CN111285828A - 化合物proximicin及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了化合物proximicin及其制备方法和应用。本发明构建了重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139,通过过量表达PPtase的方法增强了野生菌Verrucosispora sp.SCSIO 40062中的proximicin基因簇的表达,并从重组菌株的AM6‑4和AM6培养基发酵粗提物中分离得到了新的proximicin类化合物proximicin F(1),diproximicin A(2)和proximicin G(3)。
Description
技术领域:
本发明属于工业微生物领域,具体涉及新化合物proximicin F(1),diproximicinA(2)和proximicin G(3)及其制备方法和应用。
背景技术:
Proximicins是一类氨基呋喃类化合物,已报导的有proximicinsA-E,具有良好的抗肿瘤和抗结核活性。过表达PPtase是一种新的沉默次级代谢基因簇激活方法,本研究拟通过在野生菌Verrucosispora sp.SCSIO 40062中过表达PPtase来激活沉默基因簇,获得新的proximicin类化合物。
发明内容:
本发明的第一个目的是提供3个新的氨基呋喃类化合物proximicin F(1),diproximicin A(2)和proximicin G(3),其结构如式(I)所示:
本发明的第二个目的是提供一种重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139,其保藏编号为:GDMCC No.60976。
本发明的第三个目的是提供一种上述化合物proximicin F,diproximicin A和proximicin G的制备方法,化合物proximicin F和diproximicin A是从所述的重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139的AM6-4培养基发酵培养物中分离得到的;而化合物proximicin G是从所述的重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139的AM6培养基发酵培养物中分离得到的。
优选,具体步骤为:将重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139分别用AM6-4和AM6培养基发酵培养,获得发酵培养物,离心分离分别收集发酵液和菌丝体,发酵液用大孔树脂XAD-16吸附,然后用丙酮洗脱;菌丝体用甲醇浸提并超声破碎细胞,两者回收有机溶剂后剩余的水相用乙酸乙酯萃取,减压浓缩至干,分别得到重组菌株Verrucosisporasp.SCSIO 40062/pIB139的AM6-4培养基粗提物EX1和AM6培养基粗提物EX2;将粗提物EX1经正相硅胶柱层析分离,用氯仿/甲醇作为洗脱剂从氯仿、氯仿/甲醇4:1、氯仿/甲醇2:1、甲醇,v/v进行梯度洗脱,依次得到流份Fr1-Fr4,将氯仿/甲醇2:1,v/v洗脱的流份Fr3用凝胶柱层析,以氯仿/甲醇1:1,v/v为洗脱剂进行分离,洗脱流份经纯化得到化合物proximicinF和diproximicin A;将粗提物EX2经正相硅胶柱层析分离,用氯仿/甲醇作为洗脱剂从氯仿、氯仿/甲醇4:1、氯仿/甲醇2:1、甲醇,v/v进行梯度洗脱,依次得到流份Fr1-Fr4,将氯仿/甲醇4:1,v/v洗脱的流份Fr2和氯仿/甲醇2:1,v/v洗脱的流份Fr3合并后用凝胶柱层析进行分离,洗脱流份经纯化得到化合物proximicin G。
优选,重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139的发酵培养方法为:将活化的重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139接入放线菌一号培养基中,28℃,200rpm培养4d后得到种子液;将种子液以10%,v/v的接种量分别接入AM6-4和AM6发酵培养基中,28℃,200rpm培养5-7d后得到发酵培养物;
每升放线菌一号培养基:可溶性淀粉10g,酵母浸膏4g,细菌学蛋白胨2g,海盐30g,加纯净水至1L,pH7.2-7.4;
每升AM6-4培养基:甘油10g,细菌学蛋白胨5g,甘氨酸0.1g,L-丙氨酸0.1g,异亮氨酸0.1g,CaCO3 5g,海盐30g,加纯净水至1L,pH7.0;
每升AM6培养基:可溶性淀粉20g,葡萄糖10g,细菌学蛋白胨5g,酵母浸膏5g,CaCO35g,海盐30g,加纯净水至1L,pH7.0。
本发明的第四个目的是提供proximicin G在制备抗菌药物中的应用。
所述的抗菌药物是抗枯草芽孢杆菌的药物。
本发明的第五个目的是提供重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139在制备化合物proximicin F,diproximicin A和/或proximicin G中的应用。
本发明构建了重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139,通过过量表达PPtase的方法增强了野生菌Verrucosispora sp.SCSIO 40062中的proximicin基因簇的表达,并从重组菌株的AM6-4和AM6培养基发酵粗提物中分离得到了新的proximicin类化合物proximicin F(1),diproximicin A(2)和proximicin G(3)。
本发明的重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139,于2020年3月10日保藏于广东省微生物研究所菌种保藏中心(GDMCC),地址:广东省广州市越秀区先烈中路100号,保藏编号:GDMCC No.60976。
本发明中包含2个磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(PPtase)编码基因(ermE*p-sfp-svp)的质粒pIB139公开于文献:Benying Zhang,Wenya Tian,Shuwen Wang,Xiaoli Yan,Xinying Jia,Gregory Pierens,Wenqing Chen,Hongmin Ma,Zixin Deng,and XudongQu.Activation of Natural Products Biosynthetic Pathways via a ProteinModification Level Regulation.ACS Chemical Biology,2017,12(7):1732-1736。
附图说明:
图1是重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139的AM6-4培养基发酵提取物的高效液相色谱图及化合物1和2的结构
高效液相色谱(HPLC)条件:色谱柱为Phenomenex Luna C18,150mm×4.6mm,5μm;流动相包括A相和B相,A相:10%乙腈/水(v/v)+0.1%的甲酸(v/v),B相:90%的乙腈/水(v/v);进样程序:5%B-80%B(0-20min),80%B-100%B(20-21min),100%B(21-25min),100%B-5%B(25-26min),5%B(26-30min),检测波长280nm,流速1mL·min-1,其中1代表化合物1,2代表化合物2。
图2是重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139的AM6培养基发酵提取物的高效液相色谱图及化合物3的结构
高效液相色谱(HPLC)条件:色谱柱为Phenomenex Luna C18,150mm×4.6mm,5μm;流动相包括A相和B相,A相:10%乙腈/水(v/v)+0.1%的甲酸(v/v),B相:90%的乙腈/水(v/v);进样程序:5%B-80%B(0-20min),80%B-100%B(20-21min),100%B(21-25min),100%B-5%B(25-26min),5%B(26-30min),检测波长280nm,流速1mL·min-1,其中3代表化合物3。
图3是化合物1的HRESIMS谱图
图4是化合物1的1H-NMR谱图
图5是化合物1的13C-NMR谱图
图6是化合物1的DEPT135谱图
图7是化合物1的HSQC谱图
图8是化合物1的COSY谱图
图9是化合物1的HMBC谱图
图10是化合物1的NOESY谱图
图11是化合物2的HRESIMS谱图
图12是化合物2的1H-NMR谱图
图13是化合物2的13C-NMR谱图
图14是化合物2的DEPT135谱图
图15是化合物2的HSQC谱图
图16是化合物2的COSY谱图
图17是化合物2的HMBC谱图
图18是化合物2的NOESY谱图
图19是化合物3的HRESIMS谱图
图20是化合物3的1H-NMR谱图
图21是化合物3的13C-NMR谱图
图22是化合物3的DEPT135谱图
图23是化合物3的HSQC谱图
图24是化合物3的COSY谱图
图25是化合物3的HMBC谱图
图26是化合物3的NOESY谱图
具体实施方式:
以下实施实例是对本发明的进一步说明,而不是对本发明的限制。
1.质粒pIB139导入到疣孢菌Verrucosispora sp.SCSIO 40062中
通过三亲本接合转移的方法将质粒pIB139导入到疣孢菌Verrucosisporasp.SCSIO 40062中,得到重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139。对比野生菌与重组菌株在不同培养基中的发酵检测图,发现重组菌株在AM6-4培养基中新化合物1和2的产量增加(图1),经HRESIMS和NMR数据分析,确认了2个新化合物proximicin F(1)(图3-10)和diproximicin A(2)(图11-18)的结构;重组菌株在AM6培养基中除产生已知化合物proximicin C和proximicin B外,还产生了新化合物3(图2),经HRESIMS和NMR数据分析,确认了新化合物proximicin G(3)(图19-26)的结构。
以下进一步提供实施实例,这些实施实例有助于理解本发明,仅用作说明而不是对本发明的限制。
实施例1:重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139的构建
通过三亲本接合转移的方法将质粒pIB139导入到疣孢菌Verrucosisporasp.SCSIO 40062中,接合转移过程具体说明如下:疣孢菌Verrucosispora sp.SCSIO 40062在ISP4培养基平板上划线培养20-30d后,刮取适量的菌丝体接种于50mL放线菌一号液体培养基中,28℃摇床200rpm培养至对数生长期后,取5mL菌体转接到新的50mL放线菌一号液体培养基中,28℃摇床200rpm培养至对数生长期,3900rpm离心10min收集菌体,用30mL放线菌一号培养基清洗菌体2次,重悬于2mL放线菌一号培养基中,作为接合转移的受体菌。将供体菌E.coliDH5α/pIB139接种于5mL LB液体培养基中(含50μg·mL-1阿泊拉霉素),同时将助体菌E.coli ET12567/pUB307接种于5mL LB液体培养基中(含50μg·mL-1卡那霉素和50μg·mL-1氯霉素),37℃摇床200rpm过夜培养。然后取100μL过夜培养的E.coli DH5α/pIB139和E.coli ET12567/pUB307转接到10mL LB液体培养基中(含50μg·mL-1阿泊拉霉素-针对供体菌的LB液体培养基,或含50μg·mL-1卡那霉素和50μg·mL-1氯霉素-针对助体菌的LB培养基),37℃摇床200rpm培养3-4h至OD600值约为0.6,3900rpm离心10min收集2种菌体,用30mL无抗的LB液体培养基清洗2次,分别悬浮于中250μL LB液体培养基中。最后将250μL供体菌、250μL助体菌和500μL受体菌混匀,涂布于Mg2+终浓度为20mM的ISP4培养基无抗固体平板上,吹干,28℃培养箱倒置培养16-20h。将平板取出,用含抗生素的水(含50μg·mL-1阿泊拉霉素和100μg·mL-1甲氧苄啶)覆盖平板,吹干后置于28℃培养箱倒置培养20-30d。待接合子长出后,划线到ISP4培养基固体平板上(含50μg·mL-1阿泊拉霉素和100μg·mL-1甲氧苄啶)即可获得重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139,其保藏编号是:GDMCC No.60976。
实施例2:proximicin类化合物的发酵和制备
1.放大发酵培养
将重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139在ISP4培养基固体平板上(含50μg·mL-1阿泊拉霉素和100μg·mL-1甲氧苄啶)上活化后,刮取适量菌丝体接种到50mL放线菌一号培养基中,28℃摇床200rpm培养4d后得到种子液;将种子液以10%,v/v的接种量分别接入200mL AM6-4和200mL AM6发酵培养基(共15L)中,28℃摇床200rpm培养5-7d后得到发酵培养物。
放线菌一号培养基:可溶性淀粉10g,酵母浸膏4g,细菌学蛋白胨2g,海盐30g,加纯净水至1L,pH7.2-7.4,混合后灭菌即得。
AM6-4培养基:甘油10g,细菌学蛋白胨5g,甘氨酸0.1g,L-丙氨酸0.1g,异亮氨酸0.1g,CaCO3 5g,海盐30g,加纯净水至1L,pH7.0,混合后灭菌即得。
AM6培养基:可溶性淀粉20g,葡萄糖10g,细菌学蛋白胨5g,酵母浸膏5g,CaCO35g,海盐30g,加纯净水至1L,pH7.0,混合后灭菌即得。
2.发酵液的萃取
发酵培养物3900rpm离心20min后分别收集发酵液和菌丝体。发酵液用2L大孔树脂XAD-16吸附,然后用15L丙酮洗脱;菌丝体用1L甲醇浸提3次,每次超声破碎细胞1h。然后用旋转蒸发仪回收两部分中的有机溶剂,剩余的水相合并后用1L乙酸乙酯萃取10次,旋转蒸发仪回收乙酸乙酯后得到粗提物,由此分别得到重组菌株Verrucosisporasp.SCSIO40062/pIB139的AM6-4培养基粗提物EX1和AM6培养基粗提物EX2。
3.化合物的分离
将重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139的AM6-4培养基粗提物EX1(30g)用氯仿甲醇(体积比1:1)溶解,加入60mL 100-200目硅胶旋蒸拌样,以拌样硅胶(60mL)/分离硅胶(180mL)1:3干法装柱,用氯仿/甲醇作为洗脱剂进行梯度洗脱(氯仿、氯仿/甲醇4:1、氯仿/甲醇2:1、甲醇,v/v),依次得到流份Fr1-Fr4。将流份Fr3(氯仿/甲醇2:1洗脱流份)用Sephadex LH-20凝胶柱层析(120cm×3cm,氯仿/甲醇1:1,v/v)进行分离,每10mL接收一瓶,根据TLC检测结果将流份合并得到流份Fr3-1到Fr3-5。将流份Fr3-4(第29-42瓶,1.5g)再次用3mL100-200目硅胶旋蒸拌样,以拌样硅胶(3mL)/分离硅胶(30mL)1:10干法装柱,用氯仿/甲醇作为洗脱剂进行梯度洗脱(氯仿、氯仿/甲醇20:1、氯仿/甲醇15:1、氯仿/甲醇10:1,甲醇,v/v),依次得到流份Fr3-4-1到Fr3-4-5。将流份Fr3-4-3(氯仿/甲醇15:1洗脱流份)采用半制备高效液相色谱(Phenomenex Luna C18,250mm×10.0mm,5μm;A相为水,B相为乙腈,20%的B相等度洗脱;流速为2.5mL·min-1;检测波长为280nm)纯化得到化合物proximicin F(1)(Rt=8.0min)。将流份Fr3-3(第20-28瓶)采用半制备高效液相色谱(Phenomenex Luna C18,250mm×10.0mm,5μm;A相为水,B相为乙腈,30%的B相等度洗脱;流速为2.5mL·min-1;检测波长为280nm)纯化得到化合物diproximicinA(2)(Rt=12.0min)。
将重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139的AM6培养基粗提物EX2(6g)用氯仿甲醇(体积比1:1)溶解,加入12mL 100-200目硅胶旋蒸拌样,以拌样硅胶(12mL)/分离硅胶(36mL)1:3干法装柱,用氯仿/甲醇作为洗脱剂进行梯度洗脱(氯仿、氯仿/甲醇4:1、氯仿/甲醇2:1、甲醇,v/v),依次得到流份Fr1-Fr4。将流份Fr2和Fr3(氯仿/甲醇4:1、氯仿/甲醇2:1洗脱流份)合并用Sephadex LH-20凝胶柱层析(120cm×3cm,氯仿/甲醇1:1,v/v)进行分离,每10mL接受一瓶,根据TLC检测结果将流份合并得到流份Fr2-1到Fr2-7。将流份Fr2-5(第35-56瓶)经中压反相色谱(YMC*GEL ODS-A-HG,12nm S-50μm)用A相/B相=水/乙腈(v/v)根据以下程序进行洗脱:10%B(0-30min),10%B-20%B(30-50min),20%B(50-80min),20%B-30%B(80-100min),30%B(100-145min),30%B-40%B(145-165min),40%B(165-210min),40%B-90%B(210-230min),90%B(230-260min),依次得到流份Fr2-5-1到Fr2-5-9。将流份Fr2-5-7(40%B(165-210min)洗脱流份)采用半制备高效液相色谱(Phenomenex Luna C18,250mm×10.0mm,5μm;A相为水,B相为乙腈,45%的B相等度洗脱;流速为2.5mL·min-1;检测波长为280nm)纯化得到化合物proximicinG(3)(Rt=16.0min)。
4.化合物的结构鉴定
化合物1-3的结构根据HRESIMS、1H-NMR、13C-NMR、DEPT135、HSQC、COSY、HMBC和NOESY谱图进行鉴定,其核磁数据归属见表1。化合物proximicin F(1)的谱图见图3-10,diproximicin A(2)的谱图见图11-18,proximicin G(3)的谱图见图19-26。
由此确定化合物1-3的结构式如下所示:
表1化合物1-3的1H-NMR(700MHz)和13C-NMR(175MHz)核磁数据(DMSO-d6)
a对称碳和氢的化学位移值一致
实施例3:化合物1-3的抗菌活性测定
采用微量培养基稀释法测定了化合物1-3对4种指示菌Staphylococcus aureusATCC29213,methicillin-resistant Staphylococcus aureus shhs-A1(临床样品),Micrococcus luteus SCSIO ML01和Bacillus subtilis 1064的抑制活性。4种指示菌用MH培养基37℃摇床200rpm培养16h后,用无菌MH培养基稀释到OD600值约为为0.04-0.06,再稀释10倍加入到96孔板中;加入样品后,等倍稀释到样品终浓度为64-0.125μg·mL-1,每个浓度3个平行;37℃静置培养18h,用酶标仪测定各孔的在波长600nm处的吸光值,并计算各化合物的最小抑菌浓度(MIC),抑制率(%)=(1-(A样品-A样品背景)/(A阴性对照-A空白对照))×100%,抑制率>80%时的样品浓度为MIC值,其结果见表2。
表2化合物1-3的抗菌活性
实施例4:化合物1-2的抗肿瘤活性测定
采用SRB法测定了化合物1-2对4种肿瘤细胞株SF-268,MCF-7,HepG-2和A549的抑制活性。4种肿瘤细胞株用RPMI培养基培养,将180μL培养物(浓度为3×104个细胞·mL-1)加入到96孔板中,37℃ 5%CO2培养18h;将20μL的待测样品(终浓度等倍稀释为128-1μM,溶剂为DMSO)加入到96孔板相应的孔中,用DMSO作为阴性对照,每个浓度做3个平行,继续培养72h;加入50μL 50%的三氯乙酸混合,再加入0.4%的SRB(溶解在1%的乙酸中)放置30min;去除上清,将与染料结合的蛋白溶解200μL10 mM的Tris缓冲液中,用酶标仪测定各孔的OD570值,并计算相应的抑制率;以顺铂作为阳性对照。采用SigmaPlot 14.0软件中非线性曲线拟合(non-linear curve-fitting)的方法计算相应的IC50,其结果见表3。
表3化合物1-2的抗肿瘤活性
Claims (8)
2.一种重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139,其保藏编号为:GDMCCNo.60976。
3.一种权利要求1所述化合物proximicin F,diproximicin A和proximicin G的制备方法,其特征在于,化合物proximicin F和diproximicin A是从权利要求2所述的重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139的AM6-4培养基发酵培养物中分离得到的;而化合物proximicin G是从权利要求2所述的重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139的AM6培养基发酵培养物中分离得到的。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,具体步骤为:将重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139分别用AM6-4和AM6培养基发酵培养,获得发酵培养物,离心分离分别收集发酵液和菌丝体,发酵液用大孔树脂XAD-16吸附,然后用丙酮洗脱;菌丝体用甲醇浸提并超声破碎细胞,两者回收有机溶剂后剩余的水相用乙酸乙酯萃取,减压浓缩至干,分别得到重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139的AM6-4培养基粗提物EX1和AM6培养基粗提物EX2;将粗提物EX1经正相硅胶柱层析分离,用氯仿/甲醇作为洗脱剂从氯仿、氯仿/甲醇4:1、氯仿/甲醇2:1、甲醇,v/v进行梯度洗脱,依次得到流份Fr1-Fr4,将氯仿/甲醇2:1,v/v洗脱的流份Fr3用凝胶柱层析,以氯仿/甲醇1:1,v/v为洗脱剂进行分离,洗脱流份经纯化得到化合物proximicin F和diproximicin A;将粗提物EX2经正相硅胶柱层析分离,用氯仿/甲醇作为洗脱剂从氯仿、氯仿/甲醇4:1、氯仿/甲醇2:1、甲醇,v/v进行梯度洗脱,依次得到流份Fr1-Fr4,将氯仿/甲醇4:1,v/v洗脱的流份Fr2和氯仿/甲醇2:1,v/v洗脱的流份Fr3合并后用凝胶柱层析进行分离,洗脱流份经纯化得到化合物proximicin G。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO40062/pIB139的发酵培养方法为:将活化的重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139接入放线菌一号培养基中,28℃,200rpm培养4d后得到种子液;将种子液以10%,v/v的接种量分别接入AM6-4和AM6发酵培养基中,28℃,200rpm培养5-7d后得到发酵培养物;
每升放线菌一号培养基:可溶性淀粉10g,酵母浸膏4g,细菌学蛋白胨2g,海盐30g,加纯净水至1L,pH7.2-7.4;
每升AM6-4培养基:甘油10g,细菌学蛋白胨5g,甘氨酸0.1g,L-丙氨酸0.1g,异亮氨酸0.1g,CaCO3 5g,海盐30g,加纯净水至1L,pH7.0;
每升AM6培养基:可溶性淀粉20g,葡萄糖10g,细菌学蛋白胨5g,酵母浸膏5g,CaCO3 5g,海盐30g,加纯净水至1L,pH7.0。
6.权利要求1中的proximicin G在制备抗菌药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述的抗菌药物是抗枯草芽孢杆菌的药物。
8.权利要求2所述的重组菌株Verrucosispora sp.SCSIO 40062/pIB139在制备权利要求1中的化合物proximicin F,diproximicin A和/或proximicin G中的应用。
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