CN102634559A - 一种黄霉素的发酵制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄霉素的发酵制备方法，将斑伯氏链丝菌依次在种子培养基和发酵培养基中经活化培养和发酵培养得到，所述发酵培养时向发酵培养基中添加入0.05～0.5g/dl的甜菜碱，发酵过程补充氮源和甜菜碱，维持发酵培养基中碳氮比为2∶3～3∶4，甜菜碱含量为0.1～0.5g/dl。本发明在发酵制备黄霉素时加入甜菜碱作为发酵助剂，促进了氧气和营养物质在斑伯氏链丝菌菌体细胞内外的交换以及黄霉素的渗出，因此有效提高了发酵产量，降低了生产成本，有利于规模型的工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及黄霉素技术领域，尤其涉及一种利用发酵制备黄霉素的方法。
背景技术
黄霉素主要是来自于灰绿链霉菌(斑伯氏链丝菌)的发酵产物，属于弱酸性的磷酸多糖类抗生素。黄霉素在动物消化道内不被吸收，但在自然界中却能够被降解，因此被公认为是对动物无毒害、对环境无染的“绿色添加剂”，此外黄霉素还具有性能稳定、用量少、促生长效果明显、不易产生耐药性、配伍禁忌少等优良特性，因此成为目前被欧盟批准使用的四种抗生素类促生长剂之一，而国外允许在养殖业中使用的含磷糖脂类抗生素只有黄霉素一种。
近年来，随着人们对环境污染和身体健康问题重视程度的提高，黄霉素以其高度安全性、可降解性、无残留及无抗药性、特有的促生长效果等优点，正越来越受到业内人士的关注，其应用范围在不断扩大。但是黄霉素产生菌发酵产率较低，抑制了黄霉素的开发应用，因此，优化黄霉素发酵条件，提升黄霉素的发酵产量，对进一步扩大黄霉素的应用具有非常重要的现实意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种使用发酵助剂甜菜碱发酵制备黄霉素的方法，该方法能明显提高黄霉素的产量、降低生产成本。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种黄霉素的发酵制备方法，将斑伯氏链丝菌依次在种子培养基和发酵培养基中经活化培养和发酵培养得到，所述发酵培养时向发酵培养基中添加入0.05～0.5g/dl的甜菜碱，发酵过程连续补加氮源和甜菜碱，维持发酵培养基中碳氮比为2∶3～3∶4，甜菜碱含量为0.1～0.5g/dl。
优选的，所述斑伯氏链丝菌为斑伯氏链丝菌ATCC 13879。
所述活化培养时，将种子培养基按照50～65％的体积装入量装入种子罐中，调节种子培养基pH值为7.2～7.5，将斑伯氏链丝菌接种入种子罐中，于35～38℃下活化培养25～32小时。
其中，所述种子培养基的配方为：玉米淀粉2.0～4.0g/dl，玉米浆0.3～0.8g/dl，低变性豆粕1.0～3.0g/dl，大豆油0.1～0.3g/dl，碳酸钙0.1～0.4g/dl，氯化钠0.1～0.3g/dl，磷酸二氢钾0.1～0.3g/dl。
所述发酵培养时，将发酵培养基按照55～65％的体积装入量装入发酵罐中，调节发酵培养基pH值为7.0～7.4，将所述活化培养后的种子液按照5～15％的接种量接种入发酵罐中，于35～38℃下发酵培养1～7天。
其中，所述发酵培养基的配方为：玉米浆0.6～1.0g/dl，硫酸铵0.25～0.45g/dl，玉米淀粉2.5～5.0g/dl，黄豆粉2.4～4.4g/dl，豆油3.0～5.0g/dl，硫酸镁0.02～0.08g/dl，硫酸锌0.0002～0.0005g/dl，硫酸亚铁0.00003～0.00006g/dl，硫酸钴0.0001g/dl，硫酸铜0.0004～0.0006g/dl，碳酸钙0.4～0.7g/dl，磷酸二氢钾0.005～0.015g/dl，消泡剂0.015～0.025g/dl。
作为一种改进，在发酵开始后的40h后开始补加豆油，维持碳氮比为2∶3～3∶4。
作为一种优选，所述甜菜碱为无水甜菜碱、一水甜菜碱、盐酸盐甜菜碱、磺酸甜菜碱中的一种或几种的混合物。
所述发酵培养在有氧条件下进行。
作为一种优选，所述发酵培养在搅拌或震荡条件下进行。
种子培养基和发酵培养基适用的碳源包括：糖类如葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、糖蜜、粗糖、糖化的淀粉液、玉米淀粉；脂肪酸类如乙酸、丙酸、苯甲酸。
种子培养基和发酵培养基适用的氮源包括：有机氮源如黄豆粉、豆油、玉米浆、尿素、豆饼水解液；无机氮源如硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、醋酸铵、氨水。
种子培养基和发酵培养基适用的无机盐包括：磷酸盐、钾盐、钠盐、钙盐、镁盐、锰盐、铁盐等微量金属盐。
由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
本发明在发酵制备黄霉素时加入甜菜碱作为发酵助剂，由于黄霉素主要存在于斑伯氏链丝菌体内，在其发酵过程中由于发酵液比较粘稠，不利于斑伯氏链丝菌菌体溶氧和营养物质交换以及黄霉素向外分泌，因此影响了发酵效果和发酵产量，而由于甜菜碱能够调节胞内渗透压，并使细胞膜的通透性得到有效改善，从而促进了氧气和营养物质在斑伯氏链丝菌菌体细胞内外的交换以及黄霉素的渗出，因此有效提高了发酵产量，降低了生产成本，有利于规模型的工业化生产。
具体实施方式
下面结合具体的实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
按照50％的体积装入量，将种子培养基装入种子罐中，调节种子培养基的pH值为7.2，在115℃下，加热15分钟进行灭菌，然后将斑伯氏链丝菌接种入种子罐中，于37℃下活化培养30小时。种子培养基的配方为：玉米淀粉3.0g/dl，玉米浆0.5g/dl，低变性豆粕2.0g/dl，大豆油0.1g/dl，碳酸钙0.3g/dl，氯化钠0.1g/dl，磷酸二氢钾0.2g/dl。
按照55％的体积装入量，将发酵培养基装入发酵罐中，在115℃下，加热15分钟进行灭菌，向发酵培养基中加入0.2g/dl的盐酸盐甜菜碱，调节发酵培养基pH值为7.0，将活化培养后的种子液按照10％的接种量接种入发酵罐中，通气培养，于37℃下搅拌发酵培养6天，在发酵开始后的40h后开始补加豆油，维持碳氮比为3∶4，在发酵培养至120小时后，停止补加豆油；发酵过程连续补加盐酸盐甜菜碱，使盐酸盐甜菜碱的浓度维持在0.1～0.5g/dl。发酵培养基的配方为：玉米浆0.9g/dl，硫酸铵0.3g/dl，玉米淀粉3.0g/dl，黄豆粉3.4g/dl，豆油4.0g/dl，硫酸镁0.05g/dl，硫酸锌0.0002g/dl，硫酸亚铁0.00004g/dl，硫酸钴0.0001g/dl，硫酸铜0.0005g/dl，碳酸钙0.5g/dl，磷酸二氢钾0.01g/dl，消泡剂0.02g/dl。
发酵完毕，用生物测定法检测不同的甜菜碱(盐酸盐甜菜碱形式)不同浓度的情况下发酵罐的黄霉素效价，结果见表1。
表1
| 盐酸盐甜菜碱的浓度(g/dl) | 黄霉素效价(U/mL) |
| 0 | 7736 |
| 0.1 | 8425 |
| 0.2 | 8812 |
| 0.3 | 9236 |
| 0.4 | 9190 |
| 0.5 | 8910 |
实施例2
按照65％的体积装入量，将种子培养基装入种子罐中，调节种子培养基的pH值为7.5，在115℃下，加热15分钟进行灭菌，然后将斑伯氏链丝菌接种入种子罐中，于36℃下活化培养32小时。种子培养基的配方为：玉米淀粉4.0g/dl，玉米浆0.3g/dl，低变性豆粕3.0g/dl，大豆油0.1g/dl，碳酸钙0.4g/dl，氯化钠0.1g/dl，磷酸二氢钾0.3g/dl。
按照65％的体积装入量，将发酵培养基装入发酵罐中，在115℃下，加热15分钟进行灭菌，向发酵培养基中加入0.5g/dl的无水甜菜碱，调节发酵培养基pH值为7.4，将活化培养后的种子液按照15％的接种量接种入发酵罐中，通气培养，于36℃下搅拌或者震荡发酵培养5天，在发酵开始后的40h后开始补加豆油，维持碳氮比为2∶3；发酵过程连续补加无水甜菜碱的浓度维持在0.1～0.5g/dl。发酵培养基的配方为：玉米浆0.6g/dl，硫酸铵0.45g/dl，玉米淀粉5.0g/dl，黄豆粉2.4g/dl，豆油5.0g/dl，硫酸镁0.02g/dl，硫酸锌0.0005g/dl，硫酸亚铁0.00003g/dl，硫酸钴0.0001g/dl，硫酸铜0.0006g/dl，碳酸钙0.4g/dl，磷酸二氢钾0.015g/dl，消泡剂0.015g/dl。
发酵完毕，用生物测定法检测不同的甜菜碱(无水甜菜碱形式)不同浓度的情况下发酵罐的黄霉素效价，结果见表2。
表2
| 无水甜菜碱的浓度(g/dl) | 黄霉素效价(U/mL) |
| 0 | 7120 |
| 0.1 | 7823 |
| 0.2 | 8812 |
| 0.3 | 9236 |
| 0.4 | 8450 |
| 0.5 | 7865 |
实施例3
按照60％的体积装入量，将种子培养基装入种子罐中，调节种子培养基的pH值为7.3，在115℃下，加热15分钟进行灭菌，然后将斑伯氏链丝菌接种入种子罐中，于38℃下活化培养28小时。种子培养基的配方为：玉米淀粉2.5g/dl，玉米浆0.5g/dl，低变性豆粕2.0g/dl，大豆油0.2g/dl，碳酸钙0.25g/dl，氯化钠0.2g/dl，磷酸二氢钾0.2g/dl。
按照60％的体积装入量，将发酵培养基装入发酵罐中，在115℃下，加热15分钟进行灭菌，向发酵培养基中加入0.3g/dl的一水甜菜碱，调节发酵培养基pH值为7.2，将活化培养后的种子液按照12％的接种量接种入发酵罐中，通气培养，于38℃下搅拌或者震荡发酵培养5.5天，在发酵开始后的40h后开始补加豆油，维持碳氮比为3∶4，在发酵培养至120小时后，停止补加豆油；发酵过程连续补加一水甜菜碱，使一水甜菜碱的浓度维持在0.1～0.5g/dl。发酵培养基的配方为：玉米浆0.8g/dl，硫酸铵0.35g/dl，玉米淀粉3.0g/dl，黄豆粉3.2g/dl，豆油4.0g/dl，硫酸镁0.05g/dl，硫酸锌0.0003g/dl，硫酸亚铁0.00005g/dl，硫酸钴0.0001g/dl，硫酸铜0.0005g/dl，碳酸钙0.6g/dl，磷酸二氢钾0.009g/dl，消泡剂0.02g/dl。
发酵完毕，用生物测定法检测不同的甜菜碱(一水甜菜碱)不同浓度的情况下发酵罐的黄霉素效价，结果见表3。
表3
| 一水甜菜碱的浓度(g/dl) | 黄霉素效价(U/mL) |
| 0 | 6930 |
| 0.1 | 7253 |
| 0.2 | 8060 |
| 0.3 | 8845 |
| 0.4 | 9117 |
| 0.5 | 8020 |
实施例4
按照55％的体积装入量，将种子培养基装入种子罐中，调节种子培养基的pH值为7.4，在115℃下，加热15分钟进行灭菌，然后将斑伯氏链丝菌接种入种子罐中，于37℃下活化培养26小时。种子培养基的配方为(g/dl)：葡萄糖2.5、酵母粉0.3、玉米淀粉3.0、蛋白胨0.3、黄豆饼粉2.5、糊精2.0、硫酸镁0.025、磷酸二氢钾0.02、硫酸铵0.25、氯化钠0.3、碳酸钙0.6。
按照55～65％的体积装入量，将发酵培养基装入发酵罐中，在115℃下，加热15分钟进行灭菌，向发酵培养基中加入0.2g/dl的磺酸甜菜碱，调节发酵培养基pH值为7.1，将活化培养后的种子液按照15％的接种量接种入发酵罐中，通气培养，于37℃下震荡发酵培养7天，在发酵开始后的40h后开始补加豆油，维持碳氮比为2∶3，在发酵培养至120小时后，停止补加豆油；发酵过程连续补加磺酸甜菜碱，使磺酸甜菜碱的浓度维持在0.1～0.5g/dl。发酵培养基的配方为(g/dl)：豆饼粉3.75、玉米粉1.5、葡萄糖1.0、淀粉3.75、硫酸铵0.25、硫酸镁0.015、碳酸钙0.3、磷酸二氢钾0.008。
发酵完毕，用生物测定法检测不同的甜菜碱(磺酸甜菜碱)不同浓度的情况下发酵罐的黄霉素效价，结果见表4。
表4
| 磺酸甜菜碱的浓度(g/dl) | 黄霉素效价(U/mL) |
| 0 | 6760 |
| 0.1 | 6835 |
| 0.2 | 8190 |
| 0.3 | 7206 |
| 0.4 | 6987 |
| 0.5 | 6200 |
实施例5
按照60％的体积装入量，将种子培养基装入种子罐中，调节种子培养基的pH值为7.3，在115℃下，加热15分钟进行灭菌，然后将斑伯氏链丝菌接种入种子罐中，于37℃下活化培养32小时。种子培养基的配方为(g/dl)：葡萄糖2.5、酵母粉0.3、玉米淀粉3.0、蛋白胨0.3、黄豆饼粉2.5、糊精2.0、硫酸镁0.025、磷酸二氢钾0.02、硫酸铵0.25、氯化钠0.3、碳酸钙0.6。
按照60％的体积装入量，将发酵培养基装入发酵罐中，在115℃下，加热15分钟进行灭菌，向发酵培养基中加入0.4g/dl的一水甜菜碱，调节发酵培养基pH值为7.2，将活化培养后的种子液按照10％的接种量接种入发酵罐中，通气培养，于37℃下搅拌发酵培养7天，在发酵开始后的40h后开始补加豆油，维持碳氮比为3∶4，在发酵培养至120小时后，停止补加豆油；发酵过程连续补加一水甜菜碱，使一水甜菜碱的浓度维持在0.1～0.5g/dl。发酵培养基的配方为(g/dl)：豆饼粉3.75、玉米粉1.5、葡萄糖1.0、淀粉3.75、硫酸铵0.25、硫酸镁0.015、碳酸钙0.3、磷酸二氢钾0.008。
发酵完毕，用生物测定法检测不同的甜菜碱(一水甜菜碱)不同浓度的情况下发酵罐的黄霉素效价，结果见表5。
表5
| 一水甜菜碱的浓度(g/dl) | 黄霉素效价(U/mL) |
| 0 | 6785 |
| 0.1 | 7725 |
| 0.2 | 8363 |
| 0.3 | 8945 |
| 0.4 | 8156 |
| 0.5 | 7656 |
实施例6
按照50％的体积装入量，将种子培养基装入种子罐中，调节种子培养基的pH为7.2，在115℃下，加热15分钟进行灭菌，然后将斑伯氏链丝菌接种入种子罐中，于37℃下活化培养30小时。种子培养基的配方为：玉米淀粉3.0g/dl，玉米浆0.5g/dl，低变性豆粕2.0g/dl，大豆油0.1g/dl，碳酸钙0.3g/dl，氯化钠0.1g/dl，磷酸二氢钾0.2g/dl。
按照55％的体积装入量，将发酵培养基装入发酵罐中，在115℃下，加热15分钟进行灭菌，向发酵培养基中加入0.1～0.5g/dl的盐酸盐甜菜碱，调节发酵培养基pH为7.0，将活化培养后的种子液按照10％的接种量接种入发酵罐中，通气培养，于37℃下搅拌发酵培养6天，在发酵开始40h后开始补加豆油，维持培养基碳氮比为3∶4，在发酵培养至120小时后，停止补加豆油；发酵过程连续补加盐酸盐甜菜碱，使甜菜碱的浓度维持在0.3g/dl。发酵培养基的配方为：玉米浆0.9g/dl，硫酸铵0.3g/dl，玉米淀粉3.0g/dl，黄豆粉3.4g/dl，豆油4.0g/dl，硫酸镁0.05g/dl，硫酸锌0.0002g/dl，硫酸亚铁0.00004g/dl，硫酸钴0.0001g/dl，硫酸铜0.0005g/dl，碳酸钙0.5g/dl，磷酸二氢钾0.01g/dl，消泡剂0.02g/dl。
发酵完毕，用生物测定法检测在不同的盐酸盐甜菜碱初始添加量下发酵罐的黄霉素效价，结果见表6。
表6
| 盐酸盐甜菜碱的初始添加量(g/dl) | 黄霉素效价(U/mL) |
| 0 | 7620 |
| 0.1 | 8335 |
| 0.2 | 8800 |
| 0.3 | 9356 |
| 0.4 | 9096 |
| 0.5 | 9100 |
Claims (9)
1.一种黄霉素的发酵制备方法，将斑伯氏链丝菌依次在种子培养基和发酵培养基中经活化培养和发酵培养得到，其特征在于：所述发酵培养时向发酵培养基中添加入0.05～0.5g/dl的甜菜碱，发酵过程连续补充氮源和甜菜碱，维持发酵培养基中碳氮比为2∶3～3∶4，甜菜碱含量为0.1～0.5g/dl。
2.如权利要求1所述的一种黄霉素的发酵制备方法，其特征在于：所述活化培养时，将种子培养基按照50～65％的体积装入量装入种子罐中，调节种子培养基pH值为7.2～7.5，将斑伯氏链丝菌接种入种子罐中，于35～38℃下活化培养25～32小时。
3.如权利要求2所述的一种黄霉素的发酵制备方法，其特征在于所述种子培养基的配方为：玉米淀粉2.0～4.0g/dl，玉米浆0.3～0.8g/dl，低变性豆粕1.0～3.0g/dl，大豆油0.1～0.3g/dl，碳酸钙0.1～0.4g/dl，氯化钠0.1～0.3g/dl，磷酸二氢钾0.1～0.3g/dl。
4.如权利要求2所述的一种黄霉素的发酵制备方法，其特征在于：所述发酵培养时，将发酵培养基按照55～65％的体积装入量装入发酵罐中，调节发酵培养基pH值为7.0～7.4，将所述活化培养后的种子液按照5～15％的接种量接种入发酵罐中，于35～38℃下发酵培养1～7天。
5.如权利要求4所述的一种黄霉素的发酵制备方法，其特征在于所述发酵培养基的配方为：玉米浆0.6～1.0g/dl，硫酸铵0.25～0.45g/dl，玉米淀粉2.5～5.0g/dl，黄豆粉2.4～4.4g/dl，豆油3.0～5.0g/dl，硫酸镁0.02～0.08g/dl，硫酸锌0.0002～0.0005g/dl，硫酸亚铁0.00003～0.00006g/dl，硫酸钴0.0001g/dl，硫酸铜0.0004～0.0006g/dl，碳酸钙0.4～0.7g/dl，磷酸二氢钾0.005～0.015g/dl，消泡剂0.015～0.025g/dl。
6.如权利要求5所述的一种黄霉素的发酵制备方法，其特征在于：在发酵开始后的40h后开始补加豆油，维持碳氮比为2∶3～3∶4。
7.如权利要求1或6所述的任一种黄霉素的发酵制备方法，其特征在于：所述甜菜碱为无水甜菜碱、一水甜菜碱、盐酸盐甜菜碱、磺酸甜菜碱中的一种或几种的混合物。
8.如权利要求7所述的一种黄霉素的发酵制备方法，其特征在于：所述发酵培养在有氧条件下进行。
9.如权利要求7所述的一种黄霉素的发酵制备方法，其特征在于：所述发酵培养在搅拌或震荡条件下进行。
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| 《饲料工业》 20081231 吴海燕等 表面活性剂的不同添加量对黄霉素发酵效价的影响 第32-33页 1-9 第29卷, 第2期 * |
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| 蔡健等: "黄霉素补糖工艺的试验", 《中国兽医杂志》 * |
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