CN104651431A - 一种小单孢菌发酵生产庆大霉素的培养基及培养方法 - Google Patents

一种小单孢菌发酵生产庆大霉素的培养基及培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种小单孢菌发酵生产庆大霉素的培养基和培养方法，包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其特征在于上述培养中含有大米酒糟和低温压榨黄豆饼粉；发酵培养中含有大米酒糟、低温压榨黄豆饼粉、弱酸性阳离子交换树脂和非离子表面活性剂。本发明解决了原辅料的成本问题，并且最大限度的降低原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现庆大霉素稳定、高效的生产，同时利用该培养基和培养方法可提高发酵单位。

Description

一种小单孢菌发酵生产庆大霉素的培养基及培养方法
技术领域
本发明属于发酵技术领域，特别是涉及一种小单孢菌发酵生产庆大霉素的培养基及培养方法。
背景技术
庆大霉素是由放线菌属小单孢菌发酵产生的氨基糖苷类广谱抗生素，1963年被美国人Weinstein首次发现，1969年被用于临床，是各种革兰氏阴性菌感染的主要抗菌药物之一。目前，国内采用小单孢菌发酵生产庆大霉素，存在的主要问题是：
1发酵生产工艺变化不大，发酵单位维持在1500u/ml左右，导致发酵产量较低。
2发酵培养基含有的动物性氮源质量影响发酵液质量和发酵效果。目前，国内发酵生产庆大霉素的培养基中加入玉米蛋白粉或鱼粉或二者同时加入，导致发酵后期剩余蛋白质较多，发酵液粘度较高，降低了提取收率。
3庆大霉素的生产成本较高，其中氮源的成本占到发酵成本的30％左右。
发明内容
本发明目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种有效提高发酵单位，同时最大限度的降低原辅料用量，降低生产成本，且原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现庆大霉素稳定、高效生产的小单孢菌发酵生产庆大霉素的培养基。
本发明的另一目的是提供利用上述培养基生产庆大霉素的培养方法。
为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种小单孢菌发酵生产庆大霉素的培养基，包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其特征在于所述一级种子培养基的组成为：麦芽糖10～20ml/L、混合淀粉20～30g/L、豆油或玉米油1～5ml/L、低温压榨一次黄豆饼粉25～35g/L、大米酒糟15～20g/L、玉米蛋白粉5～10g/L、轻质碳酸钙2～4g/L、硫酸铵1～5g/L，麦芽糖酶0.01～0.03g/L；
所述二级种子培养基组成为：麦芽糖20～25ml/L、混合淀粉30～40g/L、豆油或玉米油1～5ml/L、低温压榨一次黄豆饼粉40～45g/L、大米酒糟25～30g/L、玉米蛋白粉10～15g/L、磷酸二氢钾0.5～0.8g/L、轻质碳酸钙3～5g/L、硫酸铵3～5g/L、麦芽糖酶0.03～0.05g/L；
所述发酵培养基的组成为：麦芽糖30～50ml/L、混合淀粉40～60g/L、豆油或玉米油1～5ml/L、低温压榨一次黄豆饼粉50～60g/L、大米酒糟30～40g/L、玉米蛋白粉20～30g/L、磷酸二氢钾0.8～1.2g/L、轻质碳酸钙6～8g/L、硫酸铵5～8g/L、氯化钠4～6g/L、硫酸镁4～6g/L、氯化钴0.003～0.007g/L、非离子表面活性剂0.01～0.05g/L，弱酸性阳离子交换树脂1～5g/L，麦芽糖酶0.04～0.07g/L。
所述大米酒糟的质量要求是：蛋白质含量在50％以上，水分含量控制在5％以内，80％的原料能够通过60目筛。
所述低温压榨一次黄豆饼粉质量要求是：黄豆饼粉在低于80℃的条件下压榨1次，要求其油含量控制在7～10％，蛋白质含量在45％以上，80％的原料能够通过80目筛。
所述混合淀粉是指淀粉中加入其重量的0.006％的泛酸和0.004％的硫辛酸。
所述非离子表面活性剂为脂肪酸甘油酯、脂肪酸山梨坦或聚山梨酯。
所述弱酸性阳离子交换树脂为大丙烯酸系阳离子交换树脂、苯丙烯阳离子交换树脂或酚醛阳离子交换树脂。
一种利用上述培养基生产庆大霉素的培养方法，其特征在于其工艺步骤包括：
1)一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的小单孢菌母瓶发酵液接入一级种子罐进行培养，接种量控制在一级种子培养基体积的0.5～1％；
2)二级种子培养：先将二级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将已经培养好的菌体浓度15～25％、pH值7～8、无其它杂菌污染的一级种子培养液按照1:9～11(体积比)比例移入二级种子罐进行培养；
3)发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将已经培养好的菌体浓度30～40％、pH值7～8、无其它杂菌污染的二级种子液按照1:5～6(体积比)比例移入发酵罐进行培养，至a发酵效价每6～8h取样检测，前、后检测的发酵单位相差在100u/ml以内；b菌体浓度30～50％；c发酵单位在2200u/mL以上；d pH值6.5～8.5时停止发酵。
所述一级种子培养条件为：罐压0.04～0.08MPa；罐温34～37℃；空气流量：0～10h，50～60m3/h；6h～移种：80～100m3/h；搅拌转速60～100r/min；pH7～8；培养时间50～55h。
所述二级种子培养条件为：罐压0.04～0.08MPa；罐温33～35℃；空气流量100～300m3/h；搅拌转速100～120r/min；pH值7～8；培养时间：40～50h。
所述发酵培养条件为：
a脂肪控制：发酵培养基灭菌后脂肪控制在4～6％；发酵前80h，脂肪含量控制在4.5％以上；发酵81～110h，脂肪含量控制在3.5～4.5％；111h至发酵结束，脂肪含量控制在1.5～2％；
b发酵过程采用变温培养：
发酵前60h，培养温度控制在35～37℃，
发酵61h～发酵结束，培养温度控制在34～35℃；
c搅拌转速：150～220r/min；
d还原糖含量：发酵培养基灭菌后还原糖控制在6～8％；发酵前80h，还原糖含量控制在6％以上；发酵81～110h，还原糖含量控制在4～6％；发酵111h至发酵结束，还原糖含量控制在1～2％；
e发酵周期：培养时间150～160h；
f压力控制：发酵全程罐压控制在0.06～0.08MPa；
g pH控制：发酵过程中pH6.5～7.5；
h无菌检查：发酵过程中进行菌检，要求无其它杂菌；
i空气流量：发酵前80h：400～600m3/h；发酵81～110h，800～1000m3/h；发酵111h至发酵结束，300～500m3/h。
在发酵过程中进行补料，包括补油、补水、补糖、补碱和补氮源，其中
a补油控制：采用流加法补豆油或玉米油，
发酵前80h不用进行补油，
发酵81h～110h，脂肪含量控制在3.5～4.5％，当脂肪含量低于4％，补入油，当脂肪含量超过6％，则停止补油，补油量(L)＝(5-脂肪含量-残油量)％×发酵液体积(L)，
发酵81～110h，脂肪含量控制在3.5～4.5％，当脂肪含量低于3.5％，补入油，当脂肪含量超过4.5％，则停止补油，补油量(L)＝(4-脂肪含量-残油量)％×发酵液体积(L)，
发酵111h至发酵结束，脂肪含量控制在1.5～2％，当脂肪含量低于1.5％，补入油，当脂肪含量超过2％，则停止补油，补油量(L)＝(1.7-脂肪含量-残油量)％×发酵液体积(L)；
b补水：
发酵前60h不用进行补水，
发酵61h～100h，当发酵液菌体浓度＞50％，采用流加法补水，控制菌体浓度40～50％，
发酵101h至发酵结束：当发酵液菌体浓度＞40％，采用流加法补水，控制菌体浓度30～40％；
c补碱：
发酵前60h，pH不进行控制，
发酵61h至发酵结束：10～20％的氢氧化钠溶液控制其pH在6.5～7.5；
d补入氮源：在发酵周期分别在60h和100h时补入5～10％的氨水，其补入量为发酵液体积的1～1.5％；
e补糖：
发酵前80h，不加入麦芽糖，
发酵81～110h，当还原糖含量＜4％，加入麦芽糖，当还原糖含量超过6％，则停止加入麦芽糖，补糖量(kg)＝(5-还原糖量)％×发酵液体积(L)，
发酵111h至发酵结束，当还原糖含量＜1％，加入麦芽糖，当还原糖含量超过2％，则停止加入麦芽糖，补糖量(kg)＝(1.5-还原糖量)％×发酵液体积(L)。
本发明的技术优势为：
1)发酵成本低。首先，培养基组成中的大米酒糟产量较大，市场价格较低，便于采购，其次使用大米酒糟代替庆大霉素常规种子培养基、发酵培养基中的氮源，减少用量，降低了20％以上的生产成本，避免因氮源质量影响种子液和发酵液质量的不利因素。
2)本发明采用大米酒糟代替了常规培养基中的蛋白胨和鱼粉，满足了庆大霉素发酵培养过程中氨基酸的需求量。根据相关文献报道庆大霉素发酵所需的前体物质主要是甘氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸和赖氨酸。本发明发酵培养基中的蛋白质含量达到55％以上，氨基酸含量明显高于国内常规培养基配方，有利于改善小单孢菌菌丝形态；提高发酵液的质量和发酵技术水平。
不同原辅料的氨基氮含量对比表
3)发酵培养基中加入表面活性剂和大孔树脂，不仅改变细胞膜的通透性，而且改善气液表面状态以及发酵液的流动状态，有利于提高发酵技术水平。
4)采用该工艺发酵生产庆大霉素，适用于单罐发酵规模在60m3以上，发酵单位达到2200u/ml以上。
具体实施方式
下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。
下述实施例中大米酒糟的质量要求是：蛋白质含量在50％以上，水分含量控制在5％以内，80％的原料能够通过60目筛。低温压榨一次黄豆饼粉质量要求是：黄豆饼粉在低于80℃的条件下压榨1次，要求其油含量控制在7～10％，蛋白质含量在45％以上。80％的原料能够通过80目筛。所述混合淀粉是指淀粉中加入其重量的0.006％的泛酸和0.004％的硫辛酸。
实施例1
一级种子培养
在1m3一级种子罐中加入麦芽糖10L、混合淀粉20kg、豆油1L、低温压榨一次黄豆饼粉25kg、大米酒糟15kg、玉米蛋白粉5kg、轻质碳酸钙2kg、硫酸铵1kg，麦芽糖酶10g。首先将一级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的小单孢菌母瓶发酵液接入一级种子罐进行培养，接种量为0.5L。一级种子培养过程中，罐压0.04～0.08MPa；罐温34～37℃；空气流量：0～10h，50m3/h；6h～移种：80m3/h；搅拌转速60r/min；pH7～8；培养时间50h。一级种子培养结束，菌体浓度16％；pH值7.1，无其它杂菌污染。
二级种子培养
在10m3二级种子罐中加入麦芽糖200L、混合淀粉300kg、豆油10L、低温压榨一次黄豆饼粉400kg、大米酒糟250kg、玉米蛋白粉100kg、磷酸二氢钾5kg、轻质碳酸钙30kg、硫酸铵30kg、麦芽糖酶300g。先将二级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将一级种子液全部移入二级种子罐进行培养。二级种子培养过程中，罐压0.04～0.08MPa；罐温33～35℃；空气流量100m3/h；搅拌转速100r/min；pH值7～8；培养时间40h。二级种子培养结束，菌体浓度31％；pH值7.2；无其它杂菌污染。
发酵培养
在60m3发酵罐中加入麦芽糖1800L、混合淀粉2400kg、豆油60L、低温压榨一次黄豆饼粉3000kg、大米酒糟1800kg、玉米蛋白粉1200kg、磷酸二氢钾48kg、轻质碳酸钙360kg、硫酸铵300kg、氯化钠240kg、硫酸镁240kg、氯化钴180g、脂肪酸甘油酯0.6kg，大丙烯酸系阳离子交换树脂60kg，麦芽糖酶2.4kg。先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，发酵培养基灭菌后脂肪控制在4.2％，然后将二级种子液全部移入发酵罐进行培养。发酵培养过程中，发酵前80h，脂肪含量控制在4.5％以上；发酵81～110h，脂肪含量控制在3.5～4.5％；111h至发酵结束，脂肪含量控制在1.5％。发酵前60h，培养温度控制在35～37℃；发酵61h～发酵结束，培养温度控制在34～35℃；搅拌转速150r/min；发酵培养基灭菌后还原糖控制在6.1％；发酵前80h，还原糖含量控制在6％以上；发酵81～110h，还原糖含量控制在4～6％；111h至发酵结束，还原糖含量控制在1.2％。培养时间150h；发酵全程罐压控制在0.06～0.08MPa；发酵过程中pH6.5～7.5；发酵过程中进行菌检，要求无其它杂菌；空气流量：发酵前80h：400m3/h；发酵81～110h，800m3/h；111h至发酵结束，300m3/h。发酵培养结束，菌体浓度31％；发酵单位2247u/ml，pH值6.6。
上述发酵过程中根据情况进行补料。
实施例2
一级种子培养
在1m3一级种子罐中加入麦芽糖12L、混合淀粉22kg、玉米油2L、低温压榨一次黄豆饼粉27kg、大米酒糟16kg、玉米蛋白粉6kg、轻质碳酸钙2.5kg、硫酸铵2kg，麦芽糖酶15g。首先将一级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的小单孢菌母瓶发酵液接入一级种子罐进行培养，接种量为0.6L。一级种子培养过程中，罐压0.04～0.08MPa；罐温34～37℃；空气流量：0～10h，52m3/h；6h～移种：85m3/h；搅拌转速70r/min；pH7～8；培养时间51h。一级种子培养结束，菌体浓度17％；pH值7.3，无其它杂菌污染。
二级种子培养
在10m3二级种子罐中加入麦芽糖210L、混合淀粉320kg、玉米油20L、低温压榨一次黄豆饼粉410kg、大米酒糟260kg、玉米蛋白粉110kg、磷酸二氢钾6kg、轻质碳酸钙35kg、硫酸铵35kg、麦芽糖酶350g。先将二级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将一级种子液全部移入二级种子罐进行培养。二级种子培养过程中，罐压0.04～0.08MPa；罐温33～35℃；空气流量150m3/h；搅拌转速105r/min；pH值7～8；培养时间42h。二级种子培养结束，菌体浓度33％；pH值7.3；无其它杂菌污染。
发酵培养
在60m3发酵罐中加入麦芽糖2100L、混合淀粉2700kg、玉米油120L、低温压榨一次黄豆饼粉3120kg、大米酒糟1920kg、玉米蛋白粉1320kg、磷酸二氢钾54kg、轻质碳酸钙390kg、硫酸铵360kg、氯化钠270kg、硫酸镁270g、氯化钴240g、脂肪酸山梨坦(司盘)1.2kg，苯丙烯阳离子交换树脂120kg，麦芽糖酶3kg。先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，发酵培养基灭菌后脂肪控制在4.5％，然后将二级种子液全部移入发酵罐进行培养。发酵培养过程中，发酵前80h，脂肪含量控制在4.5％以上；发酵81～110h，脂肪含量控制在3.5～4.5％；111h至发酵结束，脂肪含量控制在1.6％。发酵前60h，培养温度控制在35～37℃；发酵61h～发酵结束，培养温度控制在34～35℃；搅拌转速160r/min；发酵培养基灭菌后还原糖控制在6.5％；发酵前80h，还原糖含量控制在6％以上；发酵81～110h，还原糖含量控制在4～6％；111h至发酵结束，还原糖含量控制在1.3％。培养时间152h；发酵全程罐压控制在0.06～0.08MPa；发酵过程中pH6.5～7.5；发酵过程中进行菌检，要求无其它杂菌；空气流量：发酵前80h：450m3/h；发酵81～110h，850m3/h；111h至发酵结束，350m3/h。发酵培养结束，菌体浓度36％；发酵单位2296u/ml,pH值6.9。
上述发酵过程中根据情况进行补料。
实施例3
一级种子培养
在1m3一级种子罐中加入麦芽糖15L、混合淀粉25kg、豆油3L、低温压榨一次黄豆饼粉30kg、大米酒糟17kg、玉米蛋白粉7kg、轻质碳酸钙3kg、硫酸铵3kg，麦芽糖酶20g。首先将一级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的小单孢菌母瓶发酵液接入一级种子罐进行培养，接种量为0.7L。一级种子培养过程中，罐压0.04～0.08MPa；罐温34～37℃；空气流量：0～10h，55m3/h；6h～移种：90m3/h；搅拌转速80r/min；pH7～8；培养时间52h。一级种子培养结束，菌体浓度20％；pH值7.5，无其它杂菌污染。
二级种子培养
在10m3二级种子罐中加入麦芽糖220L、混合淀粉350kg、豆油30L、低温压榨一次黄豆饼粉430kg、大米酒糟270kg、玉米蛋白粉130kg、磷酸二氢钾6.5kg、轻质碳酸钙40kg、硫酸铵40kg、麦芽糖酶400g。先将二级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将一级种子液全部移入二级种子罐进行培养。二级种子培养过程中，罐压0.04～0.08MPa；罐温33～35℃；空气流量200m3/h；搅拌转速110r/min；pH值7～8；培养时间45h。二级种子培养结束，菌体浓度35％；pH值7.5；无其它杂菌污染。
发酵培养
在60m3发酵罐中加入麦芽糖2400L、混合淀粉3000kg、豆油180L、低温压榨一次黄豆饼粉3300kg、大米酒糟2100kg、玉米蛋白粉1500kg、磷酸二氢钾60kg、轻质碳酸钙420kg、硫酸铵390kg、氯化钠300kg、硫酸镁300kg、氯化钴300g、聚山梨酯1.8kg，酚醛阳离子交换树脂180kg，麦芽糖酶3.3kg。先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，发酵培养基灭菌后脂肪控制在5％，然后将二级种子液全部移入发酵罐进行培养。发酵培养过程中，发酵前80h，脂肪含量控制在4.5％以上；发酵81～110h，脂肪含量控制在3.5～4.5％；111h至发酵结束，脂肪含量控制在1.7％。发酵前60h，培养温度控制在35～37℃；发酵61h～发酵结束，培养温度控制在34～35℃；搅拌转速180r/min；发酵培养基灭菌后还原糖控制在7％；发酵前80h，还原糖含量控制在6％以上；发酵81～110h，还原糖含量控制在4～6％；111h至发酵结束，还原糖含量控制在1.5％。培养时间155h；发酵全程罐压控制在0.06～0.08MPa；发酵过程中pH6.5～7.5；发酵过程中进行菌检，要求无其它杂菌；空气流量：发酵前80h：500m3/h；发酵81～110h，900m3/h；111h至发酵结束，400m3/h。发酵培养结束，菌体浓度40％；发酵单位2401u/ml,pH值7.6。
上述发酵过程中根据情况进行补料。
实施例4
一级种子培养
在1m3一级种子罐中加入麦芽糖18L、混合淀粉28kg、豆油4L、低温压榨一次黄豆饼粉33kg、大米酒糟18kg、玉米蛋白粉8kg、轻质碳酸钙3.5kg、硫酸铵4kg，麦芽糖酶25g。首先将一级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的小单孢菌母瓶发酵液接入一级种子罐进行培养，接种量为0.8L。一级种子培养过程中，罐压0.04～0.08MPa；罐温34～37℃；空气流量：0～10h，57m3/h；6h～移种：95m3/h；搅拌转速90r/min；pH7～8；培养时间54h。一级种子培养结束，菌体浓度23％；pH值7.7，无其它杂菌污染。
二级种子培养
在10m3二级种子罐中加入麦芽糖240L、混合淀粉370kg、豆油40L、低温压榨一次黄豆饼粉440kg、大米酒糟290kg、玉米蛋白粉140kg、磷酸二氢钾7kg、轻质碳酸钙45kg、硫酸铵45kg、麦芽糖酶450g。先将二级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将一级种子液全部移入二级种子罐进行培养。二级种子培养过程中，罐压0.04～0.08MPa；罐温33～35℃；空气流量250m3/h；搅拌转速115r/min；pH值7～8；培养时间48h。二级种子培养结束，菌体浓度38％；pH值7.6；无其它杂菌污染。
发酵培养
在60m3发酵罐中加入麦芽糖2700L、混合淀粉3300kg、豆油240L、低温压榨一次黄豆饼粉3450kg、大米酒糟2250kg、玉米蛋白粉1650kg、磷酸二氢钾68kg、轻质碳酸钙450kg、硫酸铵440kg、氯化钠320kg、硫酸镁330kg、氯化钴350g、脂肪酸甘油脂2.4kg，大丙烯酸系阳离子交换树脂240kg，麦芽糖酶4kg。先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，发酵培养基灭菌后脂肪控制在5.4％，然后将二级种子液全部移入发酵罐进行培养。发酵培养过程中，发酵前80h，脂肪含量控制在4.5％以上；发酵81～110h，脂肪含量控制在3.5～4.5％；111h至发酵结束，脂肪含量控制在1.7％。发酵前60h，培养温度控制在35～37℃；发酵61h～发酵结束，培养温度控制在34～35℃；搅拌转速180r/min；发酵培养基灭菌后还原糖控制在7.4％；发酵前80h，还原糖含量控制在6％以上；发酵81～110h，还原糖含量控制在4～6％；111h至发酵结束，还原糖含量控制在1.7％。培养时间158h；发酵全程罐压控制在0.06～0.08MPa；发酵过程中pH6.5～7.5；发酵过程中进行菌检，要求无其它杂菌；空气流量：发酵前80h：550m3/h；发酵81～110h，950m3/h；111h至发酵结束，450m3/h。发酵培养结束，菌体浓度45％；发酵单位2357u/ml,pH值7.9。
上述发酵过程中根据情况进行补料。
实施例5
一级种子培养
在1m3一级种子罐中加入麦芽糖20L、混合淀粉30kg、玉米油5L、低温压榨一次黄豆饼粉35kg、大米酒糟20kg、玉米蛋白粉10kg、轻质碳酸钙4kg、硫酸铵5kg，麦芽糖酶30g。首先将一级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的小单孢菌母瓶发酵液接入一级种子罐进行培养，接种量为1L。一级种子培养过程中，罐压0.04～0.08MPa；罐温34～37℃；空气流量：0～10h，60m3/h；6h～移种：100m3/h；搅拌转速100r/min；pH7～8；培养时间55h。一级种子培养结束，菌体浓度25％；pH值7.9，无其它杂菌污染。
二级种子培养
在10m3二级种子罐中加入麦芽糖250L、混合淀粉400kg、玉米油50L、低温压榨一次黄豆饼粉450kg、大米酒糟300kg、玉米蛋白粉150kg、磷酸二氢钾8kg、轻质碳酸钙50kg、硫酸铵50kg、麦芽糖酶500g。先将二级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将一级种子液全部移入二级种子罐进行培养。二级种子培养过程中，罐压0.04～0.08MPa；罐温33～35℃；空气流量300m3/h；搅拌转速120r/min；pH值7～8；培养时间50h。二级种子培养结束，菌体浓度40％；pH值7.9；无其它杂菌污染。
发酵培养
在60m3发酵罐中加入麦芽糖3000L、混合淀粉3600kg、玉米油300L、低温压榨一次黄豆饼粉3600kg、大米酒糟2400kg、玉米蛋白粉1800kg、磷酸二氢钾72kg、轻质碳酸钙480kg、硫酸铵480kg、氯化钠360kg、硫酸镁360kg、氯化钴420g、脂肪酸山梨坦，聚丙烯阳离子交换树脂300kg，麦芽糖酶4.2kg。先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，发酵培养基灭菌后脂肪控制在6％，然后将二级种子液全部移入发酵罐进行培养。发酵培养过程中，发酵前80h，脂肪含量控制在4.5％以上；发酵81～110h，脂肪含量控制在3.5～4.5％；111h至发酵结束，脂肪含量控制在1.7％。发酵前60h，培养温度控制在35～37℃；发酵61h～发酵结束，培养温度控制在34～35℃；搅拌转速180r/min；发酵培养基灭菌后还原糖控制在8％；发酵前80h，还原糖含量控制在6％以上；发酵81～110h，还原糖含量控制在4～6％；111h至发酵结束，还原糖含量控制在1.7％。培养时间158h；发酵全程罐压控制在0.06～0.08MPa；发酵过程中pH6.5～7.5；发酵过程中进行菌检，要求无其它杂菌；空气流量：发酵前80h：600m3/h；发酵81～110h，1000m3/h；111h至发酵结束，500m3/h。发酵培养结束，菌体浓度49％；发酵单位2312u/ml，pH值8.2。
上述发酵过程中根据情况进行补料。
实施例6
一级种子培养：
在1m3一级种子罐中加入麦芽糖16L、混合淀粉26kg、豆油3.5L、低温压榨一次黄豆饼粉31kg、大米酒糟18kg、玉米蛋白粉8kg、轻质碳酸钙3.2kg、硫酸铵3.3kg，麦芽糖酶17g。首先将一级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的小单孢菌母瓶发酵液接入一级种子罐进行培养，接种量为1L。一级种子培养过程中，罐压0.04～0.08MPa；罐温34～37℃；空气流量：0～10h，57m3/h；6h～移种：93m3/h；搅拌转速95r/min；pH7～8；培养时间53h。一级种子培养结束，菌体浓度23％；pH值7.8，无其它杂菌污染。
二级种子培养：
在10m3二级种子罐中加入麦芽糖240L、混合淀粉360kg、豆油45L、低温压榨一次黄豆饼粉43kg、大米酒糟275kg、玉米蛋白粉135kg、磷酸二氢钾7.5kg、轻质碳酸钙42kg、硫酸铵43kg、麦芽糖酶450g。先将二级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将一级种子液全部移入二级种子罐进行培养。二级种子培养过程中，罐压0.04～0.08MPa；罐温33～35℃；空气流量280m3/h；搅拌转速120r/min；pH值7～8；培养时间47h。二级种子培养结束，菌体浓度37％；pH值7.7；无其它杂菌污染。
发酵培养：
在60m3发酵罐中加入麦芽糖2820kg、混合淀粉3420kg、豆油270L、低温压榨一次黄豆饼粉3420g、大米酒糟2280kg、玉米蛋白粉1740kg、磷酸二氢钾70kg、轻质碳酸钙470kg、硫酸铵468kg、氯化钠350kg、硫酸镁342kg、氯化钴415g、聚山梨酯3kg，酚醛阳离子交换树脂265kg，麦芽糖酶4kg。先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，发酵培养基灭菌后脂肪控制在5.7％，然后将二级种子液全部移入发酵罐进行培养。发酵培养过程中，发酵前80h，脂肪含量控制在4.5％以上；发酵81～110h，脂肪含量控制在3.5～4.5％；111h至发酵结束，脂肪含量控制在1.8％。发酵前60h，培养温度控制在35～37℃；发酵61h～发酵结束，培养温度控制在34～35℃；搅拌转速200r/min；发酵培养基灭菌后还原糖控制在7.8％；发酵前80h，还原糖含量控制在6％以上；发酵81～110h，还原糖含量控制在4～6％；111h至发酵结束，还原糖含量控制在1.8％。培养时间158h；发酵全程罐压控制在0.06～0.08MPa；发酵过程中pH6.5～7.5；发酵过程中进行菌检，要求无其它杂菌；空气流量：发酵前80h：570m3/h；发酵81～110h，950m3/h；111h至发酵结束，480m3/h。发酵培养结束，菌体浓度47％；发酵单位2294u/ml，pH值8.1。
上述发酵过程中根据情况进行补料。
上述实施例1-6中补料控制按照下述方式实现：
a补油控制：采用流加法补豆油或玉米油，
脂肪控制：发酵培养基灭菌后脂肪控制在4～6％；发酵前80h，脂肪含量控制在4.5％以上；发酵81～110h，脂肪含量控制在3.5～4.5％；111h至发酵结束，脂肪含量控制在1.5～2％。
发酵前80h不用进行补油，
81h～110h：如果脂肪含量低于4％，补入油；如果脂肪含量超过6％，则停止补油。其计算公式为：补油量(L)＝(5-脂肪含量-残油量)％×发酵液体积(L)
发酵81～110h：如果脂肪含量低于3.5％，补入油；如果脂肪含量超过4.5％，则停止补油。其计算公式为：补油量(L)＝(4-脂肪含量-残油量)％×发酵液体积(L)
111h至发酵结束：如果脂肪含量低于1.5％，补入油；如果脂肪含量超过2％，则停止补油。其计算公式为：补油量(L)＝(1.7-脂肪含量-残油量)％×发酵液体积(L)
b补水：
发酵前60h不用进行补水，
61h～100h：当发酵液菌体浓度＞50％，控制菌体浓度40～50％，
101h至发酵结束：当发酵液菌体浓度＞40％，采用流加法补水，控制菌体浓度30～40％；
c补碱：
发酵前60h，pH不进行控制。
发酵61h至发酵结束：10～20％的氢氧化钠溶液控制其pH在6.5～7.5。
d补入氮源：在发酵周期分别在60h和100h时补入5～10％的氨水，其补入量为发酵液体积的1～1.5％。
e补糖
发酵前80h，不加入麦芽糖。
发酵81～110h，如果还原糖含量＜4％；加入麦芽糖；如果还原糖含量超过6％，则停止加入麦芽糖。其计算公式为：补糖量(kg)＝(5-还原糖量)％×发酵液体积(L)
111h至发酵结束，如果还原糖含量＜1％；加入麦芽糖；如果还原糖含量超过2％，则停止加入麦芽糖。其计算公式为：补糖量(kg)＝(1.5-还原糖量)％×发酵液体积(L)
对比实施例
一级种子培养
在1m3一级种子罐中加入葡萄糖14L、可溶性淀粉22kg、玉米油3L、黄豆饼粉31kg、蛋白胨12kg、鱼粉13kg、轻质碳酸钙2.6kg、硫酸铵3.4kg。首先将一级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的小单孢菌母瓶发酵液接入一级种子罐进行培养，接种量为1L。一级种子培养过程中，罐压0.04～0.08MPa；罐温34～37℃；空气流量100m3/h；搅拌转速100r/min；pH7～8；培养时间50h。一级种子培养结束，菌体浓度12％；pH值7.0，无其它杂菌污染。
二级种子培养
在10m3二级种子罐中加入葡萄糖200g、淀粉300kg、玉米油40L、黄豆饼粉400kg、蛋白胨150kg、鱼粉100kg、磷酸二氢钾6kg、轻质碳酸钙40kg、硫酸铵35kg。先将二级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将一级种子液全部移入二级种子罐进行培养。二级种子培养过程中，罐压0.04～0.08MPa；罐温33～35℃；空气流量300m3/h；搅拌转速120r/min；pH值7～8；培养时间50h。二级种子培养结束，菌体浓度25％；pH值7.9；无其它杂菌污染。
发酵培养
在60m3发酵罐中加入葡萄糖2000kg、淀粉3200kg、玉米油200L、黄豆饼粉3500kg、蛋白胨1300kg、鱼粉1200kg、磷酸二氢钾70kg、轻质碳酸钙450kg、硫酸铵430kg、氯化钠330kg、硫酸镁340kg、氯化钴380g。先将发酵培养基灭菌，冷却，然后将二级种子液全部移入发酵罐进行培养。培养时间155h；发酵全程罐压控制在0.06～0.08MPa；发酵过程中pH6.5～7.5；发酵过程中进行菌检，要求无其它杂菌；空气流量1000m3/h发酵培养结束，菌体浓度32％；发酵单位1487u/ml,pH值7.0。

Claims (11)

1. 一种小单孢菌发酵生产庆大霉素的培养基，包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其特征在于所述一级种子培养基的组成为：麦芽糖10～20ml/L、混合淀粉20～30g/L、豆油或玉米油1～5ml/L、低温压榨一次黄豆饼粉25～35g/L、大米酒糟15～20g/L、玉米蛋白粉5～10g/L、轻质碳酸钙2～4g/L、硫酸铵1～5g/L，麦芽糖酶0.01～0.03g/L；
所述二级种子培养基组成为：麦芽糖20～25ml/L、混合淀粉30～40g/L、豆油或玉米油1～5ml/L、低温压榨一次黄豆饼粉40～45g/L、大米酒糟25～30g/L、玉米蛋白粉10～15g/L、磷酸二氢钾0.5～0.8g/L、轻质碳酸钙3～5g/L、硫酸铵3～5g/L、麦芽糖酶0.03～0.05g/L；
所述发酵培养基的组成为：麦芽糖30～50ml/L、混合淀粉40～60g/L、豆油或玉米油1～5ml/L、低温压榨一次黄豆饼粉50～60g/L、大米酒糟30～40g/L、玉米蛋白粉20～30g/L、磷酸二氢钾0.8～1.2g/L、轻质碳酸钙6～8g/L、硫酸铵5～8g/L、氯化钠4～6g/L、硫酸镁4～6g/L、氯化钴0.003～0.007g/L、非离子表面活性剂0.01～0.05g/L，弱酸性阳离子交换树脂1～5g/L，麦芽糖酶0.04～0.07g/L。
2. 按照权利要求1所述的小单孢菌发酵生产庆大霉素的培养基，其特征在于所述大米酒糟的质量要求是：蛋白质含量在50%以上，水分含量控制在5%以内，80%的原料能够通过60目筛。
3. 按照权利要求1所述的小单孢菌发酵生产庆大霉素的培养基，其特征在于所述低温压榨一次黄豆饼粉质量要求是：黄豆饼粉在低于80℃的条件下压榨1次，要求其油含量控制在7～10%，蛋白质含量在45%以上，80%的原料能够通过80目筛。
4. 按照权利要求1所述的小单孢菌发酵生产庆大霉素的培养基，其特征在于所述混合淀粉是指淀粉中加入其重量的0.006%的泛酸和0.004%的硫辛酸。
5. 按照权利要求1所述的小单孢菌发酵生产庆大霉素的培养基，其特征在于所述非离子表面活性剂为脂肪酸甘油酯、脂肪酸山梨坦或聚山梨酯。
6. 按照权利要求1所述的小单孢菌发酵生产庆大霉素的培养基，其特征在于所述弱酸性阳离子交换树脂为大丙烯酸系阳离子交换树脂、苯丙烯阳离子交换树脂或酚醛阳离子交换树脂。
7. 一种利用权利要求1-6任意一项所述培养基生产庆大霉素的培养方法，其特征在于其工艺步骤包括：
1）一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的小单孢菌母瓶发酵液接入一级种子罐进行培养，接种量控制在一级种子培养基体积的0.5～1%；
2）二级种子培养：先将二级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将已经培养好的菌体浓度15～25%、pH值7～8、无其它杂菌污染的一级种子培养液按照1:9～11的体积比移入二级种子罐进行培养；
3）发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将已经培养好的菌体浓度30～40%、pH值7～8、无其它杂菌污染的二级种子液按照1:5～6的体积比移入发酵罐进行培养，至a 发酵效价每6～8h取样检测，前、后检测的发酵单位相差在100u/ml以内；b 菌体浓度30～50%；c 发酵单位在2200u/mL以上；d pH值6.5～8.5时停止发酵。
8. 按照权利要求6所述的培养方法，其特征在于所述一级种子培养条件为：罐压0.04～0.08MPa；罐温34～37℃；空气流量：0～10h，50～60m3/h；6h～移种：80～100m3/h；搅拌转速60～100r/min；pH7～8；培养时间50～55h。
9. 按照权利要求6所述的培养方法，其特征在于所述二级种子培养条件为：罐压0.04～0.08MPa；罐温33～35℃；空气流量100～300m3/h；搅拌转速100～120r/min；pH值7～8；培养时间：40～50h。
10. 按照权利要求6所述的培养方法，其特征在于所述发酵培养条件为：
a 脂肪控制：发酵培养基灭菌后脂肪控制在4～6%；发酵前80h，脂肪含量控制在4.5%以上；发酵81～110h，脂肪含量控制在3.5～4.5%；111h至发酵结束，脂肪含量控制在1.5～2%；
b 发酵过程采用变温培养：
发酵前60h，培养温度控制在35～37℃，
发酵61h～发酵结束，培养温度控制在34～35℃；
c 搅拌转速：150～220r/min；
d 还原糖含量：发酵培养基灭菌后还原糖控制在6～8%；发酵前80h，还原糖含量控制在6%以上；发酵81～110h，还原糖含量控制在4～6%；发酵111h至发酵结束，还原糖含量控制在1～2%；
e 发酵周期：培养时间150～160h；
f 压力控制：发酵全程罐压控制在0.06～0.08MPa；
g pH控制：发酵过程中pH6.5～7.5；
h 无菌检查：发酵过程中进行菌检，要求无其它杂菌；
i 空气流量：发酵前80h：400～600m3/h；发酵81～110h，800～1000m3/h；发酵111h至发酵结束，300～500m3/h。
11.  按照权利要求6所述的培养方法，其特征在于在发酵过程中进行补料，包括补油、补水、补糖、补碱和补氮源，其中
 a 补油控制：采用流加法补豆油或玉米油，
发酵前80h不用进行补油，
发酵81h～110h，脂肪含量控制在3.5～4.5%，当脂肪含量低于4%，补入油，当脂肪含量超过6%，则停止补油，补油量（L）=(5-脂肪含量-残油量)%×发酵液体积（L），
发酵81～110h，脂肪含量控制在3.5～4.5%，当脂肪含量低于3.5%，补入油，当脂肪含量超过4.5%，则停止补油，补油量（L）=(4-脂肪含量-残油量)%×发酵液体积（L），
发酵111h至发酵结束，脂肪含量控制在1.5～2%，当脂肪含量低于1.5%，补入油，当脂肪含量超过2%，则停止补油，补油量（L）=(1.7-脂肪含量-残油量)%×发酵液体积（L）；
b 补水：
发酵前60h不用进行补水，
发酵61h～100h，当发酵液菌体浓度＞50%，采用流加法补水，控制菌体浓度40～50%，
发酵101h至发酵结束：当发酵液菌体浓度＞40%，采用流加法补水，控制菌体浓度30～40%；
c 补碱：
发酵前60h，pH不进行控制，
发酵61h至发酵结束：10～20%的氢氧化钠溶液控制其pH 在6.5～7.5；
d 补入氮源：在发酵周期分别在60h和100h时补入5～10%的氨水，其补入量为发酵液体积的1～1.5%；
e 补糖：
发酵前80h，不加入麦芽糖，
发酵81～110h，当还原糖含量＜4%，加入麦芽糖，当还原糖含量超过6%，则停止加入麦芽糖，补糖量（kg）=(5-还原糖量)%×发酵液体积（L），
发酵111h至发酵结束，当还原糖含量＜1%，加入麦芽糖，当还原糖含量超过2%，则停止加入麦芽糖，补糖量（kg）=(1.5-还原糖量)%×发酵液体积（L）。
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