CN101302550A

CN101302550A - 聚酮化合物和其它天然产物的产生

Info

Publication number: CN101302550A
Application number: CNA2008100823978A
Authority: CN
Inventors: M·A·格雷戈里; S·盖瑟; H·佩特克维奇; S·莫斯
Original assignee: Biotica Technology Ltd
Current assignee: Biotica Technology Ltd
Priority date: 2002-07-16
Filing date: 2003-07-16
Publication date: 2008-11-12
Also published as: CN101302225A; GB0216509D0

Abstract

本发明涉及聚酮化合物和其他天然产物的产生，还涉及化合物文库和分别的新化合物。一个重要的方面是新FKBP－配体类似物的分离和潜在用途以及产生这些化合物的宿主细胞。本发明尤其涉及用于有效转化产生FKBP类似物的菌株的方法和重组细胞，其中克隆基因或基因盒被表达以产生新化合物如聚酮化合物(特别是雷帕霉素)FKBP－配体类似物，还涉及它们的制备方法和在其中应用的工具(例如核酸、载体、基因盒和遗传修饰的菌株)。

Description

聚酮化合物和其它天然产物的产生

本申请是中国专利申请03816916.9的分案申请，原申请的申请日是2003年7月16日，发明名称是“聚酮化合物和其它天然产物的产生”。

发明领域

本发明涉及聚酮化合物(polyketides)和其他天然产物的产生，还涉及化合物文库和分别的新化合物。一个重要的方面是新FKBP-配体类似物的分离和潜在用途以及产生这些化合物的宿主细胞。本发明尤其涉及用于有效转化产生FKBP类似物的菌株的方法和重组细胞，其中克隆基因或基因盒被表达以产生新化合物如聚酮化合物(特别是雷帕霉素)FKBP-配体类似物，还涉及它们的制备方法和在其中应用的工具(例如核酸、载体、基因盒和遗传修饰的菌株)。

发明背景

雷帕霉素(西罗莫司(sirolimus))(图1)是由吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)NRRL 5491(Sehgal等，1975；Veina等，1975；美国专利号：3,929,992；美国专利号：3,993,749)产生的带有连接到六氢吡啶羧酸内酯的1，2，3-三羰基部分的亲脂性大环内酯(Paiva等，1991)。其它相关大环内酯(图2)包括FK506(tacrolimus)(Schreiber和Crabtree，1992)、FK520(子囊霉素或immunomycin)(Wu等，2000)、FK525(Hatanaka H，等，1989)、FK523(Hatanaka，H.，等，1988)、antascomicins(Fehr，T.，等，1996)和meridamycin(Salituro等，1995)。对于本发明，雷帕霉素采用McAlpine等(1991)的编号规定描述，其优于Findlay等(1980)或化学文摘(11^thCumulative Index，1982-1986 p60719CS)的编号规定。

雷帕霉素作用的多方面模式显示出了该化合物的药理学价值，并强调了分离该药物的新型衍生物的必要性。雷帕霉素显示出温和的抗真菌活性，主要抗假丝酵母(Candida)种，但也抗丝状真菌(Baker等，1978；Sehgal等，1975；Vézina等，1975；美国专利号：3,929,992；美国专利号：3,993,749)。雷帕霉素在多种细胞类型中通过靶向信号转导途径抑制细胞增殖，例如通过抑制细胞周期从G1到S-期的进行(Kuo等，1992)的信号转导途径。在T细胞内，雷帕霉素抑制源自于IL-2受体的信号转导，并抑制T细胞的后续自动增殖而导致抑制免疫反应。雷帕霉素的抑制效应并不限于T细胞，因为雷帕霉素抑制许多哺乳动物细胞类型的增殖(Brunn等，1996)。因此，在防止器官同种异体移植物的排斥中以及在治疗自身免疫性疾病中(Kahan等，1991)，具有确定的或预计治疗，雷帕霉素是有效的免疫抑制剂。它引起的负作用比标准的抗排斥治疗的低(Navia，1996)。40-O-(2-羟基)乙基-雷帕霉素(SDZ RAD，Certican，Everolimus)为雷帕霉素的半合成类似物，其显示出免疫抑制的药理学作用(Sedrani，R.等，1998；U.S.5,665,772)。目前，药物的临床功效正在第三期临床试验中(Kirchner等，2000)。在体外试验中，雷帕霉素酯CCI-779(Wyeth-Ayerst)抑制细胞生长，在体内试验中，其抑制肿瘤生长(Yu等，2001)。目前，药物正用于第三期临床试验。深入研究的领域有(Kahan和Camardo，2001)：雷帕霉素在慢性银屑病治疗中的价值(Kirby和Griffiths，2001)、例如在PC12细胞中刺激神经突瘤的功效的潜在应用(Lyons等，1994)、在受到机械损伤后通过血管和平滑肌细胞阻碍对细胞因子的增殖反应(Gregory等，1993)以及其在防止同种异体移植物纤维化中的作用(Waller和Nicholson，2001)。最近报导显示出，在器官移植患者中，雷帕霉素对进行长期免疫抑制治疗患者的癌症发生率比其它免疫抑制疗法低，并且该降低的癌症发生率是因为血管生成的抑制(Guba等，2002)。已报道了亲免素配基的亲神经活性与它们的免疫抑制的活性无关(Steiner等，1997)，并报道了如在专利申请WO01/03692中略述的神经生长刺激受成熟类固醇受体复合体的破坏而提高。已报道了例如高血脂和血小板减少症以及潜在的致畸效应的负作用(Hentges等，2001；Kahan和Camardo，2001)。

总共7个丙酸和7个乙酸单位通过头尾缩合到莽草酸衍生的环己烷羧酸起始单元合成雷帕霉素的聚酮化合物骨架(Paiva等，1991)。L-赖氨酸衍生的亚氨基酸、六氢吡啶羧酸通过酰胺键缩合到聚酮化合物骨架的最后一个醋酸上(Paiva等，1993)，然后进行内酯化作用以形成大环。已测定了包含生物合成基因簇的107kb基因组区序列(Schwecke等，1995)。对开放阅读框的分析揭示了编码模块(modular)聚酮化合物合成酶(PKS)的三个大基因(Aparicio等，1996；Schwecke等，1995)。在PKS基因之间有编码具有与非核糖体肽合成酶的激活区相似序列蛋白的rapP基因，且认为其起类似作用(

等，1997)。编码PKS基因的区域位于编码认为对于雷帕霉素的合成是必须的酶的24个额外开放阅读框的两侧(Molnár等，1996)。这些包括以下的聚酮化合物后修饰酶：两个细胞色素P-450单加氧酶，称为RapJ和RapN，相关的铁氧化还原蛋白RapO，和三个潜在的SAM-依赖的O-转甲基酶RapI，RapM和RapQ。其它相邻基因在雷帕霉素的调节和输出中具有推定功能(Molnár等，1996)。所述基因簇也包含基因rapL，认为其产物RapL通过L-赖氨酸的环化脱氨作用催化雷帕霉素前体L-六氢吡啶羧酸的形成(Khaw等，1998；Paiva等，1993)。rapL内导入移码突变使这样的体产生突变体，所述突变体不能产生大量雷帕霉素，并用L-六氢吡啶羧酸添加至生长培养基恢复野生型水平的雷帕霉素产量(Khaw等，1998)。雷帕霉素的环己烷环的生物合成前体物源自于莽草酸途径(Lowden等，1996；Lowden等，2001)。其它密切相关的大环内酯类，例如FK506(tacrolimus)(Schreiber和Crabtree，1992)、FK520(子囊霉素或immunomycin)(Wu等，2000)、antascomicin(Fehr，T.，等，1996)和meridamycin(Salituro等，1995)，都有共同的药效团，其与FK506-结合蛋白(FKBPs)相互作用(图2)。因而，可认为雷帕霉素和相关化合物，例如但不限于FK506、FK520、′hyg′、FK523、meridamycin、antascomicin、FK525和筑波霉素，为″FKBP-配基″。已发表了FK506基因簇的部分序列(Motamedi等，1996；Motamedi等，1997；Motamedi和Shafiee，1998)、′hyg′簇(Ruan等，1997)和FK520基因簇的全部序列(Wu等，2000，美国专利号6,150,513)。在这些簇和雷帕霉素生物合成基因簇内的基因之间有显著的同源性，且在酶功能上具有相似性(Motamedi等，1996)。

目前，认为表征的雷帕霉素药理学功能是由称为FKBPs或亲免素的胞内受体的相互作用调节。亲免素(该术语用于表示免疫抑制剂结合蛋白)催化顺式和反式肽基-脯氨酰键的异构化，且属于在极多的有机体内发现的酶的高保守家族(Rosen和Schreiber，1992)。属于亲免素家族的两大组酶表示为FKBPs和亲环素(Schreiber和Crabtree，1992)。在真核T-细胞内的主要细胞内雷帕霉素受体是FKBP12(DiLella和Craig，1991)，且因而产生的复合体特异地与目标蛋白相互作用以抑制细胞的信号转导级联。FK506，一种结构上与雷帕霉素有关的免疫抑制剂，也特异地结合到FKBP12上，但其通过不同机制产生抑制生物体的免疫反应(Chang等，1991；Sigal和Dumont，1992)。雷帕霉素和FK506竞争相同的结合位点，因而当一起应用这两种药物时，FK506与雷帕霉素具有拮抗效应(Cao等，1995)。对FKBP12-雷帕霉素复合体的晶体结构进行分析，已鉴定出称为′结合域′的结合雷帕霉素的药效团(Van Duyne等，1993)(见图1)。与亲免素相互作用需要′结合域′，且对于FK506和雷帕霉素，该结合域由包括酯键、六氢吡啶环、二羰基和半酮缩醇环的C-1到C-14区组成(见图2)。相互作用的特点是许多疏水触点和一些氢键，包括一个连接到环己烷环上的羟基上。六氢吡啶环(C2至N7)最深地埋进于蛋白内，在这里，其由沿着疏水结合孔穴的高度保守芳香族氨基酸残基包围。在FKBP12内，C1和C8羰基都涉及氢键结合，且C9羰基伸进由三个完全保守的芳香族氨基酸残基(一个酪氨酸和两个苯丙氨酸残基)形成的口袋内。与目标蛋白相互作用的亲免素-配基复合体的结构域从FKBP突出。

在酵母内已鉴定出雷帕霉素-FKBP12复合体的目标为TOR(雷帕霉素的目标)(Alarcon等，1999)，且为众所周知哺乳动物蛋白FRAP(FKBP-雷帕霉素相关蛋白)或mTOR(雷帕霉素的哺乳动物目标)(Brown等，1994)。这些蛋白显示出与磷脂酰肌醇3-激酶的磷酸转移酶结构域显著的相似性，且观察到在mTOR的FKBP12-雷帕霉素结合结构域(FRB)内的点突变废除了mTOR激酶活性，这一观察结果给FRB参与激酶结构域的功能提供了证据(Vilella-Bach等，1999)。已得到了FKBP12-雷帕霉素与包含FRB域的截短形式mTOR的晶体结构(Chen等，1995)，并因而定义为雷帕霉素的“效应子”结构域(Choi等，1996；Liang等，1999)。对晶体结构的分析显示出，对比于在雷帕霉素与每个蛋白之间的相互作用，蛋白-蛋白接触是相对受限的。在雷帕霉素和FRB之间没有检测到氢键。相互作用集中于雷帕霉素的三烯区和FRB主要的芳香残基之间的一系列疏水接触处(Liang等，1999)。雷帕霉素的最深埋藏原子是连接到C23上的甲基(见图2)。C23至C34区和雷帕霉素的环己基环与FRB形成了表面疏水接触。在雷帕霉素内的小构象改变明显存在于二元复合体和三元复合体间(Liang等，1999)。

检测了C16甲氧基雷帕霉素类似物的生物学作用的差异，以及其结合到FKBP12的能力之间的差异，并推定了在FKBP12和mTOR之间界面区域的C16取代的位置(Luengo等，1995)。对FKB12与非免疫抑制的28-O-甲基雷帕霉素的晶体结构进行分析，显示出在环己基环的方向性上具有显著差异，这就导致mTOR结合的破坏(Kallen等，1996)。

雷帕霉素在细胞内通过抑制使核糖体蛋白S6磷酸化的p70^S6k激酶，即高等真核细胞内的丝氨酸/苏氨酸激酶，影响信号转导传导级联(Ferrari等，1993；Kuo等，1992)。S6蛋白位于核糖体40S亚单位，且认为其是参与tRNA和mRNA结合的重要功能位点。已推定了用p70^S6k通过S6磷酸化作用对mRNA翻译的调节功能(Kawasome等，1998)。雷帕霉素通过对其它生长相关事件的影响抑制蛋白合成，其中所述事件包括细胞周期蛋白依赖性激酶的活性、cAMP-反应性元件调节子(CREM)的磷酸化和延伸因子结合蛋白4E-BP1(PHAS1)的磷酸化(Hung等，1996)。药物诱使结合到翻译起始因子eIF-4E上的4E-BP1的脱磷酸种类的积聚，进而抑制帽依赖性mRNAs的翻译起始(Hara等，1997；Raught等，2001)。

已描述了神经元内mTOR信号转导和定位蛋白合成之间的关系、对参与翻译调控的蛋白质磷酸化状态的影响、在转录及翻译水平上翻译机器中成分的丰富、氨基酸透性酶活性的调节，以及参与代谢途径的许多酶的转录协调(Raught等，2001)。雷帕霉素敏感的信号转导途径在胚胎大脑发育、学习和记忆形成中也显示出重要的作用(Tang等，2002)。对酵母中TOR蛋白的研究也揭示出了它们在调节营养敏感的信号转导途径内的作用(Hardwick等，1999)。同样地，已确定mTOR为蛋白激酶B作用的直接目标，且在胰岛素信号转导中具有关键作用(Shepherd等，1998；Nave等，1999)。哺乳动物TOR也涉及肌动蛋白细胞骨架的极化和翻译起始的调节(Alarcon等，1999)。在例如细胞周期过程、粘附、细胞幸存和血管生成的癌症发病机理的几个方面中，磷酯酰肌醇3-激酶，例如mTOR，是有功能的(Roymans和Slegers，2001)。

尽管已报道了称为FKBP-相关蛋白(FAP)的FKBP天然配基的候选物，但多数亲免素似乎并不直接涉及免疫抑制的活性，且关于它们的天然配基的了解相对较少，所述FAP例如FAP48和FAP1。在复合体形成期间FAPs与FKBPs的特异相互作用受到剂量依赖方式的雷帕霉素的阻碍(Chambraud等，1996；Kunz等，2000)。亲免素似乎在很大范围的细胞活性中起作用，例如蛋白折叠、蛋白装配和运输、包括热休克蛋白、类固醇受体、离子通道的分子复合体的共同调节、细胞到细胞的相互作用和基因的转录与翻译(Galat 2000；Hamilton和Steiner 1998)。所有亲免素拥有肽基-脯氨酰基顺-反异构化的蛋白折叠性质，且在内质网内(细胞内蛋白质合成的主要位置)发现存在几种亲免素。除了FKBP12(U.S.5,109,112)外，其它的亲免素包括FKBP12.6(U.S.5,457,182)、FKBP13(Hendrickson等，1993；U.S.5,498,597)、FKBP25(Hung和Schreiber，1992；Jin等，1992)、FKBP14.6(U.S.5,354,845)、FKBP52(U.S.5,763,590)、FKBP60(Yem等，1992)和FKBP65(Patterson等，2000)。

多数存在于不同细胞类型的FKBP强调了分离具有潜在改变的结合和/或效应结构域的新型FKBP-配基类似物的应用。

雷帕霉素和雷帕霉素类似物的药物动力学研究已显示出需要开发这样的雷帕霉素化合物，该化合物在溶液中更稳定，对新陈代谢更具抗性，且具有提高的生物利用率。虽然已提出在分子上使用化学的可用位置进行修饰，但是这种方法限制了其应用，因为化学修饰的可用位点是受限制的，且很少具有选择修饰特定位点的能力。产生新雷帕霉素类似物的生物学方法很少成功，这是由于使用生物体操作会遇到的困难(Lomovskaya等，1997；Kieser等，2000)，尽管可获得源自于吸水链霉菌(Schwecke等，1995)的雷帕霉素的生物合成基因簇序列。

已报道了使用分子的化学可用位点合成的一系列雷帕霉素类似物。下列化合物的描述适合于图1中描述的雷帕霉素分子的编号系统。在对于衍生或替代的分子上化学可用位点包括C40和C28的羟基(例如U.S.5,665,772；U.S.5,362,718)、C39和C16的甲氧基(例如W096/41807；U.S.5,728,710)、C32、C26和C9的酮基(例如U.S.5,378,836；U.S.5,138,051；U.S.5,665,772)。靶定三烯的C17、C19和/或C21的氢化作用致使抗真菌活性得以保存，但丧失了免疫抑制性(例如U.S.5,391,730；U.S.5,023,262)。通过衍生已获得分子稳定性的显著提高(例如在C32、C40和/或C28形成肟，U.S.5,563,145，U.S.5,446,048)、新陈代谢的抗性提高(例如U.S.5,912,253)、生物利用度提高(例如U.S.5,221,670；U.S.5,955,457；W098/04279)和前体药物的产量提高(例如U.S.6,015,815；U.S.5,432,183)。但是，化学修饰需要大量的雷帕霉素模板，且作为碱和酸不稳定化合物，操作是有困难的。虽然化学衍生是基团可选择时性的，对于位点选择通常是困难的。因此，化学修饰总是需要大量的保护和去保护的步骤，且在可变产量中产生混合的产物。

已描述了采用例如生物转化和基于噬菌体的遗传修饰的生物方法分离雷帕霉素类似物。从突变菌株和雷帕霉素产生菌中分离出少量代谢物，获得了少量的雷帕霉素类似物。这些菌株通常产量低，且产生雷帕霉素类似物的混合物。已报道了从吸水链霉菌NCIMB 40319的培养基上清液中分离27-O-脱甲基雷帕霉素和27-脱甲氧基雷帕霉素(Box等，1995)。27-O-脱甲基雷帕霉素的抗真菌活性低于雷帕霉素的抗真菌活性，但对FKBP12PPIase活性的抑制似乎增强了。当与雷帕霉素相比时，抑制ConA-刺激的鼠脾T细胞增殖下降和抑制LPS-刺激的鼠脾B细胞增殖下降(Box等，1995)。同样地，雷帕霉素衍生物脯氨酰雷帕霉素、27-O-脱甲基雷帕霉素和27-脱甲氧基雷帕霉素的抗真菌活性低于雷帕霉素的抗真菌活性(Wong等，1998)。在添加细胞色素P450抑制剂和/或添加到培养基内的前体后或在经分离雷帕霉素生物转化之后，也从游动放线菌(Actinoplanes)N902-109中分离出雷帕霉素类似物(16-O-脱甲基雷帕霉素，27-O-脱甲基雷帕霉素，39-O-脱甲基雷帕霉素，16，27-O-二脱甲基雷帕霉素，脯氨酰雷帕霉素，26-O-脱甲基脯氨酰雷帕霉素，9-脱氧雷帕霉素，27-脱甲氧基雷帕霉素，27-脱甲氧基-39-O-脱甲基雷帕霉素，9-脱氧-27-脱甲氧基雷帕霉素，28-脱氢雷帕霉素，9-脱氧-27-脱甲氧基-39-O-脱甲基雷帕霉素)(Nishida等，1995)。然而，这类抑制剂的使用仅仅允许特定酶功能的靶定，且不是位点选择性的。通过这种方法，不可能得到单个可选择的类似物的理想产物。因此产生雷帕霉素类似物的混合物，而不是单个期望产物，也对产量有影响。评估了化合物对混合淋巴细胞反应(MLR)抑制活性，且在丧失了C27或/和C16位的甲基后检测到了对活性几乎没有影响。另外，9-脱氧雷帕霉素显示出活性的更显著的降低，且C27的甲氧基、C28羟基的丧失以及用六氢吡啶基取代脯氨酰基导致能力的降低(Nishida等，1995)。同样地，也报道了雷帕霉素的生物转化和16，39-O-二脱甲基雷帕霉素的分离(WO94/09010)。在用环己基环内修饰的化合物进行细胞增殖试验中，抑制活性的保持使得将分子的该区鉴定为新型帕霉素类似物的目标，所述环己基环内修饰的化合物例如39-O-脱甲基雷帕霉素和例如SDZ RAD的C40修饰。报道了在添加环己烷羧酸、环庚烷羧酸、环己-1-烯羧酸、3-甲基环己烷羧酸、环己-3-烯羧酸、3-羟基环己-4-烯羧酸和环庚-1-烯羧酸到吸水链霉菌培养基后产生的新型雷帕霉素类似物，进而显示雷帕霉素聚酮化合物合成酶在输入模块(loading module)方面的适应性(P.A.S.Lowden，博士论文，剑桥大学，1997)。与天然起始物4，5-二羟基环己-1-烯羧酸竞争产生这些新型雷帕霉素类似物，导致产量降低，并产生混合产物。

已报道了通过噬菌体技术媒介的生物方法分离产生多种雷帕霉素类似物的重组吸水链霉菌菌株(Lomovskaya等，1997)。在添加脯氨酸衍生物条件下，吸水链霉菌rapL缺失突变体合成新型的雷帕霉素类似物脯氨酰雷帕霉素、4-羟基脯氨酰雷帕霉素和4-羟基脯氨酰基-26-脱甲氧基-雷帕霉素(Khaw等，1998)。同样，已鉴定了如WO98/54308中所述的新型雷帕霉素3-羟基-脯氨酰基-雷帕霉素、3-羟基-脯氨酰基-26-脱甲氧基-雷帕霉素和反-3-氮杂-二环[3，1，0]己烷-2-羧酸雷帕霉素。在增殖试验中评估了脯氨酰雷帕霉素和4-羟基脯氨酰基-26-脱甲氧基-雷帕霉素的活性，且后者的抑制活性显著低于雷帕霉素的抑制活性(Khaw等，1998)。当用六氢吡啶羧酸培养时，五个相邻基因rapQONML(负责在C16、C27处的聚酮化合物后修饰和L-六氢吡啶羧酸的产生)的缺失及将它们用新霉素抗性标记取代，在基于噬菌体法的吸水链霉菌ATCC29253导致了16-O-脱甲基-27-脱甲氧基雷帕霉素的产生(Chung等，2001)。使用该技术已显示出对这种缺失突变体没有进行互补。此外，rapM和rapQ的位点特异的功能还不清楚；因而，还不能将雷帕霉素类似物合理设计为C16-OH或C27-OH处需要甲基化。基于噬菌体的方法遭遇到如下更详细描述的很多障碍。其与本专利所揭示的方法相比，获得工程菌株的过程艰难且滞后，并且降低了多功能性。

使用生物方法操纵雷帕霉素修饰基因的常规方法包括在宿主菌株的染色体内对单个基因突变或缺失，或/和单独地或以基因盒方式以同源或异源基因的额外拷贝插入单个基因(WO01/79520，WO 03/048375)。然而，由于在雷帕霉素产生生物体吸水链霉菌的转化中的困难，因而限制了应用该生物方法的新型雷帕霉素类似物的分离。已报道了用质粒DNA转化或接合转移的方法对于雷帕霉素产生菌株是不成功的(Lomovskya等，1997，Schweke等，1995，Kieser等，2000)。本领域内当前状态是使用Lomovskya等(1997)的方法，即基于烈性噬菌体的方法，该方法受到克隆入吸水链霉菌的DNA片段大小的强烈限制(Kieser等，2000)。该技术受最大为6.4kb克隆DNA的转移的限制。因而，当互补使用该技术的缺失突变体时，技术人员受限于除了目的启动子、同源区和抗性标记外包含约2个功能基因。自从1995年，对于雷帕霉素生物合成的基因簇的遗传信息就已是可得到的(Schwecke等，1995)，然而，在该领域内却进展缓慢(Khaw等，1998；Chung等，2001；WO01/34816)。

发明摘要

本发明提供对于菌株有效转化的重组方法，所述菌株包含编码FKBP配基的生物合成簇，例如但不限于吸水链霉菌吸水亚种(Streptomyceshygroscopicus subsp.Hygroscopicus)NRRL 5491、游动放线菌属(Actinoplanes)N902-109FERM BP-3832种、链霉菌属(Streptomyces)AA6554种、吸水链霉菌子囊菌变种(Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus)MA 6475 ATCC 14891、吸水链霉菌子囊菌变种MA 6678ATCC 55087、吸水链霉菌子囊菌变种MA 6674、吸水链霉菌子囊菌变种ATCC 55276、筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)No.9993 FERMBP-927，吸水链霉菌屋九岛亚种(Streptomyces hygroscopicus subsp.Yakushimaensis)、链霉菌种DSM 4137、链霉菌种DSM 7348、微单孢菌(Micromonospora)n.sp.A92-306401 DSM 8429、链霉菌种MA6858ATCC 55098、链霉菌种MA 6848，所述方法包括：

(a)在dam^-、dcm^-或dam^-和dcm^-大肠杆菌菌株中构建接合缺失质粒；

(b)从适合于接合的菌株产生孢子，其中所述菌株培养于湿度为10％和40％之间，且在5和30天之间收获孢子；

(c)将步骤(a)的大肠杆菌菌株与步骤(b)的孢子在培养基上接合，所述培养基中，每升含有：

i)0.5g到5g玉米浆，

ii)0.1g到5g酵母提取物，

iii)0.1g到10g碳酸钙；和

iv)0.01g到0.5g硫酸铁；

所述培养基还包含细菌培养用琼脂和淀粉，且已经干燥使重量减少了1-20％；和

(d)任选地在适于聚酮化合物产生的条件下培养菌株。

在一个优选的实例方案中，该方法用于转化吸水链霉菌吸水亚种(例如NRRL 5491)、游动放线菌种N902-109(例如FERM BP-3832)、链霉菌种AA6554、吸水链霉菌子囊菌变种(例如MA 6475 ATCC 14891)、吸水链霉菌子囊菌变种(例如MA 6678 ATCC 55087)、吸水链霉菌子囊菌变种(例如MA 6674)、吸水链霉菌子囊菌变种(例如ATCC 55276)、筑波链霉菌No.9993(例如FERM BP-927)、吸水链霉菌屋九岛亚种、链霉菌种(例如DSM4137)、链霉菌种(例如DSM 7348)、微单孢菌n.sp.A92-306401(例如DSM8429)或链霉菌种(例如MA 6858 ATCC55098)。在更优选的实例方案中，该方法用于转化吸水链霉菌吸水亚种(例如NRRL 5491)或吸水链霉菌子囊菌变种(例如ATCC14891)。在还更优选的实例方案中，该方法用于转化雷帕霉素产生菌吸水链霉菌吸水亚种(例如NRRL 5491)。

因而本发明也提供了这样的重组菌株，其含有编码FKBP-配基的生物合成簇，其中使用如这里所述的方法缺失或失活一个或多个辅助基因。

在进一步的方面中，本发明提供用于表达聚酮化合物修饰酶的组合以产生新型聚酮化合物类似物的重组方法和材料。在一个特定的实施方案中，本发明提供用于表达负责后-PKS修饰的酶和/或由编码FKBP-配基的生物合成簇中供应的前体的组合的重组方法和材料，所述FKBP-配基例如但不限于雷帕霉素、FK506、FK520、FK523、FK525、antascomicin、meridamycin、筑波霉素和其类似物，以及用于在重组宿主细胞内产生它们的类似物的方法。在优选的实施方案中，使用了用于表达负责后-PKS修饰的酶和/或在雷帕霉素、FK520、FK506和′hyg′的生物合成中供应的前体的组合的重组方法和材料，且所述方法用于在重组宿主细胞内产生雷帕霉素、FK520、FK506和′hyg′类似物。在更高度优选的实施方案中，使用了用于表达负责后-PKS修饰的酶和/或在雷帕霉素的生物合成中供应的前体的组合的重组方法和材料，且所述方法用于在重组宿主细胞内产生雷帕霉素类似物。

广义地说，本发明涉及基因体系的改变，其具有负责产生基本产物的核心部分，并具有负责相对少量修饰基本产物的多个修饰基因，例如实现基本产物的糖基化、氧化、还原、烷基化、脱烷基化、酰基化或环化，并具有参与特定前体化合物(例如六氢吡啶羧酸盐；4，5-二羟环己-1烯羧酸)的产生的多个前体供应基因。因而，基本产物可以是模块聚酮化合物，修饰基因可以涉及糖基化和/或聚酮化合物链的其它修饰，且前体供应基因可以涉及天然的或非天然前体的产物和/或引入(例如在雷帕霉素体系内的六氢吡啶羧酸盐和/或4，5-二羟环己-1烯羧酸)。

核心部分在缺乏前体供应基因的条件下可能不完全地起作用或甚至完全不起作用(除非供应天然的或非天然的前体化合物，或其它方式可以得到这些化合物)。

一方面，本发明提供用于具有核心部分的基因体系的转变，该部分由于前体供应基因的缺失或失活而不起作用。适当的基因体系包括但不限于雷帕霉素、antascomicin、FK520、FK506、′hyg′、FK523、meridamycin、FK525和筑波霉素生物合成簇。在本发明的这方面中，前体供应基因缺失优选地是rapK或rapK的同源物(例如在FK506或FK520基因簇中的fkbO)。基因体系优选地是雷帕霉素簇。前体供应基因缺乏更优选地是rapK。通过天然或非天然前体例如(4，5-二羟基环己-1烯羧酸)的引入，本发明的该方面提供用于多种基本产物有效产生。所述方法也可体现下述的进一步的方面。

体系的另一个类型是非核糖体肽(″NRP″)体系，这里，基本产物是肽，且修饰基因是负责修饰肽的基因(糖基化、还原等)，且前体供应基因是涉及产生结合到肽上的稀有氨基酸残基的基因。体系可以是混合型，例如具有聚酮化合物部分和带有例如NRP的不同生物合成起源的部分。确实，可认为雷帕霉素是这样的一个例子，因为六氢吡啶羧酸盐残基是通过类似于NRP体系中发现的酶而添加的氨基酸残基。

这些修饰基因和前体供应基因可看作为聚酮化合物合成的“辅助基因”，且如这里所用的术语“辅助基因”可指修饰基因、前体供应基因，或这两者。

基因体系的改变包括产生行使功能改变的体系，其中可改变该组辅助基因。因此，可删除(或变成非功能性)和/或用不同基因代替一个或多个辅助基因(且优选地是两个或更多、三个或更多、四个或更多、五个或更多、六个或更多或者是七个或更多)。

这可涉及“缺失体系”，其包含编码缺失多个功能辅助基因的基因体系的核酸。该缺失体系进而可用一个或多个功能性辅助基因互补(其可以与其代替基因相同或不同)。它可组合地实施，即缺失体系可用多个不同基因或多组基因互补。

缺失一个或多个修饰功能的不同于天然体系的改变体系可通过如下方法产生：(a)通过产生缺失体系并通过少于所有缺失基因的互补进行恢复；或(b)通过现有体系中选择性缺失或失活基因。根据(b)产生的改变体系内，通过在蛋白功能中重要的活性位点的定点诱变(活性位点点突变)、通过移码突变的基因截短、通过在对其功能是重要的基因框内部分的缺失，例如活性位点，进行失活基因；通过点突变进行的部分缺失或失活。所有这些可通过双重组和选择突变基因型进行，或通过单重组进行。在优选的实施方案中，改变的体系用方法(a)产生。这类方法也可用于产生缺失体系。“互补”方法是优选同源的，因为“恢复”基因源自于相同基因簇，但是本发明也考虑了异源互补，其中“恢复”基因选自于与编码FKBP-配基不同的生物合成簇。在优选的实施方案中，“恢复”基因本质上与缺失基因相同，或是其变体，其执行相似功能。

在本发明的进一步方面中，带有缺失(或非功能性的)前体供应基因的改变体系可用备选的前体添料以使其产生变体产物。

如在聚酮化合物合成酶(″PKS″)体系中应用，实施方案的一个优选类型是用于生产聚酮化合物的方法，所述方法包括：(a)提供生物菌株，其含有一个或多个可表达的产生功能性PKS的PKS基因，该功能性PKS能在生物体内产生聚酮化合物，例如编码FKBP-配基的PKS基因，生物体缺乏一个或多个(且优选地是多数)天然地与所述辅助基因相连的功能性辅助基因，所述辅助基因编码能影响相应聚酮化合物修饰的基因产物；和(b)通过促使所述生物体表达一个或多个辅助基因实现互补，表达的修饰基因构成了一套不完整的天然与所述PKS基因连接的辅助基因，和/或包含一个或多个变体辅助基因；和(c)培养所述菌株，然后任选地分离产生的聚酮化合物类似物。

提供包含一个或多个PKS基因的生物体的菌株的步骤可包括提供编码基因簇的核酸的步骤，所述基因簇包含一个或多个所述PKS基因并且缺失一个或多个所述辅助基因；且包括将所述核酸导入生物体的步骤。

PKS基因优选地是雷帕霉素基因。缺失的辅助基因优选地是rapK、rapI、rapQ、rapM、相邻基因rapN和O(这里指定为rapN/O)、rapL和rapJ中的一个或多个。在特定实施方案中，本发明考虑了：

i)缺失一个辅助基因，例如缺失rapK；rapI；rapQ；rapM；rapL，rapN/O或rapJ；当缺失一个辅助基因时，其优选地选自rapK；rapI；rapQ；rapM；rapN/O和rapJ；

ii)缺失两个辅助基因，例如缺失：rapKrapI；rapKrapQ；rapKrapM；rapKrapN/O；rapKrapL；rapKrapJ；rapkIrapQ；rapIrapM；rapIrapN/O；rapIrapL；rapIrapJ；rapQrapM；rapQrapN/O；rapQrapL；rapQrapJ；rapMrapN/O；rapMrapL；rapMrapJ；rapN/OrapL；rapN/OrapJ或rapLrapJ；

iii)缺失三个辅助基因，例如缺失：rapKrapIrapQ；rapKrapIrapM；rapKrapIrapN/O；rapKrapIrapL；rapKrapIrapJ；rapKrapQrapM；rapKrapQRapN/O；rapKrapQrapL；rapKrapQrapJ；rapKrapMrapN/O；rapKrapMrapL；rapKrapMrapJ；rapKrapN/OrapL；rapKrapN/OrapJ；rapKrapLrapJ；rapIrapQrapM；rapIrapQrapN/O；rapIrapQrapL；rapIrapQrapJ；rapIrapMrapN/O；rapIrapMrapL；rapI rapMrapJ；rapIrapN/OrapL；rapIrapN/OrapJ；rapIrapLrapJ；rapQrapMrapN/O；rapQrapMrapL；rapQrapMrapJ；rapQrapN/OrapL；rapQrapN/OrapJ；rapQrapLrapJ；rapMrapN/OrapL；rapMrapN/OrapJ；rapMrapLrap或rapN/OrapLrapJ；

iv)缺失四个辅助基因，例如缺失：rapKrapIrapQrapM；rapKrapIrapQrapN/O；rapKrapIrapQrapL；rapKrapIrapQrapJ；rapKrapIrapMrapN/O；rapKrapIrapMrapL；rapKrapIrapMrapJ；rapKrapIrapN/OrapL；rapKrapIrapN/OrapJ；rapKrapIrapLrapJ；rapKrapQrapMrapN/O；rapKrapQrapMrapL；rapKrapQrapMrapJ；rapKrapQrapN/OrapL；rapK，rapQ，rapN/O，rapJ；rapKrapQrapLrapJ；rapKrapMrapN/OrapL；rapKrapMrapN/OrapJ；rapKrapMrapLrapJ；rapKrapN/OrapLrapJ；rapIrapQrapMrapN/O；rapIrapQrapMrapL；rapI rapQrapMrapJ；rapIrapQrapN/OrapL；rapIrapQrapN/OrapJ；rapIrapQrapLrapJ；rapIrapMrapN/OrapL；rapIrapMrapN/OrapJ；rapIrapMrapLrapJ；rapIrapN/OrapLrapJ；rapQrapMrapN/OrapL；rapQrapMrapN/OrapJ；rapQrapMrapLrapJ；rapQrapN/OrapLrapJ或rapMrapN/OrapLrapJ；

v)缺失五个辅助基因，例如缺失：rapKrapIrapQrapMrapN/O；rapKrapIrapQrapMrapL；rapKrapIrapQrapMrapJ；rapKrapIrapQrapN/OrapL；rapKrapIrapQrapN/OrapJ；rapKrapIrapQrapLrapJ；rapKrapIrapMrapN/OrapL；rapKrapIrapMrapN/OrapJ；rapKrapIrapMrapLrapJ；rapKrapIrapN/OrapLrapJ；rapKrapQrapMrapN/OrapL；rapKrapQrapMrapN/OrapJ；rapKrapQrapMrapLrapJ；rapKrapQrapN/OrapLrapJ；rapKrapMrapN/OrapLrapJ；rapIrapQrapMrapN/OrapL；rapIrapQrapMrapN/OrapJ；rapIrapQrapN/OrapLrapJ；rapIrapMrapN/OrapLrapJ；rapQrapMrapN/OrapLrapJ或rapIrapQrapMrapLrapJ；

vi)缺失六个辅助基因，例如缺失：

rapKrapIrapQrapMrapN/OrapL；rapKrapIrapQrapMrapN/OrapJ；rapKrapIrapQrapMrapLrapJ；rapKrapIrapQrapN/OrapLrapJ；rapKraplrapMrapN/OrapLrapJ；rapKrapQrapMrapN/OrapLrapJ或

rapIrapQrapMrapN/OrapLrapJ；或

vii)缺失七个辅助基因，例如缺失：

rapKrapIrapQrapMrapN/OrapLrapJ。

“缺失一个或多个功能性辅助基因”的表达既包括缺失基因又包括存在但处于非功能状态的基因，例如因为使其特异丧失这个能力。

在一方面中，本发明提供了新型的且快速的途径以将天然的或非天然的前体有效掺入FKBP-配基。这些包括但不限于雷帕霉素、antascomicin、FK520、FK506、hyg’、FK523、meridamycin、FK525和筑波霉素聚酮化合物合成酶/非核糖体肽合成酶体系，本发明因此提供它们相应的天然产物的新型类似物。在特定的方面中，本发明提供了新型的且快速的途径以将天然的或非天然的雷帕霉素类似物前体有效掺入FKBP-配基。

因此，在一方面，本发明提供产生FKBP-配基类似物的方法，其掺入了非天然起始单元，所述方法包括：

(a)产生重组菌株，其中至少已缺失或失活rapK同源物；和

(b)添加非天然起始单元培养所述菌株。

在优选实施方案中，使用本发明的方法产生重组菌株。

在进一步方面中，本发明提供了使用该体系可获得的化合物文库以及单个的化合物。因此，典型化合物是这样的基因体系天然产生的化合物的变体，该体系具有负责产生基本产物的核心部分，且具有负责对基本产物实施相对少量的修饰的多个辅助基因，通过改变体系从而缺失、非功能化、或由功能性变体替换一个或多个辅助基因可产生变体。优选的一类化合物是对应于雷帕霉素体系产物的雷帕霉素类似物，其中选自rapK，rapI，rapQ，rapM，rapN，rapO，rapL和rapJ基因的一个或多个基因缺失、非功能性或变异。

在进一步的方面中，本发明提供了新型FKBP-类似物，在优选的实施方案中，本发明提供新型雷帕霉素类似物。这类化合物可具有一种或多种有用的特性，例如但不限于，使用作为免疫抑剂、抗真菌剂、抗癌剂、神经再生制剂，或用于治疗银屑病、类风湿性关节炎、纤维化和其它高增殖疾病的制剂。

定义：

如这里所用的，术语“修饰基因”包括聚酮化合物的聚酮化合物合成酶后修饰所需要的基因，例如但不限于细胞色素P-450单加氧酶、铁氧化还原蛋白和SAM依赖的O-转甲基酶。在雷帕霉素体系中，这些修饰基因包括rapN/O、rapM、rapl、rapQ和rapJ，但本领域内技术人员可认识到涉及雷帕霉素(例如，但不限于：FK506、FK520、antascomicin、′hyg′、FK523、meridamycin、FK525和筑波霉素)的PKS体系至少具有这些基因的子集的同源物，在下面进一步讨论了其中的一些基因。

如这里所用的，术语“前体供应基因”包括用于天然的或非天然的前体的供应所需要的基因、合成任一天然或非天然掺入的前体所需要的基因和掺入对于任一天然或非天然掺入的前体所需要的基因。例如但不限于，在雷帕霉素体系中，这些基因包括rapL、rapK和rapP，但领域内技术人员可认识到涉及雷帕霉素(例如，但不限于：FK506、FK520、antascomicin、′hyg′、FK523、meridamycin、FK525和筑波霉素)的PKS体系具有这些基因的同源物，在下面进一步讨论了其中的一些基因。

如这里所用的，术语“辅助基因”包括修饰基因、前体供应基因或修饰基因和前体供应基因两者。

如这里所用的，术语“前体”包括天然起始单元(即4，5-二羟基环己-1-烯羧酸)、非天然的起始单元和天然掺入的氨基酸(即六氢吡啶羧酸)和非天然掺入的氨基酸。

如这里所用的，术语“非天然起始单元”是指在聚酮化合物合成中可作为起始单元的任何化合物，但不是由PKS通常选择的起始单元的化合物。

如这里所用的，术语“FKBP-配基”涉及结合到亲免素FKBP的化合物，该化合物优选地包含α，β-二酮酰胺，其中β-酮基作为半缩醛基被掩蔽。这类化合物包括但不限于雷帕霉素、FK520、FK506、antascomicin、hyg′、FK523、meridamycin、FK525和筑波霉素。

如这里所用的，术语“编码FKBP-配基的生物合成簇”包括但不限于指导合成雷帕霉素、FK506、FK520、′hyg′、FK523、antascomicin、meridamycin、FK525和筑波霉素的基因簇。

如这里所用的，术语“包含编码FKBP-配基的生物合成簇的菌株”包括但不限于：吸水链霉菌吸水亚种(例如NRRL 5491)、游动放线菌种N902-109(例如FERM BP-3832)、吸水链霉菌种AA6554、吸水链霉菌子囊菌变种MA 6475(例如ATCC 14891)、吸水链霉菌子囊菌变种MA 6678(例如ATCC 55087)、吸水链霉菌子囊菌变种MA 6674、吸水链霉菌子囊菌变种(例如ATCC 55276)、筑波链霉菌No.9993(例如FERM BP-927)、吸水链霉菌屋九岛亚种、吸水链霉菌种(例如DSM 4137)、吸水链霉菌种(例如DSM7348)、微单孢菌n.sp.A92-306401(例如DSM 8429)或吸水链霉菌种MA 6858(例如ATCC 55098)。

如这里所用的，术语“rapK同源物”是指源自于编码FKBP-配基的其它生物合成簇的雷帕霉素基因rapK的同源物，例如但不限于：源自于FK520簇的fkbO基因、源自于FK506簇的fkbO基因和源自于′hyg′簇的Orf5。在合成这些相关的FKBP-配基时，此类rapK同源物执行与rapK相同的功能，即对于供应天然起始单元而言它们是必需的。优选地，此类rapK同源物与图27显示的rapK序列(SEQ ID NO：13)具有至少40％、优选地至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的序列同一性。

发明详述

在一方面中，本发明提供了新型且快速的用于转化吸水链霉菌的方法。以前已经描述了用于分离遗传修饰的吸水链霉菌菌株的噬菌体技术(Khaw等，1998；Lomovskaya等，1997)。但已报导的仅仅是用于将DNA导入雷帕霉素产生菌吸水链霉菌的转染方法。事实上，以前已提到过，对于雷帕霉素产生菌，使用质粒DNA转化或接合转移的常用方法是不成功的(Lomovskaya等，1997，Kieser等，2000；Schweke等，1995)。

在本发明中，如实施例1所述，令人吃惊地建立了成功地转化吸水链霉菌的接合方法。本方法通过以下进行例证，即分离吸水链霉菌MG2-10的缺失突变体(实施例2)，和如实施例3、5和15所述表达基因及基因的结合。

因此，在一方面中，本发明提供用于产生包含编码FKBP-配基的生物合成簇的重组菌株的方法，所述生物合成簇已缺失或失活一个或多个辅助基因，所述方法包括：

(a)在dam^-，dcm^-或dam^-和dcm^-大肠杆菌菌株中构建接合质粒；

(c)将(a)步的大肠杆菌菌株与(b)步的孢子在培养基上接合，所述培养基中，每升含有：

i)0.5g到5g玉米浆，

ii)0.1g到5g酵母提取物，

iii)0.1g到10g碳酸钙；和

iv)0.01g到0.5g硫酸铁；

所述培养基还包含细菌培养用-琼脂和淀粉，且已干燥使重量减少了1-20％；和

(d)任选地在适合于聚酮化合物产生的条件下培养菌株。

(a)步优选的大肠杆菌菌株是dam^-和dcm^-。

(b)步优选的孢子在10天和25天之间收获或在14天和21天之间收获。在另一实施方案中，(b)步菌株在湿度为10％和20％之间培养。

在特定实施方案中，(c)步所用的培养基中淀粉是小麦淀粉。

在优选实施方案中，(c)步所用的每升培养基包括1g至4g玉米浆、1g至4g酵母提取物、1g至5g碳酸钙和0.2g至0.4g硫酸铁。在更优选的实施方案中，每升培养基包括：2.5g玉米浆、3g酵母提取物、3g碳酸钙和0.3g硫酸铁。

在本发明中公开的互补策略提供用于评估和鉴定雷帕霉素生物合成中每个辅助基因，即rapK、rapQ、rapN/O、rapM、rapL、rapJ，功能的快速方法。以前已将基因产物RapK看成为蝶啶依赖的双加氧酶的令人感兴趣的候选物，其在雷帕霉素的生物合成中也催化氧化步骤(Molnár等，1996)。在FK506的生物合成基因簇中鉴定了同源基因fkbO，且由于雷帕霉素和FK506结构上相似，因此推定了对于rapK在C9 OH基团的氧化作用(Motamedi等，1996)。在实施例3、4和6中描述通过吸水链霉菌MG2-10[pSGsetrapK]产生的rapK-依赖的前雷帕霉素产物的发现表明RapK至少有雷帕霉素生物合成中的额外功能。

因此，在另一方面中，本发明的方法阐明了RapK的功能，即rapk基因的表达对于任何环化大环内酯产物的聚积是必要的。在进一步方面中，本发明描述了用fkbO互补吸水链霉菌MG2-10，其中所述fkbO为来自FK520簇的rapK类似物，得出了令人惊讶的观察结果，即由吸水链霉菌MG2-10[pMG169-1]产生前雷帕霉素的fkbO依赖产物(实施例11)。本领域内技术人员可以看到，在产生FK520时fkbO执行在在产生前雷帕霉素时rapK和fkbO相似的功能。此外，本领域内技术人员可认识到rapK的其它同源物，包括但不限于FK506簇中的fkbO、FK520簇中的fkbO和‘hyg’簇中的Orf5，也执行相同功能。在本发明的另一方面中，编码FKBP-配基的生物合成簇内，rapK的同源物可以缺失或失活，提供不能产生它们相应已知天然产物的菌株，所述配基包括但不限于FK506、FK520、FK525、antascomicin、FK523、筑波霉素和‘hyg’。同样地，在其它聚酮化合物或非核糖体肽的生物合成中，上面提到的互补策略提供了研究辅助基因表达产物的功能、特异性和顺序的快速方法。

在一类优选实施方案中，本发明提供用于产生能产生雷帕霉素类似物的重组宿主菌株的方法，其进一步包括基因组缺失的构建，所述构建包括但不限于导入至吸水链霉菌中的rapQONMLKJI和通过表达单个基因或结合基因进行互补或部分互补，所述基因包括但不限于基因盒中的rapK、rapI、rapQ、rapM、相邻近基因rapN与O(这里指定为rapN/O)、rapL和rapJ。此外，本发明提供通过培养所述重组宿主菌株然后任选地分离产生的雷帕霉素类似物而产生所述雷帕霉素类似物的方法。因此，通过用rapk互补基因组缺失菌株吸水链霉菌MG2-10产生重组菌株MG2-10[pSGsetrapK]，用于培养产生9-脱氧-16-O-脱甲基-27-脱甲氧基-39-O-脱甲基-雷帕霉素(前雷帕霉素)。

在本发明的该类别的进一步方面中，策略涉及到将包含基因子集的载体整合入上述吸水链霉菌缺失突变体，所述子集基因包括但不限于rapK、rapI、rapQ、rapM、rapN、rapO、rapL和rapJ。所述整合可用多种可用整合功能进行，所述可用整合功能包括但不限于：基于ΦC31的载体、基于pSAM2整合酶的载体(例如在pPM927(Smovkina等，1990)中)、R4整合酶(例如在pAT98(Matsuura等，1996)中)、ΦVWB整合酶(例如在pKT02(Van Mellaert等，1998)中)、ΦBT1整合酶((例如pRT801)Gregory等，印刷中)和L5整合酶(例如Lee等，1991)。在一些情况下，这可能需要通过添加特异的用于整合酶使高效整合得以进行的attB位点改造宿主菌株。也可使用复制型载体，取代或添加到基于ΦC31的载体上。这些包括但不限于基于plJ101(例如plJ487，Kieser等，2000)、pSG5(例如pKC1139，Bierman等，1992)和SCP2＊(例如plJ698，Kieser等，2000)的载体。该方法在这里已通过使用ΦBT1和ΦC31位点特异的整合功能进行例证。

虽然在本发明中使用ΦBT1和ΦC31位点特异的整合功能已经例证了将基因盒导入吸水链霉菌中，但是本领域内技术人员可认识到存在文献中所述的多种不同策略，包括前面提到的也可以用于将该基因盒导入原核的或更优选地导入放线菌的宿主菌株内。上面所述和下述文章(Kieser等，2000；Van Mellaert等，1998；Lee等，1991；Smovkina等，1990；Matsuura等，1996)中，这些方法包括备选的位点特异性整合载体的应用。备选地，包含基因盒的质粒可以使用同源重组位点整合进入染色体上的中性位点。此外，对于许多放线菌宿主菌株，包括吸水链霉菌，基因盒可导入自我复制的质粒内(Kieser等，2000；WO98/01571)。

在该类别的进一步方面中，本发明提供用于互补重组吸水链霉菌缺失菌株的基因盒。以前已经描述了构建基因盒的方法及使用它们的异源性产生杂合的糖基化大环内酯物(Gaisser等，2002；WO01/79520，WO03/048375)。用于分离本发明基因盒的克隆方法明显不同于以前描述的方法，因为基因盒直接装配于表达载体上，而不是在pUC18/19-质粒内预装配基因，进而提供一个更快速的克隆过程。如在实施例3、4、5、9和15中所述，例证了该方法。如这里所述，可以构建适当的载体(例如但不限于pSGLit1)用于构建所述基因盒，对dam甲基化敏感的适当的限制性位点(例如但不限于XbaI)插入到目标基因的5′端，且第二限制性位点(例如XbaI)插入到目标基因的3′端。技术人员可认识到用其它限制位点代替XbaI且甲基化敏感位点可以是目标基因的5′或3′端。

基因盒的应用使得快速且平行产生多个重组菌株得以进行，所述重组菌株缺失了与源自于吸水链霉菌单一缺失菌株的修饰基因的结合。克隆策略使得以直接或随机方式的基因盒文库的装配顺利进行，并且因此成为用于组合产生新型雷帕霉素类似物的有力工具，所述雷帕霉素类似物包括但不限于9-脱氧-16-O-脱甲基-27-脱甲氧基-39-O-脱甲基-雷帕霉素(前雷帕霉素)、9-脱氧-16-O-脱甲基-27-O-脱甲基-39-O-脱甲基-雷帕霉素、16-O-脱甲基-27-脱甲氧基-39-O-脱甲基-雷帕霉素、9-脱氧-16-O-脱甲基-39-O-脱甲基-雷帕霉素、9-脱氧-16-O-脱甲基-27-脱甲氧基-雷帕霉素、16-O-脱甲基-27-O-脱甲基-39-O-脱甲基-雷帕霉素、9-脱氧-27-O-脱甲基-39-O-脱甲基-雷帕霉素、9-脱氧-16-O-脱甲基-27-O-脱甲基-雷帕霉素、27-O-脱甲基-39-O-脱甲基-雷帕霉素，9-脱氧-16-O-脱甲基-雷帕霉素、9-脱氧-39-O-脱甲基-雷帕霉素、8-脱氧-15-O-脱甲基-26-脱甲氧基-38-O-脱甲基-脯氨酰雷帕霉素(前脯氨酰雷帕霉素)、8-脱氧-15-O-脱甲基-26-O-脱甲基-38-O-脱甲基-脯氨酰雷帕霉素、15-O-脱甲基-26-脱甲氧基-38-O-脱甲基-脯氨酰雷帕霉素、8-脱氧-26-脱甲氧基-38-O-脱甲基-脯氨酰雷帕霉素、8-脱氧-15-O-脱甲基-38-O-脱甲基-脯氨酰雷帕霉素、8-脱氧-15-O-脱甲基-26-脱甲氧基-脯氨酰雷帕霉素、15-O-脱甲基-26-O-脱甲基-38-O-脱甲基-脯氨酰雷帕霉素、8-脱氧-26-O-脱甲基-38-O-脱甲基-脯氨酰雷帕霉素、8-脱氧-15-O-脱甲基-26-O-脱甲基-脯氨酰雷帕霉素、15-O-脱甲基-38-O-脱甲基-脯氨酰雷帕霉素、15-O-脱甲基-26-O-脱甲基-脯氨酰雷帕霉素、15-O-脱甲基-26-脱甲氧基-脯氨酰雷帕霉素、26-脱甲氧基-38-O-脱甲基-脯氨酰雷帕霉素、26-O-脱甲基-38-O-脱甲基-脯氨酰雷帕霉素、8-脱氧-15-O-脱甲基-脯氨酰雷帕霉素、8-脱氧-26-O-脱甲基-脯氨酰雷帕霉素、8-脱氧-38-O-脱甲基-脯氨酰雷帕霉素、15-O-脱甲基-脯氨酰雷帕霉素、38-O-脱甲基-脯氨酰雷帕霉素、9-脱氧-16-O-脱甲基-27-脱甲氧基-39-脱甲氧基-雷帕霉素、9-脱氧-16-O-脱甲基-27-O-脱甲基-39-脱甲氧基-雷帕霉素、16-O-脱甲基-27-脱甲氧基-39-脱甲氧基-雷帕霉素、9-脱氧-27-脱甲氧基-39-脱甲氧基-雷帕霉素、9-脱氧-16-O-脱甲基-39-脱甲氧基-雷帕霉素、16-O-脱甲基-27-O-脱甲基-39-脱甲氧基-雷帕霉素、9-脱氧-27-O-脱甲基-39-脱甲氧基-雷帕霉素、16-O-脱甲基-39-脱甲氧基-雷帕霉素、27-脱甲氧基-39-脱甲氧基-雷帕霉素、27-O-脱甲基-39-脱甲氧基-雷帕霉素、9-脱氧-39-脱甲氧基-雷帕霉素、8-脱氧-15-O-脱甲基-26-脱甲氧基-38-脱甲氧基-脯氨酰雷帕霉素、8-脱氧-15-O-脱甲基-26-O-脱甲基-38-脱甲氧基-脯氨酰雷帕霉素、15-O-脱甲基-26-脱甲氧基-38-脱甲氧基-脯氨酰雷帕霉素、8-脱氧-26-脱甲氧基-38-脱甲氧基-脯氨酰雷帕霉素、8-脱氧-15-O-脱甲基-38-脱甲氧基-脯氨酰雷帕霉素、15-O-脱甲基-26-O-脱甲基-38-脱甲氧基-脯氨酰雷帕霉素、8-脱氧-26-O-脱甲基-38-脱甲氧基-脯氨酰雷帕霉素、15-O-脱甲基-38-脱甲氧基-脯氨酰雷帕霉素、26-脱甲氧基-38-脱甲氧基-脯氨酰雷帕霉素、26-O-脱甲基-38-脱甲氧基-脯氨酰雷帕霉素、8-脱氧-38-脱甲氧基-脯氨酰雷帕霉素、38-脱甲氧基-脯氨酰雷帕霉素、9-脱氧-16-O-脱甲基-27-脱甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(羟基环己烯基)雷帕霉素、9-脱氧-16-O-脱甲基-27-脱甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(二羟基环己基)雷帕霉素、9-脱氧-16-O-脱甲基-27-脱甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(羟基降冰片基)雷帕霉素、9-脱氧-16-O-脱甲基-27-脱甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(3-甲基-4-羟基环己基)雷帕霉素、9-脱氧-16-O-脱甲基-27-脱甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(4-甲基羟基环己基)雷帕霉素，9-脱氧-16-O-脱甲基-27-脱甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(3-氟-4-羟基环己基)雷帕霉素、9-脱氧-16-O-脱甲基-27-脱甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(3-羟基-4-氟环己基)雷帕霉素、9-脱氧-16-O-脱甲基-27-脱甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(3-氯-4-羟基环己基)雷帕霉素、9-脱氧-16-O-脱甲基-27-脱甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(3-羟基-4-氯环己基)雷帕霉素、9-脱氧-16-O-脱甲基-27-脱甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(3-顺-4-顺-二羟基环己基)雷帕霉素、9-脱氧-16-O-脱甲基-27-脱甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(3-反-4-反-二羟基环己基)雷帕霉素、9-脱氧-16-O-脱甲基-27-O-脱甲基-39-O-脱甲基雷帕霉素、9-脱氧-16-O-脱甲基-27O-脱甲基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(羟基环己烯基)雷帕霉素、9-脱氧-16-O-脱甲基-27-O-脱甲基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(羟基降冰片基)雷帕霉素、9-脱氧-16-O-脱甲基-27-O-脱甲基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(4-甲基羟基环己基)雷帕霉素。

在该类别的进一步方面中，本发明提供用于组合产生能产生雷帕霉素类似物的重组宿主菌株的体系，涉及到构建导入吸水链霉菌中基因组缺失的rapQONMLKJI，及通过包含一个或多个缺失的辅助基因rapQ、rapN/O、rapM、rapL、rapK、rapJ和rapI的基因盒的组合文库进行部分互补。

描述的方法包括(作为一部分)组合基因的克隆策略，所述基因包括但不专门限于rapK、rapI、rapQ、rapM、rapN/O、rapL和rapJ，和/或在任一可能的基因结合和基因顺序中具有相似基因功能的基因。

本发明的另一方面允许通过改变基因盒中基因的顺序提高基因表达。如在优选类别中所应用的，基因可包括一个或多个rapK、rapI、rapQ、rapM、rapN/O、rapL和rapJ和/或具有相似功能的基因，允许如实施例5中所述的多种排列的基因排列。

本发明中概述的克隆策略也允许组氨酸标签与基因盒的3′末端序列的结合，以增强基因表达。那些领域内技术人员可认识到应用其它末端序列。

本发明的另一方面描述在装配的基因盒内启动子序列的多种应用以优化基因表达。

目前，对于领域内技术人员来说，可以构建吸水链霉菌缺失菌株是明显的，所述缺失包括但不限于一个基因或基因rapQ、rapN/O、rapM、rapL、rapK、rapJ和rapI的子集。在这种情况下，用于互补或部分互补的基因盒一般包含单基因或选自于缺失的子集基因的多基因。

领域内技术人员都知道在紧密相关的体系的基因簇中有一些雷帕霉素修饰和前体供应基因的同源物，所述相关体系包括FK506(Motamedi等，1996；Motamedi等，1997；Motamedi&Shafiee，1998)和FK520(Wu等，2000)。这些包括如下面表I中所述的下述基因：

表I

雷帕霉素基因	FK506同源物	FK520同源物	‘hyg’
雷帕霉素基因	FK506同源物	FK520同源物	‘hyg’	rapI(登录号CAA60470)	fkbM(登录号AAC44360)	fkbM(登录号AAF86398)
rapJ(登录号CAA60469)	fkbD(登录号AAC44359)	fkbD(登录号AAF86397)		rapI(登录号CAA60470)	fkbM(登录号AAC44360)	fkbM(登录号AAF86398)
rapJ(登录号CAA60469)	fkbD(登录号AAC44359)	fkbD(登录号AAF86397)		rapK(登录号CAA60468)	fkbO(登录号AAC68817)	fkbO(登录号AAF86394)	Orf5(登录号AAC38060)
rapL(登录号	fkbL(Motamedi&	fkbL(登录号		rapK(登录号CAA60468)	fkbO(登录号AAC68817)	fkbO(登录号AAF86394)	Orf5(登录号AAC38060)

雷帕霉素基因	FK506同源物	FK520同源物	‘hyg’
雷帕霉素基因	FK506同源物	FK520同源物	‘hyg’	CAA60467)	Shafiee，1998)	AAF86391)

尽管还没有对其它密切相关体系的基因簇进行测序，所述体系包括但不限于那些用于FK523、meridamycin、FK525、antascomicin和筑波霉素的生物合成的体系，但可以认为那些与已经测定的序列具有密切类似的基因簇，且特别地认为它们包含一些与雷帕霉素修饰和前体供应基因相关的同源基因。因此，在本发明的进一步方面中，在基因盒中包含源自于包括但不限于FK506、FK520、FK523、antascomicin、meridamycin、FK525、‘hyg’和筑波霉素这样的密切相关体系的异源基因簇的基因，取代或加入到其雷帕霉素同源物，用于雷帕霉素产生菌株的互补和/或部分互补，所述菌株包含包括但不限于基因rapK、rapI、rapQ、rapM、rapN/O、rapL和rapJ的一个基因缺失或多个缺失。

领域内技术人员都知道聚酮化合物基因簇可在异源宿主内表达(Pfeifer和Khosla，2001)。因此，本发明包括雷帕霉素生物合成基因簇的转移，所述基因簇具有或不具有抗性和调节基因，该基因簇是完整的或是包含缺失的基因，用于异源宿主内的互补。领域内都知道用于如上所定义的该大片段DNA转移的方法和载体(Rawlings，2001；Staunton和Weissman，2001)，或在此处公开的方法中提供该方法和载体。在该上下文中，优选的宿主细胞菌株是原核生物，更优选的是放线菌类或大肠杆菌(Escherichia coli)，还更优选地包括但不限于吸水链霉菌、吸水链霉菌种、吸水链霉菌子囊菌变种、筑波链霉菌、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)、变铅青链霉菌(Streptomyees lividans)、Saccharopolysporaerythraea、弗氏链霉菌(新霉素链霉菌)(Streptomyces fradiae)、Streptomyces avermitilis、肉桂地链霉菌(Streptomyces cinnamonensis)、龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)、白色链霉菌(Streptomyces albus)、灰褐链霉菌(Streptomyces griseofuscus)、黄色长孢链霉菌(Streptomyceslongisporoflavus)、委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)、Micromonospora griseorubida、Amycolatopsis mediterranei或游动放线菌种(Actinoplanes sp.)N902-109。

另一方面，本发明的雷帕霉素类似物可通过包括以下步骤的方法获得，即：

a)通过本发明的方法构建缺失菌株，缺失基因包括但不限于rapK、rapQ、rapN/O、rapM、rapL、rapJ和rapI，或其子集；

b)在适合于聚酮化合物产生的条件下培养菌株；

c)任选地，分离产生的雷帕霉素类似物中间体；

d)构建生物转化菌株，所述菌株包含含有所有缺失基因或其子集的基因盒；

e)将在培养上清液中的或如在c)步中分离的雷帕霉素类似物中间体添加至在适宜的生物转化条件下培养的生物转化菌株的培养物中；

f)任选地分离产生的雷帕霉素类似物。

用于构建生物转化菌株的适当宿主菌株包括天然宿主菌株，所述天然宿主菌株已缺失或相当程度上缺失或失活雷帕霉素生物合成基因簇，以至于丧失聚酮化合物合成，或包括异源宿主菌株。在WO 01/79520中描述了用于在异源宿主内表达包含一个或多个修饰的或前体供应基因的基因盒的方法。在该上下文中，适合于所述的FKBP-配基类似物中间体的生物转化异源宿主包括但不限于吸水链霉菌、吸水链霉菌属种、吸水链霉菌子囊菌变种、筑波链霉菌、天蓝色链霉菌、变铅青链霉菌、Saccharopolysporaerythraea、弗氏链霉菌、Streptomyces avermitilis、肉桂地链霉菌、龟裂链霉菌、白色链霉菌、灰褐链霉菌、黄色长孢链霉菌、委内瑞拉链霉菌、Micromonospora griseorubida、Amycolatopsis mediterranei、大肠杆菌(Escherichia coli)和游动放线菌种N902-109。

雷帕霉素和FK506、FK520、FK523、‘hyg’、meridamycin、antascomicin、FK525及筑波霉素等的密切结构关系以及对参与雷帕霉素和FK506和FK520(见上)的生物合成的基因间已建立的同源性明显使得可将本发明方法应用于这些密切相关的体系中。因此，在进一步方面中，本发明包括构建产生密切相关化合物的生产菌株的缺失菌株，所述相关化合物包括但不限于FK506、FK520、FK523、‘hyg’、antascomicin、meridamycin、FK525和筑波霉素，所构建的缺失菌株包含修饰和/或前体供应基因的一个基因或多个基因缺失，且更具体地所述基因包括但不限于具有与rapK、rapI、rapQ、rapM、rapN/O、rapL和rapJ相似功能的基因，且所构建的缺失菌株还包含用含有所缺失同源基因的全部或部分的基因或基因盒、或它们源自于异源基因簇的功能同源物以对它们进行互补或部分互补，所述基因包括但不限于rapK、rapI、rapQ、rapM、rapN/O、rapL和rapJ，从而产生在掺入备选的前体和/或后-PKS修饰过程中能产生不同于母体聚酮化合物的聚酮化合物类似物的重组菌株。此外，本发明提供通过培养所述重组宿主菌株以用于产生所述聚酮化合物类似物并任选地分离产生的聚酮化合物类似物的方法。

在进一步方面中，本发明提供用于产生能产生不同于母体聚酮化合物的聚酮化合物FKBP-配基类似物(除了雷帕霉素)的重组宿主菌株的方法，其中所述不同于母体聚酮化合物的聚酮化合物FKBP-配基类似物是掺入了备选的前体和/或后-PKS修饰程度，所述方法包括构建已缺失所有的或部分辅助基因的且用包含一个或多个缺失基因和/或这些缺失基因的同源染色体基因盒进行部分互补的基因组缺失菌株，并进一步提供通过培养所述重组宿主菌株然后任选地分离产生的聚酮化合物类似物产生所述聚酮化合物类似物的方法。本领域内众所周知，在大多数情况下，辅助基因与基因簇中聚酮化合物合成酶基因进行共同定位(Hopwood，1997；Motamedi和Shafiee，1998；Wu等，2000)，因而使缺失菌株的产生得以顺利进行。要删除的辅助基因可以或不用天然地构成连续的序列，然而，一旦已经产生了缺失菌株，通过基因盒的部分互补提供快速的用于产生已经删除了一个或多个所述基因的重组菌株的方法。因此，在进一步方面中，本发明提供用于组合产生能产生不同于母体聚酮化合物的聚酮化合物FKBP-配基类似物(除了雷帕霉素)的重组宿主菌株的方法，其中所述不同于母体聚酮化合物的聚酮化合物FKBP-配基类似物是掺入了备选的前体和/或后-PKS修饰程度，所述方法包括用含有一个或多个删除基因的基因盒的结合文库对所述基因组缺失菌株进行部分互补，并进一步提供在适合于聚酮化合物产生的条件下通过培养所述重组宿主菌株然后任选地分离产生的聚酮化合物类似物产生所述聚酮化合物类似物的方法。在该上下文中，优选的重组宿主细胞菌株是原核生物，更优选的是放线菌，还更优选的菌株选自于吸水链霉菌、吸水链霉菌种、吸水链霉菌变体子囊菌、筑波链霉菌、天蓝色链霉菌、变铅青链霉菌、Saccharopolyspora erythraea、弗氏链霉菌、Streptomyces avermitilis、肉桂地链霉菌、龟裂链霉菌、白色链霉菌、灰褐链霉菌、黄色长孢链霉菌、委内瑞拉链霉菌、Micromonospora griseorubida、Amycolatopsis mediterranei或游动放线菌属种N902-109。

领域内的技术人员可认识到：本发明的方法可以应用于重组宿主菌株，所述菌株中聚酮化合物合成酶(PKS)已用基因工程改造以表达修饰的雷帕霉素或其它聚酮化合物类似物。现有技术描述通过删除或失活单个结构域(WO93/13663，WO97/92358)、构建杂合聚酮化合物合成酶(WO98/01546，WO00/00618，WO00/01827)或通过定点诱变改变结构域特异性(WO02/14482)产生新型聚酮化合物的一些方法。

领域内众所周知，非核糖体肽合成酶(NRPSs)通过逐步缩合连续氨基酸结构单元生物合成非核糖体肽，该过程类似于聚酮化合物生物合成的过程(参见Marahiel等，1997；Schwarzer和Marahiel，2001)。众所周知，一些非核糖体肽包括不常见氨基酸残基(修饰的、蛋白原的氨基酸和/或非蛋白原的氨基酸)和羧酸，它们的生物合成基因与非核糖体肽合成酶基因共同定位于非核糖体肽基因簇内(Marahiel等，1997；Konz和Marahiel，1999；Blanc等，1997)。在一些情况下，最初释放自NRPS的非核糖体肽产物用一系列包括但不限于糖基转移酶、还原酶、酰基化或杂环环化(Konz和Marahiel，1999；Blanc等，1995)酶进一步修饰。这些包括抗生素chloroeremomycin、原始霉素、万古霉素和博来霉素(Konz和Marahiel，1999；Du等，2000)。用于这些后-NRPS酶的基因一般也共同定位于生物合成基因簇内(Marahiel等，1997；Schwarzer和Marahiel，2001)。因此，在进一步的方面中，本发明提供用于产生不同于母体非核糖体肽的非核糖体肽类似物的方法，其中所述不同于母体非核糖体肽的非核糖体肽类似物是掺入了备选的前体氨基酸和/或后-NRPS修饰程度，所述方法包括构建已经缺失所有的或部分的编码天然氨基酸前体合成和/或后NRPS酶的基因的基因组缺失菌株，且用包含一个或多个缺失基因和/或它们的同源物的基因盒进行该构建体的部分互补，以及进一步通过培养所述重组宿主菌株然后任选地分离产生的非核糖体肽类似物而产生所述非核糖体肽类似物的方法。要删除的后-NRPS和前体生物合成基因可以或不用形成连续序列，然而，一旦构建了缺失菌株，用基因盒进行的部分互补就提供用于产生删除了一个或多个所述基因的重组菌株的快速方法。因此，在进一步方面中，本发明提供用于组合产生可产生不同于母体非核糖体肽的非核糖体肽类似物的重组宿主菌株的方法，其中所述不同于母体非核糖体肽的非核糖体肽类似物是掺入了备选的前体和/或后-NRPS修饰程度，所述方法包括用包含一个或多个缺失基因的基因盒的结合文库进行部分互补所述基因组缺失菌株，以及进一步用于在适合于非核糖体肽产生的条件下通过培养所述重组宿主菌株然后任选地分离产生的非核糖体肽类似物以产生所述非核糖体肽类似物的方法。在上下文中，优选的重组宿主细胞菌株是原核生物，更优选的是放线菌，还更优选的菌株选自于吸水链霉菌、吸水链霉菌种、吸水链霉菌变种子囊霉菌、筑波链霉菌、天蓝色链霉菌、变铅青链霉菌、Saccharopolyspora erythraea、弗氏链霉菌、Streptomycesavermitilis、肉桂地链霉菌、龟裂链霉菌、白色链霉菌、灰褐链霉菌、黄色长孢链霉菌、委内瑞拉链霉菌、Micromonospora griseorubida、Amycolatopsis mediterranei或游动放线菌属种N902-109。

众所周知，许多放线菌包含用于不同次级代谢的多个生物合成基因簇，包括聚酮化合物和非核糖体地合成的肽。具体地，已显示出吸水链霉菌菌株产生除了雷帕霉素、FK506、FK520、FK523、meridamycin、FK525、antascomicin和筑波霉素以外的多种聚酮化合物和非核糖体合成的肽。这些包括但不限于油霉素、双丙氨膦(bialaphos)、潮霉素、augustmycin、涂霉素(A，B)、土块霉素、吸水霉素、奥萨霉素和尼日利亚菌素。这些额外生物合成基因簇代表对生物合成前体竞争的需求和宿主菌株额外的代谢需求。为了提高期望的雷帕霉素或其它聚酮化合物、类似物的产量，因此有利地可删除或失活宿主菌株内存在的任一其他生物代谢基因簇。本领域内众所周知用于删除或失活生物合成基因簇的方法。

在该类别的进一步方面中，本发明提供用于互补重组缺失菌株的突变合成方法。

在进一步的方面中，本发明缺失rapL的吸水链霉菌菌株可用天然掺入的氨基酸(L-六氢吡啶羧酸)类似物培养以产生新的雷帕霉素类似物，其中取代了六氢吡啶基残基。现有技术描述了通过将L-六氢吡啶羧酸添加至培养基内以补充rapL突变体(Khaw等，1998)。同样地，已显示在用L-六氢吡啶羧酸类似物、L-脯氨酸、L-反-4-羟脯氨酸、L-顺-4-羟脯氨酸、L-顺-3-羟脯氨酸、反-3-氮杂-二环[3，1，0]环己烷-2-羧酸培养并结合后，分离了雷帕霉素类似物(WO98/54308)使用吸水链霉菌MG2-10作为菌株背景以表达编码不包括rapL或rapL同源物的后-PKS修饰步骤的基因或基因盒时，在用L-六氢吡啶羧酸类似物培养时产生了能产生多个修饰产物的吸水链霉菌菌株的文库。适当的L-六氢吡啶羧酸类似物包括烷基-、卤素-、羟基-、和氨基-取代的六氢吡啶羧酸和脯氨酸，更特别的是L-脯氨酸、L-反-4-羟脯氨酸，L-顺-4-羟脯氨酸，L-顺-3-羟脯氨酸，反-3-氮杂-二环[3，1，0]己烷-2-羧酸以及显示催化PP-ATP变换的L-六氢吡啶羧酸类似物，所述催化PP-ATP变换是通过Lipmann方法(Nielsen等，1991)测定的，所述显示催化PP-ATP变换的L-六氢吡啶羧酸类似物包括L-4-羟脯氨酸、1-羟脯氨酸、2-羟脯氨酸、3-羟脯氨酸、反-3-甲基-L-脯氨酸、顺-3-甲基脯氨酸、顺-3-甲基-DL-脯氨酸、顺，反-4-甲基脯氨酸、顺-4-甲基-DL-脯氨酸、反-4-甲基-DL-脯氨酸、反-4-氨基脯氨酸、顺-4-氯-L-脯氨酸、5-盐酸亚氨基脯氨酸、顺-5-甲基-DL-脯氨酸、(+)-piperazic acid、5-氯-六氢吡啶羧酸、5-羟基-六氢吡啶羧酸、顺-4-羟基-L-六氢吡啶羧酸、反-4-羟基-D-六氢吡啶羧酸4-羟基异六氢吡啶羧酸、噻唑烷-4-羧酸(Nielsen等，1991)。该方法在实施例7中得到例证。

以前已经描述了，在将天然的4，5-二羟基环己-1-烯羧酸起始单元的结构密切类似物加入到吸水链霉菌培养基中进行培养后，产生了有限数量的新型雷帕霉素类似物，进而显示出，雷帕霉素聚酮化合物合成酶的输入模块在起始酸方面具有适应性(P.A.S.Lowden，博士论文，剑桥大学，1997)。然而，这些方法导致混合产物的产生。在进一步的方面中，通过用天然掺入的4，5-二羟基环己-1-烯羧酸起始单元的类似物培养本发明的菌株以产生雷帕霉素类似物，本发明允许产生雷帕霉素和相关的FKBP-配基类似物，所述雷帕霉素类似物掺入的备选的起始单元包括但不限于环己烷羧酸、3-顺，4反-二羟基环己烷羧酸、1-环己烯羧酸、3-环己烯羧酸、环己烷羧酸、2-降冰片烷羧酸、3-羟基环己烷羧酸、4-羟基环己烷羧酸、3-甲基环己烷羧酸、4-甲基环己烷羧酸、3-(顺/反)甲氧基环己烷羧酸、4-(顺/反)甲氧基环己烷羧酸4-氧环己烷羧酸、3-氟-4-羟基羧酸和4-氟-3-羟基羧酸、3-氧化环己烷羧酸、3，4-顺-二羟基环己烷羧酸、3-氯-4-羟基羧酸和4氯-3羟基羧酸(和成对的相反非对映异构体、环己基丙酸、4-叔-丁基环己烷羧酸和其中的简单酯和盐。该方法在实施例8、19和20种得到例证。

此外，可以添加4，5-二羟基环己-1-烯羧酸起始单元的生物合成前体的结构类似物(Lowden等，2001)，所述结构类似物导致产生掺入备选的起始单元的新型雷帕霉素类似物。

然而，这些方法可以导致产生混合的产物；因此，本发明还提供用于消除内源的起始单元与备选的起始酸类似物之间的竞争的方法，用所述类似物进行培养以提高新型雷帕霉素类似物产物的产出效率。

为了移除内源产生的天然起始单元与添加的备选的起始酸类似物之间的竞争，破坏天然的4，5-二羟基环己-1烯羧酸起始单元是首选的。这可通过删除或失活一个或多个涉及源自于莽草酸的参与天然4，5-二羟基环己-1烯羧酸起始单元的生物合成的基因(Lowden等，2001)或莽草酸本身的生物合成基因而完成。在后一情况下，必须用芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)补充至培养基。备选地，天然的4，5-二羟基环己-1烯羧酸起始单元的内源产物可通过添加莽草酸生物合成的化学抑制剂而受到抑制。领域内众所周知这类抑制剂。

在进一步方面中，本发明利用令人吃惊的发现，即rapK涉及生物合成前体例如雷帕霉素的4，5-二羟基环己-1烯羧酸起始单元的供应，且因此，rapK或rapK同源物的缺失或失活提供缺乏天然起始单元和添加的非天然起始单元之间的竞争的菌株。在另一方面中，本发明提供用于有效掺入所添加的酸的方法，其中所述酸包括但不限于下面所描述的酸：

因此，在本发明的一个方面中，所述方法包括培养式

的起始单元，其中X＝键或CH₂，且R₁、R₂、R₃、R₄、R₅和R₆可以相同或不同，且可以独立地为Cl、F、OH、SH、H、烷基、CN、Br、R₇、OR₇、C(O)R₇或HNR₇，其中R₇为C1-C4烷基；R₁与R₃、R₂与R₄、R₃与R₅、R₄与R₆、R₁与R₅或R₂与R₆可以连接成为取代的或非取代的亚甲基键、醚键、硫键或氨基键，R₁与R₂、R₃与R₄或R₅与R₆可联结在一起成为酮；条件是R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆中至多4个是Cl；R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆中至多2个是HNR₇；R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆中至多2个是SH，且源自于环上一个碳上的两个R基不都是OH。

在优选的实施方案中，起始单元不选自以下物质：环己烷羧酸、3-顺，4-反-二羟基环己烷羧酸、环庚烷羧酸和3(顺/反)-甲基环己烷羧酸。

在优选的实施方案中：在R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆是F和OH取代的结合，至多取代R_1-6的3个，且剩余的为H。在R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆是Cl和OH结合时，R_1-6中至多取代3个，且剩余的为H。相同碳上，在R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆的任意两个是OH，且剩余两个R基是F时，剩余的为H。在R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆的两个是Cl时，剩余的为H。在不是源自于相同碳的R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆的两个是Cl且还有一个R是OH时，剩余的是H。在R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆的一个是烷基时，则剩余的是H；烷基应是长度不大于3个碳的线性烷基。在R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆的一个是NHR₇时，则剩余的是H。

在更优选的实施方案中：在R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆的两个是OH且第三个R基是F时，剩余的是H。在R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆的两个是F时，剩余的是H。在R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆的两个是OH时，剩余的是H。在R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆的两个是OH且第三个R基是Cl时，剩余的是H。在R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆的两个是F且第三个R基是OH时，剩余的是H。在R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆的一个是SH时，剩余的是H。在R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆的一个是SH且第二个R基是OH(不是源自于相同的碳)时，剩余的是H。

在还更高度优选的实施方案中：在R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆的一个是F时，剩余的是H。在R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆的一个是Cl时，剩余的是H。在R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆的一个是F且第二个R基是OH(不是源自于相同的碳)时，剩余的是H。在R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆的一个是Cl且第二个R基是OH(不是源自于相同的碳)时，剩余的是H。在R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆的一个是烷基时，剩余的是H；烷基应至多包含4个碳且直链碳不多于3个。在R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆的一个是烷基且第二个R基是OH(不是源自于相同的碳)时，剩余的是H；烷基应至多包含4个碳且直链碳不多于3个。

本发明的进一步方面包括添加式

的起始单元，其中X＝键或CH₂，且R₁、R₂、R₃、R₄、R₅和R₆可以相同或不同，且可以独立地为Cl、F、OH、SH、H、烷基、CN、Br、R₇、OR₇、C(O)R₇或HNR₇，其中R₇是C1-C4烷基；R₁与R₃、R₂与R₄、R₃与R₅、R₄与R₆、R₁与R₅或R₂与R₆可以连接成为取代的或非取代的亚甲基键、醚键、硫键或氨基键，R₁与R₂、R₃与R₄或R₅与R₆可联系在一起成为酮；条件是R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆中至多4个是Cl；R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆中至多2个是HNR₇；R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆中至多2个是SH，且源自于环上一个碳上的两个R基不都是OH。

在优选的实施方案中，起始单元不选自1-环己烯羧酸和1-环庚烯羧酸。

在优选的实施方案中：在R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆是F和OH取代的结合，至多取代R_1-6的3个，且剩余的为H。在R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆是Cl和OH取代的结合时，R_1-6中至多取代3个，且剩余的为H。相同碳上，在R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆的任意两个是OH，且剩余两个R基是F时，剩余的为H。在R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆的两个是Cl时，剩余的为H。在不是源自于相同碳的R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆的两个是Cl且还有一个R是OH时，剩余的是H。在R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆的一个是烷基时，则剩余的是H；烷基应是长度不大于3个碳的线性烷基。在R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆的一个是NHR₇时，则剩余的是H。

在还更高度优选的实施方案中：在R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆的一个是F时，剩余的是H。在R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆的一个是Cl时，剩余的是H。在R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆的一个是F且第二个R基是OH(不是源自于相同的碳)时，剩余的是H。在R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆的一个是Cl且第二个R基是OH(不是源自于相同的碳)时，剩余的是H。在R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆的一个是烷基时，剩余的是H；烷基应至多包含4个碳且具有不多于3个碳的线性长度。在R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆的一个是烷基且第二个R基是OH(不是源自于相同的碳)时，剩余的是H；烷基应至多包含4个碳且具有不多于3个碳的线性长度。

本发明的进一步方面包括添加式

的起始单元，其中X＝键或CH₂，R₁和R₂可以相同或不同，且可独立地为F、Cl、OH、SH、H、CN、OR₇、C(O)R₇或NHR₇，其中R₇是C1-C4烷基，R₁与R₂连接到一起成为酮、螺环丙基或带有-OCH₂-、-CH₂O-、-SCH₂-或-CH₂S-；此外R₃和R₄可以相同或不同，且可独立地为F、Cl、Br、OR₇、H或CN；条件是源自于环上一个碳上的两个R基不都是OH。

在优选的实施方案中，起始单元不应该是5-顺-羟基-3-环己烯羧酸。

在优选的实施方案中，其中R₁、R₂、R₃或R₄中的两个是F，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃或R₄中的一个是Cl，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃或R₄中的一个是F且R₁或R₂之一是OH，其余的是H。其中R₁或R₂之一是SH，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃或R₄中的一个是烷基，其余的是H；烷基应至多包含4个碳且具有不大于3个碳的线性长度。其中R₃或R₄之一是烷基且R₁或R₂至一是OH，其余的是H；且烷基应至多包含4个碳并具有不大于3个碳的线性长度。

在更高度优选的实施方案中，其中R₁、R₂、R₃或R₄之一是F，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃或R₄之一是Cl，其余的是H。

本发明的进一步方面包括添加式

的起始单元，其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆可以相同或不同，且可独立地为Cl、F、OH、SH、H、烷基、CN、Br、R₇、OR₇、C(O)R₇或HNR₇，其中R₇是C1-C4烷基；R₁与R₃、R₂与R₄、R₃与R₅、R₄与R₆、R₁与R₅或R₂与R₆连接成为取代的或非取代的亚甲基键、醚键、硫键或氨基键，R₃与R₄或R₅与R₆可联结在一起成为酮；条件是源自于环上一个碳上的两个R基不都是OH。

在优选的实施方案中：其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆中的两个是F，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆中的两个是OH，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆中的两个是OH且第三个R基是F，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆中的两个是OH且第三个R基是Cl，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆中的两个是F且第三个R基是OH，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆之一是Br，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆之一是Br且第二个R基是OH，其余的是H。

在更优选的实施方案中：其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆之一是F，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆之一是Cl，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆之一是F且第二个R基是OH(不是源自于相同的碳)，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆之一是Cl且第二个R基是OH(不是源自于相同的碳)，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆之一是SH，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆之一是SH且第二个R基是OH(不是源自于相同的碳)，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆之一是烷基，其余的是H；烷基应至多包含4个碳并具有不大于3个碳的线性长度。其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆之一是烷基且第二个R基是OH(不是源自于相同的碳)，其余的是H；且烷基应至多包含4个碳并具有不大于3个碳的线性长度。

本发明的进一步方面包括添加式

在优选的实施方案中：其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆是F和OH取代结合，至多取代了R_1-6中的3个，且其余的为H。其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆是Cl和OH取代结合，至多取代了R_1-6中的3个，且其余的为H。其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆中的两个是OH且在是OH的碳上剩余的两个R基是F，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆中的两个是Cl，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆中的两个是Cl(不是源自于相同的碳)且第三个R基是OH，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆之一是烷基，其余的是H；烷基应具有不大于3个碳的线性长度。其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆中的两个是SH，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆之一是HNR₇，其余的是H。

在更优选的实施方案中：其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆中的两个是F，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆中的两个是OH，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆中的两个是OH且第三个R基是F，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆中的两个是OH且第三个R基是Cl，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆中的两个是F且第三个R基是OH，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆之一是Br，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆之一是Br且第二个R基是OH(不是源自于相同的碳)，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆之一是SH，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆之一是SH且第二个R基是OH(不是源自于相同的碳)，其余的是H。

在更优选的实施方案中：其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆之一是F，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆之一是Cl，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆之一是F且第二个R基是OH(不是源自于相同的碳)，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆之一是Cl且第二个R基是OH(不是源自于相同的碳)，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆之一是烷基，其余的是H；烷基应至多包含4个碳并具有不大于3个碳的线性长度。其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆之一是烷基且第二个R基是OH(不是源自于相同的碳)，其余的是H；且烷基应至多包含4个碳并具有不大于3个碳的线性长度。

本发明的进一步方面包括添加式

的起始单元，其中R₁与R₂可以相同或不同，且可独立地为F、Cl、OH、SH、H、CN、OR₇、C(O)R₇或NHR₇，其中R₇是C1-C4烷基，R₁与R₂可联结在一起成为酮、螺环丙基或带有-OCH₂-、-CH₂O-、-SCH₂-或-CH₂S-；此外，R₃与R₄可以相同或不同，且可独立地为F、Cl、Br、OR₇、H或CN；条件是源自于环上一个碳上的两个R基不都是OH。

在优选的实施方案中：其中R₁、R₂、R₃和R₄之一是F，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃和R₄之一是Cl，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃和R₄之一是F且第二个R基是OH(不是源自于相同的碳)，其余的是H。其余的是H。其中R₁、R₂、R₃和R₄之一是Cl且第二个R基是OH(不是源自于相同的碳)，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃和R₄之一是SH，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃和R₄之一是烷基，其余的是H；且烷基应至多包含4个碳并具有不大于3个碳的线性长度。其中R₁、R₂、R₃和R₄之一是烷基且第二个R基是OH(不是源自于相同的碳)，其余的是H；且烷基应至多包含4个碳并具有不大于3个碳的线性长度。其中R₁、R₂、R₃和R₄中的两个是F，其余的是H。

本发明的另外一方面包括添加式

的起始单元，其中X＝键或CH₂；且R₁、R₂、R₃、R₄或R₅可相同或不同，且可独立地为Cl、F、OH、SH、H、烷基、CN、Br、R₇、OR₇、C(O)R₇或HNR₇，其中R₇是C1-C4烷基，R₁与R₃、R₂与R₄，可联结在一起成为酮，或连接成为取代的或非取代的亚甲基键、醚键、硫键或氨基键，其中R₁与R₂或R₃与R₄连接成为螺环丙基或带有-OCH₂-或-CH₂O-或-SCH₂-或-CH₂S-，R₅可以是F、CL、OR₇、H或CN；条件是R₁、R₂、R₃、R₄或R₅中至多两个是SH，且连在一个碳上的两个R基不都是OH。

在优选的实施方案中：在R₁、R₂、R₃、R₄或R₅是F和OH的结合时，R₁、R₂、R₃、R₄或R₅中至多取代了3个，且其余的是H。在R₁、R₂、R₃、R₄或R₅是Cl和OH地结合时，R_1-5中至多取代了3个，且其余的是H。在R₁、R₂、R₃、R₄或R₅的两个是OH(不在相同碳上)且在一个碳上的两个是F的结合时，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄或R₅中的两个是Cl，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄或R₅中的两个是Cl(不是源自于相同的碳)且第三个R基是OH，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄或R₅之一是烷基，其余的是H；且烷基应具有不大于3个碳的线性长度。其中R₁、R₂、R₃、R₄或R₅中的两个是SH，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄或R₅之一是NHR₇，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄或R₅之一是SH，其余的是H。

在更高度优选的实施方案中：其中R₁、R₂、R₃、R₄或R₅之一是OH，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄或R₅之一是F，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄或R₅之一是Cl，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄或R₅之一是F且第二个R基是OH(不是源自于相同的碳)，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄或R₅之一是Cl且第二个R基是OH(不是源自于相同的碳)，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄或R₅之一是SH且第二个R基是OH(不是源自于相同的碳)，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄或R₅之一是烷基，其余的是H；且烷基应至多包含4个碳，并具有不大于3个碳的线性长度。其中R₁、R₂、R₃、R₄或R₅之一是烷基且第二个R基是OH(不是源自于相同的碳)，其余的是H；且烷基应之多包含4个碳，并具有不大于3个碳的线性长度。且烷基应至多包含4个碳，并具有不大于3个碳的线性长度。其中R₁、R₂、R₃、R₄或R₅中的两个是F，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄或R₅中的两个是OH，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄或R₅中的两个是OH且第三个R基是F，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄或R₅中的两个是OH且第三个R基是Cl，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃、R₄或R₅中的两个是F且第三个R基是OH，其余的是H。

本发明的另一方面包括添加式

的起始单元，其中R₁、R₂、R₃和R₄可以相同或不同，且可以独立地为Cl、F、OH、SH、H、烷基、CN、Br、R₇、OR₇、C(O)R₇或HNR₇，其中R₇是C1-C4烷基，R₁与R₂或R₃与R₄可连接在一起成为酮，条件是连接到相同碳上的两个R基不都是OH。

在优选的实施方案中：其中R₁、R₂、R₃或R₄之一是F，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃或R₄之一是Cl，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃或R₄之一是Br，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃或R₄之一是OH，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃或R₄之一是F且第二个R基是OH(不是源自于相同的碳)，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃或R₄之一是Cl且第二个R基是OH(不是源自于相同的碳)，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃或R₄之一是SH，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃或R₄之一是SH且第二个R基是OH(不是源自于相同的碳)，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃或R₄之一是烷基，其余的是H；烷基应至多包含4个碳且具有不大于3个碳的线性长度。其中R₁、R₂、R₃或R₄之一是烷且第二个R基是OH(不是源自于相同的碳)，其余的是H；烷基应至多包含4个碳且具有不大于3个碳的线性长度。其中R₁、R₂、R₃或R₄的两个是F，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃或R₄的两个是OH，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃或R₄的两个是OH且第三个R基是F，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃或R₄的两个是OH且第三个R基是Cl，其余的是H。其中R₁、R₂、R₃或R₄的两个是F且第三个R基是OH，其余的是H。

在优选的实施方案中，本发明提供了通过带有缺失或失活了rapK或rapK同源物的菌株将下列物质有效掺入FKBP-配基类似物的方法，所述物质为2-降冰片烷羧酸、2-(顺/反)-羟基环己烷羧酸、3-(顺/反)-羟基环己烷羧酸、4-(顺/反)-羟基环己烷羧酸；2-(顺/反)-甲基环己烷羧酸、4-(顺/反)-甲基环己烷羧酸、3-(顺/反)-甲氧基环己烷羧酸、4-(顺/反)-甲氧基环己烷羧酸、4-氧环己烷羧酸、乙基2-氧环己烷羧酸、4-反-正-戊烷基环己烷羧酸、2-反-氨基环己烷羧酸、4-顺-氨基环己烷羧酸、4-(顺/反)-氨甲基环己烷羧酸、环戊烷羧酸、环丁烷羧酸、1-甲基环己烷羧酸、3-反-羟基-4-顺-氟环己烷羧酸和4-反-羟基-3-顺-氟环己烷羧酸、3-顺-羟基-4-反-氟环己烷羧酸和4-顺-羟基-3-反-氟环己烷羧酸、3-顺-羟基-4-反-氯环己烷羧酸和4-顺-羟基-3-反-氯环己烷羧酸、3-反-羟基-4-顺-氯环己烷羧酸和4-反-羟基-3-顺-氯环己烷羧酸、3-反-氧化环己烯羧酸、3-顺-氧化环己烯羧酸、3，4-顺-二羟基环己烷羧酸和3，4-反-二羟基环己烷羧酸、环己烷乙酸、环己烷丙酸或4-顺/反-叔-丁基环己烷羧酸或其简单的酯或盐。在更优选的实施方案中，本发明提供了通过带有缺失或失活了rapK或rapK同源物的菌株将下列物质有效掺入FKBP-配基类似物的方法，所述物质3-(顺/反)-羟基环己烷羧酸、4-(顺/反)-羟基环己烷羧酸、3-(顺/反)-甲氧基环己烷羧酸、4-(顺/反)-甲氧基环己烷羧酸、4-氧代环己烷羧酸、环丁烷羧酸、3-反-羟基-4-顺-氟环己烷羧酸和4-反-羟基-3-顺-氟环己烷羧酸、3-顺-羟基-4-反-氟环己烷羧酸和4-顺-羟基-3-反-氟环己烷羧酸、3-顺-羟基-4-反-氯环己烷羧酸和4-顺-羟基-3-反-氯环己烷羧酸、3-反-羟基-4-顺-氯环己烷羧酸和4-反-羟基-3-顺-氯环己烷羧酸、3-反-氧化环己烯羧酸、3-顺-氧化环己烯羧酸、3，4-顺-二羟基环己烷羧酸和3，4-反-二羟基环己烷羧酸、环己烷丙酸、4-顺/反-叔-丁基环己烷羧酸或其简单的酯或盐。

在本发明的特定实施方案中，添加的起始单元不是环己烷羧酸、3-顺，4-反-二羟基环己烷羧酸、1-环己烯羧酸、3-环己烯羧酸、环己烷羧酸、3-(顺/反)-甲基环己烷羧酸、4-(顺/反)-甲基环己烷羧酸、1-环己烯羧酸或5-顺-羟基-3-环己烯羧酸。

上述实施方案中所用的菌株选自：吸水链霉菌吸水亚种NRRL 5491、游动放线菌种N902-109 FERM BP-3832、链霉菌种AA6554、吸水链霉菌子囊菌变种MA 6475 ATCC 14891、吸水链霉菌子囊菌变种MA 6678ATCC 55087、吸水链霉菌子囊菌变种MA 6674、吸水链霉菌子囊菌变种ATCC 55276、吸水链霉菌子囊菌变种ATCC 14891、筑波链霉菌No.9993FERM BP-927、吸水链霉菌屋九岛亚种、链霉菌属种DSM 4137、链霉菌种DSM 7348、微单孢菌n.sp.A92-306401 DSM 8429、链霉菌种MA 6858ATCC 55098、链霉菌种MA 6848。在优选的实施方案中，所述菌株选自：吸水链霉菌吸水亚种NRRL 5491、游动放线菌种N902-109 FERMBP-3832、链霉菌种AA6554、吸水链霉菌子囊菌变种MA 6475 ATCC14891、吸水链霉菌子囊菌变种MA 6678 ATCC 55087、吸水链霉菌子囊菌变种MA 6674、吸水链霉菌子囊菌变种ATCC 55276、吸水链霉菌子囊菌变种ATCC 14891、筑波链霉菌No.9993 FERM BP-927、吸水链霉菌屋九岛亚种、链霉菌种DSM 4137、链霉菌种DSM 7348、微单孢菌n.sp.A92-306401 DSM 8429或链霉菌种MA 6858 ATCC 55098。在更优选的实施方案中，菌株是雷帕霉菌吸水产生菌吸水链霉素亚种。

在有效掺入上面所描述的经添加羧酸的方法中，产生的化合物是如这里所述的FKBP-配基的类似物，其中所述FKBP-配基例如但不限于：雷帕霉素、FK506、FK520、FK523、FK525、antascomicin、meridamycin和筑波霉素。在优选的实施方案中，产生的化合物是雷帕霉素、FK506或FK520的类似物。在更高度优选的实施方案中，产生的化合物是雷帕霉素的类似物；这些化合物与下面所述的式II或式III一致。

此外，上面所述的方法可用于产生对应于下述式I的新型FK506和FK520类似物：

式I：

R₂＝H、烷基、卤素、羟基、硫醇基

R₃＝H、烷基、卤素、羟基、硫醇基

R₄＝H、烷基、卤素、羟基、硫醇基

R₅＝OMe、Me或H

R₆＝OMe、Me或H

R₇＝CH₂CH₃或CH₂CH＝CH₂

Z＝酮或CH₂

X＝X’＝键；X＝键和X’＝CH₂、S、O或X＝CH₂、S、O、融合的环丙基单元和X’＝键

在优选的实施方案中，

或

其中R₈＝OH和R₉＝H、OH、卤素、烷基或硫醇基。

在进一步优选实施方案中，

或

其中，R₈＝OH和R₉＝卤素。

其中，R₈＝4-反-OH，R₉＝3-顺-OCH₃，和R₂＝R₃＝R₄＝H，X＝CH₂，X’＝键，Z＝酮，R₅＝R₆＝OCH₃和R₇＝CH₂CH₃。

其中，R₈＝4-反-OH，R₉＝3-顺-OCH₃，和R₂＝R₃＝R₄＝H，X＝CH₂，X’＝键，Z＝酮，R₅＝R₆＝OCH₃和R₇＝CH₂CH＝CH₂。

因此，例如，在环己酸羧酸存在下可以培养重组菌株吸水链霉菌MG2-10以产生9-脱氧-16-O-脱甲基-27-脱甲氧基-39-脱甲氧基-雷帕霉素(实施例12)。本领域内技术人员能够看出：在编码FKBP-配基的其它生物合成簇内的rapK的同源物也可以缺失或失活，这就允许有效添加起始单元羧酸，从而产生新型类似物，所述FKBP-配基包括但不限于FK506、FK520、FK523、FK525、meridamycin、筑波霉素、antascomicin和‘hyg’。

在另一方面，本发明的吸水链霉菌菌株(包含rapL或rapL同源物或不包含rapL或rapL同源物和/或包含rapK或rapK同源物或不包含rapK或rapK同源物)可以用如上所述的L-六氢吡啶羧酸的类似物与如上所述的天然4，5-二羟基环己1-烯羧酸起始单元的类似物结合进行添加，以产生其中已经取代了起始单元和六氢吡啶基残基的雷帕霉素类似物。本方法在实施例10、11和12中进行例证。

本发明提供用于产生这样的FKBP-配基类似物的方法，所述FKBP-配基类似物在后-PKS修饰程度方面变化和/或其中取代了六氢吡啶羧酸残基，并任选地取代了起始4，5-二羟基环己-1烯羧酸残基。该方法包括删除或失活微生物宿主细胞内的一个或多个这样的基因，进而抑制天然产物的产生，其中所述基因参与前体化合物L-六氢吡啶羧酸和/或4，5-二羟基环己-1烯羧酸的产生，该前体化合物是雷帕霉素聚酮化合物/NRPS模板的生物合成和/或在其随后的后-PKS修饰中所需要的。本方法进一步包括用编码聚酮化合物修饰基因的核酸转化微生物宿主细胞以恢化聚酮化合物产生、在适宜聚酮化合物产生条件下培养转化的宿主细胞和任选地分离产生的雷帕霉素类似物。

本发明提供用于产生FKBP-配基类似物的方法，所述FKBP-配基包括但不限于FK506、FK520、FK523、FK525、筑波霉素、antascomicin、meridamycin和‘hyg’，所述类似物为在后-PKS修饰程度方面发生了变化和/或在其中取代了氨基酸残基，并任选地取代了起始单元。该方法包括删除或失活微生物宿主细胞内一个或多个这样的基因，从而抑制天然产物产生的步骤，其中所述基因参与为聚酮化合物/NRPS模板的生物合成和/或在其随后的后-PKS修饰中所需要的前体氨基酸残基和/或起始单元的产生。该方法进一步包括用编码聚酮化合物修饰基因的核酸转化微生物宿主细胞以恢复聚酮化合物产生、在适宜聚酮化合物产生条件下培养转化的微生物宿主细胞和任选地分离产生的聚酮化合物类似物。

本发明提供了新型FKBP-配基类似物。

在本发明的另一方面提供了下面的FK520类似物：31-去甲氧基-FK520、31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-反-羟基-FK520、31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-顺-羟基-FK520、31-去甲氧基-31-反-羟基-32-反-羟基-FK520、31-O-去甲基-32-脱羟基-FK520、31-O-去甲基-FK520、31-去甲氧基-31-甲基-FK520、31-O-去甲基-32-脱羟基-32-甲基-FK520、31-O-去甲基-32-脱羟基-32-氟-FK520、31-去甲氧基-31-氟-FK520、31-O-去甲基-32-脱羟基-32-氯-FK520、31-去甲氧基-31-氯-FK520、31-O-去甲基-32-脱羟基-32-叔-丁基-FK520、29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-环庚基)-FK520、29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-降冰片基)-FK520、9-脱氧-31-去甲氧基-FK520、9-脱氧-31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-反-羟基-FK520、9-脱氧-31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-顺-羟基-FK520、9-脱氧-31-去甲氧基-31-反-羟基-32-反-羟基-FK520、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-FK520、9-脱氧-31-O-去甲基-FK520、9-脱氧-31-去甲氧基-31-甲基-FK520、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-32-甲基-FK520、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-32-氟-FK520、9-脱氧-31-去甲氧基-31-氟-FK520、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-32-氯-FK520、9-脱氧-31-去甲氧基-31-氯-FK520、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-32-叔-丁基-FK520、9-脱氧-29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-环庚基)-FK520、9-脱氧-29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-降冰片基)-FK520、30-去甲氧基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-反-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-顺-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-反-羟基-31-反-羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-31-脱羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-甲基-丙基-FK520、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-甲基-丙基-FK520、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氟-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-氟-丙基-FK520、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氯-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-氯-丙基-FK520、30-去甲基-31-脱羟基-31-叔-丁基-丙基-FK520、28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-环庚基)-FK520、28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-降冰片基)-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-31-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-反-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-顺-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-反-羟基-31-反-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-甲基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-甲基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氟-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-氟-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氯-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-氯-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-叔-丁基-丙基-FK520、8-脱氧-28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-环庚基)-丙基-FK520、8-脱氧-28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-降冰片基)-丙基-FK520、30-去甲氧基-3-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-反-羟基-3-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-顺-羟基-3-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-反-羟基-31-反-羟基-3-羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-31-脱羟基-3-羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-3-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-甲基-3-羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-甲基-3-羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氟-3-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-氟-3-羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氯-3-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-氯-3-羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-叔-丁基-3-羟基-丙基-FK520、28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-环庚基)-3-羟基-丙基-FK520、28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-降冰片基)-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-31-羟基-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-反-羟基-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-顺-羟基-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-反-羟基-31-反-羟基-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-甲基-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-甲基-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氟-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-氟-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氯-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-氯-3-羟基-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-叔-丁基-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-环庚基)-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-降冰片基)-3-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-4-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-反-羟基-4-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-顺-羟基-4-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-反-羟基-31-反-羟基-4-羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-31-脱羟基-4-羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-4-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-甲基-4-羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-甲基-4-羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氟-4-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-氟-4-羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氯-4-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-氯-4-羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-叔-丁基-4-羟基-丙基-FK520、28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-环庚基)-4-羟基-丙基-FK520、28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-降冰片基)-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-31-羟基-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-反-羟基-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-顺-羟基-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-反-羟基-31-反-羟基-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-甲基-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-甲基-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氟-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-氟-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氯-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-氯-3-羟基-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-叔-丁基-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-环庚基)-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-降冰片基)-4-羟基-丙基-FK520、31-去甲氧基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-反-羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-顺-羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、31-去甲氧基-31-反-羟基-32-反-羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、31-O-去甲基-32-脱羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、31-O-去甲基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、31-去甲氧基-31-甲基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、31-O-去甲基-32-脱羟基-32-甲基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、31-O-去甲基-32-脱羟基-32-氟-反-3-二环[3.1.0.]FK520、31-去甲氧基-31-氟-反-3-二环[3.1.0.]FK520、31-O-去甲基-32-脱羟基-32-氯-反-3-二环[3.1.0.]FK520、31-去甲氧基-31-氯-反-3-二环[3.1.0.]FK520、31-O-去甲基-32-脱羟基-32-叔-丁基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-环庚基)-反-3-二环[3.1.0.]FK520、29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-降冰片基)-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-去甲氧基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-反-羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-顺-羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-去甲氧基-31-反-羟基-32-反-羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-O-去甲基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-去甲氧基-31-甲基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-32-甲基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-32-氟-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-去甲氧基-31-氟-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-32-氯-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-去甲氧基-31-氯-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-32-叔-丁基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-环庚基)-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-降冰片基)-反-3-二环[3.1.0.]FK520。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了下面的FK520类似物：31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-反-羟基-FK520、31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-顺-羟基-FK520、31-去甲氧基-31-反-羟基-32-反-羟基-FK520、31-去甲氧基-31-甲基-FK520、31-去甲氧基-31-氟-FK520、31-去甲氧基-31-氯-FK520、31-O-去甲基-32-脱羟基-32-叔-丁基-FK520、29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-环庚基)-FK520、29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-降冰片基)-FK520、9-脱氧-31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-反-羟基-FK520、9-脱氧-31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-顺-羟基-FK520、9-脱氧-31-去甲氧基-31-反-羟基-32-反-羟基-FK520、9-脱氧-31-去甲氧基-31-甲基-FK520、9-脱氧-31-去甲氧基-31-氟-FK520、9-脱氧-31-去甲氧基-31-氯-FK520、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-32-叔-丁基-FK520、9-脱氧-29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-环庚基)-FK520、9-脱氧-29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-降冰片基)-FK520、30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-反-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-顺-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-反-羟基-31-反-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-甲基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-氟-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-氯-丙基-FK520、30-去甲基-31-脱羟基-31-叔-丁基-丙基-FK520、28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-环庚基)-FK520、28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-降冰片基)-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-31-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-反-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-顺-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-反-羟基-31-反-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-甲基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-甲基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氟-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-氟-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氯-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-氯-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-叔-丁基-丙基-FK520、8-脱氧-28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-环庚基)-丙基-FK520、8-脱氧-28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-降冰片基)-丙基-FK520、30-去甲氧基-3-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-反-羟基-3-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-顺-羟基-3-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-反-羟基-31-反-羟基-3-羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-31-脱羟基-3-羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-3-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-甲基-3-羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-甲基-3-羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氟-3-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-氟-3-羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氯-3-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-氯-3-羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-叔-丁基-3-羟基-丙基-FK520、28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-环庚基)-3-羟基-丙基-FK520、28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-降冰片基)-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-31-羟基-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-反-羟基-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-顺-羟基-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-反-羟基-31-反-羟基-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-甲基-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-甲基-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氟-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-氟-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氯-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-氯-3-羟基-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-叔-丁基-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-环庚基)-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-降冰片基)-3-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-4-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-反-羟基-4-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-顺-羟基-4-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-反-羟基-31-反-羟基-4-羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-31-脱羟基-4-羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-4-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-甲基-4-羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-甲基-4-羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氟-4-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-氟-4-羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氯-4-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-氯-4-羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-叔-丁基-4-羟基-丙基-FK520、28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-环庚基)-4-羟基-丙基-FK520、28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-降冰片基)-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-31-羟基-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-反-羟基-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-顺-羟基-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-反-羟基-31-反-羟基-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-甲基-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-甲基-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氟-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-氟-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氯-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-氯-3-羟基-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-叔-丁基-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-环庚基)-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-降冰片基)-4-羟基-丙基-FK520、31-去甲氧基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-反-羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-顺-羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、31-去甲氧基-31-反-羟基-32-反-羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、31-O-去甲基-32-脱羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、31-O-去甲基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、31-去甲氧基-31-甲基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、31-O-去甲基-32-脱羟基-32-甲基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、31-O-去甲基-32-脱羟基-32-氟-反-3-二环[3.1.0.]FK520、31-去甲氧基-31-氟-反-3-二环[3.1.0.]FK520、31-O-去甲基-32-脱羟基-32-氯-反-3-二环[3.1.0.]FK520、31-去甲氧基-31-氯-反-3-二环[3.1.0.]FK520、31-O-去甲基-32-脱羟基-32-叔-丁基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-环庚基)-反-3-二环[3.1.0.]FK520、29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-降冰片基)-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-去甲氧基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-反-羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-顺-羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-去甲氧基-31-反-羟基-32-反-羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-O-去甲基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-去甲氧基-31-甲基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-32-甲基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-32-氟-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-去甲氧基-31-氟-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-32-氯-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-去甲氧基-31-氯-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-32-叔-丁基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-环庚基)-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-降冰片基)-反-3-二环[3.1.0.]FK520。

在一个更高度优选的实施方案中，本发明提供了下面的新型FK520类似物：31-去甲氧基-31-甲基-FK520、31-去甲氧基-31-氟-FK520、31-去甲氧基-31-氯-FK520、31-O-去甲基-32-脱羟基-32-叔-丁基-FK520、29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-环庚基)-FK520、29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-降冰片基)-FK520、9-脱氧-31-去甲氧基-31-甲基-FK520、9-脱氧-31-去甲氧基-31-氟-FK520、9-脱氧-31-去甲氧基-31-氯-FK520、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-32-叔-丁基-FK520、9-脱氧-29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-环庚基)-FK520、9-脱氧-29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-降冰片基)-FK520、30-去甲氧基-30-甲基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-氟-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-氯-丙基-FK520、30-去甲基-31-脱羟基-31-叔-丁基-丙基-FK520、28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-环庚基)-FK520、28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-降冰片基)-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-31-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-反-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-顺-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-反-羟基-31-反-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-甲基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-甲基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氟-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-氟-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氯-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-氯-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-叔-丁基-丙基-FK520、8-脱氧-28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-环庚基)-丙基-FK520、8-脱氧-28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-降冰片基)-丙基-FK520、30-去甲氧基-3-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-反-羟基-3-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-顺-羟基-3-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-反-羟基-31-反-羟基-3-羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-31-脱羟基-3-羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-3-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-甲基-3-羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-甲基-3-羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氟-3-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-氟-3-羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氯-3-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-氯-3-羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-叔-丁基-3-羟基-丙基-FK520、28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-环庚基)-3-羟基-丙基-FK520、28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-降冰片基)-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-31-羟基-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-反-羟基-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-顺-羟基-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-反-羟基-31-反-羟基-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-甲基-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-甲基-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氟-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-氟-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氯-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-氯-3-羟基-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-叔-丁基-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-环庚基)-3-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-降冰片基)-3-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-4-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-反-羟基-4-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-顺-羟基-4-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-反-羟基-31-反-羟基-4-羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-31-脱羟基-4-羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-4-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-甲基-4-羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-甲基-4-羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氟-4-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-氟-4-羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氯-4-羟基-丙基-FK520、30-去甲氧基-30-氯-4-羟基-丙基-FK520、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-叔-丁基-4-羟基-丙基-FK520、28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-环庚基)-4-羟基-丙基-FK520、28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-降冰片基)-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-31-羟基-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-反-羟基-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-顺-羟基-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-反-羟基-31-反-羟基-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-甲基-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-甲基-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氟-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-氟-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氯-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-去甲氧基-30-氯-3-羟基-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-叔-丁基-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-环庚基)-4-羟基-丙基-FK520、8-脱氧-28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-降冰片基)-4-羟基-丙基-FK520、31-去甲氧基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-反-羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-顺-羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、31-去甲氧基-31-反-羟基-32-反-羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、31-O-去甲基-32-脱羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、31-O-去甲基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、31-去甲氧基-31-甲基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、31-O-去甲基-32-脱羟基-32-甲基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、31-O-去甲基-32-脱羟基-32-氟-反-3-二环[3.1.0.]FK520、31-去甲氧基-31-氟-反-3-二环[3.1.0.]FK520、31-O-去甲基-32-脱羟基-32-氯-反-3-二环[3.1.0.]FK520、31-去甲氧基-31-氯-反-3-二环[3.1.0.]FK520、31-O-去甲基-32-脱羟基-32-叔-丁基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-环庚基)-反-3-二环[3.1.0.]FK520、29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-降冰片基)-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-去甲氧基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-反-羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-顺-羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-去甲氧基-31-反-羟基-32-反-羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-O-去甲基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-去甲氧基-31-甲基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-32-甲基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-32-氟-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-去甲氧基-31-氟-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-32-氯-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-去甲氧基-31-氯-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-32-叔-丁基-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-环庚基)-反-3-二环[3.1.0.]FK520、9-脱氧-29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-降冰片基)-反-3-二环[3.1.0.]FK520。

另一方面本发明提供了下面的FK506类似物：31-去甲氧基-FK506、31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-反-羟基-FK506、31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-顺-羟基-FK506、31-去甲氧基-31-反-羟基-32-反-羟基-FK506、31-O-去甲基-32-脱羟基-FK506、31-O-去甲基-FK506、31-去甲氧基-31-甲基-FK506、31-O-去甲基-32-脱羟基-32-甲基-FK506、31-O-去甲基-32-脱羟基-32-氟-FK506、31-去甲氧基-31-氟-FK506、31-O-去甲基-32-脱羟基-32-氯-FK506、31-去甲氧基-31-氯-FK506、31-O-去甲基-32-脱羟基-32-叔-丁基-FK506、29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-环庚基)-FK506、29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-降冰片基)-FK506、9-脱氧-31-去甲氧基-FK506、9-脱氧-31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-反-羟基-FK506、9-脱氧-31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-顺-羟基-FK506、9-脱氧-31-去甲氧基-31-反-羟基-32-反-羟基-FK506、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-FK506、9-脱氧-31-O-去甲基-FK506、9-脱氧-31-去甲氧基-31-甲基-FK506、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-32-甲基-FK506、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-32-氟-FK506、9-脱氧-31-去甲氧基-31-氟-FK506、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-32-氯-FK506、9-脱氧-31-去甲氧基-31-氯-FK506、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-32-叔-丁基-FK506、9-脱氧-29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-环庚基)-FK506、9-脱氧-29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-降冰片基)-FK506、30-去甲氧基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-反-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-顺-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-反-羟基-31-反-羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-31-脱羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-甲基-丙基-FK506、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-甲基-丙基-FK506、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氟-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-氟-丙基-FK506、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氯-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-氯-丙基-FK506、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-叔-丁基-丙基-FK506、28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-环庚基)-FK506、28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-降冰片基)-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-31-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-反-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-顺-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-反-羟基-31-反-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-甲基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-甲基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氟-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-氟-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氯-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-氯-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-叔-丁基-丙基-FK506、8-脱氧-28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-环庚基)-丙基-FK506、8-脱氧-28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-降冰片基)-丙基-FK506、30-去甲氧基-3-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-反-羟基-3-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-顺-羟基-3-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-反-羟基-31-反-羟基-3-羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-31-脱羟基-3-羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-3-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-甲基-3-羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-甲基-3-羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氟-3-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-氟-3-羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氯-3-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-氯-3-羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-叔-丁基-3-羟基-丙基-FK506、28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-环庚基)-3-羟基-丙基-FK506、28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-降冰片基)-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-31-羟基-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-反-羟基-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-顺-羟基-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-反-羟基-31-反-羟基-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-甲基-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-甲基-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氟-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-氟-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氯-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-氯-3-羟基-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-叔-丁基-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-环庚基)-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-降冰片基)-3-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-4-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-反-羟基-4-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-顺-羟基-4-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-反-羟基-31-反-羟基-4-羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-31-脱羟基-4-羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-4-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-甲基-4-羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-甲基-4-羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氟-4-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-氟-4-羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氯-4-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-氯-4-羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-叔-丁基-4-羟基-丙基-FK506、28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-环庚基)-4-羟基-丙基-FK506、28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-降冰片基)-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-31-羟基-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-反-羟基-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-顺-羟基-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-反-羟基-31-反-羟基-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-甲基-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-甲基-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氟-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-氟-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氯-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-氯-3-羟基-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-叔-丁基-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-环庚基)-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-降冰片基)-4-羟基-丙基-FK506、31-去甲氧基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-反-羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-顺-羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、31-去甲氧基-31-反-羟基-32-反-羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、31-O-去甲基-32-脱羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、31-O-去甲基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、31-去甲氧基-31-甲基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、31-O-去甲基-32-脱羟基-32-甲基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、31-O-去甲基-32-脱羟基-32-氟-反-3-二环[3.1.0.]FK506、31-去甲氧基-31-氟-反-3-二环[3.1.0.]FK506、31-O-去甲基-32-脱羟基-32-氯-反-3-二环[3.1.0.]FK506、31-去甲氧基-31-氯-反-3-二环[3.1.0.]FK506、31-O-去甲基-32-脱羟基-32-叔-丁基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-环庚基)-反-3-二环[3.1.0.]FK506、29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-降冰片基)-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-去甲氧基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-反-羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-顺-羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-去甲氧基-31-反-羟基-32-反-羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-O-去甲基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-去甲氧基-31-甲基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-32-甲基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-32-氟-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-去甲氧基-31-氟-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-32-氯-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-去甲氧基-31-氯-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-32-叔-丁基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-环庚基)-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-降冰片基)-反-3-二环[3.1.0.]FK506。

在一个优选的实施方案中本发明提供了下面的FK506类似物：31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-反-羟基-FK506、31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-顺-羟基-FK506、31-去甲氧基-31-反-羟基-32-反-羟基-FK506、31-去甲氧基-31-甲基-FK506、31-O-去甲基-32-脱羟基-32-叔-丁基-FK506、29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-环庚基)-FK506、29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-降冰片基)-FK506、9-脱氧-31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-反-羟基-FK506、9-脱氧-31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-顺-羟基-FK506、9-脱氧-31-去甲氧基-31-反-羟基-32-反-羟基-FK506、9-脱氧-31-去甲氧基-31-甲基-FK506、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-32-叔-丁基-FK506、9-脱氧-29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-环庚基)-FK506、9-脱氧-29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-降冰片基)-FK506、30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-反-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-顺-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-反-羟基-31-反-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-甲基-丙基-FK506、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-叔-丁基-丙基-FK506、28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-环庚基)-FK506、28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-降冰片基)-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-反-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-顺-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-反-羟基-31-反-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-甲基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-叔-丁基-丙基-FK506、8-脱氧-28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-环庚基)-丙基-FK506、8-脱氧-28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-降冰片基)-丙基-FK506、30-去甲氧基-3-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-反-羟基-3-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-顺-羟基-3-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-反-羟基-31-反-羟基-3-羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-31-脱羟基-3-羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-3-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-甲基-3-羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-甲基-3-羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氟-3-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-氟-3-羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氯-3-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-氯-3-羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-叔-丁基-3-羟基-丙基-FK506、28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-环庚基)-3-羟基-丙基-FK506、28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-降冰片基)-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-31-羟基-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-反-羟基-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-顺-羟基-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-反-羟基-31-反-羟基-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-甲基-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-甲基-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氟-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-氟-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氯-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-氯-3-羟基-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-叔-丁基-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-环庚基)-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-降冰片基)-3-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-4-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-反-羟基-4-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-顺-羟基-4-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-反-羟基-31-反-羟基-4-羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-31-脱羟基-4-羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-4-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-甲基-4-羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-甲基-4-羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氟-4-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-氟-4-羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氯-4-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-氯-4-羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-叔-丁基-4-羟基-丙基-FK506、28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-环庚基)-4-羟基-丙基-FK506、28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-降冰片基)-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-31-羟基-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-反-羟基-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-顺-羟基-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-反-羟基-31-反-羟基-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-甲基-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-甲基-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氟-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-氟-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氯-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-氯-3-羟基-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-叔-丁基-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-环庚基)-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-降冰片基)-4-羟基-丙基-FK506、31-去甲氧基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-反-羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-顺-羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、31-去甲氧基-31-反-羟基-32-反-羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、31-O-去甲基-32-脱羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、31-O-去甲基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、31-去甲氧基-31-甲基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、31-O-去甲基-32-脱羟基-32-甲基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、31-O-去甲基-32-脱羟基-32-氟-反-3-二环[3.1.0.]FK506、31-去甲氧基-31-氟-反-3-二环[3.1.0.]FK506、31-O-去甲基-32-脱羟基-32-氯-反-3-二环[3.1.0.]FK506、31-去甲氧基-31-氯-反-3-二环[3.1.0.]FK506、31-O-去甲基-32-脱羟基-32-叔-丁基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-环庚基)-反-3-二环[3.1.0.]FK506、29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-降冰片基)-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-去甲氧基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-反-羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-顺-羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-去甲氧基-31-反-羟基-32-反-羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-O-去甲基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-去甲氧基-31-甲基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-32-甲基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-32-氟-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-去甲氧基-31-氟-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-32-氯-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-去甲氧基-31-氯-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-32-叔-丁基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-环庚基)-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-降冰片基)-反-3-二环[3.1.0.]FK506。

在更优选的实施方案中，本发明提供了下面的FK506类似物：31-去甲氧基-31-甲基-FK506、31-O-去甲基-32-脱羟基-32-叔-丁基-FK506、29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-环庚基)-FK506、29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-降冰片基)-FK506、9-脱氧-31-去甲氧基-31-甲基-FK506、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-32-叔-丁基-FK506、9-脱氧-29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-环庚基)-FK506、9-脱氧-29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-降冰片基)-FK506、30-去甲氧基-30-甲基-丙基-FK506、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-叔-丁基-丙基-FK506、28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-环庚基)-FK506、28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-降冰片基)-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-甲基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-叔-丁基-丙基-FK506、8-脱氧-28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-环庚基)-丙基-FK506、8-脱氧-28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-降冰片基)-丙基-FK506、30-去甲氧基-3-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-反-羟基-3-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-顺-羟基-3-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-反-羟基-31-反-羟基-3-羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-31-脱羟基-3-羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-3-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-甲基-3-羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-甲基-3-羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氟-3-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-氟-3-羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氯-3-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-氯-3-羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-叔-丁基-3-羟基-丙基-FK506、28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-环庚基)-3-羟基-丙基-FK506、28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-降冰片基)-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-31-羟基-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-反-羟基-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-顺-羟基-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-反-羟基-31-反-羟基-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-甲基-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-甲基-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氟-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-氟-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氯-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-氯-3-羟基-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-叔-丁基-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-环庚基)-3-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-降冰片基)-3-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-4-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-反-羟基-4-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-顺-羟基-4-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-反-羟基-31-反-羟基-4-羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-31-脱羟基-4-羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-4-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-甲基-4-羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-甲基-4-羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氟-4-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-氟-4-羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氯-4-羟基-丙基-FK506、30-去甲氧基-30-氯-4-羟基-丙基-FK506、30-O-去甲基-31-脱羟基-31-叔-丁基-4-羟基-丙基-FK506、28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-环庚基)-4-羟基-丙基-FK506、28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-降冰片基)-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-31-羟基-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-反-羟基-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-顺-羟基-31-顺-羟基-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-反-羟基-31-反-羟基-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-甲基-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-甲基-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氟-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-氟-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-氯-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-去甲氧基-30-氯-3-羟基-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-30-O-去甲基-31-脱羟基-31-叔-丁基-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-环庚基)-4-羟基-丙基-FK506、8-脱氧-28-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-28-(羟基-降冰片基)-4-羟基-丙基-FK506、31-去甲氧基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-反-羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-顺-羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、31-去甲氧基-31-反-羟基-32-反-羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、31-O-去甲基-32-脱羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、31-O-去甲基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、31-去甲氧基-31-甲基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、31-O-去甲基-32-脱羟基-32-甲基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、31-O-去甲基-32-脱羟基-32-氟-反-3-二环[3.1.0.]FK506、31-去甲氧基-31-氟-反-3-二环[3.1.0.]FK506、31-O-去甲基-32-脱羟基-32-氯-反-3-二环[3.1.0.]FK506、31-去甲氧基-31-氯-反-3-二环[3.1.0.]FK506、31-O-去甲基-32-脱羟基-32-叔-丁基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-环庚基)-反-3-二环[3.1.0.]FK506、29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-降冰片基)-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-去甲氧基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-反-羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-去甲氧基-31-顺-羟基-32-顺-羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-去甲氧基-31-反-羟基-32-反-羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-O-去甲基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-去甲氧基-31-甲基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-32-甲基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-32-氟-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-去甲氧基-31-氟-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-32-氯-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-去甲氧基-31-氯-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-31-O-去甲基-32-脱羟基-32-叔-丁基-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-环庚基)-反-3-二环[3.1.0.]FK506、9-脱氧-29-脱(3-甲氧基-4-羟基-环己基)-29-(羟基-降冰片基)-反-3-二环[3.1.0.]FK506。

在本发明的另一方面提供了：

A：下式化合物：

其中：

x＝键或CHR₁₁，或-CHR₆-x-CHR₅-为

R₁₅＝

R₁＝OH、OCH₃

R₂＝H、OH、OCH₃

R₃＝H、OH、CH₃、F、Cl、OCH₃

R₄＝H、OH、CH₃、F、Cl

R₅＝H、OH

R₆＝H、OH

R₇＝H

R₈＝H、酮

R₉＝H、酮

R₁₀＝H

R₁₁＝H

R₁₃＝H

R₁₄＝H

R₁₆＝OH、OCH₃

R₁₇＝H、OH、Cl、F和

y＝键、CH₂

条件是这些化合物不包括下面的：

i)其中R₁＝OCH₃并且R₂＝H，R₁₅＝C，R₁₆＝顺-3-OH，R₁₇＝反-4-OH，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，R₈＝H，R₉＝H，R₁₀＝H，R₁₁＝H，x＝CHR₁₁；

ii)其中R₁＝OH并且R₂＝OCH₃，R₁₅＝C，R₁₆＝顺-3-OH，R₁₇＝反-4-OH，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，R₈，R₉＝酮，R₁₀＝H R₁₁＝H，x＝CHR₁₁；

iii)其中R₁＝OH并且R₂＝OH，R₁₅＝C，R₁₆＝顺-3-OCH₃，R₁₇＝反-4-OH，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，R₈，R₉＝酮，R₁₀＝H，R₁₁＝H，x＝CHR₁₁；

iv)其中R₁＝OH并且R₂＝H，R₁₅＝C，R₁₆＝顺-3-OCH₃，R₁₇＝反-4-OH，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，R₈，R₉＝酮，R₁₀＝H，R₁₁＝H，x＝CHR₁₁；

v)其中R₁＝OCH₃并且R₂＝H，R₁₅＝C，R₁₆＝顺-3-OH，R₁₇＝反-4-OH，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，R₈，R₉＝酮，R₁₀＝H，R₁₁＝H，x＝CHR₁₁；

vi)其中R₁＝OCH₃并且R₂＝H，R₁₅＝C，R₁₆＝顺-3-OCH₃，R₁₇＝反-4-OH，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，R₈＝H，R₉＝H，R₁₀＝H，R₁₁＝H，x＝CHR₁₁；

vii)其中R₁＝OCH₃并且R₂＝OH，R₁₅＝C，R₁₆＝顺-3-OCH₃，R₁₇＝反-4-OH，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，R₈＝H，R₉＝H，R₁₀＝H，R₁₁＝H，x＝CHR₁₁；

viii)其中R₁＝OCH₃并且R₂＝OCH₃，R₁₅＝C，R₁₆＝顺-3-OCH₃，R₁₇＝反-4-OH，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，R₈＝H，R₉＝H，R₁₀＝H，R₁₁＝H，x＝CHR₁₁；

ix)其中R₁＝OH并且R₂＝OCH₃，R₁₅＝C，R₁₆＝顺-3-OCH₃，R₁₇＝反-4-OH，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，R₈，R₉＝酮，R₁₀＝H，R₁₁＝H，x＝CHR₁₁；

x)其中R₁＝OCH₃并且R₂＝OH，R₁₅＝C，R₁₆＝顺-3-OCH₃，R₁₇＝反-4-OH，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，R₈，R₉＝酮，R₁₀＝H，R₁₁＝H，x＝CHR₁₁；

xi)其中R₁＝OCH₃并且R₂＝H，R₁₅＝C，R₁₆＝顺-3-OCH₃，R₁₇＝反-4-OH，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，R₈，R₉＝酮，R₁₀＝H，R₁₁＝H，x＝CHR₁₁；

xii)其中R₁＝OCH₃并且R₂＝OCH₃，R₁₅＝C，R₁₆＝顺-3-OH，R₁₇＝反-4-OH，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，R₈，R₉＝酮，R₁₀＝H，R₁₁＝H，x＝CHR₁₁；

xiii)其中R₁＝OCH₃并且R₂＝H，R₁₅＝C，R₁₆＝顺-3-OCH₃，R₁₇＝反-4-OH，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，R₈＝H，R₉＝H，R₁₀＝H，x＝键；

xiv)其中R₁＝OCH₃并且R₂＝OCH₃，R₁₅＝C，R₁₆＝顺-3-OCH₃，R₁₇＝反-4-OH，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，R₈＝H，R₉＝H，R₁₀＝H，x＝键；

xv)其中R₁＝OCH₃并且R₂＝OH，R₁₅＝C，R₁₆＝顺-3-OCH₃，R₁₇＝反-4-OH，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，R₈，R₉＝酮，R₁₀＝H，x＝键；

xvi)其中R₁＝OCH₃并且R₂＝H，R₁₅＝C，R₁₆＝顺-3-OCH₃，R₁₇＝反-4-OH，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，R₈，R₉＝酮，R₁₀＝H，x＝键；

xvii)其中R₁＝OCH₃并且R₂＝OCH₃，R₁₅＝C，R₁₆＝H，R₁₇＝OH，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，R₈，R₉＝酮，R₁₀＝H，R₁₁＝H，x＝CHR₁₁；

xviii)其中-CHR₆-x-CHR₅-为并且R₁₁＝H，R₁₃＝H，R₁₄＝H，并且R₁＝OCH₃，R₂＝OCH₃，R₁₅＝C，R₁₆＝顺-3-OCH₃，R₁₇＝反-4-OH，R₇＝H，R₈，R₉＝酮，R₁₀＝H；

xix)其中R₁₅＝G，R₁₆＝顺-3-OCH₃，R₁₇＝反-4-OH，y＝键，并且R₁＝OCH₃，R₂＝H，R₅＝H，R₆＝OH，R₇＝H，R₁₁＝H，x＝键，R₈，R₉＝酮，R₁₀＝H

xx)其中R₁₅＝G，R₃＝H，R₄＝反-OH，y＝键，并且R₁＝OCH₃，R₂＝OCH₃，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，R₁₁＝H，x＝CHR₁₁，R₈，R₉＝酮，R₁₀＝H

xxi)其中R₁₅＝G，R₃＝H，R₄＝OH，y＝CH₂并且R₁＝OCH₃，R₂＝OCH₃，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，R₁₁＝H，x＝CHR₁₁，R₈，R₉＝酮，R₁₀＝H

xxii)其中R₁₅＝G，R₃＝顺-OH，R₄＝H，y＝键，并且R₁＝OCH₃，R₂＝OCH₃，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，R₁₁＝H，x＝CHR₁₁，R₈，R₉＝酮，R₁₀＝H

xxiii)其中R₁₅＝G，R₃＝CH₃，R₄＝OH，y＝键，并且R₁＝OCH₃，R₂＝OCH₃，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，R₁₁＝H，x＝CHR₁₁，R₈，R₉＝酮，R₁₀＝H

xxiv)其中R₁₅＝G，R₃＝H，R₄＝OH，y＝CH₂，并且R₁＝OH，R₂＝OH，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，R₁₁＝H，x＝CHR₁₁，R₈＝R₉＝H，R₁₀＝H

xxv)其中R₁₅＝G，R₃＝H，R₄＝OH，y＝CH₂，并且R₁＝OCH₃，R₂＝OCH₃，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，R₁₁＝H，x＝CHR₁₁，R₈＝R₉＝H，R₁₀＝H

xxvi)其中R₁₅＝G，R₃＝H，R₄＝OH，y＝CH₂，并且R₁＝OH，R₂＝OCH₃，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，R₁₁＝H，x＝CHR₁₁，R₈＝R₉＝H，R₁₀＝H

xxvii)其中R₁₅＝G，R₃＝H，R₄＝OH，y＝CH₂，并且R₁＝OH，R₂＝H，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，R₁₁＝H，x＝CHR₁₁，R₈＝R₉＝H，R₁₀＝H；

xxviii)其中R₁₅＝G，R₃＝H，R₄＝OH，y＝CH₂，并且R₁＝OH，R₂＝OCH₃，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，R₁₁＝H，x＝CHR₁₁，R₈，R₉＝酮，R₁₀＝H

xxix)其中R₁₅＝G，R₃＝H，R₄＝OH，y＝CH₂，并且R₁＝OCH₃，R₂＝H，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，R₁₁＝H，x＝CHR₁₁，R₈，R₉＝酮，R₁₀＝H

B.根据下式的化合物

其中

R₁＝OH、OCH₃

R₂＝H、OH、OCH₃

R₃＝H、OH、CH₃、OCH₃

R₄＝H、OH

R₅＝H

R₆＝H、OH

R₇＝H

R₈＝H、酮

R₉＝H、酮

R₁₀＝H

x＝键、CH₂或-CHR₆-x-CHR₅-是

R₁₁＝H

R₁₃＝H

R₁₄＝H

y＝键、CH₂

条件是这些化合物不包括下面的：

i)其中R₃＝H，R₄＝反-OH，y＝键，并且R₁＝OCH₃，R₂＝OCH₃，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，x＝CH₂，R₈，R₉＝酮，R₁₀＝H

ii)其中R₃＝H，R₄＝OH，y＝CH₂并且R₁＝OCH₃，R₂＝OCH₃，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，x＝CH₂，R₈，R₉＝酮，R₁₀＝H

iii)其中R₃＝顺-OH，R₄＝H，y＝键，并且R₁＝OCH₃，R₂＝OCH₃，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，x＝CH₂，R₈，R₉＝酮，R₁₀＝H

iv)其中R₃＝CH₃，R₄＝OH，y＝键，并且R₁＝OCH₃，R₂＝OCH₃，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，x＝CH₂，R₈，R₉＝酮，R₁₀＝H

v)其中R₃＝H，R₄＝OH，y＝CH₂，并且R₁＝OH，R₂＝OH，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，x＝CH₂，R₈＝R₉＝H，R₁₀＝H

vi)其中R₃＝H，R₄＝OH，y＝CH₂，并且R₁＝OCH₃，R₂＝OCH₃，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，x＝CH₂，R₈＝R₉＝H，R₁₀＝H

vii)其中R₃＝H，R₄＝OH，y＝CH₂，并且R₁＝OH，R₂＝OCH₃，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，x＝CH₂，R₈＝R₉＝H，R₁₀＝H

viii)其中R₃＝H，R₄＝OH，y＝CH₂，并且R₁＝OH，R₂＝H，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，x＝CH₂，R₈＝R₉＝H，R₁₀＝H；

ix)其中R₃＝H，R₄＝OH，y＝CH₂，并且R₁＝OH，R₂＝OCH₃，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，x＝CH₂，R₈，R₉＝酮，R₁₀＝H

x)其中R₃＝H，R₄＝OH，y＝CH₂，并且R₁＝OCH₃，R₂＝H，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，x＝CH₂，R₈，R₉＝酮，R₁₀＝H

xi)其中R₃＝OCH₃，R₄＝OH，y＝键，并且R₁＝OCH₃，R₂＝H，R₅＝H，R₆＝OH，R₇＝H，x＝键，R₈，R₉＝酮，R₁₀＝H

xii)其中-CHR₆-x-CHR₅-为且R₁₁＝H，R₁₃＝H，R₁₄＝H，并且R₁＝OCH₃，R₂＝OCH₃，R₃＝OCH₃，R₄＝OH，R₇＝H，R₈，R₉＝酮，R₁₀＝H

xiii)其中R₁＝OCH₃并且R₂＝H，R₃＝OCH₃，R₄＝OH，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，R₈＝H，R₉＝H，R₁₀＝H，x＝键，y＝键

xiv)其中R₁＝OCH₃并且R₂＝OCH₃，R₃＝OCH₃，R₄＝OH，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，R₈＝H，R₉＝H，R₁₀＝H，x＝键，y＝键

xv)其中R₁＝OCH₃并且R₂＝OH，R₃＝OCH₃，R₄＝OH，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，R₈，R₉＝酮，R₁₀＝H，x＝键，y＝键

xvi)其中R₁＝OCH₃并且R₂＝H，R₃＝OCH₃，R₄＝OH，R₅＝H，R₆＝H，R₇＝H，R₈，R₉＝酮，R₁₀＝H，x＝键，y＝键

xvii)其中R₁＝OCH₃，R₂＝H，R₃＝OH，R₄＝OH，R₈＝H，R₉＝H

xviii)其中R₁＝OCH₃，R₂＝H，R₃＝OCH₃，R₄＝OH，R₈＝H，R₉＝H

xix)其中R₁＝OCH₃，R₂＝H，R₃＝OH，R₄＝OH，R₈，R₉＝酮

xx)其中R₁＝OH，R₂＝OH，R₃＝OCH₃，R₄＝OH，R₈，R₉＝酮

xxi)其中R₁＝OCH₃，R₂＝OCH₃，R₃＝OH，R₄＝OH，R₈，R₉＝酮

xxii)其中R₁＝OCH₃，R₂＝OH，R₃＝OCH₃，R₄＝OH，R₈，R₉＝酮

xxiii)其中R₁＝OCH₃，R₂＝OCH₃，R₃＝OCH₃，R₄＝OH，R₈＝H，R₉＝H

C.选自如下的化合物：9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-O-去甲基-雷帕霉素(前-雷帕霉素)、9-脱氧-16-O-去甲基-27-O-去甲基-39-O-去甲基-雷帕霉素、16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-O-去甲基-雷帕霉素、9-脱氧-16-O-去甲基-39-O-去甲基-雷帕霉素、9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-雷帕霉素、16-O-去甲基-27-O-去甲基-39-O-去甲基-雷帕霉素、9-脱氧-27-O-去甲基-39-O-去甲基-雷帕霉素、9-脱氧-16-O-去甲基-27-O-去甲基-雷帕霉素、27-O-去甲基-39-O-去甲基-雷帕霉素、9-脱氧-16-O-去甲基-雷帕霉素、9-脱氧-39-O-去甲基-雷帕霉素、8-脱氧-15-O-去甲基-26-去甲氧基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素(前-脯氨酰雷帕霉素)、8-脱氧-15-O-去甲基-26-O-去甲基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素、15-O-去甲基-26-去甲氧基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素、8-脱氧-26-去甲氧基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素、8-脱氧-15-O-去甲基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素、8-脱氧-15-O-去甲基-26-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素、15-O-去甲基-26-O-去甲基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素、8-脱氧-26-O-去甲基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素、8-脱氧-15-O-去甲基-26-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素、15-O-去甲基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素、15-O-去甲基-26-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素、15-O-去甲基-26-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素、26-去甲氧基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素、26-O-去甲基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素、8-脱氧-15-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素、8-脱氧-26-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素、8-脱氧-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素、15-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素、38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素、9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-去甲氧基-雷帕霉素、9-脱氧-16-O-去甲基-27-O-去甲基-39-去甲氧基-雷帕霉素、16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-去甲氧基-雷帕霉素、9-脱氧-27-去甲氧基-39-去甲氧基-雷帕霉素、9-脱氧-16-O-去甲基-39-去甲氧基-雷帕霉素、16-O-去甲基-27-O-去甲基-39-去甲氧基-雷帕霉素、9-脱氧-27-O-去甲基-39-去甲氧基-雷帕霉素、16-O-去甲基-39-去甲氧基-雷帕霉素、27-去甲氧基-39-去甲氧基-雷帕霉素、27-O-去甲基-39-去甲氧基-雷帕霉素、9-脱氧-39-去甲氧基-雷帕霉素、8-脱氧-15-O-去甲基-26-去甲氧基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素、8-脱氧-15-O-去甲基-26-O-去甲基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素、15-O-去甲基-26-去甲氧基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素、8-脱氧-26-去甲氧基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素、8-脱氧-15-O-去甲基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素、15-O-去甲基-26-O-去甲基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素、8-脱氧-26-O-去甲基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素、15-O-去甲基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素、26-去甲氧基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素、26-O-去甲基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素、8-脱氧-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素、38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素、9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(羟基环己烯基)雷帕霉素、9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(二羟基环己基)雷帕霉素、9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(羟基降冰片基)雷帕霉素、9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(3-甲基-4-羟基环己基)雷帕霉素、9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(4-甲基羟基环己基)雷帕霉素、9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(3-氟-4-羟基环己基)雷帕霉素、9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(3-羟基-4-氟环己基)雷帕霉素、9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(3-氯-4-羟基环己基)雷帕霉素、9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(3-羟基-4-氯环己基)雷帕霉素、9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(3-顺-4-顺-二羟基环己基)雷帕霉素、9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(3-反-4-反-二羟基环己基)雷帕霉素、9-脱氧-16-O-去甲基-27-O-去甲基-39-O-去甲基雷帕霉素、9-脱氧-16-O-去甲基-27O-去甲基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(羟基环己烯基)雷帕霉素、9-脱氧-16-O-去甲基-27-O-去甲基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(羟基降冰片基)雷帕霉素、9-脱氧-16-O-去甲基-27-O-去甲基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(4-甲基羟基环己基)雷帕霉素。

在本发明的特定实施方案中描述了产生和任选地分离下面化合物的方法(图10、图11、图12、图13、和图14、15、16和图17)：

表II

化合物编号：	名称：
化合物编号：	名称：	1.	9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-O-去甲基-雷帕霉素(前-雷帕霉素)
2.	9-脱氧-16-O-去甲基-27-O-去甲基-39-O-去甲基-雷帕霉素	1.	9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-O-去甲基-雷帕霉素(前-雷帕霉素)

化合物编号：	名称：
化合物编号：	名称：	3.	16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-O-去甲基-雷帕霉素
4.	9-脱氧-27-去甲氧基-39-O-去甲基-雷帕霉素	3.	16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-O-去甲基-雷帕霉素
4.	9-脱氧-27-去甲氧基-39-O-去甲基-雷帕霉素	5.	9-脱氧-16-O-去甲基-39-O-去甲基-雷帕霉素
6.	9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-雷帕霉素	5.	9-脱氧-16-O-去甲基-39-O-去甲基-雷帕霉素
6.	9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-雷帕霉素	7.	16-O-去甲基-27-O-去甲基-39-O-去甲基-雷帕霉素
8.	9-脱氧-27-O-去甲基-39-O-去甲基-雷帕霉素	7.	16-O-去甲基-27-O-去甲基-39-O-去甲基-雷帕霉素
8.	9-脱氧-27-O-去甲基-39-O-去甲基-雷帕霉素	9.	9-脱氧-16-O-去甲基-27-O-去甲基-雷帕霉素
10.	16-O-去甲基-39-O-去甲基-雷帕霉素	9.	9-脱氧-16-O-去甲基-27-O-去甲基-雷帕霉素
10.	16-O-去甲基-39-O-去甲基-雷帕霉素	11.	16-O-去甲基-27-O-去甲基-雷帕霉素
12.	16-O-去甲基-27-去甲氧基-雷帕霉素	11.	16-O-去甲基-27-O-去甲基-雷帕霉素
12.	16-O-去甲基-27-去甲氧基-雷帕霉素	13.	27-去甲氧基-39-O-去甲基-雷帕霉素
14.	27-O-去甲基-39-O-去甲基-雷帕霉素	13.	27-去甲氧基-39-O-去甲基-雷帕霉素
14.	27-O-去甲基-39-O-去甲基-雷帕霉素	15.	9-脱氧-16-O-去甲基-雷帕霉素
16.	9-脱氧-27-去甲氧基-雷帕霉素	15.	9-脱氧-16-O-去甲基-雷帕霉素
16.	9-脱氧-27-去甲氧基-雷帕霉素	17.	9-脱氧-27-O-去甲基-雷帕霉素
18.	9-脱氧-39-O-去甲基-雷帕霉素	17.	9-脱氧-27-O-去甲基-雷帕霉素
18.	9-脱氧-39-O-去甲基-雷帕霉素	19.	9-脱氧-雷帕霉素
20.	16-O-去甲基-雷帕霉素	19.	9-脱氧-雷帕霉素
20.	16-O-去甲基-雷帕霉素	21.	27-O-去甲基-雷帕霉素
22.	27-去甲氧基-雷帕霉素	21.	27-O-去甲基-雷帕霉素
22.	27-去甲氧基-雷帕霉素	23.	39-O-去甲基-雷帕霉素
24.	8-脱氧-15-O-去甲基-26-去甲氧基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素(前-脯氨酰雷帕霉素)	23.	39-O-去甲基-雷帕霉素
24.	8-脱氧-15-O-去甲基-26-去甲氧基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素(前-脯氨酰雷帕霉素)	25.	8-脱氧-15-O-去甲基-26-O-去甲基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素
26.	15-O-去甲基-26-去甲氧基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素	25.	8-脱氧-15-O-去甲基-26-O-去甲基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素

化合物编号：	名称：
化合物编号：	名称：	27.	8-脱氧-26-去甲氧基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素
28.	8-脱氧-15-O-去甲基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素	27.	8-脱氧-26-去甲氧基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素
28.	8-脱氧-15-O-去甲基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素	29.	8-脱氧-15-O-去甲基-26-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素
30.	15-O-去甲基-26-O-去甲基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素	29.	8-脱氧-15-O-去甲基-26-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素
30.	15-O-去甲基-26-O-去甲基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素	31.	8-脱氧-26-O-去甲基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素
32.	8-脱氧-15-O-去甲基-26-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素	31.	8-脱氧-26-O-去甲基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素
32.	8-脱氧-15-O-去甲基-26-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素	33.	15-O-去甲基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素
34.	15-O-去甲基-26-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素	33.	15-O-去甲基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素
34.	15-O-去甲基-26-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素	35.	15-O-去甲基-26-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素
36.	26-去甲氧基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素	35.	15-O-去甲基-26-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素
36.	26-去甲氧基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素	37.	26-O-去甲基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素
38.	8-脱氧-15-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素	37.	26-O-去甲基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素
38.	8-脱氧-15-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素	39.	8-脱氧-26-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素
40.	8-脱氧-26-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素	39.	8-脱氧-26-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素
40.	8-脱氧-26-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素	41.	8-脱氧-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素
42.	8-脱氧-脯氨酰雷帕霉素	41.	8-脱氧-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素
42.	8-脱氧-脯氨酰雷帕霉素	43.	15-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素
44.	26-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素	43.	15-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素
44.	26-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素	45.	26-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素
46.	38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素	45.	26-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素
46.	38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素	47.	9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-去甲氧基-雷帕霉素
48.	9-脱氧-16-O-去甲基-27-O-去甲基-39-去甲氧基-雷帕霉素	47.	9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-去甲氧基-雷帕霉素
48.	9-脱氧-16-O-去甲基-27-O-去甲基-39-去甲氧基-雷帕霉素	49.	16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-去甲氧基-雷帕霉素
50.	9-脱氧-27-去甲氧基-39-去甲氧基-雷帕霉素	49.	16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-去甲氧基-雷帕霉素
50.	9-脱氧-27-去甲氧基-39-去甲氧基-雷帕霉素	51.	9-脱氧-16-O-去甲基-39-去甲氧基-雷帕霉素
52.	16-O-去甲基-27-O-去甲基-39-去甲氧基-雷帕霉素	51.	9-脱氧-16-O-去甲基-39-去甲氧基-雷帕霉素

化合物编号：	名称：
化合物编号：	名称：	53.	9-脱氧-27-O-去甲基-39-去甲氧基-雷帕霉素
54.	16-O-去甲基-39-去甲氧基-雷帕霉素	53.	9-脱氧-27-O-去甲基-39-去甲氧基-雷帕霉素
54.	16-O-去甲基-39-去甲氧基-雷帕霉素	55.	27-去甲氧基-39-去甲氧基-雷帕霉素
56.	27-O-去甲基-39-去甲氧基-雷帕霉素	55.	27-去甲氧基-39-去甲氧基-雷帕霉素
56.	27-O-去甲基-39-去甲氧基-雷帕霉素	57.	9-脱氧-39-去甲氧基-雷帕霉素
58.	39-O-去甲氧基-雷帕霉素	57.	9-脱氧-39-去甲氧基-雷帕霉素
58.	39-O-去甲氧基-雷帕霉素	59.	8-脱氧-15-O-去甲基-26-去甲氧基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素
60.	8-脱氧-15-O-去甲基-26-O-去甲基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素	59.	8-脱氧-15-O-去甲基-26-去甲氧基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素
60.	8-脱氧-15-O-去甲基-26-O-去甲基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素	61.	15-O-去甲基-26-去甲氧基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素
62.	8-脱氧-26-去甲氧基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素	61.	15-O-去甲基-26-去甲氧基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素
62.	8-脱氧-26-去甲氧基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素	63.	8-脱氧-15-O-去甲基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素
64.	15-O-去甲基-26-O-去甲基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素	63.	8-脱氧-15-O-去甲基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素
64.	15-O-去甲基-26-O-去甲基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素	65.	8-脱氧-26-O-去甲基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素
66.	15-O-去甲基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素	65.	8-脱氧-26-O-去甲基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素
66.	15-O-去甲基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素	67.	26-去甲氧基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素
68.	26-O-去甲基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素	67.	26-去甲氧基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素
68.	26-O-去甲基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素	69.	8-脱氧-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素
70.	38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素	69.	8-脱氧-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素
70.	38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素	71	9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(羟基环己烯基)雷帕霉素
72	9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(二羟基环己基)雷帕霉素	71
72		73	9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(羟基降冰片基)雷帕霉素

化合物编号：	名称：
化合物编号：	名称：	74	9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(3-甲基-4-羟基环己基)雷帕霉素
75	9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(4-甲基羟基环己基)雷帕霉素	74
75		76	9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(3-氟-4-羟基环己基)雷帕霉素
77	9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(3-羟基-4-氟环己基)雷帕霉素	76
77		78	9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(3-氯-4-羟基环己基)雷帕霉素
79	9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(3-羟基-4-氯环己基)雷帕霉素	78
79		80	9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(3-顺-4-顺-二羟基环己基)雷帕霉素
81	9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(3-反-4-反-二羟基环己基)雷帕霉素	80
81		82	9-脱氧-16-O-去甲基-27-O-去甲基-39-O-去甲基雷帕霉素
83	9-脱氧-16-O-去甲基-27O-去甲基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(羟基环己烯基)雷帕霉素	82	9-脱氧-16-O-去甲基-27-O-去甲基-39-O-去甲基雷帕霉素
83		84	9-脱氧-16-O-去甲基-27-O-去甲基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(羟基降冰片基)雷帕霉素
85	9-脱氧-16-O-去甲基-27-O-去甲基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(4-甲基羟基环己基)雷帕霉素	84
85		86	9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(羟基环庚基)雷帕霉素
87	9-脱氧-16-O-去甲基-27-O-去甲基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(羟基环庚基)雷帕霉素	86

另一方面，本发明提供了下面的新型雷帕霉素类似物：

表III

化合物编号：	名称：
化合物编号：	名称：	1.	9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-O-去甲基-雷帕霉素(前-雷帕霉素)
2.	9-脱氧-16-O-去甲基-27-O-去甲基-39-O-去甲基-雷帕霉素	1.	9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-O-去甲基-雷帕霉素(前-雷帕霉素)
2.	9-脱氧-16-O-去甲基-27-O-去甲基-39-O-去甲基-雷帕霉素	3.	16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-O-去甲基-雷帕霉素
5.	9-脱氧-16-O-去甲基-39-O-去甲基-雷帕霉素	3.	16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-O-去甲基-雷帕霉素
5.	9-脱氧-16-O-去甲基-39-O-去甲基-雷帕霉素	6.	9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-雷帕霉素
7.	16-O-去甲基-27-O-去甲基-39-O-去甲基-雷帕霉素	6.	9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-雷帕霉素
7.	16-O-去甲基-27-O-去甲基-39-O-去甲基-雷帕霉素	8.	9-脱氧-27-O-去甲基-39-O-去甲基-雷帕霉素
9.	9-脱氧-16-O-去甲基-27-O-去甲基-雷帕霉素	8.	9-脱氧-27-O-去甲基-39-O-去甲基-雷帕霉素
9.	9-脱氧-16-O-去甲基-27-O-去甲基-雷帕霉素	14.	27-O-去甲基-39-O-去甲基-雷帕霉素
15.	9-脱氧-16-O-去甲基-雷帕霉素	14.	27-O-去甲基-39-O-去甲基-雷帕霉素
15.	9-脱氧-16-O-去甲基-雷帕霉素	18.	9-脱氧-39-O-去甲基-雷帕霉素
24.	8-脱氧-15-O-去甲基-26-去甲氧基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素(前-脯氨酰雷帕霉素)	18.	9-脱氧-39-O-去甲基-雷帕霉素
24.	8-脱氧-15-O-去甲基-26-去甲氧基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素(前-脯氨酰雷帕霉素)	25.	8-脱氧-15-O-去甲基-26-O-去甲基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素
26.	15-O-去甲基-26-去甲氧基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素	25.	8-脱氧-15-O-去甲基-26-O-去甲基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素
26.	15-O-去甲基-26-去甲氧基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素	27.	8-脱氧-26-去甲氧基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素
28.	8-脱氧-15-O-去甲基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素	27.	8-脱氧-26-去甲氧基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素
28.	8-脱氧-15-O-去甲基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素	29.	8-脱氧-15-O-去甲基-26-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素

化合物编号：	名称：
化合物编号：	名称：	30.	15-O-去甲基-26-O-去甲基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素
31.	8-脱氧-26-O-去甲基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素	30.	15-O-去甲基-26-O-去甲基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素
31.	8-脱氧-26-O-去甲基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素	32.	8-脱氧-15-O-去甲基-26-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素
33.	15-O-去甲基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素	32.	8-脱氧-15-O-去甲基-26-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素
33.	15-O-去甲基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素	34.	15-O-去甲基-26-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素
35.	15-O-去甲基-26-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素	34.	15-O-去甲基-26-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素
35.	15-O-去甲基-26-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素	36.	26-去甲氧基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素
37.	26-O-去甲基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素	36.	26-去甲氧基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素
37.	26-O-去甲基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素	38.	8-脱氧-15-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素
40.	8-脱氧-26-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素	38.	8-脱氧-15-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素
40.	8-脱氧-26-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素	41.	8-脱氧-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素
43.	15-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素	41.	8-脱氧-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素
43.	15-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素	46.	38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素
47.	9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-去甲氧基-雷帕霉素	46.	38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素
47.	9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-去甲氧基-雷帕霉素	48.	9-脱氧-16-O-去甲基-27-O-去甲基-39-去甲氧基-雷帕霉素
49.	16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-去甲氧基-雷帕霉素	48.	9-脱氧-16-O-去甲基-27-O-去甲基-39-去甲氧基-雷帕霉素
49.	16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-去甲氧基-雷帕霉素	50.	9-脱氧-27-去甲氧基-39-去甲氧基-雷帕霉素
51.	9-脱氧-16-O-去甲基-39-去甲氧基-雷帕霉素	50.	9-脱氧-27-去甲氧基-39-去甲氧基-雷帕霉素
51.	9-脱氧-16-O-去甲基-39-去甲氧基-雷帕霉素	52.	16-O-去甲基-27-O-去甲基-39-去甲氧基-雷帕霉素
53.	9-脱氧-27-O-去甲基-39-去甲氧基-雷帕霉素	52.	16-O-去甲基-27-O-去甲基-39-去甲氧基-雷帕霉素
53.	9-脱氧-27-O-去甲基-39-去甲氧基-雷帕霉素	54	16-O-去甲基-39-去甲氧基-雷帕霉素
55.	27-去甲氧基-39-去甲氧基-雷帕霉素	54	16-O-去甲基-39-去甲氧基-雷帕霉素
55.	27-去甲氧基-39-去甲氧基-雷帕霉素	56.	27-O-去甲基-39-去甲氧基-雷帕霉素
57.	9-脱氧-39-去甲氧基-雷帕霉素	56.	27-O-去甲基-39-去甲氧基-雷帕霉素
57.	9-脱氧-39-去甲氧基-雷帕霉素	59.	8-脱氧-15-O-去甲基-26-去甲氧基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素

化合物编号：	名称：
化合物编号：	名称：	60.	8-脱氧-15-O-去甲基-26-O-去甲基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素
61.	15-O-去甲基-26-去甲氧基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素	60.	8-脱氧-15-O-去甲基-26-O-去甲基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素
61.	15-O-去甲基-26-去甲氧基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素	62.	8-脱氧-26-去甲氧基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素
63.	8-脱氧-15-O-去甲基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素	62.	8-脱氧-26-去甲氧基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素
63.	8-脱氧-15-O-去甲基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素	64.	15-O-去甲基-26-O-去甲基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素
65.	8-脱氧-26-O-去甲基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素	64.	15-O-去甲基-26-O-去甲基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素
65.	8-脱氧-26-O-去甲基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素	66.	15-O-去甲基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素
67.	26-去甲氧基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素	66.	15-O-去甲基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素
67.	26-去甲氧基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素	68.	26-O-去甲基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素
69.	8-脱氧-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素	68.	26-O-去甲基-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素
69.	8-脱氧-38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素	70.	38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素
71	9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(羟基环己烯基)雷帕霉素	70.	38-去甲氧基-脯氨酰雷帕霉素
71		72	9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(二羟基环己基)雷帕霉素
73	9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(羟基降冰片基)雷帕霉素	72
73		74	9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(3-甲基-4-羟基环己基)雷帕霉素
75	9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(4-甲基羟基环己基)雷帕霉素	74
75		76	9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(3-氟-4-羟基环己基)雷帕霉素
77	9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(3-羟基-4-氟环己基)雷帕霉素	76

化合物编号：	名称：
化合物编号：	名称：	78	9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(3-氯-4-羟基环己基)雷帕霉素
79	9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(3-羟基-4-氯环己基)雷帕霉素	78
79		80	9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(3-顺-4-顺-二羟基环己基)雷帕霉素
81	9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(3-反-4-反-二羟基环己基)雷帕霉素	80
81		82	9-脱氧-16-O-去甲基-27-O-去甲基-39-O-去甲基雷帕霉素
83	9-脱氧-16-O-去甲基-27O-去甲基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(羟基环己烯基)雷帕霉素	82	9-脱氧-16-O-去甲基-27-O-去甲基-39-O-去甲基雷帕霉素
83		84	9-脱氧-16-O-去甲基-27-O-去甲基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(羟基降冰片基)雷帕霉素
85	9-脱氧-16-O-去甲基-27-O-去甲基-36-脱(3-顺-甲氧基-4-反-羟基环己基)-36-(4-甲基羟基环己基)雷帕霉素	84

另一方面，本发明提供了式II的新型雷帕霉素类似物：

式II：

其中

x＝键或CHR₁₁、或者-CHR₆-x-CHR₅-是

y＝键或CHR₁₂

R₁＝OH、OCH₃

R₂＝H、OH、OCH₃

R₃＝H、OH、OCH₃、烷基-、卤-、氨基-、硫醇基

R₄＝H、OH、OCH₃、烷基-、卤-、氨基-、硫醇基

R₅＝H、烷基-、卤-、羟基

R₆＝H、烷基-、卤-、羟基

R₇＝H、烷基-、卤-、羟基

R₈、R₉＝＝O或者H，H

R₁₀＝H、烷基-、卤-、羟基

R₁₁＝H、烷基-、卤-、羟基

R₁2＝H、烷基-、卤-、羟基

R₁₃＝H、烷基-、卤-、羟基

R₁₄＝H、烷基-、卤-、羟基

此外本发明提供了式III的新型雷帕霉素：

式III：

其中：

x＝键或CHR₁₁、或者-CHR₆-x-CHR₅-是

R₁＝OH、OCH₃

R₂＝H、OH、OCH₃

R₅＝H、烷基-、卤-、羟基

R₆＝H、烷基-、卤-、羟基

R₇＝H、烷基-、卤-、羟基

R₈、R₉＝＝O或者H，H

R₁₀＝H、烷基-、卤-、羟基

R₁₁＝H、烷基-、卤-、羟基

R₁2＝H、烷基-、卤-、羟基

R₁₃＝H、烷基-、卤-、羟基

R₁₄＝H、烷基-、卤-、羟基

R₁₆＝OH

R₁₇＝H、OH、卤-、硫醇基-、烷基-

新的雷帕霉素类似物直接使用，并且作为进一步半合成或生物转化的模板以产生有用化合物，作为免疫抑制剂、抗真菌剂、抗癌剂、神经再生剂或治疗牛皮癣、类风湿性关节炎、纤维化和其他超增生性疾病的药剂。

因此，另一方面，本发明提供了药物生产中产生的FKBP-配体类似物的用途，用于癌症治疗、真菌感染的治疗、自身免疫、炎性、增殖性和超增生性疾病的治疗或者免疫抑制的维持。

本领域技术人员将能够通过常规实验确定这些化合物抑制真菌生长的能力(例如Baker，H.，等，1978；NCCLS参考方法：对酵母进行肉汤稀释抗真菌易感性测试：批准标准M27-A，17(9).1997)并且例如但不限于使用实施例19中描述的方法。此外，本领域技术人员将能够通过常规实验确定这些化合物抑制肿瘤生长的能力，例如但不限于使用实施例19中描述的方法(也见Dudkin，L.等，2001；Yu等2001)。另一方面，本发明的化合物用于诱导免疫抑制并因此涉及治疗性或预防性诱导人或动物免疫系统的抑制以治疗或防止移植器官或组织的排斥、自身免疫、炎性、增殖性和超增生性疾病(例如包括但不限于自身免疫疾病、I型糖尿病、器官或组织移植的急性或慢性排斥、哮喘、肿瘤或超增殖性失调、牛皮癣、湿疹、类风湿性关节炎、纤维化、过敏和食物相关的过敏)的治疗。这些测定法是本领域技术人员熟知的，例如但不限于：免疫抑制活性-Warner，L.M.，等，1992，Kahan等(1991)&Kahan & Camardo，2001)；同种移植-Fishbein，T.M.，等，2002，Kirchner等2000；自身免疫/炎性/哮喘-Carlson，R.P.等，1993，Powell，N.等，2001；I型糖尿病-Rabinovitch，A.等，2002；牛皮癣-Reitamo，S.等，2001；类风湿性关节炎-Foey，A.，等，2002；纤维化-Zhu，J.等，1999，Jain，S.，等，2001，Gregory等1993。

本发明化合物诱导免疫抑制的能力可以在用于本目的的标准实验中阐明，例如但不限于使用实施例19中描述的方法。另一方面，本发明用于涉及抗纤维变性、神经再生、和抗血管生成机制，本领域技术人员将能够通过常规实验确定这些化合物防止血管生成的能力(例如Guba，M.，等，2002，)。本领域技术人员将能够通过常规实验确定这些化合物在斯坦特固定模中的功用(例如Morice，M.C.，等，2002)。此外，本领域技术人员将能够通过常规实验确定这些化合物的神经再生能力(例如Myckatyn，T.M.，等，2002，Steiner等1997)。

附图简述

图1雷帕霉素的结构，线的左边部分代表结合结构域，右边部分指出效应子结构域。

图2雷帕霉素(A)、FK-506(B)、FK-520(C)和meridamycin(D)的结构。

图3pMG55的质粒图，其为具有RpsL阳性选择和用于接合的oriT的双重组载体。

图4说明用于分离pMAG144-16以产生MG2-10的克隆策略的流程图。

图5基因表达盒概览。

图6 9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-O-去甲基雷帕霉素的结构。

图7 9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-O-去甲基脯氨酰雷帕霉素的结构。

图8 9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-去甲氧基雷帕霉素的结构。

图9 16-O-去甲基-27-去甲氧基雷帕霉素的结构。

图10化合物1、2、4、5、6、8、9、15、16、17、18和19的结构。

图11化合物3、7、10、11、12、13、14、20、21、22和23的结构。

图12化合物24、25、27、28、29、31、32、38、39、40、41和42的结构。

图13化合物26、30、33、34、35、36、37、43、44、45、和46的结构。

图14化合物47、48、50、51、53和57的结构。

图15化合物49、52、54、55、56、和58的结构。

图16化合物61、64、66、67、68、和70的结构。

图17化合物59、60、62、63、65、和69的结构。

图18前-雷帕霉素杂核多键一致性HMBC。

图19前-雷帕霉素杂核多量子一致性HMQC。

图20通过实箭头指出的前-雷帕霉素相关性光谱学(COSY)，通过点箭头指出的前-雷帕霉素总相关性光谱学(TOCSY)。

图21rapN的DNA序列的校正，校正的序列在顶部(SEQ ID NO：1)显示，公布的序列(登录号：X86780、nt 91764-92978)在下面显示(SEQID NO：2)。

图22RapN氨基酸序列的校正，校正序列(SEQ ID NO：3)在顶部显示，公布的序列(登录号：X86780)在下面显示(SEQ ID NO：4)。

图23rapM DNA序列的校正，校正的序列在顶部(SEQ ID NO：5)显示，公布的序列(登录号：X86780、nt 92992-93945互补)在下面显示(SEQ ID NO：6)。

图24RapM氨基酸序列的校正，校正的序列在顶部显示(SEQ IDNO：7)，公布的序列(登录号：X86780)在下面显示(SEQ ID NO：8)。

图25rapL DNA序列的校正，校正的序列在顶部显示(SEQ ID NO：9)，公布的序列(登录号：X86780、nt 94047-95078互补)在底部显示(SEQID NO：10)。

图26RapL氨基酸序列的校正，校正的序列在顶部显示(SEQ IDNO：11)，公布的序列(登录号：X86780)在下面显示(SEQ ID NO：12)。

图27rapK DNA序列的校正，校正的序列在顶部显示(SEQ ID NO：13)，公布的序列(登录号：X86780、nt 95430-96434)在底部显示(SEQ IDNO：14)。

图28RapK氨基酸序列的校正，校正的序列在顶部显示(SEQ IDNO：15)，公布的序列(登录号：X86780)在下面显示(SEQ ID NO：16)。

图29rapJ DNA序列的校正，校正的序列在顶部显示(SEQ ID NO：17)，公布的序列(登录号：X86780、nt 96465-97625)在底部显示(SEQ IDNO：18)。

图30RapJ氨基酸序列的校正，校正的序列在顶部显示(SEQ ID NO：19)，公布的序列(登录号：X86780)在下面显示(SEQ ID NO：20)。

图31rapI DNA序列的校正，校正的序列在顶部显示(SEQ ID NO：21)，公布的序列(登录号：X86780、nt 97622-98404)在底部显示(SEQ IDNO：22)。

图32RapI氨基酸序列的校正，校正的序列在顶部显示(SEQ ID NO：23)，公布的序列(登录号：X86780)在下面显示(SEQ ID NO：24)。

图33rapQ DNA序列的校正，校正的序列在顶部显示(SEQ ID NO：25)，公布的序列(登录号：X86780、nt 90798-91433)在底部显示(SEQ IDNO：26)。

图34RapQ氨基酸序列的校正，校正的序列在顶部显示(SEQ IDNO：27)，公布的序列(登录号：X86780)在下面显示(SEQ ID NO：28)。

图35说明分离pMG278-1以产生MG3的流程图。

图36说明分离pMG267-1以产生MG4的流程图。

材料和方法

材料

所有分子生物学酶和试剂来自商业来源。D/L六氢吡啶羧酸来自Sigma。

起始材料

表IV概括了实施例章节中描述的添料实验中所用酸的来源。对于购买的那些化合物给出了来源细节。对于在室内合成的那些起始酸给出了简要的合成方法。本领域技术人员将明了对于所描述方法的修改是常规的并且位于本发明范围内。

表IV

酸	公司	产品编号	合成
酸	公司	产品编号	合成	环己烷羧酸	Aldrich	10，183-4
3-顺，4-反-二羟基环己烷羧酸			室内，通过Lowden博士论文中方法	环己烷羧酸	Aldrich	10，183-4
3-顺，4-反-二羟基环己烷羧酸			室内，通过Lowden博士论文中方法	1-环己烯羧酸	Aldrich	32，836-7
3-环己烯羧酸	Aldrich	45，375-7		1-环己烯羧酸	Aldrich	32，836-7
3-环己烯羧酸	Aldrich	45，375-7		环庚烷羧酸	Aldrich	C9，850-0
甲基-2-降冰片烷羧酸盐	Aldrich	S40，932-4		环庚烷羧酸	Aldrich	C9，850-0
甲基-2-降冰片烷羧酸盐	Aldrich	S40，932-4		2-(顺/反)-羟基环己烷羧酸	U.Nottingham		R Goss博士合成
3-(顺/反)-羟基环己烷羧酸	U.Nottingham		R Goss博士合成	2-(顺/反)-羟基环己烷羧酸	U.Nottingham		R Goss博士合成
3-(顺/反)-羟基环己烷羧酸	U.Nottingham		R Goss博士合成	4-(顺/反)-羟基环己烷羧酸	U.Nottingham		R Goss博士合成
2-(顺/反)-甲基环己烷羧酸	Aldrich	33，060-4		4-(顺/反)-羟基环己烷羧酸	U.Nottingham		R Goss博士合成
2-(顺/反)-甲基环己烷羧酸	Aldrich	33，060-4		3-(顺/反)-甲基环己烷羧酸	Aldrich	33，061-2
4-(顺/反)-甲基环己烷羧酸	Aldrich	33，062-0		3-(顺/反)-甲基环己烷羧酸	Aldrich	33，061-2
4-(顺/反)-甲基环己烷羧酸	Aldrich	33，062-0		3-(顺/反)-甲氧基环己烷羧酸	Aldrich	33，283-6
4-(顺/反)-甲氧基环己烷羧酸	Aldrich	33，284-4		3-(顺/反)-甲氧基环己烷羧酸	Aldrich	33，283-6
4-(顺/反)-甲氧基环己烷羧酸	Aldrich	33，284-4		乙基4-环己酮羧酸盐	Aldrich	32，062-5
乙基2-环己酮羧酸盐	Aldrich	16，699-5		乙基4-环己酮羧酸盐	Aldrich	32，062-5
乙基2-环己酮羧酸盐	Aldrich	16，699-5		4-反-正-戊基环己烷羧酸	Aldrich	26，160-2
2-反-氨基环己烷羧酸	Aldrich	A7331		4-反-正-戊基环己烷羧酸	Aldrich	26，160-2
2-反-氨基环己烷羧酸	Aldrich	A7331		4-顺-氨基环己烷羧酸	Aldrich	40，485-3
4-(顺/反)-(氨甲基)-环己烷羧酸	Aldrich	S42，955-4		4-顺-氨基环己烷羧酸	Aldrich	40，485-3

酸	公司	产品编号	合成
酸	公司	产品编号	合成	环戊烷羧酸	Aldrich	C11，200-3
环丁烷羧酸	Aldrich	C9，560-9		环戊烷羧酸	Aldrich	C11，200-3
环丁烷羧酸	Aldrich	C9，560-9		1-甲基环己烷羧酸	Aldrich	14，282-4
3-反-羟基-4-顺-氟环己烷羧酸和4-反-羟基-3-顺-氟环己烷羧酸的混合物或者3-顺-羟基-4-反-氟环己烷羧酸和4-顺-羟基-3-反-氟环己烷羧酸的混合物			室内，方法B	1-甲基环己烷羧酸	Aldrich	14，282-4
			室内，方法B	3-顺-羟基-4-反-氯环己烷羧酸和4-顺-羟基-3-反-氯环己烷羧酸的混合物			室内，方法C
3-反-羟基-4-顺-氯环己烷羧酸和4-反-羟基-3-顺-氯环己烷羧酸的混合物			室内，方法C	3-顺-羟基-4-反-氯环己烷羧酸和4-顺-羟基-3-反-氯环己烷羧酸的混合物			室内，方法C
3-反-羟基-4-顺-氯环己烷羧酸和4-反-羟基-3-顺-氯环己烷羧酸的混合物			室内，方法C	3-反-氧化环己烯羧酸			室内，方法A
3-顺-氧化环己烯羧酸			室内，方法A	3-反-氧化环己烯羧酸			室内，方法A
3-顺-氧化环己烯羧酸			室内，方法A	3，4-顺-二羟基环己烷羧酸和3，4-反-二羟基环己烷羧酸的混合物			室内，方法D
环己烷乙酸	Aldrich	C10，450-7		3，4-顺-二羟基环己烷羧酸和3，4-反-二羟基环己烷羧酸的混合物			室内，方法D
环己烷乙酸	Aldrich	C10，450-7		环己烷丙酸	Aldrich	16，147
4-顺/反-叔-丁基环己烷羧酸	Aldrich	37，493-8		环己烷丙酸	Aldrich	16，147

3-顺，4-反-二羟基环己烷羧酸的合成

外消旋3-顺，4-反-二羟基环己烷羧酸可容易地从商业途径可得到的外消旋3-环己烯羧酸得到。该酸通过用间-氯过苯甲酸处理环氧化并通过加入碱(三乙胺)原位转化成内酯，从而设立了相对立体化学。然后通过水性氢氧化钾的作用将该内酯水解，终产物通过离子交换树脂纯化(见PASLowden论文1997，Corey，E.J.和Huang，H.，1989)。

方法A：

环氧化物A和B通过标准步骤合成。将环己-3-烯羧酸用2-三甲基甲硅烷基乙醇保护，然后用异丁基氯甲酸酯和三乙胺活化。所得酯用间-氯过苯甲酸处理并将所得非对映体的外消旋混合物在正相硅胶上分离。环氧化物或者被反应(见下面)或者被三氟乙酸处理去保护，以释放各自的游离酸。

方法B：

将去保护的环氧化物用无水HF-吡啶处理以实现环打开以产生一对外消旋区域异构体(regiomer)，含有反式排列的F和OH(如前面对于环氧己烯阐明的)。然后这些酯用三氟乙酸去保护以释放游离酸(见Welch、J.T.和Seper、K.、W.、1988)。

方法C

去保护的环氧化物用悬浮于有机溶剂中的浓盐酸处理以影响开环而产生一对外消旋区域异构体，含有反式排列的Cl和OH(如前面对于环氧己烯所阐明的)。然后这些酯用三氟乙酸去保护以释放游离酸(见Chini，M.，Crotti，P.，等，1992)。

方法D

通过用催化量的四氧化锇以及辅助氧化剂处理产生顺-二羟基环羧酸。然后这些酯用三氟乙酸去保护以释放游离酸。

细菌菌株和生长条件

大肠杆菌DH10B(GibcoBRL)生长于如Sambrook等(1989)所描述的2xTY培养基中，如在MacNeil等(1992)中描述的大肠杆菌ET12567(pUB307)和如在Paget等(1999)中所描述的大肠杆菌ET12567(pUZ8002)生长于含有卡那霉素(25μg/ml)的2xTY培养基中。载体pUC18和Litmus28从New England Biolabs得到。载体pSET152在Bierman等(1992a)中描述。大肠杆菌转化株用100μg/ml氨苄青霉素或者50μg/ml阿泊拉霉素选择。

雷帕霉素生产株吸水链霉菌ATCC29253及其衍生菌株于26℃保持在培养基1琼脂板上(见下面)，并在如(Khaw等，1998)中描述的TSBGM(含有1.0％葡萄糖和100mM MES的胰胨豆胨肉汤，pH 6.0)(当需要时补加100μg/ml阿泊拉霉素)上培养。

液体培养物在25℃下生长于侧面带有挡板的锥形瓶中，以300转/分钟摇动。

链霉素抗性突变株吸水链霉菌MG1C使用标准方法选择并保持在含有链霉素(50μg/ml)的培养基1中。

送料方法：

在培养基1上生长后制备所有菌株的孢子储备物，保存在20％w/v甘油：10％w/v乳糖的蒸馏水溶液并在-80℃保藏。通过将100μl冰冻储备物接种在250ml烧瓶中的50ml培养基中制备营养培养物。培养物在28℃，250转/分钟孵育36到48小时。

送料步骤：营养培养物以0.5ml接种到50ml试管中的7ml培养基7中。在26℃，250转/分钟下培养7天。所选羧酸(“非天然起始物”或者“天然起始物”)的送料/加入在孵育后24小时和48小时进行并且以1mM或者3mM送料。

培养基1：改良A-培养基

然后培养基通过121℃高压灭菌15分钟灭菌。

培养基2(Box等，1995)

培养基3(Wilkinson等，2000)

培养基4(美国专利号3,993,749)

培养基5(Box等、1995)

培养基6：RapV7种子培养基

培养基7：MD6培养基(发酵培养基)

灭菌前，将0.4ml Sigma α-淀粉酶(BAN 250)加到1mL培养基中。

培养基在121℃灭菌20分钟。

培养基8：MD3培养基(发酵培养基)

菌株描述

所有菌株都具有野生型形态，奶酪状营养菌丝体、白色气生菌丝产生灰色孢子而变黑并具有特征性的吸湿。

优选地，用于产生如此处描述的重组菌株的孢子颜色是暗灰色的，如在Fan 4、202C to B中所定义的，更优选地，它们为如在Fan 4、202 B(皇家园艺协会颜色表2001、可从皇家园艺协会得到、80Vincent Square、伦敦、SW1P 2PE)中定义的。

DNA操作和测序

如在Sambrook等(1989)中描述的进行DNA操作、PCR和电穿孔步骤。使用用DIG DNA标记试剂盒如生产商(Boehringer Mannheim)所描述的用地高辛标记的探针进行Southern杂交。如前面描述的(Gaisser等、2000)进行DNA测序。

吸水链霉菌菌株的发酵

在培养基1上从冷藏(20％甘油、10％w/v乳糖的蒸馏水溶液)的冰冻孢子储备物培养吸水链霉菌菌株(见材料和方法)并且在29℃生长10-20天后收获孢子。备选地，来自冰冻工作储备物的孢子直接接种到预培养培养基中。原代预培养物为用收获的孢子接种并培养于含有50ml培养基6的250ml锥形烧瓶中(见材料和方法)，以2英寸偏移度在250转/分钟下摇动，30℃培养2天。原代预培养物用于以10％v/v接种培养基6的继代预培养物，28℃下以1英寸偏移度在300转/分钟下摇动24小时。继代预培养物用于以10％v/v接种含有0.01％v/v SAG 417防沫剂的生产培养基8(见材料和方法)并允许在搅拌的生物反应器中以26℃发酵5到7天。气流设定到0.75vvm，最高气压0.5巴，叶轮尖速度控制在0.98ms^-1到2.67ms^-1。根据需要加入额外的SAG 417。用铵(10％v/v)或者硫酸(1M)将pH控制在6-7，铵需求开始时滴加葡萄糖溶液(40％w/v)。

提取和高效液相层析(HPLC)分析方法(A)

离心50ml发酵液并如下分别提取上清液和菌丝体。将菌丝体用H₂O洗涤并用50ml甲醇在4℃提取16小时。通过离心除去细胞碎片，甲醇蒸发至干并溶解在200μl甲醇中。发酵液的上清液用等体积乙酸乙酯提取2次。有机层用Na₂SO₄干燥，蒸发至干并溶解在200μl甲醇中。在HewlettPackard HP1100液相色谱仪与可变波长监测器或者Finnigan MAT LCQ(Finnigan、CA)仪器上进行HPLC分析。通过Bruker BioApex II 4.7T傅立叶变换-离子回旋加速器共振(FT-ICR)质谱仪(Bruker、Bremen、FRG)得到高分辨率光谱。

对于NMR分析，离心细菌培养液，所提取上清液用三次等体积乙酸乙酯萃取并将菌丝体用甲醇萃取，如上所描述。将萃取液合并，干燥(Na₂SO₄)并减压蒸发得到白色固体。

质子检测的NMR光谱(¹H、DQF-COSY、TOCSY、HMQC、HMBC、NOESY)记录在Bruker Advance DRX500分光计上，其在27℃下以500MHz运行，实施例6例外，其中Bruker Advance DRX500光度计在10℃下以500MHz运行。化学偏移在δ刻度上以百万分之几(ppm)描述并参照δ_H7.26(¹H)的CHCl₃和δ_C 77.0(¹³C)的CHCl₃。J值以赫兹(Hz)给出。

提取、分离和分析方案(B)

提取和纯化方案：

通过离心使发酵液澄清以提供上清液和细胞。将上清液应用于

HP20树脂(Supelco)的柱子(16×15cm)，用水然后用75％MeOH/H₂O洗涤，然后用MeOH洗脱。细胞用等体积丙酮混合均匀。至少30分钟后，丙酮浆通过离心澄清并倒出上清液。沉淀细胞类似地用丙酮再提取两次。丙酮提取物与来自HP20柱的MeOH合并并且真空除去溶剂以得到水性浓缩物。水性浓缩物(通常1-2L)用EtOAc(3×1-2L)提取并真空除去溶剂得到油状粗提取物(通常20g)。油性残渣溶于最小体积的EtOAc中并用二氧化硅干燥。将包衣二氧化硅应用于二氧化硅柱(400g、36×6cm)，对二氧化硅柱相继用最初25％丙酮到100％丙酮的丙酮/己烷混合物洗脱。含有雷帕霉素类似物的级分通过HPLC(280nm)使用此处描述的条件鉴定。

将含有雷帕霉素的级分合并并真空去除溶剂。残留物进一步用Sephadex LH20层析，以10∶10∶1氯仿/庚烷/乙醇洗脱。半纯化的雷帕霉素类似物通过反向(C18)高效液相层析，使用Gilson HPLC纯化，用以21mL/分钟洗脱Phenomenex 21.2×250mm Luna 5μm C18BDS柱，根据雷帕霉素类似物的极性用50％到70％CH₃CN/H₂O混合物进行等度洗脱。

培养液分析

等分试样的全培养液(1mL)用CH₃CN(1mL)摇动30分钟。混合物通过离心澄清并将上清液用HPCL分析，以二极管阵列检测。HPLC系统含有装备加热到40℃的BDS HYPERSIL C18 3μm 4.6×150mm柱(ThermoHypersil-Keystone)的Agilent HP1100。梯度洗脱为10分钟内从55％流动相B到95％流动相B，然后等梯度保持在95％流动相B2分钟，流速为1mL/分钟。流动相A为10％乙腈∶90％水，含有10mM乙酸铵和0.1％三氟乙酸，流动相B为90％乙腈∶10％水，含有10mM乙酸铵和0.1％三氟乙酸。通过特征性雷帕霉素三烯(以278nm为中心)的存在鉴定雷帕霉素类似物。通过LC-MS分析鉴定FK506和FK520类似物。

通过LCMS分析

上面描述的HPLC系统连接到Bruker Daltonics Esquire3000电喷雾质谱仪上。使用和上述相同的柱子和梯度洗脱方案。流动相A为水，流动相B为乙腈。正负转换在500到1000道尔顿的扫描范围内使用。

实施例1

吸水链霉菌的接合

将要接合到吸水链霉菌的质粒通过电穿孔转化到含有如MacNeil等(1992)描述的pUB307或者如Paget等(1999)描述的pUZ8002的dam^-dcm^-ET12567大肠杆菌菌株中。预培养物(过夜培养，30℃)用于以1/25稀释接种新鲜2xTY(含有50μg/ml阿泊拉霉素和25μg/ml卡那霉素)并以37℃摇动生长到595nm光密度为0.25-0.6。来自该培养液的细胞用2xTY洗涤两次，然后以0.5ml 2xTY/25ml原始培养物悬浮。所用的孢子储备物的质量对于该方法的成功是关键的。在本上下文中，收获时孢子的年龄和培养基1的使用对于分离高质量孢子悬浮物是关键的。为了分离吸水链霉菌的高质量孢子悬浮物，使用标准微生物技术将培养基1琼脂的预干燥板(见材料和方法章节)用吸水链霉菌孢子或菌丝体涂布，然后在26-28℃孵育14-21天。通过标准技术加入1-2ml无菌20％w/v甘油或者水收获孢子。吸水链霉菌孢子悬浮物的200μl等分试样在500μl 2xTY中洗涤，重悬于500μl 2xTY，在50℃热休克10分钟，然后在冰上冷却。大肠杆菌悬浮物的0.5ml等分试样与热休克孢子混合并将该混合物铺在培养基1琼脂板上。将这些平板在26℃-28℃孵育16小时后，对每板用1mg萘啶酮酸和1mg阿泊拉霉素涂布。通常3-7天后出现接合后体克隆。

备选整合载体pRT801在吸水链霉菌MG2-10中的使用

还使用基于ΦBT1的整合载体pRT801接合到上述吸水链霉菌MG2-10中。将接合后体涂在含有50μg/ml阿泊拉霉素和50μg/ml萘啶酮酸的培养基1上，并且显示为阿泊拉霉素抗性的。

实施例2

携带染色体rapQONMLKJI缺失的吸水链霉菌突变株MG2-10的分离(图4)

如下描述的构建吸水链霉菌突变株(MG2-10)，其中雷帕霉素修饰基因rapQ、rapO/N、rapM、rapL、rapK、rapJ和rapI被缺失。

链霉素抗性突变株MG1C的分离：

将吸水链霉菌NRRL5491菌丝体涂布到含有50mg/ml链霉素的培养基1的平板上。分离了三个菌落并标记为MG1A、MG1B和MG1C。如实施例1中将这些菌落用质粒pMG49-含有来自变铅青链霉菌(S.lividans)TK24的rpsL基因的pSET152衍生物-接合。将来自这些接合的每一种的接合后体涂布到含有50mg/ml阿泊拉霉素和50mg/ml萘啶酮酸的平板上，以证明质粒pMG49的存在。然后将它们以及原始菌株MG1A、MG1B和MG1C划线到不含抗生素的培养基1的平板和含有50mg/ml链霉素的培养基1平板上。在除了MG1A[pMG49]、MG1B[pMG49]和MG1C[pMG49]之外的所有情况中都看到在链霉素上的生长，表明来自变铅青链霉菌TK24的野生型rpsL基因赋予了这些菌株的显性链霉素敏感性。在MG1A、MG1B和MG1C中测量前-雷帕霉素的产生，并将最好的生产者MG1C保存备用。

吸水链霉菌MG1C的接合

使用链霉素抗性吸水链霉菌MG1C和载体pMG55衍生的构建体如在实施例1中描述的进行接合。

接合性双重组载体pMG55的构建(图3)

使用质粒pRPSL21(Shima等，1996)作为模板，用引物MAG475’-GCAAGCTTGGTACCGACACGCTCGCCGAACAGG-3’(SEQ IDNO：29)和MAG485’-GCGCATGCCCTAGGGTGTACATTACTTCTCC-3’(SEQ ID NO：30)扩增变铅青链霉菌rpsL基因。PCR片段用SphI和HindIII消化，分离并用已经被SphI和HindIII消化的pSET152(Bierman等，1992b)的3.2kb片段连接。转化到大肠杆菌DH10B后，分离质粒pMG55。通过测序证实该质粒。质粒pMG55含有rpsL基因以允许双重组体的选择(Hosted和Baltz，1997)。

使用从吸水链霉菌NRRL5491制备的基因组DNA作为模板，用引物MAG235’-TATCTAGACTTCGCACGTGCCTGGGACA-3’(SEQ ID NO：31)和MAG245’-AGAAGCTTACCCAATTCCAACATCACCT-3’(SEQID NO：32)扩增左同源区(雷帕霉素簇中从nt 89298到nt 90798，如Schwecke等(Schwecke等，1995)中所描述的)。将1.5kb PCR产物用Xbal和HindIII消化并连接到用Xbal和HindIII消化的pUC18中。转化到大肠杆菌DH10B后，分离质粒pMAG127-8。使用从吸水链霉菌NRRL5491制备的基因组DNA作为模板，用引物

MAG25 5’-GGAAGCTTTGACCACACGCCGCCCGTTC-3’(SEQID NO：33)和MAG265’-ATGCATGCCCGCCGCAACCCGCTGGCCT-3’(SEQ ID NO：34)扩增右同源区(雷帕霉素簇中从nt 98404到nt 99904，如Schwecke等(Schwecke等，1995)中所描述的)。将1.5kb PCR产物用HindIII和SphI消化并连接到用HindIII和SphI消化的pUC18中。转化到大肠杆菌DH10B后，分离质粒pMAG128-2(图4)。两种质粒都通过序列分析检查。质粒pMAG127-8用SphI和HindIII消化，质粒pMAG128-2用XbaI和HindIII消化，从两种质粒分离1.5kb片段。这些片段连接到用SphI和XbaI切割的pUC18中并用于转化大肠杆菌DH10B。分离质粒pMAG131-1。该质粒用SphI和XbaI消化，分离3kb片段并连接到用SphI和AvrII切割的pMG55中，并且该DNA用于转化大肠杆菌DH10B。分离质粒pMAG144-16并用于接合吸水链霉菌MG1C。分离阿泊拉霉素抗性吸水链霉菌菌落，在TSBGM中26℃摇动下生长24小时，并涂布到含有50μg/l链霉素的培养基1琼脂板上。分离链霉素抗性菌落并且其显示为阿泊拉霉素敏感的。通过使用MAG23和MAG24的1.5kb PCR产物探测EcoRI-和BamHI-消化的染色体DNA以证实雷帕霉素簇rapQONMLKJI区的7606nt染色体缺失。野生型吸水链霉菌的分析显示出杂交后预期的5.8kb EcoRI和5.9kb BamHI带。当MG2-10的染色体DNA进行类似处理时，检测到9.6kb EcoRI和7.6kbBamHI带，表明rapQONMLKJI已经被除去。

实施例3

携带染色体rapQONMLKJI缺失的吸水链霉菌突变株MG2-10中rapK的表达(图4)

表达载体pSGset1的构建

通过使用标准分子生物学技术将引物二聚体CR3475’-TAAACTAGTCCATCTGAGAGTTTCATATGGCCCTATTCTGCCCAGCCGCTCTAGAAAT-3’(SEQ ID NO：35)和CR3485’-ATTTCTAGAGCGGCTGGGCAGAATAGGGCCATATGAAACTCTCAGATGGACTAGTTTA-3’(SEQ ID NO：36)克隆到PvuII消化的pSET152中产生pSET152(Bierman等，1992a)衍生的载体pCJR336(由Christine Martin和Corinne Squire友好提供)，从而将限制酶SpeI、NdeI和XbaI的位点导入pSET152中。插入物的方向通过测序确定。质粒pCJR336用限制酶NdeI/SpeI消化，并且载体pSG142(Gaisser等，2000)同样地消化。分离pCJR336所得约5.4kb和pSG142的约1.2kb带然后连接，其用于转化大肠杆菌DH10B根据标准方案。分离含有actII-ORF4调节子区的载体构建体并用限制酶XbaI消化，然后用碱性磷酸酶处理。所分离DNA与来自用限制酶XbaI和NheI消化质粒pEXoleG2cas(含有pSGcasOleG2的约1.2kb NdeI/BglII片段的pSG142衍生物)(WO01/79520)所得的约200bp片段连接。分离载体pSGset1并且插入的正确方向使用限制性消化和序列分析证实。质粒pSGset1含有actII-ORF4调节子，P_actI启动子和6xHis-tag编码序列以及λt₀转录终止区(来自质粒pQE-16)并且其可在ΦC31连接位点定点整合。

rapK的克隆

通过PCR使用引物BIOSG8 5′-GGGCATATGAGGCAATTGACTCCGCCGGTCACGGCACCGTACTGCC-3′(SEQ ID NO：37)和BIOSG9 5′-GGGGTCTAGAGGTCACGCCACCACACCCTCGATCTCGACC-3′(SEQ ID NO：38)扩增基因rapK，该引物在rapK的5’末端导入NdeI位点和3’末端导入Xbal位点。质粒pR19(Schwecke等，1995)用作模板。使用标准技术用T4多核苷酸激酶处理后，PCR产物与SmaI-切割的pUC18连接并用于转化大肠杆菌DH10B。分离的质粒pUCrapK中rapK的DNA序列通过序列分析证实。该DNA序列与公布的序列(acc.no.X86780)的差异在图27中显示。RapK中所得改变在图28中显示。

pSGsetrapK的分离

质粒pUCrapK用NdeI和Xbal消化并分离插入片段，并连接到相同地消化的pSGset1中。该连接物用于使用标准步骤转化大肠杆菌DH10B并分析转化株。分离质粒pSGsetrapK并通过限制性切割和序列分析检验构建体。

实施例4

9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-O-去甲基-雷帕霉素(前-雷帕霉素，图6)的鉴定

如实施例1中描述的通过用pSGsetrapK接合吸水链霉菌菌株MG2-10并分离发酵产生的产物得到9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-O-去甲基-雷帕霉素(前-雷帕霉素)。这表明可能弥补MG2-10菌株中rapK的缺失并且，如果该菌株用六氢吡啶羧酸送料，那么产生前-雷帕霉素，其是缺少PKS后修饰的一种类似物。

质粒pSGsetrapK接合到吸水链霉菌MG2-10中，并且生长在TSBGM中的菌株用2mg/l六氢吡啶羧酸在25℃下摇动下生长。如前述，菌丝体用甲醇提取，培养液用乙酸乙酯萃取。

通过HPLC用280nm紫外检测分析六氢吡啶羧酸-送料的吸水链霉菌突变株MG2-10[pSGsetrapK]的培养液揭示存在两个主要的新峰，其保留时间为4.0和5.1分钟。这些峰的电喷雾质谱揭示两种都含有相应于分子量841.5的化合物的离子。在吸水链霉菌NRRL 5491菌株或者没有rapK表达质粒pSGsetrapK的突变菌株MG2-10的培养提取物中都没有看到这些峰。对m/z 864(相应于前-雷帕霉素的钠加合物)的离子的MS/MS分析揭示其分裂成相应于损失m/z 129(六氢吡啶羧酸)的m/z 735离子，或者相应于损失m/z 308(前-雷帕霉素的C28-C42)的m/z 556离子。该离子自身进一步分裂成m/z 306离子，相应于损失m/z 250(前-雷帕霉素的C14-C27)。该分裂模式和雷帕霉素的模式相同，但是再次损失减少14的m/z(-308)，相应于缺少C39 O-甲基基团，减少44的m/z的第三次损失(-250)相应于损失C27甲氧基和C16 O-甲基基团，最后的离子(306，质量减少14，相应于缺少C9酮基。这证明分子量为841.5的化合物代表9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-O-去甲基-雷帕霉素(前-雷帕霉素)。

实施例5

用于在吸水链霉菌MG2-10表达的基因盒的制备

能够指导多种雷帕霉素修饰基因及修饰基因的组合物进行表达的基因盒如下描述的构建。

rapN/O的克隆

使用引物BIOSG2 5′-GGGCATATGTCGACGACCGATCAGGGTGAGACCGGAAAGGCCTG-3′(SEQ ID NO：39)和BIOSG35′-GGGGTCTAGAGGTCAGTCCTGGGGTTCGAGAAGCTCGCCGGTCTCCTT-3′(SEQ ID NO：40)通过PCR扩增邻近基因rapN和rapO(此后称为rapN/O)，该引物在rapN/O的5’末端导入Ndel位点并在3’末端导入XbaI位点。质粒pR19(Schwecke等，1995)用作模板。使用标准技术用T4多核苷酸激酶处理后，将PCR产物连接到SmaI-切割的pUC18并用于转化大肠杆菌DH10B。分离的质粒pUCrapN/O中rapN/O的DNA序列通过序列分析证实。该DNA序列与公布的序列(acc.no.X86780)的差异在图21中显示。RapN中所得改变在图22中显示。

rapM的克隆

使用引物BIOSG4 5′-GGGCATATGATCCAACCCGACGTCGTGACCGCCTTCACAGCGG-3′(SEQ ID NO：41)和BIOSG55′-GGGGTCTAGAGGTCACACGCGGACGGCGATCTGGTGCCGATAGG-3′(SEQ ID NO：42)通过PCR扩增基因rapM，该引物在rapM的5’末端导入Ndel位点并在3’末端导入Xbal位点。质粒pR19(Schwecke等，1995)用作模板。使用标准技术用T4多核苷酸激酶处理后，将PCR产物连接到SmaI-切割的pUC18并用于转化大肠杆菌DH10B。分离的质粒pUCrapM中rapM的DNA序列通过序列分析证实。该DNA序列与公布的序列(acc.no.X86780)的差异在图23中显示。RapM中所得改变在图24中显示。

rapL的克隆

使用引物BIOSG6 5′-GGGCATATGCAGACCAAGGTTCTGTGCCAGCGTGACATCAAG-3′(SEQ ID NO：43)和BIOSG75′-GGGGTCTAGAGGTCACTACAGCGAGTACGGATCGAGGACGTCCTCGGGCG-3′(SEQ ID NO：44)通过PCR扩增基因rapL，该引物在rapL的5’末端导入Ndel位点并3’末端导入Xbal位点。质粒pR19(Schwecke等，1995)用作模板。使用标准技术用T4多核苷酸激酶处理后，将PCR产物连接到SmaI-切割的pUC18并用于转化大肠杆菌DH10B。分离的质粒pUCrapL中rapL的DNA序列通过序列分析证实。该DNA序列与公布的序列(acc.no.X86780)的差异在图25中显示。RapL中所得改变在图26中显示。

rapL_his的克隆

使用引物BIOSG6 5′-GGGCATATGCAGACCAAGGTTCTGTGCCAGCGTGACATCAAG-3′(SEQ ID NO：43)和BIOSG455′-GGAGATCTCAGCGAGTACGGATCGAGGACGTCCTCGGGCG-3′(SEQ ID NO：45)通过PCR扩增基因rapL_his，该引物在rapL的5’末端导入Ndel位点并3’末端导入BglII位点。质粒pR19(Schwecke等，1995)用作模板。使用标准技术用T4多核苷酸激酶处理后，将PCR产物连接到SmaI-切割的pUC18并用于转化大肠杆菌DH10B。分离的质粒pUCrapL_his中rapL的DNA序列通过序列分析证实。

rapK的克隆

使用引物BIOSG8 5′-GGGCATATGAGGCAATTGACTCCGCCGGTCACGGCACCGTACTGCC-3′(SEQ ID NO：37)和BIOSG9 5′-GGGGTCTAGAGGTCACGCCACCACACCCTCGATCTCGACC-3′(SEQ ID NO：38)通过PCR扩增基因rapK，该引物在rapK的5’末端导入Ndel位点并3’末端导入Xbal位点。质粒pR19(Schwecke等，1995)用作模板。使用标准技术用T4多核苷酸激酶处理后，将PCR产物连接到SmaI-切割的pUC18并用于转化大肠杆菌DH10B。分离的质粒pUC rapK中rapK的DNA序列通过序列分析证实。该DNA序列与公布的序列(acc.no.X86780)的差异在图27中显示。RapK中所得改变在图28中显示。

pSGsetrpaN/O、pSGsetrapJ、pSGsetrapM、pSGsetrapQ、pSGsetrapI、pSGsetrapK、和pSGsetrapL的分离

质粒pUCrapN/O、pUCrapJ、pUCrapM、pUCrapI、pUCrapL、pUCrapK和pAHL42用NdeI和XbaI消化，分离插入片段(大小从约1.3kb到0.7kb)并将其连接到同样切割的pSGset1中。连接物用于使用标准步骤转化大肠杆菌DH10B并分析转化株。分离质粒pSGsetrapN/O、pSGsetrapJ、pSGsetrapM、pSGsetrapQ、pSGsetrapI、pSGsetrapK、和pSGsetrapL并用限制性消化和序列分析检验构建体。

rapJ的克隆

使用引物BIOSG10 5′-GGGCATATGAGCACCGAAGCTCAGCAAGAGAGCACGCCCACCGCACGCT-3′(SEQ ID NO：46)和BIOSG11 5′-GGGGTCTAGAGGTCACTCCGCTCCCCAGGTGACCCGGAGCTCGGC-3′(SEQ ID NO：47)通过PCR扩增基因rapJ，该引物在rapJ的5’末端导入Ndel位点并3’末端导入Xbal位点。质粒pR19(Schwecke等，1995)用作模板。使用标准技术用T4多核苷酸激酶处理后，将PCR产物连接到SmaI-切割的pUC18并用于转化大肠杆菌DH10B。分离的质粒pUCrapJ中rapJ的DNA序列通过序列分析证实。该DNA序列与公布的序列(acc.no.X86780)的差异在图29中显示。RapJ中所得改变在图30中显示。

rapI的克隆

使用引物BIOSG12 5′-GGGCATATGAGCGCGTCCGTGCAGACCATCAAGCTGCC-3′(SEQ ID NO：48)和BIOSG135′-GGGGTCTAGAGGTCAGGCGTCCCCGCGGCGGGCGACGACCT-3′(SEQ ID NO：49)通过PCR扩增基因rapI，该引物在rapI的5’末端导入Ndel位点并3’末端导入Xbal位点。质粒pAHL2(由Huai-Lo Lee友好地提供)来自含有rapI的pUC18并用作模板。使用标准技术用T4多核苷酸激酶处理后，将PCR产物连接到SmaI-切割的pUC18并用于转化大肠杆菌DH10B。分离的质粒pUCrapI中rapI的DNA序列通过序列分析证实。该DNA序列与公布的序列(acc.no.X86780)的差异在图31中显示。RapI中所得改变在图32中显示。

rapQ的克隆

使用引物AHL21 5′-CATATGTTGGAATTGGGTACCCGCCTG-3′(SEQ ID NO：50)和AHL22 5′-TCTAGACGCTCACGCCTCCAGGGTG-3′(SEQ ID NO：51)通过PCR扩增基因rapQ，该引物在rapQ的5’末端导入Ndel位点并3’末端导入Xbal位点。质粒pR19(Schwecke等，1995)用作模板。使用标准技术用T4多核苷酸激酶处理后，将PCR产物连接到SmaI-切割的pUC18并用于转化大肠杆菌DH10B。分离的质粒pAHL42中rapQ的DNA序列通过序列分析证实。该DNA序列与公布的序列(acc.no.X86780)的差异在图33中显示。RapQ中所得改变在图34中显示。

pUC18eryBVcas的分离

使用引物casOleG21(WO01/79520)和79665′-GGGGAATTCAGATCTGGTCTAGAGGTCAGCCGGCGTGGCGGCGCGTGAGTTCCTCCAGTCGCGGGACGATCT-3′(SEQ ID NO：52)和pSG142(Gaisser等，2000)作为模板通过PCR扩增基因eryBV。使用标准方法克隆PCR片段并且分离的质粒pUC18eryBVcas具有与eryBV的起始密码子重叠的NdeI位点和终止密码子后的XbaI和BglII位点。通过序列分析证实构建体。

载体pSGLit1的分离

使用引物BIOSG1 5′-GGGTCTAGATCCGGACGAACGCATCGATTAATTAAGGAGGACACATA-3′(SEQ ID NO：53)和79665′-GGGGAATTCAGATCTGGTCTAGAGGTCAGCCGGCGTGGCGGCGCGTGAGTTCCTCCAGTCGCGGGACGATCT-3′(SEQ ID NO：52)通过PCR扩增基因eryBV，该引物在eryBV的5’末端导入对Dam甲基化敏感的Xbal位点并3’末端导入BglII位点。质粒pUC18eryBVcas用作模板。使用标准技术用T4多核苷酸激酶处理后，将PCR产物连接到SmaI-切割的pUC18并用于转化大肠杆菌DH10B。然后使用标准技术将构建体用BamHI/BglII消化并从琼脂糖凝胶分离约1.3kb DNA带，接着用BamHI/BglII消化的Litmus 28载体DNA连接。分离载体pSGLit1，插入物的DNA序列通过序列分析检验。

质粒pUCrapN/O，pUCrapJ，pUCrapM，pUCrapI，pUCrapL，pUCrapK和pAHL42用NdeI和XbaI消化并分离大小为约1.3kb到0.7kb的插入片段并连接到同样消化的pSGset1中。使用标准步骤用连接物转化大肠杆菌DH10B并分析转化株。分离质粒pSGsetrapN/O、pSGsetrapJ、pSGsetrapM、pSGsetrapQ、pSGsetrapI、pSGsetrapK、和pSGsetrapL并用限制性消化和序列分析检验构建体。

pSGLitrapN/O、pSGLitrapJ、pSGLitrapM、pSGLitrapQ、pSGLitrapI、pSGLitrapK、pSGLitrapL和pSGLitrapL_his的分离

质粒pSGsetrpaN/O、pSGsetrapJ、pSGsetrapM、pSGsetrapQ、pSGsetrapI、pSGsetrapK、pSGsetrapL、和pUC19rapL_his用NdeI/BglII限制酶消化并且分离约0.7到1.3kb的带，然后用NdeI/BglII消化的pSGLit1连接。连接物用于转化大肠杆菌ET12567并分析转化株。分离质粒pSGLitrapN/O，pSGLitrapJ，pSGLitrapM，pSGLitrapQ，pSGLitrapI，pSGLitrapK，pSGLitrapL和pSGLitrapL_his。

质粒pSGsetrapKI、pSGsetrapKM、pSGsetrapKN/O、pSGsetrapKL、pSGsetrapKQ和pSGrapKJ的分离

使用标准分子生物学技术，将质粒pSGLitrapN/O，pSGLitrapJ，pSGLitrapM，pSGLitrapQ，pSGLitrapI，和pSGLitrapL用XbaI消化并分离约0.8到1.3kb的片段，然后用XbaI消化并用碱性磷酸酶处理的pSGsetrapK连接。连接物用于转化大肠杆菌DH10B并分析转化株。分离质粒pSGsetrapKI、pSGsetrapKM、pSGsetrapKN/O、pSGsetrapKL、pSGsetrapKQ和pSGrapKJ并且插入的方向通过限制性消化分析检验。为了加入rapL_his，这些构建体或者用BglII/XbaI消化然后根据需要用BglII部分消化，并且分离的载体片段用pSGLitrapL_his的～1kb Xbal/BglII片段连接。

质粒pSGsetrapKIJ、pSGsetrapKIM和pSGsetrapKIQ的分离

使用标准分子生物学技术将质粒pSGLitrapJ，pSGLitrapM，和pSGLitrapQ用Xbal消化并分离约0.8到1.3kb片段，然后与用XbaI消化并用碱性磷酸酶处理的pSGsetrapKI连接。连接物用于转化大肠杆菌DH10B并分析转化株。分离质粒pSGrapKIQ并通过限制性消化分析检验插入的方向。为了加入rapL_his，这些构建体或者用BglII/XbaI消化然后根据需要用BgIII部分消化，分离的载体片段与pSGLitrapL_his的～1kbXbal/BglII片段连接。

质粒pSGsetrapKN/OI、pSGsetrapKN/OQ、pSGsetrapKN/OM和pSGsetrapKN/OJ的分离

使用标准分子生物学技术将质粒pSGLitrapI、pSGLitrapM、pSGLitrapJ、和pSGLitrapQ用Xbal消化并分离约0.8到1.3kb片段，然后与用XbaI消化并用碱性磷酸酶处理的pSGsetrapKN/O连接。连接物用于转化大肠杆菌DH10B并分析转化株。分离质粒pSGsetrapKN/OI，pSGsetrapKN/OQ，pSGsetrapKN/OM和pSGsetrapKN/OJ并通过限制性消化分析检验插入的方向。为了加入rapL_his，这些构建体或者用BglII/XbaI消化然后根据需要用BgIII部分消化，分离的载体片段与pSGLitrapL_his的～1kb XbaI/BglII片段连接。

质粒pSGsetrapKJM和pSGsetrapKJQ的分离

使用标准分子生物学技术将质粒pSGLitrapM和pSGLitrapQ用Xbal消化并分离约0.8到1.1kb片段，然后与用XbaI消化并用碱性磷酸酶处理的pSGsetrapKN/O连接。连接物用于转化大肠杆菌DH10B并分析转化株。分离质粒pSGsetrapKJM和pSGsetrapKJQ并通过限制性消化分析检验插入的方向。为了加入rapL_his，这些构建体或者用BglII/XbaI消化然后根据需要用BgIII部分消化，分离的载体片段与pSGLitrapL_his的～1kbXbal/BglII片段连接。

使用上面列出的相同策略，分离了下面的基因表达盒：

pSGsetrapKIJM pSGsetrapKN/OJI pSGsetrapKIQN/OM

pSGsetrapKIJQ pSGsetrapKJMN/O pSGsetrapKJMN/OQ

pSGsetrapKIJN/O pSGsetrapKJQN/O pSGsetrapKIJN/OMQ

pSGsetrapKIMN/O pSGsetrapKIJN/OM pSGsetrapN/OQ

pSGsetrapKIQN/O pSGsetrapKIJN/OQ pSGsetrapKIJMN/OQ

pSGsetrapKN/OMQ pSGsetrapKIMN/OQ

在图5中给出概览。

为了加入rapL_his，这些表达盒构建体或者用BglII/XbaI或者用XbaI消化然后根据需要用BgIII部分消化，分离的载体片段与pSGLitrapL_his的约1kb Xbal/BglII片段连接。

实施例6

9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-O-去甲基-雷帕霉素(前-雷帕霉素，图6)的分离

通过用pSGsetrapKL接合吸水链霉菌菌株MG2-10并如下分离产生的产物得到9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-O-去甲基-雷帕霉素(前-雷帕霉素)。这表明可能互补MG2-10菌株中rapK和rapL的缺失并且产生前-雷帕霉素，其是缺少PKS后修饰的类似物。当rapL被互补时，六氢吡啶羧酸的送料是不需要的，证明rapL在雷帕霉素的产生中于六氢吡啶羧酸的提供上发挥作用。

在培养基1(见材料和方法)上由冷藏(20％甘油，10％乳糖w/v溶于蒸馏水)的冰冻工作孢子储备物培养吸水链霉菌MG2-10[pSGsetrapKL]并在29℃生长14天后收获。原代预-培养物用收获的孢子接种并在含有50ml培养基3(见材料和方法)的两个250ml锥形烧瓶中培养，以2英寸偏移度以250转/分钟摇动，30℃培养两天。原代预培养物用于以10％v/v接种培养基2(见材料和方法)和培养基3的两种继代预培养物，其以1英尺偏移度300转/分钟摇动，25℃再培养24小时。制备4升含有0.01％v/v PluronicL101防沫剂(BASF)的培养基4(见材料和方法)和培养基5(见材料和方法)。生产培养基4用培养基2中的继代预培养物以10％v/v接种并且生产培养基5用培养基3中的继代预培养物以10％v/v接种并在7L搅拌的生物反应器中25℃发酵5到7天。气流设定为0.75vvm并交叶轮尖速度控制在0.98ms^-1到2.67ms^-1。根据需要加入额外的Pluronic L101。

为了证实9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-O-去甲基-雷帕霉素(前-雷帕霉素)的结构，将来自培养基4和培养基5的发酵液用乙酸乙酯萃取并蒸发减小到粗提取物。用己烷∶甲醇∶水对提取物部分脱脂并快速穿过70g二氧化硅柱，以己烷开始，丙酮结束。将来自每种发酵的前-雷帕霉素级分合并并快速过C18柱，以水开始，甲醇结束。使用庚烷∶氯仿∶乙醇作为流动相在Sephadex LH₂₀上层析后分离前-雷帕霉素(8.5mg)。分析该化合物并通过NMR充分证实其结构(图18-20)。¹H和¹³C NMR数据在下面的表V中给出。

表V：前-雷帕霉素的 ¹H和 ¹³C NMR数据

实施例7

8-脱氧-15-O-去甲基-26-去甲氧基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素(前-脯氨酰雷帕霉素，图7)的分离

对吸水链霉菌MG2-10[pSEGrapK]用脯氨酸送料导致产生如下描述的前-脯氨酰雷帕霉素。这表明在缺乏rapL时，备选的六氢吡啶羧酸类似物被掺入。

25℃摇动下，吸水链霉菌MG2-10[pSGsetrapK]生长于加入1mg/l脯氨酸的TSBGM中。用甲醇提取菌丝体并将培养液用乙酸乙酯萃取，如前述。

通过HPLC在280nm检测对送料脯氨酸的吸水链霉菌突变株MG2-10[pSGsetrapK]的分析表明存在停留时间为4.5和4.6分钟的两个主要的新峰。这些峰的电喷雾质谱表明两个峰都含有相应于分子量827.5的化合物。在没有rapK表达质粒pSGsetrapK的吸水链霉菌NRRL 5491，吸水链霉菌MG1C或者吸水链霉菌MG2-10的培养物中都没有看见这些峰。对m/z为850的离子(相应于前-脯氨酰雷帕霉素的钠加合物)的MS/MS分析表明其分裂成相应于损失m/z 115(脯氨酸)的m/z 735的离子，或者相应于损失m/z 308(前-脯氨酰雷帕霉素的C27-C41)的m/z 542离子。该离子自身进一步分分裂成m/z 292离子，相应于损失m/z 250(前-脯氨酰雷帕霉素的C13到C26)。该分裂模式和对雷帕霉素所看到的相同，但是首先减少14的m/z损失(-115)，相应于对于氨基酸从六氢吡啶羧酸改变为脯氨酸，第二次减少14的m/z损失(-308)相应于缺少C38 O-甲基基团，第三次减少44的m/z损失(-250)相应于缺少C26甲氧基和C15 O-甲基基团，质量减少14的最后离子(306)相应于缺少C8酮基和从六氢吡啶羧酸改变为脯氨酸。这证明MW为827.5的化合物代表8-脱氧-15-O-去甲基-26-去甲氧基-38-O-去甲基-脯氨酰雷帕霉素(前-脯氨酰雷帕霉素)。

实施例8

9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-去甲氧基-雷帕霉素(39-脱羟基前-雷帕霉素，图8)的分离

用六氢吡啶羧酸和环己烷羧酸送料吸水链霉菌MG2-10[pSGsetrapK]导致产生两种主要化合物：相应于掺入天然起始单元的前-雷帕霉素和相应于掺入送料起始单元的39-脱羟基前-雷帕霉素。

吸水链霉菌MG2-10[pSGsetrapK]在25℃摇动下生长于添加2mg/l六氢吡啶羧酸和1mM环己烷羧酸的TSBGM中。培养液用乙酸乙酯萃取，如前述。

对用环己烷羧酸送料的吸水链霉菌突变株MG2-10[pSGsetrapK]的培养液通过HPLC分析，在280nm UV检测揭示存在停留时间为5.8分钟的一个主要的新峰。该峰的电喷雾质谱学揭示其含有相当于MW 825.5的化合物的离子。在没有rapK表达质粒pSGsetrapK的吸水链霉菌NRRL5491，吸水链霉菌MG1C或吸水链霉菌MG2-10的培养物中没有看见该峰。对m/z 848的离子(相当于39-脱羟基前-雷帕霉素的钠加合物)的MS/MS分析揭示它分裂成相当于损失m/z 129(六氢吡啶羧酸)的m/z 719离子，或相当于损失m/z 292的m/z 556离子(39-脱羟基前-雷帕霉素的C28-C42)。该离子本身进一步分裂成m/z 306的离子，相当于损失m/z 250(39-脱羟基前-雷帕霉素的C14到C27)。该裂解方式和对于前-雷帕霉素所见到的方式相同，但是具有减少16的第二次损失(m/z 292)相当于缺少C39羟基。这证明MW 825.5的化合物代表9-脱氧-16-氧-去甲基-27-去甲氧基-39-去甲氧基-雷帕霉素(39-脱羟基前-雷帕霉素)。

实施例9

16-O-去甲基-27-去甲氧基-雷帕霉素(图9)的分离

如实施例1中所描述的，吸水链霉菌菌株MG2-10与pSGsetrapKIJ接合。用六氢吡啶羧酸送料菌株并分离发酵生产的产物导致产生16-O-去甲基-27-去甲氧基-雷帕霉素。

质粒pSGsetrapKIJ(图5)接合到吸水链霉菌MG2-10并且该菌株在添加2mg/l六氢吡啶羧酸的TSB GM中25℃摇动下生长。菌丝体用甲醇提取并且培养液用乙酸乙酯萃取，如前述。

通过电喷雾质谱学分析吸水链霉菌突变株MG2-10[pSGsetrapKIJ]的提取物揭示停留时间4.3分钟的一个主要的新峰，其含有相当于MW 869的化合物的离子。在有或者没有rapK表达质粒pSGsetrapK的吸水链霉菌NRRL5491，吸水链霉菌MG1C或吸水链霉菌MG2-10的培养物中没有看见该峰。对m/z 892的离子(相当于16-O-去甲基-27-去甲氧基-雷帕霉素的钠加合物)的MS/MS分析揭示它分裂成相当于损失m/z 129(六氢吡啶羧酸)的m/z 763离子，或相当于损失m/z 322(16-O-去甲基-27-去甲氧基-雷帕霉素的C28-C42)的m/z 570离子。该离子本身进一步分裂成m/z 320的离子，相当于损失m/z 250(16-O-去甲基-27-去甲氧基-雷帕霉素的C14到C27)。该裂解方式和对于前-雷帕霉素所见到的方式相同，但是具有减少44的第三次损失m/z(-250)相当于缺少C16甲基和C27甲氧基。这证明MW 869化合物是16-O-去甲基-27-去甲氧基-雷帕霉素。

实施例10

阵列送料

吸水链霉菌MG2-10[pSGsetrapKI]用来进行阵列送料。通过如材料和方法中描述的用孢子储备物接种培养基制备原代营养培养物。利用材料和方法章节中描述的方法以10％v/v接种TSB GM培养基。如下面的表VI中所指出的添加下列化合物。

表VI：

使用材料和方法章节中描述的技术孵育，提取和测量培养物。表VII显示了对起始羧酸和氨基酸的每种组合所观察到的离子(m/z)的分析结果：

表VII

	环己烷羧酸	环己-1-烯羧酸	环庚烷羧酸
	环己烷羧酸	环己-1-烯羧酸	环庚烷羧酸	L-赖氨酸	848.5	848.5	862.4
L-脯氨酸	834.5	834.5	848.5	L-赖氨酸	848.5	848.5	862.4

DL-六氢吡啶羧酸	848.5	848.5	862.4
DL-六氢吡啶羧酸	848.5	848.5	862.4	反-4-羟脯氨酸	850.5	850.5	864.5
顺-4-羟脯氨酸	850.5	n.a.	864.5	反-4-羟脯氨酸	850.5	850.5	864.5

这些数据表明送料化合物的掺入。

实施例11

用fkbO互补吸水链霉菌MG2-10

为了评价rapK同源基因，如吸水链霉菌子囊霉素变种和筑波链霉菌中fkbO和部分测序的‘hyg’簇(Ruan等，1997)中orf5是否完成类似功能，如下述使用fkbO进行补充分析。

pMG169-1的分离

来自吸水链霉菌子囊霉素变种(ATCC 14891)-FK520生产者的基因fkbO通过PCR使用引物fkbof 5’-GGGCATATGACCGATGCCGGACGCCA 3’(SEQ ID NO：54)和fkbor5’GGGGTCTAGATCACGCCACCATGCCTTCGA 3’(SEQ ID NO：55)扩增，在fkbO的5′末端导入NdeI位点并在3′末端导入XbaI位点。从吸水链霉菌子囊霉素变种(ATCC 14891)分离的基因组DNA被用作模板。扩增的PCR产物用NdeI和XbaI消化并与NdeI-XbaI切割的pSGsetI连接。连接物被用于转化大肠杆菌DH10B，使用材料和方法章节中描述的方法分析转化体。分离质粒pMG169-1并通过限制性消化检验，吸水链霉菌MG2-10使用材料和方法章节中描述的方法转化。

通过fkbO对rapK的异源互补

吸水链霉菌MG2-10[pMG169-1]在25℃摇动下生长于补加2mg/l六氢吡啶羧酸的TSBGM中。使用材料和方法章节中描述的方法(方法A)提取培养液和菌丝体。用280nm紫外线检测分析提取物揭示存在停留时间为4.5和4.6分钟的两个主要的新峰。这些峰的电喷雾质谱学揭示两个峰都含有相当于前-雷帕霉素(实施例7)的两种异构体的MW为827.5的离子。

实施例12

在没有内源性起始单元竞争时通过送料给rapK敲除突变株有效产生9-脱氧-16-氧-去甲基-27-去甲氧基-39-去甲氧基-雷帕霉素(39-脱羟基前-雷帕霉素，图8)。

如下述比较吸水链霉菌菌株MG2-10和MG2-10[pSGsetrapK]掺入不同起始单元-环己烷羧酸的能力。当送料环己烷羧酸和六氢吡啶羧酸时，MG2-10仅仅产生相当于仅仅掺入该送料起始单元的一种化合物(39-脱羟基前-雷帕霉素)，而MG2-10[pSGsetrapK]产生1∶1比例的两种化合物：39-脱羟基前-雷帕霉素和前-雷帕霉素。这表明rapK是掺入天然的内源性起始单元所需的，rapK敲除菌株没有内源起始单元与送料的起始单元的竞争。

吸水链霉菌MG2-10吸水链霉菌MG2-10在25℃摇动下生长于添加2mg/L六氢吡啶羧酸和1mM环己烷羧酸的TSBGM上。培养液用乙酸乙酯萃取，如前述。通过HPLC于280nm UV检测分析提取物揭示存在停留时间为5.8分钟的一个新的主峰。当以环己烷羧酸(实施例8，图8)送料时，吸水链霉菌MG2-10[pSGsetrapK](实施例4)以1∶1的比例产生前-雷帕霉素(图6)与39-脱羟基前-雷帕霉素。令人惊奇地，将环己烷羧酸送料到吸水链霉菌MG2-10导致单一产物39-脱羟基前-雷帕霉素。内源起始物4，5-二羟基环己-1-烯羧酸在缺乏rapK时没有被掺入。所以送料羧酸的掺入和该内源起始物之间没有竞争。

实施例13

RapM功能的阐明

变铅青链霉菌TK24，变铅青链霉菌TK24[pSGsetrapM]和变铅青链霉菌TK24[pSGsetrapQ]摇动下30℃生长于TSBGM中并用20μg/ml前-雷帕霉素送料。对照保持不送料。再孵育5天后，将培养物用乙酸乙酯提取并干燥。重构并通过LC-MS分析在未送料的对照中没有鉴定到雷帕霉素类似物的产生。在送料前-雷帕霉素的变铅青链霉菌TK24[pSGsetrapM]的提取物中鉴定了两个主新峰，一个在2.5分钟，一个在7.9分钟。这些峰的电喷雾质谱揭示两个峰里都含有相应于MW 855.6的化合物，与9-脱氧-16-O-甲基-27-去甲氧基-39-O-去甲基-雷帕霉素(16-O-甲基-前-雷帕霉素)一致。当提取物通过LC-MS在无TFA的情况下分析时观察到两种异构体。在变铅青链霉菌TK24或者变铅青链霉菌TK24[pSGsetrapQ]的提取物中没有鉴定到新峰。未修饰的前-雷帕霉素是明显的。RapM明显负责C16羟基的甲基化，RapQ对该位置不特异。

实施例14

RapJ功能的阐明

变铅青链霉菌TK24，变铅青链霉菌TK24[pSGsetrapK]，变铅青链霉菌TK24[pSGsetrapJ]和变铅青链霉菌TK24[pSGsetrapKJ]摇动下30℃生长于TSBGM中并用40μg/ml前-雷帕霉素送料。对照保持不送料。再孵育5天后，将培养物用乙酸乙酯提取并干燥。重构并通过LC-MS分析在未送料的对照中没有鉴定到雷帕霉素类似物的产生。在送料前-雷帕霉素的变铅青链霉菌TK24[pSGsetrapKJ]和变铅青链霉菌TK24[pSGsetrapJ]的提取物中鉴定了4.9分钟的一个主新峰。该峰的电喷雾质谱揭示其含有相应于MW 855.5的化合物的离子，与16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-O-去甲基-雷帕霉素(C9氧-前-雷帕霉素)一致。在变铅青链霉菌TK24和变铅青链霉菌TK24[pSGsetrapK]的提取物中没有鉴定到新峰。未修饰的前-雷帕霉素是明显的。

由于FK506簇和FK520簇的RapJ和FkbD的同源性，推测RapJ将前-雷帕霉素在C9氧化成9-羟基-16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-O-去甲基-雷帕霉素(C9 OH-前-雷帕霉素)。推测RapK负责进一步向酮的转化。令人惊奇地，存在RapJ，但不存在RapK时，形成了16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-O-去甲基-雷帕霉素(C9酮-前-雷帕霉素)。RapJ显然在C9具有氧化功能，观察到向酮的完全转化。RapK在C9不具有氧化功能。

实施例15

如下述构建了含有雷帕霉素修饰基因组合的质粒：pMG260(rapI、rapJ、rapN、rapO、和rapL)、pMG261(rapI、rapJ、rapN、rapO、rapM和rapL)、pMG262(rapI、rapJ、rapN、rapO、rapM、rapQ和rapL)pMG236(rapN、rapO、rapQ和rapL)和pMG238(rapJ和rapL)。

质粒pMG236和pMG238的分离

质粒pSGsetrapNOQ和pSGsetrapJ用BglII/XbaI消化，并能将分离的载体片段与pSGLitrapL_his的1kb XbaI/BglII片段连接。分别分离质粒pMG236(表达rapN、rapO、rapQ和rapL)和pMG238(表达rapJ和rapL)。

质粒pMG260、pMG261和pMG262的分离

质粒pSGSetrapKIJNOL、pSGSetrapKIJMNOL、和pSGSetrapKIJMNOQL用BglII消化，并将分离的插入片段(从rapI中的BgIII位点到rapL后的BglII位点含有雷帕霉素簇基因)与含有来自pSGSetrap的BglII消化片段的载体连接。分离了质粒pMG260(表达rapI、rapJ、rapN、rapO、和rapL)、pMG261(表达rapI、rapJ、rapN、rapO、rapM和rapL)、和pMG262(表达rapI、rapJ、rapN、rapO、rapM、rapQ和rapL)。

实施例16

如下描述的构建携带染色体缺失rapK的吸水链霉菌突变株(MG3)。用fkbO异源互补rapK可以如所描述的进行并且将导致雷帕霉素生产的恢复，表明fkbO能够补充吸水链霉菌中rapK的功能。

携带染色体缺失rapK的吸水链霉菌突变株MG3的分离

引物RAPKF1 5’-CAAAGCTTCCTGGCGCGGTTCGGCCGGCA-3’(SEQ ID NO：56)和RAPKF25’-TGGCATGCCCTTCCCCGCCGTTCCCTGGC-3’(SEQ ID NO：57)用于扩增基因rapK外的左同源区(从雷帕霉素簇中nt94403到nt95429，如Schwecke等，1995中所述)，使用从吸水链霉菌NRRL5491制备的基因组DNA作为模板。将1kb PCR产物用T4多核苷酸激酶磷酸化并连接到去磷酸化的SmaI切割的pUC18中。转化到大肠杆菌DH10B后，分离质粒pMG233-7。引物RAPKR1 5’-TGGCATGCCCCCGCCGAGCTGACCTGGAA-3’(SEQ ID NO：58)和RAPKR25’-GTTCTAGAGCTTACGCGTGATGTCGAACG-3’(SEQ ID NO：59)用于扩增基因rapK外的右同源区(从雷帕霉素簇中nt96435到nt97428，如Schwecke等，1995中所述)，使用从吸水链霉菌NRRL5491制备的基因组DNA作为模板。将1kb PCR产物用T4多核苷酸激酶磷酸化并连接到去磷酸化的SmaI切割的pUC18中。转化到大肠杆菌DH10B后，分离质粒pMG257-7。两种质粒都通过测序分析检测。质粒pMG233-7用SphI/XbaI消化并分离3.7kb片段，pMG257-7用SphI/XbaI消化并分离1kb片段。这些片段被连接并用于转化大肠杆菌DH10B。分离质粒pMG268-12。该质粒用HindIII/XbaI消化并分离2kb片段并连接到用HindIII/XbaI切割的pMG55中，该DNA用于转化大肠杆菌DH10B。分离质粒pMG278-1并用于接合吸水链霉菌MG1C。

分离阿泊拉霉素抗性菌落，并将其在TSBGM中摇动下于30℃生长24小时并涂布到含有50μg/l链霉素的培养基1琼脂板上。分离链霉素抗性菌落并且表现为阿泊拉霉素敏感的。RapK的1004nt染色体缺失可以通过Southern印迹在突变体MG3中检验。在图35中给出概览。

吸水链霉菌MG3在26℃摇动下生长于TSBGM中。使用材料和方法章节中描述的方法提取培养液和菌丝体。用UV检测分析提取物揭示没有雷帕霉素三烯的特征峰。

携带染色体缺失rapK的吸水链霉菌突变株MG3中fkbO的表达

使用如材料和方法中描述的方法将质粒pMG169-1(实施例11中描述)转化到吸水链霉菌突变株MG3中。

fkbO对rapK的异源互补

吸水链霉菌MG3pMG169-1在26℃摇动下生长于TSBGM中。使用材料和方法章节中描述的方法提取培养液和菌丝体。对提取物的280nmUV检测揭示存在两个主要的新峰。这些峰的电喷雾质谱揭示这些峰含有相应于雷帕霉素的MW 913的离子。

实施例17

携带染色体缺失fkbO的吸水链霉菌子囊霉素变种突变株MG4的分离和异源互补

分离携带染色体缺失fkbO的吸水链霉菌子囊霉素变种突变株

引物FKOF1 5’-GCTCTAGAGCCCGCGGCTCGCCGGACACG-3’(SEQ ID NO：60)和FKOF2 5’-CCCCTGCAGGCGTCCGGCATCGGTCATCAG-3’(SEQ ID NO：61)用于扩增左同源区(从子囊霉素簇中nt45750到nt46751，如Wu等，2000中所述)，使用从吸水链霉菌子囊霉素变种ATCC14891制备的基因组DNA作为模板。将1kb PCR产物用T4多核苷酸激酶磷酸化并连接到去磷酸化的SmaI切割的pUC18中。转化到大肠杆菌DH10B后，分离质粒pMG258-4。引物FKOR15’-CGCCTGCAGGGATACGGTCCGCCGGGTCTGC-3’(SEQ ID NO：62)和FKOR₂5’-CCAAGCTTGTACGGTTCGCCACGGGCGTGC-3’(SEQ ID NO：63)用于扩增右同源区(从子囊霉素簇中nt47785到nt48781，如Wu等，2000中所述)，使用从吸水链霉菌子囊霉素变种ATCC14891制备的基因组DNA作为模板。将1kb PCR产物用T4多核苷酸激酶磷酸化并连接到去磷酸化的SmaI切割的pUC18中。转化到大肠杆菌DH10B后，分离质粒pMG259-5。两种质粒都通过测序分析检测。质粒pMG258-4用SbfI/HindIII检测并分离3.7kb片段，pMG259-5用SbfI/HindIII消化并分离1kb片段。连接这些片段并将其用于转化大肠杆菌DH10B。分离质粒pMG265-1。该质粒用HindIII/EcoRI消化并分离2kb片段并连接到用HindIII/EcoRI切割的pMG55中，并将DNA用于转化大肠杆菌DH10B。分离质粒pMG267-1并将其用于接合吸水链霉菌子囊霉素变种ATCC14891。

分离阿泊拉霉素抗性菌落，并将其在TSBGM中摇动下于30℃生长24小时并涂布到含有50μg/l链霉素的培养基1琼脂板上。分离链霉素抗性菌落并且表现为阿泊拉霉素敏感的。fkbO的1034nt染色体缺失可以通过Southern印迹在突变株MG4中证实。在图36中给出概览。

在携带染色体缺失fkbO的吸水链霉菌子囊霉素变种突变株MG4中表达RapK

如在材料和方法章节中所描述的将质粒pSGsetRapK转化到吸水链霉菌突变株MG4中。

rapK对fkbO的异源互补

吸水链霉菌子囊霉素变种MG4pSGSetRapK在26℃摇动下生长于TSBGM中。使用如材料和方法章节中描述的方法提取培养液和菌丝体。通过LC-MS分析提取物揭示存在主要的新峰并揭示其含有对应于FK520(子囊霉素)的离子。

实施例18

对本领域技术人员显而易见的是编码FKBP-配体如FK506的其他生物合成簇可以使用此处描述的方法被修饰从而rapK同源物被缺失或失活。在FK506中例如这可如下实施：对fkbO基因(序列登记号码AF082099、AF082100)任一侧的区域通过扩增PCR产物，将这些扩增产物一起连接到载体如pMG55中，转化FK506生产菌株，选择双交换并通过southern印迹证实fkbO基因的删除。

实施例19

在缺少内源性天然起始单元的竞争下，通过rapK删除菌株吸水链霉菌MG2-10将非天然起始单元掺入雷帕霉素类似物中

如在实施例10和12中所阐明的，雷帕霉素PKS具有对非天然起始单元的高度适应性，并且缺少rapK时，该体系没有来自天然起始物的竞争。在该实施例中，进一步阐明了适应性的程度。

根据材料和方法(方法B)中所概述的，对吸水链霉菌MG2-10进行生长、送料、提取和分析。与所产生的化合物一起送料的羧酸类的范围在下面列出。令人惊奇地，所有所列羧酸都被掺入，这一点通过观察278nm处特征性UV生色团和电喷雾质谱分析法而确定，从而导致产生雷帕霉素类似物。

产生的该雷帕霉素类似物相当于下面的如表VIII中所列式子：

表VIII

实施例20

在缺少内源性天然起始单元的竞争下，通过rapK删除菌株吸水链霉菌MG2-10[pSGsetrapN/OQL_his]将非天然起始单元掺入雷帕霉素类似物中。

如在实施例10和12和19中所阐明的，雷帕霉素PKS具有对非天然起始单元的高度适应性，并且缺乏rapK时，该体系没有来自天然起始物的竞争。在该实施例中，进一步阐明了适应性的程度。

根据材料和方法(方法B)中所概述的，对吸水链霉菌MG2-10[pSGsetrapN/OQL_his]进行生长、送料、提取和分析。与所产生的化合物一起送料的羧酸类的范围在下面列出。令人惊奇地，所有所列羧酸都被掺入，这一点通过观察278nm处特征性UV生色团和电喷雾质谱分析法而确定，从而导致产生雷帕霉素类似物。

产生的该雷帕霉素类似物相当于下面的如表IX中所列式子：

表IX

实施例20

在缺少内源性天然起始单元的竞争下，通过rapK删除菌株吸水链霉菌MG3将非天然起始单元掺入雷帕霉素类似物中

根据材料和方法(方法B)中所概述的，对吸水链霉菌MG3进行生长、送料、提取和分析。可被送料的羧酸类的范围在下面列出。通过观察278nm处特征性UV生色团和电喷雾质谱分析法确定所列羧酸的掺入和雷帕霉素类似物的产生。

可被送料的羧酸起始单元包括：环己烷羧酸、3-顺式，4-反式-二羟基环己烷羧酸、1-环己烯羧酸、3-环己烯羧酸、环庚烷羧酸、2-降冰片烷羧酸甲酯、3-羟基环己烷羧酸、4-羟基环己烷羧酸、3-甲基环己烷羧酸、4-甲基环己烷羧酸、3-(顺式/反式)甲氧基环己烷羧酸、4-(顺式/反式)甲氧基环己烷羧酸、4-环己酮羧酸乙酯、3-氟4-羟基羧酸和4-氟3-羟基羧酸、3-环己烷氧化物羧酸、3，4-顺式二羟基环己烷羧酸、3-氯4-羟基羧酸和4-氯3-羟基羧酸(和相反的非对映异构体对)、环己基丙酸和4-叔丁基环己烷羧酸。

实施例21

在缺少内源性天然起始单元的竞争下，通过fkbO删除菌株吸水链霉菌子囊霉素变种MG4将非天然起始单元掺入FK520类似物中。

如在实施例10、12、19和20中所阐明的，雷帕霉素PKS具有对非天然起始单元的高度适应性。缺乏fkbO的情况下，FK520体系没有天然起始物的竞争。在该实施例中，研究了没有天然起始物竞争的FK520 PKS的适应程度。

根据材料和方法(方法B)中所概述的，对吸水链霉菌MG4进行生长、送料、提取和分析。可被送料的羧酸类的范围实例在表IV中给出。通过观察278nm处特征性UV生色团和电喷雾质谱分析法确定所列羧酸的掺入和FK520类似物的产生。

实施例22

缺少天然起始物的竞争时筑波链霉菌的fkbO缺失突变株将非天然起始物掺入FK506类似物。

根据材料和方法中概述的送料方法生长和送料筑波链霉菌的fkbO缺失突变体。将在材料和方法中表IV所列的一小组羧酸进行送料。如材料和方法中方法(B)所描述的进行分析。

实施例23

分离吸水链霉菌MG2-10[pSGsetrapKIL_h]的发酵产物

通过将吸水链霉菌菌株MG2-10与pSGsetrapKIL_h接合并如下所述分离产生的发酵产物得到9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-雷帕霉素。这表明有可能弥补MG2 10菌株中rapK、rapI和rapL的缺失并产生9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-雷帕霉素，其是缺少PKS后修饰的一种类似物。当rapL被互补时不需要送料六氢吡啶羧酸，证明rapL在雷帕霉素的产生中有提供六氢吡啶羧酸的作用。

发酵吸水链霉菌MG2-10[pSGsetKIL_his](见材料和方法)，根据材料和方法中概述的方法(B)提取和分离。用于制备性HPLC的等梯度溶剂系统是60％CH₃CN/H₂O。

9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基雷帕霉素(化合物6)具有下面的特征：

分离产量：22毫克

分子量：856

分子式：C₄₉H₇₇NO₁₁

UV(HPLC分析时通过二极管阵列检测)：268纳米、278纳米、288纳米

电喷雾MS：MNa⁺的m/z＝878，M-H的m/z＝854

下面的表X概述了CDCl₃中9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基雷帕霉素的¹H和¹³C NMR数据。

表X

a：可以指认为H4a

b：临时指认

c：指认可以互换

d：指认可以互换

化合物6作为CDCl₃中构象异构体的1∶1混合物存在。上面的数据属于两种构象异构体。在穿过该表画虚线时不可能确定自旋体系间的连通性，因此为特定构象异构体指认数据是不可能的。

实施例24

分离吸水链霉菌MG2-10[pSGsetrapKIMLh]的发酵产物

通过如实施例1中描述的将吸水链霉菌MG2-10菌株与pSGsetKIML_his接合并分离发酵产生的产物得到9-脱氧-27-去甲氧基-雷帕霉素。这表明可能弥补MG2-10菌株中rapK、rapI、rapM和rapL的缺失并产生缺少一些PKS后修饰的雷帕霉素类似物。

发酵吸水链霉菌MG2-10[pSGsetKIL_his](见材料和方法)，根据材料和方法中概述的方法(B)提取和分离。

用于制备性HPLC的等梯度溶剂系统是75％CH₃CN/H₂O。

9-脱氧-27-去甲氧基雷帕霉素(化合物16)具有下面的特征：

分离产量：24毫克

分子量：870

分子式：C₅₀H₇₉NO₁₁

电喷雾MS：MNa⁺的m/z＝892，M-H的m/z＝868

下面的表XI概述了CDCl₃中9-脱氧-27-去甲氧基雷帕霉素的¹H和¹³C NMR数据。

表XI

实施例25

分离吸水链霉菌MG2-10[pSGsetKIN/OLh]的发酵产物

通过如实施例1中描述的将吸水链霉菌MG2-10菌株与pSGsetKIN/OL_his接合并分离发酵产生的产物得到9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲基-雷帕霉素。这表明可能弥补MG2-10菌株中rapK、rapI、rapN/O和rapL的缺失并产生缺少一些PKS后修饰的雷帕霉素类似物。

发酵吸水链霉菌MG2-10[pSGsetKIN/OL_his](见材料和方法)，根据材料和方法中概述的方法(B)提取和分离。

用于制备性HPLC的等梯度溶剂系统是60％CH₃CN/H₂O。

9-脱氧-16-O-去甲基-27-O-去甲基雷帕霉素(化合物9)具有下面的特征：

分离产量：77毫克

分子量：872

分子式：C₄₉H₇₇NO₁₂

电喷雾MS：MNa⁺的m/z＝894，M-H的m/z＝870

下面的表XII概述了CDCl₃中9-脱氧-16-O-去甲基-27-O-去甲基雷帕霉素的¹H和¹³C NMR数据。

表XII

实施例26

分离吸水链霉菌MG2-10[pSGsetKJLh]的发酵产物

通过如实施例1中描述的将吸水链霉菌MG2-10菌株与pSGsetKJL_his接合并分离发酵产生的产物得到16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-O-去甲基-雷帕霉素。这表明可能弥补MG2-10菌株中rapK、rapJ和rapL的缺失并产生缺少一些PKS后修饰的雷帕霉素类似物。

用于制备性HPLC的等梯度溶剂系统是55％CH₃CN/H₂O。

16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-O-去甲基雷帕霉素(化合物3)具有下面的特征：

分离产量：176毫克(2种互变异构体的混合物)

分子量：856

分子式：C₄₈H₇₃NO₁₂

电喷雾MS：MNa⁺的m/z＝878，M-H的m/z＝854

MS碎片：钠加合物(m/z 878)碎片化得到三种碎片：C8-C42，m/zMNa⁺749；C1-C27，m/z MNa⁺570；C28-C42+C1-C14，m/z MNa⁺628。碎片离子628和570进一步碎片化得到相同碎片：C1-C14、m/z MNa⁺320。该C1-C14碎片的质量比9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-O-去甲基雷帕霉素(化合物1)的钠加合物破碎的等同碎片大14个质量单位，这与C9位的氧化一致。

实施例27

分离吸水链霉菌MG2-10[pSGsetKMNOLh]的发酵产物

通过如实施例1中描述的将吸水链霉菌MG2-10菌株与pSGsetKMN/OL_his接合并分离发酵产生的产物得到9-脱氧-27-O-去甲基-39-O-去甲基-雷帕霉素。这表明可能弥补MG2-10菌株中rapK、rapM、rapN/O和rapL的缺失并产生缺少一些PKS后修饰的雷帕霉素类似物。

发酵吸水链霉菌MG2-10[pSGsetKMN/OL_his](见材料和方法)，根据材料和方法中概述的方法(B)提取和分离。

用于制备性HPLC的等梯度溶剂系统是60％CH₃CN/H₂O。

9-脱氧-27-O-去甲基-39-O-去甲基雷帕霉素(化合物8)具有下面的特征：

分离产量：6毫克

分子量：872

分子式：C₄₉H₇₇NO₁₂

电喷雾MS：MNa⁺的m/z＝894，M-H的m/z＝870

MS碎片：钠加合物(m/z 894)碎片化得到三种碎片：C8-C42，m/zMNa⁺765；C1-C27，m/z MNa⁺586；C28-C42+C1-C14，m/z MNa⁺614。碎片离子614和586进一步分离得到相同碎片：C1-C14、m/z MNa⁺306。该C1-C14与9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-O-去甲基雷帕霉素的钠加合物破碎的碎片相同；该化合物是9-脱氧。该C1-C27碎片比9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-O-去甲基雷帕霉素得到的等同碎片大30个质量单位，这与一个羟基化和一个甲基化一致。RapM甲基化C-16处的羟基基团(见实施例22的pSGsetKIL_his以及实施例23的pSGsetKIML_his)并且RapN与RapO组合羟基化C27从而该数据与该化合物为9-脱氧-27-O-去甲基-39-O-去甲基雷帕霉素(化合物8)是一致的。

实施例28

分离吸水链霉菌MG2-10[pSGsetKIJLh]的发酵产物

通过如实施例1中描述的将吸水链霉菌MG2-10菌株与pSGsetKIJL_his接合并分离发酵产生的产物得到16-O-去甲基-27-去甲氧基-雷帕霉素。这表明可能弥补MG2-10菌株中rapK、rapI、rapJ和rapL的缺失并产生缺少一些PKS后修饰的雷帕霉素类似物。

发酵吸水链霉菌MG2-10[pSGsetKIJL_his](见材料和方法)，根据材料和方法中概述的方法(B)提取和分离。

用于制备性HPLC的等梯度溶剂系统是60％CH₃CN/H₂O。

16-O-去甲基-27-去甲氧基雷帕霉素(化合物12)具有下面的特征：

分离产量：11毫克

分子量：870

分子式：C₄₉H₇₅NO₁₂

电喷雾MS：MNa⁺的m/z＝892，M-H的m/z＝868

实施例29

分离吸水链霉菌MG2-10[pSGsetKL_his]的发酵产物

通过如实施例1中描述的将吸水链霉菌MG2-10菌株与pSGsetKL_his接合并分离发酵产生的产物得到9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-O-去甲基-雷帕霉素。这表明可能弥补MG2-10菌株中rapK和rapL的缺失并产生缺少PKS后修饰的雷帕霉素类似物(前-雷帕霉素)。

使用材料和方法中概述的方法发酵、提取和分离吸水链霉菌MG2-10[pSGsetKL_his]。

用于制备性HPLC的等梯度溶剂系统是60％CH₃CN/H₂O。

9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-O-去甲基雷帕霉素(化合物1)具有下面的特征：

分离产量：24毫克

分子量：842

分子式：C₄₈H₇₅NO₁₁

电喷雾MS：MNa⁺的m/z＝864，M-H的m/z＝840

MS碎片：钠加合物(m/z 864.5)碎片化得到三种碎片：C8-C42，m/zMNa⁺735；C1-C27，m/z MNa⁺556；C28-C42+C1-C14，m/z MNa⁺614，C1-C14，m/z MNa⁺306。通过与雷帕霉素的据报导的破碎(J.A.Reather，博士论文，University of Cambridge，2000)确定这些碎片的预期m/z。这些碎片具有和9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-O-去甲基雷帕霉素碎片预测的m/z相同的m/z。

实施例30

以环己烷羧酸送料的吸水链霉菌MG2-10的发酵产物的分离

将环己烷羧酸送料于吸水链霉菌MG2-10并分离发酵产生的产物得到9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-去甲氧基-雷帕霉素。所得突变合成表明在缺少天然内源起始物时，可能化学上弥补MG2-10菌株中rapK的缺失，结果产生缺少PKS后修饰的雷帕霉素类似物。

发酵吸水链霉菌MG2-10(见材料和方法)，送料(见材料和方法)，根据材料和方法中概述的方法(B)提取和分离。

用于制备性HPLC的等梯度溶剂系统是60％CH₃CN/H₂O。

9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-去甲氧基雷帕霉素(化合物47)具有下面的特征：

分离产量：12毫克

分子量：826

分子式：C₄₈H₇₅NO₁₀

电喷雾MS：MNa⁺的m/z＝848.5，M-H的m/z＝825

MS碎片：钠加合物(m/z 848.5)碎片化得到三种碎片：C8-C42，m/zMNa⁺719；C1-C27，m/z MNa⁺556；C28-C42+C1-C14，m/z MNa⁺598，C1-C14，m/z MNa⁺306。这些数据表明化合物47和9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-O-去甲基雷帕霉素(化合物1)之间的差异位于C28-C42区。化合物47的该碎片比化合物1的该碎片小16个质量单位，与化合物47是9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-去甲氧基雷帕霉素一致。

实施例31

分离吸水链霉菌MG2-10[pSGsetKNOLh]的发酵产物

通过如实施例1中描述的将吸水链霉菌MG2-10菌株与pSGsetKN/OL_his接合并分离发酵产生的产物得到9-脱氧-16-O-去甲基-27-O-去甲基-39-O-去甲基-雷帕霉素。这表明可能弥补MG2-10菌株中rapK、rapN/O和rapL的缺失并产生缺少一些PKS后修饰的雷帕霉素类似物。

用于制备性HPLC的等梯度溶剂系统是60％CH₃CN/H₂O。

9-脱氧-16-O-去甲基-27-O-去甲基-39-O-去甲基雷帕霉素(化合物2)具有下面的特征：

分子量：858

分子式：C₄₈H₇₅NO₁₂

电喷雾MS：MK+的m/z＝896，M-H的m/z＝856

实施例32

吸水链霉菌MG2-10[pSGsetKJNOLh]的发酵产物鉴定

通过如实施例1中描述的将吸水链霉菌MG2-10菌株与pSGsetKJN/OL_his接合并分析发酵产生的产物得到16-O-去甲基-27-O-去甲基-39-O-去甲基-雷帕霉素。这表明可能弥补MG2-10菌株中rapK、rapJ、rapN/O和rapL的缺失并产生缺少一些PKS后修饰的雷帕霉素类似物。

根据材料和方法中描述的提取、分离和分析方法(B)中所描述的处理发酵液(1mL)。HPLC色谱(280nm)含有具有特征性雷帕霉素三烯的一个峰(268纳米、278纳米、288纳米)。在缺乏表达盒时从吸水链霉菌MG2-10提取的对照样品色谱中没有观察到该峰。新雷帕霉素类似物的LCMS(见材料和方法，方法B)给出m/z 895(MNa⁺)和871(M-H)离子。这些离子证明新雷帕霉素类似物的分子量是872，比9-脱氧-16 O-去甲基-27-去甲氧基39-O-去甲基雷帕霉素(化合物1)大30个质量单位，与在C9处氧化(rapJ)和C27处羟基化(rapN/O)一致。这些数据与该化合物是16-O-去甲基-27-O-去甲基-39-O-去甲基雷帕霉素(化合物7)一致。

实施例33

分离吸水链霉菌MG2-10[pSGsetKJNOLh]的发酵产物

通过如实施例1中描述的将吸水链霉菌MG2-10菌株与pSGsetKJN/OL_his接合并分离发酵产生的产物得到16-O-去甲基-27-O-去甲基-39-O-去甲基-雷帕霉素。这表明可能弥补MG2-10菌株中rapK、rapJ、rapN/O和rapL的缺失并产生缺少一些PKS后修饰的雷帕霉素类似物。

发酵吸水链霉菌MG2-10[pSGsetKJN/OL_his](见材料和方法)，根据材料和方法中概述的方法(B)提取和分离。

用于制备性HPLC的等梯度溶剂系统是60％CH₃CN/H₂O。

16-O-去甲基-27-O-去甲基-39-O-去甲基雷帕霉素(化合物7)具有下面的特征：

分子量：872

分子式：C₄₈H₇₃NO₁₃

电喷雾MS：MNa⁺的m/z＝895，M-H的m/z＝871

实施例34

吸水链霉菌MG2-10[pSGsetKIJNOQLh]的发酵产物鉴定

通过如实施例1中描述的将吸水链霉菌MG2-10菌株与pSGsetKIJN/OQL_his接合并分析发酵产生的产物得到16-O-去甲基雷帕霉素。这表明可能弥补MG2-10菌株中rapK、rapI、rapJ、rapN/O、rapQ和rapL的缺失并产生缺少C16-OH甲基化的雷帕霉素类似物。此外，清除地鉴定了RapQ为负责C27-OH甲基化的SAM-依赖的O-甲基转移酶。

发酵吸水链霉菌MG2-10[pSGsetKIJN/OQL_his](见材料和方法)，根据材料和方法中概述的方法(B)提取和分析。

如材料和方法中描述的处理发酵液(1mL)。HPLC色谱(280nm)含有具有特征性雷帕霉素三烯的一个峰(268纳米、278纳米、288纳米)。在缺乏表达盒时从吸水链霉菌MG2-10提取的对照样品的色谱中没有观察到该峰。新雷帕霉素类似物的LCMS(见材料和方法，方法B)给出m/z923(MNa⁺)和899(M-H)离子。这些离子证明新雷帕霉素类似物的分子量是900，比雷帕霉素小14个质量单位。已经确定，未包括在表达盒中的唯一PKS后基因rapM产生甲基化C16-OH的作用，从而，新雷帕霉素类似物是16-O去甲基雷帕霉素(化合物20)并且rapQ显示是具有功能的并产生C27处的O-甲基化作用。

实施例35

雷帕霉素类似物的生物测定：

(1)＝9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-O-去甲基-雷帕霉素(前-雷帕霉素)

(6)＝9-脱氧-16-O-去甲基-27-去甲氧基-雷帕霉素

(16)＝9-脱氧-27-去甲氧基-雷帕霉素

(3)＝16-O-去甲基-27-去甲氧基-39-O-去甲基-雷帕霉素

(9)＝9-脱氧-16-O-去甲基-27-O-去甲基-雷帕霉素

(8)＝9-脱氧-27-O-去甲基-39-O-去甲基-雷帕霉素。

癌细胞系：

使用MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物)测定法使用微滴定板(Sieuwerts，A.M.，等，1995)体外检测对实体恶性肿瘤HT29(结肠)和MCF-7(乳腺)的人肿瘤贴壁细胞系的生长抑制。所有细胞系或者从ATCC(美国典型培养物保藏中心)或者ECACC(欧洲细胞培养物保藏中心)得到。所有细胞系都从冰冻储备物生长并且在RPMI 1640中使用前传代至少1次。使用最小胰蛋白酶化从亚汇合的培养物收获细胞。对于每种细胞系在RPMI1640将细胞稀释到适宜密度(取决于细胞倍增时间)，并以100μl/孔的体积种于96孔板中的60个孔(即不使用板中其余的孔)。96孔板在37℃孵育过夜。孵育后，向每孔加入100μl对照和受试物质的log等级稀释液，一式六份用于检验所有受试化合物、参考化合物和培养基对照。分析前将板再孵育72小时。将MTT(5mg/ml)加入每孔中并将板再孵育3-4小时。从孔除去未反应的MTT，并将从MTT形成的甲*晶体溶于DMSO中，在570nm读数特征性吸光度。为每种细胞系计算导致50％最大抑制的每种受试化合物和参考化合物的浓度(nM)(IC₅₀)，并与所观察的抑制的最大百分数(Im)一起给出，见表XIII。作为参考，雷帕霉素在HT-29细胞系中IC₅₀为200nM，Im为40％，在MCF-7细胞系中IC₅₀为0.03nM，Im为56％。

表XIII

混合淋巴细胞反应(MLR)：

开发MLR最初用于同种异体移植前评定组织相容性，MLR为体外免疫反应提供了成熟模型(SOULILLOU，J.P.，等(1975)；T.Meo.“免疫学方法”，L.Lefkovits和B.Pernis编辑，Academic Press，N.Y.227-239页(1979)。通过将从C57BL/6小鼠(5×10⁵个细胞)分离的脾脏淋巴细胞与来自CBA小鼠(2.5×10⁵个细胞)的受抑制脾脏淋巴细胞混合进行MLR。受抑制的CBA淋巴细胞在C57BL/6淋巴细胞中诱导增殖性应答并且通过将掺入到DNA中的[³H]胸苷作为测量C57BL/6小鼠分离的脾脏淋巴细胞增殖的方法确定该增殖性应答。存在参考化合物、受试化合物和培养基对照的log等级稀释液时在37℃72小时内测定抗增殖效果。对每种细胞系计算与对照增殖相比，抑制淋巴细胞增殖50％的每种受试化合物和参考化合物的浓度，并表示为抑制淋巴细胞增殖50％所需雷帕霉素的浓度的比率(rIC₅₀)，见表XIV。

表XIV

抗真菌测定法：

确定了参考化合物和受试化合物对病原性真菌白假丝酵母(Candidaalbicans)DSM 5816、白假丝酵母DSM 1386和光滑假丝酵母(Candidaglabrata)DSM 11226的比较抗真菌活性。这使用NCCLS参考方法：对酵母进行肉汤稀释抗真菌易感性测试：批准标准M27-A、17(9).1997)，采用微滴定板改良方法(M27-A，vol.17No.9.(1997))实施。酵母菌(10⁴cfu/ml)接种到含有0.165mM MOPS，pH7的RPMI1640培养基中。存在参考化合物、受试化合物和培养基对照的log等级稀释液时在37℃摇动孵育24小时后确定生长。为受试化合物确定最小抑制浓度(MIC)和最小杀真菌活性(MFC)并表达为雷帕霉素最小抑制浓度的比率(分别为rMIC)的。见表XV。

表XV

参考文献

Alarcon，C.M.，Heitman，J.，和Cardenas，M.E.(1999)酵母中蛋白激酶活性和雷帕霉素TOR蛋白靶标的毒性效应子结构域的鉴定.MolecularBiology of the Cell 10：2531-2546.

Aparicio，J.F.，Molnár，I.，Schwecke，T.，

A.，Haydock，S.F.，Khaw，LE.，Staunton，J.，和Leadlay，P.F.(1996)吸水链霉菌中雷帕霉素生物合成基因簇的组织：模块聚酮化合物合成酶中酶促结构域的分析.Gene 169：9-16.

Baker，H.，Sidorowicz，A.，Sehgal，S.N.，和Vézina，C.(1978)雷帕霉素(AY-22，989)，一种新的抗真菌抗生素.III.体外和体内评价.Journalof Antibiotics 31：539-545.

Bierman，M.，Logan，R.，O′Brien，K.，Seno，E.T.，Nagaraja Rao，R.，和Schoner，B.E.(1992)将来自大肠杆菌的DNA接合转移到链霉菌的质粒克隆载体Gene 116：43-49.

Blanc，V.，Lagneaux，D.，Didier，P.，Gil，P.，Lacroix，P.，和Crouzet，J.(1995)从始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)克隆和分析编码参与原始霉素II_B向原始霉素II_A(PII_A)转化的酶：PII_A合酶和NADH：核黄素5′-磷酸氧化还原酶的结构基因Journal of Bacteriology 177：5206-5214.

Blanc，V.，Gil，P.，Bamas-Jacques，N.，Lorenzon，S.，Zagorec，M.，Schleuniger，J.，Bisch，D.，Blanche，F.，Debussche，L.，Crouzet，J.，和Thibaut，D.(1997)从始旋链霉菌鉴定和分析编码参与原始霉素I的4-二甲氨基-L-苯丙氨酸前体的生物合成的酶的基因，MolecularMicrobiology 23：191-202.

Box，S.J.，Shelley，P.R.，Tyler，J.W.，Verrall，M.S.，Warr，S.R.C.，Badger，A.M.，Levy，M.A.，和Banks，R.M.(1995)27-O-去甲基雷帕霉素-吸水链霉菌的一个新菌株产生的免疫抑制化合物Journal of Antibiotics48：1347-1349.

Brown，E.J.，Albers，M.W.，Shin，T.B.，Ichikawa，K.，Keith，C.T.，Lane，W.S.，和Schreiber，S.L.(1994)雷帕霉素-受体复合体使停滞在G1期所靶定的哺乳动物蛋白质.Nature 369：756-758.

Brunn，G.J.，Williams，J.，Sabers，C.，Wiederrecht，G.，Lawrence，J.C.，和Abraham，R.T.(1996)通过磷酸肌醇3-激酶抑制剂渥曼青霉素和LY294002直接抑制雷帕霉素的哺乳动物靶标的信号转导功能，EMBO Journal 15：5256-5267.

Cao，W.，Mohacsi，P.，Shorthouse，R.，Pratt，R.和Morris，R.E.(1995).雷帕霉素对生长因子刺激的血管平滑肌细胞DNA合成的影响。FK506抑制碱性成纤维细胞生长因子和血小板来源的生长因子作用以及拮抗雷帕霉素，Transplantation 59(3)：390-395.

Carlson，R.P.，Hartman，D.A.，Tomchek，L.A.，Walter，T.L.，Lugay，J.R.，Calhoun，W.，Sehgal，S.N.，Chang，J.Y.(1993).雷帕霉素，一种潜在的减轻疾病的抗风湿药物J.Pharmacol.Exp.Ther.266(2)：1125-38.

Chambraud，B.，Radanyi，C.，Camonis，J.H.，Shazand，K.，Rajkowski，K.，和Baulieu，E.E.(1996)FAP48，形成特定复合物亲免素FKBP59和FKBP12的一种新蛋白质。通过免疫抑制药物FK506和雷帕霉素预防.Journal of Biological Chemistry 271：32923-32929.

Chang，J.Y.，Sehgal，S.N.，和Bansbach，C.C.(1991)FK506和雷帕霉素：免疫应答的新药理学探针.Trends in Pharmacological Sciences 12：218-223.

Chen，J.，Zheng，X.F.，Brown，E.J.，和Schreiber，S.L.(1995)289-kDaFKBP12-雷帕霉素相关蛋白内的11-kDa FKBP12-雷帕霉素结合结构域的鉴定和一个关键丝氨酸残基的表征.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 92：4947-4951.

Chini，M.，Crotti，P.，Gardelli，C.，和Macchia，F.，(1992)，Tetrahedron，48，3805-3812

Choi，J.W.，Chen，J.，Schreiber，S.L.，和Clardy，J.(1996)与人FRAP的结合结构域相互作用的FKBP12-雷帕霉素复合物的结构.Science 273：239-242.

Chung，L.，Liu，L.，Patel，S.，Carney，J.R.，和Reeves，C.D.(2001)从吸水链霉菌的雷帕霉素基因簇缺失rapQNML可以产生16-O-去甲基-27-去甲氧基类似物.Journal of Antibiotics 54：250-256.

Corey，E.J.和Huang，H.，(1989)Tetrahedron Lett.，30，5235-5238

DiLella，A.G.，和Craig，R.J.(1991)人FKBP-12基因的外显子组织：与结构和功能蛋白质结构域的相关性.Biochemistry 30：8512-8517.

Du，L.C.，Sánchez，C.，Chen，M.，Edwards，D.J.，和Shen，B.(2000)支持非核糖体肽合成酶和聚酮化合物合成酶之间功能相互作用的来自轮枝链霉菌ATCC15003的抗肿瘤药物博来霉素的生物合成基因簇。

Chemistry & Biology 7：623-642.

Dudkin，L.，Dilling，M.B.，Cheshire，P.J.，Harwood，F.C.，Hollingshead，M.，Arbuck，S.G.，Travis，R.，Sausville，E.A.，Houghton，P.J.(2001).雷帕霉素酯CCI-779对mTOR的抑制和肿瘤生长抑制的生物化学相关性。Clin.Cancer Res.7(6)：1758-64

Fehr，T.，Sanglier，J-J.，Schuler，W.，Gschwind，L.，Ponelle，M.，Schilling，W.，Wioland，C.(1996).Antascomicinc A、B、C、D和E：来自微单胞菌菌株的新FKBP12结合化合物。J.Antibiot.49(3)：230-233.

Ferrari，S.，Pearson，R.B.，Siegmann，M.，Kozma，S.C.，和Thomas，G.(1993)免疫抑制性的雷帕霉素通过一组新位点的去磷酸化诱导P70^s6k失活。Journal of Biological Chemistry 268：16091-16094.

Findlay J.A，和Radics，L.(1980)Canadian Journal of Chemistry 58：579.

Fishbein，T.M.，Florman，S.，Gondolesi，G.，Schiano，T.，LeLeiko，N.，Tschernia，A.，Kaufman，S.(2002).西罗莫司导入前后的肠移植。

Transplantation.73(10)：1538-42.

Foey，A.，Green，P.，Foxwell，B.，Feldmann，M.，Brennan，F.(2002).细胞因刺激的T细胞诱导依赖于磷脂酰肌醇3-激酶和p70S6K的巨噬细胞IL-10产生：对类风湿性关节炎的启示。Arthritis Res.4(1)：64-70.Epub 2001 Oct 10.

Gaisser，S.，Reather，J.，Wirtz，G.，Kellenberger，L.，Staunton，J.，和

Leadlay，P.F.(2000)Saccharopolyspora erythraea中杂合大环内酯

生物合成的明确系统。Molecular Microbiology 36：391-401.Gaisser，S.，Lill，R.，Staunton，J.，Mendez，C.，Salas，J.，Leadlay，PF.(2002)Saccharopolyspora erythraea中14元聚酮化合物大环内酯氧化的平行途径。Mol Microbiol 44：771-81.

Galat，A.(2000)一些不同基因组中FK506-结合蛋白的序列多样化。

European Journal of Biochemistry 267：4945-4959.

Gregory，C.R.，Huie，P.，Billingham，M.E.和Morris，R.E.(1993).雷帕霉素抑制同种免疫和机械损伤导致的动脉内膜增厚。其对受损脉管中细胞的、生长因子和细胞因子应答的影响。Transplantation55(6)：1409-1418.

Gregory MA，Till R，Smith，MCM.(印刷中)链霉菌噬菌体ΦBT1的整合位点和位点特异性整合载体的开发。J Bacteriol.

Guba，M.，von Breitenbuch，P.，Steinbauer，M.，Koehl，G.，Flegel，S.，Hornung，M.，Bruns，C.J.，Zuelke，C.，Farkas，S.，Anthuber，M.，Jauch，K.W.，和Geissler，E.K.(2002)雷帕霉素通过抗血管生成抑制原发性和转移性肿瘤生长：血管内皮生长因子的参与。NatureMedicine 8：128-135.

Hamilton，G.S.，和Steiner，J.P.(1998)亲免素：不仅仅是免疫抑制.Journal of Medicinal Chemistry 41：5119-5143.

Hara，K.，Yonezawa，K.，Kozlowski，M.T.，Sugimoto，T.，Andrabi，K.，Weng，Q.P.，Kasuga，M.，Nishimoto，I.，和Avruch，J.(1997)通过mTOR对eIF-4E BP1磷酸化的调节。Journal of Biological Chemistry272：26457-26463.

Hardwick，J.S.，Kuruvilla，F.G.，Tong，J.K.，Shamji，A.F.，和Schreiber，S.L.(1999)雷帕霉素调节的转录定义了一小组直接受Tor蛋白质控制的营养敏感的信号途径。Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 96：14866-14870.

Hatanaka，H.，Kino，T.，Miyata，S.，Inamura，N.，Kuroda，A.，Goto，T.，Tanaka，H.，Okuhara，M.(1988).FR-900520和FR-900523——从链霉菌分离的新免疫抑制剂。II.发酵、分离和理化与生物学特征。J.Antibiot.(东京).41(11)：1592-601.

Hatanaka H，Kino T，Asano M，Goto T，Tanaka H，Okuhara M.(1989).

筑波链霉菌No.9993产生的FK-506相关化合物。J.Antibiot.(东京).42(4)：620-2.

Hendrickson，B.A.，Zhang，W.，Craig，R.J.，Jin，Y.J.，Bierer，B.E.，Burakoff，S.，和DiLella，A.G.(1993)编码人和鼠FK506-结合蛋白(FKBP)13的基因的结构组织和与FKBP1的比较。Gene 134：271-275.

Hentges，K.E.，Sirry，B.，Gingeras，A.C.，Sarbassov，D.，Sonenberg，N.，Sabatini，D.，和Peterson，A.S.(2001)小鼠胚胎发育过程中的增殖和定型需要FRAP/mTOR。Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 98：13796-13801.

Hopwood，D.A.(1997)对理解聚酮化合物合成酶的遗传贡献。ChemicalReviews 97：2465-2497.

Hosted，T.J.，和Baltz，R.H.(1997)rpsL用于玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)中显性选择和基因替代。Journal ofBacteriology 179：180-186.

Hung，D.T.，和Schreiber，S.L.(1992)人25kDa FK506和雷帕霉素结合蛋白的cDNA克隆。Biochemical和Biophysical ResearchCommunications 184：733-738.

Hung，D.T.，Jamison，T.F.，和Schreiber，S.L.(1996)理解和用天然产物调控细胞周期。Chemistry&Biology 3：623-639.

Jain，S.，Bicknell，G.R.，Whiting，P.H.，Nicholson，M.L.(2001).肾局部缺血多次灌注损伤的实验模型中雷帕霉素减少纤维化相关基因的表达。Transplant Proc.33(1-2)：556-8.

Jin，Y.J.，Burakoff，S.J.，和Bierer，B.E.(1992)25-kDa高亲和性雷帕霉素结合蛋白FKBP25的分子克隆。Journal of Biological Chemistry 267：10942-10945.

Kahan，B.D.，Chang，J.Y.，和Sehgal，S.N.(1991)新的强免疫抑制剂雷帕霉素的临床前评价。Transplantation 52：185-191.

Kahan，B.D.，和Camardo，J.S.(2001)雷帕霉素：临床结果和将来的机会。Transplantation 72：1181-1193.

Kallen，J.A.，Sedrani，R.，和Cottens S.(1996)与FKBP12复合的28-O-甲基雷帕霉素的X射线结构：雷帕霉素的效应子结构域是环己基部分吗？Journal of the American Chemical Society 118：5857-5861.

Kawasome，H.，Papst，P.，Webb，S.，Keller，G.M.，Johnson，G.L.，Gelfand，E.W.，和Terada，N.(1998)p70^s6k的靶向性破坏明确了其在蛋白质合成和雷帕霉素敏感性中的角色。Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 95：5033-5038.

Khaw，L.E.，G.A.，Metcalfe，S.，Staunton，J.，和Leadlay，P.F.(1998)编码推定的赖氨酸环化脱氨酶的rapL被破坏导致吸水链霉菌NRRL5491菌株突变生物合成新的雷帕霉素。Journal of Bacteriology 180：809-814.

Kieser，T.，Bibb，M.J.，Buttner，M.J.，Chater，K.F.，和Hopwood，D.A.(2000)实用链霉菌遗传学，John Innes Foundation，Norwich.

Kirby，B.，和Griffiths，C.E.M.(2001)牛皮癣展望。British Journal ofDermatology 144：37-43.

Kirchner，G.I.，Winkler，M.，Mueller L.，Vidal，C.，Jacobsen，W.，Franzke，A.，Wagner，S.，Blick，S.，Manns M.P.，和Sewing K.-F.(2000)，在第一剂SDZ RAD后7名肾移植病人的SDZ RAD和环孢菌素(包括它们的代谢物)的药物动力学。British Journal of Clinical Pharmacology50：449-454.

A.，Schwecke，T.，Molnár，I.，

G.，Lowden，P.A.S.，Staunton，J.，和Leadlay，P.F.(1997)用于免疫抑制性雷帕霉素生物合成的六氢吡啶羧酸掺入酶。来自吸水链霉菌的rapP的核苷酸序列分析、破坏和异源表达。European Journal of Biochemistry 247：526-534.

Kunz，J.，Loeschmann，A.，Deuter-Reinhard，M.，和Hall，M.N.(2000)FAP1-人转录因子NF-X1的一种同源物与雷帕霉素竞争对酵母中FKBP12的结合。Molecular Microbiology 37：1480-1493.

Kuo，C.J.，Chung，J.K.，Fiorentino，D.F.，Flanagan，W.M.，Blenis，J.，和Crabtree，G.R.(1992)雷帕霉素选择性抑制p70 S6激酶对白介素-2的活化。Nature 358：70-73.

Lee，M.H.Pascopella，L.，Jacobs，W.R.，Jr和Hatfull，G.F(1991).分枝杆菌噬菌体L5的定点整合：包皮垢分支杆菌、结核杆菌和卡介苗的有效整合载体。Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：3111-3115.

Lee MH，Pascopella L，Jacobs WR Jr，Hatfull GF.(1991)，分枝杆菌噬菌体L5的定点整合：包皮垢分支杆菌，结核杆菌和卡介苗的有效整合载体。Proc Natl Acad Sci USA.；88：3111-5.

Liang，J.，Choi，J.，和Clardy，J.(1999)

分辨率下FKBP12-雷帕霉素-FRB三元络合物的精细结构。Acta Crystallographica SectionD-Biological Crystallography 55：736-744.

Lomovskaya，N.，Fonstein，L.，Ruan，X.，Stassi，D.，Katz，L.，和Hutchinson，C.R.(1997)产雷帕霉素吸水链霉菌菌株ATCC 29253中基因破坏和替代。Microbiology-Uk 143：875-883.

Lowden，P.A.S.，

G.，Staunton，J.，和Leadlay，P.F.(1996)雷帕霉素聚酮化合物合成酶的起始单元的性质。Angewandte Chemie 35：2249-2251.

Lowden，P.A.S.，(1997)博士论文，University of Cambridge.“雷帕霉素生物合成研究”.

Lowden，P.A.S.，Wilkinson，B.，

G.A.，Handa，S.，Floss，H.G.，Leadlay，P.F.，和Staunton，J.(2001)雷帕霉素聚酮化合物合成酶的起始单元的起源和真实性质。Angewandte Chemie-InternationalEdition 40：777-779.

Luengo，J.I.，Yamashita，D.S.，Dunnington，D.，Beck，A.K.，Rozamus，L.W.，Yen，H.K.，Bossard，M.J.，Levy，M.A.，Hand，A.，Newmantarr，T.，Badger，A.，Faucette，L.，Johnson，R.K.，Dalessio，K.，Porter，T.，Shu，A.Y.L.，Heys，R.，Choi，J.W.，Kongsaeree，P.，Clardy，J.，和Holt，D.A.(1995)雷帕霉素类似物的结构活性研究——C-7甲氧基基团是效应子结构域的一部分并且位于Fkbp12-Frap界面的证据。Chemistry & Biology 2：471-481.

Lyons，W.E.，George，E.B.，Dawson，T.M.，Steiner，J.P.，和Snyder，S.H.(1994)免疫抑制剂FK506促进PC12细胞和感觉神经节培养物中神经突突起。Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 91：3191-3195.

MacNeil，D.J.，Gewain，K.M.，Ruby，C.L.，Dezeny，G.，Gibbons，P.H.，和MacNeil，T.(1992)使用新整合载体分析除虫菌素生物合成所需的Streptomyces avermitilis基因。Gene 111：61-68.

Marahiel，M.A.，Stachelhaus，T.，和Mootz，H.D.(1997)参与非核糖体肽合成的模块肽合成酶。Chemical Reviews 97：2651-2673.

Matsuura，M.，Noguchi，T.，Yamaguchi，D.，Aida，T.，Asayama，M.，Takahashi，H.和Shirai，M.(1996).sre基因(ORF469)编码负责R₄噬菌体基因组整合的定点重组酶。J Bact.178(11)：3374-3376.

McAlpine，J.B，.Swanson S.J.，Jackson，M.，Whittern，D.N.(1991).雷帕霉素的经修订NMR指认。Journal of Antibiotics 44：688-690.

Meo，T.在“Immunological Methods”一书中(L.Lefkovits和B.Pernis编辑，Academic Press，N.Y.)，227-239页(1979).

Molnár，I.，Aparicio，J.F.，Haydock，S.F.，Khaw，L.E.，Schwecke，T.，

A.，Staunton，J.，和Leadlay，P.F.(1996)吸水链霉菌中雷帕霉素生物合成基因簇的组织：在聚酮化合物合成酶侧翼的基因的分析。Gene169：1-7.

Morice，M.C.，Serruys，P.W.，Sousa，J.E.，Faj adet，J.，Ban Hayashi，E.，Perin，M.，Colombo，A.，Schuler，G.，Barragan，P.，Guagliumi，G.，Molnar，F.，Falotico，R.(2002).RAVEL研究小组.患有从头天然冠状动脉损伤的患者治疗中使用西罗莫司-包衣的Bx速度气球-可膨胀斯坦特固定模的随机化研究。西罗莫司-洗脱斯坦特固定模与冠状再血管化标准斯坦特固定模的随机化比较。N.Eng.l J.Med.346(23)：1773-80.

Motamedi，H.，Shafiee，A.，Cai，S.J.，Streicher，S.L.，Arison，B.H.，和Miller，R.R.(1996)参与免疫抑制剂FK506和FK520生物合成中的甲基转移酶和羟化酶基因的表征。Journal of Bacteriology 178：5243-5248.

Motamedi，H.，Cai，S.J.，Shafiee，A.，和Elliston，K.O.(1997)与大环内酯免疫抑制剂FK506生物合成相关的多功能聚酮化合物合成酶的结构组织。European Journal of Biochemistry 244：74-80.

Motamedi，H.，和Shafiee，A.(1998)免疫抑制剂FK506的大内酯环的生物合成基因簇。European Journal of Biochemistry 256：528-534.

Myckatyn，T.M.，Ellis，R.A.，Grand，A.G.，Sen，S.K.，Lowe，J.B.3rd，Hunter，D.A.，Mackinnon，S.E.(2002).雷帕霉素在鼠末梢神经同系移植和同种异体移植中的作用。Plast.Reconstr.Surg.109(7)：2405-17.

Navé，B.T.，Ouwens，D.M.，Withers，D.J.，Alessi，D.R.，和Sheperd，P.R.(1999)雷帕霉素的哺乳动物靶标是蛋白激酶B的直接靶标：对胰岛素和氨基酸缺陷对蛋白质翻译的反作用的集中点的鉴定。Biochemical Journal 344：427-431.

Navia，M.A.(1996)对免疫调节和器官移植重要的蛋白质药物复合体。Current Opinion in Structural Biology 6：838-847.

NCCLS参考方法：对酵母进行肉汤稀释抗真菌易感性测试：批准标准M27-A、17(9).1997。

Nishida，H.，Sakakibara，T.，Aoki，F.，Saito，T.，Ichikawa，K.，Inagaki，T.，Kojima，Y.，Yamauchi，Y.，Huang，L.H.，Guadliana，M.A.，Kaneko，T.，和Kojima，N.(1995)通过微生物操作产生新的雷帕霉素结构。Journal of Antibiotics 48：657-666.

Nielsen，J.B.，Hsu，M.J.，Byrne，K.M.，和Kaplan，L.(1991)免疫抑制剂immunomycin的生物合成：六氢吡啶羧酸掺入酶学。Biochemistry 30：5789-5796.

Paget，M.S.B.，Chamberlin，L.，Atrih，A.，Foster，S.J.，和Buttner，M.J.(1999)天蓝色链霉菌A3(2)中正常细胞壁结构需要胞质外功能σ因子σ^E的证据。Journal of Bacteriology 181：204-211)

Paiva，N.L.，Demain，A.L.，和Roberts，M.F.(1991)吸水链霉菌将乙酸、丙酸和甲硫氨酸掺入雷帕霉素中。Journal of Natural Products 54：167-177.

Paiva，N.L.，Demain，A.L.，和Roberts，M.F.(1993)雷帕霉素的含氮环的直接前体是游离六氢吡啶羧酸。Enzyme and Microbial Technology15：581-585.

Patterson，C.E.，Schaub，T.，Coleman，E.J.，和Davies E.C.(2000)FKBP65

-一种位于ER的细胞外基质结合蛋白的发育调节。Molecular Biology ofthe Cell 11：3925-3935.

Pfeifer，B.A.，Admiraal，S.J.，Gramajo，H.，Cane，D.E.，和Khosla，C.(2001)大肠杆菌的代谢工程化菌株中复杂聚酮化合物的生物合成。Science 291：1790-1792.

Powell，N.，Till，S.，Bungre，J.，Corrigan，C.(2001).免疫调节药物环孢菌素A、霉酚酸吗啉乙酯和西罗莫司(雷帕霉素)抑制特应性哮喘患者的抗原诱导的增殖和PBMCs产生IL-5。J.Allergy Clin.Immunol.108(6)：915-7

Rabinovitch，A.，Suarez-Pinzon，W.L.，Shapiro，A.M.，Rajotte，R.V.，Power，R.(2002).西罗莫司和白介素-2的组合治疗防止NOD小鼠中自发性和复发性自身免疫糖尿病。Diabetes.51(3)：638-45.

Raught，B.，Gingras，A.C.，和Sonenberg，N.(2001)雷帕霉素靶标(TOR)蛋白质。Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 98：7037-7044.

Rawlings，B.J.(2001)细菌中I型聚酮化合物生物合成(A部分)。NaturalProduct Reports 18：190-227.

Reather，J.A.，(2000)，博士论文，University of Cambridge.“大环内酯生物合成中晚期步骤”.

Reitamo，S.，Spuls，P.，Sassolas，B.，Lahfa，M.，Claudy，A.，Griffiths，C.E.；Sirolimus European Psoriasis Study Group.(2001).在严重牛皮癣治疗中与亚治疗剂量环孢菌素同时施用的西罗莫司(雷帕霉素)的功效：随机对照试验。Br.J.Dermatol.145(3)：438-45.

Rosen，M.K.，和Schreiber，S.L.(1992)作为细胞功能探针的天然产物：亲免素研究。Angewandte Chemie-International Edition in English 31：384-400.

Roymans，D.，和Slegers，H.(2001)肿瘤恶化中磷脂酰肌醇3-激酶。European Journal of Biochemistry 268：487-498.

Ruan，X.A.，Stass，D.，Lax，S.A.，和Katz，L.(1997)从吸水链霉菌ATCC29253-一种产雷帕霉素菌株-分离的另一种I型PKS基因簇。Gene203：1-9.

Salituro，G.M.，Zink，D.L.，Dahl，A.，Nielsen，J.，Wu，E.，Huang，L.，Kastner C.，Dumont，F.(1995)Meridamycin：来自吸水链霉菌的一种新的非免疫抑制性FKBP12配体。Tetrahydron letters 36：997-1000.

Schwarzer，D.，和Marahiel，M.A.(2001)用于天然产物装配的多模块生物催化剂。Naturwissenschaften 88：93-101.

Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，和Maniatis，T.(1989)分子克隆：实验室指南，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，N.Y.

Schreiber，S.L.，和Crabtree，G.R.(1992)环孢菌素A和FK506的作用机理。Immunology Today 13：136-142.

Schwecke，T.，Aparicio，J.F.，Molnár，I.，A.，Khaw，L.E.，Haydock，S.F.，Oliynyk，M.，Caffrey，P.，Cortés，J.，Lester，J.B.，

G.A.，Staunton，J.，和Leadlay，P.F.(1995)聚酮化合物免疫抑制剂雷帕霉素的生物合成基因簇。Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 92：7839-7843.

Sedrani，R.，Cottens，S.，Kallen，J.，和Schuler，W.(1998)雷帕霉素的化学修饰：SDZ RAD的发现。Transplantation Proceedings 30：2192-2194.

Sehgal，S.N.，Baker，H.，和Vézina，C.(1975)雷帕霉素(AY-22，989)，一种新的抗真菌抗生素。II.发酵、分离和鉴定。The Journal of Antibiotics28：727-733.

Shepherd，P.R，Withers，D.J.，和Siddle K.(1998)磷酸肌醇3-激酶：胰岛素通信中的关键转换机理。Biochemical Journal 333：471-490.

Shima，J.，Hesketh，A.，Okamoto，S.，Kawamoto，S.，和Ochi，K.(1996)通过rpsL(编码核糖体蛋白S12)突变诱导放线菌紫素的产生，rpsL突变赋予变铅青链霉菌和天蓝色链霉菌A3(2)产生链霉素抗性。Journal ofBacteriology 178：7276-7284.

Sigal，N.H.，和Dumont，F.J.(1992)环孢菌素A、FK506和雷帕霉素：淋巴细胞信号转导的药理学探针。Annual Review of Immunology 10：519-560.

Sieuwerts，A.M.，Klij n，J.G.，Peters，H.A.，Foekens，J.A.(1995).MTT四唑盐测定法详究：怎样可靠地使用该测定法测定体外细胞培养物的代谢活性以评定生长特征、IC₅₀-值和细胞存活。Eur.J Clin.Chem.Clin.Biochem.33(11)：813-23.

Smovkina，T.，Mazodier，P.，Boccard，F.，Thompson，C.J.和Guerineau，M.(1990)用于放线菌中的一系列基于pSAM2的整合载体构建。Gene 94：53-59.

SOULILLOU，J.P.，CARPENTER，C.B.，LUNDIN，A.P.和STROM，T.B.(1975)通过大鼠中2-ME对细胞毒性细胞增殖和体外产生的放大。JImmunol.115(6)：1566-71.

Staunton，J.，和Weissman，K.J.(2001)聚酮化合物生物合成：千禧年回顾。Natural Product Reports 18：380-416.

Steiner，J.P.，Hamilton，G.S.，Ross，D.T.，Valentine，H.L.，Guo，H.，Connolly，M.A.，Liang，S.，Ramsey，C.，Li，J.-H.J.，Huang，W.，Howorth，P.，Soni，R.，Fuller，M.，Sauer，H.，Nowotnik，A.C.，和Suzdak，P.D.(1997)嗜中性亲免素配体刺激神经退行性病变动物模型中结构和功能恢复。Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 94：2019-2024.

Tang，S.J.，Reis，G.，Kang，H.，Gingras，A.-C.，Sonenberg，N.，和Schuman，E.M.(2002)雷帕霉素敏感的信号途径有助于海马中长期突触可塑性。Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 1：467-472.

Van Duyne，G.D.，Standaert，R.F.，Karplus，P.A.，Schreiber，S.L.，和Clardy，J.(1993)人亲免素FKBP-12与FK506和雷帕霉素的复合体的原子结构。Journal of Molecular Biology 229：105-124.

Van Mellaert，L.，Mei，L.，Lammertyn，E.，Schacht，S.，和Anné，J.(1998)细菌噬菌体VWB基因组向Streptomyces venezuelae中的定点整合和基于VWB的整合载体的构建。Microbiology 144：3351-3358.

Vézina，C.，Kudelski，A.，和Sehgal，S.N.(1975)雷帕霉素(AY-22，989)，一种新的抗真菌抗生素。I.生产性链霉菌的分类和活性成分的分离。The Journal of Antibiotics 28：721-726.

Vilella-Bach，M.，Nuzzi，P.，Fang，Y.M.，和Chen，J.(1999)FKBP12-雷帕霉素-结合结构域是FKBP12-雷帕霉素-相关的蛋白激酶活性和G₁期前进所需的.Journal of Biological Chemistry 274：4266-4272.

Waller，J.R.，和Nicholson，M.L.(2001)肾同种异体移植物纤维化的分子机理。British Journal of Surgery 88：1429-1441.

Warner，L.M.，Adams，L.M.，Chang，J.Y.，Sehgal，S.N.(1992).体内混合淋巴细胞反应的改良和雷帕霉素在该模型中的作用。Clin.Immunol.Immunopathol.64(3)：242-7.

Weber，T.，和Marahiel，M.A.(2001)探索模块非核糖体肽合成酶的结构域结构。Structure 9：R₃-R₉

Welch，J.T.和Seper，K.，W.，(1988)，J.Org.Chem.，53，2991-2999

Wilkinson，B.，Foster，G.，Rudd，B.A.M.，Taylor，N.L.，Blackaby，A.P.，Sidebottom，P.J.，Cooper，D.J.，Dawson，M.J.，Buss，A.D.，Gaisser，S.，

I.U.，Rowe，C.J.，Cortés，J.，Leadlay，P.F.和Staunton，J.(2000).与6-脱氧红霉内酯B相关的新八聚酮大环内酯提供了红霉素聚酮化合物合成酶的反复操作的证据。Chemistry&Biology 7：111-117.

Wong，G.K.，Griffith，S.，Kojima，I.，和Demain，A.L.(1998)雷帕霉素及其衍生物丙基雷帕霉素、32-去甲基雷帕霉素和32-去甲氧基雷帕霉素的抗真菌活性。Journal of Antibiotics 51：487-491.

Wu，K.，Chung，L.，Revill，W.P.，Katz，L.，和Reeves，C.D.(2000)吸水链霉菌子囊霉素变体(ATCC 14891)的FK520基因簇含有非同寻常的聚酮化合物延伸单元的生物合成基因。Gene 251：81-90.

Yem，A.W.，Tomasselli，A.G.，Heinrikson，R.L.，Zurcher-Neely，H.，Ruff，V.A.，Johnson，R.A.，和Deibel，M.R.(1992)类固醇受体复合体的Hsp56组分结合固定化FK506并显示出与FKBP-12和FKBP-13的同源性。Journal of Biological Chemistry 267：2868-2871.

Yu，K.，Toral-Barza，L.，Discafani，C.，Zhang，W.G.，Skotnicki，J.，Frost，P.，Gibbons，J.J.(2001)mTOR，乳腺癌中的新靶标：CCI-779，一种mTOR抑制剂在乳腺癌的临床前模型中的作用。Endocrine-RelatedCancer 8：249-258.

Zhu，J.，Wu J.，Frizell，E.，Liu，S.L.，Bashey，R.，Rubin，R.，Norton，P.，Zern，M.A.(1999).雷帕霉素抑制体外肝星形细胞增殖并在肝纤维化的体内模型中限制纤维发生。Gastroenterology.117(5)：1198-204.

序列表

<110>百奥帝卡技术有限公司

<120>聚酮化合物和其它天然产物的产生

<130>IS/CP6164412

<140>PCT/GB03/003230

<141>2003-07-16

<150>GB0216509.0

<151>2002-07-16

<150>GB0224922.5

<151>2002-10-25

<160>63

<170>PatentIn版本3.2

<210>1

<211>646

<212>DNA

<213>吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)

<400>1

gcgacccgag cagatcgttg gtgtcctgct tgcggcgttc cgcgatcagc tcggagaggt 60

agaggtagag cgactggccg gccgccatca cgacttcctg tgagtaggcg ccgttcgaga 120

gcatctggtc cgaccaggtc cggaacttgg tctggtcctc gatcggcacg cccagcagct 180

cacagatcat gatgatcggc agaggcaggg cgaagtcctc catcagatcg gcgggggcgc 240

ccttggccag cattttgtcg atcagatcgt cggcgacctc ctgggtgcgc ggacgcaggg 300

cctccatccg gcggctggtc agcgccttgg tcgccaaccg gcgcagccgg gtgtgttccg 360

gagggtccat cagcatgatg acgggctggt cctggatcgc cgggaggacc cggggcacgt 420

ccttgccgag cgtcgcgctg cggctgaacc gcgggtccac gaacaccttg gcgacgtcct 480

cccagctggt ggccagccag gtctccccgc cgtacggcat caggacccgg ccgagctcac 540

cggcgtcccg cagccggttg tactcggggt ggatctcgag tcgctccatt tcggcgaaag 600

gataagggca ggcctttccg gtctcaccct gatcggtcgt cgacat 646

<210>2

<211>646

<212>DNA

<213>吸水链霉菌

<400>2

gcgacccgag cagatcgttg gtgtcctgct tgcgacgttc cgcgatcagc tcggagaggt 60

agaggtagag cgactggccg gccgccatca cgacttcctg tgagtaggcg ccgttcgaga 120

gcatctggtc cgaccaggtc cggaacttgg tctggtcctc gatcggcacg cccagcagct 180

cacagatcat gatgatcggc agaggcaggg cgaagtcctc catcagatcg gcgggggcgc 240

ccttggccag cattttgtcg atcagatcgt cggcgacctc ctgggtgcgc ggacgcaggg 300

cctccatccg gcggctggtc agcgccttgg tcgccacccg gcgcagccgg gtgtgttccg 360

gagggtccat cagcatgatg acgggctggt cctggatcgc cgggaggacc cggggcacgt 420

ccttgccgag cgtcgcgctg cggctgaacc gcgggtccac gaacaccttg gcgacgtcct 480

cccagctggc ggccagccag gcctcccggc cgtccaacat caggacccgg ccgagctcac 540

cggcgtcccg cagccggttg tactcggggt ggatctcgag tcgctccatt tcggcgaaag 600

gataagggca ggcctttccg gtctcaccct gatcggtcgt cgacat 646

<210>3

<211>404

<212>PRT

<213>吸水链霉菌

<400>3

Met Ser Thr Thr Asp Gln Gly Glu Thr Gly Lys Ala Cys Pro Tyr Pro

1 5 10 15

Phe Ala Glu Met Glu Arg Leu Glu Ile His Pro Glu Tyr Asn Arg Leu

20 25 30

Arg Asp Ala Gly Glu Leu Gly Arg Val Leu Met Pro Tyr Gly Gly Glu

35 40 45

Thr Trp Leu Ala Thr Ser Trp Glu Asp Val Ala Lys Val Phe Val Asp

50 55 60

Pro Arg Phe Ser Arg Ser Ala Thr Leu Gly Lys Asp Val Pro Arg Val

65 70 75 80

Leu Pro Ala Ile Gln Asp Gln Pro Val Ile Met Leu Met Asp Pro Pro

85 90 95

Glu His Thr Arg Leu Arg Arg Leu Ala Thr Lys Ala Leu Thr Ser Arg

100 105 110

Arg Met Glu Ala Leu Arg Pro Arg Thr Gln Glu Val Ala Asp Asp Leu

115 120 125

Ile Asp Lys Met Leu Ala Lys Gly Ala Pro Ala Asp Leu Met Glu Asp

130 135 140

Phe Ala Leu Pro Leu Pro Ile Ile Met Ile Cys Glu Leu Leu Gly Val

145 150 155 160

Pro Ile Glu Asp Gln Thr Lys Phe Arg Thr Trp Ser Asp Gln Met Leu

165 170 175

Ser Asn Gly Ala Tyr Ser Gln Glu Val Val Met Ala Ala Gly Gln Ser

180 185 190

Leu Tyr Leu Tyr Leu Ser Glu Leu Ile Ala Glu Arg Arg Lys Gln Asp

195 200 205

Thr Asn Asp Leu Leu Gly Ser Leu Val Arg Ala Arg Asp Lys Asp Asp

210 215 220

Arg Leu Ser Glu Thr Glu Leu Val Gly Phe Ala Val Thr Leu Leu Ile

225 230 235 240

Ala Gly Tyr Glu Thr Thr Ala Asn Ala Ile Gly Asn Ser Val Tyr Thr

245 250 255

Leu Leu Thr His Pro Glu Lys Leu Ala Glu Leu Arg Lys Asp Leu Ser

260 265 270

Leu Ile Pro Lys Ala Val Asp Glu Leu Leu Arg Ile Ile Pro Ile Ala

275 280 285

Lys Gln Ala Ser Trp Val Arg Met Ala Val Glu Asp Val Glu Leu Ser

290 295 300

Gly Thr Ile Val Lys Ala Gly Glu Ala Val Ala Ile Gln Thr His Ser

305 310 315 320

Ala Asn Thr Asp Pro Lys Val Tyr Asp His Pro Glu Glu Ile Asp Phe

325 330 335

His Arg Thr Ser Asn Pro His Met Ser Leu Gly His Gly Ala His His

340 345 350

Cys Met Gly Ala Gln Leu Val Arg Val Glu Met Gln Thr Ala Leu Gly

355 360 365

Ser Leu Ile Ser Arg Ile Pro Ala Leu Arg Phe Ala Val Pro Glu Pro

370 375 380

Arg Ile Lys Phe Leu Arg Gly Arg Leu Val Pro Ser Leu Glu Ala Leu

385 390 395 400

Pro Leu Thr Trp

<210>4

<211>404

<212>PRT

<213>吸水链霉菌

<400>4

Met Ser Thr Thr Asp Gln Gly Glu Thr Gly Lys Ala Cys Pro Tyr Pro

1 5 10 15

Phe Ala Glu Met Glu Arg Leu Glu Ile His Pro Glu Tyr Asn Arg Leu

20 25 30

Arg Asp Ala Gly Glu Leu Gly Arg Val Leu Met Leu Asp Gly Arg Glu

35 40 45

Ala Trp Leu Ala Ala Ser Trp Glu Asp Val Ala Lys Val Phe Val Asp

50 55 60

Pro Arg Phe Ser Arg Ser Ala Thr Leu Gly Lys Asp Val Pro Arg Val

65 70 75 80

Leu Pro Ala Ile Gln Asp Gln Pro Val Ile Met Leu Met Asp Pro Pro

85 90 95

Glu His Thr Arg Leu Arg Arg Val Ala Thr Lys Ala Leu Thr Ser Arg

100 105 110

Arg Met Glu Ala Leu Arg Pro Arg Thr Gln Glu Val Ala Asp Asp Leu

115 120 125

Ile Asp Lys Met Leu Ala Lys Gly Ala Pro Ala Asp Leu Met Glu Asp

130 135 140

Phe Ala Leu Pro Leu Pro Ile Ile Met Ile Cys Glu Leu Leu Gly Val

145 150 155 160

Pro Ile Glu Asp Gln Thr Lys Phe Arg Thr Trp Ser Asp Gln Met Leu

165 170 175

Ser Asn Gly Ala Tyr Ser Gln Glu Val Val Met Ala Ala Gly Gln Ser

180 185 190

Leu Tyr Leu Tyr Leu Ser Glu Leu Ile Ala Glu Arg Arg Lys Gln Asp

195 200 205

Thr Asn Asp Leu Leu Gly Ser Leu Val Arg Ala Arg Asp Lys Asp Asp

210 215 220

Arg Leu Ser Glu Thr Glu Leu Val Gly Phe Ala Val Thr Leu Leu Ile

225 230 235 240

Ala Gly Tyr Glu Thr Thr Ala Asn Ala Ile Gly Asn Ser Val Tyr Thr

245 250 255

Leu Leu Thr His Pro Glu Lys Leu Ala Glu Leu Arg Lys Asp Leu Ser

260 265 270

Leu Ile Pro Lys Ala Val Asp Glu Leu Leu Arg Ile Ile Pro Ile Ala

275 280 285

Lys Gln Ala Ser Trp Val Arg Met Ala Val Glu Asp Val Glu Leu Ser

290 295 300

Gly Thr Ile Val Lys Ala Gly Glu Ala Val Ala Ile Gln Thr His Ser

305 310 315 320

Ala Asn Thr Asp Pro Lys Val Tyr Asp His Pro Glu Glu Ile Asp Phe

325 330 335

His Arg Thr Ser Asn Pro His Met Ser Leu Gly His Gly Ala His His

340 345 350

Cys Met Gly Ala Gln Leu Val Arg Val Glu Met Gln Thr Ala Leu Gly

355 360 365

Ser Leu Ile Ser Arg Ile Pro Ala Leu Arg Phe Ala Val Pro Glu Pro

370 375 380

Arg Ile Lys Phe Leu Arg Gly Arg Leu Val Pro Ser Leu Glu Ala Leu

385 390 395 400

Pro Leu Thr Trp

<210>5

<211>758

<212>DNA

<213>吸水链霉菌

<400>5

cggaggtgac tgtccggggc catccgccgg cgcaccgcgg cacggacttg atcggagatg 60

tcgtgatcgc tgacccactt cagttcgggt atttccgttg tgatccgacg catcgcctca 120

aggcgctgcc gcgtgaacac gtcgatgtgc gaaagggcgc cacccgggcg cagcacgcgc 180

gcggcctccc gcaggaaacg tcccagattg gggtaggtgt gcgagctctc gatgttgacg 240

agcacatcca ccgaggagtc ctcgaagggc agttcctcgg cgtcgccctg gacgaaccgc 300

agggtatcgc cgcgggacag cgtggcggtg gcgctggcga tcgccttcgg cgccaggtcc 360

agcccggtca tccgggcggt ggggacgagg cgggacagga agttgagccc ctcccccatt 420

ccgcagccga cctccaggac cgtccggccg tcgcagctct ccaagccctt cggaaggtcg 480

cgcagggcca ggtagtagag ctgctcgctg aatccgtcgg tgccgtactc ggtgaatccg 540

ggcagcctgg cctcgatctc ggcgacgaac tcggaatcgt gcacacccca gttccacagc 600

tggccctttg ccgacatgct ggcggcgagg tcgtagatgg aggagctggc ggacttgaag 660

gtggcggcct tcgtctccgc ctgcggggtg ccggattcgt cgagattgat gtcggcgaca 720

ccgctggtga aggcggtcac gacgtcgggt tggatcat 758

<210>6

<211>755

<212>DNA

<213>吸水链霉菌

<400>6

cggaggtgac tgtccggggg catccgccgg cgcaccgcgg cacggacttg atcggagatg 60

tcgtgatcgc tgacccactt cagttcgggt atttccgttg tgatccgacg catcgcctca 120

aggcgctgcc gcgtgaacac gtcgatgtgc gaaagggcgc caccccggcg cagcgcgcgc 180

gcggcctccc gcaggaaacg tcccagattg gggtaggtgt gcgagctctc gatgttgacg 240

agcacatcca ccgaggagtc ctcgaagggc agttcctcgg cgtcgccctg gacgaaccgc 300

agggtatcgc cgcgggacag cgtggcggtg gcgctggcga tcgccttcgg cgccaggtcc 360

agcccggtca tccgggcggt ggggacgagg cgggacagga agttgagccc ctcccccatt 420

ccgcagccga cctccaggac cgtccggccg tcgcagctct ccaagccctt cggaaggtcg 480

cgcagggcca ggtagtagag ctgctcgctg aatccgtcgg tgccgtactc ggtgaatccg 540

ggcagcctgg cctcgatctc ggcgacgaac tcggaatcgt gcacacccca gttccacagc 600

tggccctttg ccgacatgct ggcggcgagg tcgtagatgg aggagctggc ggacttgaag 660

gtggcggcct tcgtctccgc ctgcggggtg ccgggttcgt cgagattgat gtcgcgaacc 720

gctgtgaagg cggtcacgac gtcgggttgg atcat 755

<210>7

<211>318

<212>PRT

<213>吸水链霉菌

<400>7

Met Ile Gln Pro Asp Val Val Thr Ala Phe Thr Ser Gly Val Ala Asp

1 5 10 15

Ile Asn Leu Asp Glu Ser Gly Thr Pro Gln Ala Glu Thr Lys Ala Ala

20 25 30

Thr Phe Lys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Tyr Asp Leu Ala Ala Ser Met

35 40 45

Ser Ala Lys Gly Gln Leu Trp Asn Trp Gly Val His Asp Ser Glu Phe

50 55 60

Val Ala Glu Ile Glu Ala Arg Leu Pro Gly Phe Thr Glu Tyr Gly Thr

65 70 75 80

Asp Gly Phe Ser Glu Gln Leu Tyr Tyr Leu Ala Leu Arg Asp Leu Pro

85 90 95

Lys Gly Leu Glu Ser Cys Asp Gly Arg Thr Val Leu Glu Val Gly Cys

100 105 110

Gly Met Gly Glu Gly Leu Asn Phe Leu Ser Arg Leu Val Pro Thr Ala

115 120 125

Arg Met Thr Gly Leu Asp Leu Ala Pro Lys Ala Ile Ala Ser Ala Thr

130 135 140

Ala Thr Leu Ser Arg Gly Asp Thr Leu Arg Phe Val Gln Gly Asp Ala

145 150 155 160

Glu Glu Leu Pro Phe Glu Asp Ser Ser Val Asp Val Leu Val Asn Ile

165 170 175

Glu Ser Ser His Thr Tyr Pro Asn Leu Gly Arg Phe Leu Arg Glu Ala

180 185 190

Ala Arg Val Leu Arg Pro Gly Gly Ala Leu Ser His Ile Asp Val Phe

195 200 205

Thr Arg Gln Arg Leu Glu Ala Met Arg Arg Ile Thr Thr Glu Ile Pro

210 215 220

Glu Leu Lys Trp Val Ser Asp His Asp Ile Ser Asp Gln Val Arg Ala

225 230 235 240

Ala Val Arg Arg Arg Met Ala Pro Asp Ser His Leu Arg Ser Thr Leu

245 250 255

Asn Lys Gln Arg Met Asn Arg Leu Ala Arg Thr Leu Ala Leu His Ser

260 265 270

Gln Ile Thr Val Phe Gly Gly Thr Phe Ala Asp Tyr Gln Pro Pro Ala

275 280 285

Ser Val Lys Met Leu Ser Arg Leu Gly Leu Val Pro Pro Met Asp Ser

290 295 300

Leu Pro Met Glu Thr Tyr Arg His Gln Ile Ala Val Arg Val

305 310 315

<210>8

<211>317

<212>PRT

<213>吸水链霉菌

<400>8

Met Ile Gln Pro Asp Val Val Thr Ala Phe Thr Ala Val Arg Asp Ile

1 5 10 15

Asn Leu Asp Glu Pro Gly Thr Pro Gln Ala Glu Thr Lys Ala Ala Thr

20 25 30

Phe Lys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Tyr Asp Leu Ala Ala Ser Met Ser

35 40 45

Ala Lys Gly Gln Leu Trp Asn Trp Gly Val His Asp Ser Glu Phe Val

50 55 60

Ala Glu Ile Glu Ala Arg Leu Pro Gly Phe Thr Glu Tyr Gly Thr Asp

65 70 75 80

Gly Phe Ser Glu Gln Leu Tyr Tyr Leu Ala Leu Arg Asp Leu Pro Lys

85 90 95

Gly Leu Glu Ser Cys Asp Gly Arg Thr Val Leu Glu Val Gly Cys Gly

100 105 110

Met Gly Glu Gly Leu Asn Phe Leu Ser Arg Leu Val Pro Thr Ala Arg

115 120 125

Met Thr Gly Leu Asp Leu Ala Pro Lys Ala Ile Ala Ser Ala Thr Ala

130 135 140

Thr Leu Ser Arg Gly Asp Thr Leu Arg Phe Val Gln Gly Asp Ala Glu

145 150 155 160

Glu Leu Pro Phe Glu Asp Ser Ser Val Asp Val Leu Val Asn Ile Glu

165 170 175

Ser Ser His Thr Tyr Pro Asn Leu Gly Arg Phe Leu Arg Glu Ala Ala

180 185 190

Arg Ala Leu Arg Arg Gly Gly Ala Leu Ser His Ile Asp Val Phe Thr

195 200 205

Arg Gln Arg Leu Glu Ala Met Arg Arg Ile Thr Thr Glu Ile Pro Glu

210 215 220

Leu Lys Trp Val Ser Asp His Asp Ile Ser Asp Gln Val Arg Ala Ala

225 230 235 240

Val Arg Arg Arg Met Pro Pro Asp Ser His Leu Arg Ser Thr Leu Asn

245 250 255

Lys Gln Arg Met Asn Arg Leu Ala Arg Thr Leu Ala Leu His Ser Gln

260 265 270

Ile Thr Val Phe Gly Gly Thr Phe Ala Asp Tyr Gln Pro Pro Ala Ser

275 280 285

Val Lys Met Leu Ser Arg Leu Gly Leu Val Pro Pro Met Asp Ser Leu

290 295 300

Pro Met Glu Thr Tyr Arg His Gln Ile Ala Val Arg Val

305 310 315

<210>9

<211>300

<212>DNA

<213>吸水链霉菌

<400>9

gatcagggcg agggtggtgc tccccggccg ggcgagcagc cgggtggcga cggccgcgac 60

cgcgccggtc cgcatggcgg tgatggtggc cgcgtcggcg agcgcgacca tgcttccgct 120

gtcgtcgtcg agccgcgaca cggtcccgac gatggtgggc aggttgaagc gctcgaagtt 180

ctgcggactg tagctgaccg tcttcatcgt cacaccgatg cccgacgcgc ggtgcggcat 240

gaactcgatg acgcccggaa cgtcgccgcc gcgggcaaag ccggtacgcg gtggcggctc 300

<210>10

<211>300

<212>DNA

<213>吸水链霉菌

<400>10

gatcagggcg agggtggtgc tccccggccg ggcgagcagc cgggtggtga cggacgcgac 60

cgcgccggtc cgcatcgcgg tgatggtggc cgcgtcggcg agcgcgacca tgcttccgct 120

gtcgtcgccg agccgcgaca cggtccccac gatggtgggc aggttgaagc gctcgaagtt 180

ctccggactg tagctgaccg tcttcatcga gcacccgatg cccgacgcgc ggtgcggcat 240

gaactcgatg acgcccggaa cgtcgccgcc gcgggcaaag ccgggacgcg gtggcggctc 300

<210>11

<211>343

<212>PRT

<213>吸水链霉菌

<400>11

Met Gln Thr Lys Val Leu Cys Gln Arg Asp Ile Lys Arg Ile Leu Ser

1 5 10 15

Val Val Gly Arg Asp Val Met Met Asp Arg Leu Ile Ser Glu Val His

20 25 30

Ala Gly Phe Ala Arg Leu Gly Arg Gly Glu Thr Asp Glu Pro Pro Pro

35 40 45

Arg Thr Gly Phe Ala Arg Gly Gly Asp Val Pro Gly Val Ile Glu Phe

50 55 60

Met Pro His Arg Ala Ser Gly Ile Gly Val Thr Met Lys Thr Val Ser

65 70 75 80

Tyr Ser Pro Gln Asn Phe Glu Arg Phe Asn Leu Pro Thr Ile Val Gly

85 90 95

Thr Val Ser Arg Leu Asp Asp Asp Ser Gly Ser Met Val Ala Leu Ala

100 105 110

Asp Ala Ala Thr Ile Thr Ala Met Arg Thr Gly Ala Val Ala Ala Val

115 120 125

Ala Thr Arg Leu Leu Ala Arg Pro Gly Ser Thr Thr Leu Ala Leu Ile

130 135 140

Gly Ala Gly Ala Gln Ala Val Thr Gln Ala His Ala Leu Ser Arg Val

145 150 155 160

Leu Pro Leu Glu Arg Ile Leu Ile Ser Asp Ile Lys Ala Glu His Ala

165 170 175

Glu Ser Phe Ala Gly Arg Val Ala Phe Leu Glu Leu Pro Val Glu Val

180 185 190

Thr Asp Ala Ala Thr Ala Met Ala Thr Ala Asp Val Leu Cys Thr Val

195 200 205

Thr Ser Val Pro Val Gly Gly Gly Pro Val Val Pro Ala Glu Pro Arg

210 215 220

Gln Ala His Leu His Val Asn Gly Ile Gly Ala Asp Glu Gln Gly Lys

225 230 235 240

Thr Glu Leu Pro Lys Ala Leu Leu Asp Asp Ala Phe Ile Cys Val Asp

245 250 255

His Pro Gly Gln Ala Arg Ala Glu Gly Glu Phe Gln Gln Leu Pro Asp

260 265 270

Arg Glu Leu Gly Pro Ser Leu Ala Asp Leu Cys Ala Ala Pro Glu IIe

275 280 285

Ala Ala Pro His Pro Glu Arg Leu Ser Val Phe Asp Ser Thr Gly Ser

290 295 300

Ala Phe Ala Asp His Ile Ala Leu Asp Val Leu Leu Gly Phe Ala Asp

305 310 315 320

Glu Leu Gly Leu Gly His Lys Met Ser Ile Glu Ser Thr Pro Glu Asp

325 330 335

Val Leu Asp Pro Tyr Ser Leu

340

<210>12

<211>343

<212>PRT

<213>吸水链霉菌

<400>12

Met Gln Thr Lys Val Leu Cys Gln Arg Asp Ile Lys Arg Ile Leu Ser

1 5 10 15

Val Val Gly Arg Asp Val Met Met Asp Arg Leu Ile Ser Glu Val His

20 25 30

Ala Gly Phe Ala Arg Leu Gly Arg Gly Glu Thr Asp Glu Pro Pro Pro

35 40 45

Arg Pro Gly Phe Ala Arg Gly Gly Asp Val Pro Gly Val Ile Glu Phe

50 55 60

Met Pro His Arg Ala Ser Gly Ile Gly Cys Ser Met Lys Thr Val Ser

65 70 75 80

Tyr Ser Pro Glu Asn Phe Glu Arg Phe Asn Leu Pro Thr Ile Val Gly

85 90 95

Thr Val Ser Arg Leu Gly Asp Asp Ser Gly Ser Met Val Ala Leu Ala

100 105 110

Asp Ala Ala Thr Ile Thr Ala Met Arg Thr Gly Ala Val Ala Ser Val

115 120 125

Thr Thr Arg Leu Leu Ala Arg Pro Gly Ser Thr Thr Leu Ala Leu Ile

130 135 140

Gly Ala Gly Ala Gln Ala Val Thr Gln Ala His Ala Leu Ser Arg Val

145 150 155 160

Leu Pro Leu Glu Arg Ile Leu Ile Ser Asp Ile Lys Ala Glu His Ala

165 170 175

Glu Ser Phe Ala Gly Arg Val Ala Phe Leu Glu Leu Pro Val Glu Val

180 185 190

Thr Asp Ala Ala Thr Ala Met Ala Thr Ala Asp Val Leu Cys Thr Val

195 200 205

Thr Ser Val Pro Val Gly Gly Gly Pro Val Val Pro Ala Glu Pro Arg

210 215 220

Gln Ala His Leu His Val Asn Gly Ile Gly Ala Asp Glu Gln Gly Lys

225 230 235 240

Thr Glu Leu Pro Lys Ala Leu Leu Asp Asp Ala Phe Ile Cys Val Asp

245 250 255

His Pro Gly Gln Ala Arg Ala Glu Gly Glu Phe Gln Gln Leu Pro Asp

260 265 270

Arg Glu Leu Gly Pro Ser Leu Ala Asp Leu Cys Ala Ala Pro Glu Ile

275 280 285

Ala Ala Pro His Pro Glu Arg Leu Ser Val Phe Asp Ser Thr Gly Ser

290 295 300

Ala Phe Ala Asp His Ile Ala Leu Asp Val Leu Leu Gly Phe Ala Asp

305 310 315 320

Glu Leu Gly Leu Gly His Lys Met Ser Ile Glu Ser Thr Pro Glu Asp

325 330 335

Val Leu Asp Pro Tyr Ser Leu

340

<210>13

<211>550

<212>DNA

<213>吸水链霉菌

<400>13

gcacgcggag gggccgaagg agtcgggcag ccatgatggc gtcgcctggg ctcggacacc 60

tgactacctc ttcggtgtcg cgcgggtgcc cgagggcggc cggtacgcgg ccggcaccgc 120

ggccgtctac accggaatct tcgacctgat cgggacgctg gggtacccca gtctggcccg 180

cacctggaac tacgtcagcg gaatcaacac gccgaacgcc gatggcctcg aggtctaccg 240

ggacttctgt gtgggccgcg ccgaggcgct ggacgcccgt gggatcgacc cggcgaccat 300

gccggcggcg accggcatcg gcgcccacgg cggcggcatc acgtgctact tcatcgccgc 360

acgcgccggt gaccgggtca acatggagaa cccggccgtg ctcacggctc accgctaccc 420

gcagcggtac ggcccccgcc cgccggtctt ctcccgggcc acctggctct cgccgccggg 480

ggcggacgac ggccggctct tcgtctccgc gaccgccggc atcgtcggtc acgagacggt 540

gcaccacggc 550

<210>14

<211>541

<212>DNA

<213>吸水链霉菌

<400>14

gcacgcggag gggccgaagg agtcgtcgag gcatgatggc gtcgcctggg ctcggacacc 60

tgactacctc ttcggtgtcg cgcgggtgcc cgagggcggc cggtacgcgg ccggcaccgc 120

ggccgtctac accggaatct tcgacctgat cgggacgctg gggtacccca gtctggcccg 180

cacctggaac tacgtcagcg gaatcaacac gccgaacgcc gatggcctcg aggtctaccg 240

ggacttctgt gtgggccgcg ccgaggcgct ggacgcccgt gggatcgacc cggcgaccat 300

gccggcggcg accggcatcg gcgcccacgg cgcgcgcatc acgtgctact tcatcgccgc 360

acgcgccggt gaccgggtca acatggagaa cccggccgtg ctcacggctc accgctaccc 420

gcagcggtac ggcccccgcc cgccggtctt ctccggccac ctggctctcg ccgccggggg 480

cggacggctc ttcgtctccg cgaccgccgg catcgtcggt caggagacgg tgcaccacgg 540

c 541

<210>15

<211>337

<212>PRT

<213>吸水链霉菌

<400>15

Val Arg Gln Leu Thr Pro Pro Val Thr Ala Pro Tyr Cys Arg Phe Glu

1 5 10 15

Lys Leu Gly Ala Ser Asp Leu Asp Gly Asp Glu Thr Leu Leu Gly Val

20 25 30

Ile Glu His Arg Thr Gly His Thr Gly Val Ser Leu Ala Glu Gly Cys

35 40 45

Pro Arg Thr Ala Val His Thr Thr Thr Arg Glu Asp Glu Ser Phe Ala

50 55 60

Glu Ala Trp His Ala Glu Gly Pro Lys Glu Ser Gly Ser His Asp Gly

65 70 75 80

Val Ala Trp Ala Arg Thr Pro Asp Tyr Leu Phe Gly Val Ala Arg Val

85 90 95

Pro Glu Gly Gly Arg Tyr Ala Ala Gly Thr Ala Ala Val Tyr Thr Gly

100 105 110

Ile Phe Asp Leu Ile Gly Thr Leu Gly Tyr Pro Ser Leu Ala Arg Thr

115 120 125

Trp Asn Tyr Val Ser Gly Ile Asn Thr Pro Asn Ala Asp Gly Leu Glu

130 135 140

Val Tyr Arg Asp Phe Cys Val Gly Arg Ala Glu Ala Leu Asp Ala Arg

145 150 155 160

Gly Ile Asp Pro Ala Thr Met Pro Ala Ala Thr Gly Ile Gly Ala His

165 170 175

Gly Gly Gly Ile Thr Cys Tyr Phe Ile Ala Ala Arg Ala Gly Asp Arg

180 185 190

Val Asn Met Glu Asn Pro Ala Val Leu Thr Ala His Arg Tyr Pro Gln

195 200 205

Arg Tyr Gly Pro Arg Pro Pro Val Phe Ser Arg Ala Thr Trp Leu Ser

210 215 220

Pro Pro Gly Ala Asp Asp Gly Arg Leu Phe Val Ser Ala Thr Ala Gly

225 230 235 240

Ile Val Gly His Glu Thr Val His His Gly Asp Val Ala Ala Gln Cys

245 250 255

Glu Val Ser Leu Glu Asn Ile Ala Arg Val Ile Gly Ala Glu Asn Leu

260 265 270

Gly Arg His Gly Leu Arg Arg Gly Tyr Ala Leu Ala Asp Val Asp His

275 280 285

Leu Lys Val Tyr Val Arg His Arg Glu Asp Ile Ser Thr Val Arg Arg

290 295 300

Ile Cys Ala Glu Arg Leu Ser Arg Glu Ala Thr Val Ala Val Leu His

305 310 315 320

Thr Asp Ile Ala Arg Thr Asp Leu Leu Val Glu Ile Glu Gly Val Val

325 330 335

Ala

<210>16

<211>334

<212>PRT

<213>吸水链霉菌

<400>16

Val Arg Gln Leu Thr Pro Pro Val Thr Ala Pro Tyr Cys Arg Phe Glu

1 5 10 15

Lys Leu Gly Ala Ser Asp Leu Asp Gly Asp Glu Thr Leu Leu Gly Val

20 25 30

Ile Glu His Arg Thr Gly His Thr Gly Val Ser Leu Ala Glu Gly Cys

35 40 45

Pro Arg Thr Ala Val His Thr Thr Thr Arg Glu Asp Glu Ser Phe Ala

50 55 60

Glu Ala Trp His Ala Glu Gly Pro Lys Glu Ser Ser Arg His Asp Gly

65 70 75 80

Val Ala Trp Ala Arg Thr Pro Asp Tyr Leu Phe Gly Val Ala Arg Val

85 90 95

Pro Glu Gly Gly Arg Tyr Ala Ala Gly Thr Ala Ala Val Tyr Thr Gly

100 105 110

Ile Phe Asp Leu Ile Gly Thr Leu Gly Tyr Pro Ser Leu Ala Arg Thr

115 120 125

Trp Asn Tyr Val Ser Gly Ile Asn Thr Pro Asn Ala Asp Gly Leu Glu

130 135 140

Val Tyr Arg Asp Phe Cys Val Gly Arg Ala Glu Ala Leu Asp Ala Arg

145 150 155 160

Gly Ile Asp Pro Ala Thr Met Pro Ala Ala Thr Gly Ile Gly Ala His

165 170 175

Gly Ala Arg Ile Thr Cys Tyr Phe Ile Ala Ala Arg Ala Gly Asp Arg

180 185 190

Val Asn Met Glu Asn Pro Ala Val Leu Thr Ala His Arg Tyr Pro Gln

195 200 205

Arg Tyr Gly Pro Arg Pro Pro Val Phe Ser Gly His Leu Ala Leu Ala

210 215 220

Ala Gly Gly Gly Arg Leu Phe Val Ser Ala Thr Ala Gly Ile Val Gly

225 230 235 240

Gln Glu Thr Val His His Gly Asp Val Ala Ala Gln Cys Glu Val Ser

245 250 255

Leu Glu Asn Ile Ala Arg Val Ile Gly Ala Glu Asn Leu Gly Arg His

260 265 270

Gly Leu Arg Arg Gly Tyr Ala Leu Ala Asp Val Asp His Leu Lys Val

275 280 285

Tyr Val Arg His Arg Glu Asp Ile Ser Thr Val Arg Arg Ile Cys Ala

290 295 300

Glu Arg Leu Ser Arg Glu Ala Thr Val Ala Val Leu His Thr Asp Ile

305 310 315 320

Ala Arg Thr Asp Leu Leu Val Glu Ile Glu Gly Val Val Ala

325 330

<210>17

<211>767

<212>DNA

<213>吸水链霉菌

<400>17

agcgcctggc gtccctggcc atccacgacc tctacggcct gaatgaggag gaggggcccg 60

tactcgaggg ccagatgcgg gccatggagg gcggcaccga catggagagc atcaagaggc 120

tgaccgacga attcttcggt cacgtcctgg cgctggtgcg tgccaagcgg gagcaggcgg 180

gcgacaggct tctgcaccgg ctggccgagt ccggcgagga cgagatcctg ctcagcgacg 240

aggaggcgac cggggtgttc gccactctgc tgttcgccgg gcacgactcg atgcagcaga 300

tggtcggcta ctgtctgtac gcgctgctct cccatcccga gcagcgggcg gcgctgcggg 360

agaacccgga cctgatcgac ggcgcggtcg aggagctgct gcgcttcctg ccgctcaacc 420

agctcggcgt gccgcgggtc tgtgtcgagg acgtcgagct gcacggccag accatcagcg 480

ccggcgacaa cgtgatcccg ctctactcga cggccaaccg cgaccccggc gtcttcgccg 540

accccgacac gttcgacatc acgcgtaagc ccgaacacaa cttcgctttc gggtacggca 600

tccacaagtg cccggggcag cacctcgccc gcgtgttgat caaggtcgcc acgctgcgcc 660

tgttcgagcg cttcccggat gtgcgactgg cgggcgacgt gccgatgaac gagggtctgg 720

gcctgttcag cccggccgag ctccgggtca cctggggagc ggagtga 767

<210>18

<211>761

<212>DNA

<213>吸水链霉菌

<400>18

agcgcctggc gtccctggcc atccacgacc tctacggcct gaatgaggag gggcccgtac 60

tcgagggcca gatgcgggcc atggagggcg gcaccgacat ggagagcatc aagaggctga 120

ccgacgaatt cggtcacgtc ctggcgctgg tgcgtgccaa gcgggacgag gcgggcgaca 180

ggcttctgca ccggctggcc gagtccggcg aggacgagat cctgctcagc gacgaggagg 240

cgaccggggt gttcgccact ctgctgttcg ccgggcacga ctcgatgcag cagatggtcg 300

gctacagtct gtacgcgctg ctctcccatc ccgagcagcg ggcggcgctg cgggagaacc 360

cggacctgat cgacggcgcg gtcgaggagc tgctgcgctt cctgccgctc aaccagctcg 420

gcgtgccgcg ggtctgtgtc gaggacgtcg agctgcacgg ccagaccatc agcgccggcg 480

acaacgtgat cccgctctac tcgacggcca accgcgaccc cggcgtcttc gccgaccccg 540

acacgttcga catcacgcgt aagcccgaac acaacttcgc tttcgggtac ggcatccacg 600

gctgcccggg gcagcacctc gcccgcgtgt tgatcaaggt cgccaccgtg cgcctgttcg 660

agcgcttccc ggatgtgcga ctggcgggcg acgtgccgat gaacgagggt ctgggcctgt 720

tcagcccggc cgagctccgg gtcacctggg gagcggagtg a 761

<210>19

<211>388

<212>PRT

<213>吸水链霉菌

<400>19

Met Ser Thr Glu Ala Gln Gln Glu Ser Thr Pro Thr Ala Arg Cys Pro

1 5 10 15

Phe Ser Ile Gln Asp Gly His Arg Thr Ile Leu Glu Thr Gly Thr Val

20 25 30

Gly Ala His Glu Leu Phe Gly Val Lys Gln Trp Leu Val Ala Ala Ala

35 40 45

Glu Asp Val Lys Leu Val Thr Asn Asp Pro Arg Phe Ser Ser Ala Ala

50 55 60

Pro Ser Gly Ile Leu Gly Asp Arg Arg Pro Gly Trp Phe Ser Gly Met

65 70 75 80

Asp Ser Pro Glu His Asn Arg Tyr Arg Gln Lys Ile Ala Arg Asp Phe

85 90 95

Thr Leu Arg Ala Ala Arg Lys Gln Glu Glu Phe Ile Val Arg Ala Ala

100 105 110

Asp Ser Cys Leu Asp Asp Ile Glu Ala Ser Gly Pro Gly Thr Asp Leu

115 120 125

Val Pro Gly Tyr Ala Lys Arg Leu Ala Ser Leu Ala Ile His Asp Leu

130 135 140

Tyr Gly Leu Asn Glu Glu Glu Gly Pro Val Leu Glu Gly Gln Met Arg

145 150 155 160

Ala Met Glu Gly Gly Thr Asp Met Glu Ser Ile Lys Arg Leu Thr Asp

165 170 175

Glu Phe Phe Gly His Val Leu Ala Leu Val Arg Ala Lys Arg Glu Gln

180 185 190

Ala Gly Asp Arg Leu Leu His Arg Leu Ala Glu Ser Gly Glu Asp Glu

195 200 205

Ile Leu Leu Ser Asp Glu Glu Ala Thr Gly Val Phe Ala Thr Leu Leu

210 215 220

Phe Ala Gly His Asp Ser Met Gln Gln Met Val Gly Tyr Cys Leu Tyr

225 230 235 240

Ala Leu Leu Ser His Pro Glu Gln Arg Ala Ala Leu Arg Glu Asn Pro

245 250 255

Asp Leu Ile Asp Gly Ala Val Glu Glu Leu Leu Arg Phe Leu Pro Leu

260 265 270

Asn Gln Leu Gly Val Pro Arg Val Cys Val Glu Asp Val Glu Leu His

275 280 285

Gly Gln Thr Ile Ser Ala Gly Asp Asn Val Ile Pro Leu Tyr Ser Thr

290 295 300

Ala Asn Arg Asp Pro Gly Val Phe Ala Asp Pro Asp Thr Phe Asp Ile

305 310 315 320

Thr Arg Lys Pro Glu His Asn Phe Ala Phe Gly Tyr Gly Ile His Lys

325 330 335

Cys Pro Gly Gln His Leu Ala Arg Val Leu Ile Lys Val Ala Thr Leu

340 345 350

Arg Leu Phe Glu Arg Phe Pro Asp Val Arg Leu Ala Gly Asp Val Pro

355 360 365

Met Asn Glu Gly Leu Gly Leu Phe Ser Pro Ala Glu Leu Arg Val Thr

370 375 380

Trp Gly Ala Glu

385

<210>20

<211>386

<212>PRT

<213>吸水链霉菌

<400>20

Met Ser Thr Glu Ala Gln Gln Glu Ser Thr Pro Thr Ala Arg Cys Pro

1 5 10 15

Phe Ser Ile Gln Asp Gly His Arg Thr Ile Leu Glu Thr Gly Thr Val

20 25 30

Gly Ala His Glu Leu Phe Gly Val Lys Gln Trp Leu Val Ala Ala Ala

35 40 45

Glu Asp Val Lys Leu Val Thr Asn Asp Pro Arg Phe Ser Ser Ala Ala

50 55 60

Pro Ser Gly Ile Leu Gly Asp Arg Arg Pro Gly Trp Phe Ser Gly Met

65 70 75 80

Asp Ser Pro Glu His Asn Arg Tyr Arg Gln Lys Ile Ala Arg Asp Phe

85 90 95

Thr Leu Arg Ala Ala Arg Lys Gln Glu Glu Phe Ile Val Arg Ala Ala

100 105 110

Asp Ser Cys Leu Asp Asp Ile Glu Ala Ser Gly Pro Gly Thr Asp Leu

115 120 125

Val Pro Gly Tyr Ala Lys Arg Leu Ala Ser Leu Ala Ile His Asp Leu

130 135 140

Tyr Gly Leu Asn Glu Glu Gly Pro Val Leu Glu Gly Gln Met Arg Ala

145 150 155 160

Met Glu Gly Gly Thr Asp Met Glu Ser Ile Lys Arg Leu Thr Asp Glu

165 170 175

Phe Gly His Val Leu Ala Leu Val Arg Ala Lys Arg Asp Glu Ala Gly

180 185 190

Asp Arg Leu Leu His Arg Leu Ala Glu Ser Gly Glu Asp Glu Ile Leu

195 200 205

Leu Ser Asp Glu Glu Ala Thr Gly Val Phe Ala Thr Leu Leu Phe Ala

210 215 220

Gly His Asp Ser Met Gln Gln Met Val Gly Tyr Ser Leu Tyr Ala Leu

225 230 235 240

Leu Ser His Pro Glu Gln Arg Ala Ala Leu Arg Glu Asn Pro Asp Leu

245 250 255

Ile Asp Gly Ala Val Glu Glu Leu Leu Arg Phe Leu Pro Leu Asn Gln

260 265 270

Leu Gly Val Pro Arg Val Cys Val Glu Asp Val Glu Leu His Gly Gln

275 280 285

Thr Ile Ser Ala Gly Asp Asn Val Ile Pro Leu Tyr Ser Thr Ala Asn

290 295 300

Arg Asp Pro Gly Val Phe Ala Asp Pro Asp Thr Phe Asp Ile Thr Arg

305 310 315 320

Lys Pro Glu His Asn Phe Ala Phe Gly Tyr Gly Ile His Gly Cys Pro

325 330 335

Gly Gln His Leu Ala Arg Val Leu Ile Lys Val Ala Thr Val Arg Leu

340 345 350

Phe Glu Arg Phe Pro Asp Val Arg Leu Ala Gly Asp Val Pro Met Asn

355 360 365

Glu Gly Leu Gly Leu Phe Ser Pro Ala Glu Leu Arg Val Thr Trp Gly

370 375 380

Ala Glu

385

<210>21

<211>649

<212>DNA

<213>吸水链霉菌

<400>21

gtgagcgcgt ccgtgcagac catcaagctg ccgaacggca agaccgtcgc ccacgtcaac 60

ccgggcgagg cgcagttcct ctaccaggag atcttcgccg agcggtgcta cttgcggcgc 120

ggccttgagc tgcgagcggg tgacgtggtc ttcgacgtcg gcgcgaacat cggcatgttc 180

tcgctcttcg cccacctgga gtgccccgat gtcacggtgc acgccttcga gccggcgccg 240

gtgccgtacg ccgcgctcag ggccaatgcc gagcggtacg gcatcgcggg ccggttcgag 300

cagtgcgcgg tctcggacgt ggccggccgc ggcaagatga cgttctacac ggataccacg 360

atgatgtcgg gcttccaccc ggatccggcg acccgcgcgg agctgctgcg caggctcgcc 420

atcaacggcg ggtacagtgc cgaggccgcc gaccggatgc tggccgagct gccggacacc 480

agccaggtga tcgagacgtc cgtcgtacgc ctctccgacg tcatcgcgga gcggggcatc 540

acctcgatcg gactgctcaa gatcgatgtg gagaagaacg agcggcatgt gatggccggg 600

atcgacgcgg ccgactggcc gcgcatccgc caggtcgtca ccgaggtgc 649

<210>22

<211>649

<212>DNA

<213>吸水链霉菌

<400>22

gtgagcgcgt ccgtgcagac catcaagctg ccgtacggca gaccgtcggc ccacgtcaac 60

ccgggcgagg cgcagttcct ctaccaggag atcttcgccg agcggtgcta cttgcggcgc 120

ggccttgagc tgcgagcggg tgacgtggtc ttcgacgtcg gcgcgaacat cggcatgttc 180

tcgctcttcg cccacctgga gtgccccgat gtcacggtgc acgccttcga gccggcgccg 240

gtgccgtacg ccgcgctcag ggccaatgcc gagcggtacg ccatcgcggg ccggttcgag 300

cagtgcgcgg tctcggacgt ggccggccgc ggcaagatga cgttctacac ggataccacg 360

atgatgtcgg gcttccaccc ggatccggcg acccgcgcgg agctgctgcg caggctcgcc 420

atcaacggcg ggtacagtgc cgaggccgcc gaccggatgc tggccgagct gccggacacc 480

agccaggtga tcgagacgtc cgtcgtacgc ctctccgacg tcatcgcgga gcggggcatc 540

acctcgatcg gactgctcaa gatcgatgtg gagaagaacg agcggcatgt gatggccggg 600

atcgacgcgg gcgactggcc gcgcatccgc caggtcgtca ccgaggtgc 649

<210>23

<211>260

<212>PRT

<213>吸水链霉菌

<400>23

Val Ser Ala Ser Val Gln Thr Ile Lys Leu Pro Asn Gly Lys Thr Val

1 5 10 15

Ala His Val Asn Pro Gly Glu Ala Gln Phe Leu Tyr Gln Glu Ile Phe

20 25 30

Ala Glu Arg Cys Tyr Leu Arg Arg Gly Leu Glu Leu Arg Ala Gly Asp

35 40 45

Val Val Phe Asp Val Gly Ala Asn Ile Gly Met Phe Ser Leu Phe Ala

50 55 60

His Leu Glu Cys Pro Asp Val Thr Val His Ala Phe Glu Pro Ala Pro

65 70 75 80

Val Pro Tyr Ala Ala Leu Arg Ala Asn Ala Glu Arg Tyr Gly Ile Ala

85 90 95

Gly Arg Phe Glu Gln Cys Ala Val Ser Asp Val Ala Gly Arg Gly Lys

100 105 110

Met Thr Phe Tyr Thr Asp Thr Thr Met Met Ser Gly Phe His Pro Asp

115 120 125

Pro Ala Thr Arg Ala Glu Leu Leu Arg Arg Leu Ala Ile Asn Gly Gly

130 135 140

Tyr Ser Ala Glu Ala Ala Asp Arg Met Leu Ala Glu Leu Pro Asp Thr

145 150 155 160

Ser Gln Val Ile Glu Thr Ser Val Val Arg Leu Ser Asp Val Ile Ala

165 170 175

Glu Arg Gly Ile Thr Ser Ile Gly Leu Leu Lys Ile Asp Val Glu Lys

180 185 190

Asn Glu Arg His Val Met Ala Gly Ile Asp Ala Ala Asp Trp Pro Arg

195 200 205

Ile Arg Gln Val Val Thr Glu Val His Asp Ile Asp Gly Arg Leu Asp

210 215 220

Glu Val Leu Thr Leu Leu Arg Gly Gln Gly Phe Thr Val Leu Ser Glu

225 230 235 240

Gln Glu Pro Leu Phe Ala Gly Thr Asp Ile Tyr Gln Val Val Ala Arg

245 250 255

Arg Gly Asp Ala

260

<210>24

<211>260

<212>PRT

<213>吸水链霉菌

<400>24

Val Ser Ala Ser Val Gln Thr Ile Lys Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Ser

1 5 10 15

Ala His Val Asn Pro Gly Glu Ala Gln Phe Leu Tyr Gln Glu Ile Phe

20 25 30

Ala Glu Arg Cys Tyr Leu Arg Arg Gly Leu Glu Leu Arg AIa Gly Asp

35 40 45

Val Val Phe Asp Val Gly Ala Asn Ile Gly Met Phe Ser Leu Phe Ala

50 55 60

His Leu Glu Cys Pro Asp Val Thr Val His Ala Phe Glu Pro Ala Pro

65 70 75 80

Val Pro Tyr Ala Ala Leu Arg Ala Asn Ala Glu Arg Tyr Ala Ile Ala

85 90 95

Gly Arg Phe Glu Gln Cys Ala Val Ser Asp Val Ala Gly Arg Gly Lys

100 105 110

Met Thr Phe Tyr Thr Asp Thr Thr Met Met Ser Gly Phe His Pro Asp

115 120 125

Pro Ala Thr Arg Ala Glu Leu Leu Arg Arg Leu Ala Ile Asn Gly Gly

130 135 140

Tyr Ser Ala Glu Ala Ala Asp Arg Met Leu Ala Glu Leu Pro Asp Thr

145 150 155 160

Ser Gln Val Ile Glu Thr Ser Val Val Arg Leu Ser Asp Val Ile Ala

165 170 175

Glu Arg Gly Ile Thr Ser Ile Gly Leu Leu Lys Ile Asp Val Glu Lys

180 185 190

Asn Glu Arg His Val Met Ala Gly Ile Asp Ala Gly Asp Trp Pro Arg

195 200 205

Ile Arg Gln Val Val Thr Glu Val His Asp Ile Asp Gly Arg Leu Asp

210 215 220

Glu Val Leu Thr Leu Leu Arg Gly Gln Gly Phe Thr VaI Leu Ser Glu

225 230 235 240

Gln Glu Pro Leu Phe Ala Gly Thr Asp Ile Tyr Gln Val Val Ala Arg

245 250 255

Arg Gly Asp Ala

260

<210>25

<211>100

<212>DNA

<213>吸水链霉菌

<400>25

ggccacctcc atcgatctgt cacccgaact gaccgcggta ggccgccgca agttggcctc 60

gcgggggatc gataacgtca ccctggtcga gggtgacgtt 100

<210>26

<211>100

<212>DNA

<213>吸水链霉菌

<400>26

ggccacctcc atcgatctgt cacccgaact gaccgcggta ggcccccaca agttggcctc 60

gcgggggatc gataacgtca ccctggtcga gggtgacgtt 100

<210>27

<211>210

<212>PRT

<213>吸水链霉菌

<400>27

Met Leu Glu Leu Gly Thr Arg Leu Lys Phe Arg Phe Thr Gly Pro Leu

1 5 10 15

Leu Glu Ala Val Asn Pro Arg Leu Gln Gly His Pro Tyr Asp Val Leu

20 25 30

Met Arg Leu Leu Glu Gly Gly Arg Ile Glu Asn Val Leu Glu Leu Cys

35 40 45

Gly Gly Thr Gly Phe Ala Ser Arg Met Leu Ala Glu Arg His Ser Lys

50 55 60

Val Gln Ala Thr Ser Ile Asp Leu Ser Pro Glu Leu Thr Ala Val Gly

65 70 75 80

Arg Arg Lys Leu Ala Ser Arg Gly Ile Asp Asn Val Thr Leu Val Glu

85 90 95

Gly Asp Val Ser Thr Leu Pro Tyr Pro Asp Asp Ser Phe Asp Thr Val

100 105 110

Met Ser Ala Phe Gly Leu His Glu Val Pro Thr Ala Gly Arg Leu Ser

115 120 125

Ala Ile Arg Glu Ser Val Arg Val Leu Lys Pro Gly Gly Arg Phe Val

130 135 140

Ile Val Asp Leu Asp Arg Arg Thr Lys Tyr Gly Trp Thr Met Asp Leu

145 150 155 160

Phe Met Lys Val Met Glu Pro Lys Phe Ala Pro Glu Val Phe Gly Thr

165 170 175

Gly Leu Val Asp Arg Leu Lys Glu Asn Gly Phe Thr Ile Asp His His

180 185 190

Glu Ser Ala Gly Pro Asn Gly Trp Thr Gln Ser Ile Val Ala Thr Leu

195 200 205

Glu Ala

210

<210>28

<211>210

<212>PRT

<213>吸水链霉菌

<400>28

Met Leu Glu Leu Gly Thr Arg Leu Lys Phe Arg Phe Thr Gly Pro Leu

1 5 10 15

Leu Glu Ala Val Asn Pro Arg Leu Gln Gly His Pro Tyr Asp Val Leu

20 25 30

Met Arg Leu Leu Glu Gly Gly Arg Ile Glu Asn Val Leu Glu Leu Cys

35 40 45

Gly Gly Thr Gly Phe Ala Ser Arg Met Leu Ala Glu Arg His Ser Lys

50 55 60

Val Gln Ala Thr Ser Ile Asp Leu Ser Pro Glu Leu Thr Ala Val Gly

65 70 75 80

Pro His Lys Leu Ala Ser Arg Gly Ile Asp Asn Val Thr Leu Val Glu

85 90 95

Gly Asp Val Ser Thr Leu Pro Tyr Pro Asp Asp Ser Phe Asp Thr Val

100 105 110

Met Ser Ala Phe Gly Leu His Glu Val Pro Thr Ala Gly Arg Leu Ser

115 120 125

Ala Ile Arg Glu Ser Val Arg Val Leu Lys Pro Gly Gly Arg Phe Val

130 135 140

Ile Val Asp Leu Asp Arg Arg Thr Lys Tyr Gly Trp Thr Met Asp Leu

145 150 155 160

Phe Met Lys Val Met Glu Pro Lys Phe Ala Pro Glu Val Phe Gly Thr

165 170 175

Gly Leu Val Asp Arg Leu Lys Glu Asn Gly Phe Thr Ile Asp His His

180 185 190

Glu Ser Ala Gly Pro Asn Gly Trp Thr Gln Ser Ile Val Ala Thr Leu

195 200 205

Glu Ala

210

<210>29

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>29

gcaagcttgg taccgacacg ctcgccgaac agg 33

<210>30

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>30

gcgcatgccc tagggtgtac attacttctc c 31

<210>31

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>31

tatctagact tcgcacgtgc ctgggaca 28

<210>32

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>32

agaagcttac ccaattccaa catcacct 28

<210>33

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>33

ggaagctttg accacacgcc gcccgttc 28

<210>34

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>34

atgcatgccc gccgcaaccc gctggcct 28

<210>35

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>35

taaactagtc catctgagag tttcatatgg ccctattctg cccagccgct ctagaaat 58

<210>36

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>36

atttctagag cggctgggca gaatagggcc atatgaaact ctcagatgga ctagttta 58

<210>37

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>37

gggcatatga ggcaattgac tccgccggtc acggcaccgt actgcc 46

<210>38

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>38

ggggtctaga ggtcacgcca ccacaccctc gatctcgacc 40

<210>39

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>39

gggcatatgt cgacgaccga tcagggtgag accggaaagg cctg 44

<210>40

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>40

ggggtctaga ggtcagtcct ggggttcgag aagctcgccg gtctcctt 48

<210>41

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>41

gggcatatga tccaacccga cgtcgtgacc gccttcacag cgg 43

<210>42

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>42

ggggtctaga ggtcacacgc ggacggcgat ctggtgccga tagg 44

<210>43

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>43

gggcatatgc agaccaaggt tctgtgccag cgtgacatca ag 42

<210>44

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>44

ggggtctaga ggtcactaca gcgagtacgg atcgaggacg tcctcgggcg 50

<210>45

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>45

ggagatctca gcgagtacgg atcgaggacg tcctcgggcg 40

<210>46

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>46

gggcatatga gcaccgaagc tcagcaagag agcacgccca ccgcacgct 49

<210>47

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>47

ggggtctaga ggtcactccg ctccccaggt gacccggagc tcggc 45

<210>48

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>48

gggcatatga gcgcgtccgt gcagaccatc aagctgcc 38

<210>49

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>49

ggggtctaga ggtcaggcgt ccccgcggcg ggcgacgacc t 41

<210>50

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>50

catatgttgg aattgggtac ccgcctg 27

<210>51

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>51

tctagacgct cacgcctcca gggtg 25

<210>52

<211>72

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>52

ggggaattca gatctggtct agaggtcagc cggcgtggcg gcgcgtgagt tcctccagtc 60

gcgggacgat ct 72

<210>53

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>53

gggtctagat ccggacgaac gcatcgatta attaaggagg acacata 47

<210>54

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>54

gggcatatga ccgatgccgg acgcca 26

<210>55

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>55

ggggtctaga tcacgccacc atgccttcga 30

<210>56

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>56

caaagcttcc tggcgcggtt cggccggca 29

<210>57

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>57

tggcatgccc ttccccgccg ttccctggc 29

<210>58

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>58

tggcatgccc ccgccgagct gacctggaa 29

<210>59

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>59

gttctagagc ttacgcgtga tgtcgaacg 29

<210>60

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>60

gctctagagc ccgcggctcg ccggacacg 29

<210>61

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>61

cccctgcagg cgtccggcat cggtcatcag 30

<210>62

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>62

cgcctgcagg gatacggtcc gccgggtctg c 31

<210>63

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>63

ccaagcttgt acggttcgcc acgggcgtgc 30

Claims

1.产生掺入非天然起始单元的FBKP-配体类似物的方法，所述方法包括：

(a)产生重组菌株，其中至少rapK同源物已经被缺失或失活；和

(b)将非天然起始单元送料至所述菌株。

2.权利要求1的方法，该方法还包括缺失一个或多个其他辅助基因。

3.权利要求1或2的方法，其还包括通过互补恢复一个或多个缺失的基因。

4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其还包括分离和纯化所产生的FKBP-配体类似物的步骤。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述非天然起始单元选自2-降冰片烷羧酸、2-(顺/反)-羟基环己烷羧酸、3-(顺/反)-羟基环己烷羧酸、4-(顺/反)-羟基环己烷羧酸、2-(顺/反)-甲基环己烷羧酸、4-(顺/反)-甲基环己烷羧酸、3-(顺/反)-甲氧基环己烷羧酸、4-(顺/反)-甲氧基环己烷羧酸、4-氧代环己烷羧酸、2-氧代环己烷羧酸、4-反-正戊基环己烷羧酸、2-反-氨基环己烷羧酸、4-顺-氨基环己烷羧酸、4-(顺/反)-氨基甲基环己烷羧酸、环戊烷羧酸、环丁烷羧酸、1-甲基环己烷羧酸、3-反-羟基-4-顺-氟环己烷羧酸和4-反-羟基-3-顺-氟环己烷羧酸、3-顺-羟基-4-反-氟环己烷羧酸和4-顺-羟基-3-反-氟环己烷羧酸、3-顺-羟基-4-反-氯环己烷羧酸和4-顺-羟基-3-反-氯环己烷羧酸、3-反-羟基-4-顺-氯环己烷羧酸和4-反-羟基-3-顺-氯环己烷羧酸、3-反-氧化环己烯羧酸、3-顺-氧化环己烯羧酸、3，4-顺-二羟基环己烷羧酸和3，4-反-二羟基环己烷羧酸、环己烷乙酸、环己烷丙酸和4-顺/反-叔丁基环己烷羧酸或者其简单酯或者盐。

6.根据权利要求5的方法，其中所述非天然起始单元选自：3-(顺/反)-羟基环己烷羧酸、4-(顺/反)-羟基环己烷羧酸、3-(顺/反)-甲氧基环己烷羧酸、4-(顺/反)-甲氧基环己烷羧酸、4-氧代环己烷羧酸、环丁烷羧酸、3-反-羟基-4-顺-氟环己烷羧酸和4-反-羟基-3-顺-氟环己烷羧酸、3-顺-羟基-4-反-氟环己烷羧酸和4-顺-羟基-3-反-氟环己烷羧酸、3-顺-羟基-4-反-氯环己烷羧酸和4-顺-羟基-3-反-氯环己烷羧酸、3-反-羟基-4-顺-氯环己烷羧酸和4-反-羟基-3-顺-氯环己烷羧酸、3-反-氧化环己烯羧酸、3-顺-氧化环己烯羧酸、3，4-顺-二羟基环己烷羧酸和3，4-反-二羟基环己烷羧酸、环己烷丙酸、4-顺/反-叔丁基环己烷羧酸或者其简单酯或盐。

7.根据权利要求5的方法，条件是送料于所述重组菌株的非天然起始物不是：环己烷羧酸、3-顺，4-反-二羟基环己烷羧酸、1-环己烯羧酸、3-环己烯羧酸、环庚烷羧酸、3-(顺/反)-甲基环己烷羧酸、4-(顺/反)-甲基环己烷羧酸、1-环庚烯羧酸或者5-顺-羟基-3-环己烯羧酸。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中(a)部分的重组菌株是根据包括以下步骤的方法制备的：

(a)在dam^-、dcm^-或dam^-和dcm^-的大肠杆菌菌株中构建接合缺失质粒；

(b)从适于接合的所述宿主菌株产生孢子，其中所述菌株生长在10％到40％的湿度中并且孢子在5到30天收获；

(c)在培养基中将步骤(a)的大肠杆菌菌株与来自步骤(b)的孢子接合，其中每升该培养基含有：

i)0.5g到5g玉米浆粉，

ii)0.1g到5g酵母提取物，

iii)0.1g到10g碳酸钙；和

iv)0.01g到0.5g硫酸铁；

所述培养基还含有细菌培养用琼脂和淀粉并且已经被干燥导致1-20％重量损失；和

d)任选在适于产生聚酮化合物的条件下培养重组菌株。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中菌株选自：吸水链霉菌吸水亚种(Streptomyces hygroscopicus subsp.hygroscopicus)NRRL 5491、游动放线菌(Actinoplanes sp.)N902-109FERM BP-3832、链霉菌AA6554、吸水链霉菌子囊霉素变种(Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus)MA 6475 ATCC14891、吸水链霉菌子囊霉素变种MA 6678 ATCC 55087、吸水链霉菌子囊霉素变种MA 6674、吸水链霉菌子囊霉素变种ATCC 55276、吸水链霉菌子囊霉素亚种ATCC 14891、筑波链霉菌(Streptomycestsukubaensis)No.9993 FERM BP-927、吸水链霉菌屋九岛亚种(Streptomyces hygroscopicus subsp.Yakushimaensis)、链霉菌DSM4137、链霉菌DSM 7348、微单孢菌(Micromonospora)n.sp.A92-306401DSM 8429和链霉菌MA 6858ATCC 55098。

10.权利要求9的方法，其中菌株选自吸水链霉菌吸水亚种NRRL 5491和吸水链霉菌子囊霉素变种ATCC 14891。

11.权利要求10的方法，其中菌株为雷帕霉素生产者吸水链霉菌吸水亚种NRRL 5491。

12.根据权利要求3的方法，其中恢复缺失基因的方法包括：

(a)构建含有一个或多个缺失基因的基因盒和

(b)用所述基因盒转化含有编码FKBP-配体的生物合成簇的所述重组菌株。

13.根据权利要求12的方法，其中所述基因盒直接在表达载体中装配。

14.根据权利要求12或13的方法，其中互补是同源的。

15.根据权利要求12或13的方法，其中互补是异源的。

16.根据权利要求2-15中任一项所述的方法，其中所述一个或多个缺失或失活的辅助基因选自起始单元提供基因、氨基酸前体提供基因、细胞色素P450单加氧酶、铁氧化还原蛋白和依赖SAM的O-甲基转移酶。

17.权利要求16的方法，其中缺失或失活的基因选自rapL、rapN、rapO、rapM、rapQ、rapI和rapJ。

18.含有编码FKBP-配体的生物合成簇的重组菌株，其中至少rapK同源物被缺失或失活。

19.根据权利要求18的重组菌株，其中菌株选自吸水链霉菌吸水亚种NRRL 5491、游动放线菌N902-109FERM BP-3832、链霉菌AA6554、吸水链霉菌子囊霉素变种MA 6475 ATCC 14891、吸水链霉菌子囊霉素变种MA 6678 ATCC 55087、吸水链霉菌子囊霉素变种MA 6674、吸水链霉菌子囊霉素变种ATCC 55276、吸水链霉菌子囊霉素亚种ATCC 14891、筑波链霉菌No.9993 FERM BP-927、吸水链霉菌屋九岛亚种、链霉菌DSM 4137、链霉菌DSM 7348、微单孢菌n.sp.A92-306401 DSM 8429和链霉菌MA 6858 ATCC 55098。

20.根据权利要求19的重组菌株，其中菌株选自吸水链霉菌吸水亚种NRRL 5491和吸水链霉菌子囊霉素变种ATCC 14891。

21.根据权利要求20的重组菌株，其中菌株为雷帕霉素生产菌吸水链霉菌吸水亚种NRRL 5491。

22.根据权利要求18-21中任一项所述的重组菌株，其中额外缺失的或失活的辅助基因选自：已经被缺失的rapL、rapN/O、rapQ、rapM、rapI和rapJ，其中所述缺失不是rapQrapN/OrapMrapL。