ES2296063T3 - Produccion de poliquetidos y otros productos naturales. - Google Patents

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Abstract

Un método para la generación de análogos de ligandos de FKBP que incorpora una unidad de partida no natural, dicho método comprende: (a) la generación de una cepa recombinante en la que al menos el homólogo de rapK se ha suprimido o inactivado; y (b) la suplementación de una unidad de partida no natural a dicha cepa.

Description

Producción de poliquétidos y otros productos naturales.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a la producción de poliquétidos y otros productos naturales y con librerías de compuestos y compuestos individuales novedosos. Un área importante es el aislamiento y uso potencial de análogos novedosos de ligandos de FKBP y las células hospederas que producen estos compuestos. La invención se ocupa, de modo particular, de los métodos para la transformación eficiente de cepas que producen análogos de FKBP y células recombinantes en las que los genes clonados o casetes génicos se expresan para generar compuestos novedosos tales como poliquétidos (especialmente rapamicina) análogos a los ligandos de FKBP, y a los procesos para su preparación, y a los medios empleados en la misma (p.e. ácidos nucleicos, vectores, casetes génicos y cepas genéticamente modificadas).
Antecedentes de la invención
La rapamicina (sirolimus) (Figura 1) es un macrólido lipófilo producido por Streptomyces hygroscopicus NRRL 5491 (Sehgal et al., 1975; Vézina et al., 1975; Patente de U.S. No. 3,929,992; Patente de U.S. No. 3,993,749) con un grupo 1,2,3-tricarbonilo enlazado a una lactona del ácido pipecólico (Paiva et al., 1991). Otros macrólidos relacionados (Figura 2) incluyen FK506 (tacrolimus) (Schreiber y Crabtree, 1992), FK520 (ascomicina o inmunomicina) (Wu et al., 2000), FK525 (Hatanaka H, et al., 1989, FK523 (Hatanaka, H., et al., 1988), antascomicinas (Fehr, T., et al., 1996) y meridamicina (Salituro et al., 1995). Para el propósito de esta invención, la rapamicina se describe mediante la convención de numeración de McAlpine et al. (1991), con preferencia sobre las convenciones de numeración de Findlay et al. (1980) o de los Chemical Abstracts (11th Cumulative Index, 1982-1986 p60719CS).
El modo de acción versátil de la rapamicina demuestra el valor farmacológico del compuesto y enfatiza la necesidad del aislamiento de derivados novedosos del fármaco. La rapamicina muestra una actividad antifúngica moderada, fundamentalmente contra especies de Candida pero también contra hongos filamentosos (Baker et al., 1978; Sehgal et al., 1975; Vézina et al, 1975; Patente de U.S. No. 3,929,992; Patente de U.S. No. 3,993,749). La rapamicina inhibe la proliferación celular utilizando las vías de transducción de señales en una variedad de tipos celulares, p.e. mediante la inhibición de la vía de señalización que permite la progresión de la fase G_{1} a la S del ciclo celular (Kuo et al., 1992). En las células T, la rapamicina inhibe la señalización a partir del receptor de IL-2 y la autoproliferación subsiguiente de las células T, lo que produce inmunosupresión. Los efectos inhibitorios de la rapamicina no se limitan a las células T, pues la rapamicina inhibe la proliferación de muchos tipos de células en los mamíferos (Brunn et al., 1996). La rapamicina es, por tanto, un poderoso inmunosupresor con aplicaciones terapéuticas establecidas o predichas en la prevención del rechazo de alotransplantes de órganos y en el tratamiento de enfermedades autoinmunes (Kahan et al., 1991). La misma parece causar un menor número de efectos colaterales que los tratamientos antirrechazo estándares (Navia, 1996). La 40-O-(2-hidroxi)etil-rapamicina (SDZ RAD, Certican, Everolimus) es un análogo semisintético de la rapamicina que muestra efectos farmacológicos inmunosupresores (Sedrani, R. et al., 1998; U.S. 5,665,772). La eficacia clínica del fármaco se encuentra actualmente bajo investigación en ensayos clínicos en Fase III (Kirchner et al., 2000). El éster de rapamicina CCI-779 (Wyeth-Ayerst) inhibe el crecimiento celular in vitro e inhibe el crecimiento tumoral in vivo (Yu et al., 2001). El fármaco se encuentra actualmente en ensayos clínicos en Fase III. El valor de la rapamicina en el tratamiento de soriasis de placa crónica (Kirby y Griffiths, 2001), el uso potencial de efectos tales como la estimulación del crecimiento de neuritas en células PC12 (Lyons et al., 1994), el bloqueo de las respuestas proliferativas a citoquinas por células vasculares y del músculo liso después de daño mecánico (Gregory et al., 1993) y su papel en la prevención de la fibrosis por alotrasplante (Waller y Nicholson, 2001) son áreas de intensa investigación (Kahan y Camardo, 2001). Informes recientes revelan que la rapamicina está asociada con una menor incidencia de cáncer en pacientes con alotransplantes de órganos que están bajo terapia inmunosupresora a largo plazo que en aquellos que se encuentran bajo otros regímenes inmunosupresores, y que esta incidencia reducida del cáncer se debe a la inhibición de la angiogénesis (Guba et al., 2002). Se ha informado que las actividades neurotróficas de los ligandos de la inmunofilina son independientes de sus actividades inmunosupresoras (Steiner et al., 1997) y que la estimulación del crecimiento de nervios se promueve por alteración del complejo del receptor a esteroides maduro, como se describe en la aplicación de la patente WO01/03692. Se han informado efectos colaterales tales como la hiperlipidemia y la trombocitopenia, así como efectos teratogénicos potenciales (Hentges et al., 2001; Kahan y Camardo, 2001).
El esqueleto poliquétido de la rapamicina se sintetiza mediante una condensación cabeza cola de un total de siete unidades de propionato y siete unidades de acetato a una unidad de partida de ácido ciclohexano carboxílico, derivado del siquimato (Paiva et al., 1991). El iminoácido derivado de la L-lisina, ácido pipecólico, se condensa a través de un enlace amida con el último acetato del esqueleto poliquétido (Paiva et al., 1993) y le sigue una lactonización para formar el macrociclo. Se ha secuenciado una región genómica de 107 kb que contiene el cluster de genes biosintéticos (Schwecke et al., 1995). El análisis de los marcos de lectura abiertos reveló tres grandes genes que codifican para la poliquétido sintasa modular (PKS) (Aparicio et al., 1996; Schwecke et al., 1995). Embebido entre los genes PKS se encuentra el gen rap^{P} que codifica para una proteína con similitud de secuencia con los dominios de activación de las sintetasas de péptidos no ribosomales, y que se piensa que actúe de modo análogo (König et al., 1997). La región que codifica para los genes PKS está flanqueada por los dos lados por 24 marcos de lectura abiertos adicionales que codifican para enzimas que se cree que se requieren en la biosíntesis de la rapamicina (Molnár et al., 1996). Estos incluyen las siguientes enzimas de modificación de post-poliquétido: dos monooxigenasas citocromo P-450, designadas como RapJ y RapN, una ferredoxina asociada, RapO, y tres O-metiltransferasas potenciales dependientes de SAM, Rapl, RapM y RapQ. Otros genes adyacentes tienen posibles funciones en la regulación y secreción de la rapamicina (Molnár et al., 1996). El cluster contiene también al gen rapL cuyo producto, RapL se propone para catalizar la formación del precursor de la rapamicina, el ácido L-pipecólico, a través de la ciclodesaminación de la L-lisina (Khaw et al., 1998; Paiva et al., 1993). La introducción de una mutación con corrimiento del marco de lectura en rapL dio origen a un mutante incapaz de producir cantidades significativas de rapamicina y la suplementación del medio de cultivo con ácido L-pipecólico restableció los niveles de producción de rapamicina del tipo salvaje (Khaw et al., 1998). Los precursores de la biosíntesis del anillo ciclohexano de la rapamicina se originan de la vía del ácido siquímico (Lowden et aL, 1996; Lowden et al., 2001). Otros macrólidos estrechamente relacionados tales como el FK506 (tacrolimus) (Schreiber y Crabtree, 1992), FK520 (ascomicina o inmunomicina) (Wu et al., 2000), la antascomicina (Fehr, T., et al., 1996) y la meridamicina (Salituro et aL, 1995) comparten un farmacóforo común que interactúa con las proteínas de unión a FK506 (FKBPs) (Figura 2). De este modo, la rapamicina y los compuestos relacionados, por ejemplo, pero sin limitarse a, FK506, FK520, "hyg", FK523, meridamicina, antascomicina, FK525 y tsukubamicina pueden considerarse "ligandos de FKBP". La secuencia parcial del cluster de genes FK506 (Motamedi et al., 1996; Motamedi et al., 1997; Motamedi y Shafiee, 1998), del cluster "hyg" (Ruan et al., 1997) y la secuencia completa del cluster de genes FK520 ha sido publicada (Wu et al., 2000; Patente de U.S. No. 6,150,513). Existe una homología significativa entre los genes dentro de estos clusters y los clusters de genes de la biosíntesis de la rapamicina, y similitud en la función de la enzima (Motamedi et al., 1996).
Se cree que las acciones farmacológicas de la rapamicina que se han caracterizado hasta la fecha se encuentren mediadas por la interacción con receptores citosólicos nombrados FKBPs o inmunofilinas. Las inmunofilinas (este término se utiliza para denotar proteínas de unión a inmunosupresores) catalizan la isomerisación de enlaces peptidil prolina en cis y trans y pertenecen a una familia de enzimas altamentes conservadas, que se encuentran en una amplia variedad de organismos (Rosen y Schreiber, 1992). Dos grandes grupos de enzimas que pertenecen a la familia de las inmunofilinas están representados por los FKBPs y las ciclofilinas (Schreiber y Crabtree, 1992). El principal receptor intracelular de la rapamicina en células T en eucariontes es FKBP12 (DiLella y Craig, 1991), y el complejo resultante interactúa de manera específica con proteínas blanco para inhibir la cascada de transducción de señales de la célula. FK506, un agente inmunosupresor relacionado estructuralmente con la rapamicina, también une de modo específico a FKBP12, pero efectúa la inmunosupresión a través de un mecanismo diferente (Chang et al., 1991; Sigal y Dumont, 1992). La rapamicina y FK506 compiten por el mismo sitio de unión, de modo que FK506 pudiera tener un efecto de antagonismo con la rapamicina cuando ambas drogas se utilizan juntas (Cao et al., 1995). El análisis de la estructura cristalina del complejo FKBP12-rapamicina ha identificado un farmacóforo de unión a rapamicina llamado el "dominio de unión" (Van Duyne et al., 1993) (ver la Figura 1). El "dominio de unión" se requiere para la interacción con la inmunofilina y consta, tanto para la FK506 como para la rapamicina, de la región C-1 a C-14, incluyendo el enlace éster, el anillo pipecolinilo, el dicarbonilo y el anillo hemiacetal (ver la Figura 2). La interacción se caracteriza por poseer numerosos contactos hidrofóbicos y algunos puentes de hidrógeno incluyendo uno al grupo hidroxilo en el anillo ciclohexano. El anillo pipecolinilo (C2 a N7) logra la penetración más profunda al interior de la proteína cuando se encuentra rodeado por residuos de aminoácidos aromáticos altamente conservados que recubren la cavidad de unión hidrofóbica. Los dos grupos carbonilo de C1 y de C8 están involucrados en enlaces por puentes de hidrógeno y el grupo carbonilo del C9 se interna en un bolsillo formado por tres residuos de aminoácidos aromáticos completamente conservados (un residuo de tirosina y dos residuos de fenilalanina) en FKBP12. El dominio del complejo inmunofilina-ligando que interactúa con la proteína blanco se proyecta hacia el exterior del FKBP.
El blanco del complejo rapamicina-FKBP12 se ha identificado en levaduras como TOR (blanco de la rapamicina) (Alarcon et al., 1999) y la proteína de mamíferos se conoce como FRAP (proteína asociada a FKBP-rapamicina) o mTOR (blanco de la rapamicina de mamíferos) (Brown et al., 1994). Estas proteínas muestran una similitud significativa con los dominios fosfotransferasa de las fosfatidilinositol 3-quinasas y la observación de que una mutación puntual en el dominio de unión del FKBP12-rapamicina (FRB) de mTOR elimina la actividad de la mTOR quinasa proporciona evidencias del papel de FRB en la función del dominio quinasa (Vilella-Bach et al., 1999). Se ha obtenido la estructura cristalina de FKBP12-rapamicina con una forma truncada de mTOR que contiene el dominio FRB (Chen et al., 1995) y de este modo se ha definido el dominio "efector" de la rapamicina (Choi et al., 1996; Liang et al., 1999). El análisis de la estructura cristalina reveló que los contactos proteína-proteína se encuentran relativamente limitados en comparación con la interacción entre la rapamicina y cada proteína. No se identificaron puentes de hidrógeno entre la rapamicina y FRB. La interacción se concentra en una serie de contactos hidrofóbicos entre la región trieno de la rapamicina y, fundamentalmente, residuos aromáticos de FRB (Liang et al., 1999). El átomo más profundamente enterrado de la rapamicina es el metilo unido al C23 (ver la Figura 2). La región C23 a C34 y el anillo ciclohexilo de la rapamicina tienen contactos hidrofóbicos superficiales con FRB. Se hizo evidente la existencia de un pequeño cambio conformacional en la rapamicina entre los complejos binarios y ternarios (Liang et al., 1999).
Se detectaron las divergencias entre los efectos biológicos de los análogos del grupo metoxi de C16 de la rapamicina y su capacidad de unir a FKBP12 y se postuló la localización de los sustituyentes de C16 en el espacio interfacial entre FKBP12 y mTOR (Luengo et al., 1995). El análisis de la estructura cristalina de FKBP12 con la 28-O-metilo rapamicina, que no es inmunosupresora, reveló una diferencia significativa en la orientación del anillo ciclohexilo, lo que puede provocar la perturbación de la unión de mTOR (Kallen et al., 1996).
La rapamicina ejerce su acción sobre las cascadas de señalización en la célula a través de la inhibición de la p70^{S6k} quinasa, una quinasa serina/treonina de eucariontes superiores que fosforila a la proteína ribosomal S6 (Ferrari et al., 1993; Kuo et al., 1992). La proteína S6 se localiza en la subunidad ribosomal 40S y se cree que sea un sitio funcional importante involucrado en la unión del tRNA y del mRNA. Se ha postulado una función regulatoria en la traducción del mRNA de la fosforilación de S6 por p70^{S6k} (Kawasome et al., 1998). La rapamicina inhibe la síntesis de proteína a través de su efecto sobre otros eventos relacionados con el crecimiento, incluyendo la actividad de quinasas dependientes de ciclinas, la fosforilación del modulador del elemento de respuesta a cAMP (CREM) y la fosforilación de la proteína de unión al factor de elongación 4E-BP1 (FAS1) (Hung et al., 1996). El fármaco induce la acumulación de las especies desfosforiladas de 4E-BP1 que se unen al factor de iniciación de la traducción elF-4E, y de este modo, suprimen la iniciación de la traducción de los mRNAs dependientes de cap (Hara et al., 1997; Raught et al., 2001).
Se ha descrito la existencia de una relación entre la señalización de mTOR y la síntesis de proteínas localizada en las neuronas; el efecto sobre el estado de fosforilación de las proteínas involucradas en el control de la traducción; la abundancia de los componentes de la maquinaria traduccional a niveles transcripcional y traduccional; el control de la actividad de la aminoácido permeasa y la coordinación de la transcripción de muchas enzimas involucradas en vías metabólicas (Raught et al., 2001). Las vías de señalización sensibles a rapamicina también parecen desempeñar un papel importante en el desarrollo embrionario del cerebro, el aprendizaje y la formación de la memoria (Tang et al., 2002). Los estudios de las proteínas TOR en levaduras han revelado también sus papeles en la modulación de las vías de señalización sensibles a nutrientes (Hardwick et al., 1999). De manera semejante, se ha mostrado que mTOR es un blanco directo de la acción de la proteína quinasa B y que tiene un papel clave en la señalización de la insulina (Sheferd et al., 1998; Nave et al., 1999). El TOR de mamíferos ha sido involucrado también en la polarización del citoesqueleto de actina y la regulación de la iniciación de la traducción (Alarcon et al., 1999). Las fosfatidilinositol 3-quinasas, tales como mTOR, son funcionales en varios aspectos de la patogénesis de tumores tales como la progresión del ciclo celular, la adhesión, la supervivencia celular y la angiogénesis (Roymans y Slegers, 2001).
La mayor parte de las inmunofilinas no parecen estar directamente involucradas en actividades inmunosupresoras y se conoce relativamente poco acerca de sus ligandos naturales aunque se ha informado la existencia de candidatos a ligandos naturales de las FKBPs llamados proteínas asociadas a FKBP (FAP) tales como FAP48 y FAP1. La rapamicina impidió la interacción específica de las FAPs con FKBPs durante la formación de complejos de manera dependiente de la dosis (Chambraud et al., 1996; Kunz et al., 2000). Las inmunofilinas parecen ejercer su función en un amplio intervalo de actividades celulares tales como el plegamiento de las proteínas; el ensamblaje y tráfico de proteínas; la co-regulación de complejos moleculares que incluyen las proteínas de choque térmico; los receptores a esteroides; los canales iónicos; las interacciones célula a célula y la transcripción y traducción de genes (Galat 2000; Hamilton y Steiner 1998). Todas las inmunofilinas poseen la propiedad de plegamiento de proteína de la isomerisación peptidil-protil cis-trans y se han encontrado varias inmunofilinas localizadas en el retículo endoplasmático, el sitio principal de síntesis de proteínas en la célula. Además de FKBP12 (U.S. 5,109,112) otras inmunofilinas incluyen a FKBP12.6 (U.S. 5,457,182), FKBP13 (Hendrickson et al., 1993; U.S. 5,498,597), FKBP25 (Hung y Schreiber, 1992; Jin et al., 1992), FKBP14.6 (U.S. 5,354,845), FKBP52 (U.S. 5,763,590), FKBP60 (Yem et al., 1992) y FKBP65 (Patterson et al., 2000).
El gran número de FKBPs que se encuentran presentes en diferentes tipos celulares también destaca la utilidad del aislamiento de análogos de ligandos de FKBP novedosos con dominios efectores y/o de unión con potencialidad de cambiarse.
Los estudios farmacocinéticos de la rapamicina y de los análogos de la rapamicina han demostrado la necesidad del desarrollo de compuestos novedosos de la rapamicina que puedan ser más estables en solución, más resistentes al ataque metabólico y que tengan una biodisponibilidad mejorada. Se ha recurrido a la modificación utilizando las posiciones químicamente disponibles en la molécula, sin embargo, esta estrategia tiene una utilidad limitada debido a que los sitios disponibles para la modificación química están limitados y existe una menor capacidad para modificar de modo selectivo una posición particular. Las estrategias biológicas para producir análogos novedosos de la rapamicina han sido menos exitosas debido a las dificultades encontradas al trabajar con el organismo (Lomovskaya et al., 1997; Kieser et al., 2000) a pesar de la disponibilidad de la secuencia del cluster de genes de la biosíntesis de rapamicina a partir de S. hygroscopicus (Schwecke et al., 1995).
Se ha informado de una gama de análogos de la rapamicina sintetizados utilizando los sitios químicamente biodisponibles de la molécula. La descripción de los siguientes compuestos se adaptó al sistema de numeración de la molécula de rapamicina descrito en la Figura 1. Los sitios químicamente biodisponibles en la molécula para la derivatización o el remplazamiento incluyen los grupos hidroxilo C40 y C28 (p.e. U.S. 5,665,772; U.S. 5,362,718), los grupos metoxi C39 y C16 (p.e. WO96/41807; U.S. 5,728,710), los grupos ceto C32, C26 y C9 (p.e. U.S. 5,378,836; U.S. 5,138,051; U.S. 5,665,772). La hidrogenación en C17, C19 y/o C21, dirigida al trieno, condujo a la retención de la actividad antifúngica pero a la pérdida de la inmunosupresión (p.e. U.S. 5,391,730; U.S. 5,023,262). A través de la derivatización se han logrado mejoras significativas en la estabilidad de la molécula (p.e. formación de oximas en C32, C40 y/o C28, U.S. 5,563,145, U.S. 5,446,048), resistencia al ataque metabólico (p.e. U.S. 5,912,253), biodisponibilidad (p.e. U.S. 5,221,670; U.S. 5,955,457; WO98/04279) y la producción de prodrogas (p.e. U.S. 6,015,815; U.S. 5,432,183). Sin embargo, la modificación química requiere cantidades significativas del molde de rapamicina y, como se trata de un compuesto lábil base y ácido, es difícil trabajar con el mismo. Cuando la derivatización química puede ser grupo selectiva, es a menudo difícil que sea sitio selectiva. Por tanto, la modificación química requiere invariablemente múltiples pasos de protección y desprotección y produce mezclas de productos con rendimientos variables.
Se ha descrito también el aislamiento de análogos de la rapamicina utilizando métodos biológicos tales como la biotransformación y la modificación genética basada en fagos. El aislamiento de metabolitos minoritarios a partir de cepas mutantes y de cepas que producen rapamicina ha proporcionado pequeñas cantidades de un número de análogos de la rapamicina. Estas cepas son con frecuencia de bajo rendimiento y producen mezclas de análogos de la rapamicina. Se informó del aislamiento de la 27-O-desmetilrapamicina y 27-desmetoxirapamicina a partir del sobrenadante de cultivo de S. hygroscopicus NCIMB 40319 (Box et al., 1995). La actividad antifúngica de la 27-O-desmetilrapamicina fue menor que la de la rapamicina pero la inhibición de la actividad FKBP12 PPlasa pareció incrementarse. La inhibición de la proliferación de células T esplénicas murinas estimuladas por ConA y la inhibición de la proliferación estimulada por LPS de células B esplénicas murinas disminuyó al compararse con la rapamicina (Box et al., 1995). De modo similar, las actividades antifúngicas de los derivados de la rapamicina prolilrapamicina, 27-O-desmetilrapamicina y 27-desmetoxirapamicina fueron menores que la de la rapamicina (Wong et al., 1998). Se han aislado también análogos de la rapamicina (16-O-desmetilrapamicina, 27-O-desmetilrapamicina, 39-O-desmetilrapamicina, 16,27-O-bisdesmetitrapamicina, prolilrapamicina, 26-O-desmetilprolilrapamicina, 9-deoxorapamicina, 27-desmetoxirapamicina, 27-desmetoxi-39-O-desmetilrapamicina, 9-deoxo-27-desmetoxirapamicina, 28-dehidrorapamicina, 9-deoxo-27-desmetoxi-39-O-desmetifrapamicina) a partir de Actinoplanes sp N902-109 después de la adición de inhibidores de la citocromo P450 y/o la suplementación del cultivo con precursores o después de la biotransformación de la rapamicina aislada (Nishida et al., 1995). El uso de tales inhibidores, sin embargo, solo permite seleccionar el direccionamiento hacia una enzima particular y no es sitio selectiva. La producción racional de un único análogo seleccionado no es posible por este método. La producción resultante de mezclas de análogos de la rapamicina en lugar de un único producto deseado también tiene un impacto en el rendimiento. Se evaluó la actividad inhibitoria de los compuestos sobre la reacción de linfocitos mezclados (MLR) y se detectó poco efecto sobre la actividad después de la pérdida del grupo metilo en C27 y/o C16. Además, la 9-deoxorapamicina mostró una disminución más significativa en la actividad, y la pérdida del grupo metoxi en C27, el grupo hidroxi en C28 y la sustitución del grupo pipecolinilo por un grupo prolilo produjo una reducción en la potencia (Nishida et al., 1995). De modo semejante, se ha informado la biotransformación de la rapamicina y el aislamiento de 16,39-O-bisdesmetilrapamicina (WO 94/09010). La retención de la actividad inhibitoria en ensayos de proliferación celular con compuestos modificados en el anillo ciclohexilo, p.e. 39-O-desmetilrapamicina y modificaciones en C40 tales como SDZ RAD, identificaron esta región de la molécula como un blanco en la generación de análogos novedosos de la rapamicina. Se ha informado la existencia de análogos novedosos de la rapamicina después de añadir ácido ciclohexano carboxílico, ácido cicloheptano carboxílico, ácido ciclohex-1-enocarboxílico, ácido 3-metilciclohexanocarboxílico, ácido ciclohex-3-enocarboxílico, ácido 3-hidroxiciclohex-4-enocarboxílico y ácido ciclohept-1-eneocarboxílico a cultivos de S. hygroscopicus, lo que demuestra la flexibilidad en el módulo de carga de la rapamicin poliquétido sintasa (P.A.S. Lowden, FD disertación, Universidad de Cambridge, 1997). Estos análogos novedosos de la rapamicina se produjeron en competencia con el iniciador
natural, ácido 4,5-dihidroxiciclohex-1-enocarboxílico, lo que produjo rendimientos reducidos y mezclas de productos.
Se ha informado del aislamiento de cepas de S. hygroscopicus recombinantes que producen varios análogos de la rapamicina, utilizando métodos biológicos mediados por la tecnología de fagos (Lomovskaya et al., 1997). En presencia de la adición de derivados de prolina, un mutante por deleción en rapL de S. hygroscopicus sintetizó los análogos novedosos de la rapamicina prolilrapamicina, 4-hidroxiprolilrapamicina y 4-hidroxiprofil-26-desmetoxi-rapamicina (Khaw et al., 1998). De modo similar, se han identificado las rapamicinas novedosas 3-hidroxi-prolil-rapamicina, 3-hidroxi-prolil-26-desmetoxi-rapamicina, y ácido trans-3-aza-biciclo[3,1,0]hexano-2-carboxílico rapamicina como se describe en WO98/54308. La actividad de la prolilrapamicina y la 4-hidroxiprolil-26-desmetoxi-rapamicina se evaluó en ensayos de proliferación y la actividad inhibitoria del segundo compuesto fue significativamente menor que la de la rapamicina (Khaw et al., 1998). La deleción de cinco genes contiguos, rapQONML (responsables de las modificaciones post-poliquétido en C16, C27 y de la producción de ácido L-pipecólico) y su reemplazo con un marcador de resistencia a neomicina en S. hygroscopicus ATCC29253 utilizando una metodología basada en fagos condujo a la producción de 16-O-desmetil-27-desmetoxirapamicina cuando se le suministró el ácido pipecólico (Chung et al., 2001). No se ha demostrado la complementación de este mutante por deleción utilizando esta tecnología. Además, la funcionalidad sitio específica de rapM y rapQ no es clara aún, por lo tanto, el diseño racional de análogos de la rapamicina que requieren la metilación en C16-OH o C27-OH no se ha hecho posible. La metodología basada en fagos posee un número de desventajas como se describe con más detalle posteriormente. Ofrece un proceso difícil y prolongado para la obtención de cepas mediante ingeniería genética y tiene una versatilidad reducida en comparación con la metodología que se revela en la presente patente.
Las estrategias convencionales para la manipulación de los genes que modifican la rapamicina utilizando métodos biológicos comprenden la mutación o deleción de genes individuales en el cromosoma de una cepa hospedera y/o la inserción de genes individuales como copias extra de genes homólogos o heterólogos ya sea de modo individual o como casetes génicos (WO01/79520, WO03/048375). Sin embargo, el aislamiento de análogos novedosos de la rapamicina utilizando tales métodos biológicos ha sido limitado debido a las dificultades en la transformación del organismo productor de rapamicina, S. hygroscopicus. Se ha informado que los métodos comúnmente utilizados de transformación con ADN de plásmidios o transferencia de conjugación no fueron exitosos con la cepa que produce rapamicina (Lomovskya et al., 1997, Schweke et al., 1995, Kieser et al., 2000). El estado actual de la técnica utiliza la metodología de Lomovskya et al. (1997), un método de trabajo intensivo basado en fagos que se encuentra severamente limitado por el tamaño de los fragmentos de ADN clonados que se transfieren a S. hygroscopicus (Kieser et al., 2000). Esta tecnología se limita a la transferencia de un máximo de 6.4 kb de ADN clonado. Por lo tanto, cuando se complementa un mutante por deleción utilizando esta tecnología, el técnico se encuentra limitado a la inclusión de \sim2 genes funcionales además del promotor deseado, las regiones de homología y el marcador de resistencia. La información genética para el grupo de genes de la biosíntesis de rapamicina se encuentra disponible desde 1995 (Schwecke et al., 1995), sin embargo, se ha realizado poco progreso en esta área (Khaw et al., 1998; Chung et al., 2001; WO01/34816).
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un método para la generación de análogos de ligandos de FKBP que incorporan una unidad iniciadora no natural, dicho método comprende:
(a) la generación de una cepa recombinante en la que al menos el homólogo de rapK se ha eliminado o inactivado; y
(b) la suplementación con una unidad iniciadora no natural a dicha cepa.
La presente invención también proporciona métodos recombinantes para la transformación eficiente de cepas que contienen un grupo biosintético que codifica para un ligando de FKBP, por ejemplo, pero sin limitarse a, Streptomyces hygroscopicus subsp. hygroscopicus NRRL 5491, Actinoplanes sp. N902-109 FERM BP-3832, Streptomyces sp. AA6554, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6475 ATCC 14891, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6678 ATCC 55087, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6674, Streptomyces hygroscopicus var. Ascomyceticus ATCC 55276, Streptomyces tsukubaensis No.9993 FERM BP-927, Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis, Streptomyces sp. DSM 4137, Streptomyces sp. DSM 7348, Micromonospora n.sp. A92-306401 DSM 8429, Streptomyces sp. MA 6858 ATCC 55098, Streptomyces sp. MA 6848, dichos métodos comprenden:
(a) la construcción de un plasmidio de deleción conjugativa en una cepa de E. coli que sea dam^{-}, dcm^{-} o dam^{-} y dcm^{-}.
(b) la generación de esporas a partir de dicha cepa adecuadas para la conjugación en la que dicha cepa se cultiva a una humedad de entre 10% y 40% y las esporas se colectan entre los días 5 y 30;
(c) la conjugación de la cepa de E. coli del paso (a) con las esporas del paso (b) en un medio que contiene por litro:
i)
0,5 g a 5 g de polvo de maíz pulido,
ii)
0,1 g a 5 g de extracto de levadura,
iii)
0,1 g a 10 g carbonato de calcio; y
iv)
0,01 g a 0,5 g de sulfato de hierro;
dicho medio contiene adicionalmente BACTO-agar y almidón y se somete a secado para producir una pérdida de peso del 1-20%; y
(d) opcionalmente el cultivo de la cepa bajo condiciones apropiadas para la producción de poliquétido.
En una realización preferida, los métodos se utilizan para la transformación de Streptomyces hygroscopicus subsp., hygroscopicus (p.e. NRRL 5491), Actinoplanes sp. N902-109 (p.e. FERM BP-3832), Streptomyces sp. AA6554, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus (p.e. MA 6475 ATCC 14891), Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus (p.e. MA 6678 ATCC 55087), Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus (p.e.MA 6674), Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus (p.e. ATCC 55276), Streptomyces tsukubaensis No.9993 (p.e. FERM BP-927), Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis, Streptomyces sp. (p.e. DSM 4137), Streptomyces sp. (p.e. DSM7348), Micromonospora n.sp. A92-306401 (p.e. DSM 8429) o Streptomyces sp. (p.e. MA 6858 ATCC 55098). En una realización más preferida, los métodos se utilizan para la transformación de: S. hygroscopicus subsp. hygroscopicus (p.e.NRRL5491) o S. hygroscopicus var. ascomyceticus (p.e.ATCC14891). En una realización aún más preferida, los métodos se utilizan para la transformación de la subsp. hygroscopicus de S. hygroscopicus productora de rapamicina (p.e. NRRL 5491).
Por tanto, la presente invención también proporciona una cepa recombinante que contiene clusters de biosíntesis que codifican para ligandos FKBP en el que uno o más genes auxiliares se han eliminado o inactivado utilizando los métodos que se describen en el presente documento.
En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos y materiales recombinantes para la expresión de combinaciones de enzimas de modificación de poliquétidos para producir análogos novedosos de poliquétidos. En una realización específica, la presente invención proporciona métodos y materiales recombinantes para la expresión de combinaciones de enzimas responsables de la modificación post-PKS y/o suministro del precursor a partir de grupos de biosíntesis que codifican para ligandos de FKBP, por ejemplo, pero sin limitarse a, rapamicina, FK506, FK520, FK523, FK525, antascomicina, meridamicina, tsukubamicina y análogos de los mismos y métodos para la producción de análogos en células hospederas recombinantes. En una realización preferida, los métodos y materiales recombinantes se utilizan para la expresión de combinaciones de enzimas responsables de la modificación post-PKS y/o del suministro del precursor en la biosíntesis de rapamicina, FK520, FK506 e "hyg" y métodos para la producción de análogos de la rapamicina, FK520, FK506 e "hyg" en células hospederas recombinantes. En una realización mucho más preferida, los métodos y materiales recombinantes se utilizan en la expresión de combinaciones de enzimas responsables de la modificación post-PKS y/o del suministro del precursor en la biosíntesis de rapamicina y los métodos para la producción de análogos de la rapamicina en células hospederas recombinantes.
De manera global, la presente invención está relacionada con la alteración de un sistema de genes que posee una porción central responsable de la producción de un producto básico, y una multiplicidad de genes modificadores responsables de efectuar modificaciones relativamente pequeñas al producto básico - p.e. efectuar la glicosilación, oxidación, reducción, alquilación, desalquilación, acilación o ciclización del producto básico, y una multiplicidad de genes de suministro del precursor que están relacionados con la producción de compuestos precursores particulares (p.e. pipecolato; ácido 4,5 dihidroxiciclohex-1-eno carboxílico). De este modo, el producto básico puede ser un poliquétido modular y los genes modificadores pueden estar relacionados con la glicosilación y/o otras modificaciones de la cadena del poliquétido, y los genes de suministro del precursor pueden estar involucrados en la producción y/o incorporación de precursores naturales o no naturales (p.e. pipecolato y/o ácido 4,5 dihidroxiciclohex-1-eno carboxílico en el sistema rapamicina).
La porción central puede no funcionar correctamente, o incluso no funcionar del todo, en ausencia del gen de suministro del precursor (a menos que el compuesto precursor natural o no natural se suministre o esté disponible de otro modo).
En un aspecto, la invención proporciona los métodos para la alteración de un sistema de genes con una porción nuclear que no puede funcionar debido a una deleción o inactivación de un gen de suministro del precursor. Los sistemas de genes adecuados incluyen, pero no se limitan a, los grupos biosintéticos de la rapamicina, antascomicina, FK520, FK506, "hyg", FK523, meridamicina, FK525 y tsukubamicina. En este aspecto de la invención, el gen de suministro del precursor que se encuentra ausente es, de preferencia, rapK o un homólogo de rapK (p.e. fkbO en los grupos de genes FK506 o FK520). El sistema de genes es, de preferencia, el grupo de la rapamicina. El gen de suministro de precursor que se encuentra ausente es con mayor preferencia rapK. Este aspecto de la invención proporciona los métodos para la producción eficiente de una multiplicidad de productos básicos mediante la incorporación de precursores naturales o no naturales (p.e. ácido 4,5-dihidroxiciclohex-1-eno carboxílico). Los métodos pueden también incluir otros aspectos como se especifica más adelante.
Otro tipo de sistema es el sistema de péptido no ribosomal ("NRP") en el que el producto básico es un péptido y los genes modificadores son genes responsables de las modificaciones a un péptido (glicosilación, reducción etc), y los genes de suministro de precursor son genes involucrados en la producción de residuos de aminoácidos inusuales que deben incorporarse al péptido. Los sistemas pueden ser también de tipo mezclado, p.e. tener una porción poliquétido y una porción con un origen biosintético diferente, p.e. NRP. De hecho, la rapamicina puede considerarse como un ejemplo de esto, debido a que el residuo pipecolato es un residuo aminoacídico añadido por una enzima similar a las encontradas en los sistemas NRP.
Estos genes modificadores y genes de suministro del precursor pueden ser considerados como "genes auxiliares" para la síntesis de poliquétido y el término "genes auxiliares" como se utiliza en el presente documento puede referirse a los genes modificadores, a los genes de suministro del precursor o a ambos.
La alteración del sistema de genes involucra la creación de un sistema con funcionamiento alterado en el que se ha alterado el conjunto de genes auxiliares. Por tanto, uno o más genes auxiliares (y de preferencia, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más o siete o más) pueden haberse eliminado (o convertido en no funcionales) y/o reemplazado por genes diferentes.
Esto puede involucrar un "sistema de deleción" que comprenda un ácido nucleico que codifique un sistema de genes en el que falte una multiplicidad de genes auxiliares funcionales. Este sistema de deleción puede complementarse entonces con uno o más genes auxiliares funcionales (que pueden ser iguales o diferentes a los genes que reemplazan). Este puede llevarse a cabo de modo combinatorio, un sistema de deleción que sea complementado por una multiplicidad de genes y conjuntos de genes diferentes.
Puede producirse un sistema alterado que difiera del sistema natural en la ausencia de una o más funciones modificadoras a través de (a) la producción de un sistema de deleción y la restauración por complementación de la casi totalidad de los genes suprimidos; o (b) mediante la supresión selectiva o la inactivación de genes de un sistema existente. En un sistema alterado producido según (b) los genes pueden inactivarse mediante mutagénesis dirigida de un sitio activo importante en la función de la proteína (mutación puntual del sitio activo), mediante truncación del gen a través de una mutación por corrimiento del marco de lectura, mediante una deleción en el marco de una sección del gen importante para su función, tal como el sitio activo; la deleción o inactivación parciales por mutación puntual. Todos estos se pueden realizar mediante recombinación doble y selección del genotipo mutante, o mediante recombinación simple. En una realización preferida, el sistema alterado se produce por el método (a). Tales métodos pueden ser utilizados también para producir un sistema de deleción. La estrategia de "complementación" (a) es de preferencia homóloga, en la que los genes "restablecidos" pertenecen al mismo grupo de genes, sin embargo, la complementación heteróloga, en la que los genes restablecidos se seleccionan a partir de grupos de biosíntesis diferentes que codifican para ligandos FKBP, se contempla también en la presente invención. En una realización preferida, los genes "restablecidos" son esencialmente los mismos genes que los suprimidos, o son variantes de los mismos que realizan funciones similares.
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En otro aspecto de la invención, un sistema alterado con un gen de suministro de precursor suprimido (o no funcional) puede ser alimentado con precursores alternativos para que genere productos que varían.
Como se aplica al sistema de la poliquétido sintasa ("PKS"), un tipo de realización de preferencia es un método de producción de poliquétidos que comprenda: (a) proporcionar una cepa de un organismo que contiene uno o más genes de la PKS expresables para producir una PKS funcional que pueda generar un poliquétido en el organismo, por ejemplo genes PKS que codifican para un ligando de FKBP, el organismo carente de uno o más (y de presencia en pluralidad) genes auxiliares funcionales asociados de modo natural con dichos genes de la PKS que codifican para productos de genes capaces de realizar modificaciones respectivas del poliquétido; y (b) realizar la complementación por medio de provocar que dicho organismo exprese uno o más genes auxiliares, cuyos genes modificadores expresados constituyen un conjunto incompleto de genes auxiliares asociados naturalmente a dichos genes de la PKS y/o comprenden una o más variantes de genes auxiliares; y (c) cultivar dicha cepa y aislar de modo opcional, los análogos de poliquétido producidos.
El paso de proporcionar una cepa de un organismo que contenga uno o más genes PKS puede incluir un paso de proporcionar un ácido nucleico que codifique para un cluster de genes que comprenda dichos uno o más genes PKS y en el que se encuentre(n) ausente(s) dichos uno o más genes auxiliares; e introducir dicho ácido nucleico en el organismo.
Los genes PKS son, con preferencia, genes de la rapamicina. Los genes auxiliares que faltan son, de preferencia, uno o más de rapK, rapI, rapQ, rapM, los genes contiguos rapN y O (designados en el presente documento como rapN/O), rapL y rapJ. En realizaciones preferidas contempladas por la presente invención:
i) un gen auxiliar se encuentra ausente, por ejemplo, se encuentra ausente rapK; rapI; rapQ; rapM; rapL, rapN/O o rapJ; de preferencia en el caso en que está ausente un gen auxiliar, el mismo se selecciona entre el grupo que consta de rapK; rapI; rapQ; rapM; rapN/O y rapJ;
ii) dos genes auxiliares se encuentran ausentes, por ejemplo, están ausentes: rapKrapI; rapKrapQ; rapKrapM; rapKrapNlO; rapKrapL; rapKrapJ; rapk/rapQ; raplrapM; raplrapNlO; raplrapL; raplrapJ; rapQrapM; rapQrapN/O; rapQrapL; rapQrapJ; rapMrapN/O; rapMrapL; rapMrapJ; rapN/OrapL; rapN/OrapJ o rapLrapJ;
iii) tres genes auxiliares se encuentran ausentes, por ejemplo, están ausentes: rapKrapIrapQ; rapKrapIrapM; rapKrapIrapN/O; rapKrapIrapL; rapKrapIrapJ; rapKrapQrapM; rapKrapQRapN/O; rapKrapQrapL; rapKrapQrapJ; rapKrapMrapN/O; rapKrapMrapL; rapKrapMrapJ; rapKrapN/OrapL; rapKrapN/OrapJ; rapKrapLrapJ; rapIrapQrapM; rapIrapQrapN/O; rapIrapQrapL; rapIrapQrapJ; rapIrapMrapN/O; rapIrapMrapL; rapI rapMrapJ; rapIrapN/OrapL; rapIrapN/OrapJ; rapIrapLrapJ; rapQrapMrapN/O; rapQrapMrapL; rapQrapMrapJ; rapQrapN/OrapL; rapQrapN/OrapJ; rapQrapLrapJ; rapMrapN/OrapL; rapMrapN/OrapJ; rapMrapLrap o rapN/OrapLrapJ;
iv) cuatro genes auxiliares se encuentran ausentes, por ejemplo, están ausentes: rapKrapIrapQrapM; rapKrapIrapQrapN/O; rapKrapIrapQrapL; rapKrapIrapQrapJ; rapKrapIrapMrapN/O; rapKrapIrapMrapL; rapKrapIrapMrapJ; rapKrapIrapN/OrapL; rapKrapIrapN/OrapJ; rapKrapIrapLrapJ; rapKrapQrapMrapN/O; rapKrapQrapMrapL; rapKrapQrapMrapJ; rap-KrapQrapN/OrapL; rapK, rapQ, rapN/O, rapJ; rapKrapQrapLrapJ; rapKrapMrapN/OrapL; rapKrapMrapN/OrapJ; rapKrapMrapLrapJ; rapKrapN/OrapLrapJ; rapIrapQrapMrapN/O; rapIrapQrapMrapL; raplrapQrapMrapJ; rapIrapQrapN/OrapL; rapIrapQrapN/OrapJ; rapIrapQrapLrapJ; rapIrapMrapN/OrapL; rapIrapMrapN/OrapJ; rapJrap-MrapLrapJ; rapIrapN/OrapLrapJ; rapQrapMrapN/OrapL; rapQrapMrapN/OrapJ; rapQrapMrapLrapJ; rapQrapN/OrapLrapJ o rapMrapN/OrapLrapJ;
v) cinco genes auxiliares se encuentran ausentes, por ejemplo, están ausentes: rapKrapIrapQrapMrapN/O; rapKrapIrapQrapMrapL; rapKrapIrapQrapMrapJ; rapKrapIrapQrapN/OrapL; rapKrapIrapQrap N/OrapJ; rapKrapIrapQrapLrapJ; rapKrapIrapMrapN/OrapL; rapKrapIrapMrapN/OrapJ; rapKrapIrapMrapLrapJ; rapKrapIrapN/OrapLrapJ; rapKrapQrapMrapN/OrapL; rapKrapQrapMrapN/OrapJ; rapKrapQrapMrapLrapJ; rapKrapQrapN/OrapLrapJ; rapKrapMrapN/OrapLrapJ; rapIrapQrapMrapN/OrapL; rapIrapQrapMrapN/OrapJ; rapIrapQrapN/OrapLrapJ; rapIrapMrapN/OrapLrapJ; rapQrapMrapN/OrapLrapJ o rapIrapQrapMrapLrapJ;
vi) seis genes auxiliares se encuentran ausentes, por ejemplo, están ausentes: rapKrapIrapQrapMrapN/OrapL; rapKrapIrapQrapMrapN/OrapJ; rapKrapIrapQrapMrapLrapJ; rapKrapIrapQrapN/OrapLrapJ; rapKrapIrapMrapN/OrapLrapJ; rapKrapQrapMrapN/OrapLrapJ o rapIrapQrepMrapN/OrapLrapJ; o
vii) siete genes auxiliares se encuentran ausentes; p.e., están ausentes, rapKrapIrapQrapMrapN/OrapLrapJ.
La expresión "se encuentran ausentes uno o más genes auxiliares funcionales" cubre tanto la ausencia de un gen, como la presencia de un gen en un estado no funcional, p.e. porque ha sido inutilizado de manera específica.
En un aspecto, la invención proporciona una vía novedosa y expedita para la incorporación eficiente de precursores naturales o no naturales a ligandos de FKBP. Estos incluyen, pero no se limitan a, los sistemas poliquétido sintasa/sistemas de sintasa no ribosomal de péptidos de rapamicina, antascomicina, FK520, FK506, "hyg", FK523, meridamicina, FK525 y tsukubamicina, la invención por tanto proporciona análogos novedosos de sus productos naturales respectivos. En un aspecto específico, la invención proporciona una vía novedosa y expedita para la incorporación eficiente de precursores naturales o no naturales que proporcionen análogos novedosos de la rapamicina.
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Por tanto, en un aspecto la presente invención proporciona un método para generar análogos de ligandos de FKBP que incorporan una unidad de partida no natural, dicho método comprende:
(a) generar una cepa recombinante en la que al menos el homólogo de rapK se ha suprimido o inactivado; y
(b) alimentar con una unidad de partida no natural dicha cepa
En una realización preferida, la cepa recombinante se genera utilizando los métodos de la presente invención.
También proporcionamos librerías de compuestos y compuestos individuales disponibles utilizando dichos sistemas. De este modo, un compuesto típico es una variante de un compuesto producido naturalmente por un sistema de genes que tiene una porción nuclear responsable de la generación de un producto básico, y una multiplicidad de genes auxiliares responsables de realizar modificaciones relativamente pequeñas del producto básico, variante que se puede producir mediante un sistema alterado de modo que uno o más de los genes auxiliares están ausentes, son no funcionales, o son reemplazados por variantes funcionales. Una clase preferida de compuestos son los análogos de la rapamicina que corresponden a productos del sistema de la rapamicina en el que uno o más de los genes seleccionados entre el grupo que consta de los genes rapK, rapI, rapQ, rapM, rapN, rapO, rapL y rapJ se encuentran ausentes, son no funcionales o son variantes.
También proporcionamos análogos novedosos de FKBP, incluyendo los análogos de la rapamicina. Tales compuestos pueden poseer una o más propiedades útiles, por ejemplo, pero sin limitarse a, utilidad como inmunosupresores, agentes antifúngicos, agentes anticáncer, agentes neurorregenerativos, o agentes para el tratamiento de la soriasis, artritis reumatoide, fibrosis y otras enfermedades hiperproliferativas.
Definiciones
Como se utiliza en el presente documento, el término "gene(s) modificadores" incluye los genes requeridos para las modificaciones post-poliquétido sintasa del poliquétido, por ejemplo, pero sin limitarse a, citocromo P-450 monooxigenasas, ferredoxinas y O-metiltransferasas dependientes de SAM. En el sistema de la rapamicina estos genes modificadores incluyen a rapN/O, rapM, rapI, rapQ, y rapJ pero los expertos en la técnica apreciarán que los sistemas PKS relacionados con la rapamicina (por ejemplo, pero sin limitarse a: FK506, FK520, antascomicina, "hyg", FK523, meridamicina, FK525 y tsukubamicina) tendrán homólogos de al menos un subgrupo de estos genes, algunos de los cuales se discuten posteriormente.
Como se utiliza en el presente documento, el término "gen(es) de suministro del precursor" incluye los genes requeridos para el suministro de los precursores naturales o no naturales, los genes requeridos para la síntesis de cualquier precursor incorporado de manera natural o no natural y los genes requeridos para la incorporación de cualquier precursor incorporado de manera natural o no natural. Por ejemplo, pero sin limitarse a ello, en el sistema de la rapamicina estos genes incluyen rapL, rapK y rapP pero un experto en la técnica apreciará que los sistemas PKS relacionados con la rapamicina (por ejemplo, pero sin limitarse a: FK506, FK520, antascomicina, "hyg", FK523, meridamicina, FK525 y tsukubamicina) poseerán homólogos de estos genes, algunos de los cuales se discuten con mayor profundidad posteriormente.
Como se utiliza en el presente documento, el término "gen(es) auxiliar(es)" incluye referencias a los genes modificadores, genes de suministro del precursor o ambos, genes modificadores y genes de suministro del precursor.
Como se utiliza en el presente documento, el término "precursor" incluye unidades de partida naturales (p.e. ácido 4,5-dihidroxiciciohex 1-eno carboxílico), unidades de partida no naturales, y aminoácidos incorporados naturalmente (p.e. ácido pipecólico) y aminoácidos incorporados de modo no natural.
Como se utiliza en el presente documento, el término "unidad de partida no natural" se refiere a cualesquiera de los compuestos que pueden ser incorporados como unidad de partida en la síntesis de poliquétido que no son la unidad de partida usualmente utilizada por esa PKS.
Como se utiliza en el presente documento, el término "ligandos de FKBP" se refiere a los compuestos que se unen a la inmunofilina FKBP, tales compuestos contienen, preferiblemente, una \alpha, \beta-diceto amida en la que el \beta-ceto se encuentra enmascarado por un hemi-acetal. Tales compuestos incluyen, sin limitación, la rapamicina, FK520, FK506, antascomicina, "hyg", FK523, meridamicina, FK525 y tsukubamicina,
Como se utiliza en el presente documento, el término "clusters de biosíntesis que codifican ligandos de FKBP" incluye pero no se limita a los grupos de genes que dirigen la síntesis de la rapamicina, FK506, FK520, "hyg", FK523, antascomicina, meridamicina, FK525 y tsukubamicina.
Como se utiliza en el presente documento, el término "cepas que contienen grupos de biosíntesis que codifican ligandos de FKBP" incluye pero no se limita a: Streptomyces hygroscopicus subsp. hygroscopicus (p.e. NRRL 5491), Actinoplanes sp. N902-109 (p.e. FERM BP-3832), Streptomyces sp. AA6554, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6475 (p.e. ATCC 14891), Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6678 (p.e. ATCC 55087), Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6674, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus (p.e. ATCC 55276), Streptomyces tsukubaensis No.9993 (p.e. FERM BP-927), Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis, Streptomyces sp. (p.e. DSM 4137), Streptomyces sp. (p.e. DSM 7348), Micromonospora n.sp. A92-306401 (p.e. DSM 8429) o Streptomyces sp. MA 6858 (p.e. ATCC 55098).
Como se utiliza en el presente documento, el término "homólogo de rapK" se refiere a los homólogos del gen rapK de la rapamicina en otros grupos de biosíntesis que codifican ligandos de FKBP, por ejemplo pero sin limitarse a: el gen fkbO del grupo FK520, el gen fkbO del grupo FK506 y el Orf5 en el grupo "hyg". Tales homólogos de rapK realizan la misma función que rapK en la síntesis de estos ligandos relacionados con FKBP, es decir, son esenciales en el suministro de la unidad de partida natural. De preferencia, tales homólogos de rapK poseen al menos 40% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% o al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de rapK como se muestra en la Figura 27 (SEC ID NO: 13).
Descripción detallada de la invención
En un aspecto, la presente invención proporciona un método novedoso y expedito para la transformación de S. hygroscopicus. La utilización de la tecnología de fagos para el aislamiento de cepas genéticamente modificadas de S. hygroscopicus ha sido descrita previamente (Khaw et al., 1998; Lomovskaya et al., 1997). Sin embargo, no se ha informado de otro método aparte de la transfección para la introducción de ADN en la cepa de S. hygroscopicus productora de rapamicina. De hecho, se ha afirmado previamente que los métodos comúnmente utilizados de transformación con ADN plasmídico o transferencia conjugativa no fueron exitosos con la cepa productora de rapamicina (Lomovskaya et al., 1997, Kieser et al., 2000; Schweke et al., 1995).
En la presente invención, se estableció sorprendentemente un protocolo de conjugación para la transformación exitosa de S. hygroscopicus como se describe en el Ejemplo 1. La metodología se ejemplificó mediante el aislamiento del mutante por deleción en S. hygroscopicus MG2-10 (Ejemplo 2) y mediante la expresión de los genes y combinaciones de genes como se describen en los Ejemplos 3, 5 y 15.
Por tanto, en un aspecto la presente invención proporciona un método para la producción de una cepa recombinante que contiene los clusters de biosíntesis que codifican los ligandos de FKBP en los que uno o más genes auxiliares han sido suprimidos o inactivados, dicho método comprende:
(a) construcción de un plasmidio de conjugación en una cepa de E. coli que sea dam^{-}, dcm^{-} o dam^{-} y dcm^{-};
(b) la generación de esporas a partir de dicha cepa adecuadas para la conjugación en la que dicha cepa crece a una humedad de entre 10% y 40% y las esporas se colectan entre los días 5 y 30;
(c) la conjugación de la cepa de E. coli del paso (a) con las esporas del paso (b) en un medio que contiene por litro:
i)
0,5 g a 5 g de polvo de maíz pulido,
ii)
0,1 g a 5 g de extracto de levadura,
iii)
0,1 g a 10 g carbonato de calcio; y
iv)
0,01 g a 0,5 g de sulfato de hierro;
dicho medio contiene adicionalmente BACTO-agar y almidón y se somete a secado para producir una pérdida de peso del 1-20%; y
(d) opcionalmente el cultivo de la cepa bajo condiciones apropiadas para la producción de poliquétido.
De preferencia, la cepa de E. coli del paso (a) es dam^{-} y dcm^{-}.
De preferencia, en el paso (b) las esporas se colectan entre los días 10 y 25 o entre los días 14 y 21. En otra realización, en el paso (b), la cepa se cultiva a una humedad de entre 10 y 20%.
En una realización específica, el almidón del medio utilizado en el paso (c) es almidón de trigo.
En realizaciones preferidas, los medios utilizados en el paso (c) contienen 1 g a 4 g polvo de maíz pulido, 1 g a 4 g de extracto de levadura, 1 g a 5 g de extracto de levadura; y 0,2 g a 0,4 g de sulfato de hierro por litro. En una realización más preferida, el medio contiene por litro: 2,5 g polvo de maíz pulido, 3 g de extracto de levadura, 3 g de extracto de levadura; y 0,3 g de sulfato de hierro;
La estrategia de complementación que se muestra en esta invención proporciona un método expedito para evaluar e identificar la función de cada uno de los genes auxiliares p.e. rapK, rapQ, rapN/O, rapM, rapL, rapJ y/o rapI en la biosíntesis de rapamicina. El producto del gen RapK ha sido identificado previamente como un candidato interesante para la dioxigenasa dependiente de pteridina que pudiera catalizar también un paso de oxidación en la biosíntesis de rapamicina (Molnár et al., 1996). El gen homólogo de fkbO se identificó en el grupo de genes de biosíntesis de FK506 y debido a la semejanza estructural de la rapamicina y de FK506, se ha postulado un papel para rapK en la oxidación del grupo OH de C9 (Motamedi et al., 1996). Los hallazgos en los Ejemplos 3, 4 y 6, que describen la producción dependiente de rapK de pre-rapamicina por S. hygroscopicus MG2-10 (pSGsetrapK) sugieren que RapK posee al menos una función adicional en la biosíntesis de rapamicina.
En otro aspecto, por tanto, los métodos de la presente invención conducen a la elucidación de la función de RapK, es decir que la expresión del gen rapK es esencial en la acumulación de cualquier producto macrólido ciclado. En otro aspecto diferente, la presente invención describe la complementación de S. hygroscopicus MG2-10 con fkbO, el homólogo de rapK del grupo FK520, con la observación sorprendente de la producción, dependiente de fkbO, de pre-rapamicina por S. hygroscopicus MG2-10 (pMG169-1) (Ejemplo 11). Puede ser notado por un experto en la técnica que fkbO desempeña una función en la producción de FK520 como rapK y fkbO en la producción de rapamicina. Más aún, un experto en la técnica apreciará que otros homólogos de rapK, que incluyen, pero no se limitan a, fkbO en el cluster FK506, fkbO en el cluster FK520 y Orf5 en el cluster "hyg" también desempeñan la misma función. En otro aspecto diferente de la invención, los homólogos de rapK en los grupos de biosíntesis que codifican para ligandos de FKBP, que incluyen, pero no se limitan a, FK506, FK520, FK525, antascomicina, FK523, tsukubamicina, y "hyg" pueden ser eliminados o inactivados, lo que proporciona cepas incapaces de fabricar sus productos naturales conocidos respectivos. De modo semejante, la estrategia de complementación que se describe con anterioridad proporciona un método expedito para investigar la función, especificidad y orden de los productos de genes auxiliares expresados en la biosíntesis de otros poliquétidos o péptidos no ribosomales.
En una clase de realización preferida, la presente invención proporciona un método para la producción de una cepa hospedera recombinante capaz de producir análogos de la rapamicina, que involucra además la construcción de deleciones genómicas, que incluyen pero no se limitan a rapQONMLKJI, introducidas en S. hygroscopicus y la complementación o complementación parcial por expresión de genes únicos o combinaciones de genes, que incluyen, pero no limitan a, rapK, rapI, rapQ, rapM, los genes contiguos rapN y O (en el presente documento designados como rapN/O), rapL y rapJ, en casetes génicos. Además, la invención proporciona un método para producir dichos análogos de la rapamicina mediante el cultivo de dicha cepa hospedera recombinante, y el aislamiento opcional de los análogos de la rapamicina producida. De este modo, la cepa recombinante MG2-10 (pSGsetrapK), producida mediante complementación de la cepa de deleción genómica S. hygroscopicus MG2-10, con rapK, se cultivó para producir 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-O-desmetil-rapamicina (pre-rapamicina).
En otro aspecto diferente de esta clase de invención, la estrategia involucra la integración de un vector que comprenda un subconjunto de genes que incluya, pero no se limite a, rapK, rapI, rapQ, rapM, rapN, rapO, rapL y rapJ en el mutante por deleción de S. hygroscopicus mencionado anteriormente. Tal integración puede realizarse utilizando una variedad de funciones de integración que incluyen, pero no se limitan a: vectores basados en \PhiC31, vectores basados en pSAM2 integrasa (p.e. en pPM927 (Smovkina et al., 1990)), R4 integrasa (p.e. en pAT98 (Matsuura et al., 1996)), \PhiVWB integrasa (p.e. en pKT02 (Van Mellaert et al., 1998)), \PhiBT1 integrasa ((p.e. pRT801) Gregory et al., en prensa) y L5 integrasa (p.e. Lee et al., 1991). En algunos casos pudiera ser necesaria la alteración de la cepa hospedera por adición de los sitios específicos attB para la integrasa para permitir una integración de alta eficiencia. Pueden ser utilizados también vectores de replicación, ya sea como reemplazo de, o además de los vectores basados en \PhiC31. Estos incluyen, pero no se limitan a, vectores basedos en pIJ101 (p.e. pIJ487, Kieser et al., 2000), pSG5 (p.e. pKC1139, Bierman et al.,1992) y SCP2* (p.e. pIJ698, Kieser et al., 2000). Esta metodología ha sido ejemplificada en el presente documento por el uso de las funciones de integración sitio específicas del \varphiBT1 y \varphiC31.
Aunque la introducción de casetes génicos en S. hygroscopicus se ha ejemplificado en la presente invención utilizando las funciones de integración sitio específicas del \varphiBT1 y el \varphiC31, los expertos en la técnica apreciarán que existen descritas en la literatura un número de estrategias diferentes, que incluyen las mencionadas anteriormente que pueden también ser utilizadas para introducir tales casetes génicos en cepas hospederas procariontes, o de preferencia, actinomycetes. Estas incluyen la utilización de vectores de integración sitio específicos alternativos como se describe anteriormente y en los siguientes artículos (Kieser et al., 2000; Van Mellaert et al., 1998; Lee et al., 1991; Smovkina et al., 1990; Matsuura et al., 1996). De modo alternatico, los plasmidios que contengan los casetes génicos pueden integrarse en un sitio neutral en el cromosoma utilizando sitios de recombinación homóloga. Más aún, para un número de cepas hospederas de actinomycete, incluyendo S. hygroscopicus, los casetes génicos pueden introducirse en plásmidos de autoreplicación (Kieser et al., 2000; WO98101571).
En un aspecto diferente de esta clase, la invención proporciona casetes génicos para la complementación de las cepas recombinantes por deleción de S. hygroscopicus. Previamente han sido descritos métodos de construcción de casetes génicos y sus heterólogos utilizados para producir macrólidos glicosilados híbridos (Gaisser et al., 2002; WO01/79520, WO 03/048375). El método de clonaje utilizado para aislar los casetes génicos de la presente invención difiere significativamente de la estrategia previamente descrita en la que el casete génico se ensambla directamente en un vector de expresión en lugar de pre-ensamblarse los genes en plásmidos pUC18/19-, con lo que se proporciona un procedimiento de clonaje más rápido. Esta estrategia se ejemplifica como se describe en los Ejemplos 3, 4, 5, 9 y 15. Como se describe en el presente documento, un vector adecuado (por ejemplo, pero sin limitación, pSGLit1) puede construirse para el uso en la construcción de dichos casetes génicos, en el que un sitio de restricción adecuado (por ejemplo, pero sin limitarse a, XbaI), sensible a la metilación dam se inserte hacia 5' del (los) gen(es) de interés y un segundo sitio de restricción (por ejemplo XbaI) pueda insertarse hacia 3' de los genes de interés. Los expertos apreciarán que pueden utilizarse otros sitios de restricción como alternativa a XbaI y que el sitio sensible a metilación puede estar hacia 5' o 3' del(los) gen(es) de interés.
La utilización de casetes génicos permite la generación rápida y paralela de múltiples cepas recombinantes con cualquier combinación de genes modificadores suprimidos a partir de una única cepa por deleción de S. hygroscopicus. La estrategia de clonaje facilita el ensamblaje de una librería de casetes génicos ya sea de manera dirigida o al azar, y es, por tanto, una herramienta poderosa en la producción combinatoria de análogos novedosos de la rapamicina incluyendo, pero sin limitarse exclusivamente a, 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-O-desmetil-rapamicina (pre-rapamicina), 9-deoxo-16-O-desmetil-27-O-desmetil-39-O-desmetil-rapamicina, 16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-O-desmetil-rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-39-O-desmetil-rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-rapamicina, 16-O-desmetil-27-O-desmetil-39-O-desmetil-rapamicina, 9-deoxo-27-O-desmetil-39-O-desmetil-rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-27-O-desmetil-rapamicina, 27-O-desmetil-39-O-desmetil-rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-rapamicina, 9-deoxo-39-O-desmetil-rapamicina, 8-deoxo-15-O-desmetil-26-desmetoxi-38-O-desmetil-prolilrapamicina (preprolilrapamicina), 8-deoxo-15,-O-desmetil-26-O-desmetil-38-O-desmetil-prolilrapamicina, 15-O-desmetil-26-desmetoxi-38-O-desmetil-prolilrapamicina, 8-deoxo-26-desmetoxi-38-O-desmetil-prolilrapamicina, 8-deoxo-15-O-desmetil-38-O-desmetil-prolilrapamicina, 8-deoxo-15-O-desmetil-26-desmetoxi-prolilrapamicina, 15-O-desmetil-26-O-desmetil-38-O-desmetil-prolilrapamicina, 8-deoxo-26-O-desmetil-38-O-desmetil-prolilrapamicina, 8-deoxo-15-O-desmetil-26-O-desmetil-prolytrapamicina, 15-O-desmetil-38-O-desmetil-prolilrapamicina, 15-O-desmetil-26-O-desmetil-prolilrapamicina, 15-O-desmetil-26-desmetoxi-prolilrapamicina, 26-desmetoxi-38-O-desmetil-prolilrapamicina, 26-O-desmetil-38-O-desmetil-prolilrapamicina, 8-deoxo-15-O-desmetil-prolilrapamicina, 8-deoxo-26-O-desmetil-prolilrapamicina, 8-deoxo-38-O-desmetil-prolilrapamicina, 15-O-desmetil-prolilrapamicina, 38-O-desmetil-prolilrapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-desmetoxirapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-27-O-desmetil-39-desmetoxi-rapamicina, 16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-desmetoxi-rapamicina, 9-deoxo-27-desmetoxi-39-desmetoxi-rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-39-desmetoxi-rapamicina, 16-O-desmetil-27-O-desmetil-39-desmetoxi-rapamicina, 9-deoxo-27-O-desmetil-39-desmetoxi-rapamicina, 16-O-desmetil-39-desmetoxi-rapamicina, 27-desmetoxi-39-desmetoxi-rapamicina, 27-O-desmetil-39-desmetoxi-rapamicina, 9-deoxo-39-desmetoxi-rapamicina, 8-deoxo-15-O-desmetil-26-desmetoxi-38-desmetoxi-prolilrapamicina, 8-deoxo-15-O-desmetil-26-O-desmetil-38-desmetoxi-prolilrapamicina, 15-O-desmetil-26-desmetoxi-38-desmetoxi-prolilrapamicina, 8-deoxo-26-desmetoxi-38desmetoxi-prolilrapamicina, 8-deoxo-15-O-desmetil-38-desmetoxi-prolilrapamicina, 15-O-desmetil-26-O-desmetil-38-desmetoxi-prolilrapamicina, 8-deoxo-26-O-desmetil-38-desmetoxi-prolilrapamicina, 15-O-desmetil-38-desmetoxi-prolilrapamicina, 26-desmetoxi-38-desmetoxi-prolilrapamicina, 26-O-desmetil-38-desmetoxi-prolilrapamicina, 8-deoxo-38-desmetoxi-prolilrapamicina 38-desmetoxi-prolilrapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-36-de(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclohexil)-36-(hidroxiciclohexenyl) rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-36-de(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclohexil)-36-(dihidroxiciclohexil) rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-36-de(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclohexil)-36-(hidroxinorbornil) rapamicina, 9-deoxo 16-O-desmetil-27-desmetoxi-36-de(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclohexil)-36-(3-metil-4-hidroxiciclohexil) rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-36-de(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclohexil)-36-(4-metilo hidroxiciclohexil) rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-36-de(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclohexil)-36-(3-fluoro-4-hidroxiciclohexil) rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-36-de(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclohexil)-36-(3-hidroxi-4-fluorociclohexil) rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-36-de(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclohexil)-36-(3-cloro-4-hidroxiciclohexil) rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-36-de(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclohexil)-36-(3-hidroxi-4-clorociclohexil) rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-36-de(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclohexil)-36-(3-cis-4-cis-dihidroxiciclohexil) rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-36-de(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclohexil)-36-(3-trans-4-trans-dihidroxiciclohexil) rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-27-O-desmetil-39-O-desmetilo rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-27O-desmetil-36-de(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclohexil)-36-(hidroxiciclohexenyl) rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-27-O-desmetil-36-de(3-cis-metoxi-4-transhidroxiciclohexil)-36-(hidroxinorbornil) rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-27-O-desmetil-36-de(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclohexil)-36-(4-metil hidroxiciclohexil) rapamicina.
En un aspecto diferente de esta clase, la presente invención proporciona un sistema para la producción combinatoria de cepas hospederas recombinantes capaces de producir análogos de la rapamicina, que involucra la construcción de una deleción genómica rapQONMLKJI introducida en S. hygroscopicus y su complementación parcial mediante una librería combinatoria de casetes génicos que consta de uno o varios de los genes auxiliares suprimidos rapQ, rapN/O, rapM, rapL, rapK, rapJ, y rapI.
La estrategia presentada comprende, como parte de la estrategia de clonaje, combinar genes que incluyen, pero no se limitan exclusivamente a, rapK, rapI, rapQ, rapM, rapN/O, rapL y rapJ, y/o genes con funciones génicas similares, en cualquier combinación y orden de genes posibles.
Otro aspecto de la invención permite el aumento de la expresión génica mediante el cambio en el orden de los genes en el casete génico. Como se aplica a la clase preferida, los genes pueden comprender uno o más de rapK, rapI, rapQ, rapM, rapN/O, rapL y rapJ y/o genes con funciones similares, lo que permite el arreglo de los genes en una multitud de permutaciones como se presenta en el Ejemplo 5.
La estrategia de clonaje descrita en esta invención también permite la introducción de una cola de histidina en combinación con una secuencia terminadora 3' en el casete génico para aumentar la expresión génica. Los expertos en la técnica apreciarán que pueden ser utilizadas otras secuencias terminadoras.
Otro aspecto de la invención describe los usos múltiples de las secuencias del promotor en el casete génico ensamblado para la optimización de la expresión génica.
En estos momentos será obvio para los expertos en la materia que pueden construirse las cepaspor deleción de S. hygroscopicus, deleción que comprenda, pero no se limite a, un gen o un subgrupo de los genes rapQ, rapN/O, rapM, rapL, rapK, rapJ y rapI. En este caso, los casetes génicos para la complementación o la complementación parcial generalmente constan de genes únicos o una pluralidad de genes seleccionados entre el subgrupo de genes suprimidos.
Es bien conocido por los expertos en la materia que existen homólogos para varios de los genes de suministro del precursor y de los genes modificadores de la rapamicina en los grupos de genes de sistemas estrechamente relacionados que incluyen FK506 (Motamedi et al, 1996; Motamedi et al, 1997; Motamedi & Shafiee, 1998) y FK520 (Wu et al, 2000). Estos incluyen los siguientes, como se describen en la Tabla I inferior:
TABLA I
1
Aunque los grupos de genes de otros sistemas estrechamente relacionados, que incluyen, pero no se limitan a aquellos de la biosíntesis de FK523, meridamicina, FK525, antascomicina y tsukubamicina no han sido secuenciados aún, puede anticiparse que se demostrará que los mismos poseen un parecido cercano a aquellos cuyas secuencias han sido determinadas, y, en particular, que estos grupos de genes contendrán homólogos cercanos de varios de los genes modificadores y de suministro del precursor de la rapamicina. Por tanto, en otro aspecto más de la invención, los genes de grupos de genes heterólogos de tales sistemas estrechamente relacionados, que incluyen, pero no se limitan a, FK506, FK520, FK523, antascomicina, meridamicina, FK525, "hyg" y tsukubamicina pueden ser incluidos en casetes génicos en lugar de o además de los homólogos de la rapamicina para la complementación y/o la complementación parcial de la cepa productora de rapamicina que contiene una deleción de un gen o deleciones que incluyen pero no se limitan a los genes rapK, rapI, rapQ, rapM, rapNlO, rapL y rapJ.
Es bien conocido para los expertos en la técnica que los grupos de genes de poliquétido pueden ser expresados en hospederos heterológos (Pfeifer y Khosla, 2001). De acuerdo con esto, la presente invención incluye la transferencia del grupo de genes de la biosíntesis de rapamicina con o sin genes de resistencia y regulatorios, ya sea completo o conteniendo deleciones, para la complementación en hospederos heterólogos. Los métodos y vectores para la transferencia como se definió anteriormente de dichos grandes fragmentos de ADN son bien conocidos en la técnica (Rawlings, 2001; Staunton y Weissman, 2001) o se proporcionan en el presente documento en los métodos explicados. En este contexto una cepa de células hospederas es un procarionte, con mayor preferencia un actinomycete o Escherichia coli, con mayor preferencia aún incluye, pero no se limitan a S. hygroscopicus, S. hygroscopicus sp., S. hygroscopicus var. ascomyceticus, Streptomyces tsukubaensis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces lividans, Saccharopolyspora erythraea, Streptomyces fradiae, Streptomyces avermitilis, Streptomyces cinnamonensis, Streptomyces rimosus, Streptomyces albus, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces longisporoflavus, Streptomyces venezuelae, Micromonospora griseorobida, Amycolatopsis mediterranei o Actinoplanes sp. N902-109.
Los análogos de la rapamicina pueden obtenerse mediante un proceso que comprende los pasos de:
a) construcción de una cepa por deleción, a través de los métodos de la invención; la deleción incluye, pero no se limita a, los genes rapK, rapQ, rapN/O, rapM, rapL, rapJ y rapI, o un subgrupo de los mismos,
b) cultivo de la cepa bajo condiciones adecuadas para la producción de poliquétido;
c) el aislamiento opcional del intermediario del análogo de la rapamicina producido;
d) la construcción de una cepa de biotransformación que contenga un casete génico que comprenda todos o un subgrupo de los genes suprimidos;
e) la suplementación del intermediario del análogo de la rapamicina al sobrenadante o aislamiento del cultivo como en el paso c) a un cultivo de la cepa de biotransformación bajo condiciones adecuadas de biotransformación
f) aislamiento opcional del análogo de la rapamicina producido.
Las cepas hospederas adecuadas para la construcción de la cepa de la biotransformación incluyen la cepa hospedera nativa en la que el grupo de genes de la biosíntesis de rapamicina ha sido suprimido, o sustancialmente suprimido o inactivado, de modo tal que se elimine la síntesis del poliquétido, o una cepa hospedera heteróloga. Los métodos para la expresión de casetes génicos que incluyen uno o una pluralidad de genes modificadores o genes de suministro de precursor en hospederos heterólogos se describen en WO 01/79520. En este contexto, los hospederos heterólogos adecuados para la biotransformación de dicho intermediario del ligando del análogo de FKBP incluyen, pero no se limitan a, S. hygroscopicus, S. hygroscopicus sp., S. hygroscopicus var. ascomyceticus, Streptomyces tsukubaensis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces lividans, Saccharopolyspora erythraea, Streptomyces fradiae, Streptomyces avermitilis, Streptomyces cinnamonensis, Streptomyces rimosus, Streptomyces albus, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces longisporoflavus, Streptomyces venezuelae, Micromonospora griseorubida, Amycolatopsis mediterranei, Escherichia coli y Actinoplanes sp. N902-109.
La estrecha relación estructural entre la rapamicina y FK506, FK520, FK523, "hyg", meridamicina, antascomicina, FK525 y tsukubamicina, entre otros, y las homologías establecidas entre los genes involucrados en la biosíntesis de rapamicina y FK506 y FK520 (vide supra), hacen obvia la aplicación de los métodos de la presente invención a estos sistemas estrechamente relacionados. En otro aspecto, por tanto, la invención incluye la construcción de cepas por deleción de las cepas productoras de compuestos estrechamente relacionados, que incluyen pero no se limitan a FK506, FK520, FK523, "hyg", antascomicina, meridamicina, FK525 y tsukubamicina, que contengan una deleción de un gen o deleciones de genes modificadores y/o de genes de suministro del precursor, y más particularmente, que incluyan pero no se limiten a, genes con funciones similares como rapK, rapI, raPQ, rapM, rapN/O, rapL y rapJ, y su complementación o complementación parcial con un gen o casete génico que comprenda todos o un subgrupo de los genes homólogos surpimidos, o sus homólogos funcionales a partir de grupos de genes heterólogos, que incluyen pero no se limitan a rapK, rapI, rapQ, rapM, rapN/O, rapL y rapJ para producir cepas recombinantes capaces de producir análogos de poliquétido que varíen a partir del poliquétido de partida en la incorporación de precursores alternativos y/o el grado de la modificación post-PKS. Además, la invención proporciona un método de producción de dichos análogos de poliquétido mediante el cultivo de dicha cepa hospedera recombinante, y el aislamiento de modo opcional de los análogos de poliquétido producidos.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para la producción de cepas hospederas recombinantes capaces de producir análogos de ligandos de poliquétidos FKBP (distintos de la rapamicina) que varíen a partir del poliquétido de partida en la incorporación de precursores alternativos y/o el grado de la modificación post-PKS, lo que incluye la construcción de una cepa por deleción genómica en la cual todos o una porción de los genes auxiliares han sido eliminados, y su complementación parcial mediante un casete génico que comprenda uno o la pluralidad de los genes suprimidos y/o sus homólogos, y además, un método de producir dichos análogos de poliquétidos mediante el cultivo de dicha cepa hospedera recombinante, y opcionalmente el aislamiento de los análogos de poliquétido producidos. Es bien conocido en la técnica que en la mayoría de los casos los genes auxiliares se co-localizan con los genes de la poliquétido sintasa en un grupo de genes (Hopwood, 1997; Motamedi y Shafiee, 1998; Wu et al., 2000) y de este modo se facilita la creación de la cepa por deleción. Los genes auxiliares a ser suprimidos pueden o no formar naturalmente una secuencia contigua, sin embargo, una vez que se ha creado la cepa por deleción, la complementación parcial mediante casetes génicos proporciona una estrategia expedita para la producción de cepas recombinantes en las que han sido suprimidos uno o varios de dichos genes. Por lo tanto, en un aspecto adicional, la invención proporciona un método para la producción combinatoria de cepas hospederas recombinantes capaces de producir análogos de ligandos de poliquétidos FKBP (distintos de la rapamicina) que varíen a partir del poliquétido de partida en la incorporación de precursores alternativos y/o el grado de la modificación post-PKS, que comprendan la complementación parcial de dicha cepa por deleción genómica mediante una librería combinatoria de casetes génicos que comprenda uno o varios de los genes suprimidos, y además, un método para producir dichos análogos de poliquétidos mediante el cultivo de dichas cepas hospederas recombinantes bajo condiciones adecuadas para la producción de poliquétidos, y opcionalmente el aislamiento de los análogos de poliquétido producidos. En este contexto, una cepa celular hospedera recombinante preferida es un procarionte, con mayor preferencia un actinomycete, con mayor preferencia aún, una cepa seleccionada entre S. hygroscopicus, S. hygroscopicus sp., S. hygroscopicus var. ascomyceticus, Streptomyces tsukubaensis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces lividans, Saccharopolyspora erythraea, Streptomyces fradiae, Streptomyces avermitilis, Streptomyces cinnamonensis, Streptomyces rimosus, Streptomyces albus, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces longisporoflavus, Streptomyces venezuelae, Micromonospora griseorubida, Amycolatopsis mediterranei o Actinoplanes sp. N902-109.
Los expertos en la técnica apreciarán que los métodos de la presente invención pueden aplicarse a cepas hospederas recombinantes en las que la poliquétido sintasa (PKS) ha sido alterada mediante ingeniería genética para expresar una rapamicina modificada u otro análogo de poliquétido. La literatura previa describe varios métodos para la producción de poliquétidos novedosos por deleción o inactivación de dominios individuales (WO93/13663, WO97/92358), la construcción de poliquétido sintasas híbridas (WO98/01546, WO00/00618, WO00/01827) o la alteración de la especificidad de dominio mediante mutagénesis dirigida (WO02/14482).
Es bien conocido en la técnica que los péptidos no ribosomales se biosintetizan por las Péptido Sintasas No Ribosomales (NRPSs) a través de la condensación por pasos de sucesivos bloques elementales aminoacídicos, en un proceso análogo al de la biosíntesis de poliquétido (para una revisión, ver Marahiel et al., 1997; Schwarzer y Marahiel, 2001). Es bien conocido que varios péptidos no ribosomales incluyen residuos de aminoácidos inusuales (modificados, aminoácidos proteinogénicos y/o aminoácidos no proteinogénicos) y ácidos carboxílicos, cuyos genes de biosíntesis se encuentran colocalizados junto a los genes de la péptido sintasa no ribosomal en el grupo de genes de péptidos no ribosomales (Marahiel et al., 1997; Konz y Marahiel, 1999; Blanc et al., 1997). En varios casos, los productos peptídicos no ribosomales que se liberan inicialmente de la NRPS se continúan modificando por un grupo de enzimas, que incluyen, pero no se limitan a, glicosil transferasas, reductasas, de acilación o de formación de anillos heterocíclicos (Konz y Marahiel, 1999; Blanc et al., 1995). Estos incluyen los antibióticos cloroeremomicina, pristinamicina, vancomicina y bleomicina (Konz y Marahiel, 1999; Du et al., 2000). Los genes de estas enzimas post-NRPS se encuentran también típicamente colocalizados en el grupo de genes de biosíntesis (Marahiel et al., 1997; Schwarzer y Marahiel, 2001). Por tanto, en un aspecto adicional, la invención incluye un método para la producción de análogos de péptidos no ribosomales, que varían a partir del péptido no ribosomal inicial en la incorporación de aminoácidos precursores alternativos y/o el grado de modificación post-NRPS, lo que comprende la construcción de una cepa por deleción genómica en la que se han suprimido todos o una porción de los genes que codifican para la síntesis del aminoácido nativo precursor y/o las enzimas post-NRPS, y su complementación parcial mediante un casete génico que comprende uno o varios de los genes suprimidos y/o sus homólogos, y, adicionalmente, un método para producir dichos análogos de péptidos no ribosomales mediante el cultivo de dicha cepa hospedera recombinante, y opcionalmente el aislamiento de los análogos de péptidos no ribosomales producidos. Los genes de la biosíntesis de precursor y post-NRPS que se suprimen pueden o no formar de manera natural una secuencia contigua, sin embargo, una vez que se ha creado la cepa por deleción, la complementación parcial mediante casetes génicos proporciona una estrategia expedita para la producción de cepas recombinantes en las que uno o una pluralidad de dichos genes se han suprimido. Por tanto, en un aspecto adicional, la invención proporciona un método para la producción combinatoria de cepas hospederas recombinantes capaces de producir análogos de péptidos no ribosomales que varíen del péptido no ribosomal inicial en la incorporación de precursores alternativos y/o el grado de modificación post-NRPS, lo que comprende la complementación parcial de dicha cepa por deleción genómica mediante una librería combinatoria de casetes génicos que comprenda uno o varios de los genes suprimidos, y, además, un método para la producción de dichos análogos de péptidos no ribosomales mediante el cultivo de dichas cepas hospederas recombinantes bajo condiciones adecuadas para la producción de péptidos no ribosomales, y opcionalmente, el aislamiento de los análogos de péptidos no ribosomales producidos. En este contexto, una cepa celular hospedera recombinante preferida es un procarionte, con mayor preferencia un actinomycete, con mayor preferencia aún, una cepa seleccionada entre S. hygroscopicus, S. hygroscopicus sp., S. hygroscopicus var. ascomyceticus, Streptomyces tsukubaensis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces lividans, Saccharopolyspora erythraea, Streptomyces fradiae, Streptomyces avermitilis, Streptomyces cinnamonensis, Streptomyces rimosus, Streptomyces albus, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces longisporoflavus, Streptomyces venezuelae, Micromonospora griseorubida, Amycolatopsis mediterranei o Actinoplanes sp. N902-109.
Es bien conocido que muchos actinomycetes contienen múltiples grupos de genes de biosíntesis de diferentes metabolitos secundarios, incluyendo poliquétidos y péptidos sintetizados de manera no ribosomal. Específicamente, se ha demostrado que las cepas de S. hygroscopicus producen una variedad de poliquétidos y péptidos sintetizados de manera no ribosomal, además de la rapamicina, FK506, FK520, FK523, meridamicina, FK525, antascomicina y tsukubamicina. Estos incluyen, pero no se limitan a, elaiofilina, bialafos, higromicina, augustmicina, endomicina (A, B), glebomicina, higroscopina, ossamicina y nigericina. Estos grupos de genes de biosíntesis adicionales representan un requerimiento competitivo de los precursores biosintéticos y una demanda metabólica adicional en la cepa hospedera. Con el objetivo de aumentar la producción de la rapamicina deseada, o la de otros análogos de poliquétidos, pudiera ser, en consecuencia, ventajoso suprimir o inactivar cualquier otro grupo de genes de biosíntesis presente en la cepa hospedera. Los métodos para la deleción o inactivación de los grupos de genes de biosíntesis son bien conocidos en la técnica.
En un aspecto adicional de esta clase, la invención proporciona una metodología de mutasíntesis para la complementación de cepas por deleción recombinantes.
En un aspecto adicional, las cepas de S. hygroscopicus de la presente invención que contienen una deleción de rapL pueden alimentarse con análogos del aminoácido incorporado naturalmente, ácido L-pipecólico, para producir nuevos análogos de la rapamicina en los que el residuo pipecolil se encuentra reemplazado. La literatura previa describe que un mutante rapL puede complementarse mediante la adición de ácido L-pipecólico al cultivo (Khaw et al., 1998). De modo semejante, se ha demostrado que se aislaron los análogos de la rapamicina después de la adición y la incorporación de análogos del ácido L-pipecólico, L-prolina, L-trans-4-hidroxiprolina, L-cis-4-hidroxiprolina, L-cis-3-hidroxiprolina, ácido trans-3-aza-biciclo[3,1,0]hexano-2-carboxílico (WO98/54308). Utilizando S. hygroscopicus MG2-10 como cepa fondo para expresar genes o casetes génicos que codifiquen para pasos de modificación post-PKS que no incluyan a homólogos rapL o rapL, se genera una librería de cepas de S. hygroscopicus, capaz de producir una variedad de productos modificados al suplementarse con análogos del ácido L-pipecólico. Los análogos adecuados del ácido L-pipecólico incluyen al ácido pipecólico y la prolina sustituidos con alquilo, halo, hidroxi, y amino, y más particularmente, los análogos de L-prolina, L-trans-4-hidroxiprolina, L-cis-4-hidroxiprolina, L-cis-3-hidroxiprolina, ácido trans-3-aza-biciclo[3,1,0]hexano-2-carboxílico y ácido L pipecólico demostraron que catalizan el intercambio de PP-ATP, determinado mediante una modificación del método de Lipmann (Nielsen et al., 1991) que incluyen la L-4-hidroxiprolina, 1-hidroxiprolina, 2-hidroxiprolina, 3-hidroxiprolina, trans-3-metil-L-prolina, cis-3-metilprolina, cis-3-metil-DL-prolina, cis,trans-4-metilprolina, cis-4-metil-DL-prolina, trans-4-metil-DL-prolina, trans-4-aminoprolina, cis-4-cloro-L-prolina, 5-iminoprolina clorhídrico, cis-5-metil-DL-prolina, ácido (+)-piperázico, ácido 5-cloropipecólico, ácido 5-hidroxipipecólico, ácido cis-4-hidroxi-L-pipecólico, ácido trans-4-hidroxi-D pipecólico, ácido 4-hidroxiallopipecólico, ácido tiazolidina-4-carboxílico (Nielsen et al., 1991). Esta estrategia se encuentra ejemplificada en el Ejemplo 7.
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Previamente ha sido descrita la producción de un número limitado de análogos novedosos de la rapamicina después de añadir análogos estructurales cercanos de la unidad de partida natural ácido 4,5-dihidroxiciclohex-1-enecarboxílico a cultivos de S. hygroscopicus, y de este modo se ha demostrado que el módulo de carga de la poliquétido sintasa de la rapamicina posee cierta flexibilidad con respecto al ácido de partida (P.A.S. Lowden, disertación de doctorado, Universidad de Cambridge, 1997). Sin embargo, estos métodos conducen a la producción de una mezcla de productos. En un aspecto adicional, la presente invención incluye la producción de análogos de la rapamicina y de ligandos de FKBP relacionados mediante la adición a las cepas de la presente invención de análogos de la unidad de partida naturalmente incorporada ácido 4,5-dihidroxiciclohex-1-enecarboxílico para producir análogos de la rapamicina que incorporen unidades de partida alternativas que incluyen, pero no se limitan a, ácido ciclohexano carboxílico, ácido 3-cis,4-trans-dihidroxiciclohexano carboxílico, ácido 1-ciclohexeno carboxílico, ácido 3-ciclohexeno carboxílico, ácido cicloheptano carboxílico, ácido 2-norbomane carboxílico, ácido 3-hidroxiciclohexano carboxílico, ácido 4-hidroxiciclohexano carboxílico, ácido 3-metilciclohexano carboxílico, ácido 4-metilciclohexano carboxílico, ácido 3-(cis/trans)metoxiciclohexano carboxílico, ácido 4-(cis/trans)metoxiciclohexano carboxílico, ácido 4-oxo ciclohexano carboxílico, ácido 3-fluoro-4-hidroxicarboxílico y ácido 4-fluoro-3-hidroxicarboxílico, ácido-óxido 3-ciclohexano carboxílico, ácido 3,4-cis-dihidroxiciclohexano carboxílico, ácido 3-cloro-4-hidroxicarboxílico y ácido 4-cloro-3-hidroxicarboxílico (y el par de diastereoisómeros opuestos), ácido ciclohexilpropiónico, ácido 4-ter-butilciclohexano carboxílico y ésteres y sales simples de los mismos. Esta estrategia se ejemplifica en los Ejemplos 8, 19 y 20.
Además, pueden añadirse análogos estructurales de los precursores de biosíntesis de la unidad de partida del ácido 4,5-dihidroxiciclohex-1-enecarboxílico (Lowden et al., 2001), lo que conduce a la producción de análogos novedosos de la rapamicina que incorporen unidades de partida alternativas.
Sin embargo, estos métodos pueden conducir a la producción de grupos de mezclas de productos; por tanto, la presente invención proporciona, además, un método para la eliminación de la competencia entre las unidades de partida producidas endógenamente y los análogos de ácido de partida alternativos que se añaden con el objetivo de aumentar la eficiencia de la producción de análogos novedosos de la rapamicina.
Con el objetivo de eliminar la competencia entre las unidades de partida naturales producidas endógenamente y los análogos de ácidos de partida alternativos añadidos, es preferible interrumpir la biosíntesis de la unidad de partida natural, ácido 4,5-dihidroxiciclohex-1-enecarboxílico. Esto puede lograrse mediante la deleción o inactivación de uno o más de los genes involucrados en la biosíntesis de la unidad de partida natural ácido 4,5-dihidroxiciclohex-1-enecarboxílico a partir del ácido siquímico (Lowden et al., 2001) o de la biosíntesis del ácido siquímico en sí misma. En el segundo caso, pudiera ser necesario suplementar los cultivos con aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina, triptófano). De modo alternativo, la producción endógena de la unidad de partida natural ácido 4,5-dihidroxiciclohex-1-eno carboxílico puede eliminarse mediante la adición de un inhibidor químico de la biosíntesis del ácido siquímico. Tales inhibidores se encuentran bien descritos en la literatura.
En otro aspecto, la invención hace uso del sorprendente descubrimiento de que rapK se encuentra involucrado en el suministro del (de los) precursor(es) de biosíntesis, p.e. la unidad de partida de la rapamicina, ácido 4,5-dihidroxiciclohex-1-eno carboxílico, y por tanto la deleción o inactivación de rapK o un homólogo de rapK proporciona una cepa en la que no existe competencia entre la unidad de partida natural y las unidades de partida no naturales añadidas. En otro aspecto, la invención proporciona un método para la incorporación eficiente de los ácidos añadidos, que incluyen, pero no se limitan a aquellos que se describen posteriormente.
Por lo tanto, en un aspecto de la invención, el método comprende añadir unidades de partida de la fórmula
2
donde X = enlace o CH_{2} y R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} y R_{6} pueden ser iguales o diferentes y pueden ser, de modo independiente, Cl, F, OH, SH, H, alquilo, CN, Br, R_{7}, OR^{7}, C(O)R_{7} o HNR_{7} donde R_{7} es un alquilo C1-C4; R_{1} y R_{3}, R_{2} y R_{4}, R_{3} y R_{5}, R_{4} y R_{6}, R_{1} y R_{5}, o R_{2} y R_{6} pueden encontrarse unidos por un enlace, sea sustituido o no sustituido, metileno, un enlace éter, un enlace thia o un enlace amino, R_{1} y R_{2}, R_{3} y R_{4} o R_{5} y R_{6} pueden encontrarse juntos como una cetona; siempre que no más de 4 entre R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} sean Cl; no más de 2 entre R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} sean HNR_{7}; no más de 2 entre R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} sean SH y ambos grupos R de un carbono del anillo no sean OH.
En una realización preferida, la unidad de partida no se selecciona del grupo que consta de: ácido ciclohexano carboxílico, ácido 3-cis,4-trans-dihidroxiciclohexanocarboxílico, ácido cicloheptanocarboxílico y ácido 3-(cis/trans)-metilciclohexano carboxílico.
En realizaciones preferidas: donde R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son una combinación de F y sustitución de OH, no más de 3 de R_{1}-_{6} se encuentran sustituidos y los restantes son H. Donde R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son una combinación de Cl y sustitución de OH, no más de 3 de R_{1}-_{6} se encuentran sustituidos y los restantes son H. Donde cualesquiera dos de entre R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son OH y cualesquiera dos grupos R en un carbono son F, los restantes son H. Donde dos entre R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son Cl, los restantes son H. Donde dos entre R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son Cl, que no estén enlazados al mismo carbono, y otro R es OH, los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} es alquilo y los restantes son H; el grupo alquilo debe tener una longitud lineal de no más de 3 carbonos. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} es NHR_{7}, los restantes son H.
En realizaciones mucho más preferidas: donde dos de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son OH y un tercer grupo R es F, los restantes son H. Donde dos de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son F, los restantes son H. Donde dos de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son OH, los restantes son H. Donde dos de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son OH y un tercer grupo R es Cl, los restantes son H. Donde dos de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son F, y un tercer grupo R es OH, los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} es SH, los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} es SH y un segundo grupo R es OH (que no estén enlazados al mismo carbono), los restantes son H.
En realizaciones aún mucho más preferidas: donde uno de entre R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} es F, los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son Cl, los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6}, son F y un segundo grupo R es OH (que no estén enlazados al mismo carbono), los restantes son H. Donde uno entre R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} es Cl y un segundo grupo R es OH (que no estén enlazados al mismo carbono), los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} es alquilo y los restantes son H; el grupo alquilo no debe contener más de 4 carbonos y tener una longitud lineal de no más de 3 carbonos. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} es alquilo y un segundo grupo R es OH (que no estén enlazados al mismo carbono) y los restantes son H; el grupo alquilo no debe contener más de 4 carbonos y tener una longitud lineal de no más de 3 carbonos.
Un aspecto adicional de la invención incluye la adición de unidades de partida de la fórmula
3
donde X = enlace o CH_{2} y R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} y R_{6} pueden ser iguales o diferentes y pueden ser, de modo independiente, Cl, F, OH, SH, H, alquilo, CN, Br, R_{7}, OR^{7}, C(O)R_{7} o HNR_{7} donde R_{7} es un alquilo C1-C4; R_{1} y R_{3}, R_{2} y R_{4}, R_{3} y R_{5}, R_{4} y R_{6}, R_{1} y R_{5}, o R_{2} y R_{6} pueden encontrarse unidos por un enlace metileno, sea sustituido o no sustituido, un enlace éter, un enlace tio, o un enlace amino, R_{1} y R_{2}, R_{3} y R_{4} o R_{5} y R_{6} pueden encontrarse unidos como una cetona; siempre que no más de 4 de R_{1} R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} sean Cl; no más de dos de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} sean HNR_{7}; no más de 2 de R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} sean SH y ambos grupos R enlazados al mismo carbono en el anillo no sean OH.
En una realización preferida, la unidad de partida no se selecciona entre el grupo que consta de: ácido 1-ciclohexeno carboxílico y ácido 1-ciclohepteno carboxílico.
En realizaciones preferidas, donde R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son una combinación de sustituciones de F y OH no más de 3 de R_{1}-_{6} se encuentran sustituidos y los restantes son H. Donde R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son una combinación de Cl y sustitución de OH no más de 3 de R_{1}-_{6} se encuentran sustituidos y los restantes son H. Donde cualesquiera de entre R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son OH y dos de los grupos R restantes son F sobre el mismo carbono, los restantes son H. Donde dos de entre R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son Cl, los restantes son H. Donde dos de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son Cl, que no se encuentren enlazados al mismo carbono, y otro grupo R es OH, los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} es alquilo y los restantes son H; el grupo alquilo debe tener una longitud lineal de no más de 3 carbonos. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} es NHR_{7}, los restantes son H.
En realizaciones mucho más preferidas: donde dos de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son OH y un tercer grupo R es F, los restantes son H. Donde dos de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son F, los restantes son H. Donde dos de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son OH, los restantes son H. Donde dos de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son OH y un tercer grupo R es Cl, los restantes son H. Donde dos de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son F, y un tercer grupo R es OH, los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} es SH, los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} es SH y un segundo grupo R es OH (que no estén enlazados al mismo carbono), los restantes son H.
En realizaciones mucho más preferidas aún: donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} es F, los restantes son H. Donde dos entre R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son Cl, los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}. R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6}, son F y un segundo grupo R es OH (que no estén enlazados al mismo carbono), los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} es Cl, un segundo grupo R es OH (que no estén enlazados al mismo carbono), los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} es alquilo y los restantes son H; el grupo alquilo debe contener no más de 4 carbonos y tener una longitud lineal de no más de 3 carbonos. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} es alquilo y un segundo grupo R es OH (que no estén enlazados al mismo carbono), los restantes son H; y el grupo alquilo debe contener no más de 4 carbonos y tener una longitud lineal de no más de 3 carbonos.
Otro aspecto de la invención incluye la adición de unidades de partida de la fórmula:
4
donde X = enlace o CH_{2}, R_{1} y R_{2}, pueden ser iguales o diferentes y pueden ser, de modo independiente, F, Cl, OH, SH, H, CN, OR_{7}, C(O)R_{7}, o NHR_{7} en los que R_{7} es un alquilo C1-C4, R_{1} y R_{2} pueden también encontrarse juntos formando una cetona, un grupo spirociclopropilo o con -OCH_{2}-, -CH_{2}O-, -SCH_{2}- o -CH_{2}S-; más aún, R_{3}, y pueden ser iguales o diferentes y pueden ser, de modo independiente, F, Cl, Br, OR_{7}, H o CN; siempre que ambos grupos R enlazados al mismo carbono del anillo no sean OH.
En una realización preferida, la unidad de partida no debe ser ácido 5-cis-hidroxil-3-ciclohexeno carboxílico.
En realizaciones preferidas: Donde dos de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, o R_{4} son F, los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, o R_{4} es Cl, los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{3}, o R_{4} es F y uno de los siguientes R_{1} o R_{2} es OH, los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{3} o R_{4} es Cl y uno de los siguientes R_{1} o R_{2} es OH, los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1} o R_{2} es SH, los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, o R_{4} es alquilo y los restantes son H; el grupo alquilo debe contener no más de 4 carbonos y tener una longitud lineal de no más de 3 carbonos. Donde uno de los siguientes R_{3} o R_{4} es alquilo y R_{1} o R_{2} es OH, los restantes son H; y el grupo alquilo debe contener no más de 4 carbonos y tener una longitud lineal de no más de 3 carbonos.
En una realización mucho más preferida, donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, o R_{4} es F, los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, o R_{4} es Cl, los restantes son H.
Otro aspecto de la invención comprende la adición de unidades de partida de la fórmula
5
donde R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} pueden ser iguales o diferentes y pueden ser, de modo independiente, Cl, F, OH, SH, H, alquil, CN, Br, R_{7}, OR_{7}, C(O)R_{7} o HNR_{7} donde R_{7} es un alquilo C1-C4; R_{1} y R_{3}, R_{2} y R_{4}, R_{3} y R_{5}, R_{4} y R_{6}, R_{1} y R_{5}, o R_{2} y R_{6} pueden encontrarse unidos por un enlace, sea sustituido o no sustituido, metileno, un enlace éter, un enlace thia o un enlace amino, R_{3} y R_{4} o R_{5} y R_{6} R_{6} pueden encontrarse unidos como una cetona; siempre que los grupos R que se originan del mismo carbono del anillo no sean OH.
En realizaciones preferidas: donde dos de R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son F, los restantes son H. Donde dos de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son OH, los restantes son H. Donde dos de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son OH, y un tercer grupo R es F, los restantes son H. Donde dos de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son OH, y un tercer grupo R es Cl, los restantes son H. Donde dos de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son F y un tercer grupo R es OH, los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} es Br, los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} es Br y un segundo grupo R es OH, los restantes son H.
En realizaciones más preferidas: Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} es F, los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} es Cl, los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} es F y un segundo grupo R es OH (que no estén enlazados al mismo carbono), los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} es Cl y un segundo grupo R es OH (que no estén enlazados al mismo carbono), los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} es SH, los restantes son H. Donde uno de R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} es SH y un segundo grupo R es OH (que no estén enlazados al mismo carbono), los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} es alquilo y los restantes son H; el grupo alquilo debe contener no más de 4 carbonos y tener una longitud lineal de no más de 3 carbonos. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} alquilo y un segundo grupo R es OH (que no estén enlazados al mismo carbono), los restantes son H; y el grupo alquilo debe contener no más de 4 carbonos y tener una longitud lineal de no más de 3 carbonos.
Otro aspecto de la invención incluye adicionar unidades de partida de la fórmula
6
donde R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} pueden ser iguales o diferentes y pueden ser, de modo independiente, Cl, F, OH, SH, H, alquilo, CN; Br, R_{7}, OR_{7}, C(O)R_{7} o HNR_{7} donde R_{7} es un alquilo C1-C4; R_{1} y R_{3}, R_{2} y R_{4}, R_{3} y R_{5}, R_{4} y R_{6}, R_{1} y R_{5}, o R_{2} y R_{6} pueden encontrarse unidos por un enlace metileno, sea sustituido o no sustituido, un enlace éter, un enlace tio o un enlace amino, R_{3} y R_{4} o R_{5} y R_{6} pueden encontrarse unidos como una cetona; siempre que ambos grupos R que se originan del mismo carbono del anillo no sean OH.
En realizaciones preferidas: donde R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son una combinación de sustituciones de F y OH no más de 3 de R_{1}-_{6} están sustituidos y los restantes son H. Donde R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son una combinación of Cl y sustitución de OH no más de 3 de R_{1}-_{6} están sustituidos y los restantes son H. Donde dos de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son OH y dos de los grupos R restantes unidos al mismo carbono son F, los restantes son H. Donde dos de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son Cl, los restantes son H. Donde dos de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son Cl (que no estén enlazados al mismo carbono) y un tercer grupo R es OH, los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} es alquilo y los restantes son H; el grupo alquilo debe tener una longitud lineal de no más de 3 carbonos. Donde dos de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son SH, los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} es HNR_{7}, los restantes son H.
En realizaciones más preferidas: Donde dos de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son F, los restantes son H. Donde dos de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son OH, los restantes son H. Donde dos de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son OH y un tercer grupo R es F, los restantes son H. Donde dos de los siguientes R_{1}' R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son OH y un tercer grupo R es Cl, los restantes son H. Donde dos de los siguientes R_{1}' R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} son F, y un tercer grupo R es OH, los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} es Br, los restantes son H. Donde uno de R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} es Br y un segundo grupo R es OH (que no estén enlazados al mismo carbono), los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} es SH, los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} es SH y un segundo grupo R es OH (que no estén enlazados al mismo carbono), los restantes son H.
En realizaciones más preferidas: Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} es F, los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} es Cl, los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} es F y un segundo grupo R es OH (que no estén enlazados al mismo carbono), los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} es Cl y un segundo grupo R es OH (que no estén enlazados al mismo carbono), los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} es alquilo y los restantes son H; el grupo alquilo debe contener no más de 4 carbonos y tener una longitud lineal de no más de 3 carbonos. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} es alquilo y un segundo grupo R es OH (que no estén enlazados al mismo carbono), los restantes son H; y el grupo alquilo debe contener no más de 4 carbonos y tener una longitud lineal de no más de 3 carbonos.
Otro aspecto de la invención incluye la adición de unidades de partida de la fórmula
7
donde R_{1} y R_{2} pueden ser iguales o diferentes y pueden ser, de modo independiente F, Cl, OH, SH, H, CN, OR_{7}, C(O)R_{7}, o NHR_{7} en los que R_{7} es un alquilo C1-C4, R_{1} y R_{2} pueden encontrarse juntos en forma de una cetona, un grupo spirociclopropilo o con -OCH_{2}-, -CH_{2}O-, -SCH_{2}- o -CH_{2}S-; más aún, R_{3}, y R_{4} pueden ser iguales o diferentes y pueden ser, de modo independiente, F, Cl, Br, OR_{7}, H o CN; siempre que ambos grupos R enlazados al mismo carbono del anillo no sean OH.
En realizaciones preferidas: Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} es F, los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} es Cl, los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} es F y un segundo grupo R es OH (que no estén enlazados al mismo carbono), los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} es Cl y un segundo grupo R es OH (que no estén enlazados al mismo carbono), los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} es SH, los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} es alquil, los restantes son H; y el grupo alquilo debe contener no más de 4 carbonos y tener una longitud lineal de no más de 3 carbonos. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} es alquilo y un segundo grupo R es OH (que no estén enlazados al mismo carbono), los restantes son H; y el grupo alquilo debe contener no más de 4 carbonos y tener una longitud lineal de no más de 3 carbonos. Donde dos de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} son F, los restantes son H.
Otro aspecto de la invención incluye la adición de unidades de partida de la fórmula
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donde X = enlace o CH_{2}; y R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} o R_{5} pueden ser iguales o diferentes y pueden ser, de modo independiente, Cl, F, OH, SH, H, alquil, CN, Br, R_{7}, OR_{7}, C(O)R_{7} o HNR_{7} donde R_{7} es un alquilo C1-C4, R_{1} y R_{3}, R_{2} y R_{4}, pueden encontrarse juntos formando una cetona o enlazados, ya sea de modo sustituido o no sustituido, como enlace metileno, enlace éter, enlace tio o enlace amino donde R_{1} y R_{2} o R_{3} y R_{4} se encuentran enlazados como grupo spiro-ciclopropilo o con -OCH_{2}- o -CH_{2}O- o -SCH_{2}- o -CH_{2}S-, R_{5} puede ser F, CL, OR_{7}, H o CN; siempre que no más de dos de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} o R_{5} sean SH y que ambos grupos R enlazados al mismo carbono del anillo no sean OH.
En realizaciones preferidas: donde R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} o R_{5} son una combinación de F y OH no más de 3 de R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} o R_{5} se encuentran sustituidos y los restantes son H. Donde R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} o R_{5} son una combinación de Cl y OH, no más de 3 de R_{1}-_{5} se encuentran sustituidos y los restantes son H. Donde R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} o R_{5} son una combinación de dos OH (que no se encuentren enlazados al mismo carbono) y dos F enlazados al mismo carbono, los restantes son H. Donde dos de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} o R_{5} son Cl, los restantes son H. Donde dos de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} o R_{5} son Cl (que no estén enlazados al mismo carbono) y un tercer grupo R es OH, los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} o R_{5} es alquil, los restantes son H; y el grupo alquilo debe tener una longitud lineal de no más de 3 carbonos. Donde dos de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} o R_{5} son SH, los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} o R_{5} es NHR_{7}, los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} o R_{5} es SH, los restantes son H.
En realizaciones mucho más preferidas: donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} o R_{5} es OH, los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} o R_{5} es F, los restantes son H. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} o R_{5} es Cl, los restantes son H. Donde uno de R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} o R_{5} es F y un segundo grupo R es OH (que no estén enlazados al mismo carbono), los restantes son H. Donde uno de R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} o R_{5} es Cl y un segundo grupo R es OH (que no estén enlazados al mismo carbono), los restantes son H. Donde uno de R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} o R_{5} es SH y un segundo grupo es OH (que no estén enlazados al mismo carbono), los restantes son H. Donde uno de R_{1}' R_{2}, R_{3}, R_{4} o R_{5} es alquilo, los restantes son H; y el grupo alquilo no debe contener más de 4 carbonos y tener una longitud lineal de no más de 3 carbonos. Donde uno de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} o R_{5} es alquilo y un segundo grupo R es OH (que no estén enlazados al mismo carbono), los restantes son H; y el grupo alquilo debe contener no más de 4 carbonos y tener una longitud lineal de no más de 3 carbonos. Donde dos de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} o R_{5} son F, los restantes son H. Donde dos de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} o R_{5} son OH, los restantes son H. Donde dos de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} o R_{5} son OH y un tercer grupo R es F, los restantes son H. Donde dos de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} o R_{5} son OH y un tercer grupo R es Cl, los restantes son H. Donde dos de los siguientes R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} o R_{5} son F y un tercer grupo R es OH, los restantes son H.
Otro aspecto de la invención incluye el suministro de unidades de partida de la fórmula
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donde R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} pueden ser iguales o diferentes y pueden ser, de modo independiente, Cl, F, OH, SH, H, alquilo, CN, Br, R_{7}, OR7, C(O)R_{7} o HNR_{7}, donde R_{7} es un alquilo C1-C4, R_{1} y R_{2} o R_{3} y R_{4} pueden encontrarse juntos en forma de una cetona, siempre que dos grupos R enlazados al mismo carbono no sean ambos OH.
En realizaciones preferidas: donde uno de R_{1}, R_{2}, R_{3} o R_{4} es F, los restantes son H. Donde uno de R_{1}, R_{2}, R_{3} o R_{4} es Cl, los restantes son H. Donde uno de R_{1}, R_{2}, R_{3} o R_{4} es Br, los restantes son H. Donde uno de R_{1}, R_{2}, R_{3} o R_{4} es OH, los restantes son H. Donde uno de R_{1}, R_{2}, R_{3} o R_{4} es F y un segundo grupo R es OH (que no estén enlazados al mismo carbono), los restantes son H. Donde uno de R_{1}, R_{2}, R_{3} o R_{4} es Cl y un segundo grupo R es OH (que no estén enlazados al mismo carbono), los restantes son H. Donde uno de R_{1}, R_{2}, R_{3} o R_{4} es SH, los restantes son H. Donde uno de R_{1}, R_{2}, R_{3} o R_{4} es SH y un segundo grupo R es OH (que no estén enlazados al mismo carbono), los restantes son H. Donde uno de R_{1}, R_{2}, R_{3} o R_{4} es alquilo, los restantes son H; y el grupo alquilo no debe contener más de 4 carbonos y tener una longitud lineal de no más de 3 carbonos. Donde uno de R_{1}, R_{2}, R_{3} o R_{4} es alquilo y un segundo grupo R OH (que no estén enlazados al mismo carbono), los restantes son H; y el grupo alquilo no debe contener más de 4 carbonos y tener una longitud lineal de no más de 3 carbonos. Donde dos de R_{1}, R_{2}, R_{3} o R_{4} son F, los restantes son H. Donde dos R_{1}, R_{2}, R_{3} o R_{4} son OH, los restantes son H. Donde dos de R_{1}, R_{2}, R_{3} o R_{4} son OH y un tercer grupo R es F, los restantes son H. Donde dos de R_{1}, R_{2}, R_{3} o R_{4} son OH y un tercer grupo R es R es Cl, los restantes son H. Donde dos de R_{1}, R_{2}, R_{3} o R_{4} son F y un tercer grupo R es OH, los restantes son H.
En una realización preferida, la presente invención proporciona un método para la incorporación eficiente de: ácido 2-norbornano carboxílico; ácido 2-(cis/trans)-hidroxiciclohexano carboxílico; ácido 3-(cis/trans)-hidroxiciclohexano carboxílico; ácido 4-(cis/trans)-hidroxiciclohexano carboxílico; ácido 2-(cis/trans)-metilciclohexano carboxílico; ácido 4-(cis/trans)-metilciclohexano carboxílico; ácido 3-(cis/trans)-metoxiciclohexano carboxílico; ácido 4-(cis/trans)-metoxiciclohexano carboxílico; ácido 4-oxociclohexano carboxílico; ácido etilo 2-oxociclohexano carboxílico; ácido 4-trans-n-pentylciclohexano carboxílico; ácido 2-trans-aminociclohexano carboxílico; ácido 4-cis-aminociclohexano carboxílico; ácido 4-(cis/trans)-aminometilciclohexano carboxílico; ácido ciclopentano carboxílico; ácido ciclobutano carboxílico; ácido 1-metilciclohexano carboxílico; ácido 3-trans-hidroxi-4-cis-fluorociclohexano carboxílico y ácido 4-trans-hidroxi-3-cis-fluorociclohexano carboxílico; ácido 3-cis-hidroxi-4-trans-fluorociclohexano carboxílico y ácido 4-cis-hidroxi-3-trans-fluorociclohexano carboxílico; ácido 3-cis-hidroxi-4-trans-clorociclohexano carboxílico y ácido 4-cis-hidroxi-3-trans-clorociclohexano carboxílico; ácido 3-trans-hidroxi-4-cis-clorociclohexano carboxílico y ácido 4-trans-hidroxi-3-cis-clorociclohexano carboxílico; ácido 3-trans-ciclohexeneoxide carboxílico; ácido 3-cis-ciclohexeneoxide carboxílico; ácido 3,4-cis-dihidroxiciclohexano carboxílico y ácido 3,4-trans-dihidroxiciclohexano carboxílico; ácido ciclohexanoacético; ácido ciclohexanopropiónico o ácido 4-cis/trans-terc-butilciclohexano carboxílico o ésteres simples o sales de los mismos en análogos de ligandos de FKBP por una cepa en la que se ha eliminado o inactivado rapK o un homólogo de rapK. En una realización más preferida, la presente invención proporciona un método para la incorporación eficiente de: ácido 3-(cis/trans)-hidroxiciclohexano carboxílico; ácido 4-(cis/trans)-hidroxiciclohexano carboxílico; ácido 3-(cis/trans)-metoxiciclohexano carboxílico; ácido 4-(cis/trans)-metoxicicohexano carboxílico; ácido 4-oxo ciclohexano carboxílico; ácido ciclobutano carboxílico; ácido 3-trans-hidroxi-4-cis-fluorociclohexano carboxílico y ácido 4-trans-hidroxi-3-cis-fluorociclohexano carboxílico; ácido 3-cis-hidroxi-4-trans-fluorociclohexano carboxílico y ácido 4-cis-hidroxi-3-trans-fluorociclohexano carboxílico; ácido 3-cis-hidroxi-4-trans-clorociclohexano carboxílico y ácido 4-cis-hidroxi-3-trans-clorociclohexano carboxílico; ácido 3-trans-hidroxi-4-cis-clorociclohexano carboxílico y ácido 4-trans-hidroxi-3-cis-clorociclohexano carboxílico; ácido 3-trans-ciclohexeneoxide carboxílico; ácido 3-cis-ciclohexeneoxide carboxílico; ácido 3,4-cis-dihidroxiciclohexano carboxílico y ácido 3,4-trans-dihidroxiciclohexano carboxílico; ácido ciclohexanopropiónico; ácido 4-cis/trans-ter-butilciclohexano carboxílico o ésteres simples o sales de los mismos en análogos de ligandos de FKBP por cepas en las que se ha eliminado o inactivado rapK o un homólogo de rapK.
En una realización específica de la presente invención las unidades de partidas suministradas no son ácido ciclohexano carboxílico, ácido 3-cis,4-trans-dihidroxiciclohexano carboxílico, ácido 1-ciclohexeno carboxílico, ácido 3-ciclohexeno carboxílico, ácido cicloheptano carboxílico, ácido 3-(cis/trans)-metilciclohexano carboxílico, ácido 4-(cis/trans)-metilciclohexano carboxílico, ácido 1-ciclohepteno carboxílico ni ácido 5-cis-hidroxil-3-ciclohexeno carboxílico.
Las cepas que se utilizan en las realizaciones descritas anteriormente se seleccionan entre el grupo que comprende: Streptomyces hygroscopicus subsp. hygroscopicus NRRL 5491, Actinoplanes sp. N902-109 FERM BP-3832, Streptomyces sp. AA6554, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6475 ATCC 14891, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6678 ATCC 55087, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6674, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus ATCC55276, Streptomyces hygroscopicus subsp. ascomyceticus ATCC14891, Streptomyces tsukubaensis No.9993 FERM BP-927, Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis, Streptomyces sp. DSM 4137, Streptomyces sp. DSM 7348, Micromonospora n.sp. A92-306401 DSM 8429, Steptomyces sp. MA 6858ATCC55098, Steptomyces sp.MA6848. En una realización preferida dicha cepa se selecciona entre el grupo que consta de: Streptomyces hygroscopicus subsp. hygroscopicus NRRL 5491, Actinoplanes sp. N902-109 FERM BP-3832, Streptomyces sp. AA6554, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6475 ATCC 14891, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6678 ATCC 55087, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6674, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus ATCC 55276, Streptomyces hygroscopicus subsp. ascomyceticus ATCC 14891, Streptomyces tsukubaensis No.9993 FERM BP-927, Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis, Streptomyces sp. DSM 4137, Streptomyces sp. DSM 7348, Micromonospora n.sp. A92-306401 DSM 8429 o Streptomyces sp. MA 6858 ATCC 55098. En una realización mucho más preferida, la cepa es el productor de rapamicina S.hygroscopicus subsp. hygroscopicus.
En los métodos para la incorporación eficiente de los ácidos carboxílicos suministrados descritos anteriormente, los compuestos producidos son análogos de los ligandos de FKBP como se describe en el presente documento, por ejemplo, pero sin limitarse a: rapamicina, FK506, FK520, FK523, FK525, antascomicina, meridamicina y tsukubamicina. En una realización preferida, los compuestos producidos son los análogos de la rapamicina, FK506 o FK520. En una realización mucho más preferida, los compuestos producidos son análogos de la rapamicina; estos compuestos corresponden a la Fórmula II o Fórmula III como se describen posteriormente.
De modo adicional, los métodos antes descritos pueden ser utilizados para generar análogos de novedosos FK506 y FK520 que corresponden a la Fórmula I siguiente:
Fórmula I
10
R_{2} = H, alquilo, halo, hidroxil, tiol
R_{3} = H, alquilo, halo, hidroxil, tiol
R_{4} = H, alquiol, halo, hidroxil, tiol
R_{5} = OMe, Me o H
R_{6} = OMe, Me o H
R_{7} = CH_{2}CH_{3} o CH_{2}CH = CH_{2}
Z = ceto o CH_{2}
X=X' = enlace; X = enlace y X' = CH_{2}, S, O o X = CH_{2}, S, O, unidad ciclopropil fusionada y X' = enlace
En una realización preferida,
11
donde R_{8} = OH y R_{9} = H, OH, halo, alquilo o tiol.
En una realización aún más preferida
12
200 donde R_{8} = OH y R_{9} = halo.
201 donde R_{8} = 4-trans-OH, R_{9} = 3-cis-OCH_{3}, y R_{2} = R_{3} = R_{4} = H, X = CH_{2}, X' = enlace, Z = ceto, R_{5} = R_{6} = OCH_{3} y R_{7} = CH_{2}CH_{3}
202 donde R_{8} = 4-trans-OH, R_{9} = 3-cis-OCH_{3}, y R_{2} = R_{3} = R_{4} = H, X = CH_{2}, X' = enlace, Z = ceto, R_{5} = R_{6} = OCH_{3} y R_{7} = CH_{2}CH = CH_{2}
Así, por ejemplo, la cepa recombinante S. hygroscopicus MG2-10 puede cultivarse en presencia de ácido ciclohexano carboxílico para producir 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-desmetoxi-rapamicina (Ejemplo 12). Puede observarse por los expertos en la técnica que los homólogos de rapK en otros grupos de biosíntesis que codifican para ligandos FKBP, que incluyen, pero no se limitan a, FK506, FK520, FK523, FK525, meridamicina, tsukubamicina, antascomicina y "hyg" pueden eliminarse o inactivados para permitir un suministro eficiente de los ácidos carboxílicos que constituyen la unidad de partida, que conduce a la producción de análogos novedosos.
En otro aspecto, las cepas de S. hygroscopicus de la invención (incluyendo rapL o los homólogos de rapL o sin incluir rapL o los homólogos de rapL y/o incluyendo rapK o los homólogos de rapK o sin incluir rapK o los homólogos de rapK) pueden alimentarse con análogos del ácido L-pipecólico, como se describe anteriormente, en combinación con análogos de la unidad de partida natural, ácido 4,5-dihidroxiciclohex-1-enecarboxílico, como se describe anteriormente, para producir análogos de la rapamicina en los que ambos, la unidad de partida y el residuo pipecolil han sido remplazados. Esta estrategia se ejemplifica en los Ejemplos 10, 11 y 12.
La presente invención proporciona un proceso para la producción de análogos de ligandos de FKBP con variación en el grado de modificación post-PKS y/o en el que el residuo de ácido pipecólico ha sido reemplazado, y opcionalmente el residuo de ácido 4,5-dihidroxiciclohex-1-eno carboxílico ha sido reemplazado. Este proceso comprendel paso de eliminar o inactivar uno o más genes en la célula hospedera del microorganismo involucrada en la producción del compuesto precursor, ácido L-pipecólico y/o ácido 4,5-dihidroxicylohex-1-eno carboxílico, requeridos en la biosíntesis del molde rapamicina poliquétido/NRPS y/o en su subsiguiente modificación post-PKS, de modo de suprimir la producción del producto natural. El proceso comprende además la transformación de las células hospederas del microorganismo con ácidos nucleicos que codifican para los genes modificadores del poliquétido para restablecer la producción de poliquétido, cultivar las células hospederas transformadas bajo condiciones adecuadas para la producción de poliquétido y opcionalmente el aislamiento de los análogos de rapamicina de los poliquétidos producidos.
La presente invención proporciona un proceso para la producción de análogos de ligandos de FKBP que incluyen, pero no se limitan a, FK506, FK520, FK523, FK525, tsukubamicina, antascomicina, meridamicina e "hyg", con variación en el grado de modificación post-PKS y/o en el que el residuo de aminoácido se ha reemplazado, y opcionalmente la unidad de partida se ha reemplazado. Este proceso comprendel paso de eliminar o inactivar uno o más genes en las células hospederas del microorganismo involucradas en la producción del residuo de aminoácido y/o los precursores de la unidad de partida, requeridos en la biosíntesis del molde poliquétido/NRPS y/o en su modificación post-PKS subsiguiente, de modo de suprimir la producción del producto natural. El proceso comprende además la transformación de las células hospederas del microorganismo con los ácidos nucleicos que codifican para los genes modificadores del poliquétido para restablecer la producción de poliquétido, cultivar las células hospederas transformadas bajo condiciones adecuadas para la producción de poliquétido y opcionalmente el aislamiento de los análogos de poliquétido producidos.
También proporcionamos análogos novedosos de los ligandos de FKBP: 31-desmetoxi-FK520, 31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-trans-hidroxi-FK520, 31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-cis-hidroxi-FK520, 31-desmetoxi-31-trans-hidroxi-32-trans-hidroxi-FK52D, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-FK520, 31-O-desmetil-FK520, 31-desmetoxi-31-metil-FK520, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-metil-FK520, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-fluoro-FK520, 31-desmetoxi-31-fluoro-FK520, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-cloro-FK520, 31-desmetoxi-31-cloro-FK520, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-terc-butil-FK520, 29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-cicloheptil)-FK520, 29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-norbornil)-FK520, 9-deoxo-31-desmetoxi-FK520, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-trans-hidroxi-FK520, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-cis-hidroxi-FK520, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-trans-hidroxi-32-trans-hidroxi-FK520, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-FK520, 9-deoxo-31-O-desmetil-FK520, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-metil-FK520, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-metil-FK520, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-fluoro-FK520, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-fluoro-FK520, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-cloro-FK520, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-cloro-FK520, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-terc-butil-FK520, 9-deoxo-29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-cicloheptil)-FK520, 9-deoxo-29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-norbornil)-FK520, 30-desmetoxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-metil-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-metil-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-fluoro-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-fluoro-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-cloro-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cloro-prolil-FK520, 30-desmetil-31-dehidroxi-31-terc-butil-prolil-FK520, 28-de(3-metoxi-4-hidroxiciclohexil)-28-(hidroxi-cicloheptil)-FK520, 28-de(3-metoxi-4-hidroxiciclohexil)-28-(hidroxi-norbornil)-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-31-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-prolil-FK520,-8-deoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-metil-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-metil-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-fluoro-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-fluoroprolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-cloro-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cloro-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-terc-butil-prolil-FK520, 8-deoxo-28-de(3-metoxi-4-hidroxiciclohexil)-28-(hidroxi-cicloheptil)-prolil-FK520, 8-deoxo-28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-norbornil)-prolil-FK520, 30-desmetoxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-metil-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-metil-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-cloro-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cloro-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-terc-butil-3-hidroxi-prolil-FK520, 28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil-28-(hidroxi-cicloheptil)-3-hidroxi-prolil-FK520, 28-de(3-metoxi-4-hidroxiciclohexil)-28-(hidroxi-norbornil)-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-31-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-metil-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-metil-31-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-cloro-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cloro-3-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-terc-butil-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-cicloheptil)-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-28-deE(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-norbornil)-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-metil-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-metil-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-cloro-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cloro-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-terc-butil-4-hidroxi-prolil-FK520, 28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-cicloheptil)-4-hidroxi-prolil-FK520, 28-de(3-metoxi-4-hidroxiciclohexil)-28-(hidroxi-norbornil)-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-31-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-metil-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-metil-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-cloro-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cloro-3-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-terc-butil-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-cicloheptil)-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-norbornil)-4-hidroxi-prolil-FK520, 31-desmetoxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-trans-hidroxitrans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-cis-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-desmetoxi-31-trans-hidroxi-32-trans-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-O-desmetil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-desmetoxi 31-metil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-metil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-desmetoxi-31-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-cloro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-desmetoxi-31-cloro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-terc-butil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-cicloheptil)-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-norbornil)-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-31-desmetoxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-trans-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-cis-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-trans-hidroxi-32-trans-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-31-O-desmetil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-metil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-metiltrans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-cloro-trans-3-bicylo[3.1.0.]FK520. 9-deoxo-31-desmetoxi-31-cloro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-terc-butil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-cicloheptil)-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-norbornil)-trans-3-biciclo[3.1.0.] FK520.
También proporcionamos los siguientes análogos de FK520: 31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-trans-hidroxi-PK520, 31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-cis-hidroxi-FK520, 31-desmetoxi-31-trans-hidroxi-32-trans-hidroxi-FK520, 31-desmetoxi-31-metil-FK520, 31-desmetoxi-31-fluoro-FK520, 31-desmetoxi-31-cloro-FK520, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-terc-butil-FK520, 29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-cicloheptil)-FK520, 29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-norbornil)-FK520, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-trans-hidroxi-FK520, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-cis-hidroxi-FK520, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-trans-hidroxi-32-trans-hidroxi-FK520, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-metil-FK520, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-fluoro-FK520, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-cloro-FK520, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-terc-butil-FK520, 9-deoxo-29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-cicloheptil)-FK520, 9-deoxo-29-de(3-metoxi-4-hidroxiciclohexil)-29-(hidroxi-norbornil)-FK520, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-metil-profil-FK520, 30-desmetoxi-30-fluoro-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cloroprolil-FK520, 30-desmetil-31-dehidroxi-31-terc-butil-prolil-FK520, 28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-cicloheptil)-FK520, 28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-norbornil)-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-31-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-metil-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-metil-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-fluoro-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-fluoro-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-cloro-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cloro-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-terc-butil-prolil-FK520, 8-deoxo-28-de(3-metoxi-4-hidroxiciclohexil)-28-(hidroxi-cicloheptil)-prolil-FK520, 8-deoxo-28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-norbornil)-prolil-FK520, 30-desmetoxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-metil-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-metil-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-cloro-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cloro-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-terc-butil-3-hidroxi-prolil-FK520, 28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-cicloheptil)-3-hidroxi-prolil-FK520, 28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-norbornil)-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-31-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-metil-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-metil-3-hidroxi-prolil-FK520,8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-cloro-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cloro-3-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-terc-butil-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-cicloheptil)-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-norbornil)-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-metil-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-metil-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-cloro-4-hidroxi-profyl-FK520, 30-desmetoxi-30-cloro-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-terc-butil-4-hidroxi-prolil-FK520, 28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-cicloheptil)-4-hidroxi-prolil-FK520, 28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-norbornil)-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-31-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-metil-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-metil-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-cloro-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cloro-3-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-terc-butil-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-cicloheptil)-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-norbornil)-4-hidroxi-prolil-FK520, 31-desmetoxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-trans-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-cis-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-desmetoxi-31-trans-hidroxi-32-trans-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-O-desmetil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-desmetoxi-31-metil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-metil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-fluorotrans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-desmetoxi-31-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-cloro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-desmetoxi-31-cloro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-terc-butil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-cicloheptil)-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-norbornil)-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-31-desmetoxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-trans-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-cis-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-trans-hidroxi-32-trans-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-31-O-desmetil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-metil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-metiltrans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-cloro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-cloro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-31-O-desmetilo 32-dehidroxi-32-terc-butil-trans-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxicicloheptil)-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-norbornil)-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520.
También proporcionamos los siguientes análogos novedosos de FK520: 31-desmetoxi-31-metil-FK520, 31-desmetoxi-31-fluoro-FK520, 31-desmetoxi-31-cloro-FK520, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-terc-butil-FK520, 29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-cicloheptil)-FK520, 29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-norbornil)-FK520, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-metil-FK520, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-fluoro-FK520, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-cloro-FK520, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-terc-butil-FK520, 9-deoxo-29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-cicloheptil)-FK520, 9-deoxo-29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-norbornil)-FK520, 30-desmetoxi-30-metil-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-fluoro-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cloro-prolil-FK520, 30-desmetil-31-dehidroxi-31-ter-butil-prolil-FK520, 28-de(3-metoxi-4-hidroxiciclohexil)-28-(hidroxi-cicloheptil)-FK520, 28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-norbornil)-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-31-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-metil-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-metil-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-fluoro-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-fluoroprolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-cloro-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cloro-prolil-FK520, B-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-terc-butil-prolil-FK520, 8-deoxo-28-de(3-metoxi-4-hidroxiciclohexil)-28-(hidroxi-cicloheptil)-prolil-FK520, 8-deoxo-28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-norbornil) prolil-FK520, 30-desmetoxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-metil-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-metil-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-cloro-3-hidroxi-prolyhFK520, 30-desmetoxi-30-cloro-3-hidroxi-prolil-FK520 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-terc-butil-3-hidroxi-prolil-FK520, 28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-cicloheptil)-3-hidroxi-prolil-FK520, 28-de(3-metoxi-4-hidroxiciclohexil)-28-(hidroxi-norbornil)-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-31-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-metil-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-metil-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-cloro-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cloro-3-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-terc-butil-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-cicloheptil)-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-28-de(3-metoxi-4-hidroxiciclohexil)-28-(hidroxi-norbornil)-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-metil-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-metil-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-cloro-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cloro-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-terc-butil-4-hidroxi-prolil-FK520, 28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-cicloheptil)-4-hidroxi-prolil-FK520, 28-de(3-metoxi-4-hidroxiciclohexil)-28-(hidroxi-norbornil)-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-31-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-4-hidroxi-propyl-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-metil-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-metil-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-cloro-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cloro-3-hidroxi4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-terc-butil-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-cicloheptil)-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-deoxo-28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-norbornil)-4-hidroxi-prolil-FK520, 31-desmetoxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-trans-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-cis-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-desmetoxi-31-trans-hidroxi-32-trans-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-O-desmetil-trans-3-biciclo[3.1.0,]FK520, 31-desmetoxi-31-metil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-metil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-desmetoxi-31-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-cloro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-desmetoxi-31-cloro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-terc-butil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-cicloheptil)-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-norbornil)-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-31-desmetoxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-trans-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-cis-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-trans-hidroxi-32-trans-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-31-O-desmetil-trans-3-biciclo[3.1.0]FK520, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-metil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520,9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-2-metiltrans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-cloro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-cloro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-terc-butil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-cicloheptil)-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-deoxo-29-de(3-metoxi-4-hidroxi-cydohexil)-29-(hidroxi-norbornil)-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520.
También proporcionamos los siguientes análogos de FK506: 31-desmetoxi-FK506, 31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-trans-hidroxi-FK506, 31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-cis-hidroxi-FK506, 31-desmetoxi-31-trans-hidroxi-32-trans-hidroxi-FK506, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-FK506, 31-O-desmetil-FK506, 31-desmetoxi-31-metil-FK506, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-metil-FK506, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-fluoro-FK506, 31-desmetoxi-31-fluoro-FK506, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-cloro-FK506, 31-desmetoxi-31-cloro-FK506, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-terc-butil-FK506, 29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-cicloheptil)-FK506, 29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-norbornil)-FK506, 9-deoxo-31-desmetoxi-FK506, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-trans-hidroxi-FK506, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-cis-hidroxi-FK506, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-trans-hidroxi-32-trans-hidroxi-FK506, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-FK506, 9-deoxo-31-O-desmetil-FK506, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-metil-FK506, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-metil-FK506, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-fluoro-FK506, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-fluoro-FK506, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-cloro-FK506, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-cloro-FK506, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-terc-butil-FK506, 9-deoxo-29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-cicloheptil)-FK506, 9-deoxo-29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-norbornil)-FK506, 30-desmetoxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-metil-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-metil-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-fluoro-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-fluoro-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-cloro-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cloro-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-terc-butil-prolil-FK506, 28-de(3-metoxi-4-hidroxiciclohexil)-28-(hidroxi-cicloheptil)-FK506, 28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)28-(hidroxi-norbornil)-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-31-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-metil-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-metil-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-fluoro-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-fluoroprolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-cloro-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cloro-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-terc-butil-prolil-FK506, 8-deoxo-28-de(3-metoxi-4-hidroxiciclohexil)-28-(hidroxi-cicloheptil)-prolil-FK506, 8-deoxo-28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-norbornil)-prolil-FK506, 30-desmetoxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-metil-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-metil-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-cloro-3 hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cloro-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-terc-butil-3-hidroxi-prolil-FK506, 28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-cicloheptil)-3-hidroxi-prolil-FK506, 28-de(3-metoxi-4-hidroxiciclohexil)-28-(hidroxi-norbornil)-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-31-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-metil-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-metil-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-cloro-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cloro-3-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-terc-butil-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-cicloheptil)-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-28-de(3-metoxi-4-hidroxiciclohexil)-28-(hidroxi-norbornil)-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-metil-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-metil-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-cloro-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cloro-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-terc-butil-4-hidroxi-prolil-FK506, 28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-cyc)oheptil)-4-hidroxi-prolil-FK506, 28-de(3-metoxi-4-hidroxiciclohexil)-28-(hidroxi-norbornil)-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-31-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolyhFK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-metil-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-metil-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-cloro-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cloro-3-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-terc-butil-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-cicloheptil)-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-norbornil)-4-hidroxi-prolil-FK506, 31-desmetoxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-trans-hidroxitrans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-cis-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-desmetoxi-31-trans-hidroxi-32-trans-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-O-desmetil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-desmetoxi-31-metil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-metil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506.31-desmetoxi-31-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-cloro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-desmetoxi-31-cloro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-terc-butil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-cicloheptil)-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-norbornil)-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-desmetoxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-trans-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-cis-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-trans-hidroxi-32-trans-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-O-desmetil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-metil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-metiltrans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-fluoro-trans-3-bicydo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-cloro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-cloro-trans-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-terc-butil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-cicloheptil)-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-norbornil)-trans-3-biciclo[3.9.0.]FK506.
También proporcionamos los siguientes análogos de FK506: 31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-trans-hidroxi-FK506, 31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-cis-hidroxi-FK506, 31-desmetoxi-31-trans-hidroxi-32-trans-hidroxi-FK506, 31-desmetoxi-31-metil-FK506, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-terc-butil-FK506, 29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-cicloheptil)-FK506, 29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-norbornil)-FK506, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-trans-hidroxi-FK506, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-cis-hidroxi-FK506, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-trans-hidroxi-32-trans-hidroxi-FK506, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-metil-FK506, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-terc-butil-FK506, 9-deoxo-29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-cicloheptil)-FK506, 9-deoxo-29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-norbornil)-FK506, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-metil-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-terc-butil-prolil-FK506, 28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-cicloheptil)-FK506, 28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-norbornil)-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-metil-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-terc-butil-prolil-FK506, 8-deoxo-28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-cicloheptil)-prolil-FK506, 8-deoxo-28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-norbornil)-prolil-FK506, 30-desmetoxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-metil-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-metil-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-cloro-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cloro-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-terc-butil-3-hidroxi-prolil-FK506, 28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-cicloheptil)-3-hidroxi-prolil-FK506, 28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-norbornil)-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-31-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-metil-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-metil-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-cloro-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cloro-3-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-terc-butil-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-cicloheptil)-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-28-de(3-metoxi-4-hidroxiciclohexil)-28-(hidroxi-norbornil)-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-4-hidroxiprolil-FK506, 30-O-desmetil-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-metil-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-metil-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetit-31-dehidroxi-31-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK506, 3DO-desmetil-31-dehidroxi-31-cloro-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cloro-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-terc-butil-4-hidroxi-prolil-FK506, 28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-cicloheptil)-4-hidroxi-prolil-FK506, 28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-norbornil)-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-31-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-metil-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-metil-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-cloro-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cloro-3-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-terc-butil-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-cicloheptil)-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-norbornil)-4-hidroxi-prolil-FK506, 31-desmetoxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-trans-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-cis-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-desmetoxi-31-trans-hidroxi-32-trans-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-O-desmetil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-desmetoxi-31-metiltrans-3-bicylo[3.1.0.]FK506, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-metil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-desmetoxi-31-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-Odesmetil-32-dehidroxi-32-cloro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-desmetoxi-31-cloro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-terc-butil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506. 29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-cicloheptil)-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 29-de(3-metoxi-4-hidroxi-cydohexil)-29-(hidroxinorbornil)-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-desmetoxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-trans-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-cis-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-trans-hidroxi-32-trans-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-trans-3-bicydo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-O-desmetil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-metil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-metil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-cloro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-cloro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-terc-butil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-29-de(3-metoxi-4-hidroxiciclohexil)-29-(hidroxi-cicloheptil)-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506. 9-deoxo-29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-norbornil)-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506.
También proporcionamos los siguientes análogos de FK506: 31-desmetoxi-31-metil-FK506, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-terc-butil-FK506, 29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-cicloheptil)-FK506, 29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-norbornil)-FK506, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-metil-FK506, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-terc-butil-FK506. 9-deoxo-29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-cicloheptil)-FK506, 9-deoxo-29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-norbornil)-FK506, 30-desmetoxi-30-metil-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-terc-butil-prolil-FK506, 28-de(3-metoxi-4-hidroxiciclohexil)-28-(hidroxi-cicloheptil)-FK506, 28-de(3-metoxi-4-hidroxiciclohexil)-28-(hidroxi-norbornil)-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-metil-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-tert butil-prolil-FK506, 8-deoxo-28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-cicloheptil)-prolil-FK506, 8-deoxo-28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-norbornil)-prolil-FK506, 30-desmetoxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-3-hidroxiprolil-FK506, 30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-metil-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-metil-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-cloro-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cloro-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-terc-butil-3-hidroxi-prolil-FK506, 28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-cicloheptil)-3-hidroxi-prolil-FK506, 28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-norbornil)-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-31-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506,8-deoxo-30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-metil-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-metil-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-cloro-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cloro-3-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-terc-butil-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-cicloheptil)-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-28-de(3-metoxi-4-hidroxiciclohexil)-28-(hidroxi-norbornil)-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-4-hidroxiprolil-FK506, 30-O-desmetil-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-metil-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-metil-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-cloro-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cloro-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-terc-butil-4-hidroxi-prolil-FK506, 28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-cicloheptil)-4-hidroxi-prolil-FK506, 28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-norbornil)-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-31-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-metil-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-metil-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-cloro-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-desmetoxi-30-cloro-3-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-30-O-desmetil-31-dehidroxi-31-tert butil-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-cicloheptil)-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-deoxo-28-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-28-(hidroxi-norbornil)-4-hidroxi-prolil-FK506, 31-desmetoxi-trans-3-biciclo[3.1.0]FK506, 31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-trans-hidroxi-trans-3-biciclo[3.10]FK506, 31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-cis-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-desmetoxi-31-trans-hidroxi-32-trans-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-O-desmetil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-desmetoxi-31-metiltrans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-metil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-desmetoxi-31-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-Odesmetil-32-dehidroxi-32-cloro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-desmetoxi-31-cloro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-terc-butil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-cicloheptil)-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-norbornil)-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-desmetoxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-trans-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-cis-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]PK506, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-trans-hidroxi-32-trans-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-O-desmetiltrans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-metil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-metil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-cloro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-desmetoxi-31-chloro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-31-O-desmetil-32-dehidroxi-32-terc-butyl-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-deoxo-29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-cicloheptil)-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506. 9-deoxo-29-de(3-metoxi-4-hidroxi-ciclohexil)-29-(hidroxi-norbornil)-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506.
También proporcionamos:
A: Compuestos de la fórmula:
13
donde:
x = enlace o CHR_{11}, o -CHR_{6}-x-CHR_{5}- es 14
R15 = 203 
\hskip1cm
2003
R1 = OH, OCH_{3}
R2 = H, OH, OCH_{3}
R3 = H, OH, CH_{3}, F, Cl, OCH_{3}
R4 = H, OH, CH_{3}, F, Cl
R5 = H, OH
R6 = H, OH
R7 = H
R8 = H, ceto
R9 = H, ceto
R10 = H
R11 = H
R13 = H
R14 = H
R16 = OH, OCH_{3}
R17 = H, OH, Cl, F y
y = enlace, CH_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
con la salvedad de que los compuestos no incluyen lo siguiente:
i) donde R_{1} = OCH_{3} en combinación con R_{2} = H, R_{15} = C, R_{16} = cis-3-OH, R_{17} = trans-4-OH, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, R_{8} = H, R_{9} = H, R_{10} = H, R_{11} = H, x = CHR_{11};
ii) donde R_{1} = OH en combinación con R_{2} = OCH_{3}, R_{15} = C, R_{16} = cis-3-OH, R_{17} = trans-4-OH, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, R_{8}, R_{9} = ceto, R_{10} = H, R_{11} = H, x = CHR_{11};
iii) donde R_{1} = OH en combinación con R_{2} = OH, R_{15} = C, R_{16} = cis-3-OCH_{3}, R_{17} = trans-4-OH, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, R_{8},R_{9} =ceto, R_{10} = H, R_{11} = H, x = CHR_{11};
iv) donde R_{1} = OH en combinación con R_{2} = H, R_{15} = C, R_{16} = cis-3-OCH_{3}, R_{17} = trans-4-OH, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, R_{8},R_{9} = ceto, R_{10} = H, R_{11} = H, x = CHR_{11};
v) donde R_{1} = OCH_{3} en combinación con R_{2} = H, R_{15} = C, R_{16} = cis-3-OH, R_{17} = trans-4-OH, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, R_{8},R_{9} = ceto, R_{10} = H, R_{11} = H, x = CHR_{11};
vi) donde R_{1} = OCH_{3} en combinación con R_{2} = H, R_{15} = C, R_{16} = cis-3-OCH_{3}, R_{17} = trans-4-OH, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, R_{8} = H, R_{9} = H, R_{10} = H, R_{11} = H, x = CHR_{11};
vii) excepto donde R_{1} = OCH_{3} en combinación con R_{2} = OH, R_{15} = C, R_{16} = cis-3-OCH_{3}, R_{17} = trans-4-OH, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, R_{8} = H, R_{9} = H, R_{10} = H, R_{11} = H, x = CHR_{11};
viii) donde R_{1} = OCH_{3} en combinación con R_{2} = OCH_{3}, R_{15} = C, R_{16} = cis-3-OCH_{3}, R_{17} = trans-4-OH, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, R_{8} = H, R_{9} = H, R_{10} = H, R_{11} = H, x = CHR_{11};
ix) donde R_{1} = OH en combinación con R_{2} = OCH_{3}, R_{15} = C, R_{16} = cis-3-OCH_{3}, R_{17} = trans-4-OH, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, R_{8}, R_{9} = ceto, R_{10} = H, R_{11} = H, x = CHR_{11};
x) donde R_{1} = OCH_{3} en combinación con R_{2} = OH, R_{15} = C; R_{16} = cis-3-OCH_{3}, R_{17} = trans-4-OH, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, R_{8}, R_{9} = ceto, R_{10} = H, R_{11} = H, x = CHR_{11};
xi) donde R_{1} = OCH_{3} en combinación con R_{2} = H, R_{15} = C, R_{16} = cis-3-OCH_{3}, R_{17} = trans-4-OH, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, R_{8}, R_{9} = ceto, R_{10} = H, R_{11} = H, x = CHR_{11};
xii) donde R_{1} = OCH_{3} en combinación con R_{2} = OCH_{3}, R_{15} = C, R_{16} = cis-3-OH, R_{17} = trans-4-OH, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} H, R_{8}, R_{9} = ceto, R_{10} = H, R_{11} = H, x = CHR_{11};
xiii) donde R_{1} = OCH_{3} en combinación con R_{2} = H, R_{15} = C, R_{16} = cis-3-OCH_{3}, R_{17} = trans-4-OH, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, R_{8} = H, R_{9} = H, R_{10} = H, x = enlace;
\global\parskip0.900000\baselineskip
xiv) donde R_{1} = OCH_{3} en combinación con R_{2} = OCH_{3}, R_{15} = C, R_{16} = cis-3-OCH_{3}, R_{17} = trans-4-OH, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, R_{8} = H, R_{9} = H, R_{10} = H, x = enlace;
xv) donde R_{1} = OCH_{3} en combinación con R_{2} = OH, R_{15} = C, R_{16} = cis-3-OCH_{3}, R_{17} = trans-4-OH, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, R_{8}, R_{9} = ceto, R_{10} = H, x = enlace;
xvi) donde R_{1} = OCH_{3} en combinación con R_{2} = H, R_{15} = C, R_{16} = cis-3-OCH_{3}, R_{17} = trans-4-OH, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, R_{8}, R_{9} = ceto, R_{10} = H, x = enlace;
xvii) donde R_{1} = OCH_{3} en combinación con R_{2} = OCH_{3}, R_{15} = C, R_{16} = H, R_{17} = OH, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, R_{8}, R_{9} = ceto, R_{10} = H, R_{11} = H, x = CHR_{11};
xviii) donde -CHR_{6}-x-CHR_{5} es 15 y R_{11} = H, R_{13} = H, R_{14} = H, en combinación con R_{1} = OCH_{3}, R_{2} = OCH_{3}, R_{15} = C, R_{16} = cis-3-OCH3, R_{17} = trans-4-OH, R_{7} = H, R_{8}, R_{9} = ceto, R_{10} = H;
xix) donde R_{15} = G, R_{16} = cis-3-OCH_{3}, R_{17} = trans-4-OH, y = enlace, en combinación con R_{1} = OCH_{3}, R_{2} = H, R_{5} = H, R_{6} = OH, R_{7} = H, R_{11} = H, x = enlace, R_{8}, R_{9} = ceto, R_{10} = H;
xx) donde R_{15} = G, R_{3} = H, R_{4} = trans-OH, y = enlace, en combinación con R_{1} = OCH_{3}, R_{2} = OCH_{3}, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, R_{11} = H, x = CHR_{11}, R_{8}, R_{9} = ceto, R_{10} = H
xxi) donde R_{15} = G, R_{3} = H, R_{4} = OH, y = CH_{2} en combinación con R_{1} = OCH_{3}, R_{2} = OCH_{3}; R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, R_{11} = H, x = CHR_{11}, R_{8}, R_{9} = ceto, R_{10} =H
xxii) donde R_{15} = G, R_{3} = cis-OH, R_{4} = H, y = enlace, en combinación con R_{1} = OCH_{3}, R_{2} = OCH_{3}, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, R_{11} = H, x = CHR_{11}, R_{8}, R_{9} = ceto, R_{10} = H
xxiii) donde R_{15} = G, R_{3} = CH_{3}, R_{4} = OH, y = enlace, en combinación con R_{1} = OCH_{3}, R_{2} = OCH_{3}, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, R_{11} = H, x = CHR_{11}, R_{8}, R_{9} = ceto, R_{10} = H
xxiv) donde R_{15} = G, R_{3} = H, R_{4} = OH, y = CH_{2}, en combinación con R_{1} = OH, R_{2} = OH, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, R_{11} = H, x = CHR_{11}, R_{8} = R_{9} = H, R_{10} = H
xxv) donde R_{15} = G, R_{3} = H, R_{4} = OH, y = CH_{2}, en combinación con R_{1} = OCH_{3}, R_{2} = OCH_{3}, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, R_{11} = H, x = CHR_{11}, R_{8} = R_{9} = H, R_{10} = H
xxvi) donde R_{15} = G, R_{3} = H, R_{4} = OH, y = CH_{2}, en combinación con R_{1} = OH, R_{2} = OCH_{3}, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, R_{11} = H, x = CHR_{11}, R_{8} = R_{9} = H, R_{10} = H
xxvii) donde R_{15} = G, R_{3} = H, R_{4} = OH, y = CH_{2}, en combinación con R_{1} = OH, R_{2} = H, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, R_{11} = H, x = CHR_{11}, R_{8} = R_{9} = H, R_{10} = H;
xxviii) donde R_{15} = G, R_{3} = H, R_{4} = OH, y = CH_{2}, en combinación con R_{1} = OH, R_{2} = OCH_{3}, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, R_{11} = H, x = CHR_{11}, R_{8}, R_{9} = ceto, R_{10} = H
xxix) donde R_{15} = G, R_{3} = H, R_{4} = OH, y = CH_{2}, en combinación con R_{1} = OCH_{3}, R_{2} = H, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, R_{11} = H, x = CHR_{11}, R_{8},R_{9} = ceto, R_{10} = H
\vskip1.000000\baselineskip
B. Compuestos según la fórmula siguiente
16
R_{1} = OH, OCH_{3}
\global\parskip1.000000\baselineskip
R_{2} = H, OH, OCH_{3}
R_{3} = H, OH, CH_{3}, OCH_{3}
R_{4} = H, OH
R_{5} = H
R_{6} = H, OH
R_{7} = H
R_{8} = H, ceto
R_{9} = H, ceto
R_{10} = H
x = enlace, CH_{2} o-CHR_{6}-x-CHR_{5}- es 17
R_{11} = H
R_{13} = H
R_{14} = H
y = enlace, CH_{2}
con la salvedad de que los compuestos no incluyan lo siguiente:
i) donde R_{3} = H, R_{4} = trans-OH, y = enlace, en combinación con R_{1} = OCH_{3}, R_{2} = OCH_{3}, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, x = CH_{2}, R_{8},R_{9} = ceto, R_{10} =H
ii) donde R_{3} = H, R_{4} = OH, y = CH_{2} en combinación con R_{1} = OCH_{3}, R_{2} = OCH_{3}, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, x = CH_{2}, R_{8},R_{9} = ceto, R_{10} = H
iii) donde R_{3} = cis-OH, R_{4} = H, y = enlace, en combinación con R_{1} = OCH_{3}, R_{2} = OCH_{3}, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, x = CH_{2}, R_{8},R_{9} = ceto, R_{10} = H
iv) donde R_{3} = CH_{3}, R_{4} = OH, y = enlace, en combinación con R_{1} = OCH_{3}, R_{2} = OCH_{3}, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, x = CH_{2}, R_{8},R_{9} = ceto, R_{10} = H
v) donde R_{3} = H, R_{4} = OH, y = CH_{2}, en combinación con R_{1} = OH, R_{2} = OH, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, x = CH_{2}, R_{8} = R_{9} = H, R_{10} = H
vi) donde R_{3} = H, R_{4} = OH, y = CH_{2}, en combinación con R_{1} = OCH_{3}, R_{2} = OCH_{3}, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, x = CH_{2}, R_{8} = R_{9} = H, R_{10} = H
vii) donde R_{3} = H, R_{4} = OH, y = CH_{2}, en combinación con R_{1} = OH, R_{2} = OCH_{3}, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, x = CH_{2}, R_{8} = R_{9} = H, R_{10} = H
viii) donde R_{3} = H, R_{4} = OH, y = CH_{2}, en combinación con R_{1} = OH, R_{2} = H, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, x = CH_{2}, R_{8} = R_{9} = H, R_{10} = H;
ix) donde R_{3} = H, R_{4} = OH, y = CH_{2}, en combinación con R_{1} = OH, R_{2} = OCH_{3}, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, x = CH_{2}, R_{8},R_{9} = ceto, R_{10} = H
x) donde R_{3} = H, R_{4} = OH, y = CH_{2}, en combinación con R_{1} = OCH_{3}, R_{2} = H, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, x = CH_{2}, R_{8},R_{9} = ceto, R_{10} = H
xi) donde R_{3} = OCH_{3}, R_{4} = OH, y = enlace, en combinación con R_{1} = OCH_{3}, R_{2} = H, R_{5} = H, R_{6} = OH, R_{7} = H, x = enlace, R_{8},R_{9} = ceto, R_{10} = H
xii) donde -CHR_{6}-x-CHR_{5}- es 18 y R_{11} = H, R_{13} = H, R_{14} = H, en combinación con R_{1} = OCH_{3}, R_{2} = OCH_{3}, R_{3} = OCH_{3}, R_{4} = OH, R_{7} = H, R_{8}, R_{9} = ceto, R_{10} = H
xiii) donde R_{1} = OCH_{3} en combinación con R_{2} = H, R_{3} = OCH_{3}, R_{4} = OH, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, R_{8} = H, R_{9} = H, R_{10} = H, x = enlace, y = enlace
xiv) donde R_{1} = OCH_{3} en combinación con R_{2} = OCH_{3}, R_{3} = OCH_{3}, R_{4} = OH, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, R_{8} = H, R_{9} = H, R_{10} = H, x = enlace, y = enlace
xv) donde R_{1} = OCH_{3} en combinación con R_{2} = OH, R_{3} = OCH_{3}, R_{4} = OH, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, R_{8},R_{9} = ceto, R_{10} = H, x = enlace, y = enlace
xvi) donde R_{1} = OCH_{3} en combinación con R_{2} = H, R_{3} = OCH_{3}, R_{4} = OH, R_{5} = H, R_{6} = H, R_{7} = H, R_{8},R_{9} = ceto, R_{10} = H, x = enlace, y = enlace
xvii) donde R_{1} = OCH_{3}, R_{2} = H, R_{3} = OH, R_{4} = OH, R_{8} = H, R_{9} = H
xviii) donde R_{1} = OCH_{3}, R_{2} = H, R_{3} = OCH_{3}, R_{4} = OH, R_{8} = H, R_{9} = H
xix) donde R_{1} = OCH_{3}, R_{2} = H, R_{3} = OH, R_{4} = OH, R_{8},R_{9} = ceto
xx) donde R_{1} = OH, R_{2} = OH, R_{3} = OCH_{3}, R_{4} = OH, R_{8},R_{9} = ceto
xxi) donde R_{1} = OCH_{3}, R_{2} = OCH_{3}, R_{3} = OH, R_{4} = OH, R_{8},R_{9} = ceto
xxii) donde R_{1} = OCH_{3}, R_{2} = OH, R_{3} = OCH_{3}, R_{4} = OH, R_{8},R_{9} = ceto
xxiii) donde R_{1} = OCH_{3}, R_{2} = OCH_{3}, R_{3} = OCH_{3}, R_{4} = OH, R_{8} = H, R_{9} = H
\vskip1.000000\baselineskip
C. Un compuesto seleccionado entre el grupo que consta de: 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-O-desmetilo rapamicina (prerapamicina), 9-deoxo-16-O-desmetil-27-O-desmetil-39-O-desmetilo rapamicina, 16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-O-desmetilo rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-39-O-desmetilo rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-rapamicina, 16-O-desmetil-27-O-desmetil-39-O-desmetilo rapamicina, 9-deoxo-27-O-desmetil-39-O-desmetilo rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-27-O-desmetilo rapamicina, 27-O-desmetil-39-O-desmetilo rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetilo rapamicina 9-deoxo-39-O-desmetilo rapamicina, 8-deoxo-15-O-desmetil-26-desmetoxi-38-O-desmetil-prolilrapamicina (preprolilrapamicina), 8-deoxo-15-O-desmetil-26-O-desmetil-38-O-desmetil-prolilrapamicina, 15-O-desmetil-26-desmetoxi-38-O-desmetil-prolilrapamicina, 8-deoxo-26-desmetoxi-38-O-desmetil-prolilrapamicina, 8-deoxo-15-O-desmetil-38-O-desmetil-prolilrapamicina, 8-deoxo-15-O-desmetil-26-desmetoxi-prolil rapamicina, 15-O-desmetil-26-O-desmetil-38-O-desmetil-prolilrapamicina, 8-deoxo-26-O-desmetil-38-O-desmetil-prolil rapamicina, 8-deoxo-15-O-desmetil-26-O-desmetil-prolil rapamicina, 15-O-desmetil-38-O-desmetil-prolil rapamicina, 15-O-desmetil-26-O-desmetil-prolil rapamicina, 15-O-desmetil-26-desmetoxi-prolil rapamicina, 26-desmetoxi-38-O-desmetil-prolil rapamicina, 26-O-desmetil-38-O-desmetil-prolil rapamicina, 8-deoxo-15-O-desmetil-prolil rapamicina, 8-deoxo-26-O-desmetil-prolil rapamicina, 8-deoxo-38-O-desmetil-prolil rapamicina, 15-Odesmetil-prolil rapamicina, 38-O-desmetil-prolil rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-desmetoxi-rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-27-O-desmetil-39-desmetoxi-rapamicina, 16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-desmetoxi-rapamicina, 9-deoxo-27-desmetoxi-39-desmetoxi-rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-39-desmetoxi-rapamicina, 16-O-desmetil-27-O-desmetil-39-desmetoxi-rapamicina, 9-deoxo-27-O-desmetil-39-desmetoxi-rapamicina, 16-O-desmetil-39-desmetoxi-rapamicina, 27-desmetoxi-39-desmetoxi-rapamicina, 27-O-desmetil-39-desmetoxi-rapamicina, 9-deoxo-39-desmetoxi-rapamicina, 8-deoxo-15-O-desmetil-26-desmetoxi-38-desmetoxi-prolil rapamicina, 8-deoxo-15-O-desmetil-26-O-desmetil-38-desmetoxi-prolil rapamicina, 15-O-desmetil-26-desmetoxi-38-desmetoxi-prolil rapamicina, 8-deoxo-26-desmetoxi-38-desmetoxi-prolil rapamicina8-deoxo-15-O-desmetil-38-desmetoxi-prolil rapamicina,15-O-desmetil-26-O-desmetil-38-desmetoxi-prolil rapamicina, 8-deoxo-26-O-desmetil-38-desmetoxi-prolil rapamicina, 15-O-desmetil-38-desmetoxi-prolil rapamicina, 26-desmetoxi-38-desmetoxi-prolil rapamicina, 26-O-desmetil-38-desmetoxi-prolil rapamicina, 8-deoxo-38-desmetoxi-prolil rapamicina, 38-desmetoxi-prolil rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-36-de(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclohexil)-36-(hidroxiciclohexenil) rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-36-de(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclohexil)-36-(dihidroxi ciclohexil) rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-36-de(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclohexil)-36-(hidroxinorbornil) rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-36-de(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclohexil)-36-(3-metil-4-hidroxiciclohexil) rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-36-de(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclohexil)-36-(4-metilo hidroxiciclohexil) rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-36-de(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclohexil)-36-(3-fluoro-4-hidroxiciclohexil) rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-36-de(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclohexil)-36-(3-hidroxi-4-fluorociclohexil) rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-36-de(3-cis-Metoxi-4-transhidroxiciclohexil)-36-(3-chloro-4-hidroxiciclohexil) rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-36-de(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclohexil)-36-(3-hidroxi-4-chlorociclohexil) rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-36-de(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclohexil)-36-(3-cis-4-cis-dihidroxiciclohexil) rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-36-de(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclohexil)-36-(3-trans-9-trans-dihidroxiciclohexil) rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-27-O-desmetil-39-O-desmetilo rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-27O-desmetil-36-de(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclohexil)-36-(hidroxiciclohexenil) rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-27-O-desmetil-36-de(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclohexil)-36-(hidroxinorbornil) rapamicina, 9-deoxo-16-O-desmetil-27-O-desmetil-36-de(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclohexil)-36-(4-metil hidroxiciclohexil) rapamicina.
En una realización específica, la presente invención describe métodos para producir y, de manera opcional, aislar los siguientes compuestos (Figura 10, Figura 11, Figura 12, Figura 13, y Figuras 14, 15, 16 y Figura 17):
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA II
19
20
21
También proporcionamos los siguientes análogos novedosos de la rapamicina:
TABLA III
22
23 
\newpage
También proporcionamos análogos novedosos de la rapamicina de
Fórmula II: 
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24 
\vskip1.000000\baselineskip
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donde x = enlace o CHR_{11}, o -CHR_{6}-x-CHR_{5}- es 25
y = enlace o CHR_{12}
R_{1} = OH, OCH_{3}
R_{2} = H, OH, OCH_{3}
R_{3} = H, residuo OH, OCH_{3}, alquil-, halo-, amino-, tiol-
R_{4} = H, residuo OH, OCH_{3}, alquil-, halo-, amino-, tiol-
R_{5} = H, residuo alquil-, halo-, hidroxi-
R_{6} = H, residuo alquil-, halo-, hidroxi-
R_{7} = H, residuo alquil-, halo-, hidroxi-
R_{8} R_{9} = =O o H, H
R_{10} = H, residuo alquil-, halo-, hidroxi-
R_{11} = H, residuo alquil-, halo-, hidroxi-
R_{12} = H, residuo alquil-, halo-, hidroxi-
R_{13} = H, residuo alquil-, halo-, hidroxi-
R_{14} = H, residuo alquil-, halo-, hidroxi-
\newpage
También proporcionamos análogos novedosos de la rapamicina de
Fórmula III:
26
donde:
x = enlace o CHR_{11}, o -CHR_{6}-x-CHR_{5}- es 27
R_{1} = OH, OCH_{3}
R_{2} = H, OH, OCH_{3}
R_{5} = H, residuo alquil-, halo-, hidroxi-
R_{6} = H, residuo alquil-, halo-, hidroxi-
R_{7} = H, residuo alquil-, halo-; hidroxi-
R_{8}, R_{9} = =O o H, H
R_{10} = H, residuo alquil-, halo-, hidroxi-
R_{11} = H, residuo alquil-, halo-, hidroxi-
R_{12} = H, residuo alquil-, halo-, hidroxi-
R_{13} = H, residuo alquil-, halo-, hidroxi-
R_{14} = H, residuo alquil-, halo-, hidroxi-
R_{15} = 28 
\hskip0.8cm
280
R_{16} = OH
R_{17} = H, OH, halo-, tiol-, alquil-
Los análogos novedosos de la rapamicina resultan eficaces de manera directa, y como moldes para la semisíntesis o bioconversión posterior para producir compuestos útiles, como inmunosupresores, agentes antifúngicos, agentes anticancerígenos, agentes neurodegenerativos o agentes para el tratamiento de la soriasis, la artritis reumatoide, la fibrosis y otras enfermedades neuroproliferativas.
Por lo tanto, también revelamos el uso de los análogos de ligandos de FKBP en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer, el tratamiento de infecciones fúngicas, el tratamiento de enfermedades autoinmunes, inflamatorias, proliferativas e hiperproliferativas, o el mantenimiento de la inmunosupresión.
Un experto en la técnica será capaz, mediante experimentación rutinaria, de determinar la capacidad de estos compuestos de inhibir el crecimiento de los hongos (e.g. Baker, H., et al., 1978; NCCLS Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing for yeasts: Approved standard M27-A, 17(9). 1997), y, por ejemplo, pero sin limitación, de emplear los métodos descritos en el Ejemplo 19. Además, un experto en la técnica sería capaz de determinar, mediante experimentación rutinaria, la capacidad de estos compuestos de inhibir el crecimiento de células tumorales, por ejemplo, pero sin limitación, mediante el empleo de los métodos descritos en el Ejemplo 19 (ver también Dudkin, L, et al., 2001; Yu et al. 2001). Los compuestos revelados anteriormente resultan útiles para la inducción de inmunosupresión y, por tanto, se relacionan con métodos de inducción profiláctica o terapéutica de inducción de supresión del sistema inmune de un humano o animal para el tratamiento o prevención del rechazo de órganos o tejidos trasplantados, el tratamiento de enfermedades autoinmunes, inflamatorias, proliferativas e hiperproliferativas (los ejemplos incluyen, pero no se limitan de manera inclusiva a las enfermedades autoinmunes, la diabetes tipo I, el rechazo agudo o crónico de un trasplante de órgano o tejido, el asma, los tumores, o los desórdenes hiperprolíficos, la soriasis, el eczema, la artritis reumatoide, la fibrosis, las alergias, y las alergias relacionadas con los alimentos). Dichos ensayos son bien conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, pero sin limitación: Actividad inmunosupresora - Warner, LM., et al., 1992, Kahan et al. (1991) & Kahan & Camardo, 2001); Alotrasplantes - Fishbein, T.M., et al., 2002, Kirchner et al. 2000; Auntoinmune/Inflamatoria/Asma - Carlson, R.P. et al., 1993, Powell, N. et al., 2001; Diabetes I - Rabinovitch, A. et al., 2002; Soriasis - Reitamo, S. et al., 2001; Artritis reumatoide - Foey, A., et al., 2002; Fibrosis - Zhu, J. et al., 1999, Jain, S., et al., 2001, Gregory et al. 1993.
La capacidad de los compuestos revelados anteriormente de inducir inmunosupresión puede demostrarse en pruebas estándar empleadas con este propósito, por ejemplo, pero sin limitación, empleando los métodos descritos en el ejemplo 19. Los compuestos resultan útiles en relación con los mecanismos antifibróticos, neurorregenerativos y antiangiogénicos, un experto en la técnica sería capaz, mediante experimentación rutinaria, de determinar la capacidad de estos compuestos de prevenir la angiogénesis (p. e. Guba, M., et al., 2002,). Un experto en la técnica podría, mediante experimentación rutinaria, determinar la utilidad de estos compuestos (p. e. Morice, M.C., et al., 2002). Además, un experto en la técnica podría, mediante experimentación rutinaria, determinar la capacidad neurorregenerativa de estos compuestos (e.g. Myckatyn, T.M., et al., 2002, Steiner et al. 1997).
Breve descripción de las figuras
Figura 1 Estructura de la rapamicina, las secciones a la izquierda de la línea representan el dominio de unión y las de la derecha indican el dominio efector.
Figura 2 Estructura de la rapamicina (A), FK-520 (C) y meridamicina (D).
Figura 3 Mapa plasmídico de pMG55, un vector de doble recombinación con selección positiva para RpsL y en T para conjugación.
Figura 4 Un diagrama de flujo mostrando la estrategia de clonaje para el aislamiento de pMAG144-16 para crear MG2-10.
Figura 5 Revisión de los casetes génicos
Figura 6 Estructura de 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-0-desmetilo rapamicina
Figura 7 Estructura de 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-O-desmetil prolilrapamicina
Figura 8 Estructura de 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-desmetoxi rapamicina
Figura 9 Estructura de 16-O-desmetil-27-desmetoxi rapamicina
Figura 10 Estructuras de compuestos 1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, 15, 16, 17, 18 y 19
Figura 11. Estructuras de compuestos 3, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 20, 21, 22 y 23
Figura 12 Estructuras de compuestos 24, 25, 27, 28, 29, 31, 32, 38, 39, 40, 41 y 42
Figura 13 Estructuras de compuestos 26, 30, 33, 34, 35, 36, 37, 43, 44, 45, y 46
Figura 14 Estructuras de compuestos 47, 48, 50, 51, 53 y 57
Figura 15 Estructuras de compuestos 49, 52, 54, 55, 56, y 58
Figura 16 Estructura de compuestos 61, 64, 66, 67, 68, y 70
Figura 17 Estructura de compuestos 59, 60, 62, 63, 65, y 69
Figura 18 Coherencia HMBC de enlaces múltiple heteronuclear de la prerapamicina
Figura 19 Coherencia HMQC cuántica múltiple heteronuclear de la prerapamicina
Figura 20 Espectroscopía de correlación (COSY) de la prerapamicina indicada por medio de las flechas continuas, espectroscopia de correlación total (TOCSY) de la prerapamicina indicada por medio de las flechas de puntos.
Figura 21 Correcciones en la secuencia de ADN de rapN, la secuencia corregida se muestra encima (SEC. ID. NO: 1) y la secuencia publicada (acc no: X86780, nt 91764-92978) se muestra debajo (SEC. ID. NO: 2).
Figura 22 Correcciones en la secuencia aminoacídica de RapN, la secuencia corregida se muestra encima (SEC. ID. NO: 3) y la secuencia publicada (acc no: X86780) se muestra debajo (SEC. ID. NO: 4).
Figura 23 Correcciones en la secuencia de ADN de rapM, la secuencia corregida se muestra encima (SEC. ID. NO: 5) y la secuencia publicada (acc no: X86780, nt 92992-93945 complemento) se muestra debajo (SEC. ID. NO: 6).
Figura 24 Correcciones en la secuencia aminoacídica de RapM, la secuencia corregida se muestra encima (SEC. ID. NO: 7) y la secuencia publicada (acc no: X86780) se muestra debajo (SEC. ID. NO: 8).
Figura 25 Correcciones en la secuencia de ADN de rapL, la secuencia corregida se muestra encima (SEC. ID. NO: 9) y la secuencia publicada (acc no: X86780, nt 94047-95078 complemento) se muestra debajo (SEC. ID. NO: 10).
Figura 26 Correcciones en la secuencia aminoacídica de RapL, la secuencia corregida se muestra encima (SEC. ID. NO: 11) y la secuencia publicada (acc no: X86780) se muestra debajo (SEC. ID. NO: 12).
Figura 27 Correcciones en la secuencia de ADN de rapK, la secuencia corregida se muestra encima (SEC. ID. NO: 13) y la secuencia publicada (acc no: X86780, nt 95430-96434) se muestra debajo (SEC. ID. NO: 14).
Figura 28 Correcciones en la secuencia aminoacídica de RapK, la secuencia corregida se muestra encima (SEC. ID. NO: 15) y la secuencia publicada (acc no: X86780) se muestra debajo (SEC. ID. NO: 16).
Figura 29 Correcciones en la secuencia de ADN de rapJ, la secuencia corregida se muestra encima (SEC. ID. NO: 17) y la secuencia publicada (acc no: X86780, nt 96465-97625) se muestra debajo (SEC. ID. NO: 18).
Figura 30 Correcciones en la secuencia aminoacídica de RapJ, la secuencia corregida se muestra encima (SEC. ID. NO: 19) y la secuencia publicada (acc no: X86780) se muestra debajo (SEC. ID. NO: 20).
Figura 31 Correcciones en la secuencia de ADN de rapI, la secuencia corregida se muestra encima (SEC. ID. NO: 21) y la secuencia publicada (acc no: X86780, nt 97622-98404) se muestra debajo (SEC. ID. NO: 22).
Figura 32 Correcciones en la secuencia aminoacídica de RapI, la secuencia corregida se muestra encima (SEC. ID. NO: 23) y la secuencia publicada (acc no: X86780) se muestra debajo (SEC. ID. NO: 24).
Figura 33 Correcciones en la secuencia de ADN de rapQ, la secuencia corregida se muestra encima (SEC. ID. NO: 25) y la secuencia publicada (acc no: X86780, nt 90798-91433) se muestra debajo (SEC. ID. NO: 26).
Figura 34 Correcciones en la secuencia aminoacídica de RapQ, la secuencia corregida se muestra encima (SEC. ID. NO: 27) y la secuencia publicada (acc no: X86780) se muestra debajo (SEC. ID. NO: 28).
Figura 35 Un diagrama de flujo que muestra la estrategia de clonaje para el aislamiento de pMG278-1, para crear MG3.
Figura 36 Un diagrama de flujo que muestra la estrategia de clonaje para el aislamiento de pMG267-1, para crear MG4.
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Materiales y métodos Materiales
Todas las enzimas y reactivos de biología molecular se obtuvieron a partir de fuentes comerciales. El ácido pipecólico D/L se obtuvo a partir de Sigma.
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Materiales de partida
La tabla IV resume las fuentes de los ácidos empleados para los experimentos de alimentación descritos en la sección de Ejemplos. Para los compuestos que fueron adquiridos se proporcionan los detalles de la fuente. Un método de síntesis breve se proporciona para los ácidos de partida que se sintetizaron en nuestro laboratorio. Un experto en la técnica comprenderá que las variaciones a los métodos descritos son de rutina y se encuentran dentro del alcance de la presente invención.
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TABLA IV
29
30
Síntesis del ácido 3-cis,4-trans-dihidroxiciclohexano carboxílico
31
El ácido 3-cis,4-trans-dihidroxiciclohexano carboxílico racémico fue fácilmente obtenido a partir del ácido 3-ciclohexano carboxílico racémico, disponible comercialmente. El ácido se epoxidizó por medio del tratamiento con ácido meta-clorobenzoico y se convirtió a lactona in situ, por medio de la adición de base (trietilamina), configurando de ese modo las estereoquímicas relativas. Esta lactona se hidrolizó a continuación por medio de la acción de hidróxido de potasio acuoso, y el producto final se purificó por medio de resinas de intercambio iónico (ver PAS Lowden Thesis 1997, Corey, E. J. and Huang, H., 1989).
Método A
32
Los epóxidos A y B se sintetizaron por medio de etapas estándar. Se protegió el ácido ciclohex-3-eno carboxílico con 2-trimetilsililetanol, siguiendo la activación con isoutilcloroformato y trietilamina. El éster resultante se trató con ácido metacloroperbenzoico y la mezcla racémica resultante de diastereoisómeros se separó sobre una fase normal de sílica. Los epóxidos se hicieron reaccionar sobre (ver más adelante) o se desprotegieron directamente por medio del tratamiento de ácido trifluoroacético, para liberar los ácidos respectivos.
Método B
33 
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Un epóxido protegido se trató con HF-piridina ahidro para efectuar la apertura del anillo para producir un par de regiómeros racémico, que contenían F y OH en un arreglo trans (como se describió con anterioridad para el óxido de ciclohexeno). Los ésteres se desprotegieron a continuación con ácido trifluoroacético para liberar los ácidos, (ver Welch, J. T. y Seper, K., W., 1988).
Método C
34 
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Un epóxido protegido se trató con solvente orgánico suspendido en ácido clorhídrico concentrado para efectuar la apertura del anillo para producir un par de regiómeros racémicos, que contenían Cl y OH en una configuración trans (como se demostró previamente para el óxido de ciclohexeno). Los ésteres se desprotegieron a continuación con ácido trifluoroacético para liberar los ácido, (ver Chini, M., Crotti, P., et al., 1992).
Método D
35 
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Se generaron los ácidos cis-dihidroxiciclocarboxílicos mediante el tratamiento de époxidos protegidos con una cantidad catalítica de tetróxido de osmio junto con un cooxidante. Los ésteres se desprotegieron a continuación con ácido trifluoroacético para liberar los ácidos.
Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento
La Escherichia coli DH10B (GibcoBRL) se cultivó en medio 2xTY como describen Sambrook et al. (1989) y la E. coli ET12567 (pUB307) como describen MacNeil et al. (1992) y la E. coli ET12567 (pUZ8002) como se describe en Pager et al. (1999), en medio 2xTY con kanamicina (25 \mug/ml). Los vectores pUC18 y Litmus28 se obtuvieron de New England Biolabs. El vector pSET152 se describe en Bierman et al., (1992a). Los transformantes de E. coli se seleccionaron positivamente con ampicillina 100 \mug/ml o apramcina, 50 \mug/ml.
El productor de rapamicina S. hygroscopicus ATCC29252 y sus derivados se mantuvieron en placas con medio 1 agar (ver más adelante) a 26ºC, y se cultivaron en TSBGM (sobrenadante tríptico de soya con 1,0% de glucosa y 100 mM MES, pH 6,0), como se describe en (Khaw et al., 1998), suplementado con apramicina, 100 \mug/ml cuando se requirió.
Los cultivos líquidos se mantuvieron a 25ºC en frascos Erlenmeyer horizontales con agitación a 300 rpm.
El mutante de S. hygroscopicus MG1C, resistente a estreptomicina se seleccionó empleando procedimientos estándar y se mantuvo en medio 1 con estreptomicina (50 \mug/ml).
Métodos de alimentación
Se prepararon conjuntos de esporas de todas las cepas después de cultivadas en medio 1, se conservaron en glicerol al 20% w/v: lactosa en agua destilada al 10% w/v y se almacenaron a -80ºC. Se prepararon cultivos vegetativos por medio de la inoculación de 100 \mul del conjunto congelado en 50 ml de medio 6 en un frasco de 250 ml. El cultivo se incubó durante 36 a 48 horas a 28ºC, 250 rpm.
Procedimiento de alimentación: Los cultivos vegetativos se inocularon a 0,5 ml en 7 ml de medio 7 en tubos de 50 ml. El cultivo se llevó a cabo durante 7 días, a 26ºC, 250 rpm. La alimentación/adición de los ácidos carboxílicos seleccionados ("iniciadores no naturales" o "iniciadores naturales") se llevó a cabo entre 24 y 48 horas después de la inoculación y se alimentaron a 1 mM ó 3 mM.
Medio 1: Medio A Modificado
36
El medio se esterilizó a continuación mediante autoclave a 121ºC, durante 15 min.
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Medio 2 (Box et al.,1995)
37 
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Medio 3 (Wilkinson et al., 2000)
38 
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Medio 4 (Patente U.S. No. 3.993.749)
39 
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Medio 5 (Box et al., 1995)
40
41 
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Medio 6: Medio de siembra RapV7
42 
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Medio 7: medio MD6 (medio de fermentación)
43
antes de la esterilización se añaden 0,4 ml de \alpha-amilasa Sigma (BAN 250) a 1 L de medio. El medio se esteriliza durante 20 min a 121ºC.
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Medio 8: medio MD3 (medio de fermentación)
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45 
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Descripción de las cepas
Todas las cepas compartían la morfología del tipo salvaje, con micelas vegetativas, hifas aéreas blancas, y desarrollaban esporas grises que se tornaban negras, y se mostraban higroscópicas de modo característico.
Las esporas empleadas de preferencia para la generación de las cepas recombinantes como se describe en el presente documento, eran de color gris oscuro, como se define en Fan 4, 202 C a B, con mayor preferencia, son como se define en Fan 4, 202 B (Royal Horticultural Society Colour Chart 2001, disponible en The Royal Horticultural Society, 80 Vincent Square, London, SW1P 2PE).
Manipulación y secuenciación de ADN
Las manipulaciones de ADN y los procedimientos de electroporación se llevaron a cabo como se describe en Sambrook et al. (1989). Las hibridizaciones de Southern se llevaron a cabo con sondas marcadas con digoxigenina, empleando el paquete de marcaje de ADN DIG, como describe el fabricante (Boehringer Mannheim). La secuenciación de ADN se llevó a cabo como se describió con anterioridad (Gaisser et al., 2000).
Fermentación de cepas de Streptomyces higroscopicus
Las cepas de Streptomyces higroscopicus se cultivaron a partir de un conjunto de esporas congeladas en criopreservación (glicerol al 20%; lactosa al 10% w/v en agua destilada) en medio 1 (ver Materiales y Métodos) y las esporas se cultivaron después de un crecimiento de 10-20 días a 29ºC. De modo alternativo, las esporas de conjuntos de trabajo se inocularon directamente en el medio precultivado. Un precultivo primario se inoculó con las esporas colectadas y se cultivó en frascos Erlenmeyer de 250 ml, que contenían 50 ml de Medio 6 (ver Materiales y Métodos), agitados a 250 rpm llenos con dos pulgadas de contenido, a 30ºC, durante dos días. El precultivo primario se empleó para inocular precultivos secundarios de Medio 6 (ver Materiales y Métodos), a 10% v/v, que se agitó a 300 rpm, con una pulgada de contenido, a 28ºC, durante 24 h. Los precultivos secundarios se emplearon para inocular, a 10% v/v, Medio 8 de producción (ver Materiales y Métodos), que contenía 0,01% v/v de SAG 417, antiespumante y se dejó fermentar en un biorreactor con agitación, durante cinco a siete días a 26ºC. Se ajustó un flujo de aire de 0,75 vvm, bajo presión de 0,5 bar y la velocidad de la punta del impelente se controló entre 0,98 ms^{-1} y 2,67 ms^{-1}. Se añadió SAG 417 adicional a demanda. Se controló el pH entre 6 y 7, con amonio (10% v/v) o ácido sulfúrico (1 M) y se goteó solución de glucosa (40% w/v) al comenzar la demanda de amonio.
Extracción y método de análisis (A) mediante Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC)
Se llevó a cabo la centrifugación en un sobrenadante de fermentación de 50 ml y se extrajeron separadamente el sobrenadante y el mycelium, como sigue. Las células se lavaron con agua y se extrajeron con 50 ml de metanol durante 16 horas a 4ºC. Los restos celulares se eliminaron mediante centrifugación, se evaporó el metanol hasta sequedad y luego se disolvió en 200 \mul de metanol. El sobrenadante del sobrenadante de fermentación se extrajo dos veces con un volumen igual de acetato de etilo. La capa orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4}, se evaporó a sequedad y luego se disolvió en 200 \mul de metanol. El análisis de HPLC se llevó a cabo en un cromatógrafo líquido Hewlett Packard HP1100, con detector de longitud de onda variable, o un instrumento Finnigan MAT LCQ (Finnigan, CA). Los espectros de alta resolución se obtuvieron en un espectrómetro de masas Bruker BioApex II 4.7 T Fourier Transform-Ion Ciclotron Resonance (FT-ICR) (Bruker, Bremen, FRG).
Para el análisis de RMN, se centrifugó el sobrenadante de bacterias, se extrajo el sobrenadante con tres volúmenes iguales de acetato de etilo y se extrajeron las células con metanol como se describió con anterioridad. Los extractos se combinaron, se secaron (Na_{2}SO_{4}) y se evaporaron bajo presión reducida, para rendir un sólido blanco.
Los espectros de RMN de protones detectados (^{1}H, DQF-COSY, TOCSY, HMQC, HMBC, NOESY) se grabaron en un espectrómetro Bruker Advance DRX500, que operaba a 500 MHz a 27ºC, con la excepción del ejemplo 6, en que el espectrómetro Bruker Advance DRX500 se operó a 500 MHz a 10ºC. Los cambios químicos se describen en partes por millón (ppm) en la escala \delta y se refieren a \delta_{H} 7,26 (^{1}H) y CHCl_{3} a \delta_{C} 77,0 (^{13}C). Los valores J se dan en Hertz (Hz).
Protocolos de extracción, aislamiento y análisis (B) Protocolo de extracción y purificación
El sobrenadante de fermentación se clarificó por medio de centrifugación para dar lugar al sobrenadante y las células. El sobrenadante se aplicó a una columna (16 x 15 cm) de resina Diaion HP20 (Supelco), se lavó con agua, seguida por MeOH/H_{2}O al 75%, y luego se eluyó con MeOH. Las células se mezclaron hasta homogeneidad con un volumen igual de acetona. Luego de al menos 30 minutos, la fase de acetona se clarificó por medio de centrifugación, y se decantó el sobrenadante. Las células sedimentadas se extrajeron dos veces más de forma similar con acetona. El extracto de acetona se combinó con el MeOH de la columna HP20 y se eliminó elsolvente al vacío para dar un concentrado acuoso. El acuoso (por lo regular 1-2 L) se extrajo con EtOAc en un volumen mínimo de EtOAc y se secó sobre sílica. La sílica cubierta se aplicó a una columna de sílica (400 g, 36 x 6 cm), que se eluyó de manera secuencial con mezclas de acetona/hexano, en un intervalo desde 25% de acetona hasta 100% de acetona. Las fracciones que contenían los análogos de rapamicina se identificaron mediante HPLC (280 nm), empleando las condiciones que aquí se describen.
Las fracciones que contenían los análogos de rapamicina se combinaron y el solvente se eliminó al vacío. El residuo se cromatografió luego sobre Sephadex LH20, se eluyó con cloroformo/heptano/etanol 10:10:1. Los análogos semipurificados de rapamicina se purificaron por medio de cromatografía líquida de alta resolución de fase reversa (C 18), empleando un HPLC Wilson, eluyendo una columna de Phenomenex 21,2 x 250 mm Luna de 5\mum C18 BDS a 21 ml/min, con una elusión isocrática con mezclas de CH_{3}CN/H_{2}O de 50% a 70%, en dependencia de la polaridad del análogo de rapamicina.
Análisis de los sobrenadantes de cultivo
Se agitó una alícuota de sobrenadante entero (1 ml) con CH_{3}CN durante 30 min. La mezcla se clarificó mediante centrifugación, y el sobrenadante se analizó por HPLC con detección de arreglo de diodo. El sistema de HPLC consistía en un HP1100 Agilent, equipado con una columna BDS HYPERSIL C18 de 3 \mum 4,6 x 150 mm (ThermoHypersil-Keystone), calentada a 40ºC. El gradiente de elusión fue de 55% de la fase móvil B a 95% de la fase móvil B durante 10 minutos, seguido por una fijación isocrática a 95% de la fase móvil B durante 2 minutos, con una velocidad de flujo de 1 mU/min. La fase móvil A era 10% de acetonitrilo: 90% agua, conteniendo 10 mM de acetato de amonio y 0,1% de ácido trifluoroacético, la fase móvil B era 90% de acetonitrilo: 10% de agua, conteniendo 10 mM de acetato de amonio y 0,1% de ácido trifluoroacético. Los análogos de rapamicina se identificaron por la presencia del trieno característico de la rapamicina, centrado en 278 nm. Los análogos FK506 y FK520 se identificaron mediante análisis LC-MS.
Análisis por LCMS
El sistema de HPLC descrito con anterioridad se acopló a un espectrómetro de masas de electrospray Bruker Daltonics Esquire3000. La misma columna y el mismo esquema de elusión por gradiente descritos con anterioridad se emplearon aquí. La fase móvil A era agua, la fase móvil B era acetonitrilo. Se empleo un cambio de positivo a negativo en el intervalo de escaneo de 500 a 1000 Dalton.
Ejemplo 1 Conjugación de S. hygroscopicus
El plásmido a conjugarse en S. hygroscopicus se transformó mediante electroporación en una cepa de E. coli ET12567 dam^{-} dcm^{-}, que contenía ya fuese pUB307, como se describe en MacNeil et al. (1992) o pUZ8002, como se describe en Pager et al (1999). Se empleó un precultivo (cultivo durante toda la noche, 30ºC) para inocular 2xTY (con apramicina a 50 \mug/ml y kanamicina a 25 \mug/ml) a una dilución de 1/25 y se creció con agitación a 37ºC hasta una densidad óptica a 595 nm de 0,25-0,6. Las células de este sobrenadante se lavaron dos veces con 2xTY, luego se resuspendieron en 0,5 ml de 2xTY por 25 ml del cultivo original. La calidad del lote de esporas empleado es crítica para el éxito de este método. En este contexto, la edad de las esporas cuando se cultivan, y el empleo de medio 1 son cruciales para el aislamiento de una suspensión de esporas de alta calidad. Para aislar suspensiones de esporas de alta calidad de S. hygroscopicus, se rociaron placas presecadas de medio 1 agar (ver sección Materiales y Métodos) con esporas o micelas de S. hygroscopicus empleando técnicas microbiológicas estándar, seguidas por incubación a 26º-28ºC durante 14-21 días. Las esporas se cultivaron mediante adición de 1-2 ml de 20% w/v de glicerol o agua mediante técnicas estándar. Una alícuota de 200 \mul de la suspensión de esporas de S. hygroscopicus se lavó en 500 \mul de 2xTY, se resuspendió en 500 \mul de 2xTY, se sometió a choque térmico a 50ºC durante 10 minutos y luego se enfrió en hielo. Una alícuota de 0,5 ml de la suspensión de E. coli se mezcló con las esporas expuestas a choque térmico y esta mezcla se depositó en placas con medio 1 agar. Estas placas se incubaron a 26-28ºC durante 16 horas antes de recubrirlas con 1 mg de ácido nalidíxico y 1 mg de apramicina por placa. Las colonias exconjugantes aparecieron, usualmente, después de 3-7 días.
Uso en S. hygroscopicus MG2-10 de un vector de integración alternativo, pRT801
La conjugación también se llevó a cabo empleando el vector de integración pRT801 basado en \phiBT1 en S. hygroscopicus MG2-10, como se describe con anterioridad. Las colonias exconjugantes se plantaron en medio 1 que contenía apramicina 50 \mug/ml y ácido nalidíxico 50 \mug/ml, y se demostró que eran resistentes a apramicina.
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Ejemplo 2 Aislamiento del mutante MG2-10 de S. hygroscopicus que porta la deleción cromosómica de rapQONMLKJI (Figura 4)
Se construyó un mutante de S. hygroscopicus (MG2-10) en el que los genes de modificación de la rapamicina rap^{Q}, rapO/N, rapM, rapL, rapK, rapJ y rapI se habían eliminado, como se describe a continuación:
Aislamiento del mutante MG1C resistente a estreptomicina
Se esparcieron celúlas de S. hygroscopicus NRRL5491 sobre placas de medio 1 que contenía 50 mg/ml de estreptomicina. Se aislaron tres colonias y se marcaron MG1A, MG1B y MG1C. Estas se conjugaron como en el ejemplo 1 con el plásmido pMG49, un derivado de pSET152 que contenía el gen rpsL proveniente de S. lividans TK24. Los exconjugantes de cada una de estas conjugaciones se colocaron sobre una placa de medio 1 que contenía 50 mg/ml de apramicina y 50 mg/ml de ácido nalidíxico, para confirmar la presencia del plásmido pMG49. Luego se colocaron, junto con las cepas originales MG1A, MG1B y MG1C, tanto sobre una placa de medio 1 que no contenía ningún antibiótico, como sobre una placa de medio 1 que contenía 50 mg/ml de estreptomicina. Se observó crecimiento en todos los casos, excepto las franjas correspondientes a MG1A (pMG49), MG1B (pMG49) y MG1C (pMG49) sobre estreptomicina, lo que indicaba que el tipo salvaje del gen rpsL de S. lividans TK24 confería sensibilidad dominante a estreptomicina en estas cepas. Se midió la producción de prerapamicina en MG1A,MG1B y MG1C y se tomó el mejor productor, MG1C, para el trabajo posterior.
Conjugación de S. hygroscopicus MG1C
Las conjugaciones se llevaron a cabo como se describe en el ejemplo 1, empleando el S. hygroscopicus MG1C resistente a estreptomicina y las construcciones derivadas del vector pMG55.
Construcción del vector conjugativo de doble recombinación pMG55 (Figura 3)
Los cebadores MAG47 5'-GCAAGCTTGGTACCGACACGCTCGCCGAACAGG-3' (SEC ID NO: 29) y MAG48 5'-GCGCATGCCCTAGGGTGTACATTACTTCTCC-3' (SEC ID NO: 30) se emplearon para amplificar el gen rpsL de S. lividans empleando el plásmido pRPSL21 (Shima et al., 1996) como molde. El fragmento de PCR se digirió con SphI y Hindi, se aisló y se ligó con el fragmento de 3,2kb de pSET152 (Bierman et al., 1992b), que había sido digerido con SphI y Hindi. Luego de la transformación en E. coli DH10B, se aisló el plásmido pMG55. Este plásmido se confirmó mediante secuenciación. El plásmido pMG55 contiene al gen rpsL para permitir la selección de los dobles recombinantes (Hosted and Baltz, 1997).
Aislamiento del mutante MG2-10 de S. hygroscopicus, que porta la deleción cromosómica de rapQONMLKJI (Fig.4)
Los cebadores MAG23 5'-TATCTAGACTTCGCACGTGCCTGGGACA-3' (SEC ID NO: 31) y MAG24 5'-AGAAGCTTACCCAATTCCAACATCACCT-3' (SEC ID NO: 32) se emplearon para amplificar la región izquierda de homología (desde nt 89298 hasta nt90798) en el cluster de rapamicina, como se describe en Schwecke et al.(Schwecke et al., 1995) empleando ADN genómico preparado a partir de S. hygroscopicus NRRL5491 como molde. El producto de PCR de 1,5 kb se digirió con XbaI y Hindi y se ligó en pUC18 cortado con XbaI y HindIII. Luego de la transformación en E. coli DH10B, se aisló el plásmido pMAG127-8. Los cebadores MAG25 5'-GGAAGCTTT
GACCACACGCCGCCCGTTC-3' (SEQ ID NO: 33) y MAG26 5'-ATGCATGCCCGCCGCAACCCGCTGGCCT-3' (SEQ ID NO: 34) se emplearon para amplificar la región derecha de homología (desde nt 98404 hasta nt 99904) en el cluster de rapamicina, como se describe en Schwecke et al.(Schwecke et al., 1995) empleando ADN genómico preparado a partir de S. hygroscopicus NRRL5491 como molde. El producto de PCR de 1,5 kb se digirió con HindIII y SphI y se ligó en pUC18 cortado con HindIII y SphI. Luego de la transformación en E. coli DH10B, se aisló el plásmido pMAG128-2 (Figura 4). Ambos plásmidos se comprobaron mediante análisis de secuencia. El plásmido pMAG127-8 se digirió con SphI y HindIII, el plásmido pMAG128-2 se digirió con XbaI y HindIII y se aislaron los fragmentos de 1,5 kb de ambos plásmidos. Dichos fragmentos se ligaron en pUC18 cortado con SphI y XbaI y se emplearon para transformar E. coli DH10B. Se aisló el plásmido pMAG131-1. Este plásmido se digirió con SphI y XbaI, el fragmento de 3 kb se aisló y se ligó en pMG55 cortado con SphI y AvrII y el ADN se empleó para transformar E. coli DH10B. El plásmido pMAG144-16 se aisló y se empleó para conjugar S. hygroscopicus MG1C. Se aisló una colonia de S. hygroscopicus resistente a apramicina, cultivada durante 24 horas en TSBGM con agitación a 26ºC, y se colocó sobre placas de agar con medio 1 que contenían 50 \mug/l de estreptomicina. Las colonias resistentes a estreptomicina se aislaron y se demostró que eran sensibles a apramicina. La deleción cromosómica de 7606 nt de la región rapQONMLKJI, correspondiente al cluster de rapamicina se verificó en el mutante MG2-10 mediante el empleo del producto de PCR de 1,5 kb de MAG23 y MAG24 usado como sonda para elADN cromosómico digerido con EcoRI y BamHI. El análisis del ADN cromosómico de MG2-10 se trató de manera similar, se detectaron bandas de 9,6 kb con EcoRI y 7,6 kb con BamHI, lo que indicaba que rapQONMLKJI había sido eliminado.
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Ejemplo 3 Expresión de rapK en el mutante MG2-10 de S. hygroscopicus que portaba la deleción cromosómica de rapQONMLKJI (Figura 4) Construcción del vector de expresión pSGset1
El vector pCJR336 (gentilmente proporcionado por Christine Martin y Corinne Squire), derivado de pSET152 (Bierman et al., 1992a) se creópor medio del clonaje del dímero cebador de CR347 5'-TAAACTAGTC
CATCTGAGAGTTTCATATGGCCCTATTCTGCCCAGCCGCTCTAGAAAT-3' (SEC ID NO: 35) y CR348 5'-ATTTCTAGAGCGGCTGGGCAGAATAGGGCCATATGAAACTCTCAGATGGACTAGTTTA-3' (SEC ID NO: 36) en pSET152 digerido con PvuII empleando técnicas estándar de biología molecular, de manera que se introdujesen sitios para las enzimas de restricción SpeI, NdeI y XbaI en pSET152. La orientación del inserto se confirmó mediante secuenciación. El plásmido pCJR336 se digirió empleando las enzimas de restricción NdeI/SpeI y el vector pSG142 (Gaisser et al., 2000) se digirió de forma idéntica. Las bandas de ADN resultantes, de alrededor de 5,4 kb para pCJR336 y 1,2 kb para pSG142 se aislaron luego de la ligación que se usó para transformar a E. coli DH10B. La construcción del vector que contenía a región reguladora actII-ORF4 se aisló y se digirió empleando la enzima de restricción XbaI, seguido por un tratamiento con fosfatasa alcalina, de acuerdo con protocolos estándar. El ADN aislado se ligó con un fragmento de alrededor de 200 pb del plásmido pEXoleG2cas (derivado de pSG142 que contenía el fragmento ca. de 1,2 kb NdeI/BgIII) de pSGcasOleG2 (WO01/79520), digerido con las enzimas de restricción XbaI y NheI. El vector pSGset1 se aisló y se verificó la orientación correcta del inserto empleando digestiones de restricción y análisis de secuencia. El plásmido pSGset1 contiene el regulador actII-ORF4, el promotor P_{actl} y la secuencia codificadora de cola 6xHis, así como la región terminadora de la transcripción lambda t_{0} (originaria del plásmido pQE-16) y puede integrarse de modo sitio específico en el sitio de unión \varphiC31.
Clonaje de rapK
El gen rapK se amplificó mediante PCR empleando los cebadores BIOSG8 5'-GGGCATATGAGGCAATTGACTCCGCCGGTCACGGCACCGTACTGCC-3' (SEC ID NO: 37) y BIOSG9 5'-GGGGTCTAGAGGTCACGCCACCACACCCTCGATCTCGACC-3' (SEC ID NO: 38), que introducen un sitio de NdeI en el extremo 5' y un sitio de XbaI en el extremo 3' de rapK. Se empleó el plásmido pR19 (Schwecke et al., 1995) como molde. Luego del tratamiento con T4 polinucleótido quinasa empleando técnicas estándar, el producto del PCR se ligó con pUC18 cortado con SmaI, para transformar a E. coli DH10B. La secuencia de ADN de rapK en el plásmido aislado pUCrapK se verificó mediante análisis de secuencia. Las diferencias en la secuencia de ADN, en comparación con la secuencia publicada (acc. No. X86780) se muestran en la Figura 27. Los cambios resultantes en RapK se muestran en la Figura 28.
Aislamiento de pSGsetrapK
El plásmido pUCrapK se digirió con NdeI y XbaI y los fragmentos de inserto se aislaron y se ligaron en un pSGset1 digerido de forma idéntica. La ligación se empleó para transformar E. coli DH10B empleando procedimientos estándar y se analizaron los transformantes. El plásmido pSGsetrapK se aisló y se verificó la construcción empleando digestiones de restricción y análisis de secuencia.
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Ejemplo 4 Identificación de 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-O-desmetilo rapamicina (prerapamicina, Figura 6)
Se obtuvo la 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-O-desmetilo rapamicina (prerapamicina) mediante la conjugación de la cepa MG2-10 de S. hygroscopicus, como se describe en el Ejemplo 1, con pSGsetrapK y el aislamiento de los productos generados en la fermentación. Esto demuestra que es posible complementar la deleción de rapK en la cepa MG2-10 y que, si la cepa se alimenta con ácido pipecólico, se produce prerapamicina, un análogo que carece de las modificaciones post-PKS.
El plásmido pSGsetrapK se conjugó en S. hygroscopicus MG2-10, y la cepa se cultivó en TSBGM suplementado con 2 mg/l de ácido pipecólico a 25ºC, con agitación. Se extrajeron las celúlas con metanol y el sobrenadante de cultivo se extrajo con acetato de etilo, como se describió con anterioridad.
El análisis del sobrenadante de cultivo del mutante MG2-10 de S. hygroscopicus (pSGsetrapK) alimentado con ácido pipecólico mediante HPLC con detección W a 280 nm reveló la presencia de dos picos nuevos principales con tiempos de retención de 4,0 y 5,1 minutos. La espectroscopia de masas por electrospray de estos picos mostró que ambos contenían iones correspondientes a un compuesto con una masa molar de 841,5. Ninguno de estos picos se observó en las extracciones del cultivo de S. hygroscopicus, cepa NRRL 5491, o de la cepa MG2-10 mutante sin el plásmido pSGsetrapK de expresión de rapK. El análisis MS|MS del ion con m/z de 846 (correspondiente al aducto de sodio de la prerapamicina) mostró que se fragmentaba en un ion con m/z de 735, correspondiente a la pérdida de m/z 129 (ácido pipecólico), o un ion con m/z de 556, correspondiente a la pérdida de m/z 308 (C28-C42 de la prerapamicina). Este ion, a su vez, se fragmentaba más aun a un ion con m/z 306, correspondiente a la pérdida de m/z 250 (C14-C27 de la prerapamicina). Este patrón de fragmentación era idéntico al patrón observado para la rapamicina, pero con la segunda pérdida de m/z (-308) reducida en 14, correspondiente a la ausencia del grupo O-metilo C39, la tercera pérdida de m/z (-250) reducida en 44, correspondiente a la ausencia de los grupos metoxi C27 y O-metilo C16, y con un ion final (306) con m/z reducida en 14, en correspondencia con la ausencia del grupo cetona C9. Esto era evidencia de que el compuesto con masa molar 841,5 representa a la 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-O-desmetilo rapamicina (prerapamicina).
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Ejemplo 5 Preparación de los casetes génicos para la expresión en S. hygroscopicus MG2-10
Los casetes génicos capaces de dirigir la expresión de una variedad de genes modificadores de rapamicina y combinaciones de genes modificadores se construyeron como se describe a continuación.
Clonaje de rapN/O
Los genes contiguos rapN y rapO, designados a partir de ahora como rapN/O se amplificaron mediante PCR, empleando los cebadores BIOSG2 5'-GGGCATATGTCGACGACCGATCAGGGTGAGACCGGAAAGGCCTG-3' (SEC ID NO: 39) y BIOSG3 5'-GGGGTCTAGAGGTCAGTCCTGGGGTTCGAGAAGCTCGCCGGTCTCCTT-3' (SEC ID NO: 40), que introducen un sitio de NdeI en el extremo 5' y un sitio de XbaI en el extremo 3' de rapN/O. Se empleó el plásmido pR19 (Schwecke et al., 1995) como molde. Luego del tratamiento con la T4 polinucleótido quinasa empleando técnicas estándar, se ligó el producto del PCR en pUC18 cortado con SmaI y se empleó para transformar E. coli DH10B. La secuencia de ADN de rapN/O en el plámido pUCrapN/O aislado se verificó mediante análisis de secuencia. Las diferencias en la secuencia de ADN en comparación con la secuencia publicada (acc. no. X86780) se muestran en la Fig 21. Los cambios resultantes en RapN se muestran en la Fig 22.
Clonaje de rapM
El gen rapM se amplificó mediante PCR empleando los cebadores BIOSG4 5'-GGGCATATGATCCAACCCGA
CGTCGTGACCGCCTTCACAGCGG-3' (SEC ID NO: 41) y BIOSG5 5'-GGGGTCTAGAGGTCACACGCGGAC
GGCGATCTGGTGCCGATAGG-3' (SEC ID NO: 42), que introducen un sitio para NdeI en el extremo 5' y un sitio para XbaI en el extremo 3' de rapM. El plásmido pR19 (Schwecke et al., 1995) se empleó como molde. Luego del tratamiento con la T4 polinucleótido quinasa empleando técnicas estándar, se ligó el producto del PCR en pUC18 cortado con SmaI y se empleó para transformar E. coli DH10B. La secuencia de ADN de rapM en el plámido pUCrapM aislado se verificó mediante análisis de secuencia. Las diferencias en la secuencia de ADN en comparación con la secuencia publicada (acc. no. X86780) se muestran en la Fig 23. Los cambios resultantes en RapM se muestran en la Fig 24.
Clonaje de rapL
El gen rapL se amplificó mediante PCR empleando los cebadores BIOSG6 5'-GGGCATATGCAGACCA
AGGTTCTGTGCCAGCGTGACATCAAG-3' (SEC ID NO: 43) y BIOSG7 5'-GGGGTCTAGAGGTCACTACAG
CGAGTACGGATCGAGGACGTCCTCGGGCG-3' (SEC ID NO: 44), que introducen un sitio para NdeI en el extremo 5' y un sitio para XbaI en el extremo 3' de rapL. El plásmido pR19 (Schwecke et al., 1995) se empleó como molde. Luego del tratamiento con la T4 polinucleótido quinasa empleando técnicas estándar, se ligó el producto del PCR en pUC18 cortado con SmaI y se empleó para transformar E. coli DH10B. La secuencia de ADN de rapL en el plámido pUCrapL aislado se verificó mediante análisis de secuencia. Las diferencias en la secuencia de ADN en comparación con la secuencia publicada (acc. no. X86780) se muestran en la Fig 25. Los cambios resultantes en RapL se muestran en la Fig 26.
Clonaje de rapL_{his}
El gen rapL se amplificó mediante PCR empleando los cebadores BIOSG6 5'-GGGCATATGCAGACCA
AGGTTCTGTGCCAGCGTGACATCAAG-3' (SEC ID NO: 43) y BIOSG45 5'-GGAGATCTCAGCGAGTACGGAT
CGAGGACGTCCTCGGGCG-3' (SEC ID NO: 45), que introducen un sitio para NdeI en el extremo 5' y un sitio BglII en el extremo 3' de rapL. El plásmido pR19 (Schwecke et al., 1995) se empleó como molde. Luego del tratamiento con la T4 polinucleótido quinasa empleando técnicas estándar, se ligó el producto del PCR en pUC18 cortado con SmaI y se empleó para transformar E. coli DH10B. La secuencia de ADN de rapL en el plámido pUCrapL_{his} aislado se verificó mediante análisis de secuencia.
Clonaje de rapK
El gen rapK se amplificó mediante PCR empleando los cebadores BIOSG85'-GGGCATATGAGGCAATTGA
CTCCGCCGGTCACGGCACCGTACTGCC-3' (SEC ID NO: 37) y BIOSG9 5'-GGGGTCTAGAGGTCACGCCAC
CACACCCTCGATCTCGACC-3' (SEQ ID NO: 38), que introducen un sitio para NdeI en el extremo 5' y un sitio para XbaI en el extremo 3' de rapK. El plásmido pR19 (Schwecke et al., 1995) se empleó como molde. Luego del tratamiento con la T4 polinucleótido quinasa empleando técnicas estándar, se ligó el producto del PCR en pUC18 cortado con SmaI y se empleó para transformar E. coli DH10B. La secuencia de ADN de rapK en el plámido pUCrapK aislado se verificó mediante análisis de secuencia. Las diferencias en la secuencia de ADN en comparación con la secuencia publicada (acc. no. X86780) se muestran en la Fig 27. Los cambios resultantes en RapK se muestran en la Fig 28.
Aislamiento de pSGsetrapN/O, pSGsetrapM, pSGsetrapQ, pSGsetrapI, pSGsetrapK, y pSGsetrapL
Los plásmidos pUCrapN/O, pUCrapJ, pUCrapM, pUCrapI, pUCrapL, pUCrapK y pAHL42 se digirieron con NdeI y XbaI y los fragmentos insertados, con intervalos de tamaño desde aproximadamente 1,3 kb hasta 0,7 kb, se amplificaron y ligaron en pSGset1 cortados de forma idéntica. Se emplearon los ligados para transformar E. coli DH10B empleando procedimientos estándar y se analizaron los transformantes. Los plásmidos pSGsetrapN/O, pSGsetrapM, pSGsetrapQ, pSGsetrapI, pSGsetrapK, y pSGsetrapL se aislaron y se verificaron las construcciones empleando digestiones de restricción y análisis de secuencia.
Clonaje de rapJ
El gen rapJ se amplificó mediante PCR empleando los cebadores BIOSG10 5'-GGGCATATGAGCACCGA
AGCTCAGCAAGAGAGCACGCCCACCGCACGCT-3' (SEC ID NO: 46) y BIOSG11 5'-GGGGTCTAGAGGT
CACTCCGCTCCCCAGGTGACCCGGAGCTCGGC-3' (SEC ID NO: 47), que introducen un sitio para NdeI en el extremo 5' y un sitio para XbaI en el extremo 3' de rapJ. El plásmido pR19 (Schwecke et al., 1995) se empleó como molde. Luego del tratamiento con la T4 polinucleótido quinasa empleando técnicas estándar, se ligó el producto del PCR en pUC18 cortado con SmaI y se empleó para transformar E. coli DH10B. La secuencia de ADN de rapJ en el plámido pUCrapJ aislado se verificó mediante análisis de secuencia. Las diferencias en la secuencia de ADN en comparación con la secuencia publicada (acc. no. X86780) se muestran en la Fig 29. Los cambios resultantes en RapJ se muestran en la Fig 30.
Clonaje de rapI
El gen rapI se amplificó mediante PCR empleando los cebadores BIOSG12 5'-GGGCATATGAGCGCG
TCCGTGCAGACCATCAAGCTGCC-3' (SEC ID NO: 48) y BIOSG13 5'-GGGGTCTAGAGGTCAGGCGTC
CCCGCGGCGGGCGACGACCT-3' (SEC ID NO: 49), que introducen un sitio para NdeI en el extremo 5' y un sitio para XbaI en el extremo 3' de rapI. El plásmido pAHL2 (gentilmente proporcionado por Huai-Lo-Lee) se obtiene a partir de pUC18, conteniendo el gen rapI y se empleó como molde. Luego del tratamiento con la T4 polinucleótido quinasa empleando técnicas estándar, se ligó el producto del PCR en pUC18 cortado con SmaI y se empleó para transformar E. coli DH10B. La secuencia de ADN de rapI en el plámido pUCrapI aislado se verificó mediante análisis de secuencia. Las diferencias en la secuencia de ADN en comparación con la secuencia publicada (acc. no. X86780) se muestran en la Fig 31. Los cambios resultantes en RapI se muestran en la Fig 32.
Clonaje de rapQ
El gen rapQ se amplificó mediante PCR empleando los cebadores AHL21 5'-CATATGTTGGAATTGGGTA
CCCGCCTG-3' (SEC ID NO: 50) y AHL22 5'-TCTAGACGCTCACGCCTCCAGGGTG-3' (SEC ID NO: 51), que introducen un sitio para NdeI en el extremo 5' y un sitio para XbaI en el extremo 3' de rapQ. El plásmido pR19 (Schwecke et al., 1995) se empleó como molde. Luego del tratamiento con la T4 polinucleótido quinasa empleando técnicas estándar, se ligó el producto del PCR en pUC18 cortado con SmaI y se empleó para transformar E. coli DH10B. La secuencia de ADN de rapQ en el plámido pAHL42 aislado se verificó mediante análisis de secuencia. Las diferencias en la secuencia de ADN en comparación con la secuencia publicada (acc. no. X86780) se muestran en la Fig 33. Los cambios resultantes en RapQ se muestran en la Fig 34.
Aislamiento de pUC18eryBVcas
El gen rapQ se amplificó mediante PCR empleando los cebadores casOleG21 (WO01/79520) y 7966 5'-GGGG
AATTCAGATCTGGTCTAGAGGTCAGCCGGCGTGGCGGCGCGTGAGTTCCTCCAGTCGCGGGACGATCT-3' (SEC ID NO: 52) y pSG142 (Gaisser et al., 2000) como molde. El fragmento de PCR se clonó empleando técnicas estándar, y el plásmido pUC18eryBVcas se aisló con un sitio para NdeI sobrelapado con el codon de inicio de eryBV y sendos sitios para XbaI y BglII luego del codon de parada. La construcción se verificó mediante análisis de secuencia.
Aislamiento del vector pSGLit1
El gen eryBV se amplificó mediante PCR empleando los cebadores BIOSG1 5'-GGGTCTAGATCCGGACGA
ACGCATCGATTAATTAAGGAGGACACATA-3' (SEC ID NO: 53) y 7966 5'-GGGGAATTCAGATCTGGTCTAGAGGTCAGCCGGCGTGGCGGCGCGTGAGTTCCTCCAGTCGCGGGACGATCT-3' (SEC ID NO: 52), que introducen un sitio para XbaI sensible a la mutilación Dam en el extremo 5' y sendos sitios para XbaI y BglII en el extremo 3' de eryBV. El plásmido pUC18eryBVcas se empleó como molde. Luego del tratamiento con la T4 polinucleótido quinasa empleando técnicas estándar, se ligó el producto del PCR en pUC18 cortado con SmaI y se empleó para transformar E. coli DH10B. La construcción se digirió luego con BamHI/BglII y se aisló una banda de ADN de aproximadamente 1,3 kb a partir de un gel de azarosa seguido por la ligación con el ADN del vector Litmus28 digerido con BamHI/BglII empleando procedimientos estándar. Se aisló el vector pSGLit1 y la secuencia de ADN del inserto se verificó mediante análisis de secuencia.
Aislamiento de pSGsetrapN/O, pSGsetrapM, pSGsetrapQ, pSGsetrapI, pSGsetrapK, y pSGsetrapL
Los plásmidos pUCrapN/O, pUCrapJ, pUCrapM, pUCrapI, pUCrapL, pUCrapK y pAHL42 se digirieron con NdeI y XbaI y los fragmentos insertados, con intervalos de tamaño desde aproximadamente 1,3 kb hasta 0,7 kb, se amplificaron y ligaron en pSGset1 cortados de forma idéntica. Se emplearon los ligados para transformar E. coli DH10B empeando procedimientos estándar y se analizaron los transformantes. Los plásmidos pSGsetrapN/O, pSGsetrapM, pSGsetrapQ, pSGsetrapI, pSGsetrapK, y pSGsetrapL se aislaron y se verificaron las construcciones empleando digestiones de restricción y análisis de secuencia.
Aislamiento de pSGLitrapN/O, pSGLitrapM, pSGLitrapQ, pSGLitrapI, pSGLitrapK, pSGLitrapL y pSGUtrapL_{his}
Los plásmidos pSGLitrapN/O, pSGLitrapM, pSGLitrapQ, pSGLitrapI, pSGLitrapK, pSGLitrapL y pSGUtrapL_{his} se digirieron empleando las enzimas de restricción NdeI/BglII y las bandas en el intervalo desde aproximadamente 0,7 a 1,3 kb se aislaron luego de la ligación con pSGLit1 digerido con NdeI/BglII. Las ligaciones se emplearon para transformar E. coli ET12567 y se analizaron los transformantes. Se aislaron los plásmidos pSGLitrapN/O, pSGLitrapM, pSGLitrapQ, pSGLitrapI, pSGLitrapK, pSGLitrapL y pSGUtrapL_{his}.
Aislamiento de pSGsetrapKI, pSGsetrapKM, pSGsetrapKN/O, pSGsetrapKL, pSGsetrapKQ, y pSGsetrapKJ
Los plásmidos pSGLitrapN/O, pSGLitrapJ, pSGLitrapM, pSGUtrapQ, pSGLitrapI, pSGLitrapL se digirieron con XbaI y los fragmentos, en el intervalo entre aproximadamente 0,8 y 1,3 kb se aislaron y luego se ligaron con pSGsetrapK digerido con XbaI y tratado con fosfatasa alcalina empleando técnicas estándar de biología molecular. Las ligaciones se emplearon para transformar E. coli DH10B y se analizaron los transformantes. Los plásmidos pSGsetrapKI, pSGsetrapKM, pSGsetrapKN/O, pSGsetrapKL, pSGsetrapKQ, y pSGrapKJ se aislaron y se verificó la orientación del inserto mediante el análisis de digestión de restricción. Para la adición de rapL_{his} estas construcciones fueron digeridas con BglII/XbaI seguido por digestión parcial con BglII según fuese apropiado y los fragmentos del vector aislados se ligaron con el fragmento de \sim1 kb de XbaI/BglII de pSGLitrapL_{his}.
Aislamiento de los plásmidos pSGsetrapKIJ, pSGsetrapKIM y pSGsetrapKIQ
Los plásmidos pSGLitrapJ, pSGLitrapM, and pSGLitrapQ se digirieron empleando XbaI y los fragmentos, en el intervalo entre aproximadamente 0,8 y 1,3 kb se aislaron seguido de ligaciones con pSGsetrapKI digerido con XbaI y tratado con fosfatasa alcalina usando técnicas estándar de biología molecular. Las ligaciones se emplearon para transformar E. coli DH10B y se analizaron los transformantes. Se aislaron los plásmidos pSGsetrapKIJ, pSGsetrapKIM, y pSGrapKIQ y se verificó la orientación del inserto por medio de análisis de digestión de restricción. Para la adición de rapL_{his} estas construcciones fueron digeridas con BglII/XbaI seguido por digestión parcial con BglII cuando fuese apropiado, y los fragmentos del vector aislados se ligaron con los fragmentos de \sim1 kb de XbaI/BglII de pSGLitrapL_{his}.
Aislamiento de los plásmidos pSGsetrapKN/OI, pSGsetrapKN/OQ, pSGsetrapKN/OM and pSGsetrapKN/OJ
Los plásmidos pSGLitrapI, pSGLitrapM, pSGLitrapJ, and pSGLitrapQ se digirieron empleando XbaI y los fragmentos, en el intervalo entre aproximadamente 0,8 y 1,3 kb se aislaron seguido de ligaciones con pSGsetrapKN/O digerido con XbaI y tratado con fosfatasa alcalina usando técnicas estándar de biología molecular. Las ligaciones se emplearon para transformar E. coli DH10B y se analizaron los transformantes. Se aislaron los plásmidos pSGsetrapKN/OI, pSGsetrapKN/OQ, pSGsetrapKN/OM y pSGrapKN/OJ y se verificó la orientación del inserto por medio de análisis de digestión de restricción. Para la adición de rapL_{his} estas construcciones fueron digeridas con BglII/XbaI seguido por digestión parcial con BglII cuando fuese apropiado, y los fragmentos del vector aislados se ligaron con los fragmentos de \sim1 kb de XbaI/BglII de pSGLitrapL_{his}.
Aislamiento de los plásmidos pSGsetrapKJM and pSGsetrapKJQ
Los plásmidos pSGLitrapM and pSGLitrapQ se digirieron empleando XbaI y los fragmentos, en el intervalo entre aproximadamente 0,8 y 1,1 kb se aislaron seguido de ligación con pSGsetrapKJ digerido con XbaI y tratado con fosfatasa alcalina usando técnicas estándar de biología molecular. Las ligaciones se emplearon para transformar E. coli DH10B y se analizaron los transformantes. Se aislaron los plásmidos pSGsetrapKJM y pSGrapKJQ y se verificó la orientación del inserto por medio de análisis de digestión de restricción. Para la adición de rapL_{his} estas construcciones fueron digeridas con BglII/XbaI seguido por digestión parcial con BglII cuando fuese apropiado, y los fragmentos del vector aislados se ligaron con los fragmentos de \sim1 kb de XbaI/BglII de pSGLitrapL_{his}.
Empleando la misma estrategia delineada con anterioridad, se aislaron los siguientes casetes génicos:
pSGsetrapKIJM pSGsetrapKN/OJI pSGsetrapKIQN/OM
pSGsetrapKIJQ pSGsetrapKJMN/O pSGsetrapKJMN/OQ
pSGsetrapKIJN/O pSGsetrapKJQN/O pSGsetrapKIJN/OMQ
pSGsetrapKIMN/O pSGsetrapKIJN/OM pSGsetrapN/OQ
pSGsetrapKIQN/O pSGsetrapKIJN/OQ pSGsetrapKIJMN/OQ
pSGsetrapKN/OMQ pSGsetrapKIMN/OQ
Se presenta un resumen en la Figura 5.
Para la adición de rapL_{his} estas construcciones de casetes fueron digeridas bien con BglII/XbaI, o bien con XbaI, seguido de digestión parcial con BglII según fuese apropiado y los fragmentos aislados del vector se ligaron con el fragmento de aproximadamente 1 kb de XbaI/BglII de pSGLitrapL_{his}.
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Ejemplo 6 Aislamiento de 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-O-desmetilo rapamicina (prerapamicina, Figura 6)
La 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-O-desmetilo rapamicina (prerapamicina) se obtuvo por medio de la conjugación de la cepa MG2-10 de S. hygroscopicus con pSGsetrapKL y el aislamiento de los productos generados como se describe más adelante. Esto demuestra que es posible complementar la deleción de rapK y rapL en la cepa MG2-10 y que se produce prerapamicina, un análogo que carece de la modificación post-PKS. La adición de ácido pipecólico no se requiere cuando se complementa con rapL, lo que confirma que rapL desempeña un papel en la proporción del ácido pipecólico en la producción de la rapamicina.
S. hygroscopicus MG2-10 (pSGsetrapKL) se cultivó a partir de una masa de esporas de trabajo congelada en criopreservación (20% glicerol, 10% lactosa w/v en agua destilada) en medio 1 (ver Materiales y Métodos), agitada a 250 rpm con un agitador de dos pulgadas a 30ºC, durante dos días. El precultivo primario se empleó para inocular dos precultivos secundarios de medio 2 (ver materiales y Métodos) y el medio 3, a 10% v/v, que se agitó a 300 rpm con un agitador de una pulgada, a 25ºC, durante otras 24 horas. Cuatro litros de medio 4 (ver Materiales y Métodos) y medio 5 (ver Materiales y Métodos) se prepararon, conteniendo 0,01% v/v de antiespumante Pluronic L101 (BASF). El medio 4 de producción se inoculó con el precultivo secundario en el medio 2 y se inoculó el medio 5 de producción con el precultivo secundario en medio 3 a 10% v/v y se permitió fermentar en un biorreactor de 7L con agitación durante cinco a siete días a 25ºC. Se ajustó el flujo de aire a 0,75 vvm y la velocidad de la punta del impelente se controló entre 0,98 ms^{-1} y 2,67 ms^{-1}. Se añadió más Pluronic L101 a demanda.
Para confirmar la estructura de la 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-O-desmetil-rapamicin (prerapamicin), se extrajeron sobrenadantes del medio 4 y el medio 5 con acetato de etilo y se redujo a un extracto crudo mediante evaporación. Los extractos se desgrasaron en una partición de hexano:metanol:agua y se aplicaron a un cartucho de 70 g de sílica, comenzando con hexano y terminando con acetona. Las fracciones de prerapamicina de cada fermentación se recogieron y se aplicaron a un cartucho de C18 comenzando con agua y terminando con metanol. Se aisló la prerapamicina (8,5 mg) luego de cromatografía en Sephadex LH_{20} empleando heptano:cloroformo:etanol como fase móvil. Este compuesto se analizó y la estructura fue totalmente confirmada por medio de RMN (Figuras 18-20). Los datos de RMN ^{1}H y ^{13}C se presentan en la Tabla V a continuación.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA V Datos de RMN ^{1}H y ^{13}C para la prerapamicina
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Ejemplo 7 Aislamiento de la 8-deoxo-15-O-desmetil-26-desmetoxi-38-O-desmetil-prolilrapamicina (preprolilrapamicina, Figura 7)
El suministro de ácido de prolina a S. hygroscopicus MG2-10 (pSEGrapK) dio como resultado la producción de preprolilrapamicina, como se describe más adelante. Esto demostró que, en ausencia de rapL, se incorporan análogos alternativos del ácido pipecólico.
S. hygroscopicus MG2-10 (pSGsetrapK) se cultivó en TSBGM suplementado con prolina a 1 mg/l a 25ºC con agitación. Se extrajeron las celúlas con metanol, y el sobrenadante del cultivo se extrajo con acetato de etilo, como se describió con anterioridad.
El análisis del sobrenadante del cultivo del mutante MG2-10 (pSGsetrapK) de S. hygroscopicus suplementado con prolina, mediante HPLC con detección UV a 280 nm mostró la presencia de dos nuevos picos importantes con tiempos de retención de 4,5 y 4,6 minutos. La espectroscopia de masas mediante electrospray de estospicos reveló que ambos contenían iones correspondientes a un compuesto con masa molar de 827,5. Ninguno de estos picos se apreció en el cultivo de S. hygoscopicus NRRL 5491, S. hygroscopicus MG1C o S. hygroscopicus MG2-10 sin el plásmido de expresión de rapK pSGsetrapK. El análisis MS/MS del ion com m/z de 850 (correspondiente al aducto de sodio de la preprolilrapamicina) mostró que se fragmentaba en un ion con m/z de 735, correspondiente a la pérdida de m/z 115 (prolina), o un ion con m/z de 542, correspondiente a la pérdida de m/z 308 (C27-C41 de la preprolilrapamicina). Este ion, a su vez, se fragmentó más aun para dar origen a un ion con m/z 292, correspondiente a la pérdida de m/z 250 (C13-C26 de la preprolilrapamicina). Este patrón de fragmentación era idéntico al patrón observado para la rapamicina, pero con la primera pérdida de m/z (-115) reducida en 14, correspondiente a la ausencia del grupo O-metilo C38, la tercera pérdida de m/z (-250) reducida en 44, en correspondencia con la ausencia de los grupos metoxi C26 y O-metilo C15 y el ion final (306) con la masa reducida en 14, en correspondencia con la ausencia del grupo cetona C8, y el cambio del ácido pipecólico por prolina. Esto indicaba que el compuesto con masa molar de 827,5 representa a la 8-deoxo-15-Odesmetil-26-desmetoxi-38-O-desmetil-prolilrapamicina (preprolilrapamicina).
Ejemplo 8 Aislamiento de la 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-desmetoxi-rapamicina (39-dehidroxi prerapamicina, Figura 8)
La suplementación de S. hygroscopicus MG2-10 (pSGsetrapK) con ácido pipecólico y ácido ciclohexano carboxílico dio como resultado la producción de dos compuestos principales, la prerapamicina, que corresponde a la incorporación de la unidad de partida natural y la 39-dehidroxi prerapamicina, que corresponde a la incorporación de la unidad de partida suplementada.
S. hygroscopicus MG2-10 (pSGsetrapK) se cultivó en TSBGM, suplementado con ácido pipecólico a 2 mg/l y 1 mM de ácido ciclohexano carboxílico a 25ºC con agitación. El sobrenadante de cultivo se extrajo con acetato de etilo como se decribió con anterioridad.
El análisis del sobrenadante de cultivo del mutante MG2-10 (pSGsetrapK) de S. hygroscopicus suplementado con ácido ciclohexano carboxílico, mediante HPLC con detección UV a 280 nm mostró la presencia de un nuevo pico principal, con un tiempo de retención de 5,8 minutos. La espectroscopia de masas de electrospray de este pico mostró que contenía iones correspondientes a un compuesto con una masa molar de 825,5. Este pico no se observó en los cultivos de S. hygoscopicus NRRL 5491, S. hygroscopicus MG1C o S. hygroscopicus MG2-10 sin el plásmido de expresión de rapK pSGsetrapK. El análisis MS/MS del ion con m/z de 848 (correspondiente al aducto de sodio de la 39-dehidroxi prerapamicina) demostró que se fragmentaba en un ion con m/z de 719, correspondiente a la pérdida de m/z 129 (ácido pipecólico), o un ion con m/z de 556, correspondiente a la pérdida de m/z 292 (C28-C42 de la 39-dehidroxi prerapamicina). Este ion, a su vez, se fragmentaba en un ion con m/z 306, correspondiente a la pérdida de m/z 250 (C14 a C27 de la 39-deshidroxi prerapamicina). Este patrón de fragmentación era idéntico al patrón observado para la prerapamicina, pero con la segunda pérdida de m/z (-292) reducida en 16, en correspondencia con la ausencia del grupo hidroxilo C39. Esto era evidencia de que el compuesto con masa molar 825,5 representa a la 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-desmetoxi-rapamicina (39-dehidroxi-prerapamicina).
Ejemplo 9 Aislamiento de la 16-O-desmetil-27-desmetoxi-rapamicina (Figura 9)
La cepa MG2-10 (pSGsetrapK) de S. hygroscopicus se conjugó con pSGsetrapKIJ, como se describió en el Ejemplo 1. La suplementanción de esta cepa con ácido pipecólico y el aislamiento de los productos generados por la fermentación dieron como resultado la producción de 16-O-desmetil-27-desmetoxi-rapamicina.
El plásmido pSGsetrapKIJ (Figura 5) se conjugó en S. hygroscopicus MG2-10 y la cepa se cultivó en TSB GM suplementado con 2 mg/l de ácido pipecólico a 25ºC con agitación. Se extrajeron las celúlas con metanol y se extrajo el sobrenadante del cultivo con acetato de etilo, como se describió con anterioridad.
El análisis del extracto del mutante MG2-10 (pSGsetrapK) de S. hygroscopicus mediante espectroscopia de masas de electrospray mostró un pico prinicipal que contenía iones correspondientes a un compuesto con un compuesto de una masa molar de 869. Este pico no se observó en los cultivos de S. hygoscopicus NRRL 5491, S. hygroscopicus MG1C o S. hygroscopicus MG2-10 sin el plásmido de expresión de rapK pSGsetrapK. El análisis MS/MS del ion con m/z de 892 (correspondiente al aducto de sodio de la 16-O-desmetil-27-desmetoxi-rapamicina) demostró que se fragmentaba en un ion con m/z de 763, correspondiente a la pérdida de m/z 129 (ácido pipecólico), o un ion con m/z de 332, (C28-C42 de la 16-O-desmetil-27-desmetoxi-rapamicina). Este ion, a su vez, se fragmentaba en un ion con m/z 320, correspondiente a la pérdida de m/z 250 (C14 a C27 de la 16-O-desmetil-27-desmetoxi-rapamicina). Este patrón de fragmentación era idéntico al patrón observado para la prerapamicina, pero con la tercera pérdida de m/z (-250) reducida en 44, en correspondencia con la ausencia de los grupos metilo C16 y metoxi C27. Esto era evidencia de que el compuesto con masa molar 869 era la 16-O-desmetil-27-desmetoxi-rapamicina.
Ejemplo 10 Suplementación de una batería de compuestos
S. hygroscopicus MG2-10 (pSGsetrapK) se empleó para la suplementación de una batería de compuestos. Los cultivos vegetativos primarios se prepararon mediante la inoculación de medio con el surtido de esporas, como se describe en los Materiales y Métodos. El medio TSB GM se inoculó al 10% v/v empleando los métodos que se describen en la sección de materiales y métodos. Se añadieron los compuestos siguientes como se indica en la Tabla VI, a continuación:
TABLA VI
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Los cultivos se incubaron, se extrajeron y se midieron empleando técnicas descritas en la sección de Materiales y Métodos. La Tabla VII muestra los resultados del análisis que muestra el ion (m/z) observado para cada combinación de ácido carboxílico y aminoácido de partida.
TABLA VII
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Estos datos demuestran la incorporación de los compuestos suplementados.
Ejemplo 11 Complementación de S. hygroscopicus MG2-10 con fkbO
Para evaluar si los genes homólogos a rapK, tales como fkbO en S. hygroscopicus var. ascomyceticus y S. tsukubaensis, y la orf5 del cluster "hyg" parcialmente secuenciado (Ruan et al., 1997) cumplen funciones similares, se llevaron a cabo ensayos de complementación empleando fkbO como se describe a continuación.
Aislamiento de pMG169-1
El gen fkbO de Strepomyces hygroscopicus var. ascomyceticus (ATCC 14891), productora de FK520,se amplificó mediante PCR empleando los cebadores fkbof 5'-GGGCATATGACCGATGCCGGACGCCA 3' (SEC ID NO: 54) y fkbor 5' GGGGTCTAGATCACGCCACCATGCCTTCGA 3' (SEC ID NO: 55), que introducen un sitio para NdeI en el extremo 5' y un sitio para XbaI en el extremo 3' de fkbO. El ADN genómico aislado a partir de Strepomyces hygroscopicus var. ascomyceticus (ATCC 14891) se empleó como molde. El producto de PCR amplificado se sometió a digestión con NdeI y XbaI y se ligó con pSGsetI cortado con NdeI-XbaI. Se empleó el producto ligado para transformar E. coli DH10B y los transformantes se analizaron empleando métodos descritos en la sección de Materiales y Métodos. Se aisló el plásmido pMG169-1 y se verificó la digestión de restricción y se transformó S. hygroscopicus MG2-10 empleando los métodos descritos en la sección de Materiales y Métodos.
Complementación heteróloga de rapK mediante fkbO
Se cultivó S. hygroscopicus MG2-10 (pMG169-1) en TSBGM suplementado con 2 mg/l de ácido pipecólico a 25ºC con agitación. Se extrajeron el sobrenadante del cultivo y las celúlas, empleando los métodos descritos en la sección de Materiales y Métodos (Método A). El análisis del extracto con detección UV a 280 nm mostró la presencia de dos nuevos picos principales con tiempos de retención de 4,5 y 4,6 minutos. La espectroscopia de masas de electrospray de estos picos mostró que ambos contenían iones con una masa molar de 827,5, correspondiente a los dos isómeros de la prerapamicina (Ejemplo 7).
Ejemplo 12 Producción eficiente de 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-desmetoxi-rapamicina (39-dehidroxi prerapamicina, Figure 8) en ausencia de competencia por la unidad de partida endógena, por medio de la suplementación a un mutante knockout de rapK
La capacidad de S. hygroscopicus, cepas MG2-10 y MG2-10 (pSGsetrapK) de incorporar una unidad de partida diferente, el ácido ciclohexano carboxílico se comparó como se describe más adelante. Cuando se le proporcionaba ácido ciclohexano carboxílico y ácido pipecólico, la MG2-10 producía solo un compuesto (39-dehidroxi prerapamicina), correspondiente a la incorporación de la unidad de partida suministrada, únicamente, mientras que MG2-10 (pSGsetrapK) producía dos compuestos en una proporción 1:1, la 39-dehidroxi prerapamicina y la prerapamicina. Esto demostró que se necesita rapK para la incorporación de la unidad de partida natural endógena, y que una cepa knockout para rapK no tenía competencia de la unidad de partida endógena con la unidad de partida natural.
S. hygroscopicus MG2-10 se cultivó en TSBGM suplementado con 2 mg/L de ácido pipecólico y 1 mM de ácido ciclohexano carboxílico a 25ºC con agitación. El sobrenadante del cultivo se extrajo con acetato de etilo como se describió con anterioridad. El análisis de los extractos mediante HPLC con detección UV a 280 nm mostró la presencia de un nuevo pico importante con un tiempo de retención de 5,8 min. Sin embargo, S. hygroscopicus MG2-10 (pSGsetrapK) (Ejemplo 4), produjo prerapamicina (Figura 6) además de 39-dehidroxi prerapamicina, en una proporción aproximada de 1:1,cuando se le suministró ácido ciclohexano carboxílico (Ejemplo 8, Figura 8). Resulta sorprendente que la suplementación de S. hygroscopicus MG2-10 con ácido ciclohexano carboxílico dio como resultado un solo producto, la 39-dehidroxi prerapamicina. El iniciador endógeno, el ácido 4,5-dihidroxiciclohex-1-eno carboxílico no se incorporó en ausencia de rapK. Por tanto, no hubo competencia entre la incorporación del ácido carboxílico suministrado y el iniciador endógeno.
Ejemplo 13 Elucidación de la función de RapM
Se mantuvieron cultivos de Streptomyces lividans TK24, S. lividans TK24 (pSGsetrapM) y S. lividans TK24 (pSGsetrapQ) en TSBGM con agitación a 30ºC y se suplementaron con 20 \mug/ml de prerapamicina. Los controles no fueron suplementados. Luego de otros 5 días de incubación, se extrajeron los cultivos con acetato de etilo y se llevaron hasta sequedad. La reconstitución y el análisis mediante LC-MS identificaron que no había producción de análogos de rapamicina en los controles no suplementados. Se identificaron dos nuevos picos importantes en el extracto de S. lividans TK24 (pSGsetrapM) suplementado con prerapamicina, uno a 2,5 min y otro a 7,9min.La espectroscopia de masas de electrospray de estos picos mostró que ambos contenían iones correspondientes a un compuesto con una masa molar de 855,6, consistente con la 9-deoxo-16-O-metil-27-desmetoxi-39-O-desmetilo rapamicina (16-O-metil-prerapamicina). Por lo regular se observaron dos isómeros cuando se analizaron los extractos por LC-MS en ausencia de TFA. No se identificaron picos nuevos en los extractos de S. lividans TK24 o S. lividans TK24 (pSGsetrapQ). Fue evidente la presencia de prerapamicina no modificada. RapM fue el responsable claro de la mutilación en el hidroxilo C16, RapQ no era específico para este sitio.
Ejemplo 14 Elucidación de la función de RapJ
Se mantuvieron cultivos de Streptomyces lividans TK24, S. lividans TK24 (pSGsetrapK), S. lividans TK24 (pSGsetrapJ) y S. lividans TK24 (pSGsetrapKJ) en TSBGM con agitación a 30ºC y se suplementaron con 40 \mug/ml de prerapamicina. Los controles no fueron suplementados. Luego de otros 5 días de incubación, se extrajeron los cultivos con acetato de etilo y se llevaron hasta sequedad. La reconstitución y el análisis mediante LC-MS identificaron que no había producción de análogos de rapamicina en los controles no suplementados. Se identificaron un nuevo pico importantes en el extracto de S. lividans TK24 (pSGsetrapM) suplementado con prerapamicina, a 4,9 min. La espectroscopia de masas de electrospray de este pico mostró que contenía iones correspondientes a un compuesto con una masa molar de 855,5, consistente con la 16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-O-desmetilo rapamicina (C9 oxoprerapamicina). No se identificaron picos nuevos en los extractos de S. lividans TK24 y S. lividans TK24 (pSGsetrapK) suplementados con prerapamicina. Fue evidente la presencia de prerapamicina no modificada.
Debido a la homología de RapJ con FkbD del cluster FK506 y el cluster FK520, se ha postulado que RapJ oxida a la prerapamicina en C9 a 9-hidroxi-16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-O-desmetilo rapamicina (C9 OH-prerapamicina). Se ha postulado que RapK es responsable de la conversión posterior a cetona. Resulta sorprendente que, en presencia de RapJ, pero ausencia de RapK, se forme 16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-O-desmetilo rapamicina (C9 ceto-prerapamicina). RapJ posee una clara función oxidativa en C9, observándose una conversión completa de la cetona. RapK no posee una función oxidativa en C9.
Ejemplo 15
Se construyeron plásmidos que contenían las siguientes combinaciones de genes modificadores de la rapamicina, como se describe a continuación: pMG260 (rapI, rapJ, rapN, rapO, y rapL), pMG261 (rapI, rapJ, rapN, rapO, rapM y rapL), pMG262 (rapI, rapJ, rapN, rapO, rapM, rapQ y rapL) pMG236 (rapN, rapO, rapQ and rapL) y pMG238 (rapJ y rapL).
Aislamiento de los plásmidos pMG236 y pMG238
Se digirieron los plásmidos pSGsetrapNOQ y pSGsetrapJ empleando BglII/XbaI y se ligaron los fragmentos de vectores aislados con el fragmento XbaI/BglII de 1 kb de pDGLitrapL_{his}. Se aislaron los plásmidos pMG236 (que expreasaba rapN, rapO, rapQ y rapL) y pMG238 (que expresaba rapJ y rapL), respectivamente.
Aislamiento de los plásmidos pMG260, pMG261 y pMG262
Los plásmidos pSGSetrapKIJNOL, pSGSetrapKIJMNOL, y pSGSetrapKIJMNOQL se digirieron empleando BglII y los fragmentos de inserción aislados (que contienen el cluster de genes de la rapamicina desde el sitio BglII en rapI hasta el sitio BglII después de rapL) se ligaron con el fragmento del vector pSGSetrapI digerido con BglII. Se aislaron los plásmidos pMG260 (que expresaba rapI, rapJ, rapN, rapO, y rapL), pMG261 (que expresaba rapI, rapJ, rapN, rapO, rapM y rapL), y pMG262 (que expresaba rapI, rapJ, rapN, rapO, rapM, rapQ y rapL).
Ejemplo 16
Se construyó un mutante de S. hygroscopicus (MG3) que portaba la deleción cromosómica de rapK, como se describe más adelante. La complementación heteróloga de rapK con fkbO puede entonces llevarse a cabo como se describe y dará como resultado la restauración de la producción de rapamicina, lo que demuestra que fkbO es capaz de complementar la función de rapK en S. hygroscopicus.
Aislamiento del mutante MG3 de S. hygroscopicus que porta la deleción cromosómica de rapK
Se emplearon los cebadores RAPKF1 5'-CAAAGCTTCCTGGCGCGGTTCGGCCGGCA-3' (SEC ID NO: 56) y RAPKF2 5'-TGGCATGCCCTTCCCCGCCGTTCCCTGGC-3' (SEC ID NO: 57) para amplificar la región de homología fuera del gen rapK (desdel nt94403 hasta el nt95429 en el cluster de rapamicina descrito en Schwencke et al., 1995) empleando ADN genómico preparado a partir de S. hygroscopicus NRRL5491 como molde. El producto de PCR de 1 kb se fosforiló empleando la T4 polinucleótido quinasa, y se ligó en pUC18 cortado con SmaI desfosforilado. Luego de la transformación en E. coli DH10B, se aisló elplásmido pMG233-7. Se emplearon los cebadores RAPKR1 5'-TGGCATGCCCCCGCCGAGCTGACCTGGAA-3' (SEC ID NO: 58) y RAPKR2 5'-GTTCTAGAGCT
TACGCGTGATGTCGAACG-3' (SEC ID NO: 59) para amplificar la región derecha de homología fuera del gen rapK (desdel nt96435 hasta el nt97428 en el cluster de rapamicina como está descrito por Schwencke et al., 1995) empleando ADN genómico preparado a partir de S. hygroscopicus NRRL5491 como molde. El producto de PCR de 1 kb se fosforiló empleando T4 polinucleótido quinasa y se ligó en pUC18 cortado con SmaI y desfosforilado. Luego de la transformación en E. coli DH10B, se aisló el plásmido pMG257-7. Se verificaron ambos plásmidos en busca de la secuencia de análisis. El plásmido pMG233-7 se digirió con SphI/XbaI y se aisló el fragmento de 3,7 kb, el pMG257-7 se digirió con Sphi/XbaI y se aisló el fragmento de 1 kb. Estos fragmentos se ligaron y se emplearon para transformar E. coli DH10B. Se aisló el plásmido pMG268-12. Este plásmido se digirió con HindIII/XbaI y se aisló el fragmento de 2 kb y se ligó en pMG55 cortado con HindIII/XbaI y se empleó elADN para transformar E. coli DH10B. Se aisló el plásmido pMG278-1 y se empleó para conjugar S. hygroscopicus MG1C.
Se aisló una colonia resistente a apramicina, y se cultivó durante 24 horas en TSBGM con agitación a 30ºC y se dispersó en placas con agar y medio 1 que contenían 50 \mug/l de estreptomicina. Se aislaron las colonias resistentes a estreptomicina y se mostró que eran sensibles a apramicina. Se pudo corroborar la mutación cromosómica en el nt1004 de rapK en el mutante MG3 mediante Southern blotting. Se presenta un resumen en la Figura 35.
Se cultivó S. hygroscopicus MG3 en TSBGM a 26ºC con agitación. Se extrajeron tanto el sobrenadante del cultivo como las células empleando los métodos que se describen en la sección de Materiales y Métodos. El análisis del extracto con detección UV demostró que no se encontraba presente ningún pico con las características del trieno de rapamicina.
Expresión de fkbO en el mutante MG3 de S. hygroscopicus que porta la deleción cromosómica de rapK
El plásmido pMG169-1 (descrito en el ejemplo 11) se transformó en el mutante MG3 de S. hygroscopicus empleando los métodos que se describen en la sección de Materiales y Métodos.
Complementación heteróloga de rapK por fkbO
S. hygroscopicus MG3pMG169-1 se cultivó en TSBGM a 26ºC con agitación. Se extrajeron tanto el sobrenadante del cultivo como las células, empleando los métodos que se describen en la sección de Materiales y Métodos. El análisis del extracto con detección UV a 280 nm mostró la presencia de dos nuevos picos principales. La espectroscopia de masas de electrospray de estos picos demostró que los mismos contenían iones con una masa molar de 913, correspondiente a la rapamicina.
Ejemplo 17 Aislamiento y complementación heteróloga del mutante MG4 de S. hygroscopicus var ascomyceticus que porta la deleción cromosómica de fkbO
Se emplearon los cebadores FKOF1 5'-GCTCTAGAGCCCGCGGCTCGCCGGACACG-3' (SEC ID NO: 60) y FKOF2 5'-CCCCTGCAGGCGTCCGGCATCGGTCATCAG-3' (SEC ID NO: 61) para amplificar la región izquierda de homología (desde el nt45750 hasta el nt46751 en el cluster de ascomicina, como se describe en Wu et al., 2000) empleando el ADN genómico preparado a partir de S. hygroscopicus var ascomyceticus ATCC14891 como molde. El producto de PCR de 1 kb se fosforiló empleando la T4 polinucleótido quinasa y se ligó en pUC18 cortado con SmaI y desfosforilado. Luego de la transformación en E. coli DH10B, se aisló el plásmido pMG258-4. Se emplearon los cebadores FKOR1 5'-CGCCTGCAGGGATACGGTCCGCCGGGTCTGC-3' (SEC ID NO: 62) y FKOR2 5'-CCAAGCTTGTACGGTTCGCCACGGGCGTGC-3' (SEC ID NO: 63) para amplificar la región derecha de homología (desde el nt47785 hasta el nt48781 en el cluster de rapamicina, como se describe en Wu et al., 2000) empleando el ADN genómico preparado a partir de S. hygroscopicus var ascomyceticus ATCC14891 como molde. Se fosforiló el producto de PCR de 1 kb empleando la T4 polinucleótido quinasa y se ligó en pUC18 cortado con SmaI y desfosforilado. Luego de la transformación en E. coli DH10B, el plásmido pMG259-9 se aisló. Se verificó en ambos plásmidos la presencia de la secuencia de análisis. El plásmido pMG258-4 se digirió con SbfI/HindIII y se aisló el fragmento de 3,7 kb, pMG259-5 se digirió con SbfI/HindIII y se aisló el fragmento de 1 kb. Estos fragmentos se ligaron y se emplearon para transformar E. coli DH10B. Se aisló el plásmido pMG265-1. El plásmido se digirió con HindIII/EcoRI y se aisló el fragmento de 2 kb y se ligó en pMG55 cortado con HindIII/EcoRI y el ADN se empleó para transformar E. coli DH10B. El plásmido pMG267-1 se aisló y se empleó para conjugar S. hygroscopicus var. ascomyceticus ATCC14891.
Se aisló una colonia resistente a apramicina y se cultivó durante 24 horas en TSBGM con agitación a 30ºC y se dispersó en placas con agar y medio 1 que contenían 50 \mug/l de estreptomicina. Se aislaron las colonias resistentes a estreptomicina y se mostró que eran sensibles a apramicina. Se pudo corroborar la mutación cromosómica en el nt1034 de fkbO en el mutante MG4 mediante Southern blotting. Se presenta un resumen en la Figura 35.
Expresión de RapK en el mutante MG4 de S. hygroscopicus var. ascomyceticus que porta la deleción cromosómica de fkbO
El plásmido pSGsetRapK se transformó en el mutante MG4 de S. hygroscopicus como se describe en la sección de Materiales y Métodos.
Complementación heteróloga de fkbO por rapK
Se cultivó S. hygroscopicus var. ascomyceticus MG4pSGSetRapK en TSBGM a 26ºC con agitación. Se extrajeron tanto el sobrenadante del cultivo como las células, empleando los métodos descritos en la sección de Materiales y Métodos. Se analizó el extracto por medio de LC-MS para detectar la presencia de un nuevo pico importante para mostrar que el mismo contenía iones correspondientes a FK520 (ascomicina).
Ejemplo 18
Resulta obvio para los expertos en la técnica que otros clusters biosintéticos, que codifican para ligandos FKBP, por ejemplo, FK506 pueden modificarse de manera que el homólogo de rapK sea eliminado o inactivado empleando los métodos que se describen en el presente documento. En FK506, por ejemplo, esto podría hacerse mediante la amplificación de los productos de PCR contra las regiones a cada lado del gen fkbO (número de acceso a la secuencia AF082099, AF082100), ligando los mismos en un vector como pMG55, transformando la cepa productora de FK506, seleccionando para el doble entrecruzamiento y confirmando la remoción del gen fkbO por medio de Southern blotting.
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Ejemplo 19 Incorporación de unidades de partida no naturales por la cepa de deleción de rapK, S. hygroscopicus MG2-10, a análogos de rapamicina en ausencia de competencia por unidades de partida naturales endógenas
Como se demostró en los Ejemplos 10 y 12, la rapamicina PKS posee un elevado grado de flexibilidad para las unidades de partida no naturales y, en ausencia de rapK, el sistema está libre de competencia del iniciador natural. En este Ejemplo, se demuestra más aun el grado de flexibilidad.
Se cultivó S. hygroscopicus MG2-10, se suplementó y se extrajo de acuerdo a los métodos de suplementación, extracción y análisis que se describen en Materiales y Métodos (Método B). La gama de ácidos carboxílicos suplementados, junto a los compuestos generados, se lista más adelante. Resulta sorprendente que todos los ácidos carboxílicos listados se incorporaron, tal como se determinó por medio de la observación del cromóforo UV característico a 278 nm y la espectrometría de masas de electrospray, lo que dio como resultado la producción de análogos de rapamicina.
Los análogos de rapamicina generados correspondían a la fórmula siguiente, como se describe en la Tabla VIII:
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50 
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R15 = 204 
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2004 TABLA VIII
51
52 
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Ejemplo 20 Incorporación de unidades de partida no naturales por la cepa S. hygroscopicus MG2-10[pSGsetrapN/OQLhis] con la deleción rapK a análogos de rapamicina en ausencia de competencia por la unidad de partida natural endógena
Como se demostró en los Ejemplos 10, 12 y 19, la rapamicina PKS posee un alto grado de flexibilidad para las unidades no naturales de partida en ausencia de rapK, el sistema se encuentra libre de competencia por el iniciador natural. En este ejemplo, se demuestra más aun el grado de flexibilidad.
Se cultivó S. hygroscopicus MG2-10[pSGsetrapN/OQLhis], se suplementó y se extrajo de acuerdo con los métodos de suplementación, extracción y análisis que se describen en Materiales y Métodos (Método B). La gama de ácidos carboxílicos suplementados junto con los compuestos generados se lista a continuación. Resulta sorprendente que todos los ácidos carboxílicos listados se incorporaron como se determinó por medio de la observación del cromóforo UV característico a 278 nm y la espectrometría de masas de electrospray y dieron como resultado la producción de análogos de rapamicina.
Los análogos de rapamicina generados corresponden a la fórmula siguiente, como se describe en la Tabla IX:
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53 
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R15 = 205 
\hskip0.7cm
2005 TABLA IX
54 
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Ejemplo 20 Incorporación de unidades de partida no naturales por la cepa MG3 de S. hygroscopicus con la deleción de rapK, a análogos de rapamicina en ausencia de competencia por la unidad de partida natural
Como se demostró en los Ejemplos 10, 12 y 19, la rapamicina PKS posee un alto grado de flexibilidad para las unidades no naturales de partida en ausencia de rapK, el sistema se encuentra libre de competencia por el iniciador natural. En este ejemplo, se demuestra más aun el grado de flexibilidad.
Se cultivó S. hygroscopicus MG3, se suplementó y se extrajo de acuerdo con los métodos de suplementación, extracción y análisis que se describen en Materiales y Métodos (Método B). La gama de ácidos carboxílicos suplementados junto con los compuestos generados se lista a continuación. La incorporación de los ácidos carboxílicos listados y la producción de análogos de rapamicina se determinó por medio de la observación del cromóforo UV característico a 278 nm y la espectrometría de masas de electrospray.
Los ácidos carboxílicos que pueden suplementarse como unidades de partida incluyen el ácido ciclohexano carboxílico, ácido 3-cis, 4-trans-dihidroxiciclohexano carboxílico, ácido 1-ciclohexeno carboxílico, ácido 3-ciclohexeno carboxílico, ácido cicloheptano carboxílico, carboxilato de metilo 2-norbornano, ácido 3-hidroxiciclohexano carboxílico, ácido 4-hidroxiciclohexano carboxílico, ácido 3-metilciclohexano carboxílico, ácido 4-metilciclohexano carboxílico, ácido 3-(cis/trans) metoxiciclohexano carboxílico, ácido 4-(cis/trans) metoxiciclohexano carboxílico, carboxilato de etilo 4-ciclohexanona, ácido 3-fluoro-4-hidroxicarboxílico y ácido 4-fluoro-3-hidroxicarboxílico, ácido 3-ciclohexano óxido carboxílico, ácido 3,4-cis-dihidroxiciclohexano carboxílico, ácido 3-cloro-4-hidroxicarboxílico y ácido 4-cloro-3-hidroxicarboxílico (y el par de diasteroisómeros opuestos), ácido ciclohexilpropiónico y ácido 4-terc-butilciclohexano carboxílico.
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Ejemplo 21 Incorporación de unidades de partida no naturales por la cepa S. hygroscopicus var. ascomyceticus MG4 con deleción de fkbO a análogos de FK520 en ausencia de competencia por unidades de partida naturales endógenas
Como se demostró en los Ejemplos 10, 12, 19 y 20, la rapamicina PKS posee un alto grado de flexibilidad para las unidades no naturales de partida. En ausencia de fkbO, el sistema FK520 se encuentra libre de competencia por el iniciador natural. En este ejemplo, se analiza el grado de flexibilidad de FK520 PKS, libre de competencia por parte del iniciador natural.
Se cultivó S. hygroscopicus var. ascomyceticus MG4, se suplementó y se extrajo de acuerdo con los métodos de suplementación, extracción y análisis que se describen en Materiales y Métodos (Método B). La gama de ácidos carboxílicos suplementados junto con los compuestos generados se proporcionan en la Tabla IV. La incorporación de los ácidos carboxílicos listados y la producción de análogos de FK520 se determinó por medio de espectrometría de masas de electrospray.
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Ejemplo 22 Incorporación de ácidos de partida no naturales a análogos de FK506 por el mutante de S. tsukubaensis con deleción de fkbO en ausencia de competencia por parte del iniciador natural
Se cultivó un mutante de S. tsukubaensis con deleción de fkbO y se suplementó de acuerdo con loe métodos de suplementación descritos en Materiales y Métodos. Se suplementó un subconjunto de los ácidos carboxílicos listados en la Tabla IV en Materiales y Métodos. Se llevó a cabo el análisis como se describe en el Método (B) de los Materiales y Métodos.
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Ejemplo 23 Aislamiento del producto de la fermentación de S. hygroscopicus MG2-10[pSGsetrapKILh]
Se obtuvo 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-rapamicina por medio de la conjugación de la cepa MG2-10 de S. hygroscopicus con pSGsetrapKIL_{h} y el aislamiento de los productos de fermentación generados como se describe más adelante. Esto demuestra que es posible complementar la deleción de rapK, rapI y rapL en la cepa MG2-10 y que se produce 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-rapamicina, un análogo que carece de las modificaciones post-PKS. La suplementación de ácido pipecólico no se requiere cuando rapL es complementado, confirmando que rapL desempeña un papel en la provisión de ácido pipecólico para la producción de rapamicina.
Se fermentó S. hygroscopicus MG2-10 [pSGsetKIL_{his}] (ver Materiales y Métodos) y se extrajo y aisló empleando el método (B) como se describe en Materiales y Métodos. El sistema de solvente isocrático empleado para la HPLC preparativa fue 60% de CH_{3}CN/H_{2}O.
La 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-rapamicina (Compuesto 6) posee las características siguientes:
Rendimiento del aislamiento: 22 mg
Peso molecular: 856
Fórmula molecular: C_{49}H_{77}NO_{11}
UV (mediante detección de arreglo de diodos durante el análisis de HPLC): 268 nm, 278 nm, 288 nm
MS electrospray: m/z para MNa+ = 878, m/z para M-H = 854
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La Tabla X, a continuación, resume los datos de RMN de ^{1}H y ^{3}C para la 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-rapamicina en CDCl_{3}
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA X
57
58
El compuesto 6 existe como una mezcla 1:1 de confórmeros en CDCl_{3}. Los datos anteriores son para ambos confórmeros. En los casos en que se ha trazado una línea punteada a través de la tabla no fue posible determinar la conec-
tividad entre los sistemas de espín, por tanto, la asignación de datos a un confórmero particular no resulta posible.
Ejemplo 24 Aislamiento del producto de la fermentación de S. hygroscopicus MG2-10[pSGsetrapKIMLh]
Se obtuvo 9-deoxo-27-desmetoxi-rapamicina por medio de la conjugación de la cepa MG2-10 de S. hygroscopicus con pSGsetrapKIML_{h}, como se describió en el Ejemplo 1, y el aislamiento de los productos de fermentación. Esto demuestra que es posible complementar la deleción de rapK, rapI, rapM y rapL en la cepa MG2-10 con la producción de un análogo de la rapamicina que carece de algunas de las modificaciones post-PKS.
Se fermentó S. hygroscopicus MG2-10 [pSGsetKIML_{his}] (ver Materiales y Métodos) y se extrajo y aisló empleando el método (B) como se describe en Materiales y Métodos. El sistema de solvente isocrático empleado para la HPLC preparativa fue 75% de CH_{3}CN/H_{2}O.
La 9-deoxo-27-desmetoxi-rapamicina (Compuesto 16) posee las características siguientes:
Rendimiento del aislamiento: 24 mg
Peso molecular: 870
Fórmula molecular: C_{50}H_{79}NO_{11}
UV (mediante detección de arreglo de diodos durante el análisis de HPLC): 268 nm, 278 nm, 288 nm
MS electrospray: m/z para MNa+ = 892, m/z para M-H = 868
La Tabla XI, a continuación, resume los datos de RMN de ^{1}H y ^{13}C para la 9-deoxo-27-desmetoxi-rapamicina en CDCl_{3}.
TABLA XI
59
60
Ejemplo 25 
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Aislamiento del producto de la fermentación de S. hygroscopicus MG2-10 (pSGsetKIN/OLh)
Se obtuvo la 9-Deoxo-16-O-desmetil-27-O-desmetilo rapamicina mediante la conjugación de la cepa de S. hygroscopicus MG2-10 con pSGsetKIN/OL_{his}, como se describe en el Ejemplo 1 y se aislaron los productos generados durante la fermentación. Esto demostró que es posible complementar la deleción de rapK, rapI,rapN/O y rapL en la cepa MG2-10 con la producción de un análogo de la rapamicina que carece de alguna de las modificaciones post-PKS.
Se fermentó S. hygroscopicus MG2-10 (pSGsetKIN/OL_{his}) (ver Materiales y Métodos), se extrajo y se aisló empleando el Método (B), como se describe en Materiales y Métodos.
El sistema de solvente isocrático empleado para la HPLC preparativa fue 60% de CH3CN/H2O. La 9-Deoxo-16-O-desmetil-27-O-desmetilrapamicina (Compuesto 9) posee las características siguientes:
Rendimiento del aislamiento: 77 mg
Peso molecular: 872
Fórmula molecular: C_{49}H_{77}NO_{12}
UV (mediante detección de arreglo de diodos durante el análisis de HPLC): 268 nm, 278 nm, 288 nm
MS electrospray: m/z para MNa+ = 894, m/z para M-H = 870
La Tabla XII a continuación resume los datos de RMN de ^{1}H y ^{13}C para la 9-deoxo-16-O-desmetil-27-O-desmetilrapamicina en CDCl_{3}.
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TABLA XII 
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61
62
Ejemplo 26 Aislamiento del producto de la fermentación de S. hygroscopicus MG2-10 (pSGsetKJLh)
Se obtuvo la 16-O-Desmetil-27-desmetoxi-39-O-desmetilo rapamicina mediante la conjugación de la cepa MG2-10 de S. hygroscopicus con pSGsetKJI_{his}, como se describió en el Ejemplo 1, y el aislamiento de los productos generados en la fermentación. Esto demostró que era posible la complementación de la deleción de rapK, rapJ y rapL en la cepa MG2-10 con la producción de análogos de rapamicina que carecen de alguna de las modificaciones post-PKS.
Se fermentó S. hygroscopicus MG2-10 (pSGsetKJL_{his}) (ver Materiales y Métodos), se extrajo y se aisló empleando el Método (B), como se describe en Materiales y Métodos. El sistema de solvente isocrático empleado para la HPLC preparativa fue 55% de CH3CN/H2O. La 16-O-Desmetil-27-desmetoxi-39-O-desmetilo rapamicina (Compuesto 3) posee las características siguientes:
Rendimiento del aislamiento: 176 mg (mezcla de los 2 isómeros interconvertibles)
Peso molecular: 856
Fórmula molecular: C_{48}H_{73}NO_{12}
UV (mediante detección de arreglo de diodos durante el análisis de HPLC): 268 nm, 278 nm, 288 nm
MS electrospray: m/z para MNa+ = 894, m/z para M-H = 854
Fragmentación MS: El aducto de sodio (m/z 878) se fragmentó para proporcionar tres fragmentos: C8-C24, m/z MNa^{+} 749; C1-C27, m/z MNa+ 570; C28-C42+C1-C14, m/z MNa+ 628. Los iones fragmentos 628 y 570 se fragmentaron nuevamente para producir el mismo fragmento: C1-C14 m/z MNa^{+} 320. La masa de este fragmento C1-C14 es mayor en 14 unidades de masa que el fragmento equivalente resultado de la fragmentación del aducto de sodio de la 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-O-desmetilo rapamicina (Compuesto 1), consistente con la oxidación en C9.
Ejemplo 27 Aislamiento del producto de la fermentación de S. hygroscopicus MG2-10 (pSGsetKMNOLh)
Se obtuvo 9-Deoxo-27-O-desmetil-39-O-desmetilo rapamicina mediante la conjugación de la cepa MG2-10 de S. hygroscopicus con pSGsetKMN/OL_{his}, como se describió en el Ejemplo 1, y el aislamiento de los productos generados en la fermentación. Esto demostró que era posible la complementación de la deleción de rapK, rapM, rapN/O y rapL en la cepa MG2-10 con la producción de análogos de rapamicina que carecen de alguna de las modificaciones post-PKS.
Se fermentó S. hygroscopicus MG2-10 (pSGsetKMN/OL_{his}) (ver Materiales y Métodos), se extrajo y se aisló empleando el Método (B), como se describe en Materiales y Métodos. El sistema de solvente isocrático empleado para la HPLC preparativa fue 60% de CH3CN/H2O. La 9-Deoxo-27-O-desmetil-39-O-desmetilo rapamicina (Compuesto 8) posee las características siguientes:
Rendimiento del aislamiento: 6 mg
Peso molecular: 872
Fórmula molecular: C_{49}H_{77}NO_{12}
UV (mediante detección de arreglo de diodos durante el análisis de HPLC): 268 nm, 278 nm, 288 nm
MS electrospray: m/z para MNa+ = 894, m/z para M-H = 870
Fragmentación MS: El aducto de sodio (m/z 894) se fragmentó para proporcionar tres fragmentos: C8-C42, m/z MNa^{+} 765; C1-C27, m/z MNa+ 586; C28-C42+C1-C14, m/z MNa+ 614. Los iones fragmentos 614 y 586 se fragmentaron nuevamente para producir el mismo fragmento: C1-C14 m/z MNa^{+} 306. La masa de este fragmento C1-C14 es idéntica a la obtenida para el aducto de sodio de la 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-O-desmetilo rapamicina. El compuesto es 9-deoxo. El fragmento C1-C27 posee una masa mayor en 30 unidades que la del fragmento equivalente de la 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-O-desmetilo rapamicina, consistente con una hidroxilación y una metilación; RapM metila el grupo hidroxilo en C16 (ver Ejemplo 22 para pSGsetKIL_{his}, junto al Ejemplo 23 pSGsetKIML_{his}) y RapN en combinación con RapO hidroxila C27, de manera que los datos son consistentes con que el compuesto sea la 9-deoxo-27-O-desmetil-39-O-desmetilo rapamicina (Compuesto 8).
Ejemplo 28 Aislamiento del producto de la fermentación de S. hygroscopicus MG2-10 (pSGsetKIJLh)
Se obtuvo 16-O-desmetil-27-desmetoxi-rapamicina mediante la conjugación de la cepa MG2-10 de S. hygroscopicus con pSGsetKIJL_{his}, como se describió en el Ejemplo 1, y el aislamiento de los productos generados en la fermentación. Esto demostró que era posible la complementación de la deleción de rapK, rapI, rapJ y rapL en la cepa MG2-10 con la producción de análogos de rapamicina que carecen de alguna de las modificaciones post-PKS.
Se fermentó S. hygroscopicus MG2-10 (pSGsetKMN/OL_{his}) (ver Materiales y Métodos), se extrajo y se aisló empleando el Método (B), como se describe en Materiales y Métodos. El sistema de solvente isocrático empleado para la HPLC preparativa fue 60% de CH3CN/H2O. La 16-O-desmetil-27-desmetoxi-rapamicina (Compuesto 12) posee las características siguientes:
Rendimiento del aislamiento: 11 mg
Peso molecular: 870
Fórmula molecular: C_{49}H_{75}NO_{12}
UV (mediante detección de arreglo de diodos durante el análisis de HPLC): 268 nm, 278 nm, 288 nm
MS electrospray: m/z para MNa+ = 892, m/z para M-H = 868
Ejemplo 29 Aislamiento del producto de la fermentación de S. hygroscopicus MG2-10 (pSGsetKL_{his})
Se obtuvo 9-Deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-O-desmetilo rapamicina mediante la conjugación de la cepa MG2-10 de S. hygroscopicus con pSGsetKL_{his}, como se describió en el Ejemplo 1, y el aislamiento de los productos generados en la fermentación. Esto demostró que era posible la complementación de la deleción de rapK y rapL en la cepa MG2-10 con la producción de análogos de rapamicina que carecen de alguna de las modificaciones post-PKS.
Se fermentó S. hygroscopicus MG2-10 (pSGsetKL_{his}) (ver Materiales y Métodos), se extrajo y se aisló empleando el Método (B), como se describe en Materiales y Métodos.
El sistema de solvente isocrático empleado para la HPLC preparativa fue 60% de CH3CN/H2O. La 9-Deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-O-desmetilo rapamicina (Compuesto 1) posee las características siguientes:
Rendimiento del aislamiento: 24 mg
Peso molecular: 842
Fórmula molecular: C_{48}H_{75}NO_{11}
UV (mediante detección de arreglo de diodos durante el análisis de HPLC): 268 nm, 278 nm, 288 nm
MS electrospray: m/z para MNa+ = 864, m/z para M-H = 840
Fragmentación MS: El aducto de sodio (m/z 864,5) se fragmentó para proporcionar tres fragmentos: C8-C42, m/z MNa^{+} 735; C1-C27, m/z MNa+ 556; C28-C42+C1-C14, m/z MNa+ 614, C1-C14, m/z MNa^{+} 306. Se determinó la m/z esperada para estos fragmentos mediante comparación con la fragmentación reportada para la rapamicina (J. A Reather, Ph.D. Dissertation, University of Cambridge, 2000). Los fragmentos poseen la misma m/z predicha para la fragmentación de la 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-O-desmetilo rapamicina.
Ejemplo 30 Aislamiento del producto de la fermentación de S. hygroscopicus MG2-10 suplementado con ácido ciclohexano carboxílico
Se obtuvo 9-Deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-desmetoxi-rapamicina al suplementar ácido ciclohexano carboxílico a S. hygroscopicus MG2-10 y aislar los productos generados en la fermentación. La mutasíntesis resultante demostró que es posible complementar químicamente mediante la conjugación de la cepa MG2-10 en ausencia del iniciador natural endógeno, con el resultado de la producción de un análogo de rapamicina que carece de modificaciones post-PKS.
Se fermentó S. hygroscopicus MG2-10 (pSGsetKL_{his}) (ver Materiales y Métodos), se suplementó (ver Materiales y Métodos) y se extrajo y aisló empleando el Método (B), como se describe en Materiales y Métodos.
El sistema de solvente isocrático empleado para la HPLC preparativa fue 60% de CH3CN/H2O. La 9-Deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-desmetoxi-rapamicina (Compuesto 47) posee las características siguientes:
Rendimiento del aislamiento: 12 mg
Peso molecular: 826
Fórmula molecular: C_{48}H_{75}NO_{10}
UV (mediante detección de arreglo de diodos durante el análisis de HPLC): 268 nm, 278 nm, 288 nm
MS electrospray: m/z para MNa+ = 848,5, m/z para M-H = 825
Fragmentación MS: El aducto de sodio (m/z 848,5) se fragmentó para proporcionar cuatro fragmentos: C8-C42, m/z MNa^{+} 735; C1-C27, m/z MNa+ 556; C28-C42+C1-C14, m/z MNa+ 598, C1-C14, m/z MNa^{+} 306. Estos datos ilustran que la diferencia entre el Compuesto 47 y la 9-Deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-O-desmetilo rapamicina (Compuesto 1) se localiza en la región de C28-C42. Este fragmento es menor en 16 unidades de masa para el Compuesto 47 que lo que lo es para el Compuesto 1, lo que es consistente con el hecho de que el Compuesto 47 sea la 9-Deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-desmetoxi-rapamicina.
Ejemplo 31 Aislamiento del producto de la fermentación de S. hygroscopicus MG2-10 (pSGsetKNOLh)
Se obtuvo 9-Deoxo-16-O-desmetil-27-O-desmetil-39-O-desmetilo rapamicina mediante la conjugación de la cepa MG2-10 de S. hygroscopicus con pSGsetKN/OL_{his}, como se describió en el Ejemplo 1, y el aislamiento de los productos generados en la fermentación. Esto demostró que era posible la complementación de la deleción de rapK, rapN/O y rapL en la cepa MG2-10 con la producción de análogos de rapamicina que carecen de alguna de las modificaciones post-PKS.
Se fermentó S. hygroscopicus MG2-10 (pSGsetKN/OL_{his}) (ver Materiales y Métodos), se extrajo y se aisló empleando el Método (B), como se describió en Materiales y Métodos.
El sistema de solvente isocrático empleado para la HPLC preparativa fue 60% de CH3CN/H2O.
La 9-Deoxo-16-O-desmetil-27-O-desmetil-39-O-desmetilo rapamicina (Compuesto 2) posee las características siguientes:
Peso molecular: 858
Fórmula molecular: C_{48}H_{75}NO_{12}
UV (mediante detección de arreglo de diodos durante el análisis de HPLC): 268 nm, 278 nm, 288 nm
MS electrospray: m/z para MK+ = 896, m/z para M-H = 856.
Ejemplo 32 Identificación del producto de la fermentación de S. hygroscopicus MG2-10 (pSGsetKJNOLh)
Se obtuvo 16-O-desmetil-27-O-desmetil-39-O-desmetilo rapamicina mediante la conjugación de la cepa MG2-10 de S. hygroscopicus con pSGsetKJN/OL_{his}, como se describió en el Ejemplo 1, y el análisis de los productos generados en la fermentación. Esto demostró que era posible la complementación de la deleción de rapK, rapJ, rapN/O y rapL en la cepa MG2-10 con la producción de análogos de rapamicina que carecen de alguna de las modificaciones post-PKS.
Se trató el sobrenadante de la fermentación (1 mL) como se describe en el Método (B) de extracción, aislamiento y análisis, descrito en Materiales y Métodos. El cromatograma de HPLC (280 nm) contenía un pico que poseía el trieno característico de la rapamicina (268 nm, 278 nm, 288 nm). Este pico no se observó en el cromatograma de la muestra de control extraída de S. hygroscopicus MG2-10 en ausencia del casete. La LC/MS (ver Materiales y Métodos, Método B) del pico correspondiente al análogo novedoso de la rapamicina produjo iones de m/z 895 (mNa^{+}) y 871 (M-H). Estos iones confirman que la masa molar del análogo novedoso de la rapamicina es 872, superior en 30 unidades de masa a la 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-O-desmetilo rapamicina (Compuesto 1), lo que es consistente con la oxidación en C9 (rapJ) y la hidroxilación en C27 (rapN/O). Estos datos son consistentes con el hecho de que el compuesto sea la 16-O-desmetil-27-O-desmetil-39-O-desmetilo rapamicina (Compuesto 7).
Ejemplo 33 Aislamiento del producto de la fermentación de S. hygroscopicus MG2-10 (pSGsetKJNOLh)
Se obtuvo 16-O-desmetil-27-O-desmetil-39-O-desmetilo rapamicina mediante la conjugación de la cepa MG2-10 de S. hygroscopicus con pSGsetKJN/OL_{his}, como se describió en el Ejemplo 1, y el aislamiento de los productos generados en la fermentación. Esto demostró que era posible la complementación de la deleción de rapK, rapJ, rapN/O y rapL en la cepa MG2-10 con la producción de un análogo de rapamicina que carece de alguna de las modificaciones post-PKS.
Se fermentó S. hygroscopicus MG2-10 (pSGsetKJN/OL_{his}) (ver Materiales y Métodos), se extrajo y se aisló empleando el Método (B), como se describió en Materiales y Métodos.
El sistema de solvente isocrático empleado para la HPLC preparativa fue 60% de CH3CN/H2O.
La 9-Deoxo-16-O-desmetil-27-O-desmetil-39-O-desmetilo rapamicina (Compuesto 2) posee las características siguientes:
Peso molecular: 872
Fórmula molecular: C_{48}H_{73}NO_{13}
UV (mediante detección de arreglo de diodos durante el análisis de HPLC): 268 nm, 278 nm, 288 nm
MS electrospray: m/z para MK+ = 895, m/z para M-H = 871
Ejemplo 34 Identificación del producto de la fermentación de S. hygroscopicus MG2-10 (pSGsetKIJNOQLh)
Se obtuvo 16-O-desmetilo rapamicina mediante la conjugación de la cepa MG2-10 de S. hygroscopicus con pSGsetKIJN/OQL_{his}, como se describió en el Ejemplo 1, y el análisis de los productos generados en la fermentación. Esto demostró que era posible la complementación de la deleción de rapK, rapI, rapJ, rapN/O, rapQ y rapL en la cepa MG2-10 con la producción de un análogo de rapamicina que carece de la mutilación en C16-OH. Además, esto identificó de manera clara a RapQ como la O-metiltransferasa dependiente de SAM, que es responsable de la metilación de C27-OH.
Se fermentó S. hygroscopicus (pSGsetKIJN/OQL_{his}) (ver Materiales y Métodos), se extrajo y se analizó empleando el Método (B) como se describió en Materiales y Métodos.
Se trató el sobrenadante de la fermentación (1 mL) como se describe en el Método (B) de extracción, aislamiento y análisis, descrito en Materiales y Métodos. El cromatograma de HPLC (280 nm) contenía un pico que poseía el trieno característico de la rapamicina (268 nm, 278 nm, 288 nm). Este pico no se observó en el cromatograma de la muestra de control extraída de S. hygroscopicus MG2-10 en ausencia del casete. La LC/MS (ver Materiales y Métodos, Método B) del pico correspondiente al análogo novedoso de la rapamicina produjo iones de m/z 923 (mNa^{+}) y 899 (M-H). Estos iones confirman que la masa molar del análogo novedoso de la rapamicina es 900, inferior en 14 unidades de masa a la rapamicina. Se ha establecido ya que el único gen post-PKS no incluido en el casete, rapM, actúa para mutilar el C16-OH, por tanto, el análogo novedoso de la rapamicina es la 16-O-desmetilo rapamicina (Compuesto 20), y se muestra que rapQ es funcional y que actúa para O-metilar en C27.
Ejemplo 35 Bioensayo de los análogos de rapamicina
(1) = 9-deoxo-16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-O-desmetilo rapamicina (prerapamicina)
(6) = 9-deoxo-16-O-desmeti-27-desmetoxi-rapamicina
(16) = 9-deoxo-27-desmetoxi-rapamicina,
(3) = 16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-O-desmetilo rapamicina
(9) = 9-deoxo-16-O-desmetil-27-O-desmetilo rapamicina
(8) = 9-deoxo-27-O-desmetil-39-O-desmetilo rapamicina
Líneas celulares cancerosas
La inhibición del crecimiento de líneas celulares tumorales humanas adherentes de tumores maligno sólidos HT29 (colon) y MCF-7 (mama) se ensayó in vitro empleando un ensayo de MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio) empleando placas de microtítulo (Sieuwerts, A.M., et al., 1995). Todas las líneas celulares se obtuvieron bien a partir de ATCC (American Type Culture Collection), o bien de ECACC (European Collection of Cell Cultures).Todas las líneas celulares se cultivaron a partir de almacenamientos congelados y se les hizo un pase al menos una vez antes de su empleo en RPMI 1640. Se colectaros las células a partir de los cultivos subconfluentes empleando tripsinización mínima. Se diluyeron las células hasta la densidad apropiada para cada línea celular (en dependencia del tiempo de duplicación del número celular) en RPMI 1640, y se plantaron en 60 pocillos de una placa de 96 pocillos en un volumen de 100 \mul por pocillo (o sea, no se emplearon los pocillos externos de la placa). Se incubaron las placas durante toda la noche a 37ºC. A continuación de esta incubación, se realizaron diluciones de referencia en escala log y se añadieron las sustancias de ensayo en 900 \mul por pocillo, se emplearon 6 réplicas para ensayar todos los compuestos de prueba, los compuestos de referencia y los controles de medio. Se incubaron las placas durante otro período de 72 horas antes del análisis. Se añadió MTT (5 mg/ml) a cada pocillo y se reincubaron las placas durante 3-4 h. Se eliminó de las placas el MTT que no había reaccionado y se disolvieron los cristales de fromazan formados a partir del MTT en DMSO y se leyó la absorbancia característica a 570 nm. Se calculó la concentración (nM) de cada compuesto de prueba y de cada compuesto de referencia, que dio como resultado un 50% de inhibición máxima (IC_{50}) para cada línea celular y se reportó junto al porcentaje máximo de inhibición observado (I_{m}), ver Tabla XIII. Para referencia, la rapamicina posee un IC_{50} de 200 nM y un I_{m} de 40% en la línea celular HT29 y un IC_{50} de 0,03 nM y un I_{m} de 56% en la línea celular MCF-7.
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TABLA XIII
63
Reacción mixta de linfocitos
Desarrollada originalmente para evaluar la compatibilidad de tejidos con anterioridad a los alotrasplantes, la MLR ofrece un modelo establecido para la reacción inmune in Vitro (SOULILLOU, J.P., et al. (1975); T. Meo. "Immunological Methods", L. Lefkovits and B. Pernis, Eds., Academic Press, N.Y. pp. 227-239 (1979)). La MLR se llevó a cabo mediante la mezcla de linfocitos esplénicos aislados a partir de ratones C57BU6 (5x10^{5} células) con linfocitos esplénicos inhibidos a partir de ratones CBA (2,5x10^{5} células). Los linfocitos CBA inhibidos inducen una respuesta proliferativa en linfocitos C57BU6 y esto se determinó mediante la incorporación de timidita (^{3}H) al ADN, como medida de la proliferación de linfocitos esplénicos aislados a partir de ratones C57BL/6. Se ensayó el efecto antiproliferativo para analizar la presencia de diluciones en escala log de compuestos de referencia, compuestos de prueba y controles de medios durante un período de 72 h a 37ºC. Se calculó la concentración de cada compuesto de prueba y de cada compuesto de referencia que inhibía la proliferación de los linfocitos en 50% (IC_{50}), en comparación con la proliferación del control, para cada línea celular, y se reportó como el cociente de la concentración de rapamicina requerida para inhibir la proliferación de los linfocitos en 50% (rIC_{50}), ver Tabla XIV.
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TABLA XIV
64
Ensayo antifúngico
Las actividades antifúngicas comparativas de los compuestos de prueba y de referencia se determinaron con los hongos patogénicos Candida albicans DSM5816, Candida albicans DSM 1386 y Candida glabrata DSM 11226. Esto se llevó a cabo empleando una adaptación de las placas de microtitulación del Método NCCLS de Referencia para la prueba de susceptibilidad a la dilución del caldo de cultivo antifúngico para levaduras: Estándar aprobado (M27-A, vol. 17 No. 9. (1997). Se inocularon las cepas de levadura (10^{4} cfu/ml) a medio RPMI 1640 que contenía 0,165 mM de MOPS, pH 7. Se determinó el crecimiento en presencia de diluciones de escala log de los compuestos de referencia, los compuestos de prueba y los controles de los medios luego de la incubación con agitación a 37ºC, durante 24 h. Se determinaron la concentración inhibitoria mínima (MIC) y la actividad fungicida mínima (MFC) para los compuestos de prueba y se expresó como el cociente de la concentración inhibitoria mínima de la rapamicina (rMIC respectivamente), ver Tabla XV.
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TABLA XV
65 
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Gregory, Matthew A 
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Gaisser, Sabine 
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Petkovic, Hrvoje 
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Moss, Steven 
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<120> Producción de poliquétidos y otros productos naturales
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
taaactagtc catctgagag tttcatatgg ccctattctg cccagccgct ctagaaat 
\hfill
58 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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<400> 36
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atttctagag cggctgggca gaatagggcc atatgaaact ctcagatgga ctagttta 
\hfill
58 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggcatatga ggcaattgac tccgccggtc acggcaccgt actgcc 
\hfill
46 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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<400> 38
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggtctaga ggtcacgcca ccacaccctc gatctcgacc 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
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<211> 44
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggcatatgt cgacgaccga tcagggtgag accggaaagg cctg 
\hfill
44 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggtctaga ggtcagtcct ggggttcgag aagctcgccg gtctcctt 
\hfill
48 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggcatatga tccaacccga cgtcgtgacc gccttcacag cgg 
\hfill
43 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggtctaga ggtcacacgc ggacggcgat ctggtgccga tagg 
\hfill
44 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggcatatgc agaccaaggt tctgtgccag cgtgacatca ag 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggtctaga ggtcactaca gcgagtacgg atcgaggacg tcctcgggcg 
\hfill
50 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggagatctca gcgagtacgg atcgaggacg tcctcgggcg 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggcatatga gcaccgaagc tcagcaagag agcacgccca ccgcacgct 
\hfill
49 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggtctaga ggtcactccg ctccccaggt gacccggagc tcggc 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggcatatga gcgcgtccgt gcagaccatc aagctgcc 
\hfill
38 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggtctaga ggtcaggcgt ccccgcggcg ggcgacgacc t 
\hfill
41 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
catatgttgg aattgggtac ccgcctg 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctagacgct cacgcctcca gggtg 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
500 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggtctagat ccggacgaac gcatcgatta attaaggagg acacata 
\hfill
47 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggcatatga ccgatgccgg acgcca 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggtctaga tcacgccacc atgccttcga 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caaagcttcc tggcgcggtt cggccggca 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tggcatgccc ttccccgccg ttccctggc 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tggcatgccc ccgccgagct gacctggaa 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gttctagagc ttacgcgtga tgtcgaacg 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctctagagc ccgcggctcg ccggacacg 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cccctgcagg cgtccggcat cggtcatcag 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgcctgcagg gatacggtcc gccgggtctg c 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccaagcttgt acggttcgcc acgggcgtgc 
\hfill
30

Claims (22)

1. Un método para la generación de análogos de ligandos de FKBP que incorpora una unidad de partida no natural, dicho método comprende:
(a) la generación de una cepa recombinante en la que al menos el homólogo de rapK se ha suprimido o inactivado; y
(b) la suplementación de una unidad de partida no natural a dicha cepa.
2. El método de la reivindicación 1, que incluye, de manera adicional, la supresión de uno o más genes auxiliares.
3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, que incluye, de manera adicional el restablecimiento, mediante complementación, de uno o más de los genes suprimidos.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 3, que incluye, de manera adicional, el paso de aislamiento y purificación de los análogos de los ligandos de FKBP generados.
5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 4, donde dicha unidad de partida no natural se selecciona del grupo que consta de: ácido 2-norbornano carboxílico; ácido 2-(cis/trans)-hidroxiciclohexano carboxílico; ácido 3-(cis/trans)-hidroxiciclohexano carboxílico; ácido 4-(cis/trans)-hidroxiciclohexano carboxílico; ácido 2-(cis/trans)-metilciclohexano carboxílico; ácido 4-(cis/trans)-metilciclohexano carboxílico; ácido 3-(cis/trans)-metoxiciclohexano carboxílico; ácido 4-(cis/trans)-metoxiciclohexano carboxílico; ácido 4-oxo ciclohexano carboxílico; ácido 2-oxo ciclohexano carboxílico; ácido 4-trans-n-pentilciclohexano carboxílico; ácido 2-trans-aminociclohexano carboxílico; ácido 4-cis-aminociclohexano carboxílico ácido; 4-(cis/trans)-aminometilciclohexano carboxílico; ácido ciclopentano carboxílico; ácido ciclobutano carboxílico; ácido 1-metilciclohexano carboxílico; ácido 3-trans-hidroxi-4-cis-fluorociclohexano carboxílico y ácido 4-trans-hidroxi-3-cis-fluorociclohexano carboxílico; ácido 3-cis-hidroxi-4-trans-fluorociclohexano carboxílico y ácido 4-cis-hidroxi-3-trans-fluorociclohexano carboxílico; ácido 3-cis-hidroxi-4-trans-clorociclohexano carboxílico y ácido 4-cis-hidroxi-3-trans-clorociclohexano carboxílico; ácido 3-trans-hidroxi-4-cis-clorociclohexano carboxílico y ácido 4-trans-hidroxi-3-cis-clorociclohexano carboxílico; ácido 3-trans-ciclohexeno oxido carboxílico; ácido 3-cis-ciclohexeno oxido carboxílico; ácido 3,4-cis-dihidroxiciclohexano carboxílico y ácido 3,4-trans-dihidroxiciclohexano carboxílico; ácido ciclohexanoacético; ácido ciclohexanopropiónico y ácido 4-cis/trans-ter-butilciclohexano carboxílico o los ésteres simples o sales de los mismos.
6. El método según la reivindicación 5, donde dicha unidad de partida no natural se selecciona del grupo que consta de: ácido 3-(cis/trans)-hidroxiciclohexano carboxílico; ácido 4-(cis/trans)-hidroxiciclohexano carboxílico; ácido 3-(cis/trans)-metoxiciclohexano carboxílico; ácido 4-(cis/trans)-metoxiciclohexano carboxílico; ácido 4-oxo ciclohexano carboxílico; ácido ciclobutano carboxílico; ácido 3-trans-hidroxi-4-cis-fluorociclohexano carboxílico y ácido 4-trans-hidroxi-3-cis-fluorociclohexano carboxílico; ácido 3-cis-hidroxi-4-trans-fluorociclohexano carboxílico y ácido 4-cis-hidroxi-3-trans-fluorociclohexano carboxílico; ácido 3-cis-hidroxi-4-trans-clorociclohexano carboxílico y ácido 4-cis-hidroxi-3-trans-clorociclohexano carboxílico; ácido 3-trans-hidroxi-4-cis-clorociclohexano carboxílico y ácido 4-trans-hidroxi-3-cis-clorociclohexano carboxílico; ácido 3-trans-ciclohexeno oxido carboxílico; ácido 3-cis-ciclohexeno oxido carboxílico; ácido 3,4-cis-dihidroxiciclohexano carboxílico y ácido 3,4-trans-dihidroxiciclohexano carboxílico; ácido ciclohexanopropiónico; ácido 4-cis/trans-ter-butilciclohexano carboxílico, o ésteres simples o sales de los mismos.
7. El método según la reivindicación 5, siempre que el iniciador no natural con el que se suplementa dicha cepa recombinante no sea: ácido ciclohexano carboxílico, ácido 3-cis,4-trans-dihidroxiciclohexano carboxílico, ácido 1-ciclohexeno carboxílico, ácido 3-ciclohexeno carboxílico, ácido cicloheptano carboxílico, ácido 3-(cis/trans)-metilciclohexano carboxílico, ácido 4-(cis/trans)-metilciclohexano carboxílico, ácido 1-ciclohepteno carboxílico o ácido 5-cis-hidroxil-3-ciclohexeno carboxílico.
8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 7, en el que la cepa recombinante del inciso (a) se genera según un método que comprenda:
(a) la construcción de un plasmidio de conjugación de deleción en una cepa de E. coli que sea dam^{-}, dcm^{-} o dam^{-} y dcm^{-}.
(b) la generación de esporas a partir de dicha cepa hospedera, adecuadas para la conjugación, en la que dicha cepa se cultiva en una humedad entre 10% y 40% y las esporas se cosechan entre los días 5 y 30;
(c) la conjugación de la cepa de E. coli del paso (a) con las esporas del paso (b) en un medio que incluye, por litro:
i)
0,5 g a 5 g de polvo de maíz pulido,
ii)
0,1 g a 5 g de extracto de levadura,
iii)
0,1 g a 10 g de carbonato de calcio; y
iv)
0,01 g a 0,5 g de sulfato de hierro;
dicho medio puede contener de modo adicional agar BACTO y almidón y puede secarse para producir una pérdida en peso de 1-20%; y
(d) de manera opcional, el cultivo de la cepa recombinante bajo condiciones adecuadas para la producción de poliquétidos.
9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde dicha cepa se selecciona entre el grupo que consta de: Streptomyces hygroscopicus subsp. hygroscopicus NRRL 5491, Actinoplanes sp. N902-109 FERM BP-3832, Streptomyces sp. AA6554, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6475 ATCC 14891, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6678 ATCC 55087, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6674, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus ATCC 55276, Streptomyces hygroscopicus subsp. ascomyceticus ATCC 14891, Streptomyces tsukubaensis No.9993 FERM BP-927, Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis, Streptomyces sp. DSM 4137, Streptomyces sp. DSM 7348, Micromonospora n.sp. A92-306401 DSM 8429 y Streptomyces sp. MA 6858 ATCC 55098.
10. El método de la reivindicación 9, donde las cepas se seleccionan entre el grupo que consta de: S. hygroscopicus subsp. hygroscopicus NRRL 5491 y S. hygroscopicus var. ascomyceticus ATCC 14891.
11. El método de la reivindicación 10, donde la cepa es S. hygroscopicus subsp. hygroscopicus NRRL 5491 productora de rapamicina.
12. El método según la reivindicación 3, donde el proceso de restablecer los genes suprimidos incluye:
(a) la construcción de un casete génico que contenga uno o más de los genes suprimidos y
(b) la transformación de dicha cepa recombinante que contiene clusters de biosíntesis que codifican para ligandos de FKBP con dicho casete génico.
13. El método según la reivindicación 12, donde dicho casete génico se ensambla directamente en un vector de expresión.
14. El método según las reivindicaciones 12 ó 13, donde la complementación es homóloga.
15. El método según las reivindicaciones 12 ó 13, donde la complementación es heteróloga.
16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 15, donde dicho gen o genes auxiliares suprimidos o inactivados se seleccionan entre el grupo que consta de genes de suministro de la unidad de partida, genes de suministro del precursor aminoácido, monooxigenasas citocromo P-450, ferredoxinas y O-metiltransferasas dependientes de SAM.
17. El método de la reivindicación 16, donde los genes suprimidos o inactivados se seleccionan entre el grupo que consta de rapL, rapN, rapO, rapM, rapQ, rapI y rapJ.
18. Una cepa recombinante que contiene clusters de biosíntesis que codifican para ligandos de FKBP, donde al menos el homólogo de rapK se ha suprimido o inactivado.
19. La cepa recombinante, según la reivindicación 18, donde al menos el homólogo de rapK se ha suprimido o inactivado en una cepa seleccionada entre el grupo que consta de Streptomyces hygroscopicus subsp. hygroscopicus NRRL 5491, Actinoplanes sp. N902-109 FERM BP-3832, Streptomyces sp. AA6554, Streptomyces hygroscopicus var. Ascomyceticus MA 6475 ATCC 14891, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6678 ATCC 55087, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6674, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus ATCC55276, Streptomyces hygroscopicus subsp. ascomyceticus ATCC 14891, Streptomyces tsukubaensis No.9993 FERM BP-927, Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis, Streptomyces sp. DSM 4137, Streptomyces sp. DSM 7348, Micromonospora n.sp. A92-306401 DSM 8429 y Streptomyces sp. MA 6858 ATCC 55098.
20. La cepa recombinante según la reivindicación 19, donde las cepas se seleccionan entre el grupo que consta de S. hygroscopicus subsp. hygroscopicus NRRL 5491 y S. hygroscopicus var. ascomyceticus ATCC 14891.
21. La cepa recombinante según la reivindicación 20, donde la cepa es el productor de rapamicina S. hygroscopicus subsp. hygroscopicus NRRL 5491.
22. La cepa recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, donde otros genes auxiliares suprimidos o inactivados se seleccionan entre el grupo que consta de: rapL, rapN/O, rapQ, rapM, rapI y rapJ, donde dicha deleción no sea rapQrapN/OrapMrapL.
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