或ku2-U-FOR与ku2-U-REV为引物，以拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)基因组为模板，PCR扩增ku1基因或ku2基因的上下游同源臂；

(2)

所得上下游同源臂片段通过Assembly试剂盒连接到pKC1139质粒的HindIII/EcoRI位点，构建得到质粒pKC1139-ku1和/或pKC1139-ku2；

(3)

利用接合转移实验方法，将pKC1139-ku1和/或pKC1139-ku2质粒转化到拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)中，经阿伯拉霉素抗性筛选出阳性突变株，获得敲除ku1和/或ku2基因的拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)工程菌株，所得工程菌株经PCR验证正确。

在本发明中，构建敲除ku1或ku2基因的拟无枝酸菌时，将pKC1139-ku1或pKC1139-ku2质粒转化到拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)时的出发菌株为拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)HM-141，该菌株已于2021年7月9日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为CGMCC No.22871。该拟无枝酸菌HM-141也记载于中国发明专利申请CN2021109397312。本领域技术人员也可以以其他拟无枝酸菌株作为出发菌株，构建敲除ku1或ku2基因的拟无枝酸菌。

拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)HM-141是从西安、咸阳、渭南等地果树周围采集的土壤样品后，经常规技术进行分离，然后诱变后鉴定获得的。其中，所述诱变是以分离所得的原始菌株为出发菌株，进行复合诱变选育，紫外-亚硝酸钠复合诱变筛出高产香兰素的菌株：

将出发菌株在平板培养基上进行活化，然后挑取菌落溶于装有玻璃珠的10mL无菌水中，震荡混匀后得到菌悬液，梯度稀释获得OD₆₀₀为0.4-0.6的菌悬液。取10mL菌悬液置于无菌培养皿中，在15W紫外灯的30cm处照射30s，然后避光培养1h，再向培养皿中加入0.1M的亚硝酸钠，在30℃，200rpm培养3min。

诱变结束后，立即加入磷酸氢二钠溶液终止反应。将诱变后的菌悬液进行梯度稀释，然后涂布于平板培养基上，挑取长出的单菌落接入装有种子培养基(种子培养基：葡萄糖25g/L，酵母浸粉10g/L，氯化钠0.8g/L，磷酸二氢钾5g/L，七水硫酸镁0.2g/L，氯化钙0.05g/L，其余为水，调节pH为7.2，在121℃下灭菌20min)的96孔板中培养，种子液以5％的接种量接入96孔板发酵培养基(发酵培养基：葡萄糖30g/L，酵母浸粉10g/L，氯化钠0.8g/L，磷酸二氢钾5g/L，七水硫酸镁1g/L，氯化钙0.05g/L，其余为水，调节初始pH为7.2，发酵培养基在121℃下灭菌20min)中，在30℃、200rpm摇床中培养，加入0.5g/L的底物阿魏酸，结合2，4-二硝基苯肼显色法，用酶标仪在520nm处测吸光度，以此测定发酵液中香兰素的含量。

采用2，4-二硝基苯肼显色法测定香兰素的产量：发酵转化后期每4h从96孔板的培养液中取出10μL菌液于24深孔板内，加入100μL 2，4-二硝基苯肼溶液和5mL 0.8mol/L的NaOH溶液，混匀，以蒸馏水作为空白对照，同时以出发菌株作为对照组，然后检测吸光度。筛选出正突变株进行摇瓶复筛，将在平板培养基上活化的正突变株分别接种于种子培养基，30℃、200rpm培养48-72h，然后按照5％的接种量接种于发酵培养基中，30℃、200rpm条件下进行转化，底物阿魏酸初始浓度为10g/L。通过HPLC测定最终发酵液中香兰素的含量。最终筛选出高产香兰素的菌株。

所得菌株采用16s rDNA方法鉴定，确认筛选的菌株的16s rDNA与拟无枝酸菌具有99％的同源性，因此，将拟无枝酸菌HM-141定名为Amycolatopsis sp.HM-141。其生物学特性为：在固体培养基上能形成明显的菌落，其菌落形态见附图1，菌落为白色或淡黄色、不透明，表面干燥。革兰氏染色为阳性，菌体为细丝状。

拟无枝酸菌Amycolatopsis sp.HM-141产香兰素测定：

取一管-80℃保藏的甘油菌种Amycolatopsis sp.HM-141，在固体平板(固体培养基：葡萄糖4g/L，酵母浸粉4g/L，麦芽提取物10g/L，琼脂20g/L，其余为水)上稀释涂布，平板倒置于30℃培养箱中培养3-4d至长出菌落。

从活化平板上接一环菌到种子培养基中，在30℃培养48-72h，转速为200rpm。

将种子液按照5％的接种量接种到5L发酵罐中(含有4L发酵培养基)，在30℃发酵培养，搅拌转速为800rpm，通气比为1vvm。培养24h后，加入底物阿魏酸22.5g/L(共90g，按照4L发酵液体积计算的阿魏酸浓度，将阿魏酸溶于0.5M NaOH溶液中使其浓度为100g/L)，然后调节pH为8.2，继续发酵48h。

由于在4L发酵液的基础上加了0.9L的阿魏酸溶液，而在发酵期间对发酵液取样导致发酵液有所减少，在发酵结束时，测得实际的发酵液体积为4.5L，为了保持数据一致，以下数据均用4L发酵液进行计算。用HPLC测定发酵液中香兰素的浓度为15g/L，残留的阿魏酸浓度为0.5g/L，如果计入未参与转化的残留阿魏酸，则摩尔转化率为85％；如果不计入未参与转化的残留阿魏酸，则摩尔转化率为87％。副产物香兰酸的含量为0.25g/L，发酵液中未检测到香兰醇。

可见，作为本发明的出发菌株的拟无枝酸菌Amycolatopsis sp.HM-141能够以阿魏酸为底物生产香兰素，实现的摩尔转化率高达87％，且产物中的杂质含量少，香兰醇的检出量为0，香兰酸的检出量为0.25g/L。

本发明以拟无枝酸菌内源的ech-fcs基因为例，验证了将内源基因以同源重组的方式整合到基因工程菌Δku1的基因组上，获得ech-fcs基因整合的基因工程菌株。以vdh-F验/ech-R验和fcs-F验/vdh-R验作为鉴定引物进行PCR验证并验证正确。该实验确认，拟无枝酸菌缺失ku1基因、ku2基因或同时缺失ku1基因和ku2基因时，ech-fcs基因整合的同源重组概率为11/20，即55％。以Δku1菌株为出发菌株时，基因整合同源重组概率为19/20，即95％。以Δku2菌株为出发菌株时，基因整合同源重组概率为17/20，即85％。以Δku1ku2菌株为出发菌株时，基因整合同源重组概率为18/20，即90％。

可见，缺失ku1基因、ku2基因或同时缺失ku1基因和ku2基因均能显著提高拟无枝酸菌的同源重组效率，其中，将拟无枝酸菌的内源基因ech-fcs以同源重组的方式整合到Δku1菌株的基因组上，同源重组的效率达到95％，具有最突出的效果，为基因打靶技术在拟无枝酸菌中的应用提供了好的理论基础。

本发明涉及的拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)HM-141已于2021年7月9日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为CGMCC No.22871。

【附图说明】

图1为本发明中pKC1139-ku1质粒的图谱。

图2为本发明中pKC1139-ku2质粒的图谱。

图3为本发明中Δku1突变体的PCR验证：M，2K Plus DNA Marker，1，3为ku1-U-F验/ku1-U-R验引物验证结果，2，4为ku1-D-F验/ku1-D-R验引物验证结果，1，2为对照基因组，3，4为阳性突变株。

图4为本发明中Δku2突变体的PCR验证：M，2K Plus DNA Marker，1，2为ku2-U-F验/ku2-U-R验引物验证结果，3，4为ku2-D-F验/ku2-D-R验引物验证结果，1，3为对照基因组，2，4为阳性突变株。

图5为本发明中pKG1132-vdh-2500质粒的图谱。

图6为本发明中pKG1132-vdh-echfcs质粒的图谱。

图7为本发明中Δku1-echfcs突变体的PCR验证：M，2K Plus DNA Marker，1，2，3，4为fcs-F验/vdh-R验引物验证结果，5，6，7，8为vdh-F验/ech-R验引物验证结果，4，5为对照基因组(无条带)，1，2，3，6，7，8为阳性突变株。

【具体实施方式】

通过下述实施例将能够更好地理解本发明。

在本发明中，如无特殊说明，用于解释浓度的“％”均为质量百分比，用于解释比例的“：”均为质量比。

实施例中使用到的菌株和质粒见表1，合成的引物序列见表2。

表1本发明所用的菌种和质粒

表2本发明所用的引物

本发明涉及以下培养基：

LB培养基配方为：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L。

GYM培养基配方为：葡萄糖4g/L、酵母提取物4g/L、麦芽提取物10g/L。

GYM固体培养基配方为：葡萄糖4g/L、酵母提取物4g/L、麦芽提取物10g/L、碳酸钙2g/L、琼脂粉20g/L。M1培养基配方为：葡萄糖25g/L，酵母浸粉10g/L，氯化钠0.8g/L，磷酸二氢钾5g/L，七水硫酸镁0.2g/L，氯化钙0.05g/L，其余为水，调节pH为7.2。

M2培养基配方为：葡萄糖30g/L，酵母浸粉10g/L，氯化钠0.8g/L，磷酸二氢钾5g/L，七水硫酸镁1g/L，氯化钙0.05g/L，其余为水，调节pH为7.2。

在本发明中，如无特殊说明，大肠杆菌在37℃的液体LB培养基或在添加1.5％琼脂的固体LB平板上培养。拟无枝酸菌及其他工程菌株在30℃的液体GYM培养基或在含有2％琼脂和2g/L碳酸钙的固体GYM平板上培养。

本发明涉及以下培养基：

LB培养基配方为：10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠。

GYM培养基配方为：4g/L葡萄糖、4g/L酵母提取物、10g/L麦芽提取物。

GYM固体培养基配方为：葡萄糖4g/L、酵母提取物4g/L、麦芽提取物10g/L、碳酸钙2g/L、琼脂粉20g/L。

以下实施例中使用的接合转移实验包括以下步骤：

将拟无枝酸菌Amycolatopsis sp.(或其他工程菌株)在GYM固体培养基上进行活化，在30℃培养3-4d至长出菌落，然后接种菌株到50mL GYM液体培养基中在30℃、200rpm培养2d。将构建好的质粒热激转入E.coli ET12567(pUZ8002)菌株，涂布于含有25μg/mL氯霉素、25μg/mL卡那霉素和50μg/mL阿伯拉霉素抗性的LB固体平板，在37℃培养12h至长出单菌落，接种单菌落于含有抗性的4mL LB液体培养基中37℃、200rpm过夜培养，然后按照1％的接种量接种于20mL LB中在37℃、200rpm培养4-5h至OD₆₀₀为0.4-0.6。分别取拟无枝酸菌菌液2mL及携带质粒的E.coli ET12567(pUZ8002)菌液1mL，5000g离心1min，用无抗LB清洗两遍，加入100μL无抗LB培养基，将拟无枝酸菌和E.coli ET12567(pUZ8002)按体积比7:1的比例混合，将混合好的菌液取30μL点在无抗GYM固体培养基上30℃，14h正置培养。将长出的菌斑刮下，涂布于含有50μg/mL阿伯拉霉素和25μg/mL萘啶酮酸溶液GYM固体培养基中，在30℃培养4d至长出单菌落，然后对单菌落进行PCR验证。

实施例1：ku1基因缺失菌株的构建

在NCBI网站上根据拟无枝酸菌Amycolatopsis sp.ATCC 39116菌株的基因序列比对出拟无枝酸菌的ku1的序列，基因序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的蛋白质登录号为WP_027936589.1。

ku1基因缺失菌株的构建：为了敲除拟无枝酸菌中的ku1基因，分别用ku1-U-FOR/ku1-U-REV和ku1-D-FOR/ku1-D-REV为引物，拟拟无枝酸菌HM-141基因组为模板，PCR扩增ku1基因各约2kb的上下游同源臂。同时将上述两个ku1-up和ku1-down片段通过Assembly试剂盒连接到pKC1139质粒的HindIII/EcoRI位点，完成质粒pKC1139-ku1的构建，pKC1139-ku1质粒图谱如图1所示。

利用接合转移实验方法，将pKC1139-ku1质粒转化到拟无枝酸菌HM-141(CGMCCNo.22871)菌株中，根据阿伯拉霉素抗性筛选阳性突变株，获得ku1基因敲除的基因工程菌株。以ku1-U-F验/ku1-U-R验和ku1-D-F验/ku1-D-R验作为鉴定引物，以拟无枝酸菌HM-141基因组为对照进行PCR验证，阳性缺失突变株命名为Δku1(见图3)。

实施例2：ku2基因缺失菌株的构建

类似地，在NCBI网站上根据拟无枝酸菌ATCC 39116菌株的基因序列比对出拟无枝酸菌菌株中ku2的序列，其编码的蛋白质登录号为WP_020416491.1。

ku2基因缺失菌株的构建：为了敲除拟无枝酸菌中的ku2基因，分别用ku2-U-FOR/ku2-U-REV和ku2-D-FOR/ku2-D-REV为引物，拟无枝酸菌HM-141基因组为模板，PCR扩增ku2基因各约2kb的上下游同源臂。

将上述两个ku2-up和ku2-down片段通过Assembly试剂盒连接到pKC1139质粒的HindIII/EcoRI位点，完成质粒pKC1139-ku2的构建，pKC1139-ku2质粒图谱如图2所示。利用接合转移实验方法，将pKC1139-ku2质粒转化到拟无枝酸菌菌株中，根据阿伯拉霉素抗性筛选阳性突变株，获得ku2基因敲除的基因工程菌株。以ku2-U-F验/ku2-U-R验和ku2-D-F验/ku2-D-R验作为鉴定引物，以拟无枝酸菌基因组为对照进行PCR验证，阳性缺失突变株命名为Δku2(见图4)。

实施例3：ku1和ku2基因都缺失菌株的构建

在实施例1构建得到的Δku1菌株的基础上，进一步敲除ku2基因：

利用接合转移实验方法，将实施例2的pKC1139-ku2质粒转化到Δku1菌株中，根据阿伯拉霉素抗性筛选阳性突变株，获得ku1和ku2基因都缺失的基因工程菌株Δku1ku2。

实施例4：ku基因缺失的基因工程菌Δku1，Δku2，Δku1ku2中同源重组效率验证

为了验证Δku1，Δku2，Δku1ku2菌株中的同源重组效率，本发明将拟无枝酸菌中的内源基因ech-fcs分别整合到拟无枝酸菌-HM141、Δku1、Δku2、Δku1ku2菌株中，观察其成功率。

分别用vdh-U-FOR/vdh-U-REV和vdh-D-FOR/vdh-D-REV为引物，拟无枝酸菌-HM141基因组为模板，PCR扩增vdh基因各约2.5kb的上下游同源臂。同时将上述两个vdh-up和vdh-down片段通过Assembly试剂盒连接到pKG1132质粒的HindIII/EcoRI位点，完成质粒pKG1132-vdh-2500的构建，pKG1132-vdh-2500质粒图谱如图5所示。

以ech-F/fcs-R为引物，拟无枝酸菌-HM141基因组为模板，PCR扩增ech和fcs基因，其中ech和fcs基因在一起连着，PCR产物用XbaI和SpeI酶切，酶切产物通过T4连接酶连接到pKG1132-vdh-2500质粒的SpeI位点，得到整合质粒pKG1132-vdh-echfcs，pKG1132-vdh-echfcs质粒图谱如图5所示。

利用接合转移实验方法，将pKG1132-vdh-echfcs质粒分别转化到出发菌株拟无枝酸菌-HM141、Δku1、Δku2、Δku1ku2菌株中，根据阿伯拉霉素抗性筛选阳性突变株，获得ech-fcs基因整合的基因工程菌株。以vdh-F验/ech-R验和fcs-F验/vdh-R验作为鉴定引物，以拟无枝酸菌-HM141基因组为对照进行PCR验证，阳性缺失突变株分别命名为Amycolatopsis sp-echfcs、Δku1-echfcs、Δku2-echfcs、Δku1ku2-echfcs。

图7为Amycolatopsis sp-echfcs菌株验证图。对照拟无枝酸菌-HM141菌株中基因整合同源重组概率为11/20。Δku1菌株中基因整合同源重组概率为19/20，Δku2菌株中基因整合同源重组概率为17/20，而Δku1ku2菌株中基因整合同源重组概率为18/20。

由此可见，缺失ku1基因、ku2基因或同时缺失ku1基因和ku2基因均能显著提高拟无枝酸菌的同源重组效率。其中，ku1基因缺失的工程菌株的同源重组效率达到95％，具有最突出的效果。

序列表

<110> 陕西海斯夫生物工程有限公司

<120> 高效同源重组的拟无枝酸菌工程菌株、其构建方法及应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 858

<212> DNA

<213> 拟无枝酸菌ku1基因(Amycolatopsis sp.)

<400> 1

atgcgatcga tgtggaaggg ctcggtgtcg ttcgggctgg tcacgatccc gatcaacctc 60

tacgcggcca ccgagaacaa gaacgtgtcc ctgcgccagg tgcacgtcag cgacggcggg 120

cgcatccagt acaagcgctt ctgcaccatc gacggcgaag aggtgcccta cgccgacatc 180

gccaaggggt acgagaccga cgacggcgag atggtggtca tcaccgacga ggacctcaag 240

gagctgccgc tgtccagctc caacgtgatc gacgtgctgg agttcgtgcc gctcgaggcc 300

atcgacccgc tgcacttcga ccgccactac tacctggagc cgcagaaggc cgcggtcaag 360

ccgtacgtgc tgctgcgcga cgcgctgcac aagtccggca acgtcgccat cgccaaggtc 420

gcgctgcgcc agcgcgagac cctcgcgctg ctgcgcgtgc acgccgacgt gatggtcatg 480

accacgatgc tgtggccgga cgaggtgcgc accccggact tcgggttcct gcgcgacgag 540

ctgccccagg tgcggccgca ggagctgagc atggccggct cgctcatcga gtcgctgtcc 600

gagccggttt tcgacccgga caagtacacc gaccagtacc gggaggcgct ggaatcggtg 660

atcgaggcga agatcgcggg caagaagacc acccggccga aggggcgctc gcccaagacc 720

gacgtggtcg acctgatggc ggcgctggag gccagcgtca gcgaggcgaa gaaggcacgc 780

aaaccggcca agcgcgcggc cgcgaagaag ccggccgcga ccccggcgcg cagccgccgc 840

tcgccgaaga gcgcctga 858

<210> 2

<211> 990

<212> DNA

<213> 拟无枝酸菌ku2基因(Amycolatopsis sp.)

<400> 2

atggcgcgag cgatctggag cggtgcgatc aacttcggcc tggtgacggt gccggtcgag 60

ctgtactccg cgaccgagga ccacaccgtg cacttccggc agttcgagcg cggcacgtcg 120

gaccggatcc ggtacaagcg cgtgaacgag cggaccggcg aggaggtggc ctacgaggac 180

atcgtgaagg gctacgacct cggcgacggc gactacgtgc tggtcgagca ggaggagctg 240

gaccagatcg cgccaggccg gtcccggtcc atcgacatcg agtcgttcgt cgacctcggc 300

gagatcgacc cgctgtactt ccagaagagc tattggctgg cgccgacgaa ggaggagttc 360

gggcgcgcgt acgggctgct catgcaggcc atggcggaga ccaacaaggc cggcatcgca 420

cgcttcgtga tgcgcggcaa ggagcacatc gccgcggtcc gcgccggcga cggtgtgctg 480

gtgctggaca cgctgctgtt cgccgaggac gtgcggaacc cggcgaagga gctgaagaag 540

ctgccggaga aggcggagcc gcggggccgg gaactggaga tggcggtcgc gctggtggac 600

tccatggcgg acgactggcg tcccgacgac taccacgacc agtacaacga gcgcgtcctg 660

aagctgatcg acgacaagaa ggccgggcgc acggtgacgg tcgaggacga gcccggcgag 720

ccgaccaagg tggtcgacct gttcgaagcg ctgtcccgca gcgtcgagcg gcgcaagggc 780

gccggcggga agtcggagaa ggccgcttcg agcgccccga agaagtcccg caaggccgcg 840

gagccggacc tgtccgagct gagcaaggcg gagctggaca agatggcacg ggagctcgac 900

atcaagggcc gatcgaaact caaccgcgcc gagctggaga aggccatccg ggaggcgcga 960

ccggcccgtt cgcgcaaacg cgcttcctga 990

Claims

1.ku1基因缺失在提高拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.) 的同源重组效率中的应用，所述ku1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.ku2基因缺失在提高拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.) 的同源重组效率中的应用，所述ku2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.高效同源重组的拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)工程菌株，所述拟无枝酸菌工程菌株缺失了拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)的ku1基因和/或ku2基因，所述ku1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述ku2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.权利要求3所述的拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)工程菌株的构建方法，所述方法包括以下步骤：

（1）

分别用ku1-U-FOR/ku1-U-REV与ku1-D-FOR/ku1-D-REV和/或ku2-U-FOR/ku2-U-REV与ku2-D-FOR/ku2-D-REV为引物，以拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)基因组为模板，PCR扩增ku1基因和/或ku2基因的上下游同源臂；其中，引物序列为：

ku1-U-FOR ggccagtgccaagcttaggcagagccggtagctcca

ku1-U-REV ctgacacccccttccacatcgatcgcat

ku1-D-FOR ggaagggggtgtcagacatggagtgcc

ku1-D-REV acatgattacgaattcgtcccgctgctgatcgtcgt

ku2-U-FOR ggccagtgccaagcttacgacgaactgcggttccag

ku2-U-REV tttgcgcgctccagatcgctcgcgccat

ku2-D-FOR tctggagcgcgcaaacgcgcttcctga

ku2-D-REV acatgattacgaattctcctgcaggccaccgccaaa

（2）

（3）

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于步骤（3）中，所述拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)是拟无枝酸菌（Amycolatopsis sp.）HM-141，该菌株已于2021年7月9日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为CGMCC No. 22871。