CN111807946A - 一种Pratensinon A化合物及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体的说是一种Pratensinon A化合物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。化合物的化学式为C₁₈H₁₄O₄，其结构式如下，本发明制备所得的Pratensinon A类化合物来源于海洋链霉菌Streptomyces pratensis KCB‑132的发酵产物，采用微生物发酵的方法制备该化合物具有高效环保的特点。

Description

一种Pratensinon A化合物及其制备和应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体的说是一种Pratensinon A化合物及其制备方法和在制备抗霜霉病菌药物中的应用。

背景技术

近年来，全球癌症的发病率呈现持续升高的总体趋势，癌症已成为全球性的公共卫生问题。据调查，全球57％的癌症患者以及65％的癌症死亡患者来自于发展中国家。随着我国老龄化加剧、生态环境恶化、不健康生活方式及食品安全等问题凸显，肿瘤发病率持续上升，癌症发病个案高居世界第一位，已经成为必须高度重视的公共卫生问题，乃至社会问题。鉴于此，寻找新型、高效、低毒的抗肿瘤药物已成为迫切需要解决的重大课题。

发明内容

本发明提供一种新结构天然来源的化合物及其制备方法，和在制备抗霜霉病菌药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种Pratensinon A化合物，化合物的化学式为C₁₈H₁₄O₄，其结构式为

化合物的制备方法，将活化后的海洋链霉菌Streptomyces pratensis KCB-132于ISP2培养基中发酵培养，纯化后即为式一所示化合物。

具体为：

1)将海洋链霉菌Streptomyces pratensis KCB-132划线接种于ISP2固体培养基上，28℃培养直至长出白色的孢子，取孢子体接种到液体培养基，28℃，150-220rpm/min，摇床培养8-12d收获发酵物。将发酵液经大孔吸附树脂洗脱，而后减压浓缩得总浸膏；

2)总浸膏经硅胶柱层析，以体积比为0:100-100:0的甲醇/二氯甲烷为洗脱液进行梯度洗脱，收集洗脱液体积比5:95的甲醇/二氯甲烷的洗脱组分，将收集的洗脱组分进行ODS反相柱层析，收集含55％有机溶剂的洗脱液的洗脱部分，浓缩，进行HPLC制备得到化合物Pratensinon A。

所述步骤1)中萃取是采用的有机溶剂为乙酸乙酯和/或正丁醇，优选为乙酸乙酯；

所述大孔吸附树脂洗脱采用的洗脱液为有机醇；其中，有机醇为甲醇、乙醇中的一种，优选为乙醇。

所述ODS反相柱层析的洗脱液为有机醇和水；其中，有机醇和水的体积比为0:100-100:0，所述有机剂为甲醇、乙醇或乙腈，优选为甲醇。

所述培养基为ISP2固体或液体培养基。

所述大孔吸附树脂柱，为弱极性或非极性的大孔吸附树脂，优选弱极性。

一种化合物的应用，所述化合物在作为抗肿瘤药物或先导化合物中的应用。

所述化合物在作为抗结肠癌药物或先导化合物中的应用。

本发明所具有的优点：

1.本发明制备所得的Pratensinon A类化合物来源于海洋链霉菌Streptomycespratensis KCB-132的发酵产物，采用微生物发酵的方法制备该化合物具有高效环保的特点；

2.本发明制备所得的Pratensinon A类化合物具有显著抗肿瘤细胞活性，且该化合物为尚未被报道的新化合物，对结肠癌细胞的IC50值为7.3μg/mL，可进一步探索其作用机制，以期开发为新型抗肿瘤药物或其先导化合物；

附图说明

图1为本发明实施例提供的Pratensinon A正离子质谱图(HR-ESI-MS)。

图2为本发明实施例提供的Pratensinon A ¹H NMR谱(溶剂：DMSO-d₆)。

图3为本发明实施例提供的Pratensinon A ¹³C NMR谱(溶剂：DMSO-d₆)。

图4为本发明实施例提供的Kiamycin E DEPT-135谱(溶剂：DMSO-d₆)

图5为本发明实施例提供的Pratensinon A ¹H-¹H COSY谱(溶剂：DMSO-d₆)。

图6为本发明实施例提供的Pratensinon A HMBC谱(溶剂：DMSO-d₆)。

图7为本发明实施例提供的Pratensinon A NOESY谱(溶剂：DMSO-d₆)。

图8为本发明实施例提供的Pratensinon A HSQC谱(溶剂：DMSO-d₆)。

具体实施方式

下面的实施例用以解释本发明，但是并非对本发明实质内容的限制。

实施例1.海洋链霉菌Streptomyces pratensis KCB-132的获取。

分离培养基为高氏一号培养基，加入50mg/L放线菌酮、50mg/L制霉菌素和20mg/L萘啶酮酸作为抑制剂，灭菌条件为121℃、20min。采用稀释涂布法对海洋沉积物样品中的放线菌进行分离，分离平板于28℃培养21天，经纯化得到链霉菌Streptomyces pratensisKCB-132。

形态生长特征：

将菌株Streptomyces pratensis KCB-132接种于固体ISP2培养基上，培养7天。菌体可产生丰富的白色气生菌丝，基内菌丝成淡黄色。菌落干燥，周别不规则。

将菌株接种在ISP2培养基上，分别在4℃、10℃、15℃、20℃、28℃、32℃、37℃、42℃、45℃培养，每周观察一次，四周结束，重复2次；

再将菌株接种在含有不同浓度NaCl(不同浓度的NaCl依次为0％，3％，5％，8％，10％，15％)的ISP2培养基内，37℃培养，每周观察一次，四周结束，重复2次；

另，再将菌株接种在含有不同缓冲液(不同缓冲液为：pH Buffer：pH 5.0-5.5：0.1M柠檬酸-0.1M柠檬酸钠；pH 6.0-8.0：10mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸-0.5M NaOH；pH 8.5-11.5：0.5M NaHCO₃-0.5M Na₂CO₃)的ISP2培养基中，并以空白培养基作阴性对照，37℃培养，每周观察一次，四周结束，重复2次。

结果表明：菌株生长温度范围为10-37℃，最适生长温度为28℃，pH生长范围为6.0-11.0，最适pH为7.5，盐浓度(NaCl)生长范围为0-5％。

链霉菌Streptomyces pratensis KCB-132保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.19782，保藏时间为2020年5月7日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

实施例2 Pratensinon A的制备

1)发酵培养

将上述获得海洋链霉菌Streptomyces pratensis KCB-132划线接种于ISP2固体培养基上，28℃培养3-4d，直至长出白色的孢子，将孢子体10％的接种量接种到ISP2液体培养基中，28℃，150-220rpm/min，摇床培养8-12d收获发酵物。过滤发酵物获得发酵液和菌丝体，发酵液经大孔吸附树脂柱(12nm，50μm)，100％乙醇洗脱，用旋转蒸发仪减压浓缩(真空度100mbar，转速100rpm)得总浸膏。

所述ISP2液体培养基为葡萄糖0.4％，酵母粉0.4％，麦芽浸粉1％。固体培养基在此基础上添加2％的琼脂。

2)粗提物分离纯化

总浸膏经正相硅胶(200-300目，54-75μm)柱层析，以二氯甲烷：甲醇进行梯度洗脱，流速5ml/min，以体积比为100:0至0：100(二氯甲烷：甲醇(v/v))。收集洗脱液体积比95:5(二氯甲烷：甲醇)的洗脱组分，将收集的洗脱组分进行ODS(C-18，50μm)反相柱层析，以水：甲醇(v/v)体积比100:0至0:100进行梯度洗脱，流速2ml/min，收集45：55(水：甲醇)洗脱部分，浓缩，进行HPLC制备，以甲醇：水作为流动相，洗脱速率为1ml/min，收集保留时间t_R为15.7-17.7min的组分，得到化合物Pratensinon A。

实施例3.Pratensinon A的结构确证

1.仪器与材料

Jasco P-1020数字式旋光仪，Agilent TOF/6500高分辨率质谱，岛津UV-2401型可见-紫外分光光度计，核磁为Bruke Avance III 500NMR spectrometer，为按上述实施例1步骤制备。

2.化合物结构鉴定

Pratensinon A：白色粉末，易溶于二甲亚砜、甲醇，丙酮、氯仿，微溶于水，UV(Acetonitrile)λmax(logε)190(3.2),215(3.09),257(3.12),282(2.6)nm；HRESIMS[M+H]+,m/z295.09677(calcd for C18H15O4,295.09703).

Pratensinon A的核磁数据见表一，图1是Pratensinon A正离子质谱图(HR-ESI-MS)。图2是Pratensinon A ¹H NMR谱图(溶剂：DMSO-d₆)。图3是Pratensinon A ¹³C NMR谱(溶剂：DMSO-d₆)。图4是Pratensinon A DEPT-135谱(溶剂：DMSO-d₆)。图5是Pratensinon A¹H-¹H COSY谱(溶剂：DMSO-d₆)。图6是Pratensinon A HMBC谱(溶剂：DMSO-d₆)。图7是Pratensinon A NOESY谱(溶剂：DMSO-d₆)。图8是Pratensinon A HSQC谱(溶剂：DMSO-d₆)。

表1：Pratensinon A的核磁数据(¹H NMR 500MHz，¹³C NMR 125MHz)。

据此确定该化合物结构。

实施例4.Pratensinon A抗肿瘤活性初步测评

(1)细胞复苏：将冻存的各肿瘤细胞从液氮罐取出，于37℃水浴锅中快速解冻，离心，弃上清，用H460细胞培养基(10％牛血清)重悬，将细胞悬液转移到10mL细胞培养皿中，放入37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养，静置24小时，更换细胞培养基。

(2)细胞传代：细胞贴壁生长至90％左右，弃培养基，使用无菌PBS清洗2遍，加入1mL胰酶消化液，放入培养箱1min左右，加入适量细胞培养基终止消化，接种在新的培养皿内。

(3)细胞铺板：按照细胞传代步骤，吹打成单细胞悬液，按照每孔3×10⁴个细胞数量接种到96孔板中，培养24h。

(4)细胞给药：用无菌注射器把每个孔中的培养基吸出，向孔中加入100μL含上述实施例获得不同化合物(浓度<50μg/mL)的培养液，每个浓度设5个复孔。

(5)检测：将CCK8与细胞培养基按1：9(v/v)配制。用无菌注射器把每个孔中的培养基吸出，向孔中加入100μL配制好的CCK8溶液，而后于5％CO₂细胞培养箱中孵育1-4h，酶标仪测定吸光度。由上述吸光度取平均值，通过计算获得IC50(参见表2)。

结论：Pratensinon A表现出了一定的抗肿瘤活性。其中，对Colon38的IC50值为7.3μg/mL；对Hela的IC50值为10.3μg/mL。

表2 Pratensinon A的抗肿瘤活性

Colon 38-结肠癌细胞，Hela-宫颈癌细胞

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.Pratensinon A化合物，其特征在于：化合物的化学式为C₁₈H₁₄O₄，其结构式为

2.按权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于：将活化后的海洋链霉菌Streptomyces pratensis KCB-132于ISP2培养基中发酵培养，纯化后即为式一所示化合物。

3.按权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于：

1)将海洋链霉菌Streptomyces pratensis KCB-132划线接种于ISP2固体培养基上，28℃培养直至长出白色的孢子，取孢子体接种到液体培养基，28℃，150-220rpm/min，摇床培养8-12d收获发酵物；将发酵液经大孔吸附树脂洗脱，而后减压浓缩得总浸膏；

2)总浸膏经硅胶柱层析，以体积比为0:100-100:0的甲醇/二氯甲烷为洗脱液进行梯度洗脱，收集洗脱液体积比5:95的甲醇/二氯甲烷的洗脱组分，将收集的洗脱组分进行ODS反相柱层析，收集含55％有机溶剂的洗脱液的洗脱部分，浓缩，进行HPLC制备得到化合物Pratensinon A。

4.按权利要求3所述的化合物的制备方法，其特征在于:

所述步骤1)中萃取是采用的有机溶剂为乙酸乙酯和/或正丁醇；

所述大孔吸附树脂洗脱采用的洗脱液为有机醇。

5.按权利要求3所述的化合物的制备方法，其特征在于:

所述ODS反相柱层析的洗脱液为有机溶剂和水；其中，有机溶剂和水的体积比为0:100-100:0，所述有机溶剂为甲醇、乙醇或乙腈。

6.一种权利要求1所述的化合物的应用，其特征在于：所述化合物在作为抗肿瘤药物或先导化合物中的应用。

7.按权利要求6所述的化合物的应用，其特征在于：所述化合物在作为抗结肠癌药物或先导化合物中的应用。

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