CN105002106A

CN105002106A - 平板霉素和平板素的高产工程菌株及其发酵和分离纯化工艺

Info

Publication number: CN105002106A
Application number: CN201410397311.6A
Authority: CN
Inventors: 段燕文; 沈奔; 黄勇; 朱湘成; 石俊
Original assignee: Changsha Cihang Pharmaceutical Institute Co ltd; Hayao Cihang Pharmaceutical Co ltd; Changsha Tianci Biomedicine Technology Co ltd
Current assignee: Changsha Cihang Pharmaceutical Institute Co ltd; Hayao Cihang Pharmaceutical Co ltd; Changsha Tianci Biomedicine Technology Co ltd
Priority date: 2014-08-13
Filing date: 2014-08-13
Publication date: 2015-10-28
Anticipated expiration: 2034-08-13
Also published as: CN105002106B

Abstract

本发明属于工程菌株领域，具体提供了平板霉素和平板素的高产工程菌株及其发酵和分离纯化工艺。本发明获得了三株能高产平板霉素和平板素的工程菌株普拉特链霉菌SB12026、SB12027和SB12028；然后，建立了平板霉素和平板素的发酵生产工艺；进一步，我们建立了不依赖于高效液相色谱分离的平板霉素和平板素的分离提纯工艺。本发明的菌株产量明显高于现有菌株。本发明的分离提纯工艺可以分别得到纯度在95.0%以上的平板霉素和平板素。

Description

平板霉素和平板素的高产工程菌株及其发酵和分离纯化工艺

技术领域

本发明属于工程菌株领域，具体涉及平板霉素和平板素的生产菌株。

背景技术

平板霉素(platensimycin，PLM)和平板素(platencin,PTN)是近年来新发现的一类对革兰氏阳性菌敏感的强效抗生素。它们的发现被广泛认为是现代抗生素研究里程碑式的成就之一。平板霉素和平板素结构相似，它们由一个笼状四环或三环不饱和酮与一个3-氨基-2,4-二羟基苯甲酸侧链通过酰胺键各自连接而成(平板霉素见化学结构式(1)和平板素见化学结构式(2))。平板霉素通过与细菌脂肪酸生物合成酶FabF/B共价结合，而平板素通过与细菌脂肪酸生物合成酶FabF和FabH共价结合而阻断脂肪酸合成,属于广谱、强效和低毒抗生素，尤其是对包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌在内多种耐药性革兰氏阳性菌有特效。

目前临床使用抗生素的作用机制包括阻碍细菌蛋白、细胞壁、叶酸、DNA或RNA合成，以及破坏细胞膜，然而平板霉素和平板素通过阻塞脂肪酸合酶而阻断脂肪酸合成，代表了一种新的抗生素作用机制。综上所述，平板霉素和平板素的发现被誉为是本世纪抗生素发现“里程碑”式的成就之一。另外，平板霉素最近被报道能够有效降低动物体内甘油三酯的浓度，因而它同时具有被开发成治疗糖尿病药物的潜力。

目前产平板霉素的野生菌株只有一种，被称为普拉特链霉菌MA7327(Streptomyces platensis MA7327)，分离于非洲南非的土壤中。目前产平板素的野生菌株包括普拉特链霉菌MA7327，以及分离于欧洲西班牙土壤中的普拉特链霉菌MA7339(Streptomyces platensis MA7339)。但是，平板霉素和平板素在上述两株菌株中的产量都很低，已报道的普拉特链霉菌MA7327和普拉特链霉菌MA7339产平板霉素和平板素的量低于10mg/L(Smanski MJ,et al.Engineered Streptomyces platensis strains that overproduce antibiotics platensimycin and platencin.Antimicrob Agents Chemother.2009Apr；53(4):1299-304；Wang J,et al.Discovery of platencin,a dual FabF and FabH inhibitor with in vivo antibiotic properties.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2007May1；104(18):7612-6.))，极大地阻碍了平板霉素和平板素的应用研究和开发利用。

发明内容

针对现有技术产平板霉素和平板素的菌株少，且产量低的不足，本发明的目的是提供可以产生平板霉素和平板素的高产菌株，并研究合适的发酵工艺和分离提纯工艺。本发明获得了三株能高产平板霉素和平板素的工程菌株普拉特链霉菌SB12026、SB12027和SB12028；然后，建立了平板霉素和平板素的发酵生产工艺；最后，我们进一步建立了不依赖于高效液相色谱分离的平板霉素和平板素的分离提纯工艺。本发明的菌株产量明显高于现有菌株。本发明的分离提纯工艺可以分别得到纯度在95％以上的平板霉素和平板素。

为实现上述目的，本发明的技术方案是：

本发明的技术方案之一：一种平板霉素和平板素的高产工程菌株，所述工程菌株为普拉特链霉菌SB12026，其保藏编号为CCTCC M 2014286。

本发明的技术方案之二：一种平板霉素和平板素的高产工程菌株，所述工程菌株为普拉特链霉菌SB12027，其保藏编号为CCTCC M 2014287。

本发明的技术方案之三：一种平板霉素和平板素的高产工程菌株，所述工程菌株为普拉特链霉菌SB12028，其保藏编号为CCTCC M 2014288。

本发明的技术方案之四：

用所述工程菌株生产平板霉素和平板素的发酵工艺，将所述工程菌株的孢子按照体积比0.01‰-0.1‰的接种量分别接种至种子培养基中，在25℃～32℃、200rpm～250rpm恒温摇床培养24h～60h；然后再按照体积比1％～20％的接种量转接于生产培养基中，在25℃～32℃、200rpm～250rpm恒温摇床培养5～10天；

所述种子培养基的质量百分比配方：酵母粉1％～2％，麦芽提取物0.5％～1.2％，葡萄糖2％～3％，硫酸镁0.025％～0.04％，六水三氯化铁0.025％～0.04％，其余为水，pH6.5～7.5。

所述生产培养基的质量百分比配方：糊精,1％～6％，乳糖1％～6％，酵母粉0.1％～0.8％，碳酸钙0.08％～0.13％，3-(N-吗啉基)丙磺酸0.3％～2％，消泡剂0-1.0％，其余为水，pH6.5～7.5。

所述麦芽提取物是现有公知的产品，本申请实施例中的麦芽提取物均购于上海生工。

本发明的技术方案之五：

一种平板霉素和平板素的分离和纯化工艺，包括以下步骤：

(1)吸附：将生产平板霉素和平板素的工程菌株的发酵培养后的发酵产物过滤，将发酵液与菌丝体分离，然后向发酵液中投入占发酵液质量为3％-10％的大孔吸附树脂，搅拌混合3-8小时，吸附完成后，静置发酵液，过滤，将发酵液和大孔吸附树脂分开，水洗大孔吸附树脂后晾干；

(2)分离纯化：将所述大孔吸附树脂用乙醇浸提，得提取液；将所述提取液旋转蒸干，填充于硅胶柱中，用体积比为6-8:3的丙酮:正己烷溶液洗脱，收集洗脱液，蒸干，得到含有平板霉素和平板素的粗品；再将所述含有平板霉素和平板素的粗品用丙酮溶解，加入聚酰胺粉末，拌匀，加入干净的聚酰胺柱上部，分别用1-2倍柱体积、pH为7的1mM-12mM 3-(N-吗啉基)丙磺酸或磷酸盐缓冲液，1-2倍柱体积、pH为7的1mM-12mM 3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液或磷酸盐:乙醇＝8-9:1的溶液，1-2倍柱体积、pH为7的1mM-12mM 3-(N-吗啉基)丙磺酸或磷酸盐缓冲液:乙醇溶液＝4-5:5的溶液，1-2倍柱体积、pH为7的1mM-12mM 3-(N-吗啉基)丙磺酸或磷酸盐缓冲液:乙醇＝2:7-8的溶液，和1-2倍柱体积的乙醇溶液冲洗聚酰胺柱，收集柱后流份；通过薄层色谱和高效液相色谱检测柱后流份，分别合并含有平板霉素或平板素的组分，干燥，分别得到平板霉素和平板素产品。

所述平板霉素和平板素产品的纯度在95.0％以上。

步骤(1)所述发酵产物优选为本发明所述发酵工艺发酵后的产物。

下面对发明中所涉及的菌株保藏信息进行统一说明：

1、菌种名称为：普拉特链霉菌CB00739

拉丁文学名为：Streptomyces platensis CB00739，

保藏编号为：CCTCC NO：M 2014280，

保藏日期为：2014年6月25日，

保藏单位为；中国典型培养物保藏中心，

保藏单位地址为：中国武汉，武汉大学。

2、菌种名称为：普拉特链霉菌CB00765

拉丁文学名为：Streptomyces platensis CB00765，

保藏编号为：CCTCC NO：M 2014281，

保藏日期为：2014年6月25日，

保藏单位为；中国典型培养物保藏中心，

保藏单位地址为：中国武汉，武汉大学。

3、菌种名称为：普拉特链霉菌CB00775

拉丁文学名为：Streptomyces platensis CB00775，

保藏编号为：CCTCC NO：M 2014282，

保藏日期为：2014年6月25日，

保藏单位为；中国典型培养物保藏中心，

保藏单位地址为：中国武汉，武汉大学。

4、菌种名称为：普拉特链霉菌SB12026

拉丁文学名为：Streptomyces platensis SB12026，

保藏编号为：CCTCC NO：M 2014286，

保藏日期为：2014年6月25日，

保藏单位为；中国典型培养物保藏中心，

保藏单位地址为：中国武汉，武汉大学。

5、菌种名称为：普拉特链霉菌SB12027

拉丁文学名为：Streptomyces platensis SB12027，

保藏编号为：CCTCC NO：M 2014287，

保藏日期为：2014年6月25日，

保藏单位为；中国典型培养物保藏中心，

保藏单位地址为：中国武汉，武汉大学。

6、菌种名称为：普拉特链霉菌SB12028

拉丁文学名为：Streptomyces platensis SB12028，

保藏编号为：CCTCC NO：M 2014288，

保藏日期为：2014年6月25日，

保藏单位为；中国典型培养物保藏中心，

保藏单位地址为：中国武汉，武汉大学。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

1、本发明获得了三株能高产平板霉素和平板素的工程菌株普拉特链霉菌SB12026、SB12027和SB12028。

2、本发明建立了用普拉特链霉菌SB12026、SB12027和SB12028生产平板霉素和平板素的发酵生产工艺，产量高。

3、本发明建立了平板霉素和平板素的分离提纯工艺，该方法不依耐于高效液相色谱，该工艺可以分别得到纯度在95.0％以上的平板霉素和平板素。

附图说明

图1是普拉特链霉菌SB12026、SB12027、SB12028基因工程菌株的构建示意图；

图2是普拉特链霉菌CB00739、CB00765和CB00775，以及普拉特链霉菌SB12026、SB12027和SB12028的基因型数据对比图；泳道1为DNA分子量标准品；泳道2为普拉特链霉菌CB00739；泳道3-4为普拉特链霉菌SB12026；泳道5普拉特链霉菌CB00765；泳道6-7为普拉特链霉菌SB12027；泳道8为普拉特链霉菌CB00775；泳道9-10为普拉特链霉菌SB12028。

图3是普拉特链霉菌SB12026发酵产物的高效液相色谱图，其中●是平板霉素；◆是平板素；

图4是普拉特链霉菌SB 12027发酵产物的高效液相色谱图，其中●是平板霉素；◆是平板素；

图5是普拉特链霉菌SB 12028发酵产物的高效液相色谱图，其中●是平板霉素；◆是平板素；

图6是平板霉素标准样高效液相色谱图，其中●是平板霉素；

图7是平板素标准样高效液相色谱图；其中◆是平板素；

图8是发酵产物分离纯化后的产品高效液相色谱图，其中●是平板霉素；

图9是发酵产物分离纯化后的产品高效液相色谱图，其中◆是平板素。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1普拉特链霉菌SB12026、SB12027、SB12028基因工程菌株的获得

普拉特链霉菌SB12026、SB12027、SB12028基因工程菌株的构建方法包括如下步骤：(1)构建黏粒pBS12034、pBS12035和pBS12036：将包含调控子ptmR1基因的黏粒中的长608-bp的片段，通过聚合酶链式反应体系(λRED-mediated PCR targeting)方法，用aac(3)IV-oriT这一阿普拉霉素抗性基因替换；(2)基因替换后的黏粒pBS12034、pBS2035和pBS2036再接入大肠杆菌S17-1后，通过结合转移，分别转入普拉特链霉菌CB00739、CB00765和CB00775中，并通过抗性筛选和PCR测序来确定替换后的基因工程菌株，替换后的基因工程菌株将产生一个长1445-bp的DNA片段。替换后的基因工程菌株被分别命名为SB12026(源于CB00739)、SB12027(源于CB00765)和SB12028(源于CB00775)。

如图1所示，普拉特链霉菌SB12026、SB12027、SB12028基因工程菌株的构建示意图。长1445-bp的含aac(3)IV-oriT的片段，通过同源重组，将野生型的普拉特链霉菌(包括CB00739、CB00765和CB00775)重组为SB12026、SB12027和SB12028。如图2所示，通过PCR反应，确定普拉特链霉菌CB00739、CB00765和CB00775，以及普拉特链霉菌SB12026、SB12027和SB12028的基因型。泳道1，DNA分子量标准品；泳道2，CB00739；泳道3-4，SB12026；泳道5，CB00765；泳道6-7，SB12027；泳道8，CB00775；泳道9-10，SB12028。

实施例2普拉特链霉菌SB12026、SB12027、SB12028的发酵工艺及发酵产物分析。

10微升左右普拉特链霉菌SB12026、SB12027和SB12028菌株的孢子(约10⁸)，被分别接种于50mL种子培养基A中。菌种在25～32℃、200～250rpm恒温摇床培养36～60h后，再转接于50mL生产培养基中，接种量5％～15％，在25～32℃、200～250rpm恒温摇床培养5～8天。

所述种子培养基A质量配方：酵母粉1～2％，麦芽提取物(购于上海生工)0.5～1.2％，葡萄糖2～3％，硫酸镁0.025～0.040％，六水三氯化铁0.025～0.04％，其余为水，pH6.5～7.5。

所述生产培养基质量配方：糊精2～6％，乳糖2～6％，酵母粉0.3～0.8％，碳酸钙0.08～0.13％，3-(N-吗啉基)丙磺酸0.3～0.8％，其余为水，pH6.5～7.5。

发酵产物分析：

普拉特链霉菌SB12026、SB12027和SB12028菌株的发酵液通过离心后，取上清加入3g大孔吸附树脂，在室温下混合1-3小时。大孔吸附树脂用3X30mL去离子水洗涤后阴干。1.5g阴干后的大孔吸附树脂用甲醇、乙醇或丙酮浸渍(3X10mL)、浓缩后通过高效液相色谱和液相色谱-质谱联用仪分析，见图3-7。通过比较分析平板霉素和平板素标准样以及发酵产物在高效液相色谱上的保留时间，发现SB12026、SB12027和SB12028产生了平板霉素和平板素，与已报道的普拉特链霉菌MA7327和MA7339相比(原文请见背景技术)，其产量有了大幅度提高(表1)。

表1 普拉特链霉菌SB12026、SB12027和SB12028在摇瓶中的发酵产量。

平板霉素和平板素产量	平板霉素mg/L	平板素mg/L
			SB12026	310±12	170±6
SB12027	11±0.9	12±1
			SB12028	230±20	200±25
普拉特链霉菌MA7327	10.1±3.6	1.7±1.0
			普拉特链霉菌MA7339	-	1.0

实施例3在15L发酵罐中的发酵工艺

10ul孢子(约10⁸)接种至有50mL种子培养基的250mL摇瓶中进行种子培养，30℃，220rpm培养24h，继续转接至含500mL种子培养基的摇瓶中继续培养24h。将扩大后的种子液接种至15L发酵罐(含生产培养基8L)，在30℃、转速200rpm/min，pH7.0，连续发酵7天。所述孢子为任意可以生产平板霉素和平板素菌株的孢子，优选为普拉特链霉菌SB12026的孢子。

所述种子培养基配方同实例2所述种子培养基。

生产培养基配方：糊精1-4％，乳糖1-4％，酵母粉0.1-0.5％，碳酸钙0.1-1.0％，3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)0.5-2.0％，消泡剂0.1-1.0％，pH7.0。

实施例4在150L发酵罐中的发酵工艺

25ul孢子(约10⁸)接种至有500mL种子培养基A的2500mL摇瓶中进行种子培养，30℃，220rpm培养48小时后，继续转接至含7L种子培养基B的发酵罐中继续培养24h。将扩大后的种子液接种至150L发酵罐(含生产培养基80L)，在30℃、转速200rpm/min下连续发酵7天。所述孢子为任意可以生产平板霉素和平板素菌株的孢子，优选为普拉特链霉菌SB12026的孢子。

所述种子培养基B配方：酵母粉0.1-1.5％，麦芽提取物(购于上海生工)1-5％，葡萄糖2-5％，硫酸镁0.01-0.2％，氯化铁0.01-0.1％，消泡剂0.05-0.5％，pH7.0。

所述生产培养基配方同实例2中生产培养基。

实施例3和4证明，本发明的发酵工艺已经成功小试，具有工业应用前景。

实施例5平板霉素和平板素的分离纯化工艺

平板霉素和平板素的吸附：分别将发酵产物通过板框式过滤器(150L发酵罐发酵)或落地式高速离心机(15L发酵罐发酵)，将发酵液与菌丝体分离后，向发酵液中投入XAD-16型大孔吸附树脂，投入质量：3％。机械搅拌混合均匀，转速50-200rpm，每次混合3-8小时。吸附完成后，静置发酵液，将发酵液和大孔吸附树脂分开，树脂用大量自来水漂洗干净，晾干。所述发酵产物为任意可以生产平板霉素和平板素菌株通过现有发酵方法或者是实施例2-4之一的发酵方法发酵后的产物，优选普拉特链霉菌SB12026、SB12027或者SB12028中的任意一种通过实施例2-4之一的发酵方法发酵后的产物。

平板霉素和平板素的分离纯化：称取100g吸附了目标产物的树脂，用无水乙醇反复浸提3次，每次500ml，每次浸提时长2h，使目标产物溶解于乙醇中。合并浸提后的乙醇，旋转蒸干至剩余少量溶液，加入15g硅胶填料，拌匀，待乙醇蒸干后填至硅胶柱顶端。用体积比7:3的丙酮:正己烷洗脱，冲洗体积1000ml。收集柱后流分，根据TLC和HPLC将组成相似的组份合并、蒸干，得到含有平板霉素和平板素的粗品。

将蒸干后含有平板霉素和平板素的粗品用5ml丙酮溶解，加入10g聚酰胺粉，拌匀，待乙醇蒸干后填至聚酰胺柱顶端。分别用用2倍柱体积、pH为7的10mM 3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液，1倍柱体积的、pH为7的10mmol3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液:乙醇＝9：1(体积比)，用1倍柱体积、pH为7的10mM 3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液:乙醇＝5：5(体积比)，用1倍柱体积、pH为7的10mM缓冲液:乙醇＝2：8(体积比)，和用1倍柱体积的乙醇冲洗聚酰胺柱，收集柱后流份。通过TLC和HPLC检测柱后流份，合并含有平板霉素和或平板素的组分，蒸干剩余少量溶液。真空冷冻干燥，分别得到平板霉素或平板素纯品，纯度均在95％以上，见图8-9。

Claims

1.平板霉素和平板素的高产工程菌株，其特征是，所述工程菌株为普拉特链霉菌 SB12026，其保藏编号为CCTCC M 2014286。

2.平板霉素和平板素的高产工程菌株，其特征是，所述工程菌株为普拉特链霉菌 SB12027，其保藏编号为CCTCC M 2014287。

3.平板霉素和平板素的高产工程菌株，其特征是，所述工程菌株为普拉特链霉菌 SB12028，其保藏编号为CCTCC M 2014288。

4.用权利要求1-3之一所述工程菌株生产平板霉素和平板素的发酵工艺，其特征是，将权利要求1-3之一所述工程菌株的孢子按照体积比0.01‰-0.1‰的接种量分别接种至种子培养基中，在25℃～32℃、200rpm～250rpm恒温摇床培养24h～60h；然后再按照体积比1%～20%的接种量转接于生产培养基中，在25℃～32℃、200rpm～250rpm恒温摇床培养5～10天；

所述种子培养基的质量百分比配方为：酵母粉 1%～2%，麦芽提取物0.5%～1.2%，葡萄糖 2%～3%，硫酸镁0.025%～0.04%，六水三氯化铁0.025%～0.04%，其余为水，pH6.5～7.5；

所述生产培养基的质量百分比配方为：糊精,1%～6%，乳糖1%～6%，酵母粉 0.1%～0.8%，碳酸钙0.08%～0.13%，3-（N-吗啉基）丙磺酸0.3%～2%，消泡剂0-1.0%，其余为水，pH 6.5～7.5。

5.平板霉素和平板素的分离和纯化工艺，其特征是，包括以下步骤：

（1）吸附：将生产平板霉素和平板素的工程菌株的发酵培养后的发酵产物过滤，将发酵液与菌丝体分离，然后向发酵液中投入占发酵液质量为3%-10%的大孔吸附树脂，搅拌混合3-8小时，吸附完成后，静置发酵液，过滤，将发酵液和大孔吸附树脂分开，水洗大孔吸附树脂后晾干；

（2）分离纯化：将所述大孔吸附树脂用乙醇浸提，得提取液；将所述提取液旋转蒸干，填充于硅胶柱中，用体积比为6-8:3的丙酮:正己烷溶液洗脱，收集洗脱液，蒸干，得到含有平板霉素和平板素的粗品；再将所述含有平板霉素和平板素的粗品用丙酮溶解，加入聚酰胺粉末，拌匀，加入干净的聚酰胺柱上部，分别用1-2倍柱体积、pH为7的1 mM-12 mM 3-（N-吗啉基）丙磺酸或磷酸盐缓冲液，1-2倍柱体积、pH为7的1 mM-12 mM 3-（N-吗啉基）丙磺酸缓冲液或磷酸盐:乙醇=8-9:1的溶液，1-2倍柱体积、pH为7的1 mM-12 mM 3-（N-吗啉基）丙磺酸或磷酸盐缓冲液:乙醇溶液=4-5:5的溶液，1-2倍柱体积、pH为7的1 mM-12 mM 3-（N-吗啉基）丙磺酸或磷酸盐缓冲液:乙醇=2:7-8的溶液，和1-2倍柱体积的乙醇溶液冲洗聚酰胺柱，收集柱后流份；通过薄层色谱和高效液相色谱检测柱后流份，分别合并含有平板霉素或平板素的组分，干燥，分别得到平板霉素和平板素产品。

6.根据权利要求5所述平板霉素和平板素的分离和纯化工艺，其特征是，步骤（1）所述发酵产物为权利要求4所述工艺发酵后的产物。