CN111285828A - 化合物proximicin及其制备方法和应用 - Google Patents

化合物proximicin及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111285828A
CN111285828A CN202010165365.5A CN202010165365A CN111285828A CN 111285828 A CN111285828 A CN 111285828A CN 202010165365 A CN202010165365 A CN 202010165365A CN 111285828 A CN111285828 A CN 111285828A
Authority
CN
China
Prior art keywords
methanol
chloroform
proximicin
scsio40062
verrucosispora
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010165365.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111285828B (zh
Inventor
张长生
方春艳
张庆波
朱义广
张丽萍
张文军
马亮
张海波
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Original Assignee
South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China Sea Institute of Oceanology of CAS filed Critical South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority to CN202010165365.5A priority Critical patent/CN111285828B/zh
Publication of CN111285828A publication Critical patent/CN111285828A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111285828B publication Critical patent/CN111285828B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D307/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D307/56—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D307/68—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/16—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing two or more hetero rings
    • C12P17/162—Heterorings having oxygen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. Lasalocid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01034—Pantetheine kinase (2.7.1.34)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了化合物proximicin及其制备方法和应用。本发明构建了重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139，通过过量表达PPtase的方法增强了野生菌Verrucosispora sp.SCSIO 40062中的proximicin基因簇的表达，并从重组菌株的AM6‑4和AM6培养基发酵粗提物中分离得到了新的proximicin类化合物proximicin F(1)，diproximicin A(2)和proximicin G(3)。

Description

化合物proximicin及其制备方法和应用
技术领域：
本发明属于工业微生物领域，具体涉及新化合物proximicin F(1)，diproximicinA(2)和proximicin G(3)及其制备方法和应用。
背景技术：
Proximicins是一类氨基呋喃类化合物，已报导的有proximicinsA-E，具有良好的抗肿瘤和抗结核活性。过表达PPtase是一种新的沉默次级代谢基因簇激活方法，本研究拟通过在野生菌Verrucosispora sp.SCSIO 40062中过表达PPtase来激活沉默基因簇，获得新的proximicin类化合物。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供3个新的氨基呋喃类化合物proximicin F(1)，diproximicin A(2)和proximicin G(3)，其结构如式(I)所示：
Figure BDA0002407254150000011
本发明的第二个目的是提供一种重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139，其保藏编号为：GDMCC No.60976。
本发明的第三个目的是提供一种上述化合物proximicin F，diproximicin A和proximicin G的制备方法，化合物proximicin F和diproximicin A是从所述的重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139的AM6-4培养基发酵培养物中分离得到的；而化合物proximicin G是从所述的重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139的AM6培养基发酵培养物中分离得到的。
优选，具体步骤为：将重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139分别用AM6-4和AM6培养基发酵培养，获得发酵培养物，离心分离分别收集发酵液和菌丝体，发酵液用大孔树脂XAD-16吸附，然后用丙酮洗脱；菌丝体用甲醇浸提并超声破碎细胞，两者回收有机溶剂后剩余的水相用乙酸乙酯萃取，减压浓缩至干，分别得到重组菌株Verrucosisporasp.SCSIO 40062/pIB139的AM6-4培养基粗提物EX1和AM6培养基粗提物EX2；将粗提物EX1经正相硅胶柱层析分离，用氯仿/甲醇作为洗脱剂从氯仿、氯仿/甲醇4:1、氯仿/甲醇2:1、甲醇，v/v进行梯度洗脱，依次得到流份Fr1-Fr4，将氯仿/甲醇2:1，v/v洗脱的流份Fr3用凝胶柱层析，以氯仿/甲醇1:1，v/v为洗脱剂进行分离，洗脱流份经纯化得到化合物proximicinF和diproximicin A；将粗提物EX2经正相硅胶柱层析分离，用氯仿/甲醇作为洗脱剂从氯仿、氯仿/甲醇4:1、氯仿/甲醇2:1、甲醇，v/v进行梯度洗脱，依次得到流份Fr1-Fr4，将氯仿/甲醇4:1，v/v洗脱的流份Fr2和氯仿/甲醇2:1，v/v洗脱的流份Fr3合并后用凝胶柱层析进行分离，洗脱流份经纯化得到化合物proximicin G。
优选，重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139的发酵培养方法为：将活化的重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139接入放线菌一号培养基中，28℃，200rpm培养4d后得到种子液；将种子液以10％，v/v的接种量分别接入AM6-4和AM6发酵培养基中，28℃，200rpm培养5-7d后得到发酵培养物；
每升放线菌一号培养基：可溶性淀粉10g，酵母浸膏4g，细菌学蛋白胨2g，海盐30g，加纯净水至1L，pH7.2-7.4；
每升AM6-4培养基：甘油10g，细菌学蛋白胨5g，甘氨酸0.1g，L-丙氨酸0.1g，异亮氨酸0.1g，CaCO3 5g，海盐30g，加纯净水至1L，pH7.0；
每升AM6培养基：可溶性淀粉20g，葡萄糖10g，细菌学蛋白胨5g，酵母浸膏5g，CaCO35g，海盐30g，加纯净水至1L，pH7.0。
本发明的第四个目的是提供proximicin G在制备抗菌药物中的应用。
所述的抗菌药物是抗枯草芽孢杆菌的药物。
本发明的第五个目的是提供重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139在制备化合物proximicin F，diproximicin A和/或proximicin G中的应用。
本发明构建了重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139，通过过量表达PPtase的方法增强了野生菌Verrucosispora sp.SCSIO 40062中的proximicin基因簇的表达，并从重组菌株的AM6-4和AM6培养基发酵粗提物中分离得到了新的proximicin类化合物proximicin F(1)，diproximicin A(2)和proximicin G(3)。
本发明的重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139，于2020年3月10日保藏于广东省微生物研究所菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号，保藏编号：GDMCC No.60976。
本发明中包含2个磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(PPtase)编码基因(ermE*p-sfp-svp)的质粒pIB139公开于文献：Benying Zhang,Wenya Tian,Shuwen Wang,Xiaoli Yan,Xinying Jia,Gregory Pierens,Wenqing Chen,Hongmin Ma,Zixin Deng,and XudongQu.Activation of Natural Products Biosynthetic Pathways via a ProteinModification Level Regulation.ACS Chemical Biology,2017,12(7):1732-1736。
附图说明：
图1是重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139的AM6-4培养基发酵提取物的高效液相色谱图及化合物1和2的结构
高效液相色谱(HPLC)条件：色谱柱为Phenomenex Luna C18,150mm×4.6mm,5μm；流动相包括A相和B相，A相：10％乙腈/水(v/v)+0.1％的甲酸(v/v)，B相：90％的乙腈/水(v/v)；进样程序：5％B-80％B(0-20min)，80％B-100％B(20-21min)，100％B(21-25min)，100％B-5％B(25-26min)，5％B(26-30min)，检测波长280nm，流速1mL·min-1，其中1代表化合物1，2代表化合物2。
图2是重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139的AM6培养基发酵提取物的高效液相色谱图及化合物3的结构
高效液相色谱(HPLC)条件：色谱柱为Phenomenex Luna C18,150mm×4.6mm,5μm；流动相包括A相和B相，A相：10％乙腈/水(v/v)+0.1％的甲酸(v/v)，B相：90％的乙腈/水(v/v)；进样程序：5％B-80％B(0-20min)，80％B-100％B(20-21min)，100％B(21-25min)，100％B-5％B(25-26min)，5％B(26-30min)，检测波长280nm，流速1mL·min-1，其中3代表化合物3。
图3是化合物1的HRESIMS谱图
图4是化合物1的1H-NMR谱图
图5是化合物1的13C-NMR谱图
图6是化合物1的DEPT135谱图
图7是化合物1的HSQC谱图
图8是化合物1的COSY谱图
图9是化合物1的HMBC谱图
图10是化合物1的NOESY谱图
图11是化合物2的HRESIMS谱图
图12是化合物2的1H-NMR谱图
图13是化合物2的13C-NMR谱图
图14是化合物2的DEPT135谱图
图15是化合物2的HSQC谱图
图16是化合物2的COSY谱图
图17是化合物2的HMBC谱图
图18是化合物2的NOESY谱图
图19是化合物3的HRESIMS谱图
图20是化合物3的1H-NMR谱图
图21是化合物3的13C-NMR谱图
图22是化合物3的DEPT135谱图
图23是化合物3的HSQC谱图
图24是化合物3的COSY谱图
图25是化合物3的HMBC谱图
图26是化合物3的NOESY谱图
具体实施方式：
以下实施实例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
1.质粒pIB139导入到疣孢菌Verrucosispora sp.SCSIO 40062中
通过三亲本接合转移的方法将质粒pIB139导入到疣孢菌Verrucosisporasp.SCSIO 40062中，得到重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139。对比野生菌与重组菌株在不同培养基中的发酵检测图，发现重组菌株在AM6-4培养基中新化合物1和2的产量增加(图1),经HRESIMS和NMR数据分析，确认了2个新化合物proximicin F(1)(图3-10)和diproximicin A(2)(图11-18)的结构；重组菌株在AM6培养基中除产生已知化合物proximicin C和proximicin B外，还产生了新化合物3(图2)，经HRESIMS和NMR数据分析，确认了新化合物proximicin G(3)(图19-26)的结构。
以下进一步提供实施实例，这些实施实例有助于理解本发明，仅用作说明而不是对本发明的限制。
实施例1：重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139的构建
通过三亲本接合转移的方法将质粒pIB139导入到疣孢菌Verrucosisporasp.SCSIO 40062中，接合转移过程具体说明如下：疣孢菌Verrucosispora sp.SCSIO 40062在ISP4培养基平板上划线培养20-30d后，刮取适量的菌丝体接种于50mL放线菌一号液体培养基中，28℃摇床200rpm培养至对数生长期后，取5mL菌体转接到新的50mL放线菌一号液体培养基中，28℃摇床200rpm培养至对数生长期，3900rpm离心10min收集菌体，用30mL放线菌一号培养基清洗菌体2次，重悬于2mL放线菌一号培养基中，作为接合转移的受体菌。将供体菌E.coliDH5α/pIB139接种于5mL LB液体培养基中(含50μg·mL-1阿泊拉霉素)，同时将助体菌E.coli ET12567/pUB307接种于5mL LB液体培养基中(含50μg·mL-1卡那霉素和50μg·mL-1氯霉素)，37℃摇床200rpm过夜培养。然后取100μL过夜培养的E.coli DH5α/pIB139和E.coli ET12567/pUB307转接到10mL LB液体培养基中(含50μg·mL-1阿泊拉霉素-针对供体菌的LB液体培养基，或含50μg·mL-1卡那霉素和50μg·mL-1氯霉素-针对助体菌的LB培养基)，37℃摇床200rpm培养3-4h至OD600值约为0.6，3900rpm离心10min收集2种菌体，用30mL无抗的LB液体培养基清洗2次，分别悬浮于中250μL LB液体培养基中。最后将250μL供体菌、250μL助体菌和500μL受体菌混匀，涂布于Mg2+终浓度为20mM的ISP4培养基无抗固体平板上，吹干，28℃培养箱倒置培养16-20h。将平板取出，用含抗生素的水(含50μg·mL-1阿泊拉霉素和100μg·mL-1甲氧苄啶)覆盖平板，吹干后置于28℃培养箱倒置培养20-30d。待接合子长出后，划线到ISP4培养基固体平板上(含50μg·mL-1阿泊拉霉素和100μg·mL-1甲氧苄啶)即可获得重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139，其保藏编号是：GDMCC No.60976。
实施例2：proximicin类化合物的发酵和制备
1.放大发酵培养
将重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139在ISP4培养基固体平板上(含50μg·mL-1阿泊拉霉素和100μg·mL-1甲氧苄啶)上活化后，刮取适量菌丝体接种到50mL放线菌一号培养基中，28℃摇床200rpm培养4d后得到种子液；将种子液以10％，v/v的接种量分别接入200mL AM6-4和200mL AM6发酵培养基(共15L)中，28℃摇床200rpm培养5-7d后得到发酵培养物。
放线菌一号培养基：可溶性淀粉10g，酵母浸膏4g，细菌学蛋白胨2g，海盐30g，加纯净水至1L，pH7.2-7.4，混合后灭菌即得。
AM6-4培养基：甘油10g，细菌学蛋白胨5g，甘氨酸0.1g，L-丙氨酸0.1g，异亮氨酸0.1g，CaCO3 5g，海盐30g，加纯净水至1L，pH7.0，混合后灭菌即得。
AM6培养基：可溶性淀粉20g，葡萄糖10g，细菌学蛋白胨5g，酵母浸膏5g，CaCO35g，海盐30g，加纯净水至1L，pH7.0，混合后灭菌即得。
2.发酵液的萃取
发酵培养物3900rpm离心20min后分别收集发酵液和菌丝体。发酵液用2L大孔树脂XAD-16吸附，然后用15L丙酮洗脱；菌丝体用1L甲醇浸提3次，每次超声破碎细胞1h。然后用旋转蒸发仪回收两部分中的有机溶剂，剩余的水相合并后用1L乙酸乙酯萃取10次，旋转蒸发仪回收乙酸乙酯后得到粗提物，由此分别得到重组菌株Verrucosisporasp.SCSIO40062/pIB139的AM6-4培养基粗提物EX1和AM6培养基粗提物EX2。
3.化合物的分离
将重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139的AM6-4培养基粗提物EX1(30g)用氯仿甲醇(体积比1:1)溶解，加入60mL 100-200目硅胶旋蒸拌样，以拌样硅胶(60mL)/分离硅胶(180mL)1:3干法装柱，用氯仿/甲醇作为洗脱剂进行梯度洗脱(氯仿、氯仿/甲醇4:1、氯仿/甲醇2:1、甲醇，v/v)，依次得到流份Fr1-Fr4。将流份Fr3(氯仿/甲醇2:1洗脱流份)用Sephadex LH-20凝胶柱层析(120cm×3cm，氯仿/甲醇1:1，v/v)进行分离，每10mL接收一瓶，根据TLC检测结果将流份合并得到流份Fr3-1到Fr3-5。将流份Fr3-4(第29-42瓶，1.5g)再次用3mL100-200目硅胶旋蒸拌样，以拌样硅胶(3mL)/分离硅胶(30mL)1:10干法装柱，用氯仿/甲醇作为洗脱剂进行梯度洗脱(氯仿、氯仿/甲醇20:1、氯仿/甲醇15:1、氯仿/甲醇10:1，甲醇，v/v)，依次得到流份Fr3-4-1到Fr3-4-5。将流份Fr3-4-3(氯仿/甲醇15:1洗脱流份)采用半制备高效液相色谱(Phenomenex Luna C18，250mm×10.0mm，5μm；A相为水，B相为乙腈，20％的B相等度洗脱；流速为2.5mL·min-1；检测波长为280nm)纯化得到化合物proximicin F(1)(Rt＝8.0min)。将流份Fr3-3(第20-28瓶)采用半制备高效液相色谱(Phenomenex Luna C18，250mm×10.0mm，5μm；A相为水，B相为乙腈，30％的B相等度洗脱；流速为2.5mL·min-1；检测波长为280nm)纯化得到化合物diproximicinA(2)(Rt＝12.0min)。
将重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139的AM6培养基粗提物EX2(6g)用氯仿甲醇(体积比1:1)溶解，加入12mL 100-200目硅胶旋蒸拌样，以拌样硅胶(12mL)/分离硅胶(36mL)1:3干法装柱，用氯仿/甲醇作为洗脱剂进行梯度洗脱(氯仿、氯仿/甲醇4:1、氯仿/甲醇2:1、甲醇，v/v)，依次得到流份Fr1-Fr4。将流份Fr2和Fr3(氯仿/甲醇4:1、氯仿/甲醇2:1洗脱流份)合并用Sephadex LH-20凝胶柱层析(120cm×3cm，氯仿/甲醇1:1，v/v)进行分离，每10mL接受一瓶，根据TLC检测结果将流份合并得到流份Fr2-1到Fr2-7。将流份Fr2-5(第35-56瓶)经中压反相色谱(YMC*GEL ODS-A-HG，12nm S-50μm)用A相/B相＝水/乙腈(v/v)根据以下程序进行洗脱：10％B(0-30min)，10％B-20％B(30-50min)，20％B(50-80min)，20％B-30％B(80-100min)，30％B(100-145min)，30％B-40％B(145-165min)，40％B(165-210min)，40％B-90％B(210-230min)，90％B(230-260min)，依次得到流份Fr2-5-1到Fr2-5-9。将流份Fr2-5-7(40％B(165-210min)洗脱流份)采用半制备高效液相色谱(Phenomenex Luna C18，250mm×10.0mm，5μm；A相为水，B相为乙腈，45％的B相等度洗脱；流速为2.5mL·min-1；检测波长为280nm)纯化得到化合物proximicinG(3)(Rt＝16.0min)。
4.化合物的结构鉴定
化合物1-3的结构根据HRESIMS、1H-NMR、13C-NMR、DEPT135、HSQC、COSY、HMBC和NOESY谱图进行鉴定，其核磁数据归属见表1。化合物proximicin F(1)的谱图见图3-10，diproximicin A(2)的谱图见图11-18，proximicin G(3)的谱图见图19-26。
由此确定化合物1-3的结构式如下所示：
Figure BDA0002407254150000071
表1化合物1-3的1H-NMR(700MHz)和13C-NMR(175MHz)核磁数据(DMSO-d6)
Figure BDA0002407254150000081
a对称碳和氢的化学位移值一致
实施例3：化合物1-3的抗菌活性测定
采用微量培养基稀释法测定了化合物1-3对4种指示菌Staphylococcus aureusATCC29213，methicillin-resistant Staphylococcus aureus shhs-A1(临床样品)，Micrococcus luteus SCSIO ML01和Bacillus subtilis 1064的抑制活性。4种指示菌用MH培养基37℃摇床200rpm培养16h后，用无菌MH培养基稀释到OD600值约为为0.04-0.06，再稀释10倍加入到96孔板中；加入样品后，等倍稀释到样品终浓度为64-0.125μg·mL-1，每个浓度3个平行；37℃静置培养18h，用酶标仪测定各孔的在波长600nm处的吸光值，并计算各化合物的最小抑菌浓度(MIC)，抑制率(％)＝(1-(A样品-A样品背景)/(A阴性对照-A空白对照))×100％，抑制率>80％时的样品浓度为MIC值，其结果见表2。
表2化合物1-3的抗菌活性
Figure BDA0002407254150000091
实施例4：化合物1-2的抗肿瘤活性测定
采用SRB法测定了化合物1-2对4种肿瘤细胞株SF-268，MCF-7，HepG-2和A549的抑制活性。4种肿瘤细胞株用RPMI培养基培养，将180μL培养物(浓度为3×104个细胞·mL-1)加入到96孔板中，37℃ 5％CO2培养18h；将20μL的待测样品(终浓度等倍稀释为128-1μM，溶剂为DMSO)加入到96孔板相应的孔中，用DMSO作为阴性对照，每个浓度做3个平行，继续培养72h；加入50μL 50％的三氯乙酸混合，再加入0.4％的SRB(溶解在1％的乙酸中)放置30min；去除上清，将与染料结合的蛋白溶解200μL10 mM的Tris缓冲液中，用酶标仪测定各孔的OD570值，并计算相应的抑制率；以顺铂作为阳性对照。采用SigmaPlot 14.0软件中非线性曲线拟合(non-linear curve-fitting)的方法计算相应的IC50，其结果见表3。
表3化合物1-2的抗肿瘤活性
Figure BDA0002407254150000092

Claims (8)

1.化合物proximicin F，diproximicin A和proximicin G中的任一化合物，其结构如式(I)所示：
Figure FDA0002407254140000011
2.一种重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139，其保藏编号为：GDMCCNo.60976。
3.一种权利要求1所述化合物proximicin F，diproximicin A和proximicin G的制备方法，其特征在于，化合物proximicin F和diproximicin A是从权利要求2所述的重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139的AM6-4培养基发酵培养物中分离得到的；而化合物proximicin G是从权利要求2所述的重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139的AM6培养基发酵培养物中分离得到的。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，具体步骤为：将重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139分别用AM6-4和AM6培养基发酵培养，获得发酵培养物，离心分离分别收集发酵液和菌丝体，发酵液用大孔树脂XAD-16吸附，然后用丙酮洗脱；菌丝体用甲醇浸提并超声破碎细胞，两者回收有机溶剂后剩余的水相用乙酸乙酯萃取，减压浓缩至干，分别得到重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139的AM6-4培养基粗提物EX1和AM6培养基粗提物EX2；将粗提物EX1经正相硅胶柱层析分离，用氯仿/甲醇作为洗脱剂从氯仿、氯仿/甲醇4:1、氯仿/甲醇2:1、甲醇，v/v进行梯度洗脱，依次得到流份Fr1-Fr4，将氯仿/甲醇2:1，v/v洗脱的流份Fr3用凝胶柱层析，以氯仿/甲醇1:1，v/v为洗脱剂进行分离，洗脱流份经纯化得到化合物proximicin F和diproximicin A；将粗提物EX2经正相硅胶柱层析分离，用氯仿/甲醇作为洗脱剂从氯仿、氯仿/甲醇4:1、氯仿/甲醇2:1、甲醇，v/v进行梯度洗脱，依次得到流份Fr1-Fr4，将氯仿/甲醇4:1，v/v洗脱的流份Fr2和氯仿/甲醇2:1，v/v洗脱的流份Fr3合并后用凝胶柱层析进行分离，洗脱流份经纯化得到化合物proximicin G。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO40062/pIB139的发酵培养方法为：将活化的重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139接入放线菌一号培养基中，28℃，200rpm培养4d后得到种子液；将种子液以10％，v/v的接种量分别接入AM6-4和AM6发酵培养基中，28℃，200rpm培养5-7d后得到发酵培养物；
每升放线菌一号培养基：可溶性淀粉10g，酵母浸膏4g，细菌学蛋白胨2g，海盐30g，加纯净水至1L，pH7.2-7.4；
每升AM6-4培养基：甘油10g，细菌学蛋白胨5g，甘氨酸0.1g，L-丙氨酸0.1g，异亮氨酸0.1g，CaCO3 5g，海盐30g，加纯净水至1L，pH7.0；
每升AM6培养基：可溶性淀粉20g，葡萄糖10g，细菌学蛋白胨5g，酵母浸膏5g，CaCO3 5g，海盐30g，加纯净水至1L，pH7.0。
6.权利要求1中的proximicin G在制备抗菌药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的抗菌药物是抗枯草芽孢杆菌的药物。
8.权利要求2所述的重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139在制备权利要求1中的化合物proximicin F，diproximicin A和/或proximicin G中的应用。
CN202010165365.5A 2020-03-11 2020-03-11 化合物proximicin及其制备方法和应用 Active CN111285828B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010165365.5A CN111285828B (zh) 2020-03-11 2020-03-11 化合物proximicin及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010165365.5A CN111285828B (zh) 2020-03-11 2020-03-11 化合物proximicin及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111285828A true CN111285828A (zh) 2020-06-16
CN111285828B CN111285828B (zh) 2022-02-18

Family

ID=71023750

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010165365.5A Active CN111285828B (zh) 2020-03-11 2020-03-11 化合物proximicin及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111285828B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014057436A2 (en) * 2012-10-10 2014-04-17 Adamed Sp. Z O.O. Anticancer conjugate
CN106497981A (zh) * 2016-10-31 2017-03-15 广东省微生物研究所 一种激活微生物隐性次级代谢产物生物合成基因簇表达的方法
CN109988129A (zh) * 2019-04-29 2019-07-09 中国科学院微生物研究所 化合物及其在制备抗结核药物中的应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014057436A2 (en) * 2012-10-10 2014-04-17 Adamed Sp. Z O.O. Anticancer conjugate
CN106497981A (zh) * 2016-10-31 2017-03-15 广东省微生物研究所 一种激活微生物隐性次级代谢产物生物合成基因簇表达的方法
CN109988129A (zh) * 2019-04-29 2019-07-09 中国科学院微生物研究所 化合物及其在制备抗结核药物中的应用

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALEXANDER DENISIUK 等: "Conformational investigation of antibiotic proximicin by X-ray structure analysis and quantum studies suggest a stretched conformation of this type of γ-peptide", 《BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY》 *
BENYIN ZHANG等: "Activation of natural products biosynthetic pathways via a protein modification level regulation", 《ACS CHEM. BIOL.》 *
CHUNYAN FANG 等: "Proximicins F and G and diproximicin A: aminofurans from the marine-derived Verrucosispora sp.SCSIO 40062 by overexpression of PPtase genes", 《JOURNAL OF NATURAL PRODUCTS》 *
HANS-PETER FIEDLER等: "Proximicins A, B, and C,novel aminofuran antibiotic and anticancer compounds isolated from marine strains of the actinomycete Verrucosispora", 《J. ANTIBIOT.》 *
KATHRIN SCHNEIDER 等: "Proximicins A, B, and C-antitumor furan analogues of netropsin from the marine actinomycete Verrucosispora induce upregulation of p53 and the cyclin kinase inhibitor p21", 《ANGEW. CHEM. INT. ED.》 *
吴云丹 等: "疣孢菌FIM090395细胞毒活性次级代谢产物的研究", 《中国抗生素杂志》 *
林如等: "新的抗肿瘤萜类化合物产生菌FIM06-0031的分离鉴别", 《海峡药学》 *
焦晓臻等: "4-叔丁氧羰酰胺基-呋喃-2-甲酸甲酯的合成", 《合成化学》 *
马艳玲等: "海洋放线菌(Salinispora arenicola)基因转移系统的建立", 《中国酿造》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111285828B (zh) 2022-02-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108660082B (zh) 一种海洋曲霉来源氧杂蒽醌类化合物及其制备方法和在制备抗菌剂中的应用
CN111303247B (zh) 海洋环肽化合物及其在制备抗结核分枝杆菌药物中的应用
CN109020943B (zh) 一种抗结核聚酮类化合物及其制备方法和用途
CN108299467B (zh) 具有细胞毒活性的吲哚咔唑类生物碱及制备方法、用途
CN111253408B (zh) 抗生素pactamide G及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用
CN115109023B (zh) 大环内酯类化合物fwyz52-a、其发酵菌株、发酵方法及应用
CN109810919B (zh) 一类安莎全碳环聚酮类抗生素及其在制备抗菌药物或抗肿瘤药物中的应用
CN111285828B (zh) 化合物proximicin及其制备方法和应用
CN108374028B (zh) 一种利用化学表观遗传修饰提高海洋真菌中azaphilone类化合物产量的方法
CN115850354A (zh) 一种聚酮类化合物efrotomycin及其制备方法和应用
CN111808112B (zh) 一种Pratensilin D化合物及其制备和应用
CN111170975B (zh) 抗生素lobophorin及其制备方法和应用
CN110872338B (zh) 一种吲哚二萜类化合物及其制备方法和用途
CN114907367A (zh) 大环内酯类化合物fw-z、其发酵菌株、发酵方法及应用
CN110092758B (zh) 一种新型生物碱化合物及发酵制备该化合物的疣孢菌株
DK143570B (da) Fremgangsmaade til fremstilling af maytansinol maytanacin og eller maytansinolpropionat
CN109762046B (zh) 环肽类抗生素及其制备方法和在制备抗结核分枝杆菌药物中的应用
CN108949610B (zh) 一种链霉菌和以链霉菌产生的angucycline类化合物及其制备与应用
CN107973803B (zh) 一种七元内酯并呋喃衍生物及其制备方法和应用
CN109837318B (zh) 一种链霉菌制备天赐霉素-a及其衍生物的发酵工艺
CN112680394A (zh) 一种提高天然产物生物合成量的方法
CN111892574A (zh) 一类非典型角环素类化合物及其制备方法和应用
CN111807946A (zh) 一种Pratensinon A化合物及其制备和应用
CN116874417B (zh) 一种吡啶类生物碱及其在抗肿瘤药物制备中的应用
CN115466241B (zh) 抗幽门螺旋杆菌活性的化合物及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: No.1119 Haibin Road, Nansha District, Guangzhou City, Guangdong Province

Applicant after: SOUTH CHINA SEA INSTITUTE OF OCEANOLOGY, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES

Address before: 510301 No. 164 West Xingang Road, Guangzhou, Guangdong, Haizhuqu District

Applicant before: SOUTH CHINA SEA INSTITUTE OF OCEANOLOGY, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES

CB02 Change of applicant information
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant