KR20070052784A

KR20070052784A - 17―데스메틸라파마이신 및 그 유사체, 그들의 제조 방법및 그들의 면역억제제, 항암제, 항진균제 등으로서의 용도

Info

Publication number: KR20070052784A
Application number: KR1020077005523A
Authority: KR
Inventors: 메튜 알란 그레고리; 크리스틴 제닛 마틴
Original assignee: 바이오티카 테크놀로지 리미티드
Priority date: 2004-08-11
Filing date: 2005-08-11
Publication date: 2007-05-22
Also published as: CN101056880A; AU2005270989B2; ZA200701622B; CN101805748A; EP2471797A2; BRPI0514236A; EP2471797B1; MX2007001809A; NZ553074A; WO2006016167A2; US7803808B2; US20090253732A1; EP2471797A3; NO20070686L; RU2009140290A; GB0417852D0; AU2005270989A1; IL181171A0; CA2575582A1; RU2430922C2

Abstract

본 발명은 폴리케티드 및 기타 천연 생성물의 생산과 화합물 및 개별적인 신규한 화합물의 라이브러리에 관한 것이다. 따라서, 일 양태에서, 본 발명은 17-데스메틸라파마이신 및 그 유사체, 재조합 균주를 포함하는 그들의 생산 방법, 및 본 발명의 화합물의 분리 및 용도를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 면역억제의 유도 또는 유지, 신경세포 재생의 촉진 또는 암, B-세포 악성종양, 진균성 감염증, 이식 거부, 이식편-대-숙주 질병, 자가면역 질환, 염증성 질병, 혈관 질병 또는 섬유증의 치료 또는 상처 치료의 제어에서 17-데스메틸라파마이신 및 그 유사체의 용도를 제공한다.

라파마이신, 폴리케티드, 17-데스메틸라파마이신

Description

17―데스메틸라파마이신 및 그 유사체, 그들의 제조 방법 및 그들의 면역억제제, 항암제, 항진균제 등으로서의 용도{17-Desmethylrapamycin and analogues thereof, methods for their production and their use as immunosupressants, anticancer agents, antifungal agents, etc.}

본 발명은 폴리케티드 및 기타 천연 생성물의 생산 및 화합물의 라이브러리 및 개별적인 신규한 화합물에 관한 것이다. 따라서, 일 양태에서, 본 발명은 17-데스메틸라파마이신 및 그의 유사체(analogue), 재조합 균주(recombinant strain)를 포함한 그들의 생산 방법, 및 본 발명의 화합물의 분리 및 용도를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 면역억제, 신경원 재생(neuronal regeneration)의 자극 또는 암, B-세포 악성종양(malignancy), 진균성 감염, 이식 거부, 이식편-대-숙주 질병, 자가면역성 질환, 염증성 질병, 혈관 질병 및 섬유소성 질병(fibrotic disease)의 치료 및 상처 치유의 조절에서 이와 같은 신규한 라파마이신 유사체의 용도를 제공한다. 특정한 구체예에서, 본 발명은 17-데스메틸라파마이신 및 그 유사체를 생산하는 유전적으로 조작된 균주(engineered strain)를 제조하기 위해 라파마이신의 생산을 담당하는 생합성 유전자를 조작하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 그와 같은 균주에 비-천연 스타터 산(non-natural starter acid)을 공급하여 17-데스메틸라파마이신 유사체의 라이브러리를 생성하는 방법, 및 그에 의해 생 산된 화합물의 라이브러리 및 클로닝된 유전자 또는 유전자 카세트가 추가적인 유사체를 생산하기 위해 발현되는 것인 유도 균주(derivative strain), 및 그들을 제조하는 방법, 및 상기 방법에서 이용된 수단(예를 들면, 핵산, 벡터, 유전자 카세트 및 유전적으로 변형된 균주)에 관한 것이다.

라파마이신(시롤리무스)(도 1)는 피페콜산 락톤(pipecolic acid lactone)에 연결된 1,2,3-트리카르보닐 모이어티를 갖는(Paiva et al., 1991), 스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus) NRRL 5491(Sehgal et al., 1975; Vezina et al., 1975; 미국특허 제3,929,992호; 미국특허 제3,993,749호)에 의해 생산되는 지방 친화성의 마크롤리드(lipophilic macrolide)이다. 기타 관련된 마크롤리드(도 2)는 FK506(타크롤리무스)(Schreiber and Crabtree, 1992), FK520(아스코마이신 또는 이뮤노마이신) (Wu et al., 2000), FK525(Hatanaka H, et al., 1989), FK523 (Hatanaka, H., et al., 1988), 안타스코미신(Fehr, T., et al., 1996) 및 메리다마이신(Salituro et al., 1995)을 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, 라파마이신은 Findlay et al. (1980) 또는 Chemical Abstracts(11^th Cumulative Index, 1982-1986 p60719CS)의 번호부여(numbering) 방식보다 McAlpine et al. (1991)의 번호부여 방식에 의해 기재된다.

라파마이신의 폴리케티드 백본은 총 7개의 프로피오네이트와 7개의 아세테이트 유닛의 쉬키메이트 유래 시클로헥산카르복시산 스타터 유닛(shikimate derived cyclohexanecarboxylic acid starter unit)으로의 두미 응축(head-to-tail condensation)에 의해 합성된다(Paiva et al., 1991). L-라이신 유래 아미노산인, 피페콜산은 아미드 결합을 통해 폴리케티드 백본의 말단 아세테이트로 응축되고(Paiva et al., 1993) 마크로사이클을 형성하기 위해 락톤화(lactonisation)로 이어진다. 생합성 유전자 클러스터를 포함하는 107 kb 게놈 영역의 서열이 결정되었다(Schwecke et al., 1995). 개방 해독 프레임(open reading frame)의 분석은 모듈형 폴리케티드 신타아제(PKS)를 코딩하는 3개의 대형 유전자를 밝혔다(Aparicio et al., 1996; Schwecke et al., 1995). PKS 유전자들 사이에 비-리보좀(nonribosomal) 펩티드 신테타아제의 활성화 도메인과 서열 유사성을 갖는 단백질을 코딩하는 rapP 유전자가 끼어 있으며 이는 유사하게 작용할 것으로 판단되고 있다(K[omicron]nig et al., 1997). PKS 유전자를 코딩하는 영역은 그 양쪽으로 라파마이신의 생합성을 위해 요구되는 것으로 생각되는 효소를 코딩하는 24개의 추가적인 개방 해독 프레임에 접하고 있다(Molnar et al., 1996). 이들은 다음의 포스트-폴리케티드 변형 효소를 포함한다: RapJ 및 RapN로 불리는 두 개의 시토크롬 P- 450 모노옥시게나아제, 연관된 페레독신 RapO, 및 세 개의 SAM-의존성 O-메틸트랜스퍼라아제 RapI, RapM 및 RapQ. 기타 인접한 유전자들은 라파마이신의 조절 및 외부로의 이동(export)에서 추정되는 역할을 갖는다(Molnar et al., 1996). 클러스터는 rapL 유전자를 포함하고, 그 생성물인 RapL은 L-라이신의 시클로디아미네이션(cyclodeamination)을 통한 라파마이신 전구체 L-피페콜산의 형성을 촉매하는 것으로 제안되고 있다(Khaw et al., 1998; Paiva et al., 1993).

라파마이신의 폴리케티드 심부(core)는 타입 I 폴리케티드 신타아제(rap PKS)를 포함하는 매우 큰, 다기능성 단백질에 의해 조립된다. 이 폴리펩티드 복합체는 로딩(loading) 모듈 및 14개의 신장(extension) 모듈을 포함하고, 각 모듈은 성장하는 폴리케티드 사슬로의 특정한 아실-CoA 전구체의 첨가 및 β-케토 카르보닐 기의 환원 정도를 결정한다. 각 모듈은 상기 폴리펩티드의 특정 도메인에 의해 수행되는 여러 생화학 반응을 담당한다. 모든 신장 모듈은 전구체로부터 아실 기를 선택하고 아실 전달 단백질(acyl carrier protein: ACP)로 공여하는 아실 트랜스퍼라아제(AT) 도메인, 및 기존의 폴리케티드 사슬을 탈카르복실 응축(decarboxylative condensation)에 의해 새로운 아실-ACP에 첨가하는 β-케토신타아제(KS) 도메인을 포함한다. 일부 신장 모듈에는 추가적인 도메인이 존재한다: β-케토 기를 히드록실로 환원하는 β-케토리덕타아제 (KR) 도메인, 이중 결합을 남기기 위해 히드록실에 작용하는 디히드라타아제(DH) 도메인, 및 포화된 탄소를 남기기 위해 이중 결합을 환원시키는 에노일 리덕타아제(ER) 도메인. 모듈 3 및 모듈 6에서, 존재하는 β-케토 프로세싱 도메인은 이 도메인들의 작용이 최종 구조에 반영되지 않기 때문에 비활성 상태일 것으로 예측된다. 마지막 신장 모듈(신장 모듈 14)은 β-케토 프로세싱 도메인을 포함하지 않는 것으로 보인다. 라파마이신 생합성의 개시는 쉬키메이트 경로로부터 유래되는 4,5-디히드록시시클로헥스-1-엔카르복시산의 도입(incorporation)을 통해 이루어지고, FK506 및 FK520와 같은 다른 FKBP-결합 분자들에 공통된다(도 2). 폴리케티드의 생합성 후에, rapP에 의해 코딩되는 NRPS 모듈은 피페콜산(L-라이신 유래)을 도입하고, 이는 아미드 결합을 통해 폴리케티드 백본의 마지막 아세테이트로 응축된다 (Paiva et al., 1993). 이는 마크로사이클을 형성하는 락톤화로 이어진다.

세 개의 라파마이신 PKS 유전자, NRPS-코딩 유전자 및 플랭킹 후기 유전자(flanking late gene) 각각의 뉴클레오티드 서열 및 상응하는 폴리펩티드가 Aparicio et al., 1996, 및 Schwecke et al., 1995에 의해 확인되고 수탁번호 X86780으로 NCBI에 기탁되었고 이 서열에 대한 정정이 최근에 WO 04/007709에서 발표되었다.

라파마이신 생합성 클러스터의 최초의 효소-불포함 생성물이 라파마이신 전구체(pre-라파마이신)으로 표시되었다(WO 04/007709, Gregory et al., 2004). 완전히 처리된 라파마이신의 생산은 라파마이신 후기 유전자, apJ, RapN, RapO, RapM, RapQ 및 RapI에 의해 코딩되는 효소에 의한 폴리케티드/NRPS 심부의 추가적인 처리를 필요로 한다.

라파마이신은 그 화합물에 의해 발휘되는 광범위한 활성 스펙트럼 때문에 중요한 약학적 가치를 갖는다; 이는 라파마이신의 신규한 유도체를 생성할 필요성을 역설한다. 라파마이신은 항진균 활성, 주로, 칸디다 종 및 또한 사상균(filamentous fungi)에 대한 중간 정도의 항진균 활성을 보인다(Baker et al., 1978; Sehgal et al., 1975; Vezina et al., 1975; U.S. 3,929,992; U.S. 3,993,749). 라파마이신은 다양한 종류의 세포에서 신호 전달(signal transduction) 경로를 표적화하여, 예를 들면, 세포 주기의 G₁기가 S기로 진행될 수 있게 하는 신호전달 경로를 억제하여 세포 증식을 억제한다(Kuo et al., 1992). T 세포에서, 라파마이신은 IL-2 수용체로부터의 신호전달 및 뒤이은 T-세포의 자가증식(autoproliferation)을 억제하여 면역억제를 초래한다. 라파마이신의 억제 효과는 T 세포로 한정되지 않으며, 이는 라파마이신은 다수의 종류의 포유동물 세포의 증식을 억제하기 때문이다(Brunn et al., 1996). 라파마이신은 따라서, 기관 동종이식편 거부(organ allograft rejection)의 방지 및 자가면역 질병의 치료에서 정립되거나 또는 예측되는 치료적 응용을 갖는 강력한 면역억제제이다(Kahan et al., 1991). 40-O-(2-히드록시)에틸-라파마이신(SDZ RAD, Certican, everolimus)은 면역억제 약학적 효과를 보이는 라파마이신의 반-합성 유사체(semi-synthetic analogue)이다(Sedrani, R. et al., 1998; Kirchner et al., 2000; U.S. 5,665,772). 이 약물은 2003년에 유럽에서 허가되었고 곧 미국에서 허가될 것으로 예상된다. 라파마이신 에스테르 CCI-779(Wyeth-Ayerst)는 생체 외에서 세포 성장을 억제하고 생체 내에서 종양 성장을 억제한다(Yu et al., 2001). CCI-779는 현재 임상 III 상에 있다. 만성 판상 건선(chronic plaque psoriasis)의 치료에서의 라파마이신의 가치(Kirby and Griffiths, 2001), PC12 세포들에서 신경돌기 성장의 촉진과 같은 효과의 잠재적 이용(Lyons et al., 1994), 기계적 손상 후 혈관 및 평활근 세포들에 의한 사이토카인에 대한 증식성 반응의 차단(Gregory et al., 1993) 및 동종 이식편 섬유증(allograft fibrosis)의 예방에서의 역할(Waller and Nicholson, 2001)이 주요한 연구 영역이다(Kahan and Camardo, 2001). 최근의 보고서들은 라파마이신은 장기적인 면역억제 요법을 받고 있는 기관 동종이식 환자들의 다른 면역 억제성 치료를 받고 있는 환자들보다 낮은 암 발생률과 연관되고, 이와 같은 감소된 암 발생률은 혈관신생(angiogenesis)의 억제 때문인 것으로 밝히고 있다(Guba ef al., 2002). 이뮤노필린(immunophilin) 리간드의 향신경성(neurotrophic) 활성은 그들의 면역억제 활성과 독립적이고(Steiner ef al., 1997) 신경 성장 자극은 특허출원 WO 01/03692에 약술된 바와 같은 성숙한 스테로이드 수용체 복합체의 붕괴에 의해 촉진되는 것으로 보고되었다. 고지혈증 및 혈소판감소증과 같은 부작용 및 잠재적인 기형유발 효과가 보고되었다(Hentges et al., 2001; Kahan and Camardo, 2001).

라파마이신은 고등 진핵생물에서 리보좀 단백질 S6을 인산화시키는 p70^S6k 키나아제인 세린/쓰레오닌 키나아제의 억제를 통해 세포 내에서 신호전달 캐스캐이드(cascade)에 영향을 준다(Ferrari et al., 1993; Kuo et al., 1992). S6 단백질은 리보좀의 40S 서브유닛에 위치하고 tRNA 및 mRNA 결합에 관여하는 중요한 기능성 부위인 것으로 추정된다. p70^S6k에 의한 S6 인산화를 통해 mRNA 번역을 조절하는 기능이 주장되었다(Kawasome et al, 1998). 라파마이신은 사이클린-의존성 키나아제의 활성, cAMP-민감성 요소 조절제(cAMP-responsive element modulator: CREM)의 인산화 및 연장(elongation) 인자 결합 단백질 4E-BP1(PHAS1)의 인산화를 포함한 기타 성장 관련 사건들에 대한 효과를 통해 단백질 합성을 억제한다(Hung ef al, 1996). 라파마이신은 번역 개시 인자 eIF-4E에 결합하는 4E-BP1의 탈인산화된 종의 축적을 유도하여, cap-의존성 mRNA의 번역 개시를 억제한다(Hara et al., 1997; Raught ef al., 2001).

현재까지 규명된 라파마이신의 약리적 작용은 FKBP 또는 이뮤노필린이라 불리는 세포질 수용체와의 상호작용에 의해 매개되는 것으로 추정된다. 이뮤노필린(이 용어는 면역억제성 결합 단백질을 나타내기 위해 이용됨)은 시스 및 트랜스 펩티딜-프롤린 결합의 이성질체화를 촉매하고 다양한 개체에서 발견되는 고도로 보존된 효소의 패밀리에 속한다(Rosen and Schreiber, 1992). 이뮤노필린의 패밀리에 속하는 효소의 두 개의 큰 군은 FKBP 및 사이클로필린(cyclophilin)이다(Schreiber and Crabtree, 1992). 진핵생물 T-세포에서 주요한 세포내 라파마이신 수용체는 FKBP12이고 (DiLeIIa and Craig, 1991) 결과물인 복합체는 세포의 신호 전달 캐스캐이드를 억제하기 위해 표적 단백질과 특이적으로 상호작용한다. FKBP12-라파마이신 복합체의 결정 구조의 분석은 '결합 도메인(binding domain)'이라 불리는 라파마이신-결합 약리활성단(pharmacophore)를 확인하였다(Van Duyne et al., 1993) (도 1 참조). '결합 도메인'은 이뮤노필린과의 상호작용을 위해 요구되고 에스테르 결합, 피페콜산-유래 고리, 디카르보닐 및 헤미케탈 고리를 포함하는 C-1 내지 C-14 영역으로 구성된다. 상호작용은 다수의 소수성 접촉 및 시클로헥산 고리 상의 히드록실 기에 대한 수소 결합을 포함한 일부 수소 결합을 특징으로 한다. 피페콜리닐 고리(C2 내지 N7)는 단백질로 최대한 침투(deepest penetration)하여 소수성 결합 공동(hydrophobic binding cavity)을 채우고 있는 고도로 보존된 방향족 아미노산 잔기들로 둘러싸인다. FKBP12에서 C1 및 C8 카르보닐 기들은 수소결합에 관여하며 C9 카르보닐 기는 세 개의 완전히 보존된 방향족 아미노산 잔기들(하나의 티 로신 및 두 개의 페닐알라닌 잔기)에 의해 형성되는 포켓으로 돌출된다. 표적 단백질과 상호작용하는 이뮤노필린-리간드 복합체의 도메인은 FKBP로부터 돌출된다.

대부분의 이뮤노필린은 면역억제 활성에 직접적으로 관여하지 않는 것으로 보이며 FAP48 및 FAP1과 같은 FKBP-연관 단백질(FAP)이라 불리는 FKBP의 천연 리간드의 후보들이 보고되었으나, 그들의 천연 리간드에 관해서는 비교적 알려진 것이 없다. 복합체 형성 동안 FAP와 FKBP간의 특정한 상호작용은 투여량-의존적 방식으로 라파마이신에 의해 방지된다(Chambraud et al., 1996; Kunz et al., 2000). 이뮤노필린은 단백질 폴딩(folding); 단백질의 조립 및 번역 후 변형(trafficking); 열 충격 단백질(heat shock protein)를 포함한 분자 복합체의 동시-조절(co-regulation); 스테로이드 수용체; 이온 채널; 세포-대-세포 상호작용 및 유전자의 전사 및 번역과 같은 광범위한 세포 활성에서 기능하는 것으로 보인다(Galat 2000; Hamilton and Steiner 1998). 모든 이뮤노필린은 펠티딜-프롤릴 시스-트랜스 이성질체화의 단백질 폴딩 특성을 가지며 다수의 이뮤노필린이 세포 내에서 단백질 합성의 주요 부위인 소포체에 위치하는 것으로 확인된다. FKBP12(U.S. 5,109,112) 외에, 다른 이뮤노필린은 FKBP12.6 (U.S. 5,457,182), FKBP13(Hendrickson et al., 1993; U.S. 5,498,597), FKBP25(Hung and Schreiber, 1992; Jin et al., 1992), FKBP14.6(U.S. 5,354,845), FKBP52(U.S. 5,763,590), FKBP60(Yem et a/., 1992) 및 FKBP65(Patterson et al., 2000)을 포함한다.

라파마이신-FKBP12 복합체의 표적은 효모에서 TOR( 라파마이신의 표적)로 확인되었고(Alarcon et al., 1999) 포유동물 단백질은 FRAP(FKBP-라파마이신 연관 단 백질) 또는 mTOR(라파마이신의 포유동물 표적)으로 알려져 있다(Brown et al., 1994). 이 단백질들은 포스파티딜이노시톨 3-키나아제의 포스포트랜스퍼라아제와 유의성 있는 유사성을 보이고 mTOR의 FKBP12-라파마이신 결합 도메인(FRB)에서 점 돌연변이(point mutation)은 mTOR 키나아제 활성을 파괴한다는 관찰은 FRB의 키나아제 도메인의 기능에 대한 관여에 대한 증거를 제공한다(Vilella-Bach et al., 1999). FRB 도메인을 포함하는 mTOR의 절단형(truncated form)을 갖는 FKBP12-라파마이신의 결정 구조(Chen et al., 1995)가 수득되어 라파마이신의 '효능기(effector)'를 한정했다(Choi et al., 1996; Liang et al., 1999). 결정 구조의 분석은 단백질-단백질 접촉은 라파마이신과 각 단백질 간의 상호작용에 비해 비교적 제한적이라는 것을 보여주었다. 라파마이신과 FRB 간의 수소 결합은 확인되지 않았다. 상호 작용은 라파마이신의 트리엔(triene) 영역과 FRB의 주로 방향족 잔기들 간의 일련의 소수성 접촉에 집중된다(Liang et al, 1999). 라파마이신의 가장 깊이 묻힌 원자는 C23에 결합된 메틸이다(도 1 참조). 라파마이신의 C23 내지 C34 영역과 시클로헥실 고리는 FRB와 소수성 접촉을 한다. 이원(binary) 및 삼원 복합체(ternary complex) 간에 라파마이신에서 작은 구조 변화(conformational change)가 명확하다(Liang et al., 1999).

C16 메톡시 기에서 변형된 라파마이신 유사체의 생물학적 효과와 FKBP12를 결합하는 그들의 능력 간에 차이가 검출되고 FKBP12와 mTOR 간의 계면 공간(interfacial space)에 있는 C16 치환기의 위치가 주장되었다(Luengo et al., 1995). 비-면역억제성 28-O-메틸 라파마이신과 결합된 FKBP12의 결정 구조의 분석 은 mTOR 결합의 파괴를 초래할 수 있는 시클로헥실 고리의 배향(orientation)에서 중요한 차이를 보여주었다(Kallen et al., 1996).

신경 세포에서 mTOR 신호전달과 국소화된 단백질 합성 간의 연결; 번역 제어에 관여하는 단백질의 인산화 상태에 대한 효과; 전사 및 번역 수준에서 번역 기구(translation machinery)의 성분들의 풍부; 아미노산 투과 효소(permease)의 제어 및 대사 경로에 관여하는 다수의 효소의 전사의 조정이 기술되었다(Raught et al., 2001). 라파마이신 민감성 신호전달 경로는 또한 배의 뇌 발달, 학습 및 기억 형성에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 보인다(Tang et al., 2002). 효모에서 TOR 단백질에 대한 연구는 또한 영양소-민감성(nutrient-sensitive) 신호전달 경로의 조절에서의 그들의 역할을 밝혔다(Hardwick et al., 1999). 유사하게, mTOR는 프로테인 키나아제 B(akt)의 작용에 대한 직접적인 표적이며 인슐린 신호전달에서 주요한 역할을 수행하는 것으로 확인되었다(Shepherd et al., 1998; Nave et al., 1999). 포유동물 TOR는 또한 액틴 세포 골격의 분극화 및 번역 개시의 조절에 관련되었다(Alarcon et al., 1999). mTOR와 같은 포스파티딜이노시톨 3-키나아제는 세포 주기 진행, 부착, 세포 생존 및 혈관신생과 같은 종양의 발병의 여러 측면에서 기능을 갖는다(Roymans and Siegers, 2001).

상이한 종류의 세포들에 존재하는 다수의 FKBP는 잠재적으로 변화된 결합 및/또는 효능기 도메인으로 신규한 FKBP-리간드 유사체를 분리하는 유용성을 분명히 나타낸다. 예를 들면, 라파마이신 유사체(및 기타 FKBP12-결합 화합물)가 신경 재생 및 신경돌기 성장을 조정하는 메카니즘으로 확인된 것은 스테로이드 수용체 복 합체를 형성하는 로타마아제(rotamase) 효소 FKBP52의 억제이다(WO 01/03692).

라파마이신 및 라파마이신 유사체의 약동학적 연구는 용액에서 보다 안정하고, 대사 공격(metabolic attack)에 대해 보다 내성을 가지며 및/또는 개선된 생체-이용율(bio-availability)을 가질 수 있는 신규한 라파마이신 화합물의 개발 필요성을 보여주었다. 화학적으로 이용가능한 위치를 이용한 라파마이신의 변형이 광범위하게 시도되었다(이하 참조). 그러나, 이 접근방법은 화학적 변형을 위해 이용가능한 일부 부위에 한정되고 또한 라파마이신 분자 상의 다른 반응성 부위들의 존재 하에 특정한 위치에서의 선택적 변형의 어려움 때문에 그 유용성이 더 제한된다.

라파마이신의 화학적으로 이용가능한 부위들을 이용하여 합성된 다양한 라파마이신 유사체들이 보고되었다. 하기의 화합물들의 설명은 도 1에 기재된 라파마이신 분자의 번호부여 시스템에 맞추었다. 라파마이신 분자에서 유도체화(derivatization) 또는 치환을 위해 화학적으로 이용가능한 부위는 C40 및 C28 히드록실 기(예를 들면, U.S. 5,665,772; U.S. 5,362,718), C39 및 C16 메톡시 기(예를 들면, WO 96/41807; U.S. 5,728,710), C32, C26 및 C9 케토 기(예를 들면, U.S. 5,378,836; U.S. 5,138,051; U.S. 5,665,772)를 포함한다. 트리엔을 표적으로 하는, C17, C19 및/또는 C21에서의 수소화(hydrogenation)는 항진균 활성의 유지 및 면역억제의 상대적 상실을 초래했다(예를 들면, U.S. 5,391,730; U.S. 5,023,262). 라파마이신의 안정성의 상당한 개선 (예를 들면, C32, C40 및/또는 C28에서의 옥심 형성, U.S. 5,563,145, U.S. 5,446,048), 대사 공격에 대한 저항성(예를 들면, U.S. 5,912,253), 생체이용률(예를 들면, U.S. 5,221,670; U.S. 5,955,457; WO 98/04279) 및 전구체 약물(prodrug)의 생산(예를 들면, U.S. 6,015,815; U.S. 5,432,183)이 유도체화를 통해 달성되었다. 그러나, 화학적 변형은 라파마이신 주형의 상당한 양을 필요로 하고, 염기 및 산에 불안정한(labile) 화합물이기 때문에, 작업하기가 어렵다. 화학적 유도체화는 그룹 선택적(group selective)일 수 있으나, 종종 부위 선택적(site selective)이기는 어려울 수 있다. 결과적으로, 화학적 변형은 종종 복수의 보호 및 탈보호 단계들을 필요로 하며 다양한 수율로 혼합된 생성물을 생산할 수 있다.

신규한 라파마이신 유사체의 제조에 대한 생물학적 접근방법은 S. 히그로스코피쿠스로부터 유래된 라파마이신의 생합성 유전자 클러스터의 서열의 이용가능성(Aparicio et al., 1996; Schwecke et al., 1995)에도 불구하고, 생산하는 개체와 작업하면서 직면하는 어려움 때문에 초기에는 생산성이 낮았다(Lomovskaya et al., 1997; Kieser et al., 2000) . 본 발명자들에 의한 최근의 특허출원은 포스트 PKS 변형 유전자들의 조작에 의한 라파마이신 생합성 경로의 변형을 통해 이전에 접근가능했던 것에 비해 더 광범위한 라파마이신 유사체를 개시한다(WO 04/007709). 추가적인 유사체들이 또한 라파마이신 구조로 도입된 라파마이신 PKS의 천연 스타터 산에 대한 대용물을 공급하는 것에 의해 접근될 수 있다(WO 04/007709). 이 방법들은 라파마이신 분자 주위에 보다 많은 화학적 공간에 대한 접근을 제공하나, 이 기술은 타입 I 폴리케티드 신타아제 유전자에 의해 코딩되는 라파마이신 분자의 핵심 프레임워크의 변형을 허용하지 않는다.

생물변환(biotransformation) 및 파아지-기반 유전적 변형과 같은 다른 생물 학적 방법을 이용한 라파마이신 유사체의 분리가 또한 개시되었다. 돌연변이 균주 및 라파마이신 생산 균주로부터 미량의 대사물질의 분리는 다수의 라파마이신 유사체를 소량으로 제공했다. 이 균주들은 종종 수율이 낮고 라파마이신 유사체의 혼합물을 생산한다. S. 히그로스코피쿠스 NCIMB 40319의 배양 상층액으로부터 27-O-데스메틸라파마이신 및 27-데스메톡시라파마이신의 분리가 보고되었다(Box et al., 1995). 27-O-데스메틸라파마이신의 항진균 활성은 라파마이신보다 낮았으나 FKBP12 PPIase 활성의 억제는 증가된 것으로 보였다. 쥐 비장 T 세포의 ConA-촉진된 증식의 억제 및 쥐 비장 B 세포의 LPS-촉진된 증식의 억제는 라파마이신에 비해 감소되었다(Box et aL., 1995). 유사하게, 라파마이신 유사체인 프롤릴라파마이신, 27-O-데스메틸라파마이신 및 27-데스메톡시라파마이신(도 1에 기재된 바와 같은 라파마이신 분자의 번호부여 시스템)의 항진균 활성은 라파마이신보다 낮았다(Wong et al., 1998). 라파마이신 유사체(16-O-데스메틸라파마이신, 27-O-데스메틸라파마이신, 39-O-데스메틸라파마이신, 16,27-O-비스데스메틸라파마이신, 프롤릴라파마이신, 26-O-데스메틸프롤릴라파마이신, 9-데옥소라파마이신, 27-데스메톡시라파마이신, 27-데스메톡시-39-O-데스메틸라파마이신, 9-데옥소-27-데스메톡시라파마이신, 28-디히드로라파마이신, 9-데옥소-27-데스메톡시-39-O-데스메틸라파마이신)가 또한 배양에 시토크롬 P450 억제제의 첨가 및/또는 전구체 공급 후에 또는 분리된 라파마이신의 생물 전환 후에 액티노플라네스(Actinoplanes) sp. N902-109로부터 분리되었다(Nishida et al., 1995). 그러나, 그와 같은 억제제의 이용은 특정 효소 기능의 표적화를 가능하게 할 뿐이고 부위 선택적은 아니어서 생성물의 혼합물이 수 득된다. 단일의 선택된 유사체의 합리적인 생산은 이 방법을 통해 가능하지 않다. 단일의 원하는 생성물이 아닌, 결과적인 라파마이신 유사체의 혼합물의 생성은 또한 수율에 영향을 미친다. 라파마이신 화합물의 혼재된 림프구 반응(Mixed Lymphocyte Reaction: MLR) 억제 활성을 평가하였고 C27 또는/및 C16에서 메틸 기의 상실 후에 활성에 대한 영향은 거의 검출되지 않았다. 활성의 보다 유의성 있는 감소가 9-데옥소라파마이신의 경우 관찰되었고; 추가적으로, C27에서의 메틸 기의 상실, C28에서의 히드록시 기의 상실 및 피페콜산-유래 기의 프롤릴기에 의한 치환은 모두 활성 강도(potency)의 감소를 가져왔다(Nishida et al., 1995). 유사하게, 라파마이신의 생물전환 및 16,39-O-비스데스메틸라파마이신의 분리가 보고되었다(WO 94/09010). 시클로헥실 고리에서 변형된 화합물, 예를 들면, 39-O-데스메틸라파마이신 및 SDZ RAD 및 CCI-779와 같은 C40 변형에 의한 세포 증식 분석에서 일부 억제 활성의 보유는 라파마이신의 이 영역이 면역억제 및 항암 특성을 모두 갖는 신규한 라파마이신 유사체의 생성에 대한 표적이라는 것을 확인한다.

시클로헥산카르복시산, 시클로헵탄카르복시산, 시클로헥스-1-엔카르복시산, 3-메틸시클로카르복시산, 시클로헥스-3-엔카르복시산, 3-히드록시시클로헥스-4-엔카르복시산 및 시클로헵트-1-엔카르복시산을 라파마이신-생산 야생형 S. 히그로스코피쿠스의 배양에 제공한 후 신규한 라파마이신 유사체가 보고되었고 이는 라파마이신 폴리케티드 신타아제의 로딩 모듈에서 유연성을 입증한다(PAS. Lowden, Ph. D dissertation, University of Cambridge, 1997; Lowden et a/., 2004). 이와 같은 신규한 라파마이신 유사체들은 천연의 스타터, 4,5-디히드록시시클로헥스-1-엔카르 복시산과 경쟁하여, 감소된 수율 및 혼합된 생성물로 생성되었다.

라파마이신을 생산하는 S. 히그로스코피쿠스 NRRL5491의 배양에 L-피페콜산의 생산을 억제하기 위해 (±)니페코트산을 공급하고 황-함유 피페콜산 유사체 (S)-1,4-티아진-3 카르복시산 또는 (S)-1,4-티아진-4 카르복시산을 동시-공급하는 것에 의해 라파마이신의 두 개의 신규한 황-함유 라파마이신 유사체를 분리하였다 (Graziani et al., 2003).

파아지 기술에 의해 매개된 생물학적 방법을 이용하여, 다양한 라파마이신 유사체를 생산하는 두 개의 재조합 S. 히그로스코피쿠스의 분리가 보고되었다 (Lomovskaya et al., 1997). 첨가된 프롤린 유사체의 존재 하에, S. 히그로스코피쿠스 rapL 결실 돌연변이는 신규한 라파마이신 유사체인 프롤릴라파마이신, 4-히드록시프롤릴라파마이신 및 4-히드록시프롤릴-26-데스메톡시-라파마이신을 합성하였다(Khaw et al., 1998). 유사하게, 신규한 라파마이신인 3-히드록시-프롤릴-라파마이신, 3-히드록시-프롤릴-26-데스메톡시-라파마이신, 및 트랜스-3-아자-비시클로 [3,1,0]헥산-2-카르복시산 라파마이신이 WO 98/54308에 기재된 것과 동일한 돌연변이 균주의 유가식 배양(fed culture)로부터 확인되었다. 프롤릴라파마이신 및 4-히드록시프롤릴-26-데스메톡시-라파마이신의 활성을 증식 분석에서 평가하고 후자의 화합물, 4-히드록시프롤릴-26-데스메톡시-라파마이신의 억제 활성은 라파마이신의 활성보다 상당히 낮았다(Khaw et al., 1998). 파아지에 기초한 방법을 이용하여 S. 히그로스코피쿠스 ATCC29253에서 다섯 개의 인접한 유전자들, rapQONML(C16, C27에서 포스트-폴리케티드 변형 및 L-피페콜산의 생산을 담당함)의 결실 및 그들의 네 오마이신 저항성 마커에 의한 치환은 피페콜산 공급시 16-O-데스메틸-27-데스메톡시 라파마이신의 생산을 가져왔다(Chung et al., 2001). 이 결실 돌연변이의 보완(complementation)은 입증되지 않았다. 또한, RapM 및 RapQ의 어느 것의 부위-특이성도 이 연구에서 확인되지 않았고; 따라서, C16-OH 또는 C27-OH에서의 메틸화를 요구하는 라파마이신 유사체의 합리적인 설계는 Chung 등(2001)에 의해 가능하지 않았다. 파아지-기초 방법은 하기에서 보다 상세하게 기술되고 유전자 서열의 개시 후 9년간 단 세 종의 재조합 S. 히그로스코피쿠스의 생산이 보고되었다는 것에 의해 설명되듯이 다수의 단점을 갖는다. 이 방법은 유전적으로 조작된 균주를 수득하는 어렵고 장시간 소요하는(protracted) 방법을 제공하고 본 발명자들에 의한 보다 선행된 출원(WO 04/007709)에 개시된 방법에 비해 그 유용성이 훨씬 더 제한된다.

생물학적 방법을 이용하여 라파마이신 변형 유전자를 조작하는 통상적인 접근방법은 숙주 균주의 염색체에서 개별 유전자의 돌연변이 또는 결실 및/또는 개별 유전자의 동종 기원 또는 이종 기원 유전자의 추가적인 카피의 개별유전자로서 또는 유전자 카세트로서의 삽입을 포함한다(WO 01/79520, WO 03/048375). 그러나, 그와 같은 생물학적 방법을 이용한 신규한 라파마이신 유사체의 분리는 라파마이신-생산 개체인 S. 히그로스코피쿠스를 형질전환시키는 어려움 때문에 제한적이었다. 플라스미드 DNA에 의한 형질전환 또는 접합 전달(conjugal transfer)의 통상적으로 이용되는 방법은 라파마이신-생산 균주에서 성공적이지 않았다(Lomovskya ef al., 1997, Schwecke et al., 1995, Kieser et al., 2000). WO 04/007709의 개시 이전의 최신 기술은 S. 히그로스코피쿠스로 전달되는 클로닝된 DNA의 크기에 의해 크게 제 한되는 노동 집약적인 파아지-기초 방법(work intensive phage based method)인 Lomovskya 등(1997)의 방법을 이용했다(Kieser et al., 2000). 이 기술은 최대 약 6.4 kbp의 클로닝된 DNA의 전달로 제한된다. 따라서, 이 기술을 이용하여 결실 돌연변이를 보충하는 경우, 기술자는 이 크기 제한 내에서 유전자 물질을 포함시킬 수 있는 것으로 제한되며, 예를 들면, 보완은 원하는 프로모터, 상동성(homology) 영역(필요한 경우) 및 저항성 마커 외에 두 개의 전형적인 기능성 유전자(일반적으로 각각 크기가 약 1 kbp임)로 제한된다. WO 04/007709는 라파마이신 생합성 유전자 클러스터를 포함하는 스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스 아종. 히그로스코피쿠스 NRRL5491과 같은 종의 효율적인 형질전환을 위한 재조합 기술 방법의 최초의 설명을 개시하였다. 그 이전에, 라파마이신 생합성 유전자 클러스터에 대한 유전 정보는 1995년(Schwecke et al., 1995) 이후 이용가능했으나, 현재까지 이 분야에서 제한적인 진보가 이루어졌을 뿐이다(Khaw et al., 1998; Chung ef al., 2001; WO 01/34816). WO 04/007709는 라파마이신 생합성 경로를 조작하고 포스트-PKS 처리의 양이 특이적으로 변화되는 결실 돌연변이의 보완 및 선택적으로 적어도 rapK가 결실되거나 불활성화된 균주에 외래의 스타터 산을 공급하는 것에 의해 다수의 라파마이신 유사체를 생산하는 방법을 기술한다.

이전의 연구는 폴리케티드 신타아제(PKS) 유전자는 원칙적으로 신규한 폴리케티드를 제공할 목적으로 조잘될 수 있다는 것을 보여주었다. 이와 같은 변형은 하기를 포함한다:

ㆍ결실: 사카로폴리스포라 에리트라에아(Saccharopolyspora erythraea)에서 에리트로마이신-생성(ery) PKS의 모듈 5에서 KR 도메인의 DNA 코딩 부분의 인-프레임 결실(in-frame deletion)은 에리트로마이신 유사체, 즉, 5,6-디데옥시-3-α-미카로실-5-옥소에리트로놀리드 B 및 5,6-디데옥시-5-옥소에리트로놀리드 B의 형성을 가져오는 것으로 확인되었다(Donadio et al., 1991).

ㆍ 개별 도메인의 불활성화: ery PKS의 모듈 4의 ER 도메인에서 상응하는 PKS-코딩 DNA의 유전자 조작에 의한 활성 부위 잔기들의 변형 및 사카로폴리스포라 에리트라에아로의 도입은 6.7-안히드로트로마이신 C(6.7-anhydroerythromycin C)의생산을 가져왔다(Donadio et al., 1993).

ㆍ 로딩 모듈 스왑: WO 98/01546는 신규한 에리트로마이신 유사체를 제조하기 위해 상이한 스타터 유닛을 도입시키는 하이브리드 타입 I PKS 유전자를 제조하기 위해 ery PKS의 로딩 모듈을 아베르멕틴(ave) PKS로부터의 로딩 모듈로 치환하는 것을 개시한다. 하이브리드 타이락톤(tylactone) 로드/플라테놀리드 폴리케티드 신타아제가 생성되어(Kuhstoss et al., 1996) 메틸말로닐-CoA에 대한 타이락톤 로딩 모듈의 특이성을 성공적으로 플라테놀리드 분자로 이전시켰다. KS^Q의 기능의 규명(Bisang et al., 1999) 및 KS^Q-함유 로딩 모듈의 조작이 WO 00/00618에 개시된다. 스피노신(spinosyn) 생합성 경로에서 로딩 모듈 스왑은 또한 WO 03/070908에 기재되었다.

ㆍ AT 스왑: Oliynyk 등(1996) 및 WO 98/01546은 에리트로마이신 모듈 1 AT가 라파마이신 모듈 2의 AT 도메인에 의해 치환되고 신장(extender) 유닛에 대한 모듈 1의 특이성도 이에 따라 변형된 AT 도메인 스왑을 기재한다. 예를 들면, 에리트로마이신 폴리케티드 신타아제(WO 98/01546, Ruan et al., 1997; Stassi et al., 1998) 및 스피노신 폴리케티드 신타아제(WO 03/070908)에서의 추가적인 AT 도메인 스왑이 기재되었다.

ㆍ 환원적 루프 스왑(Reductive Loop Swap): 예를 들면, 각 응축 동안 형성된 β-케토 기의 환원적 처리의 양의 변화가 WO 98/01546, WO 00/01827 및 Kao 등 (1997)에 기재되었다.

ㆍ 도메인 스왑 방법들의 조합이 McDaniel 등(1999)에 예시된다.

ㆍ 부위-지향 돌연변이유발(Site-directed mutagenesis): WO 02/14482, Reeves 등(2001), Reid 등(2003) 및 Del Vecchio 등(2003)은 특정 잔기의 선택적 돌연변이에 의해 AT 도메인의 기질 특이성에 영향을 줄 수 있다는 것을 보여주었다.

ㆍ 고리 수축(Ring contraction): 예를 들면, 불완전한 모듈형 폴리케티드 신타아제를 이용하거나(Kao et al., 1994) 또는 에리트로마이신 PKS의 모듈 1, 2, 3, 5 또는 6의 하류로 에리트로마이신 사슬 종료 티오에스테라아제를 이동시키는 것은(Cortes et al., 1995; Kao et al., 1995; Kao et al., 1996; Bohm et al., 1998) 예상되는 절단형 에리트로마이신 분자의 생성을 가져온다.

ㆍ 고리 확장(Ring expansion): 에리트로마이신 PKS 모듈 1 및 2 사이에 있는 에리트로마이신 PKS의 제1 ORF로 라파마이신 모듈을 삽입하면 예상되는 16-원 마크롤리드(16-membered macrolide)의 생산이 초래된다(Rowe et al., 2001).

PKS 클러스터의 변형은 전술된 것들에 한정되지 않는다.

그러나, PKS 유전자의 모든 조작이 예상되는 신규한 유사체를 생산할 수 있는 것은 아니라는 것이 확인되었다. Donadio 등(1993)이 에리트로마이신 PKS의 에노일 리덕타아제(ER)을 불활성화시켰을 때, 이는 더 이상 미카로오스-O-메틸트랜스퍼라아제의 기질이 아니기 때문에, 결과물인 안히드로-유사체(anhydro-analogue)는 완전히 처리되지 않았다. 유사하게, 폴리케티드 스타터 유닛을 변화시키는 것은 아미콜라톱시스 메디테라네이(Amycolatopsis mediterranei)에서 리파마이신 유사체의 완전한 신장(elongation) 및 합성(elaboration)을 방해했다(Hunziker et al., 1998).

라파마이신 유사체가 생합성 클러스터에서 폴리케티드 신타아제 유전자를 조작하는 것에 의해 제조될 수 있다면, 그들은 흥미로운 생물학적 활성을 가질 것으로 예상되기 때문에 매우 바람직할 것이다.

라파마이신 생합성 클러스터의 서열은 1995년에 최초로 발표되었다(Schwecke et al.; Aparicio et al., 1996). 전술된 PKS의 조작에 대한 종래 기술의 풍부함에도 불구하고, 현재까지 라파마이신 클러스터의 핵심 폴리케티드 신타아제의 성공적인 폴리케티드 조작에 관한 보고는 없었다. 라파마이신 생산균주인 S. 히그로스코피무스는 조작하기에 어려운 개체이다(Lomovskaya et al., 1997).

17-데스메틸라파마이신을 생산하도록 변형된 숙주 세포가 미국특허 제6,670,168호에서 청구되었으나, 이 특허는 그와 같은 균주가 모듈 10의 AT 도메인의 치환에 의해 작제될 수 있다는 가설 외에, 이 화합물이 어떻게 제조될 수 있는 지에 관한 상세한 설명이나 구현 실시예(working example)는 포함하지 않는다. 이 위치에서의 치환이 가설적으로 17-데스메틸라파마이신을 가져온다는 사실은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 자명하나, 그와 같은 치환이 전술된 어려움들을 고려할 때 어떻게 이루어질 수 있는지는 명확하지 않고, 이 효과에 대한 교시는 미국특허 제6,670,168호에서 제공되지 않았다. S. 히그로스코피쿠스로 작업하는데 따른 공지된 어려움 및 그와 같은 재조합 숙주 균주가 어떻게 생성될 수 있는지에 대한 상세한 설명의 부재를 고려할 때, 이는 동 저자들이 그와 같은 균주의 개시로 가능하게 하기 보다는 달성하고자 하는 것에 대한 기술에 불과하다는 것이 명확하다. 또한, 미국특허 제6,670,168호는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 17-데스메틸라파마이신이 어떻게 제조 또는 분리될 수 있는지에 관한 어떠한 교시도 제공하지 않는다. 라파마이신 유사체의 생합성에 관한 최신 기술은 포스트 PKS 변형 효소들을 코딩하는 유전자가 조작되는 WO 04/007709 및 라파마이신으로의 도입을 위한 외래 스타터 산의 공급을 기술하는 관련 출원들로 한정된다. 라파마이신의 PKS를 조작하는 부문에서 진보의 전반적인 부족은 생산 개체인 S. 히그로스코피쿠스 NRRL5491의 형질전환의 기술적 어려움 때문이다.

본 발명은 17-데스메틸라파마이신 및 그의 유사체의 생성에 관한 것이다. 17-데스메틸라파마이신 유사체에 접근하기 위해서는 라파마이신 PKS의 조작이 요구된다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 현재의 상태 내에서 그와 같은 균주를 생산하기 위해서 요구되는 조작을 달성하는 것이 가능한 지 여부는 명확하지 않다. 본 발명에서, 초기 표적은 S. 히그로스코피쿠스 MG2-10의 조작이다. S. 히그로스코피쿠 스 MG2-10은 WO 04/007709 및 Gregory 등(2004)에 개시된 바와 같이 외래 산(exogenuous acid) 3,4-디히드록시시클로헥산카르복시산이 공급되면 라파마이신-전구체(pre-rapamycin)룰 생산한다. 이 개체의 조작은 외래 산 3,4-디히드록시시클로헥산카르복시산이 공급되면 17-데스메틸라파마이신-전구체(17-desmethylpre-rapamycin)를 생산하는 조작된 균주를 생성하기 위해 수행되었다. 본 발명이 속하는 기술분야의 현재 상태는 그와 같은 균주가 후기 유전자 카세트에 의한 보완을 위해 기본 균주(base strain)로서 어떻게 이용될 수 있는지(WO 04/007709) 및/또는 외래 산을 공급하고 추가적인 라파마이신 유사체를 생성하기 위한 기본 균주로서(WO 04/007709) 어떻게 이용될 수 있는지를 교시하나, 그와 같은 균주가 PKS 조작에 의해 S. 히그로스코피쿠스에서 어떻게 생성될 수 있는지는 교시하지 않는다. 본 발명은 놀랍게도, Oiiynyk 등, 1996에기술된 것과 유사하게, 라파마이신 PKS에 대한 PKS 조작 방법의 성공적인 적용을 기술한다. 이 재조합 DNA 기술들이 이전에는 S. 히그로스코피쿠스에 성공적으로 적용된 바 없었기 때문에, 이는 예기치 않은 결과이다. 17-데스메틸-라파마이신 전구체 유사체의 생산을 위한 균주의 생성은 후기 유전자 카세트(WO 04/007709)에 의한 보완을 위해 유용한 기본 균주 및/또는 외래 산을 공급하기 위한 기본 균주(WO 04/007709)로서 유용하다. 이 라파마이신 유사체 각각은 그 후 반-합성(semi-synthesis)에 의해 더 변형될 수 있다. 이는 라파마이신 유사체의 라이브러리를 생성하기 위해 이용될 수 있는 진정한 조합 방법이 하나 이상의 하기 수준에서 변형될 수 있다는 것에 대한 최초의 입증이다: PKS 조작 수준, 보조(auxiliary) 유전자 수준, 스타터 산 결합, 아미노산 결합 및 반-합 성에 대해 접근가능한, 분자 상의 접근가능한 화학적 기능기.

일 양태에서, 본 발명은 17-데스메틸라파마이신 및 그의 유사체를 제공하고, 특히, 본 발명은 하기 식을 가지며:

식 중에서:

x는 직접 결합, -CH₂-, -S-CH₂-, -CH₂-S- 또는 -S(=O)-CH₂-을 나타내고;

또는 -CHR₅-X-CHR₆- 는

를 나타내며;

R₁은 =0 또는 (H, H)를 나타내고;

R₂는 OH 또는 OMe를 나타내며;

R₃는 H, OH 또는 OMe를 나타내고;

R₄는 하기의 A, B, C, D, E 및 F 기로부터 선택되는 구조적 단편을 나타내며,

식 중에서

파형의 선(wavy line)은 상기 단편의 결합 위치를 나타내고,

R₇은 H, OH 또는 OMe를 나타내며

R₈은 H, OH, OMe, 할로, 티올 또는 C₁ _-4 알킬을 나타내고;

또는 R₄는 대안적으로 O, S 및 N으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 헤테로 원자를 포함하는 5- 내지 7-원 헤테로사이클을 나타내며, 상기 헤테로사이클은 선택적으로 C₁ _-4 알킬, OH, F 및 Cl로부터 선택되는 하나 이상의 치환기에 의해 치환되고;

R₅ 및 R₆는 각각 독립적으로 H 또는 OH인 것인 17-데스메틸라파마이신 유사체, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 유도체를 제공한다.

추가적인 양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법을 이용하여 생성된 17-데스메틸라파마이신의 라이브러리를 제공한다.

신규한 라파마이신 유사체는 면역억제제, 항진균제, 항암제, 항염제, 신경재생제 또는 이식 거부, 이식편-대-숙주 질병, 자가면역 질환, 혈관 질환 및 섬유증(fibrotic disease)의 치료용 작용제 또는 상처 치료의 제어에서의 용도를 위한 작용제로서 유용한 화합물을 생산하기 위해 직접적으로 및 추가적인 반-합성 또는 생물전환(bioconversion)을 위한 주형으로서 유용하다.

추가적인 양태에서, 본 발명은 17-데스메틸라파마이신 또는 그의 유사체의 의약에서의 용도를 제공한다. 추가적인 양태에서, 본 발명은 면역억제의 유도 또는 유지, 신경세포 재생의 촉진 또는 암, B-세포 악성종양, 진균성 감염증, 이식 거부, 이식편-대-숙주 질병, 자가면역 질환, 염증성 질병, 혈관 질병 또는 섬유증의 치료 또는 상처 치료의 제어를 위한 약제의 제조에서의 17-데스메틸라파마이신 또는 그의 유사체의 용도를 제공한다.

일 구체예에서, 17-데스메틸라파마이신 또는 그의 유사체는 면역억제의 유도 또는 유지, 신경세포 재생의 촉진 또는 암, B-세포 악성종양, 진균성 감염증, 이식 거부, 이식편-대-숙주 질병, 자가면역 질환, 염증성 질병, 혈관 질병 또는 섬유증의 치료 또는 상처 치료의 제어를 위한 조합 요법(combination therapy)에서 이용된다.

본 발명은 또한 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 17-데스메틸라파마이신 또는 그의 유사체 또는 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

추가적인 양태에서, 본 발명은 또한 17-데스메틸라파마이신 또는 그의 유사체를 생산하는 방법을 제공하고, 상기 방법은:

(a) 라파마이신 PKS의 모듈 10의 메틸말로닐-CoA 특이적 AT 도메인을 말로닐-CoA-특이적 AT 도메인으로 치환하는 단계,

(b) 상기 조작된 라파마아신 PKS를 적합한 숙주 세포에서 발현시키는 단계,

(c) 선택적으로 외래 전구체를 공급하는 단계를 포함하는, 17-데스메틸라파마이신 또는 그의 유사체가 생산되는 조건 하에서 상기 숙주 세포를 배양하는 단계,

(d) 선택적으로 상기 생산된 화합물을 분리하는 단계를 포함한다.

바람직한 구체예에서, 말로닐-CoA 특이적 AT 도메인은 하기 클러스터 중 하나로부터 선택된다: 라파마이신, 모넨신, 스피노신, FK506, 에리트로마이신, FK520, 암포테리신, 안골라마이신(angolamycin), 틸로신(tylosin), 'hyg', FK523, 메리다마이신, 안타스코미신, FK525 및 추쿠바마이신(tsukubamycin). 보다 바람직한 구체예에서, 말로닐-CoA 특이적 AT 도메인은 하기의 클러스터 중 하나로부터 선택된다: 라파마이신, 모넨신 및 FK506. 보다 더 바람직한 구체예에서, AT 도메인은 라파마이신 모듈 2, 모넨신 모듈 3, 모넨신 모듈 6, 모넨신 모듈 8, FK506 모듈 3 및 FK506 모듈 7로 구성된 군으로부터 선택된다. 가장 바람직한 구체예에서, 말로닐-CoA 특이적 AT 도메인은 라파마이신의 모듈 2로부터 유래한다.

본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 이 형질전환이 임의의 타입 I PKS 또는 혼합된 NRPS/PKS로부터의 다수의 말로닐-CoA 선택적 아실 트랜스퍼라아제 도메인 중 하나로 시도될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 또한 모듈 10 AT에 의한 말로닐-CoA의 도입은 그 특이성을 변경시키기 위해, 예를 들면, WO 02/14482에 기재된 방식을 이용하거나 또는 모듈 10 전체를 말로닐-CoA에 대해 선택적인 AT 도메인을 포함하는 모듈로서, 상기 모듈은 천연 모듈 및 조합 모듈(combinational module)을 포함하는 것인 모듈로 치환하는 것에 의해 원형의(native) rap AT10에 돌연변이를 유발하는 것에 의해 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다.

추가적인 양태에서, 본 발명은 모듈 10의 메틸말로닐-CoA 특이적 AT 도메인이 말로닐-CoA 특이적 AT 도메인으로 치환된 것인 조작된 라파마이신 폴리케티드 신타아제를 코딩하는 생합성 클러스터를 포함하는 재조합 균주를 생성하는 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 말로닐-CoA 특이적 AT 도메인은 하기의 PKS 클러스터 중 하나로부터 선택된다: 라파마이신, 모넨신, FK506, 에리트로마이신, FK520, 암포테리신, 안골라마이신, 틸로신, 'hyg', FK523, 메리다마이신, 안타스코미신, FK525 및 추쿠바마이신. 보다 바람직한 구체예에서, 말로닐-CoA 특이적 AT 도메인은 하기의 클러스터 중 하나로부터 선택된다: 라파마이신, 모넨신 및 FK506. 보다 더 바람직한 구체예에서, AT 도메인은 라파마이신 모듈 2, 모넨신 모듈 3, 모넨신 모듈 6, 모넨신 모듈 8, FK506 모듈 3 및 FK506 모듈 7로 구성된 군으로부터 선택된다. 가장 바람직한 구체예에서, 말로닐-CoA 특이적 AT 도메인은 라파마이신의 모듈 2로부터 유래한다.

S. 히그로스코피쿠스 MG2-10(그 생성은 WO 04/007709 및 Gregory et al., (2004)에 개시됨)에서 라파마이신 폴리케티드 신타아제 경로의 조작은 본 명세서에서 예시되었으나, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 이 방법들이 야생형 S. 히그로스코피쿠스 NRRL5491 및 기타 관련된 균주에 동등하게 적용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 바람직하게는, 유전적으로 조작된 균주는 S. 히그로스코피쿠스 MG2-10 및 S. 히그로스코피쿠스 NRRL 5491로 구성된 군으로부터 선택된다.

17-데스메틸라파마이신 및 그의 유사체를 생산하는 방법 및 유전적으로 조작된 라파마이신 폴리케티드 신타아제를 코딩하는 생합성 클러스터를 포함하는 재조합 균주를 생성하는 방법을 제공하는 본 발명의 전술된 양태들의 구체예는 하기의 추가적인 단계들을 포함한다:

(a) 도입될 AT를 적합한 플랭킹 제한 부위(flankign restriction site)를 갖는 단일의 DNA 단편으로 분리하는 단계,

(b) 적합한 제한 부위를 이용하여 표적 AT의 플랭킹 서열에 상동한 DNA 서열의 영역을 증폭하고 분리하는 단계,

(c) 상기 단계 (a) 및 (b)에 기술된 바와 같은 세 개의 DNA 단편들을 라이게이션하여 LHS 상동성 및 이어진 공여 AT 도메인 및 RHS 상동성의 인-프레임 서열을 생성하는 단계,

(d) 상기 단계 (c)로부터의 완전한 서열을 숙주 균주로 도입하기 위해 벡터에 도입하여 최종 플라스미드를 생성하고, 상기 플라스미드는:

i) 접합을 위한 oriT,

ii) 하나 이상의 저항성 마커,

iii) 통합체(integrant)가 37℃에서의 배양에 의해 선택될 수 있게 하는 온도 민감성 복제 원점, 및

iv) 대장균의 복제 원점;을 포함하는 것인 최종 플라스미드를 생성하는 단계,

(e) 상기 단계 (d)에 기재된 바와 같은 최종 플라스미드를 이용하여 접합에 의해 상기 숙주 균주를 형질전환시키는 단계,

(f) 적합한 항생제에 대한 저항성에 의해 형질전환체를 선택하는 단계,

(g) 항생제 선택 하에 37℃에서 배양하여 일차적인 통합체(primary integrant)을 생성하는 단계,

(h) 항생제 선택의 부재 하에 37℃에서 배양하여 이차적인 재조합체(secondary recombinant)를 생성하는 단계,

(i) 표적 생성물을 생산하는 능력에 의해 원하는 균주를 확인하는 단계 및

(j) 선택적으로, 표준 방법에 의해 상기 균주의 유전학적 특성(genetics)을 확인하는 단계.

또 다른 양태에서, 본 발명은 17-데스메틸라파마이신 유사체를 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은:

(a) 라파마이신 PKS의 모듈 10의 메틸말로닐-CoA 특이적 AT 도메인이 말로닐-CoA 특이적 AT 도메인으로 치환된 재조합 균주를 생성하는 단계, 및;

(b) 폴리케티드 생산에 적합한 조건 하에서 상기 재조합 균주의 배양에 비-천연 스타터 산(non-natural starter acid)을 공급하는 단계, 및;

(c) 선택적으로, 그에 의해 생성된 화합물을 분리하는 단계;를 포함한다.

따라서, 본 발명은 비-천연 스타터 산을 도입한 17-데스메틸라파마이신 유사체를 생성하는 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 재조합 균주는 rapK가 결실되거나 또는 불활성화되었다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 재조합 균주는 rapK가 결실되거나 또는 불활성화되었고, 이 균주에 공급된 비-천연 스타터 산은 시클로헥산카르복시산, 3-메틸시클로헥산카르복시산, 시클로헵탄카르복시산, 3-플루오로-4-히드록시시클로헥산카르복시산, 4-플루오로-3-히드록시시클로헥산카르복시산, 3-클로로-4-히드록시시클로헥산카르복시산 및 4-클로로-3-히드록시시클로헥산카르복시산으로 구성된 군으로부터 선택된다.

일 구체예에서, 그 균주는 17-데스메틸라파마이신을 생산하는 재조합 S. 히그로스코피쿠스 숙주 세포가 아니다. 또 다른 구체예에서, 그 균주는 외래의 전구체의 제공 없이 17-데스메틸라파마이신을 생산하는 재조합 S. 히그로스코피쿠스 숙주 세포가 아니다.

(a) (보다 상세하게 전술된 바와 같이) 라파마이신 PKS의 모듈 10의 메틸말로닐-CoA 특이적 AT 도메인이 말로닐-CoA 특이적 AT 도메인으로 치환된 재조합 균주를 생성하는 단계,

(b) rapI, rapJ, rapK, rapL, rapM, rapN, rapO 및 rapQ로부터 선택된 하나 이상의 라파마이신 보조(auxiliary) 유전자를 추가적으로 결실시키거나 또는 불활성화시키는 단계,

(c) 17-데스메틸라파마이신 유사체를 생산하기 위해, 필요한 경우 선택적으로 외래 전구체의 존재 하에 그에 의해 수득된 균주를 배양하는 단계, 및

(d) 선택적으로 그에 의해 생산된 화합물을 분리하는 단계;를 포함한다.

대안적인 바람직한 구체예에서, 결실된 보조 유전자는 rapI, rapJ 및 rapQ이다. 대안적인 바람직한 구체예에서, 결실된 보조 유전자는 rapJ, rapM 및 rapQ이다.

(b) rapI, rapJ, rapK, rapL, rapM, rapN, rapO 및 rapQ로부터 선택된 하나 이상의 라파마이신 보조 유전자를 추가적으로 결실시키거나 또는 불활성화시키는 단계,

(c) 상기 결실을 완전히 또는 부분적으로 보완하기 위해 모든 보조 유전자 또는 일부(subset) 보조 유전자를 트랜스로 재도입하는 단계,

(d) 17-데스메틸라파마이신 유사체를 생산하기 위해, 필요한 경우, 선택적으로 외래 전구체의 존재 하에 그에 의해 수득된 균주를 배양하는 단계, 및

(e) 선택적으로, 그에 의해 생산된 화합물을 분리하는 단계;를 포함한다.

바람직한 구체예에서, 단계 (b)에서 모든 라파마아신 보조 유전자들은 결실되거나 또는 불활성화된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 재조합 균주는 rapI, rapJ, rapK, rapL, rapM, rapN, rapO 및 rapQ 또는 그들의 상동체(homologue)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 보조 유전자에 의해 유전적으로 보완된다. 특정한 구체예에서, 균주는 모든 보조 유전자에 의해 보완된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 재조합 균주는 rapK, rapM, rapN, rapO 및 rapL 또는 그들의 상동체(homologue)에 의해 유전적으로 보완된다. 대안적인 바람직한 구체예에서, 재조합 균주는 라파마이신 보조 유전자, rapK, rapI, rapN, rapO 및 rapL 또는 그들의 상동체에 의해 유전적으로 보완된다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 전술된 변형은 조합되고, 따라서, 본 발명은 17-데스메틸라파마이신 유사체를 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은:

(a) 라파마이신 PKS의 모듈 10의 메틸말로닐-CoA 특이적 AT 도메인이 말로닐-CoA 특이적 AT 도메인으로 치환된 재조합 균주를 생성하는 단계,

(c) 선택적으로, 상기 결실을 완전히 또는 부분적으로 보완하기 위해 모든 보조 유전자 또는 서브 세트의 보조 유전자를 트랜스로 재도입하는 단계,

(d) 폴리케티드의 생성을 위해 적합한 조건 하에서 상기 재조합 균주에 비-천연 스타터 산을 공급하는 단계, 및

바람직한 구체예에서, 결실되거나 또는 불활성화된 보조 유전자는 rapK를 포함한다.

바람직한 구체예에서, 단계 (b)에서 모든 라파마아신 보조 유전자들은 결실되거나 또는 불활성화된다. 특정한 양태에서, 본 발명은 모든 라파마이신 보조 유전자들이 결실되거나 또는 불활성화된 재조합 균주를 라파마이신 보조 유전자 rapI, rapJ, rapK, rapL, rapM, rapN, rapO 및 rapQ 또는 그들의 상동체에 의해 유전적으로 보완하여 rapK를 제외한 모든 보조 유전자들을 포함하는 균주를 생성하고 외래 스타터 산을 공급하여, 비-천연 스타터 산으로 17-데스메틸라파마이신을 생성하는 대안적인 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 외래의 비-천연 스타터 산은 시클로헥산카르복시산이다. 대안적인 바람직한 구체예에서, 비-천연 스타터 산은 3-메틸시클로헥산카르복시산이다. 대안적인 바람직한 구체예에서, 비-천연 스타터 산은 시클로헵탄카르복시산이다. 대안적인 바람직한 구체예에서, 비-천연 스타터 산은 3-플루오로-4-히드록시시클로헥산카르복시산, 4-플루오로-3-히드록시시클로헥산카르복시산, 3-클로로-4-히드록시시클로헥산카르복시산 및 4-클로로-3-히드록시시클로헥산카르복시산으로 구성된 군으로부터 선택된다.

추가적인 구체예에서, 본 발명은 보조 유전자 활성과 비-천연 스타터 산의 조합으로 17-데스메틸라파마이신 유사체를 제조하는 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 결실된 보조 유전자는 rapK, rapM 및 rapQ이고 이 균주에 공급된 비-천연 스타터 산은 시클로헥산카르복시산이다. 대안적인 바람직한 구체예에서, rapK, rapM 및 rapQ가 결실된 이 균주에 공급된 비-천연 스타터 산은 3-메틸시클로헥산카르복시산이다. 대안적인 바람직한 구체예에서, rapK, rapM 및 rapQ가 결실된 이 균주에 공급된 비-천연 스타터 산은 시클로헵탄카르복시산이다. 바람직한 구체예에서, 결실된 보조 유전자는 rapK, rapM 및 rapQ이고 이 균주에 공급된 비-천연 스타터 산은 3-플루오로-4-히드록시시클로헥산카르복시산, 4-플루오로-3-히드록시시클로헥산카르복시산, 3-클로로-4-히드록시시클로헥산카르복시산 및 4-클로로-3-히드록시시클로헥산카르복시산으로 구성된 군으로부터 선택된다.

또 다른 바람직한 구체예에서, 결실된 보조 유전자는 rapK, rapI 및 rapQ이고 이 균주에 공급된 비-천연 스타터 산은 3-메틸시클로헥산카르복시산, 시클로헥산카르복시산, 시클로헵탄카르복시산, 3-플루오로-4-히드록시시클로헥산카르복시산, 4-플루오로-3-히드록시시클로헥산카르복시산, 3-클로로-4-히드록시시클로헥산카르복시산 및 4-클로로-3-히드록시시클로헥산카르복시산으로 구성된 군으로부터 선택된다. 보다 더 바람직한 구체예에서, 결실된 보조 유전자는 rapK, rapI 및 rapQ이고 이 균주에 공급된 비-천연 스타터 산은 3-메틸시클로헥산카르복시산이다. 보다 더 바람직한 구체예에서, 결실된 보조 유전자는 rapK, rapI 및 rapQ이고 이 균주에 공급된 비-천연 스타터 산은 시클로헥산카르복시산이다.

대안적인 바람직한 구체예에서, 결실된 보조 유전자는 rapK 및 rapM이고 이 균주에 공급된 비-천연 스타터 산은 3-메틸시클로헥산카르복시산, 시클로헥산카르복시산, 시클로헵탄카르복시산, 3-플루오로-4-히드록시시클로헥산카르복시산, 4-플루오로-3-히드록시시클로헥산카르복시산, 3-클로로-4-히드록시시클로헥산카르복시산 및 4-클로로-3-히드록시시클로헥산카르복시산으로 구성된 군으로부터 선택된다. 보다 더 바람직한 구체예에서, 공급된 비-천연 스타터 산은 시클로헥산카르복시산이다.

또 다른 바람직한 구체예에서, 결실된 보조 유전자는 rapK, rapI 및 rapM이고 이 균주에 공급된 비-천연 스타터 산은 3-메틸시클로헥산카르복시산, 시클로헥산카르복시산, 시클로헵탄카르복시산, 3-플루오로-4-히드록시시클로헥산카르복시산, 4-플루오로-3-히드록시시클로헥산카르복시산, 3-클로로-4-히드록시시클로헥산카르복시산 및 4-클로로-3-히드록시시클로헥산카르복시산으로 구성된 군으로부터 선택된다. 보다 더 바람직한 구체예에서, 공급된 비-천연 스타터 산은 시클로헥산카르복시산이다.

대안적인 바람직한 구체예에서, 결실된 보조 유전자는 rapK, rapI, rapJ 및 rapQ이고 이 균주에 공급된 비-천연 스타터 산은 3-메틸시클로헥산카르복시산, 시클로헥산카르복시산, 시클로헵탄카르복시산, 3-플루오로-4-히드록시시클로헥산카르복시산, 4-플루오로-3-히드록시시클로헥산카르복시산, 3-클로로-4-히드록시시클로헥산카르복시산 및 4-클로로-3-히드록시시클로헥산카르복시산으로 구성된 군으로부터 선택된다. 보다 더 바람직한 구체예에서, 공급된 비-천연 스타터 산은 시클로헥산카르복시산이다.

대안적인 바람직한 구체예에서, 결실된 보조 유전자는 rapK, rapJ, rapM 및 rapQ이고 이 균주에 공급된 비-천연 스타터 산은 3-메틸시클로헥산카르복시산, 시클로헥산카르복시산, 시클로헵탄카르복시산, 3-플루오로-4-히드록시시클로헥산카르복시산, 4-플루오로-3-히드록시시클로헥산카르복시산, 3-클로로-4-히드록시시클로헥산카르복시산 및 4-클로로-3-히드록시시클로헥산카르복시산으로 구성된 군으로부터 선택된다. 보다 더 바람직한 구체예에서, 공급된 비-천연 스타터 산은 시클로헥산카르복시산이다.

추가적인 구체예에서, 본 발명은 천연 또는 비-천연 스타터 산의 공급과 조합되어, 모든 라파마이신 보조 유전자들이 결실되거나 또는 불활성화된 재조합 균주를 라파마이신 보조 유전자 rapI, rapJ, rapK, rapL, rapM, rapN, rapO 및 rapQ 또는 그들의 상동체에 의해 유전적으로 보완하는 단계에 의해 17-데스메틸라파마이신을 생성하는 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 상기 재조합 균주는 rapI, rapJ, rapN, rapO 및 rapL에 의해 유전적으로 보완되고 시클로헥산카르복시산, 3-메틸시클로헥산카르복시산, 시클로헵탄카르복시산, 3-플루오로-4-히드록시시클로헥산카르복시산, 4-플루오로-3-히드록시시클로헥산카르복시산, 3-클로로-4-히드록시시클로헥산카르복시산 및 4-클로로-3-히드록시시클로헥산카르복시산으로 구성된 군으로부터 선택된 비-천연 스타터 산이 공급된다. 바람직한 구체예에서, 상기 재조합 균주는 rapJ, rapN, rapO 및 rapL에 의해 유전적으로 보완되고 시클로헥산카르복시산, 3-메틸시클로헥산카르복시산, 시클로헵탄카르복시산, 3-플루오로-4-히드록시시클로헥산카르복시산, 4-플루오로-3-히드록시시클로헥산카르복시산, 3-클로로-4-히드록시시클로헥산카르복시산 및 4-클로로-3-히드록시시클로헥산카르복시산으로 구성된 군으로부터 선택된 비-천연 스타터 산이 공급된다.

대안적인 구체예에서, 상기 재조합 균주는 rapJ, rapM, rapN, rapO 및 rapL에 의해 유전적으로 보완되고 3-메틸시클로헥산카르복시산, 시클로헥산카르복시산, 시클로헵탄카르복시산, 3-플루오로-4-히드록시시클로헥산카르복시산, 4-플루오로-3-히드록시시클로헥산카르복시산, 3-클로로-4-히드록시시클로헥산카르복시산 및 4-클로로-3-히드록시시클로헥산카르복시산으로 구성된 군으로부터 선택된 스타터 산이 공급된다. 보다 더 바람직한 구체예에서, 공급된 스타터 산은 시클로헥산카르복시산이다.

대안적인 구체예에서, 상기 재조합 균주는 rapI, rapJ, rapN, rapO, rapQ 및 rapL에 의해 유전적으로 보완되고 3-메틸시클로헥산카르복시산, 시클로헥산카르복시산, 시클로헵탄카르복시산, 3-플루오로-4-히드록시시클로헥산카르복시산, 4-플루오로-3-히드록시시클로헥산카르복시산, 3-클로로-4-히드록시시클로헥산카르복시산 및 4-클로로-3-히드록시시클로헥산카르복시산으로 구성된 군으로부터 선택된 스타터 산이 공급된다. 보다 더 바람직한 구체예에서, 공급된 스타터 산은 시클로헥산카르복시산이다.

대안적인 구체예에서, 상기 재조합 균주는 rapJ, rapN, rapO, rapQ 및 rapL에 의해 유전적으로 보완되고 3-메틸시클로헥산카르복시산, 시클로헥산카르복시산, 시클로헵탄카르복시산, 3-플루오로-4-히드록시시클로헥산카르복시산, 4-플루오로-3-히드록시시클로헥산카르복시산, 3-클로로-4-히드록시시클로헥산카르복시산 및 4-클로로-3-히드록시시클로헥산카르복시산으로 구성된 군으로부터 선택된 스타터 산이 공급된다. 보다 더 바람직한 구체예에서, 공급된 스타터 산은 시클로헥산카르복시산이다.

대안적인 구체예에서, 상기 재조합 균주는 rapM, rapN, rapO 및 rapL에 의해 유전적으로 보완되고 3-메틸시클로헥산카르복시산, 시클로헥산카르복시산, 시클로헵탄카르복시산, 3-플루오로-4-히드록시시클로헥산카르복시산, 4-플루오로-3-히드록시시클로헥산카르복시산, 3-클로로-4-히드록시시클로헥산카르복시산 및 4-클로로-3-히드록시시클로헥산카르복시산으로 구성된 군으로부터 선택된 스타터 산이 공급된다. 보다 더 바람직한 구체예에서, 공급된 스타터 산은 시클로헥산카르복시산이다.

대안적인 구체예에서, 상기 재조합 균주는 rapI, rapN, rapO 및 rapL에 의해 유전적으로 보완되고 3-메틸시클로헥산카르복시산, 시클로헥산카르복시산, 시클로헵탄카르복시산, 3-플루오로-4-히드록시시클로헥산카르복시산, 4-플루오로-3-히드록시시클로헥산카르복시산, 3-클로로-4-히드록시시클로헥산카르복시산 및 4-클로로-3-히드록시시클로헥산카르복시산으로 구성된 군으로부터 선택된 스타터 산이 공급된다. 보다 더 바람직한 구체예에서, 공급된 스타터 산은 시클로헥산카르복시산이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 17-데스메틸라파마이신 유사체의 라이브러리를 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은:

(b) 선택적으로, rapI, rapJ, rapK, rapL, rapM, rapN, rapO 및 rapQ로부터 선택된 하나 이상의 라파마이신 보조 유전자를 결실시키거나 또는 불활성화시키는 단계,

(d) 다수의 17-데스메틸라파마이신 유사체를 생성하기 위해 상기 재조합 균주의 생산용 배양에 일련의 비-천연 스타터 산(an array of non-natural starter acids)을 공급하는 단계,

(e) 폴리케티드가 생산되도록 적합한 조건 하에서 상기 재조합 균주의 생산용 배양에 천연 아미노산 또는 신규한 아미노산을 공급하는 단계,

(f) 선택적으로, 그에 의해 생산된 화합물을 분리하는 단계, 및

(g) 선택적으로, 상기 분리된 라파마이신 유사체에 대해 반-합성을 수행하는 단계;를 포함한다.

하기의 설명, 실시예 및 청구항에서 본 발명의 전술된 구체예 및 기타 구체예들이 보다 상세하게 기술된다.

정의

관사인 "하나의("a" 및 "an)"는 본 명세서에서 하나 또는 하나보다 많은(즉, 하나 이상의) 관사의 문법적 대상을 의미하기 위해 이용된다. 예로서, "하나의 유사체(an analogue)"는 하나 이상의 유사체를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "유사체(들)(analogue(s))"는 구조적으로 유사하나 조성에 있어서 약간 상이한(하나의 원자의 치환 또는 특정한 기능기의 존재 또는 부재에 의해) 화학적 화합물을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "17-데스메틸라파마이신(17-desmethylrapamycin) 및 그 유도체"는 하기 식 I:

식 중에서:

또는 -CHR₅-X-CHR₆- 는

를 나타내며;

R₁은 =0 또는 (H, H)를 나타내고;

R₂는 OH 또는 OMe를 나타내며;

R₃는 H, OH 또는 OMe를 나타내고;

상기에서 파형의 선은 상기 단편의 결합 위치를 나타내고,

R₇은 H, OH 또는 OMe를 나타내며

R₈은 H, OH, OMe, 할로, 티올 또는 C₁ _-4 알킬을 나타내고;

R₅ 및 R₆는 각각 독립적으로 H 또는 OH인 것인 식 I의 범위 내의 화합물, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 유도체를 포함하도록 의도되고, 이하에서 상기 화합물들은 "본 발명의 화합물(compounds of the invention)"로 지칭된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "약학적으로 허용가능한 유도체(pharmaceutically-acceptable derivatives)"는 약학적으로 허용가능한 염(예를 들면, 산부가 염)을 포함한다. 이는 또한 용매화물(예를 들면, 수화물)에 대한 지칭을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "할로(halo)"는 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "티올(thiol)"은 SH 기를 포함한다.

달리 특정되지 않으면, 본 명세서에서 언급된 C₁ _-4 알킬기는 직쇄형(straight-chained)일 수 있고, 또는 충분한 수(즉, 3개 이상)의 C-원자들이 존재할 때 분지형(branched)일 수 있다. 그와 같은 C₁ _-4 알킬기는 추가적으로 하나 이상의 할로(예를 들면, 플루오로) 원자에 의해 치환될 수 있다.

R₄가 나타낼 수 있는 헤테로시클릭 기는 완전히 포화되거나, 부분적으로 불포화되거나, 전적으로(wholly) 방향족 또는 부분적으로 방향족이다. 그와 같은 기는 단일 고리(monocyclic) 또는 가능한 경우, 이중 고리(bicyclic)일 수 있다. 언급될 수 있는 헤테로시클릭 R4 기는 디옥사닐, 디옥솔릴, 푸라닐, 헥사히드로피리미디닐, 하이단토이닐(hydantoinyl), 이미다졸릴, 이속사졸리디닐, 이속사졸릴, 말레이미도, 모르폴리닐, 옥사디아졸릴, 1,2- 또는 1,3-옥사지나닐, 옥사졸릴, 피페라지닐, 피페리디닐, 피라닐, 피라지닐, 피라졸릴, 피리디닐, 피리도닐, 피리미디닐, 피롤리디노닐, 피롤리디닐, 피롤리닐, 피롤릴, 술폴라닐(sulfolanyl), 3-술폴레닐(3-sulfolenyl), 테트라히드로푸라닐, 테트라히드로피라닐, 3,4,5,6-테트라히드로피리디닐, 1,2,3,4-테트라히드로피리미디닐, 3,4,5,6-테트라히드로피리미디닐, 테트라졸릴, 티아디아졸릴, 티아졸리디닐, 티아졸릴, 티에닐, 트리아졸릴 및 그 등가물(예를 들면, 디옥사닐, 디옥솔릴, 헥사히드로피리미디닐, 하이단토이닐, 이속사졸리디닐, 말레이미도, 모르폴리닐, 피페라지닐, 피페리디닐, 피롤리디노닐, 피롤리디닐, 피롤리닐, 술폴라닐, 3-술폴레닐, 테트라히드로푸라닐, 테트라히드로피라닐, 3,4,5,6-테트라히드로피리디닐, 1,2,3,4-테트라히드로피리미디닐, 3,4,5,6-테트라히드로피리미디닐, 티아졸리디닐 및 그 등가물과 같은 포화된 또는 부분적으로 불포화된 기, 단일고리 기, 또는, 특히, 피페리디닐, 피롤리디닐, 테트라히드로푸라닐, 테트라히드로피라닐 및 그 등가물과 같은, N, S 또는 특히, O로부터 선택된 하나의 이종원자(heteroatom)을 포함하는 포화된, 단일고리 기)를 포함한다. 그러나, 본 발명의 화합물에 관한 특별한 구체예에서, R4는 A, B, C, D, E 및 F기로부터 선택된 구조적 단편이다(즉, 이는 헤테로시클릭 기를 나타내지 않음).

본 명세서에서 사용된 용어 "변형 유전자(modifying gene)"는 폴리케티드의 포스트-폴리케티드 신타아제 변형을 위해 요구되는 유전자, 예를 들면, 시토크롬 P-450 모노옥시게나아제, 페레독신 및 SAM-의존성 O-메틸트랜스퍼라아제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 라파마이신 시스템에서, 이 변형 유전자는 rapN, rapO, rapM, rapI, rapQ, 및 rapJ를 포함한다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 이 유전자들의 상동체가 관련된 생합성 유전자 클러스터에 존재하고 또한 본 발명의 방법에서 이 상동체 유전자의 이용이 고려된다는 것을 이해할 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "전구체 공급 유전자(precursor supply gene)"는 천연 또는 비-천연 전구체의 공급을 위해 요구되는 유전자, 천연 또는 비-천연적으로 도입되는(incorporated) 전구체의 합성을 위해 요구되는 유전자 및 천연 또는 비-천연적으로 도입되는 전구체의 도입(incorporation)을 위해 요구되는 유전자를 포함한다. 라파마이신 시스템에서, 예를 들면, 이 유전자들은 rapL, rapK, rapP 및 rapA를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 이 유전자들의 상동체가 관련된 생합성 유전자 클러스터에 존재하고 또한 본 발명의 방법에서 이 상동체 유전자의 이용이 고려된다는 것을 이해할 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "보조 유전자(auxiliary gene)"는 변형 유전자, 전구체 공급 유전자 또는 변형 유전자 및 전구체 공급 유전자 모두에 대한 지칭을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "전구체(precursor)"는 천연 스타터 산(즉, 4,5-디히드록시시클로헥스-1-엔카르복시산), 비-천연 스타터 산, 천연적으로 도입되는 아미노산(즉, 피페콜산, 프롤린), 비-천연적으로 도입되는 아미노산, 말로닐-CoA 및 메틸말로닐-CoA를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "비-천연 스타터 산(non-naturai starter acid)"은 통상적으로 PKS에 의해 선택되지 않는, 폴리케티드 합성에서 스타터 산으로 도입될 수 있는 임의의 화합물을 의미한다.

혼란을 방지하기 위해, 용어 "전구체(precursor)" 및 "비-천연 스타터 산(non-natural starter acid)"은 올리고케티드(예를 들면, 디케티드 ε 및 트리케티드)의 N-아실시스테아민 티오에스테르, 및 최종 생성물로 도입될 수 있는 카르복시산의 N-아실시스테아민 티오에스테르 또는 에스테르를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "천연 모듈(natural module)"은 KS 도메인에서 ACP 도메인까지의 일련의 인접한 도메인을 의미하며, KS-AT-ACP(순서대로 배열됨) 및 선택적으로, 하기로부터 선택된 하나 이상의 도메인을 추가적으로 포함한다: β-케토리덕타아제(KR) 도메인, KR 도메인 및 디히드라타아제(DH) 도메인, 및 KR 도메인, DH 도메인 및 에노일 리덕타아제(ER) 도메인.

본 명세서에서 사용된 용어 "조합형 모듈(combinatorial module)"은 천연 모듈의 일 지점으로부터 후속 모듈의 상응하는 지점까지 신장되는 일련의 인접한 도메인을 의미하며, 예를 들면, 모듈 A의 AT 도메인의 개시 부위로부터 모듈 B의 AT 도메인의 개시 부위까지, 또는 모듈 B의 AT 도메인의 중간(middle) 부위로부터 모듈 C의 KS 도메인의 중간 부위까지 신장된 일련의 인접한 도메인을 의미한다. 이와 같은 조합형 모듈은 "더블(double)" 또는 그보다 더 클 수 있고, 즉, 둘 또는 그 이상의 수의 천연 모듈을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "라파마이신-전구체(pre-rapamycin)"는 변형 유전자의 작용 전에 라파마이신 폴리케티드 신타아제(rapA, rapB, 및 rapC를 포함) 및 rapP의 활성에 의해 생성되는 최초의 효소-불포함 생성물(first enzyme-free product)을 의미하고, 특히, 하기의 구조를 갖는 화합물을 의미한다:

본 명세서에서 사용되는 용어, "자가면역 질환(autoimmune disorder)"은 전신성 낭창 적혈병(systemic lupus erythrematosis: SLE), 류마티즘성 관절염(rheumatoid arthritis), 중증 근무력증(myasthenia gravis) 및 다발성 경화증을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어 "염증성 질병(diseases of inflammation)"은 건선, 피부염, 습진, 지루(seborrhoea), 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease) (궤양성 대장염 및 크론씨병을 포함하나, 이에 한정되지 않음), 폐 염증(천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐기종, 급성 호흡곤란 증후군 및 기관지염을 포함함) 및 포도막염(eye uveitis)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어 "암(cancer)"은 상피에서 발생하거나, 피부에서 발견되고, 또는 보다 일반적으로는 신체 기관, 예를 들면, 유방, 전립선, 폐, 신장, 췌장, 위 또는 장의 내벽(lining)에서 발생하는 악성의 신생(malignant new growth)을 의미한다. 암은 인근 조직으로 침투하고 원격 기관, 예를 들면, 뼈, 간, 폐, 또는 뇌로 확산(전이)되는 경향이 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 암은 흑색종, 림프종, 백혈병, 섬유육종, 횡문근육종, 및 비만세포종과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 전이성 종양 세포들 및 대장암, 전립선암, 소세포 폐암(small cell lung cancer) 및 비-소세포 폐암, 유방암, 췌장암, 방광암, 신장암, 위암, 교모세포종, 원발성 간암 및 난소암과 같은, 그러나, 이에 한정되지 않는 조직 암종을 모두 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "B-세포 악성종양(B-cell malignancy)"은 만성 림프구성 백혈병(CLL), 다발성 골수종, 및 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma: NHL)을 포함하는 일군의 질병을 포함한다. 그들은 혈액 및 혈액 생성 기관의 신생 질환(neoplastic disease)이다. 그들은 골수 및 면역계 기능장애를 유발하여, 숙주를 감염 및 출혈에 매우 취약하게 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "혈관 질환(vascular disease)"은 과잉증식성 혈관 질환(예를 들면, 재협착 및 혈관 폐쇄), 이식편 혈관 죽상동맥경화(graft vascular atherosclerosis), 심혈관 질환, 뇌혈관 질환 및 말초혈관 질환(예를 들면, 관상동맥질환, 동맥경화증, 죽상동맥경화, 비죽종성 동맥경화증 또는 혈관벽 손상)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어 "신경세포 재생(neuronal regeneration)"은 신경 세포 성장의 촉진을 의미하고 신경 신경돌기 성장 및 신경 세포의 기능적 회복을 포함한다. 신경 재생이 중요한 치료적 효능을 갖는 질병 및 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴 무도병, 근위축성 측삭경화증, 삼차 신경통, 설인 신경통, 벨 안면신경마비, 근육성 이영양증, 뇌졸중, 진행성 근위축증, 진행성 구성 유전성 근위축증(progressive bulbar inherited muscular atrophy), 경부 척추증, 굴라인-바레 증후군(Gullain-Barre syndrome), 치매, 말초 신경병증 및 신체적 손상(예를 들면, 척수 손상 또는 외상, 말초 신경 손상, 좌골 신경 또는 안면 신경 병소 또는 손상) 또는 질병 상태(예를 들면, 당뇨병)에 의해 유발된 말초 신경 손상을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어 "섬유증(fibrotic disease)"은 세포외 기질(extracellular matrix)의 과다 생성과 연관된 질병을 의미하며 (한정됨 없이) 유육종증, 켈로이드, 사구체 신염, 말기 신장병(end stage renal disease), 간 섬유증(간경변, 알코올성 간질환 및 지방-간염(steato-heptatitis)을 포함하나 이에 한정되지 않음), 만성 이식편 신장병(ronic graft nephropathy), 혈관염, 심장 섬유증(cardiac fibrosis), 폐 섬유증(특발성 폐 섬유증 및 특발성 섬유성 폐포염을 포함하나, 이에 한정되지 않음), 시력 감퇴, 망막증(retinal and vitreal retinopathy) 및 화학요법 또는 방사선-유도 섬유증을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "상처 치료(wound healing)"는 피부 및 기타 연 조직에 대한 손상 후에 이어지는 치료 과정을 의미하며, 수술-후 상처 치료, 화상 치료 또는 비후성 또는 켈로이드성 상흔의 치료 및 수술성 유착(surgical adhesions)의 예방을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

발명의 상세한 설명

일 양태에서, 본 발명은 17-데스메틸라파마이신 및 그의 유사체를 제공하고, 특히, 본 발명은 하기의 식을 가지며:

식 중에서:

또는 -CHR₅-X-CHR₆- 는

를 나타내며;

R₁은 =0 또는 (H, H)를 나타내고;

R₂는 OH 또는 OMe를 나타내며;

R₃는 H, OH 또는 OMe를 나타내고;

상기에서 파형의 선은 상기 단편의 결합 위치를 나타내고,

R₇은 H, OH 또는 OMe를 나타내며

R₈은 H, OH, OMe, 할로, 티올 또는 C₁ _-4 알킬을 나타내고;

또는 R₄는 대안적으로 O, S 및 N으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 헤테로 원자를 포함하는 5- 내지 7-원 헤테로사이클을 나타내며, 상기 헤테로사이클은 선택적으로 C₁ _-4 알킬, OH, F 및 Cl로부터 선택되는 하나 이상의 치환기에 의해 치환되고; 및

R₅ 및 R₆는 각각 독립적으로 H 또는 OH인 것인 17-데스메틸라파마이신 유사체, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 유도체인 17-데스메틸라파마이신 유사체를 제공한다.

일 구체예에서, R₄는 앞서 정의된 바와 같은 A, B, C, E 및 F 기로부터 선택된 구조적 단편(예를 들면, A, C, E 및 F기로부터 선택된 구조적 단편)을 나타내고, R₇ 및 R₈은 앞서 정의된 바와 같다(예를 들면, R₇은 H, OH 또는 OMe를 나타내고, R₈은 H, OH, OMe, Cl 또는 F (H, OH, OMe 또는 F와 같은)를 나타냄).

또 다른 구체예에서, R₄는 하기의 A(i), C(i), E(i) 및 F(i)로 구성된 군으로부터 선택되는 구조적 단편을 나타내고:

상기에서, R₇ 및 R₈은 앞서 정의된 바와 같다(예를 들면, R₇은 H, 또는 OH를 나타내고, R₈은 H, OH, 또는 OMe를 나타낸다).

또 다른 바람직한 구체예에서, R₄는 R₈은 H이고, R₇은 H, OMe 또는, 특히, OH인 것인, 앞서 정의된 바와 같은 구조적 단편 C(i)을 나타낸다.

바람직한 구체예에서, R₅가 OH를 나타낼 때, R₆는 H를 나타내고, R₆가 OH를 나타낼 때, R₅는 H를 나타내며; x는 직접 결합 또는, 특히, CH₂를 나타낸다.

대안적인 구체예에서, R₂는 OH를 나타낸다.

대안적인 구체예에서, R₄는 4번 위치에 산소를 갖는 6-원 고리를 나타낸다(즉, 테트라히드로피란-4-일).

본 발명의 화합물의 바람직한 구체예는:

R₁은 (H, H) 또는 =0을 나타내고;

R₂는 OH 또는 OMe를 나타내며;

R₃은 OH 또는 OMe를 나타내고;

R₄는 R₇은 OH를 나타내고, R₈은 H, OH, 또는 OMe를 나타내는 앞서 정의된 바와 같은 구조적 단편 C(i)을 나타내며;

x는 CH₂를 나타내는 것인 화합물이다.

보다 더 바람직한 구체예에서:

R₁은 (H, H)를 나타내고;

R₂는 OH를 나타내며;

R₃은 H를 나타내고;

R₄는 R₇은 OH를 나타내고, R₈은 H를 나타내는 것인, 앞서 정의된 바와 같은 구조적 단편 C(i)을 나타내며;

x는 CH₂를 나타낸다.

바람직한 구체예에서:

R₁은 (H, H)를 나타내고;

R₂는 OH를 나타내며;

R₃은 H를 나타내고;

R₄는 R₇과 R₈은 모두 OH를 나타내는 것인 앞서 정의된 바와 같은 구조적 단편 C(i)을 나타내고;

x는 CH₂를 나타낸다.

보다 더 바람직한 구체예에서:

R₁은 (H, H)를 나타내고;

R₂는 OH를 나타내며;

R₃은 H를 나타내고;

R₄는 R₇은 OH를 나타내며 R₈은 F를 나타내는 것인 인, 앞서 정의된 바와 같은 구조적 단편 C(i)을 나타내고;

x는 CH₂를 나타낸다.

보다 더 바람직한 구체예에서:

R₁은 =0를 나타내고;

R₂는 OH 또는 OMe를 나타내며;

R₃은 H, OH 또는 OMe를 나타내고;

R₄는 R₇은 OH를 나타내며 R₈은 F 또는 Cl을 나타내는 것인 앞서 정의된 바와 같은 구조적 단편 C(i)을 나타내며;

x는 CH₂를 나타낸다.

보다 더 바람직한 구체예에서:

R₁은 =0를 나타내고;

R₂는 OH를 나타내며;

R₃은 OMe를 나타내고;

R₄는 R₇은 OH를 나타내며 R₈은 H를 나타내는 것인 앞서 정의된 바와 같은 구조적 단편 C(i)을 나타내며;

x는 CH₂를 나타낸다.

보다 더 바람직한 구체예에서:

R₁은 =0를 나타내고;

R₂는 OH를 나타내며;

R₃은 OH를 나타내고;

x는 CH₂를 나타낸다.

보다 더 바람직한 구체예에서:

R₁은 =0를 나타내고;

R₂는 OH를 나타내며;

R₃은 OMe를 나타내고;

R₄는 R₇은 OH를 나타내며 R₈은 OMe를 나타내는 것인 앞서 정의된 바와 같은 구조적 단편 C(i)을 나타내며;

x는 CH₂를 나타낸다.

일 구체예에서, 화합물은 17-데스메틸라파마이신이 아니다.

R₄기가 치환된 시클로헥산 고리를 나타내는 것인 본 발명의 화합물의 모든 전술된 구체예들과 관련하여, 언급될 수 있는 추가적인 구체예들은 시클로헥산 고리 상의 치환기들의 상대적인 입체화학은 시클로헥산 고리가 의자 형태(chair conformation)일 때, 치환기 각각(R₄기가 부착된 폴리케티드 고리를 포함함)이 동시에 수평 위치(equatorial position)를 취할 수 있게 되는 것인 화합물을 포함한다. 따라서, 예를 들면, 언급될 수 있는 본 발명의 화합물은 구조적 단편, C, D, F, C(i) 및 F(i)의 시클로헥산 고리의 2-, 4- 및/또는 6- 위치에 부착된 기들이 시클로헥산 고리의 1-위치에 부착된 폴리케티드 고리에 대해 트랜스-인 것인 화합물을 포함한다. 또한, 언급될 수 있는 본 발명의 다른 화합물은 구조적 단편, C, D, F, C(i) 및 F(i)의 시클로헥산 고리의 3- 및/또는 5- 위치에 부착된 기들이 시클로헥산 고리의 1-위치에 부착된 폴리케티드 고리에 대해 시스-인 것인 화합물을 포함한다. 따라서, 언급될 수 있는 본 발명의 다른 화합물은 R₄가 구조적 단편 C(i)을 나타낼 때, 시클로헥산 고리의 위치 1에 부착된 폴리케티드 고리에 대해, R₇기(존재하고, 특히, OH 또는 OMe인 경우)는 트랜스 입체화학을 가지며 R₈기(존재하고, 특히, OH 또는 OMe기인 경우)는 시스-입체화학을 갖는 것인 화합물을 포함한다. 유사하게, R₄기가 시클로헥스-3-엔 고리(즉, 구조적 단편 A 또는 A(i))인 경우, 언급될 수 있는 본 발명의 화합물은 시클로헥산 고리의 위치 1에 결합된 폴리케티드 고리에 대해, 2- 및/또는 6-위치의 치환기는 트랜스-입체화학을 가지며 3-위치의 치환기는 시스-입체화학을 갖는 것인 화합물을 포함한다.

본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 명세서에 기재된 17-데스메틸라파마이신 및 그의 유사체를 생성하는 방법은 관련된 유사체의 라이브러리 생성에 적용가능하다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법을 이용하여 생성된 17-데스메틸라파마이신 유사체의 라이브러리를 제공한다. 특히, 본 발명은 도입된 스타터 산, 도입된 아미노산, 포스트-PKS 처리의 정도 및 반-합성 유도체화 중 하나 이상에서 상이한 17-데스메틸라파마이신 유사체의 라이브러리를 제공한다.

신규한 라파마이신 유사체는 면역억제제, 항진균제, 항암제, 항염제, 신경재생제 또는 이식 거부, 이식편-대-숙주 질병, 자가면역 질환, 혈관 질환 및 섬유증(fibrotic disease)의 치료용 작용제 또는 상처 치료의 제어에서의 용도를 위한 작용제로서 유용한 화합물을 생산하기 위해 직접적으로 및 추가적인 반-합성 또는 생물전환을 위한 주형으로서 유용하다. 라파마이신 및 그 유사체의 반합성적 유도체화(semisynthetic derivatisation) 방법은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있으며 예를 들면, U.S. 5,665,772; U.S. 5,362,718, WO 96/41807; U.S. 5,728,710, U.S. 5,378,836; U.S. 5,138,051; U.S. 5,665,772, U.S. 5,391,730; U.S. 5,023,262, U.S. 5,563,145, U.S. 5,446,048, U.S. 5,912,253, U.S. 5,221,670; U.S. 5,955,457; WO 98/04279, U.S. 6,015,815 및 U.S. 5,432,183에 기재된 그들의 변형을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 의약에서 17-데스메틸라파마이신 또는 그의 유사체의 용도를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 면역억제의 유도 또는 유지, 신경재생의 자극 또는 암, B-세포 악성종양, 진균성 감염, 이식 거부, 이식편-대-숙주 질병, 자가면역성 질환, 염증성 질병, 혈관 질병 및 섬유소성 질병의 치료용 약제 또는 상처 치유의 조절에서 이용을 위한 약제의 제조에서 17-데스메틸라파마이신 또는 그 유사체의 용도를 제공한다.

라파마이신 유사체는 또한 폐림프관평활근증 및 결절성 경화증을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다른 증상들의 치료에서 유용성을 갖는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 화합물을 포함하는 용도 및 방법은 또한 다른 적응증으로도 확대된다.

본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 일상적인 실험에 의해 이 화합물들의 진균 성장 억제 능력을 결정할 수 있을 것이다(예를 들면, Baker, H., et al., 1978; NCCLS Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing for yeasts: Approved standard M27-A, 17(9). 1997). 추가적으로, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 일상적인 실험에 의해 이 화합물들의 종양 세포 성장 억제 능력을 결정할 수 있을 것이다(Dudkin, L., et al., 2001; Yu et al. 2001 참조). 또 다른 양태에서, 본 발명의 화합물은 면역억제를 유도하기에 유용하고, 이 영역에서 화합물의 효능을 결정하는 하기와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 분석이 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있다: 면역억제 활성- Warner, LM., et al., 1992, Kahan et al. (1991) & Kahan & Camardo, 2001); 동종이식편 - Fishbein, T.M., et al., 2002, Kirchner et al. 2000; 자가면역/염증성/천식- Carlson, RP. et al., 1993, Powell, N. et al., 2001; 타입 I 당뇨병- Rabinovitch, A. et al., 2002; 건선- Reitamo, S. et al., 2001; 류마티즘성 관절염- Foey, A., et al., 2002; 섬유증- Zhu, J. et al., 1999, Jain, S., et al., 2001 , Gregory et al. 1993.

본 발명의 화합물이 면역억제를 유도하는 능력은 이 목적을 위해 이용되는 표준 테스트에서 입증될 수 있다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 화합물은 항섬유증, 신경재생성 및 항-혈관신경 메카니즘에 대해 유용하고, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 일상적인 실험에 의해 이 화합물들의 혈관신생을 방지하는 능력을 결정할 수 있을 것이다(예를 들면, Guba, U.,et al., 2002). 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 일상적인 실험에 의해 이 화합물들의 예를 들면, 스텐트(stent)에서 혈관 과잉증식성 질환(vascular hyperproliferative disease)을 치료하는 유용성을 결정할 수 있을 것이다(예를 들면, Morice, M. C, et al., 2002). 추가적으로, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 일상적인 실험에 의해 이 화물들의 신경재생 능력을 결정할 수 있을 것이다(예를 들면, Myckatyn, T.M., et al., 2002, Steiner et al. 1997).

본 발명은 또한, 약학적으로 허용가능한 담체와 함께, 17-데스메틸라파마이신 또는 그의 유사체, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

전술된 본 발명의 화합물 또는 그의 제제는 통상적인 방법에 의해 투여될 수 있고, 예를 들면, 그들은 비경구로, 경구로, 국소적으로(구강, 설하 또는 경피를 포함), 의료 장치(예를 들면, 스텐트)를 통해, 흡입에 의해, 또는 주사(피하 또는 근육 내)를 통해 투여될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 치료는 일정한 기간 동안 단일 투여 또는 복수의 투여로 구성될 수 있다.

본 발명의 화합물은 단독으로 투여될 수 있으나, 하나 이상의 허용가능한 담체와 함께 약학적 제제로서 제공하는 것이 바람직하다. 담체는 본 발명의 화합물과 융화될 수 있고 그의 수용자에게 유해하지 않다는 점에서 "허용 가능한(acceptable)" 것이어야 한다. 적합한 담체의 예는 하기에서 보다 상세하게 기재된다.

본 발명의 화합물은 단독으로 또는 다른 치료제와 조합되어 투여될 수 있고, 두 개(또는 그 이상)의 작용제의 동시-투여는 사용되는 각각의 투여량을 상당히 낮출 수 있게 하고, 이에 의해 부작용을 감소시킨다.

일 구체예에서, 17-데스메틸라파마이신 또는 그의 유사체는 면역억제의 유도 또는 유지, 이식 거부증, 이식편-대-숙주 질병, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 치료를 위한 다른 치료제와 동시-투여되고, 바람직한 작용제는 면역조절제, 예를 들면, 아자티오프린, 코르티코스테로이드, 사이클로포스파미드, 사이클로스포린 A, FK506, 마이코페놀레이트 모페틸(Mycophenolate Mofetil), OKT-3 및 ATG를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

대안적인 구체예에서, 17-데스메틸라파마이신 또는 그의 유사체는 암 또는 B-세포 악성종양의 치료를 위한 치료제와 동시-투여되고, 바람직한 작용제는 메토트렉세이트, 류코보린, 아드리아마이신, 프레니손, 블레오마이신, 사이클로포스파미드, 5-플루오로우라실, 파클리탁셀, 도세탁셀, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 독소루비신, 타목시펜, 토레미펜, 메게스트롤 아세테이트, 아나스트로졸, 고세렐린, 항-HER2 단일클론 항체(예를 들면, Herceptin™), 카페시타빈, 랄록시펜 히드로클로리드, EGFR 억제제(예를 들면, Iressa®, Tarceva™, Erbitux™), VEGF 억제제(예를 들면, Avastin™), 프로테아좀 억제제(예를 들면, Velcade™), Glivec® 또는 hsp90 억제제(예를 들면, 17-AAG)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가적으로, 17-데스메틸라파마이신 또는 그의 유사체는 방사선 요법 또는 외과수술을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다른 치료법과 조합되어 투여될 수 있다.

일 구체예에서, 17-데스메틸라파마이신 또는 그의 유사체는 혈관 질환의 치료용 작용제와 함께 동시-투여되고, 바람직한 작용제는 ACE 억제제, 안기오텐신 II 수용체 길항제, 피브르산 유도체, HMG-CoA 리덕타아제 억제제, 베타 아드레날린 차단제(beta adrenergic blocking agent), 칼슘 채널 차단제, 항산화제, 항응고제 및 혈소판 억제제 (예를 들면, Plavix™)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

일 구체예에서, 17-데스메틸라파마이신 또는 그의 유사체는 신경재생의 촉진용 치료적 작용제와 함께 동시-투여되고, 바람직한 작용제는 신경영양성 인자, 예를 들면, 신경 성장 인자, 신경교 유래 성장 인자, 뇌 유래 성장 인자, 섬모 신경영양성 인자 및 뉴로트로핀-3을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

일 구체예에서, 17-데스메틸라파마이신 또는 그의 유사체는 진균 감염증의 치료를 위한 치료적 작용제와 함께 동시-투여되고; 바람직한 작용제는 암포테리신 B, 플루시토신, 에키노칸딘스(예를 들면, 카스포푼긴(caspofungin), 아니둘라푼긴(anidulafungin) 또는 미카푼긴), 그리세오풀빈, 이미다졸 또는 트리아졸 항진균제(예를 들면, 클로트리마졸, 미코나졸, 케토코나졸, 에코나졸, 부토코나졸, 옥시코나졸, 테르코나졸, 이트라코나졸, 플루코나졸 또는 보리코나졸)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

동시-투여(co-administration)에는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 명확한 바와 같이, 동일한 치료 계획(treatment regime)의 일환으로 두 개 이상의 치료적 작용제를 환자에게 전달하는 임의의 수단이 포함된다. 둘 이상의 작용제가 단일 제제로 동시에 투여될 수 있으나, 이는 필수적인 것은 아니다. 작용제들은 상이한 제제로 상이한 시기에 투여될 수 있다.

제제는 편리하게 단위 투여량 제형(unit dosage form)으로 제공될 수 있고 제약 부문에서 잘 알려진 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 그와 같은 방법은 활성 성분(본 발명의 화합물)을 하나 이상의 보조 성분을 포함하는 담체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제제는 활성 성분을 액체 담체 또는 잘게 부순 고형 담체(finely divided carrier) 또는 양자 모두와 균일하고 조밀하게 접촉시키는 단계, 및 그 후 필요한 경우, 그 생성물을 성형하는 단계에 의해 제조된다.

본 발명의 화합물은 선택적으로 무-독성 유기, 또는 무기, 산 또는 염기, 부가 염인 활성 성분을 약학적으로 허용가능한 투여 제형으로 포함하는 약학적 제제의 형태로 경구로 또는 비-경구 경로에 의해 일반적으로 투여될 것이다. 투여 경로뿐 아니라, 치료대상 질환 및 환자에 따라, 조성물은 다양한 투여량으로 투여될 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 화합물은 즉시-방출, 서방형-또는 제어-방출 적용을 위해, 향미제 또는 착색제를 포함할 수 있는 정제, 캡슐, 소란(ovule), 엘릭시르, 용액 또는 현탁액의 제형으로 경구, 구강 또는 설하로, 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 음경내 주사(intracavernosal injection)를 통해 투여될 수 있다.

경구 투여에 적합한 본 발명의 화합물의 용액 또는 현탁액은 또한 부형제, 예를 들면, N,N-디메틸아세트아미드, 분산제, 예를 들면, 폴리소르베이트 80, 계면활성제 및 가용화제, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜, Phosal 50 PG(포스파티딜콜린, 대두-지방산(soya-fatty acid), 에탄올, 모노/디글리세리드, 프로필렌 글리콜 및 아스코르빌 팔미테이트로 구성됨)를 포함할 수 있다.

정제는 미정질 셀룰로오스, 락토오스(예를 들면, 락토오스 모노히드레이트 또는 무수 락토오스), 소디움 시트레이트, 탄산칼슘, 제2인산칼슘 및 글리신과 같은 부형제, 전분(바람직하게는 옥수수, 감자 또는 타피오카 전분), 나트륨 전분 글리콜레이트, 크로스카르멜로오스 소디움 및 일부 복합 규산염과 같은 붕해제, 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필메틸셀룰로오스(HPMC), 히드록시프로필셀룰로오스(HPC), 마크로골 8000, 수크로오스, 젤라틴 및 아카시아와 같은 과립화 결합제를 포함할 수 있다. 추가적으로, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 글리세릴 베헤네이트(glyceryl behenate) 및 활석과 같은 윤활제가 포함될 수 있다.

유사한 종류의 고형 조성물이 또한 젤라틴 캡슐에서 충전제로 이용될 수 있다. 이와 관련하여 바람직한 부형제는 락토오스, 전분, 셀룰로오스, 유당(milk sugar) 또는 고분자량 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 수용성 현탁액 및/또는 엘릭시르의 경우, 본 발명의 화합물은 다양한 감미제 또는 향미제, 착색물 또는 염료, 유화제 및/또는 현탁제 및 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜 및 글리세린과 같은 희석제 및 그들의 조합과 조합될 수 있다.

정제는 선택적으로 하나 이상의 부속 성분(accessory ingredient)과 함께, 압착(compression) 또는 성형(moulding)에 의해 제조될 수 있다. 압착된 정제는 선택적으로 결합제(예를 들면, 포비돈, 젤라틴, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스), 윤활제, 비활성 희석제, 보존제, 붕해제(예를 들면, 나트륨 전분 글리콜레이트, 가교 결합된 포비돈, 가교 결합된 소디움 카르복시메틸 셀룰로오스), 계면활성제 또는 분산제와 혼합된, 자유-유동 제형(free-flowing form)인 활성 성분을 적합한 기계에서 압착하는 것에 의해 제조될 수 있다. 성형된 정제(moulded tablet)는 비활성 액체 희석제로 적신 분말형 화합물의 혼합물을 적합한 기계에서 성형하는 것에 의해 제조될 수 있다. 정제는 선택적으로 코팅되거나 분할선이 표시될 수 있고(scored) 그 내부의 활성 성분의 서방형 또는 제어 방출을 제공할 수 있도록 예를 들면, 원하는 방출 프로파일을 제공하기 위해 다양한 비율의 히드록시프로필메틸셀룰로오스를 이용하여 제조될 수 있다.

경구 투여에 적합한 본 발명에 따른 제제는 캡슐, 카세제(cachet) 또는 정제와 같은 개별적인 단위로 제공될 수 있고, 각 단위는 소정의(predetermined) 양의 활성 성분을 분말 또는 과립으로서; 수용성 액체 또는 비-수용성 액체의 용액 또는 현탁액으로서; 또는 수중유형 액체 유제(oil-in-water liquid emulsion) 또는 유중수형 액체 유제(water-in-oil liquid emulsion)로서 포함한다. 활성 성분은 또한 볼루스(bolus), 연약(electuary) 또는 페이스트로서 제공될 수 있다.

구강에서 국소 투여에 적합한 제제는 향미가 있는 주성분(flavored basis), 통상적으로 수크로오스 및 아카시아 또는 트라가칸스에 활성 성분을 포함하는 로젠지(lozenge); 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로오스 및 아카시아와 같은 비활성 주성분에 활성 성분을 포함하는 향정(pastille); 및 적합한 액체 담체에 활성 성분을 포함하는 구강 청정제를 포함한다.

앞서 특별히 언급된 성분들 외에, 본 발명의 제제는 대상이 되는 제제의 유형에 대해 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적인 기타 작용제를 포함할 수 있고, 예를 들면, 경구 투여에 적합한 작용제는 향미제를 포함할 수 있다.

국소 투여를 위해 개조된 약학적 조성물은 연고, 크림, 현탁액, 로션, 분말, 용액, 페이스트, 겔, 함침된 드레싱(impregnated dressing), 스프레이, 에어로졸 또는 오일, 경피 장치, 살포제(dusting powder), 및 그 등가물로 제조될 수 있다. 활성제를 포함하는 이와 같은 조성물은 통상적인 방법을 통해 제조될 수 있다. 따라서, 그들은 또한 융화가능한 통상적인 담체 및 첨가제, 예를 들면, 보존제, 약물 침투를 보조하는 용매, 크림 또는 연고의 연화제 및 로션의 경우 에탄올 또는 올레일 알코올을 포함할 수 있다. 그와 같은 담체는 조성물의 약 1% 내지 약 98%로 존재할 수 있다. 보다 통상적으로, 그들은 조성물의 약 80% 까지를 구성할 수 있다. 예시의 목적으로만, 크림 또는 연고는 원하는 농도(consistency)를 갖는 크림 또는 연고를 제조하기 위해 충분한 양의 친수성 물질과 물, 화합물의 중량 기준으로 약 5-10% 포함하는 충분한 양을 혼합하여 제조된다.

경피 투여용으로 개조된 약학적 조성물은 연장된 기간 동안 수용자의 표피와 밀착되도록 의도된 개별적인 패치로 제공될 수 있다. 예를 들면, 활성제는 패치로부터 이온영동법(iontophoresis)에 의해 전달될 수 있다.

외부 조직, 예를 들면, 구강 및 피부에 대한 적용을 위해, 조성물은 바람직하게는 국소용 연고 또는 크림으로서 적용된다. 연고로 제조된 경우, 활성제는 파라핀계(paraffinic) 또는 수용성(water-miscible) 연고 기반(ointment base)과 함께 이용될 수 있다.

대안적으로, 활성제는 수중유 크림 기반 또는 유중수 기반으로 제제될 수 있다.

비경구 투여를 위해, 유체 단위 투여 제형(fluid unit dosage form)이 활성 성분 및 무균 비히클, 비한정적인 예로서 물, 알코올, 폴리올, 글리세린 및 식물성 오일을 포함하고, 바람직하게는 물인 무균 비히클을 이용하여 제조될 수 있다. 이용되는 비히클 및 농도에 따라, 활성 성분은 비히클에 현탁되거나 또는 용해될 수 있다. 용액 제조시, 활성 성분이 주사용수에 용해되고 적합한 바이알 또는 앰플로 충전하고 밀봉하기 전에 필터 멸균될 수 있다.

편리하게는, 국소 마취제, 보존제 및 완충제와 같은 작용제가 비히클에 용해될 수 있다. 안정성을 강화하기 위해, 바이알로 충전한 후 조성물은 동결되고 물은 진공하에 제거될 수 있다. 사용 전에 액체로 재구성될 수 있도록 건조된 동결건조 분말은 그 후 바이알에 밀봉되고 주사용수를 담은 바이알과 함께 공급된다.

비경구용 현탁제는 활성제가 용해되는 대신에 비히클에 현탁되고 멸균이 여과에 의해 수행될 수 없다는 점을 제외하고는 실질적으로 용액과 동일한 방식으로 제조된다. 활성 성분은 멸균된 비히클에 현탁되기 전에 에틸렌 옥시드에 대한 노출에 의해 멸균될 수 있다. 편리하게는, 활성 성분의 균일한 분포를 촉진하기 위해 계면활성제 또는 습윤제(wetting agent)가 조성물에 포함된다.

본 발명의 화합물은 또한 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려진 의료 장치를 이용하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 일 구체예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 U.S. 5,399,163; U.S. 5,383,851; U.S. 5,312,335; U.S. 5,064,413; U.S. 4,941,880; U.S. 4,790,824; 또는 U.S. 4,596, 556에 개시된 장치와 같은 무봉 피하 주사 장치(needleless hypodermic injection device)로 투여될 수 있다. 본 발명에서 유용한 잘 알려진 이식물(implant) 및 모듈의 예들은: 제어된 속도로 약제를 분배하는 이식가능한 미세주입 펌프(implantable micro-infusion pump)를 개시하는 미국특허 제4,487,603호; 피부를 통해 약제를 투여하는 치료 장치를 개시하는 미국특허 제4,486,194호; 정확한 주입 속도로 약제를 전달하는 약제 주입 펌프를 개시하는 미국특허 제4,447,233호; 연속적인 약물 전달을 위한 가변 흐름 이식가능한 주입 장치를 개시하는 미국특허 제4,447,224호; 복수-챔버 구획을 갖는 삼투성 약물 전달 시스템을 개시하는 미국특허 제4,439,196호; 및 삼투성 약물 전달 시스템을 개시하는 미국특허 제4,475,196호를 포함한다. 특정한 구체예에서, 본 발명의 화합물은 약물-용출 스텐트(drug-eluting stent), 예를 들면, WO 01/87263 및 관련된 문헌에 개시된 것 또는 Perin(Perin, EC, 2005)에 의해 기술된 것과 같은 약물-용출 스텐트를 이용하여 투여될 수 있다. 다수의 그와 같은 이식물, 전달 시스템 및 모듈이 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자들에게 공지되어 있다.

본 발명의 대안적인 구체예에서, 본 발명의 화합물은 환자에게 "전구체 약물(prodrug)"의 형태로 제공될 수 있고, 이는 특히 항암제의 경우에 적용가능하나, 다른 증상을 위해서도 이용될 수 있다.

본 명세서에서 이용되는 용어 "전구체 약물(prodrug)"은 모 약물(parent drug)에 비해 세포독성이 더 약하고 보다 활성인 모 형태로 효소에 의해 활성화되거나 전환될 수 있는 약학적 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 의미한다(예를 들면, Wilman D.E.V., 1986 및 Stella VJ. et al, 1985 참조).

본 발명의 화합물의 투여되는 투여량은 특정 화합물, 관련된 질환, 대상자 및 질병의 속성 및 심각도 및 대상자의 신체 조건, 및 선택된 투여 경로에 따라 변할 것이다. 적합한 투여량은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

조성물은 투여 방법에 따라, 본 발명의 화합물을 중량 기준으로 0.1% 이상, 바람직하게는 중량 기준으로 10-60% 이상 포함할 수 있다.

본 발명의 화합물의 개별적인 투여량의 최적량 및 간격(spacing)은 치료대상인 증상의 속성 및 정도, 투여 제형, 경로 및 부위, 및 치료되는 특정 대상자의 연령 및 조건에 따라 결정되고, 의사가 궁극적으로 이용될 적합한 투여량을 결정할 것이라는 것이 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 인지될 것이다. 이 투여량은 적합한 빈도로 반복될 수 있다. 부작용이 발생하면, 투여량의 용량 및/또는 빈도가 정상적인 임상 관행에 따라 변경 또는 감소될 수 있다.

대안적인 양태에서, 본 발명은 17-데스메틸라파마이신 또는 그 유사체를 생산하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 :

(c) 선택적으로 외래 전구체를 공급하는 단계를 포함하여, 17-데스메틸라파마이신 또는 그의 유사체가 생산되는 조건 하에서 상기 숙주 세포를 배양하는 단계,

특정한 구체예에서, 생산된 화합물은 17-데스메틸라파마이신이 아니다.

이 치환은 라파마이신 PKS 모듈 10에 의한 말로닐-CoA의 도입 및 라파마이신 또는 라파마이신-전구체에 비해 C17에서 메틸 분지의 부재를 가져온다. 바람직한 구체예에서, 말로닐-CoA 특이적 AT 도메인은 하기의 폴리케티드 신타아제 유전자 클러스터 중 하나로부터 선택된다: 라파마이신, 모넨신, FK506, 에리트로마이신, FK520, 암포테리신, 안골라마이신, 틸로신, 'hyg', FK523, 메리다마이신, 안타스코미신, FK525 및 추쿠바마이신. 보다 바람직한 구체예에서, 말로닐-CoA 특이적 AT 도메인은 하기의 클러스터 중 하나로부터 선택된다: 라파마이신, 모넨신 또는 FK506. 보다 더 바람직한 구체예에서, 말로닐-CoA 특이적 AT 도메인은 라파마이신 모듈 2, 모넨신 모듈 3으로부터의 AT 도메인, 모넨신 모듈 6으로부터의 AT 도메인, 모넨신 모듈 8로부터의 AT 도메인, FK506 모듈 3으로부터의 AT 도메인 및 FK506 모듈 7로부터의 AT 도메인로 구성된 군으로부터 선택된다. 가장 바람직한 구체예에서, 말로닐-CoA 특이적 AT 도메인은 라파마이신의 모듈 2로부터의 AT 도메인이다.

기탁된 서열에서 04/007709에서 보고된 것과 같은 다수의 오류가 확인되었다는 것에 유의해야 한다. 본 저자들은 기탁된 서열에 추가적인 오류가 있을 것이고 그 오류 중 일부는 클러스터를 유전적으로 조작하기 위해 본 연구에서 이용된 영역 내에 존재할 수 있는 것으로 예측한다. 서열 목록에 있는 서열들은 공개된 서열 및 폴리뉴클레오티드 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭된 서열이 결정된 DNA 단편들에 기초하여 설계된 합성 올리고뉴클레오티드의 서열을 나타낸다. 따라서, 그 서열들은 기탁된 서열과 일치하지 않을 수 있다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 서열이 결정되지 않은 클로닝된 DNA 단편은 기능성 단백질을 형성하는 생물학적으로 정확한(biologically correct) 서열을 가지며 기탁된 서열의 오류는 이에 대해 효과를 가지지 않는다는 것을 이해할 것이다. 또한, PKS 유전자의 예측된 번역 생성물 및 (Aparicio et al., 1996) 그 도메인 및 모듈의 경계(boundary)가 확인되었다(NCBI accession number X86780). 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 도메인의 정의에 어느 정도의 유동성(fluidity)이 있으며 Schwecke et al., (1995)에 정의된 바와 같은 경계는 경계가 있을 수 있는 경우의 예로 간주되어야 한다는 것을 이해할 것이다.

본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 공여 AT 도메인(donor AT domain)으로 이용될 수 있는 타입 I 폴리케티드 신타아제 (및 혼합된 PKS-NRPS)에 다수의 말로닐-CoA 특이적 AT 도메인이 있으며 이 형질전환이 임의의 타입 I PKS 또는 혼합된 PKS-NRPS로부터의 말로닐-CoA 선택적 아실 트랜스퍼라아제로 시도될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 모듈 10 AT에 의한 말로닐-CoA의 도입은 그 특이성을 변형하기 위해, 예를 들면 WO 02/14482에 기재된 방법을 이용하여, rapAT10에 돌연변이를 유발하거나, 또는 모듈 10을 말로닐-CoA에 대해 선택적인 AT 도메인을 포함하는 천연 모듈이거나 조합형 모듈로 치환하는 것에 의해 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다.

말로닐-CoA 특이적 AT의 라파마이신 PKS의 모듈 10으로의 도입은 공여 도메인을 플랭킹하는 제한 부위를 도입하고 라파마이신 모듈 10의 아실트랜스퍼라아제의 동일 위치에 인-프레임(in-frame)으로 클로닝하는 것에 의해 이루어질 수 있다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 이는 일련의 제한 효소 부위 및 일련의 접합 위치(junction position)의 이용에 의해 달성될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 바람직한 구체예에서, 라파마이신 AT2의 말로닐-CoA 특이적 AT 도메인은 제한효소 부위 Mscl 및 AvrII에 의해 플랭킹된 DNA 단편 상으로 도입된다. Mscl 부위는 보존된 PGQ를 코딩하는 DNA 서열과 중첩되는 AT 도메인의 개시부위로 도입된다(하기 참조). AvrII 부위는 보존된 아미노산 서열 VLG를 코딩하는 DNA 서열과 중첩되는 AT 도메인의 말단에 도입된다(하기 참조). 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 이 클로닝 전략 내에서 MscI 부위가 메틸화되고 제한효소 MscI에 의한 처리 전에 dcm^- DNA를 생성하기 위해 ET12567과 같은 대장균 균주를 통한 계대(passaging)가 요구된다는 것을 이해할 것이다. 대안적인 구체예는 상이한 제한부위, 예를 들면, SpeI 및 AvrII, MscI 및 BglII, SpeI 및 BglII를 포함하나 이에 한정되지 않는 제한부위의 이용을 포함한다. 대안적인 바람직한 결합 부위 조합은 Spel와 AvrII이다.

바람직한 구체예에서, S. 히그로스코피쿠스 MG2-10의 라파마이신 폴리케티드 신타아제는 모듈 10에 말로닐-CoA 특이적 AT를 갖도록 조작된다. 매우 바람직한 구체예에서, 말로닐-CoA AT는 본 명세서의 실시예 1에 기재된 바와 같은 라파마이신 AT2이다.

본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 PKS 유전자 클러스터의 조작을 위해 DNA가 세포 내로 도입될 수 있는 다수의 방법들이 있다는 것을 이해할 것이다. 실시예 1에서, 본 발명자들은 온도 민감성 원점 플라스미드(temperature sensitive origin plasmid)를 이용한 접합 방법(conjugative method)를 기술한다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 또한 다른 방법들, 예를 들면, WO 03/033699에 기재된 방법, 자가-복제 벡터를 사용하지 않는 상동성 재조합(homologous recombination)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 방법들이 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 유전적으로 조작된 라파마이신 PKS를 생성하는 재조합 방법은 본 명세서에 기재된 방법들에 한정해서는 안된다.

그러나, 본 명세서에 기재된 방법은 유전적으로 조작된 PKS 클러스터를 생성하는 바람직한 방법이다. 현재까지 전술된 대안적인 방법들에 의한 rapA, rapB 또는 rapC의 조작에 대한 성공은 보고된 바 없다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 전술된 바와 같이 모듈 10의 메틸말로닐-CoA 특이적 AT 도메인이 말로닐-CoA 특이적 AT 도메인으로 치환된 라파마이신 폴리케티드 신타아제를 코딩하는 유전적으로 조작된 생합성 클러스터를 포함하는 재조합 균주를 생성하는 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 말로닐-CoA 특이적 AT 도메인은 하기의 폴리케티드 신타아제 유전자 클러스터 중 하나로부터 선택된다: 라파마이신, 모넨신, FK506, 에리트로마이신, FK520, 암포테리신, 안골라마이신, 틸로신, 'hyg', FK523, 메리다마이신, 안타스코미신, FK525 및 추쿠바마이신. 보다 바람직한 구체예에서, 말로닐-CoA 특이적 AT 도메인은 하기의 클러스터 중 하나로부터 선택된다: 라파마이신, 모넨신 또는 FK506. 보다 더 바람직한 구체예에서, 말로닐-CoA 특이적 AT 도메인은 라파마이신 모듈 2, 모넨신 모듈 3, 모넨신 모듈 6, 모넨신 모듈 8, FK506 모듈 3 및 FK506 모듈 7로 구성된 군으로부터 선택된다. 가장 바람직한 구체예에서, 말로닐-CoA 특이적 AT 도메인은 라파마이신의 모듈 2로부터 유래한다.

S. 히그로스코피쿠스 MG2-10(그 생성은 WO 04/007709 및 Gregory et al., (2004)에 개시됨)에서 라파마이신 폴리케티드 신타아제 경로의 조작은 본 명세서에서 예시되었으나, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 이 방법들이 야생형 S. 히그로스코피쿠스 NRRL5491 및 기타 관련된 균주에 동등하게 적용될 수 있다는 것을 이해할 것이다(하기 참조). 바람직하게는, 유전적으로 조작된 균주는 S. 히그로스코피쿠스 MG2-10 및 S. 히그로스코피쿠스 NRRL 5491로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명에서, S. 히그로스코피쿠스 NRRL5491 관련된 균주는 액티노플라네스 종.(Actinoplanes sp .) N902-109(예를 들면, FERM BP-3832), 스트렙토마이세스 종.(Streptomyces sp .) AA6554, 스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스 변종. 아스코마이세티쿠스(Streptomyces hygroscopicus var . ascomyceticus) MA 6475(예를 들면, ATCC 14891), 스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스 변종. 아스코마이세티쿠스 MA 6678(예를 들면, ATCC 55087), 스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스 변종. 아스코마이세티쿠스 MA 6674, 스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스 변종. 아스코마이세티쿠스(예를 들면, ATCC 55276), 스트렙토마이세스 츄쿠바엔시스(Streptomyces tsukubaensis) No.9993 (예를 들면, FERM BP-927), 스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스 아종. 야쿠쉬마엔시스(Streptomyces hygroscopicus subsp . yakushimaensis), 스트렙토마이세스 종.(예를 들면, DSM 4137), 스트렙토마이세스 종.(예를 들면, DSM 7348), 마이크로모노스포라 n.종(Micromonospora n. sp .)A92-306401(예를 들면, DSM 8429) 및 스트렙토마이세스 종. MA 6858(예를 들면, ATCC 55098)을 포함한다. 일 구체예에서, 균주는 17-데스메틸라파마이신을 생산하는 재조합 S. 히그로스코피쿠스 숙주 세포가 아니다. 또 다른 구체예에서, 균주는 외래 전구체 공급의 부재 하에 17-데스메틸라파마이신을 생산하는 재조합 S. 히그로스코피쿠스 숙주 세포가 아니다. 또 다른 구체예에서, 균주는 5개의 인접한 유전자, rapQONML를 포함하는 재조합 S. 히그로스코피쿠스 숙주 세포가 아니다.

선택적으로, 이 방법은 포스트-PKS 효소에 의한 처리의 정도 또는 비-천연 스타터 산의 도입에 있어서 천연 라파마이신 구조와 상이한 17-데스메틸라파마이신의 생산을 위해서 WO 04/007709에 개시된 방법과 조합될 수 있다.

(a) 도입될 AT를 적합한 플랭킹 제한 부위를 갖는 단일의 DNA 단편으로 분리하는 단계,

(b) 동일한 적합한 제한 부위를 이용하여 표적 AT의 플랭킹 서열에 상동한 DNA 서열의 영역을 증폭하고 분리하는 단계,

(c) 상기 단계 (a) 및 (b)에 기술된 바와 같은 세 개의 DNA 단편들을 라이게이션하여 LHS 상동성 및 뒤이은 공여 AT 도메인 및 뒤이은 RHS 상동성의 인-프레임 서열을 생성하는 단계,

i) 접합을 위한 oriT,

ii) 하나 이상의 저항성 마커,

본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 단계 (b)에서 언급된 적합한 제한 부위는 세 개의 서열이 함께 라이게이션 되어 인-프레임(in-frame)이고- 그들이 AT를 위해 이용된 두 개의 부위들과 반드시 동일할 필요는 없음-; 구체적으로, 상동성의 좌측의 RHS 상의 제한 부위는 AT의 LHS 상의 부위와 동일하거나, 인-프레임 서열을 생성하기 위해 융화될 수 있어야 하고; 상동성의 좌측 영역의 LHS 상에 있는 제한 부위는 후속 클로닝 단계들을 수행하기 위해 적합한 임의의 부위일 수 있다는 것을 이해할 것이다. 유사하게, 상동성의 우측 영역의 LHS 상의 부위는 AT의 RHS 상에 있는 부위와 동일하거나 또는 인-프레임서열을 생성하기 위해 융화될 수 있어야 하고; 상동성의 우측 영역의 RHS 상의 제한 부위는 후속 클로닝 단계들을 수행하기에 적합한 임의의 서열일 수 있다.

따라서, 본 발명은 비-천연 스타터 산을 도입한 17-데스메틸라파마이신 유사체를 생성하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 17-데스메틸라파마이신 유사체로 시클릭 스타터 산 및 헤테로시클릭 스타터 산을 도입하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 17-데스메틸라파마이신 전구체(17-desmethly-pre-rapamycin) 심부의 합성을 담당하는 유전적으로 조작된 라파마이신 생합성 유전자 클러스터를 포함하는 균주로 상기 대안적인 스타터 산을 공급하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 재조합 균주는 전구체 공급 유전자(precursor supply gene)이 결실되거나 또는 불활성화되었다. 바람직한 구체예에서, 결실 또는 불활성화된 전구체 공급 유전자는 rapK이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 재조합 균주는 rapK가 결실 또는 불활성화되었고 이 균주에 공급된 비-스타터 산은 시클로헥산카르복시산, 3-메틸시클로헥산카르복시산, 시클로헵탄카르복시산, 3-플루오로-4-히드록시시클로헥산카르복시산, 4-플루오로-3-히드록시시클로헥산카르복시산, 3-클로로-4-히드록시시클로헥산카르복시산 및 4-클로로-3-히드록시시클로헥산카르복시산으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 구체예에서, 균주는 17-데스메틸라파마이신을 생산하는 재조합 S. 히그로스코피쿠스 숙주 세포가 아니다. 또 다른 구체예에서, 균주는 외래 전구체 공급의 부재 하에 17-데스메틸라파마이신을 생산하는 재조합 S. 히그로스코피쿠스 숙주 세포가 아니다.

본 발명의 이 양태는 비-천연 전구체(예를 들면, 시클릭 스타터 산 또는 헤테로시클릭 스타터 산)의 도입을 통한 복수의 기본 생성물의 효율적인 생산 방법을 제공한다. 방법들은 또한 하기에 기재된 추가적인 양태들을 구현할 수 있다.

따라서, 일 양태에서, 시클릭 또는 헤테로시클릭 스타터 산을 도입하는 17-데스메틸라파마이신을 생성하는 방법을 제공하고, 상기 방법은:

(a) 하나 이상의 전구체 공급 유전자를 추가적으로 결실 또는 불활성화시키기 위해 유전적으로 조작된 라파마이신 PKS 유전자를 포함하는 상기 재조합 균주를 변형시키는 단계; 및

(b) 상기 재조합 균주에 시클릭 또는 헤테로시클릭 비-천연 스타터 산을 공급하는 단계;를 포함한다.

바람직한 구체예에서, 재조합 균주는 WO 04/007709 및 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 생성된다. 바람직한 구체예에서, 결실 또는 불활성화된 전구체 공급 유전자들 중 하나는 rapK이다.

일 구체예에서, 공급된 외래 산은 고리 크기가 5개 내지 7개의 원자들로 구성된 고리로 다양한, 시클로알킬 카르복시산 또는 그들의 단순한 에스테르를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 바람직한 구체예에서, 카르복시산은 WO 04/007709에 기재된 것들이다.

또 다른 바람직한 구체예에서, 비-천연 스타터 산은 본 명세서의 실시예 2에 기재된 것들이다. 보다 바람직한 구체예에서, 이 균주에 공급된 비-천연 스타터 산은 시클로헥산카르복시산, 3-메틸시클로헥산카르복시산, 시클로헵탄카르복시산, 3-플루오로-4-히드록시시클로헥산카르복시산, 4-플루오로-3-히드록시시클로헥산카르복시산, 3-클로로-4-히드록시시클로헥산카르복시산 및 4-클로로-3-히드록시시클로헥산카르복시산으로 구성된 군으로부터 선택된다.

일 구체예에서, 공급될 수 있는 헤테로시클릭 스타터 산은 (한정 없이) 5개 내지 7개의 원자들로 구성된 다양한 크기의 고리를 갖는 헤테로시클릭 카르복시산 또는 그의 에스테르를 포함하며, 상기 고리는 하나 이상의 이종원자(heteroatom)를 포함하고, 상기 고리가 하나보다 많은 수의 이종원자를 포함하는 경우, 상기 이종원자는 동일할 수 있고 또는 그들은 상이할 수 있다. 이종원자들은 O, S 및 N으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 고리가 N을 포함하는 경우, N은 유리 염기(NH), 아실화된 아민(N-아실), 알킬화된 아민(N-알킬), 또는 알킬화된 N-옥시드(N-알킬, N-O)일 수 있다. 고리가 S를 포함하는 경우, S는 시클릭 티오에테르, 술폭시드 또는 술폰일 수 있다. 전술된 헤테로시클릭 카르복시산 모두에서, 고리의 나머지 부분은 미치환이거나 또는 선택적으로 C₁ _-4 알킬, OH, F 및 Cl을 포함하나, 이에 한정되지 않는 하나 이상의 치환기를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 일 구체예에서, 헤테로시클릭 카르복시산은 4번 위치에 산소 원자를 갖는 6원 고리(6 membered ring)를 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 헤테로시클릭 카르복시산은 테트라히드로-2H-피란-4-카르복시산이다.

(d) 선택적으로, 그에 의해 생산된 화합물을 분리하는 단계;를 포함한다.

바람직한 구체예에서, 결실되거나 불활성화된 보조 유전자는 rapI, rapJ 및 rapQ이다. 대안적인 바람직한 구체예에서, 결실된 보조 유전자는 rapJ, rapM 및 rapQ이다.

본 발명의 대안적인 양태에서, 변형된 라파마이신 PKS는 하나 이상의 라파마이신 보조 유전자가 결실 또는 불활성화된 숙주 세포에서 발현된다. 대안적인 구체예에서, 변형된 라파마이신 PKS는 모든 보조 유전자가 결실 또는 불활성화된 숙주 세포, 예를 들면, 숙주 균주 S. 히그로스코피쿠스 MG2-10 (WO 04/007709; Gregory et al., 2004)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 숙주 세포에서 발현된다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 WO 04/007709에 존재하는 개시에 기초하여, rapK가 결실 또는 불활성화되면, 17-데스메틸라파마이신 또는 그 유사체의 생산을 위해 외래 산이 제공되어야 할 것이라는 것을 이해할 것이다.

(c) 상기 결실을 완전히 또는 부분적으로 보완하기 위해 모든 보조 유전자 또는 서브 세트의 보조 유전자를 트랜스로 재도입하는 단계,

바람직한 구체예에서, 단계 (b)에서 모든 라파마아신 보조 유전자들은 결실되거나 또는 불활성화된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 재조합 균주는 rapI, rapJ, rapK, rapL, rapM, rapN, rapO 및 rapQ 또는 그들의 상동체(homologue)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 보조 유전자에 의해 유전적으로 보완된다. 특정한 구체예에서, 균주는 모든 보조 유전자에 의해 보완된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 재조합 균주는 rapK, rapM, rapN, rapO 및 rapL 또는 그들의 상동체에 의해 유전적으로 보완된다. 대안적인 바람직한 구체예에서, 재조합 균주는 rapK, rapI, rapN, rapO 및 rapL 또는 그들의 상동체에 의해 유전적으로 보완된다.

따라서, 본 발명의 특정한 양태에서, AT 스왑은 라파마이신 생성물을 생산하기 위해 외래 산에 의한 화학적 보완을 필요로 하는 균주를 생성하기 위해, 모든 보조 유전자가 제거된 S. 히그로스코피쿠스 MG2-10(WO 04/007709 및 Gregory et al., (2004)에 개시됨)에서 수행된다. 예를 들면, 시클로헥산카르복시산을 공급하는 것은 17-데스메틸-39-데스히드록시-라파마이신 전구체(17-desmethyl-39-deshydroxypre-rapamycin)의 생성을 가져오고 스타터 산인 3,4-디히드록시시클로헥산카르복시산을 공급하는 것은 17-데스메틸라파마이신 전구체의 생성을 가져온다. 바람직한 구체예에서, 히그로스코피쿠스 MG2-10에서 AT 스왑을 수행하여 생성된 균주는 원형(native) AT10을 치환하기 위해 라파마이신 모듈 2의 아실 트랜스퍼라아제를 모듈 10으로 도입하는 것에 의해 실시예 1에 기재된 바와 같이 생성된 S. 히그로스코피쿠스 MG7-9이다.

본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 S. 히그로스코피쿠스 MG7-9에 rapL이 존재하지 않고 전술된 화학적 보완은 피페콜산 또는 대안적인 아미노산의 첨가를 의미하지 않는다는 것을 이해할 것이다. 복합 생산 배지(complex production media)를 라이신으로 보충하는 것이 그 균주에 피페콜산을 제공하게 되는 경우(확인되지는 않았으나, 생산된 라파마이신-전구체 유사체의 관찰에 의해 정립됨)이다. 이 균주(S. 히그로스코피쿠스 MG7-9)를 배양하는 것은 낮은 수준으로 관찰되는 17-데스메틸프롤릴라파마이신 유사체의 동시-생산을 가져오고 유사한 관찰이 RapL이 결핍된 다른 균주들에서 이루어지고 있다. 외래의 천연 및 신규한 아미노산은 생산 배지로 공급되어 피페콜산과의 직접적인 경쟁으로 야생형 라파마이신 분자로 도입될 수 있다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 유사하게, 추가적인 신규한 라파마이신 유사체를 제공하기 위해 천연 또는 비-천연 아미노산이 S. 히그로스코피쿠스 MG7-9과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 rapL이 결실된 균주에 공급될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

선택적으로, 하나 이상의 결실된 보조 유전자가 적합한 프로모터 하에 상기 숙주 세포로 도입될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 결실된 유전자가 스트렙토마이세스 파아지 phiBT1의 염색체 파아지 결합 부위(chromosomal phage attachment site)로 도입될 수 있다(Gregory et al., 2003). 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 트랜스 보완(complementation in-trans)은 이 파아지 결합 부위, 또는 실제로 결합 부위의 이용에 한정되지 않는다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 결실된 보조 유전자의 보완은 또한 적합한 프로모터 하에 하나 이상의 보조 유전자를 스트렙토마이세스 파아지 phiC31의 결합 부위와 같은 다른 파아지 결합 부위로, 예를 들면, pSET152 유도체를 이용하여 도입하는 것에 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지 않는다(Bierman et al., 1992). 그와 같은 통합(integration)은 다음을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다른 이용가능한 통합 기능을 이용하여 유사하게 수행될 수 있다: pSAM2 인테그라아제(integrase)(예를 들면, pPM927 (Smovkina et al., 1990)), R4 인테그라아제 (예를 들면, pAT98 (Matsuura et al., 1996)), VWB 인테그라아제(예를 들면, pKT02 (Van Mellaert et al., 1998)), 및 L5 인테그라아제(예를 들면, Lee et al., 1991)에 기초한 벡터. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 S. 히그로스코피쿠스로 유전자를 도입하기 위해 이용될 수 있는 다른 시스템을 생성하기 위해 적합한 프로모터와 함께 전달 벡터(delivery vector)로 이전될 수 있는 통합 기능을 포함할 것으로 예상되는 다수의 액티노마이세스 파아지가 있다는 것을 이해할 것이다. 실제로, 다수의 추가적인 S. 히그로스코피쿠스 파아지가 확인되었고, 그들로부터 통합 기능이 수득되어 유사한 방식으로 이용될 수 있었다. 보다 많은 파아지들이 규명되면서, 유사하게 이용될 수 있는 인테그라아제들이 추가적으로 존재할 것으로 기대된다. 일부 경우에, 이는 고효율의 통합을 가능하게 하기 위해 인테그라아제에 대한 특정 attB 부위의 첨가에 의한 숙주 균주의 변형을 필요로 할 것이다. 적합한 프로모터 하에 보조 유전자를 도입하는 것은 (예를 들면, 선택된 유전자를 파괴하기 위해) 염색체의 중립적 위치로의 상동성 재조합, 염색체의 비-중립적(non-neutral) 위치로의 상동성 재조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는 방식으로 수행될 수 있다. 또한, 예를 들면, pSG5(예를 들면, pKC1139 Bierman et al, 1992), plJ101(예를 들면, plJ487, Kieser ef al., 2000) 및 SCP2^* (예를 들면, plJ698, Kieser et al., 2000)를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 스트렙토마이세스의 복제 원점을 포함하는 자가-복제 벡터들이 이용될 수 있다. 하나 이상의 전술된 시스템들이 17-데스메틸라파마이신 유사체를 생성하는 재조합 균주의 조작을 위해 이용될 수 있다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 각 보조 유전자를 적절하게 불활성화 또는 결실시키는 것에 의해 모든 보조 유전자의 결실 및 트랜스 보완과 동일한 생성물을 생산할 수 있는 생합성 경로를 생성할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 적합한 경우, 유리 산의 공급과 함께, 그와 같은 유전자의 상기 숙주 세포에서의 발현은 천연 또는 비-천연 스타터 산을 결합하고 및/또는 변형된 수준의 포스트 폴리케티드 처리를 갖는 17-데스메틸라파마이신 유사체의 생산을 가져올 것이다. 또 다른 구체예에서, 변형된 라파마이신 PKS는 상기 선택된 보조 유전자와 함께 라파마이신 보조 유전자(또는 그의 등가물)가 본래 결핍된 이종기원의 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 적어도 rapK가 결핍되거나 또는 RapK가 숙주 균주에 존재하지 않고, 비-천연 스타터 산을 도입한 17-데스메틸라파마이신 유사체를 생산하기 위해 다양한 외래의 카르복시산이 상기 숙주 균주에 공급될 수 있다.

바람직한 구체예에서, 단계 (b)에서 모든 라파마아신 보조 유전자들은 결실되거나 또는 불활성화된다. 특정한 양태에서, 본 발명은 모든 라파마이신 보조 유전자들이 결실되거나 또는 불활성화된 재조합 균주를 라파마이신 보조 유전자 rapI, rapJ, rapL, rapM, rapO 및 rapQ 또는 그들의 상동체에 의해 유전적으로 보완하여 rapK를 제외한 모든 보조 유전자들을 포함하는 균주를 생성하고 외래 스타터 산을 공급하여, 비-천연 스타터 산으로 17-데스메틸라파마이신을 생성하는 대안적인 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 외래 비-스타터 산은 시클로헥산카르복시산이다. 대안적인 바람직한 구체예에서 비-천연 스타터 산은 3-메틸시클로헥산카르복시산이다. 대안적인 바람직한 구체예에서 비-천연 스타터 산은 시클로헵탄카르복시산이다. 대안적인 바람직한 구체예에서 비-천연 스타터 산은 3-플루오로-4-히드록시시클로헥산카르복시산, 4-플루오로-3-히드록시시클로헥산카르복시산, 3-클로로-4-히드록시시클로헥산카르복시산 및 4-클로로-3-히드록시시클로헥산카르복시산으로 구성된 군으로부터 선택된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 보조 유전자 활성 및 비-천연 스타터 산과 조합된 재조합 균주의 발효에 의해 17-데스메틸라파마이신 유사체를 생성하는 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 결실된 보조 유전자는 rapK, rapM 및 rapQ이고 이 균주에 공급된 비-천연 스타터 산은 시클로헥산카르복시산이다. 대안적인 바람직한 구체예에서, rapK, rapM 및 rapQ가 결실된 이 균주에 공급된 비-천연 스타터 산은 3-메틸시클로헥산카르복시산이다. 대안적인 바람직한 구체예에서, rapK, rapM 및 rapQ가 결실된 이 균주에 공급된 비-천연 스타터 산은 시클로헵탄카르복시산이다. 바람직한 구체예에서, 결실된 보조 유전자는 rapK, rapM 및 rapQ이고 이 균주에 공급된 비-천연 스타터 산은 3-플루오로-4-히드록시시클로헥산카르복시산, 4-플루오로-3-히드록시시클로헥산카르복시산, 3-클로로-4-히드록시시클로헥산카르복시산 및 4-클로로-3-히드록시시클로헥산카르복시산으로 구성된 군으로부터 선택된다.

또 다른 대안적인 바람직한 구체예에서, 결실된 보조 유전자는 rapK, rapI 및 rapQ이고 이 균주에 공급된 비-천연 스타터 산은 3-메틸시클로헥산카르복시산, 시클로헥산카르복시산, 시클로헵탄카르복시산, 3-플루오로-4-히드록시시클로헥산카르복시산, 4-플루오로-3-히드록시시클로헥산카르복시산, 3-클로로-4-히드록시시클로헥산카르복시산 및 4-클로로-3-히드록시시클로헥산카르복시산으로 구성된 군으로부터 선택된다. 보다 더 바람직한 구체예에서, 결실된 보조 유전자는 rapK, rapI 및 rapQ이고 이 균주에 공급된 비-천연 스타터 산은 3-메틸시클로헥산카르복시산이다. 보다 더 바람직한 구체예에서, 결실된 보조 유전자는 rapK, rapI 및 rapQ이고 이 균주에 공급된 비-천연 스타터 산은 3-메틸시클로헥산카르복시산이다. 보다 더 바람직한 구체예에서, 결실된 보조 유전자는 rapK, rapI 및 rapQ이고 이 균주에 공급된 비-천연 스타터 산은 시클로헥산카르복시산이다.

또 다른 대안적인 바람직한 구체예에서, 결실된 보조 유전자는 rapK, rapI 및 rapM이고 이 균주에 공급된 비-천연 스타터 산은 3-메틸시클로헥산카르복시산, 시클로헥산카르복시산, 시클로헵탄카르복시산, 3-플루오로-4-히드록시시클로헥산카르복시산, 4-플루오로-3-히드록시시클로헥산카르복시산, 3-클로로-4-히드록시시클로헥산카르복시산 및 4-클로로-3-히드록시시클로헥산카르복시산으로 구성된 군으로부터 선택된다. 보다 더 바람직한 구체예에서, 공급된 비-천연 스타터 산은 시클로헥산카르복시산이다.

추가적인 양태에서, 본 발명은 천연 또는 비-천연 스타터 산의 공급과 조합된, 모든 라파마이신 보조 유전자들이 결실되거나 또는 불활성화된 재조합 균주를 라파마이신 보조 유전자 rapI, rapJ, rapK, rapL, rapM, rapN, rapO 및 rapQ 또는 그들의 상동체에 의해 유전적으로 보완하는 단계에 의해 17-데스메틸라파마이신을 생성하는 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 상기 재조합 균주는 rapI, rapJ, rapN, rapO 및 rapL에 의해 유전적으로 보완되고 시클로헥산카르복시산, 3-메틸시클로헥산카르복시산, 시클로헵탄카르복시산, 3-플루오로-4-히드록시시클로헥산카르복시산, 4-플루오로-3-히드록시시클로헥산카르복시산, 3-클로로-4-히드록시시클로헥산카르복시산 및 4-클로로-3-히드록시시클로헥산카르복시산으로 구성된 군으로부터 선택된 비-천연 스타터 산이 공급된다. 바람직한 구체예에서, 상기 재조합 균주는 rapJ, rapN, rapO 및 rapL에 의해 유전적으로 보완되고 시클로헥산카르복시산, 3-메틸시클로헥산카르복시산, 시클로헵탄카르복시산, 3-플루오로-4-히드록시시클로헥산카르복시산, 4-플루오로-3-히드록시시클로헥산카르복시산, 3-클로로-4-히드록시시클로헥산카르복시산 및 4-클로로-3-히드록시시클로헥산카르복시산으로 구성된 군으로부터 선택된 비-천연 스타터 산이 공급된다.

대안적인 바람직한 구체예에서, 상기 재조합 균주는 rapJ, rapM, rapN, rapO 및 rapL에 의해 유전적으로 보완되고 3-메틸시클로헥산카르복시산, 시클로헥산카르복시산, 시클로헵탄카르복시산, 3-플루오로-4-히드록시시클로헥산카르복시산, 4-플루오로-3-히드록시시클로헥산카르복시산, 3-클로로-4-히드록시시클로헥산카르복시산 및 4-클로로-3-히드록시시클로헥산카르복시산으로 구성된 군으로부터 선택된 스타터 산이 공급된다. 보다 더 바람직한 구체예에서, 공급된 스타터 산은 3-메틸시클로헥산카르복시산이다.

대안적인 바람직한 구체예에서, 상기 재조합 균주는 rapI, rapJ, rapN, rapO, rapQ 및 rapL에 의해 유전적으로 보완되고 3-메틸시클로헥산카르복시산, 시클로헥산카르복시산, 시클로헵탄카르복시산, 3-플루오로-4-히드록시시클로헥산카르복시산, 4-플루오로-3-히드록시시클로헥산카르복시산, 3-클로로-4-히드록시시클로헥산카르복시산 및 4-클로로-3-히드록시시클로헥산카르복시산으로 구성된 군으로부터 선택된 스타터 산이 공급된다. 보다 더 바람직한 구체예에서, 공급된 스타터 산은 시클로헥산카르복시산이다.

대안적인 바람직한 구체예에서, 상기 재조합 균주는 rapJ, rapN, rapO, rapQ 및 rapL에 의해 유전적으로 보완되고 3-메틸시클로헥산카르복시산, 시클로헥산카르복시산, 시클로헵탄카르복시산, 3-플루오로-4-히드록시시클로헥산카르복시산, 4-플루오로-3-히드록시시클로헥산카르복시산, 3-클로로-4-히드록시시클로헥산카르복시산 및 4-클로로-3-히드록시시클로헥산카르복시산으로 구성된 군으로부터 선택된 스타터 산이 공급된다. 보다 더 바람직한 구체예에서, 공급된 스타터 산은 시클로헥산카르복시산이다.

(e) 폴리케티드의 생산에 적합한 조건 하에서 천연 아미노산 또는 신규한 아미노산을 공급하는 단계,

본 발명은 하기의 실시예에 의해 더 설명되며, 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

도 1은 라파마아신의 구조: A는 ;'결합 도메인'이고 B는 '효능기 도메인'을 도시한다.

도 2는 라파마이신(A), FK506(B), FK520(C) 및 메리다마이신(D)의 구조를 도시한다.

도 3은 MG7-9을 생성하기 위한 MG2-10의 유전적 조작을 도시한다.

도 4는 질량 분석법에 의한 17-데스메틸라파마이신 전구체(17-desmethylpre-rapamycin)의 단편화(fragmentation)을 도시한다.

도 5는 17-데스메틸-39-데스히드록시라파마이신 전구체(17-desmethyl-39-deshydroxypre-rapamycin)의 LC-FT-ICR-MS 분석을 도시한다.

도 6은 17-데스메틸-39-데스히드록시라파마이신 전구체의 LC-FT-ICR-MSⁿ 분석을 도시한다.

도 7은 17-데스메틸-39-데스히드록시라파마이신 전구체의 유의성 있는 NMR 상관관계를 도시한다.

도 8은 플라스미드 pLL150의 개략도이다.

재료

모든 분자 생물학 관련 효소 및 시약들은 상업적인 공급원으로부터 수득하였다.

세균 균주 및 배양 조건

대장균(Escherichia coli .) DH1OB(GibcoBRL)은 Sambrook et al.(1989)에 기재된 바와 같이 2xTY 배지에서 배양하고, 대장균 ET12567(pUZ8002)은 Paget et al.(1999)에 기재된 바와 같이 카나마이신(25 mg/L)을 포함하는 2xTY 배지에서 배양하였다. 벡터 pUC18은 New England Biolabs로부터 수득하였다. 벡터 pKC1139은 Practical Streptomyces Genetics, Kieser et al.(2000)에 기재되어 있다. 대장균 형질전환체는 100 mg/L 암피실린 또는 50 mg/L 아프라마이신으로 선별하였다.

S. 히그로스코피쿠스 MG2-10(WO 04/007709; Gregory et al., 2004) 및 그의 파생물(derivative)은 28℃에서 배지 1 아가 플레이트(하기 참조) 상에서 유지시키고 (Khaw et al., 1998)에 기재된 바와 같이 TSBGM(1.0% 글루코오스 및 100 mM MES 를 포함하는 트립틱 소이 배지)에서, 필요한 경우 50 mg/L 아프라마이신으로 보충하여 배양하였다.

액체 배양은 28℃에서 300 rpm으로 진탕하면서 엘렌마이어 플라스크(Erlenmeyer flask) 또는 팰콘 튜브에서 수행하였다.

공급 방법(Feeding method):

모든 균주의 포자 스톡(spore stock)은 배지 1에서 배양한 후 준비하고 멸균된 증류수에 포함된 20% w/v 글리세롤:10% w/v 락토오스에 보존하여 -80℃에 보관하였다. 증식 배양(vegetative culture)은 250 mL 플라스크에 담긴 50 mL의 배지 2(하기 참조)에 0.1 mL의 동결된 스톡을 접종하여 준비하였다. 배양은 28℃, 300 rpm으로 36시간 내지 48시간 동안 방치하였다.

공급 절차: 증식 배양을 50 mL 튜브에 담긴 7 mL 배지에 0.5 mL 접종하였다. 배양은 26℃, 300 rpm으로 7일간 수행하였다. 선택된 카르복시산("비-천연 스타터" 또는 "천연 스타터")의 공급/첨가를 접종 24시간 후에, 달리 언급되지 않으면 1mM로 수행하였다.

그 후, 배지를 121℃에서 20분간 고압멸균기(autoclave)에 의해 멸균시켰다.

배지 2: RapV7 시드 배지

그 후, 배지를 121℃에서 20분간 고압멸균기(autoclave0에 의해 멸균시켰다.

멸균 후에, 7mL의 배지 당 0.16 mL의 4% 글루코오스를 첨가하였다.

멸균 전에, 1L의 배지에 0.4 mL의 Sigma α-아밀라아제(BAN 250)를 첨가하였다.

배지는 121℃에서 20분간 멸균시켰다.

멸균 후에, 7mL의 배지 당, 0.35 mL의 멸균된 40 % 프럭토오스 및 0.10 mL의 L-라이신(140 mg/mL로 물에 용해, 여과-멸균)을 첨가하였다.

배지 4: RapV7a 시드 배지

그 후, 배지를 121℃에서 20분간 고압멸균기에 의해 멸균시켰다.

배지 5: MD6/5-1 배지(발효 배지)

배지를 121℃에서 30분간 멸균시켰다.

멸균 후에, L 당 15g의 프럭토오스를 첨가하였다.

항암 활성에 대한 체외 생물학적 분석( bioassay )

단층 증식 분석(monolayer proliferation assay)에서 12개의 인간 종양 세포주를 대상으로 화합물의 항암 활성에 대한 체외 평가를 Oncotest Testing Facility, Institute for Experimental Oncology, Oncotest GmbH, Freiburg에서 수행하였다. 12개의 선택된 세포주의 특징은 표 1에 요약된다.

표 1: 테스트 세포주

Oncotest 세포주는 Roth et al. 1999에 의해 기재된 바와 같은 인간 종양 이종이식체(human tumor xenograft)로부터 수립되었다. 다른 세포주들은 NCI(H460, SF-268, OVCAR-3, DU145, MDA-MB-231, MDA-MB-468)로부터 수득하거나 또는 DSMZ, Braunschweig, Germany(LNCAP)로부터 구매하였다.

달리 특정되지 않으면, 모든 세포주는 RPMI 1640 배지, 10% 우태혈청 및 0.1 mg/mL 겐타마이신(PAA, Colbe, Germany)를 포함하는 '레디-믹스(ready-mix)' 배지에서 습기를 조절한(humidified) 대기(95% 공기, 5% CO₂) 하에 37℃에서 배양하였다.

단층 분석:

변형된 프로피디움 요오디드(propidium iodide) 분석을 이용하여 12개의 인간 종양 세포주의 성장에 대한 테스트 화합물의 효과를 평가하였다(Dengler et al, 1995).

먼저, 트립신 처리(trypsinization)에 의해 지수 성장기 배양(exponential phase culture)으로부터 세포들을 채취하고 계수하고 세포주에 따른 세포 밀도(5 - 10,000 개의 생존 세포/웰)로 96 웰 평판 마이크로타이터 플레이트에 배양하였다. 세포들이 지수 성장을 재개할 수 있도록 하기 위해 회수 24시간 후에, 0.01 mL의 배양 배지(플레이트 당 6개의 대조구 웰) 또는 39-데스메톡시라파마이신을 포함하는 배양 배지를 웰에 첨가하였다. 각 농도는 3배수로(triplicate) 플레이팅하였다. 39-데스메톡시라파마이신은 두 개의 농도(0.001 mM 및 0.01 mM)로 적용하였다. 4일의 연속적인 배양 후에, 39-데스메톡시라파마이신을 포함하거나 또는 포함하지 않는 세포 배지를 0.2 mL의 프로피디움 요오디드(PI) 수용액으로 교체하였다(7 mg/L). 살아있는 세포의 비율을 측정하기 위해, 플레이트를 동결하여 세포들이 투과성을 가지게 하였다(permeabilize). 플레이트를 해동한 후, Cytofluor 4000 마이크로플레이트 판독기(여기 530 nm, 방출 620 nm)를 이용하여 형광을 측정하여 살아있는 세포의 총수에 대한 직접적인 관계를 산출하였다.

성장 억제는 처리/대조 x 100 (%T/C)로 표현하고 세포주의 선택을 위해 제공하였다. 활성 화합물의 경우, 전체 세포주 패널에 대한 IC₅₀ & IC₇₀값을 화합물 농도 대 세포 생존성(cell viability)의 그래프를 작성하여 추정하고 또한 기재하였다.

실시예 1. 조작된 균주 S. 히그로스코피쿠스 MG7 -9의 분리

i) 플라스미드 pALK83의 생성

S. 히그로스코피쿠스 NRRL5491로부터 제조된 코스미드(cos26, Schwecke et al., 1995 참조)를 주형으로 이용하여 라파마이신 모듈 10 아실 트랜스퍼라아제(rapAT1O)의 상류의 상동성 영역 (Schwecke et al., 1995에 기재된 라파마이신 클러스터에서 nt11693 내지 nt13289)을 증폭하기 위해, 프라이머 MG308 5'-GTCCTAGGTGATGTCCCGGCAACACG-3'(서열번호: 13) 및 MG309 5'- CACCTGCAGGCCCAACTCGGCCAGCTCGCT-3' (서열번호: 14)를 이용하였다. 1596 bp PCR 산물(서열번호: 15)을 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 이용하여 인산화시키고 탈인산화된 SmaI 처리된 pUC18에 라이게이션시켰다. 대장균 DH10B로 형질전환시킨 후, 플라스미드 pMG255-4를 분리하였다. S. 히그로스코피쿠스 NRRL5491로부터 제조된 코스미드(cos26, Schwecke et al., 1995 참조)를 주형으로 이용하여 라파마이신 모듈 10 AT의 하류의 상동성 영역 (Schwecke et al., 1995에 기재된 라파마이신 클러스터에서 nt14191 내지 nt15742)을 증폭하기 위해, 프라이머 MG310 5'-CCTGGCCAGGAAAGACGAACACGATCCT-3'(서열번호: 16) 및 MG311 5'- CGAAGCTTGAGCCGCTGGCGATCGTGGGA-3' (서열번호: 17)을 이용하였다. 1551 bp PCR 산물(서열번호: 18)을 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 이용하여 인산화시키고 탈인산화된 SmaI 처리된 pUC18에 라이게이션시켰다. 대장균 DH10B로 형질전환시킨 후, 플라스미드 pMG256-1을 분리하였다. 각 플라스미드의 삽입물의 완전성(integrity)을 서열 분석에 의해 확인하였다.

플라스미드 pCJR26 (Rowe et al., 1998) 및 pMG256-1을 각각 대장균 ET12567로 형질전환시키고 비메틸화된 (dam^-, dcm^-, hsdn^-) 플라스미드 DNA를 분리하였다. 플라스미드 pMG255-4를 AvrII/HindIII로 처리하고 약 4.3 kbp 단편을 분리하였다: 탈메틸화된 pCJR26를 MscI/AvrII로 처리하고 약 1 kbp 단편을 분리하고, 탈메틸화된 pMG256-1을 HindIII로 처리하고, MscI으로 부분 처리(partial digestion)하여 약 1.5 kbp의 단편을 분리하였다. 이와 같은 세 개의 DNA 단편을 라이게이션하고 대장균 DH10B를 형질전환시키기 위해 이용하였다. 결과물인 플라스미드 pMG291-14를 분리하였다. 이 플라스미드를 HindIII/XbaI으로 처리하여 약 4 kbp 단편을 분리하고 이를 HindIII/XbaI으로 처리된 pKC1139로 라이게이션시키고, 이 DNA를 이용하여 대장균 DH10B를 형질전환시켰다. 결과물인 플라스미드, pALK83은 이중 재조합(double recombination)에 의한 AT 스왑을 수행하기 위해 모듈 10으로의 상동성 재조합을 가능하게 하는 DNA 영역에 의해 플랭킹된 모듈 2의 라파마이신 아실 트랜스퍼라아제 모듈을 포함한다.

ii) 조작된 균주 S. 히그로스코피쿠스 MG7-9의 분리

플라스미드 pUZ8002을 포함하는 대장균 ET12567을 접합(conjugation)을 위한 대장균-공여 균주(E. coli.-donor strain)를 생성하기 위해 pALK83으로 형질전환시켰다. 이를 접합에 의해 S. 히그로스코피쿠스 MG2-10(WO 04/007709; Gregory et al., 2004)을 형질전환시키기 위해 이용하였다. 아프라마이신 저항성 균주를 분리하여 배지 1 + 50 mg/L 아프라마이신 및 25 mg/L 날리딕산(nalidixic acid)에 패치(patch)시켰다. 그 후, 이 패치를 50 mg/L 아프라마이신과 함께 TSBGM을 포함하는 플라스크에 접종하기 위해 이용하였다. 이 배양을 28℃에서 2일간 방치하고 뒤이어 37℃에서 2일간 방치하였다. 이 배양을 50 mg/L 아프라마이신을 포함하는 배지 1의 플레이트에 도말하고(streak) 37℃에서 7일간 방치하였다. 단일 콜로니들을 50 mg/L 아프라마이신을 포함하는 배지 1의 플레이트에 재-패치하고 37℃에서 7일간 더 배양하였다. 이 패치들을 항생제를 포함하지 않는 TSBGM을 담은 플라스크에 접종하기 위해 이용하고 이를 37℃에서 3일간 배양하였다. 이 배양물을 배지 1의 플레이트에 도말하고 플라스미드 백본의 상실을 포함하는 제2 재조합 사건을 나타내는 민감성을 찾기 위해, 아프라마이신(50 mg/L) 포함 및 불포함 배지 1의 플레이트에 패치하기 위해 이용하였다. 14개의 아르파마아신 민감성 패치들을 7 mL의 배지 2(rapV7)에 접종하기 위해 이용하고 이 시드 배양을 28℃에서 3일간 배양하였다. 그 후, 이들을 배지 3(MD6)에 (0.5 mL를 7 mL의 배지로) 접종하기 위해 이용하고 24시간 후에 1 mM의 최종 농도로 시클로헥산카르복시산을 공급하여 26℃에서 5일간 배양하였다. 이 배양의 추출물을 대상으로 LCMS에 의해 라파마이신 유사체의 생성을 평가하였다. 9개의 개별적인 배양이 17-데스메틸-39-데스히드록시라파마이신 전구체에 대한 적절한 분자 질량을 갖는 신규한 화합물을 생산하는 것으로 관찰하였다. 생산 수준 및 견실성(robustness)에 기초하여 신규한 화합물의 분리를 위해 보다 큰 규모로 배양될 배양물을 이 배양들 중에서 선택하였다; 이 균주를 S. 히그로스코피쿠스 MG7-9으로 명명하였다.

iii) S. 히그로스코피쿠스 MG7-9로부터 유래된 신규한 라파마이신 유사체의 분석

관찰된 신규한 라파마이신 유사체는 하기의 분석 데이터에 기초하여 원하는 17-데스메틸-39-데스히드로라파마이신-전구체인 것으로 제안되었다. 신규한 라파마이신 유사체는 메틸 기의 상실에 의해 예상되는 바와 같이, 39-데스히드로라파마이신-전구체(유지 시간 6.35 - 6.95분)보다 더 극성(유지 시간 5.9 - 6.2분)이다.

MG7-9 추출액의 LCMS 및 LCMSⁿ 분석은 신규한 라파마이신 유도체에 대한 m/z 비율은 메틸 기의 부재와 일치되어, 39-데스히드록시라파마이신-전구체의 경우보다 14 질량 유닛(mass unit) 낮았다. 관찰된 이온: [M-H^-] 810.8, [M+Na]⁺ 834.8, [M+K]⁺ 850.8. 소디움 부가물(adduct)의 단편화(fragmentation)는 이전에 확인된 단편화 경로(도 4)(J. A. Reather, Ph.D. Dissertation, University of Cambridge, 2000)에 따라, 17-데스메틸-39-데스히드록시라파마이신-전구체에 대한 예측된 이온들을 생성했다. 이 질량 분석 단편화 데이터(mass spectrometry fragmentation data)는 메틸의 상실이 원형에서 3개의 메틸 기들을 포함하는 단편 C16-C27에서 일어난 신규한 라팔로그(rapalogue)의 영역을 축소시켰다. 이 메틸기들은 C17(트리엔), C23(트리엔으로부터 1개의 탄소가 제거됨) 및 C25(트리엔으로부터 3개의 탄소가 제거됨)에 결합된다. 라파마이신에 특징적인 UV 트리엔이 관찰되었으나, 중심 피크의 UV 최대값이 이동되었다(λ = 270 nm; 39-데스히드록시라파마이신-전구체의 경우 λ= 278 nm). 이는 파장의 그와 같은 변화는 C16(OH/OCH₃)에서의 작용기(functionality) 변화에 대해 관찰되지 않기 때문에, 트리엔 상의 작용기 변화가 있고; 관찰된 변화는 C17에서의 메틸기의 상실에 대해 예상되는 것과 일치한다는 것을 강하게 시사한다.

축적된 생성물을 또한 LC 고 해상도-파우리에 변환-이온 사이클로트론 공명, 질량분석계(LC-FT-ICR-MS)에 의해 분석하였다. 모 이온의 소디움 부가물에 대해 정확한 질량 데이터를 수득하고(관찰된 질량: 834.51342 (도 5, A), C₄₇H₇₃NO₁₀Na 에 대해 계산된 질량: 834.51319, 편차 0.28 ppm) 주요한 딸 이온을 하기의 표에 표시한다(단편화 경로에 대한 첨부된 도 4 참조).

(도 6 참조)

이 질량 분석 단편화 데이터는 17-데스메틸-39-데스히드로라파마이신-전구체와 전체적으로 일치한다.

iv) 분리를 위한 신규한 라파마이신 유사체의 발효

모든 균주의 포자 스톡(spore stock)은 배지 1에서 배양한 후 준비하고 멸균된 증류수에 포함된 20% w/v 글리세롤:10% w/v 락토오스에 보존하여 -80℃에 보관하였다. 일차 증식 배양은 250 mL 플라스크에 담긴 50 mL의 배지 4에 0.1 mL의 동 결된 스톡을 접종하여 준비하였다. 배양은 28℃에서 250 rpm으로 진탕하면서 48시간 동안 방치하였다. 그 후, 이차 증식 배양을 생성하기 위해 2000 mL 플라스크에 담긴 400 mL의 배지 4에 계대배양(subculture)하였다. 그 배양을 28℃, 250 rpm에서 24시간 동안 방치하였다.

증식 배양을 20 L 발효기(fermenter)에 담긴 15 L의 배지 5(전술 참조)에 7.5% v/v으로 접종하였다. 배양은 26℃, 0.5 vvm ≥ 30% 용존 산소, 1.18 ms^-1의 최소 팁 속도 및 2.75 ms^-1의 최대 팁 속로 6일간 수행하였다. 시클로헥산카르복시산의 공급은 접종 24 및 48시간 후에 2 mM/L의 최종 농도가 되도록 수행하였다. 접종 48시간 후에 200 mL의 물에 담긴 9.5 g의 L-라이신을 첨가하였다.

v) 추출 및 정제

발효액(fermentation broth)(12 L)을 동일 부피의 메탄올과 함께 2시간 동안 교반하고 원심분리(10분, 3500 rpm)하여 세포들의 펠렛을 수득하였다. 상층액을 Diaion® HP20 수지(43 g/L)와 함께 1.5시간 동안 교반한 후 여과시켰다. 수지를 배치별로(batchwise) 아세톤(총 부피 7.5 L)으로 세척하여 라팔로그를 제거하고 용매를 진공 하에 제거하였다. 결과물인 수용성 농축액(800 mL)을 물로 1L까지 희석하고 EtOAc로 추출하였다(3 x 1 L). 진공 하에 용매를 제거하여 점성이 있는 갈색 추출물(10.9 g)을 생성하였다. 그 추출물을 아세톤(약 20 mL)에 용해하고 실리카 상에 코팅한 후 실리카 컬럼(3 x 6.5 cm 직경)에 적용하고 아세톤/헥산(20% - 40%)의 계단식 구배에 의해 용출시켰다. 라팔로그-함유 분획들을 모으고 진공 하에 용 매를 제거하였다. 잔류물(840 mg)을 대상으로 Sephadex LH20 상에서 크로마토그래피를 더 수행하고, 10:10:1 클로로포름/헵탄/에탄올로 용출시켰다. 반정제된(semipurified) 라팔로그(151 mg)를 아세토니트릴(2.7 mL)에 용해시키고, 원심분리(10분, 13200 rpm)하고 Gilson HPLC를 이용한 역상(C18) 프렙용 HPLC에 의해 정제하고, Phenomenex 21.2 x 250 mm Luna 5 ㎛ C18 BDS 컬럼을 60% 아세토니트릴/물 21 mL/분으로 용출시켰다. 가장 순수한 분획(분석용 HPLC에 의해 확인함)DMF 합치고 진공 하에 용매를 제거하여 17-데스메틸-39-데스히드로라파마이신-전구체(10 mg)를 생성하였다.

vi) 특성 규명(Characterisation)

일련의 NMR 실험, 즉 ¹H, ¹³C, APT, COSY, HMQC, HMBC, TOCSY를 수행하였다. 이 데이터의 완전하고 철저한 검토는 대다수의 양성자 및 탄소를 17-데스메틸-39-데스히드록시라파마이신-전구체의 두 로토머(rotomer)에 지정할 수 있게 하였다. 올레핀계 메틸 공명(olefinic methyl resonance)의 부재는 ¹H NMR 스펙트럼으로부터 즉시 확인되었다. H16과 올레핀계 메틴(methine)(39-데스히드록시-라파마이신 전구체의 스펙트럼에 존재하지 않음) 간의 상관관계가 COSY 스펙트럼에서 관찰가능하여 화합물이 C-17에서 메틸기를 갖지 않는다는 것을 확인했다. 화합물의 공지된 로타머 각각의 부분을 포함하는 C17에 대한 중요한 NMR 상관관계가 도 7에 도시된다(둘 간의 변이는 도시되지 않은 구조의 아미드 부분에 있음).

표 2: 17- 데스메틸 -39- 데스히드록시라파마이신 -전구체의 ¹ H 및 ¹³ C NMR 데이 터

a, b, c, d, e: 이 지정은 교환될 수 있음.

¹H-NMR에 대한 500 MHz 및 ¹³C-NMR에 대한 125 MHz에서 CDCl₃로 얻은 NMR 데이터.

실시예 2 - S. 히그로스코피쿠스 MG7 -9로의 스타터 산의 어레이 공급( array feed)

표 3: 어레이 공급 실험에서의 이용을 위한 산의 출처

방법 A: (1R^*, 3R^*, 4R^*)-3,4-디히드록시시클로헥산카르복시산의 합성

(1R^*, 3R^*, 4R^*)-3,4-디히드록시시클로헥산카르복시산은 상업적으로 입수가능한 라세믹 3-시클로헥센 카르복시산으로부터 용이하게 수득가능했다. 이 산을 메타-클로로퍼벤조산(meta-chloroperbenzoic acid)의 처리를 통해 에폭시화(expoxidized)시키고 염기(트리에틸아민)의 첨가에 의해 (1R^*, 3R^*, 4R^*)-4-히드록시시클로헥산-1,3-카르보락톤으로 인-시투 전환하여, 상대적인 입체화학을 형성하였다. 그 후, 이 락톤을 수성 수산화칼륨(aqueous potassium hydroxide)의 작용에 의해 가수분해하고 최종 생성물을 이온교환수지 상에서 정제하였다(Corey, E.J. and Huang, H. 1989).

방법 B: 에틸 (1R^*,5R^*)5-히드록시시클로헥스-3-엔 카르복실레이트의 합성

시클로헥스-3-엔 카르복시산으로부터 (1R^*, 3R^*, 4R^*)-4-요오도시클로헥산-1,3-카르보락톤을 생성하고 그 후, HI를 제거하기 위해 염기 DBU(1,8-디아자비시클로[5,4,0]운데크-7-엔)으로 처리하여, 라세미 형태로 표제 화합물을 제조하였다. 그 후, 결과물인 (1R^*, 5S^*)-시클로헥스-3-엔-1,5-카르보락톤을 에탄올에 용해된 수산화칼륨으로 처리하여 표제 화합물을 생성하였다(Marshall, J. A., and Shiping, X., 1995)

방법 C: 에틸 (1R^*, 4R^*)-3-플루오로-4-히드록시시클로헥산 카르복실레이트의 합성

방법 A에서와 같이 제조된 (1R^*, 3R^*, 4R^*)-4-히드록시시클로헥산-1,3-카르보락톤을 (1R^*, 3R^*, 4R^*)-4-(1-테트라히드로피라닐)시클로헥산-1,3-카르보락톤으로서 보호되게 하고, 이를 에탄올에 용해된 수산화칼륨으로 처리하여 에틸(1R^*, 3R^*, 4R^*)-3-히드록시-4-(1-테트라히드로피라닐)옥시시클로헥산 카르복실레이트를 생성하였다. 불소를 활성화-치환 방법(Yin et al., 2004)에 의해 3번 위치로 도입하고 산성 DOWEX 수지로 4-(1-테트라히드로피라닐)기를 제거하였다.

i) 어레이 공급 실험(Array feeding experiment)

S. 히그로스코피쿠스 MG7-9를 포자형성(sporulation)이 일어날 때까지 28℃에서 14일간 배지 1 상에서 배양하였다. 아가, 균사체 및 포자의 0.5 cm 직경 조각을 플레이트로부터 취하여 발포체 마개(foam bung)를 가진 50 mL 팔콘 튜브에 담긴 7 mL의 배지 2(rapV7)로 옮기고 300 rpm으로 진탕하면서 28℃에서 48시간 동안 배양하였다. 이 시드 배양의 0.5 mL를 발포체 마개를 가진 50 mL 팔콘 튜브에 담긴 7 mL의 배지 3(MD6)으로 옮기고 300 rpm으로 진탕하면서 26℃에서 24시간 동안 배양하였다. 0.05 mL의 메탄올에 용해된 각각의 스타터 산을 최종 농도 2 mM까지 적합한 배양에 공급하였다(표 1의 스타터 산 목록 참조). 그 후, 배양을 26℃에서 4일간 더 성장시켰다. 그 후, 1 mL의 배양물을 각 플라스크로부터 제거하여 2 mL 에펜도르프에 담긴 1 mL의 아세토니트릴에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 흔들어주고 마이크로퓨지(microfuge)에서 13,000 rpm으로 15분간 원심분리시켰다. 0.2 mL의 상 층을 제거하여 HPLC 튜브에 넣고 UV 및 LCMS 검출을 이용하여 HPLC에 의해 분석하였다.

표 4: 추출물의 분석

* = 도입된 스타터 산에서 히드록실 또는 불소 기의 regiochemistry 및/또는 입체화학은 결정되지 않았다; 이는 하기의 구조 도식에 반영된다. 그러나, 이 도식은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가, 원하는 경우 전술된 실시예에 따라 분리하고 동정하기 위해 수득하는 단일 생성물을 반영하도록 의도된다.

실시예 3 - 접합성 벡터 pLL150 의 작제

플라스미드 pSGseti (WO 04/007709)를 SpeI 및 BstEII를 이용하여 처리하고 2.481 kbp 단편을 분리하고 유사하게 SpeI 및 BstEII로 처리된 벡터 pRT801 (Gregory et al., 2003)과 라이게이션시켰다. 대장균 DH10B로의 형질전환 후에, 제한효소 처리에 의해 콜로니들을 스크리닝하여 최종 플라스미드인 pLL150을 분리하였다. 도 8 참조.

실시예 4 - 보조 유전자 카세트에 의한 S. 히그로스코피쿠스 MG7 -9의 보완에 의한 17- 데스메틸라파마이신의 분리

i) 라파마이신 보조 유전자 rapK , rapI , rapJ , rapN , rapO , rapM , rapQ 및 rapL ( rap KIJN / OMQL )을 포함하는 보완 플라스미드 pLL158 의 생성

플라스미드 pSGsetrapKIJN/OMQL (WO 04/007709)을 SpeI 및 HindIII를 이용하여 처리하고 8.516 kbp 단편(rap KIJN/OMQL 포함)을 분리하고 유사하게 SpeI 및 HindIII로 처리된 접합성 벡터 pLL150과 라이게이션시켰다. 대장균 DH10B로의 형질전환 후에, 제한효소 처리에 의해 최종 플라스미드인 pLL158을 분리하고 확인하였다.

ii ) 균주 S. 히그로스코피쿠스 MG7 -9 ( pLL158 )의 분리

플라스미드 pUZ8002을 포함하는 대장균 ET12567을 접합을 위한 대장균-공여 균주를 생성하기 위해 pLL158로 형질전환시켰다. 이를 접합에 의해 S. 히그로스코피쿠스 MG7-9를 형질전환시키기 위해 이용하였다. 아프라마이신 저항성 콜로니를 배지 1(50 mg/L 아프라마이신 및 25 mg/L 날리딕산을 포함) 상에서 분리하여 50 mg/L 아프라마이신 및 25 mg/L 날리딕산을 포함하는 배지 1에 패치시켰다. 그 후, 이 패치를 배지 ISP3 + 50 mg/L 아프라마이신으로의 이차 패치 전에 28℃에서 14- 21일간 배양하였다. 각 패치로부터의 플러그를 50 mg/L 아프라마이신을 포함하는 7 mL 배지 2(RapV7)를 포함하는 개별적인 팔콘 튜브에 접종하기 위해 이용하였다. 이 시드 배양을 28℃, 300 rpm에서 2일간 방치하였다. 그 후, 이들을 배지 3(MD6)에 (0.5 mL를 7 mL의 배지로) 접종하기 위해 이용하고 26℃, 300 rpm으로 6일간 배양하였다. 동일 부피의 아세토니트릴을 첨가하여 이 배양들로부터 이차 대사물질을 추출하였다. 원심분리에 의해 세포 잔해를 제거하였다. 그 후 시료들을 대상으로 LC-MS에 의해 17-데스메틸 라파마이신의 생산을 평가하였다.

iii ) 17- 데스메틸라파마이신의 분석

관찰된 신규한 라팔로그는 LCMS 데이터에 기초하여 17-데스메틸라파마이신인 것으로 제안되었다. 이 데이터는 신규한 라팔로그는 메틸 기의 부재와 일치되게, 라파마이신의 경우보다 14 질량 유닛 낮다는 것을 보여주었다. 관찰된 이온: [M-H] 898.7, [M+Na]⁺ 922.7, [M+K]⁺ 938.6. 라파마이신의 특징적인 UV 트리엔이 관찰되었으나, 중심 피크의 UV 최대값은 이동하였다(λ=270 nm; 라파마이신의 경우 λ=278 nm).

iv ) 분리를 위한 17- 데스메틸라파마이신의 발효

일차 증식 배양은 250 mL 플라스크에 담긴 50 mL의 배지 4에 0.1 mL의 동결된 스톡을 접종하여 제조하였다. 배양은 28℃에서 250 rpm으로 진탕하면서 48시간 동안 방치하였다. 그 후, 이차 증식 배양을 생성하기 위해 2000 mL 플라스크에 담긴 400 mL의 배지 4에 계대배양하였다. 그 배양을 28℃, 250 rpm에서 24시간 동안 방치하였다.

증식 배양을 20 L 발효기에 담긴 15 L의 배지 5(전술 참조)에 7.5% v/v으로 접종하였다. 배양은 26℃, 0.5 vvm ≥30% 용존 산소, 1.18 ms^-1의 최소 팁 속도 및 2.75 ms^-1의 최대 팁 속로 6일간 수행하였다. 접종 48시간 후에 200 mL의 물에 담긴 9.5 g의 L-라이신을 첨가하였다.

v) 추출 및 정제

발효액(12 L)을 동일 부피의 메탄올과 함께 2시간 동안 교반하고 원심분리(10분, 3500 rpm)하여 세포들의 펠렛을 수득하였다. 상층액을 Diaion® HP20 수지(43 g/L)와 함께 1.5시간 동안 교반한 후 여과시켰다. 수지를 배치별로 아세톤(총 부피 7.5 L)으로 세척하여 라팔로그를 제거하고 용매를 진공 하에 제거하였다. 결과물인 수용성 농축액(~800 mL)을 물로 1L까지 희석하고 EtOAc로 추출하였다(3 x 1 L). 진공 하에 용매를 제거하여 점성이 있는 갈색 추출물을 생성하였다.

그 추출물을 아세톤(약 20 mL)에 용해하고 실리카 상에 코팅한 후 실리카 컬럼(3 x 6.5 cm 직경)에 적용하고 아세톤/헥산(20% - 40%)의 계단식 구배에 의해 용출시켰다. 라팔로그-함유 분획들을 모으고 진공 하에 용매를 제거하였다. 잔류물을 대상으로 Sephadex LH20 상에서 크로마토그래피를 더 수행하고, 10:10:1 클로로포름/헵탄/에탄올로 용출시켰다. 반정제된 라팔로그를 아세토니트릴(2.7 mL)에 용해시키고, 원심분리(10분, 13200 rpm)하고 Gilson HPLC를 이용한 역상(C18) 프렙용 HPLC에 의해 정제하고, Phenomenex 21.2 x 250 mm Luna 5 ㎛ C18 BDS 컬럼을 60% 아세토니트릴/물 21 mL/분으로 용출시켰다. 가장 순수한 분획(분석용 HPLC에 의해 확인함)을 합치고 진공 하에 용매를 제거하여 17-데스메틸라파마이신(133 mg)를 생성하였다.

vi ) 특성 규명

분리된 생성물을 대상으로 LCMSⁿ 분석을 수행하고 소디움 부가물의 단편화는 확인된 단편화 경로(J.A. Reather, Ph.D. Dissertation, University of Cambridge, 2000)에 기초하여 17-데스메틸라파마이신에 대한 예측되는 이온을 생성하였다. 이 질량 분석 단편화 데이터(mass spectrometry fragmentation data)는 메틸의 상실이 단편 C16-C27에서 일어난 신규한 라팔로그의 영역을 축소시켰다. 일련의 NMR 실험, 즉 ¹H, ¹³C, APT, COSY, HMQC, HMBC, TOCSY를 수행하였다. 이 데이터의 완전하고 철저한 검토는 17-데스메틸라파마이신의 지정을 가능하게 하였다. 올레핀계 메틸 공명의 부재는 특히 정보제공에 있어 유익했고 중요한 상관관계를 관찰하여 하기의 표 5에 요약했다.

표 5: 17- 데스메틸라파마이신의 ¹ H 및 ¹³ C NMR 데이터

ㆍ¹H-NMR에 대한 500 MHz 및 ¹³C-NMR에 대한 125 MHz에서 CDCl₃로 얻은 NMR 데이터.

실시예 5 - 보조 유전자 카세트에 의한 S. 히그로스코피쿠스 MG7 -9의 보완에 의한 9- 데옥소 -17- 데스메틸 -27-O- 데스메틸 -39-O- 데스메틸 라파마이신의 분리

i) 라파마이신 보조 유전자 rapK , rapN , rapO , rapM 및 rapL ( rap KN / OML ) 을 포함하는 보완 플라스미드 pLL174 의 생성

플라스미드 pSGsetrapKN/OML (WO 04/007709)을 SpeI 및 HindIII를 이용하여 처리하고 5.795 kbp 단편(rap KN/OML 포함)을 분리하고 유사하게 SpeI 및 HindIII로 처리된 접합성 벡터 pLL150과 라이게이션시켰다. 대장균 DH10B로의 형질전환 후에, 제한효소 처리에 의해 최종 플라스미드인 pLL174를 분리하고 확인하였다.

ii ) 균주 S. 히그로스코피쿠스 MG7 -9 ( pLL174 )의 분리

플라스미드 pUZ8002을 포함하는 대장균 ET12567을 접합을 위한 대장균-공여 균주를 생성하기 위해 pLL174로 형질전환시켰다. 이를 접합에 의해 S. 히그로스코피쿠스 MG7-9를 형질전환시키기 위해 이용하였다. 아프라마이신 저항성 콜로니들을 분리하고 50 mg/L 아프라마이신 및 25 mg/L 날리딕산을 포함하는 배지 1에 패치시켰다. 이 패치를 배지 ISP3 + 50 mg/L 아프라마이신으로의 이차 패치 전에 28℃에서 14-21일간 배양하였다. 각 패치로부터의 플러그를 50 mg/L 아프라마이신을 포함하는 7 mL 배지 2(RapV7)를 포함하는 개별적인 팔콘 튜브에 접종하기 위해 이용하였다. 이 시드 배양을 28℃, 300 rpm에서 2일간 방치하였다. 그 후, 이들을 배지 3(MD6)에 (0.5 mL를 7 mL의 배지로) 접종하기 위해 이용하고 26℃, 300 rpm으로 6일간 배양하였다.

동일 부피의 아세토니트릴을 첨가하여 이 배양들로부터 이차 대사물질을 추출하였다. 원심분리에 의해 세포 잔해를 제거하였다. 그 후 배양들을 대상으로 LCMS에 의해 9-데옥소-17-데스메틸-27-O-데스메틸-39-O-데스메틸 라파마이신의 생산을 평가하였다.

iii ) 9- 데옥소 -17- 데스메틸 -27-O- 데스메틸 -39-O- 데스메틸 라파마이신의 분석

관찰된 신규한 라팔로그는 LCMS 데이터에 기초하여 9-데옥소-17-데스메틸-27-O-데스메틸-39-O-데스메틸 라파마이신인 것으로 제안되었다. 이 데이터는 신규한 라팔로그는 3개의 메틸 기의 부재와 일치되게, 17-데스메틸라파마이신의 경우보다 42 질량 유닛 낮다는 것을 보여주었다. 관찰된 이온: [M-H] 856.8, [M+Na]⁺ 880.7, [M+K]⁺ 896.6.

실시예 6 - 보조 유전자 카세트에 의한 S. 히그로스코피쿠스 MG7 -9의 보완에 의한 9- 데옥소 -16-O- 데스메틸 -17-데스메틸-27-O-데스메틸 라파마이신의 분리

i) 라파마이신 보조 유전자 rapK , rapI , rapN , rapO 및 rapL (rap KIN/ OL )을 포함하는 보완 플라스미드 pLL173 의 생성

플라스미드 pSGsetrapKIN/OL (WO 04/007709)을 SpeI 및 HindIII를 이용하여 처리하고 5.624 kbp 단편(rap KIN/OL 포함)을 분리하고 유사하게 SpeI 및 HindIII로 처리된 접합성 벡터 pLL150과 라이게이션시켰다. 대장균 DH10B로의 형질전환 후에, 제한효소 처리에 의해 최종 플라스미드인 pLL173을 분리하고 확인하였다.

ii) 균주 S. 히그로스코피쿠스 MG7 -9 ( pLL173 )의 분리

플라스미드 pUZ8002을 포함하는 대장균 ET12567을 접합을 위한 대장균-공여 균주를 생성하기 위해 pLL173으로 형질전환시켰다. 이를 접합에 의해 S. 히그로스코피쿠스 MG7-9를 형질전환시키기 위해 이용하였다. 아프라마이신 저항성 콜로니들 을 분리하고 50 mg/L 아프라마이신 및 25 mg/L 날리딕산을 포함하는 배지 1에 패치시켰다. 이 패치를 배지 ISP3 + 50 mg/L 아프라마이신으로의 이차 패칭 전에 28℃에서 14-21일간 배양하였다. 각 패치로부터의 플러그를 50 mg/L 아프라마이신을 포함하는 7 mL 배지 2(RapV7)를 포함하는 개별적인 팔콘 튜브에 접종하기 위해 이용하였다. 이 시드 배양을 28℃, 300 rpm에서 2일간 방치하였다. 그 후, 이들을 배지 3(MD6)에 (0.5 mL를 7 mL의 배지로) 접종하기 위해 이용하고 26℃, 300 rpm으로 6일간 배양하였다.

동일 부피의 아세토니트릴을 첨가하여 이 배양들로부터 이차 대사물질을 추출하였다. 원심분리에 의해 세포 잔해를 제거하였다. 그 후 배양들을 대상으로 LCMS에 의해 9-데옥소-16-O-데스메틸-17-데스메틸-27-O-데스메틸 라파마이신의 생산을 평가하였다.

iii) 9- 데옥소 -16-O- 데스메틸 -17- 데스메틸 -27-O- 데스메틸 라파마이신의 분석

관찰된 신규한 라팔로그는 LCMS 데이터에 기초하여 9-데옥소-16-O-데스메틸-17-데스메틸-27-O-데스메틸 라파마이신인 것으로 제안되었다. 이 데이터는 신규한 라팔로그는 3개의 메틸 기의 부재와 일치되게, 17-데스메틸라파마이신의 경우보다 42 질량 유닛 낮다는 것을 보여주었다. 관찰된 이온: [M-H] 856.8, [M+Na]⁺ 880.7, [M+K]⁺ 896.6.

실시예 7 - 보조 유전자 카세트에 의한 S. 히그로스코피쿠스 MG7 -9의 보완 및 생산 배지의 스타터 산에 의한 보충에 의한 17- 데스메틸 -29- 데스메톡시 라파마이신의 분리

i) 라파마이신 보조 유전자 rapI , rapJ , rapN , rapO , rapM, rapQ 및 rapL (rap IJN / OMQL )을 포함하는 보완 플라스미드 pLL178 의 생성

플라스미드 pMG262 (WO 04/007709)(유전자 rapI, rapJ, rapN, rapO, rapM, rapQ 및 rapL 발현)을 SpeI 및 HindIII를 이용하여 처리하고 7.259 kbp 단편(rap IJN/OMQL 포함)을 분리하고 유사하게 SpeI 및 HindIII로 처리된 접합성 벡터 pLL150과 라이게이션시켰다. 대장균 DH10B로의 형질전환 후에, 제한효소 처리에 의해 최종 플라스미드인 pLL178을 분리하고 확인하였다.

ii) 균주 S. 히그로스코피쿠스 MG7 -9 ( pLL178 )의 분리

플라스미드 pUZ8002을 포함하는 대장균 ET12567을 접합을 위한 대장균-공여 균주를 생성하기 위해 pLL178로 형질전환시켰다. 이를 접합에 의해 S. 히그로스코피쿠스 MG7-9를 형질전환시키기 위해 이용하였다. 아프라마이신 저항성 콜로니들을 분리하고 50 mg/L 아프라마이신 및 25 mg/L 날리딕산을 포함하는 배지 1에 패치시켰다. 이 패치를 배지 ISP3 + 50 mg/L 아프라마이신으로의 이차 패칭 전에 28℃에서 14-21일간 배양하였다. 각 패치로부터의 플러그를 50 mg/L 아프라마이신을 포함하는 7 mL 배지 2(RapV7)를 포함하는 개별적인 팔콘 튜브에 접종하기 위해 이용하였다. 이 시드 배양을 28℃, 300 rpm에서 2일간 방치하였다. 그 후, 이들을 배지 3(MD6)에 (0.5 mL를 7 mL의 배지로) 접종하기 위해 이용하고 26℃, 300 rpm으로 6일간 배양하였다. 배지 3에서의 배양 24시간 후에, 배양물에 시클로헥산 카르복시 산을 최종 농도 1 mM까지 공급하였다.

동일 부피의 아세토니트릴을 첨가하여 이 배양들로부터 이차 대사물질을 추출하였다. 원심분리에 의해 세포 잔해를 제거하였다. 그 후 배양들을 대상으로 LCMS에 의해 17-데스메틸-39-데스메톡시 라파마이신의 생산을 평가하였다.

iii) 17- 데스메틸 -39- 데스메톡시라파마이신의 분석

관찰된 신규한 라팔로그는 LCMS 데이터에 기초하여 17-데스메틸-39-데스메톡시 라파마이신인 것으로 제안되었다. 이 데이터는 신규한 라팔로그는 1개의 메톡시 기의 부재와 일치되게, 17-데스메틸라파마이신의 경우보다 30 질량 유닛 낮다는 것을 보여주었다. 관찰된 이온: [M-H] 863.3, [M+Na]⁺ 892.3, [M+K]⁺ 908.3. 라파마이신에 특징적인 UV 트리엔이 관찰되었으나, 중심 피크의 UV 최대값이 이동되었다(λ = 270 nm; 라파마이신의 경우 λ= 278 nm).

iv) 분리를 위한 17- 데스메틸 -39- 데스메톡시라파마이신의 발효

v) 추출 및 정제

그 추출물을 아세톤(약 20 mL)에 용해하고 실리카 상에 코팅한 후 실리카 컬럼(3 x 6.5 cm 직경)에 적용하고 아세톤/헥산(20% - 40%)의 계단식 구배에 의해 용출시켰다. 라팔로그-함유 분획들을 모으고 진공 하에 용매를 제거하였다. 잔류물을 대상으로 Sephadex LH20 상에서 크로마토그래피를 더 수행하고, 10:10:1 클로로포름/헵탄/에탄올로 용출시켰다. 반정제된 라팔로그를 아세토니트릴(2.7 mL)에 용해시키고, 원심분리(10분, 13200 rpm)하고 Gilson HPLC를 이용한 역상(C18) 프렙용 HPLC에 의해 정제하고, Phenomenex 21.2 x 250 mm Luna 5 ㎛ C18 BDS 컬럼을 60% 아세토니트릴/물 21 mL/분으로 용출시켰다. 가장 순수한 분획(분석용 HPLC에 의해 확인함)을 합치고 진공 하에 용매를 제거하여 17-데스메틸-39-데스메톡시라파마이신(30 mg)를 생성하였다.

vi) 특성 규명

분리된 생성물을 대상으로 LCMSⁿ 분석을 수행하고 소디움 부가물의 단편화는 확인된 단편화 경로(J.A. Reather, Ph.D. Dissertation, University of Cambridge, 2000)에 기초하여 17-데스메틸-39-데스메톡시라파마이신에 대한 예측되는 이온을 생성하였다. 이 질량 분석 단편화 데이터(mass spectrometry fragmentation data)는 메틸의 상실이 단편 C16-C27에서 일어나고 메톡시 기의 상실이 C28-C44에서 일어난 신규한 라팔로그의 영역을 축소시켰다. 일련의 NMR 실험, 즉 ¹H, ¹³C, APT, COSY, HMQC, HMBC, TOCSY를 수행하였다. 이 데이터의 완전하고 철저한 검토는 17-데스메틸-39-데스메톡시라파마이신의 지정을 가능하게 하였다. 올레핀계 메틸 공명의 부재는 특히 정보제공에 있어 유익했고 중요한 상관관계를 관찰하여 하기의 표 6에 요약했다.

표 6: 17- 데스메틸 -39- 데스메톡시라파마이신의 ¹ H NMR 데이터

400 MHz에서 CDCl₃에서의 NMR 데이터

실시예 8 - 보조 유전자 카세트에 의한 S. 히그로스코피쿠스 MG7 -9의 보완 및 생산 배지의 스타터 산에 의한 보충에 의한 16-O- 데스메틸 -17- 데스메틸 -39- 데스메톡시 라파마이신의 분리

i) 라파마이신 보조 유전자 rapI , rapJ , rapN /O, rapQ 및 rapL ( rap IJN/OQL)을 포함하는 보완 플라스미드 pLL184 의 생성

플라스미드 pMG262 (WO 04/007709)(유전자 rapI, rapJ, rapN, rapO, rapQ 및 rapL 발현)을 SpeI 및 HindIII를 이용하여 처리하고 6.3 kbp 단편(rap IJN/OQL 포함)을 분리하고 유사하게 SpeI 및 HindIII로 처리된 접합성 벡터 pLL150과 라이게이션시켰다. 대장균 DH10B로의 형질전환 후에, 제한효소 처리에 의해 최종 플라스미드인 pLL184를 분리하고 확인하였다.

ii) 균주 S. 히그로스코피쿠스 MG7 -9 ( pLL184 )의 분리

플라스미드 pUZ8002을 포함하는 대장균 ET12567을 접합을 위한 대장균-공여 균주를 생성하기 위해 pLL184로 형질전환시켰다. 이를 접합에 의해 S. 히그로스코피쿠스 MG7-9를 형질전환시키기 위해 이용하였다. 아프라마이신 저항성 콜로니들을 분리하고 50 mg/L 아프라마이신 및 25 mg/L 날리딕산을 포함하는 배지 1에 패치시켰다. 이 패치를 배지 ISP3 + 50 mg/L 아프라마이신으로의 이차 패칭 전에 28℃에서 14-21일간 배양하였다. 각 패치로부터의 플러그를 50 mg/L 아프라마이신을 포함하는 7 mL 배지 2(RapV7)를 포함하는 개별적인 팔콘 튜브에 접종하기 위해 이용하 였다. 이 시드 배양을 28℃, 300 rpm에서 2일간 방치하였다. 그 후, 이들을 배지 3(MD6)에 (0.5 mL를 7 mL의 배지로) 접종하기 위해 이용하고 26℃, 300 rpm으로 6일간 배양하였다. 배지 3에서의 배양 24시간 후에, 배양물에 시클로헥산 카르복시산을 최종 농도 1 mM까지 공급하였다.

동일 부피의 아세토니트릴을 첨가하여 이 배양들로부터 이차 대사물질을 추출하였다. 원심분리에 의해 세포 잔해를 제거하였다. 그 후 배양들을 대상으로 LCMS에 의해 16-O-데스메틸-17-데스메틸-39-데스메톡시 라파마이신의 생산을 평가하였다.

iii) 16-O- 데스메틸 -17- 데스메틸 -39- 데스메톡시 라파마이신의 분석

관찰된 신규한 라팔로그는 LCMS 데이터에 기초하여 16-O-데스메틸-17-데스메틸-39-데스메톡시 라파마이신인 것으로 제안되었다. 이 데이터는 신규한 라팔로그는 1개의 메톡시 기 및 1개의 메틸 기의 부재와 일치되게, 17-데스메틸라파마이신의 경우보다 44 질량 유닛 낮다는 것을 보여주었다. 관찰된 이온: [M-H] 854.2, [M+Na]⁺ 878.3, [M+K]⁺ 894.3.

실시예 9 - 보조 유전자 카세트에 의한 S. 히그로스코피쿠스 MG7 -9의 보완 및 생산 배지의 스타터 산에 의한 보충에 의한 16-O- 데스메틸 -17- 데스메틸 -39- 데스메톡시 라파마이신의 분리

i) 라파마이신 보조 유전자 rapJ , rapN /O, rapQ 및 rapL (rap JN / OQL )을 포 함하는 보완 플라스미드 pLSS249 의 생성

플라스미드 pSGsetrapKIJN/OQL (WO 04/007709)을 EcoRI 및 BglII를 이용하여 처리하고 3.744 kbp 단편(rap JN/OQL 포함)을 분리하고 유사하게 처리된 pSGsetrapJ(WO 04/007709)와 라이게이션시켰다. 대장균 DH10B로의 형질전환 후에, 제한효소 처리에 의해 플라스미드인 pSS238을 분리하고 확인하였다. 플라스미드 pSS238을 SpeI 및 HindIII로 더 처리하여 7.311 kbp 단편(rap JN/OQL 포함)을 분리하고 유사하게 SpeI 및 HindIII로 처리된 접합성 벡터 pLL150과 라이게이션시켰다. 대장균 DH10B로의 형질전환 후에, 제한효소 처리에 의해 최종 플라스미드인 pLSS249를 분리하고 확인하였다.

ii) 균주 S. 히그로스코피쿠스 MG7 -9 ( pLSS249 )의 분리

신규한 라팔로그의 LCMS는 신규한 라팔로그가 실시예 8에 기재된 라팔로그와 동일한 질량 및 유지 시간을 갖는다는 것을 보여주었다.

실시예 10 - 보조 유전자 카세트에 의한 S. 히그로스코피쿠스 MG7 -9의 보완 및 생산 배지의 스타터 산에 의한 보충에 의한 9- 데옥소 -17- 데스메틸 -27-O- 데스메틸 -39- 데스메톡시 라파마이신의 분리

i) 라파마이신 보조 유전자 rapM , rapN , rapO 및 rapL (rap MN/ OL )을 포함하는 보완 플라스미드 pLL191 의 생성

플라스미드 pMG237의 분리: 플라스미드 pSGsetrapKJMN/O는 유전자 rapK, rapJ, rapM, rapN 및 rapO가 상기 플라스미드에 존재하는 actII-ORF4에 의해 제어되는 actI 프로모터 하에 배치되는 것인 pSET 152-유래 플라스미드이다. 이는 본 연구에서 이용된 다른 카세트-포함 플라스미드에 유사한 상황이다. 플라스미드 pSGsetrapKJMN/O를 BglII/XbaI을 이용하여 처리하고 분리된 벡터 단편을 pSGLitrapL_his의 1 kb XbaI/BglII과 라이게이션시켰다. 플라스미드 pMG237(rapK, rapJ, rapM, rapN, rapO, 및 rapL 발현)을 분리하였다.

플라스미드 pMG237(rapK, rapJ, rapM, rapN, rapO, 및 rapL 발현)을 SpeI 및 HindIII를 이용하여 처리하고 6.841 kbp 단편을 분리하고 유사하게 SpeI 및 HindIII로 처리된 접합성 벡터 pLL150과 라이게이션시켰다. 대장균 DH10B로의 형질전환 후에, 제한효소 처리에 의해 최종 플라스미드인 pLL171을 분리하고 확인하였다. 플라스미드 pLL171을 AsiSI 및 NheI로 처리하고 5.293 kbp 단편(rap MN/OL 포함)을 분리하고 유사하게 AsiSI 및 NheI로 처리된 pSGsetrapM(WO 04/007709)과 라이게이션시켰다. 대장균 DH10B로의 형질전환 후에, 제한효소 처리에 의해 플라스미드인 pLL180을 분리하고 확인하였다. 플라스미드 pLL180은 유전자 rapM, rapN/O 및 rapL을 발현한다. 이들을 SpeI 및 HindIII에 의한 처리에 의해 접합성 벡터 pLL150으로 전이시켰다. pLL180으로부터 4.785 kbp SpeI/HindIII 단편을 분리하고 유사하게 처리된 pLL150과 라이게이션시켰다. 대장균 DH10B로의 형질전환 후에, 제한효소 처리에 의해 최종 플라스미드인 pLL191을 분리하고 확인하였다.

ii) 균주 S. 히그로스코피쿠스 MG7 -9 ( pLL191 )의 분리

플라스미드 pUZ8002을 포함하는 대장균 ET12567을 접합을 위한 대장균-공여 균주를 생성하기 위해 pLL191로 형질전환시켰다. 이를 접합에 의해 S. 히그로스코피쿠스 MG7-9를 형질전환시키기 위해 이용하였다. 아프라마이신 저항성 콜로니들을 분리하고 50 mg/L 아프라마이신 및 25 mg/L 날리딕산을 포함하는 배지 1에 패치시 켰다. 이 패치를 배지 ISP3 + 50 mg/L 아프라마이신으로의 이차 패칭 전에 28℃에서 14-21일간 배양하였다. 각 패치로부터의 플러그를 50 mg/L 아프라마이신을 포함하는 7 mL 배지 2(RapV7)를 포함하는 개별적인 팔콘 튜브에 접종하기 위해 이용하였다. 이 시드 배양을 28℃, 300 rpm에서 2일간 방치하였다. 그 후, 이들을 배지 3(MD6)에 (0.5 mL를 7 mL의 배지로) 접종하기 위해 이용하고 26℃, 300 rpm으로 6일간 배양하였다. 배지 3에서의 배양 24시간 후에, 배양물에 시클로헥산 카르복시산을 최종 농도 1 mM까지 공급하였다.

동일 부피의 아세토니트릴을 첨가하여 이 배양들로부터 이차 대사물질을 추출하였다. 원심분리에 의해 세포 잔해를 제거하였다. 그 후 배양들을 대상으로 LCMS에 의해 9-데옥소-17-데스메틸-27-O-데스메틸-39-데스메톡시 라파마이신의 생산을 평가하였다.

iii) 9- 데옥소 -17- 데스메틸 -27-O- 데스메틸 -39- 데스메톡시 라파마이신의 분석

관찰된 신규한 라팔로그는 LCMS 데이터에 기초하여 9-데옥소-17-데스메틸-27-O-데스메틸-39-데스메톡시라파마이신인 것으로 제안되었다. 이 데이터는 신규한 라팔로그는 1개의 메톡시 기와 1개의 히드록시 기의 첨가와 일치되게, 17-데스메틸-39-데스히드록시라파마이신-전구체의 경우보다 30 질량 유닛 크다는 것을 보여주었다. 관찰된 이온: [M-H] 840.6, [M+Na]⁺ 864.6, [M+K]⁺ 880.6.

실시예 11- 보조 유전자 카세트에 의한 S. 히그로스코피쿠스 MG7 -9의 보완 및 생산 배지의 스타터 산에 의한 보충에 의한 9- 데옥소 -16-O- 데스메틸 -17- 데스메틸 -29-O- 데스메틸 -39-데스메톡시 라파마이신의 분리

i) 라파마이신 보조 유전자 rapI , rapN /O 및 rapL (rap IN/ OL )을 포함하는 보완 플라스미드 pLL190 의 생성

플라스미드 pSGsetrapKIN/OL을 BglII로 처리하여 3.272 kbp 단편(rap IN/OL 포함)을 분리하고 BglII로 처리되고 알칼리 포스파타아제로 처리된 플라스미드 pSGsetrapI(WO 04/007709)와 라이게이션시켰다. 대장균 DH10B로의 형질전환 후에, 제한효소 처리에 의해 플라스미드인 pLL177을 확인하였다. 플라스미드 pLL177을 SpeI 및 HindIII를 이용하여 더 처리하여 5.624 kbp 단편(rap IN/OL 포함)을 분리하고 유사하게 SpeI 및 HindIII로 처리된 접합성 벡터 pLL150과 라이게이션시켰다. 대장균 DH10B로의 형질전환 후에, 제한효소 처리에 의해 최종 플라스미드인 pLL190을 분리하고 확인하였다.

ii) 균주 S. 히그로스코피쿠스 MG7 -9 ( pLL190 )의 분리

플라스미드 pUZ8002을 포함하는 대장균 ET12567을 접합을 위한 대장균-공여 균주를 생성하기 위해 pLL190으로 형질전환시켰다. 이를 접합에 의해 S. 히그로스코피쿠스 MG7-9를 형질전환시키기 위해 이용하였다. 아프라마이신 저항성 콜로니들을 분리하고 50 mg/L 아프라마이신 및 25 mg/L 날리딕산을 포함하는 배지 1에 패치시켰다. 이 패치를 배지 ISP3 + 50 mg/L 아프라마이신으로의 이차 패칭 전에 28℃에서 14-21일간 배양하였다. 각 패치로부터의 플러그를 50 mg/L 아프라마이신을 포함하는 7 mL 배지 2(RapV7)를 포함하는 개별적인 팔콘 튜브에 접종하기 위해 이용 하였다. 이 시드 배양을 28℃, 300 rpm에서 2일간 방치하였다. 그 후, 이들을 배지 3(MD6)에 (0.5 mL를 7 mL의 배지로) 접종하기 위해 이용하고 26℃, 300 rpm으로 6일간 배양하였다. 배지 3에서의 배양 24시간 후에, 배양물에 시클로헥산 카르복시산을 최종 농도 1 mM까지 공급하였다.

동일 부피의 아세토니트릴을 첨가하여 이 배양들로부터 이차 대사물질을 추출하였다. 원심분리에 의해 세포 잔해를 제거하였다. 그 후 배양들을 대상으로 LCMS에 의해 9-데옥소-16-O-데스메틸-17-데스메틸-27-데스메틸-39-데스메톡시 라파마이신의 생산을 평가하였다.

iii) 9- 데옥소 -16-O- 데스메틸 -17- 데스메틸 -27- 데스메틸 -39-데스메톡시 라파마이신의 분석

관찰된 신규한 라팔로그는 LCMS 데이터에 기초하여 9-데옥소-16-O-데스메틸-17-데스메틸-27-데스메틸-39-데스메톡시 라파마이신인 것으로 제안되었다. 이 데이터는 신규한 라팔로그는 1개의 히드록시 기의 첨가와 일치되게, 17-데스메틸-39-데스히드록시라파마이신-전구체의 경우보다 16 질량 유닛 크다는 것을 보여주었다. 관찰된 이온: [M-H] 826.7, [M+Na]⁺ 850.6, [M+K]⁺ 866.6.

실시예 12. 항암 활성의 체외 생물학적 분석

단층 증식 분석에서 12개의 인간 종양 세포주의 패널에 대한 17-데스메틸-39-데스메톡시라파마이신의 항암 활성의 체외 평가를 전술된 바와 같이 변형된 프 로피디움 요오디드 분석을 이용하여 수행하였다.

결과를 하기의 표 7에 표시하며, 각 결과는 이중(duplicate) 실험의 평균을 나타낸다. 표 8은 테스트된 세포주에 대한 테스트 화합물 및 라파마이신의 IC₅₀ 및 IC₇₀을 보여준다.

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SEQUENCE LISTING <110> Biotica Technology Ltd Gregory, Matthew A Martin, Christine Janet <120> Production of Polyketides and Other Natural Products <130> BIOY/P30824WO <150> GB 0417852.1 <151> 2004-08-11 <160> 18 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificially generated restriction site <400> 1 Phe Pro Gly Gln Gly 1 5 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially generated restriction site <400> 2 tttcccgggc aggga 15 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificially generated restriction site <400> 3 Phe Pro Gly Gln Gly 1 5 <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially generated restriction site <400> 4 ttcccgggtc agggg 15 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificially generated restriction site <400> 5 Phe Pro Gly Gln Gly 1 5 <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially generated restriction site <400> 6 tttcctggcc agggg 15 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificially generated restriction site <400> 7 Ala Val Leu Gly Asp 1 5 <210> 8 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Artificially generated restriction site <400> 8 gcggtgctgg gtgat 15 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificially generated restriction site <400> 9 Ala Val Leu Gly Asp 1 5 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially generated restriction site <400> 10 gcggtgctgg gtgat 15 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificially generated restriction site <400> 11 Ala Val Leu Gly Asp 1 5 <210> 12 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially generated restriction site <400> 12 gcggtcctag gtgat 15 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 13 gtcctaggtg atgtcccggc aacacg 26 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 14 cacctgcagg cccaactcgg ccagctcgct 30 <210> 15 <211> 1596 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Left region of homology PCR product from AT10, amplified from S. hygroscopicus using SEQ ID NOs 1 and 2, which contain additional restriction sites. <400> 15 cacctgcagg cccaactcgg ccagctcgct gatcagcgcc tcgtccgggg cgctgcggga 60 cagcaacagc agatgacgca caccgcgttc ggccaccagg tgccgggcgg cgatccccgc 120 cagcacaccc gaaccaccgg tgatcagaac cgtgccatcc ggatcccaga cgccttcagg 180 ctcaggctca gcgacgcccg tacgagtcag tcgcggtgcc tcgtaccggc cgtcgatgac 240 ccgcagccgc ggctcatcga gcccgacggt ggcggccagt tggtccgggg tgagggtgtc 300 gtcgtcactt tccaccagga cgaaccggcc cgggtgctcc gactgagccg aacgcatcaa 360 ccccgacacc gcggctgcgg ccaaaccagt tccggtccgc acaaccagcg tactgtcagt 420 gaaacgctcc cccgccagcc acacctgcac cgcctgcaga acctcagcgg tcagccgacg 480 agtctgtgcc agcgggtcac cgctgtcggg gagtgcggtg aacacaacga catcgggcat 540 cggcacctcg ccgtccgcga ggtcttcaaa cttgcccacc gtcacgccga cctgctggga 600 gaccgggatc tccgtccacg tcagggcgaa cagatcatcg acagcagaac cgagcgcatc 660 ggctgccacc ggacgggtca ccagcgagcc gatggtggcc accggccgac cgatgtcatc 720 agcgacccgc acaccccagc catccgcgac ccgtgtcatc gcgacccgca gcgtggccga 780 gccagtgaca tggacctgga cgtggttcca ggagaacggc aaccgcacgg tgtcgcggtc 840 ggcatcgggt gtgttcagga tcccggcgtg cagggcggca tccaacaccg cagggtggac 900 ggcgaatcgt gccgcgtcct gggtctgctc ctcagccaga gcaacctcgg cgaagacggt 960 gtcaccatca cgccacgcgg cctgcaaacc ctggaaggca ggtccgtact cgtaacccgc 1020 cctggtcagc tggtcgtaga agcctgccac gtccaccggc ttggcctgcg caggtggcca 1080 cgcggtgagg tccgacgttg gcacagtcgt gtcggacacg ctgacggtgg cggaaacgtg 1140 ccggacccag gcatcggcgc tgtccgcccg ggagaagacc gtcaccgcgc ggtgtccgga 1200 ctcgtcggcc tcgccgacgg atacggacag ttgcacaccg ccggtctgcg gcagcagaag 1260 cggggcttcg acgatcagct cgtcaacgac gtcgcagccc acctcatcag ccgcgcggac 1320 aaccagctcc acaaacccgg taccgggcag caggacactg ccccggaccg cgtgatcagc 1380 cagccacgcg tgggtggcca gtgatacccg cccggtcagc atcacaccat ccgaacccgg 1440 catcgccagc accgcaccca gcaacggatg gcccaccgca tccagacccg cccccgacac 1500 atcggcagac cggccggcct cagcccaata ccgctggtgc tggaacgcgt acgtcggaag 1560 atccagcacc cgtgttgccg ggacatcacc taggac 1596 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 16 cctggccagg aaagacgaac acgatcct 28 <210> 17 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 17 cgaagcttga gccgctggcg atcgtggga 29 <210> 18 <211> 1550 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Right region of homology PCR product from AT10, amplified from S. hygroscopicus using SEQ ID NOs 1 and 2, which contain additional restriction sites. <400> 18 cctgccagga aagacgaaca cgatcctggg gtcggacacc gcggtgccgg tgacggtctc 60 atctccaagg agtacggcgc ggtgctcgaa caccgaccgt gtcaccgcca gcgtcgatgc 120 cacagcccgt atatccactc cgggcgacgc cgccaggtag gcgcggagcc ggtcttcgtg 180 ttcggtcagg gcgggctggg tcttggccga tatcaccagc ggcaccagtt ccgaaaccag 240 tacgggtgta gagccagccg tgtcgcccac agactgtgcc ggtgcactct caaggatgac 300 gtgggcgtta gtgccactga tcccgaacga cgacacacct gcccgacggg gtcggccggt 360 ctccggccac ggctggttct ccgccaccag ctcgaccgca cccgccgacc agtccacatg 420 ccgcgacggc tcatccacat gcaacgtgcg cggcaccatg ctgtgctgca gggccatcac 480 catcttgatg acacccgaca cacctgcggc agcctgggta tggccgacgt tcgacttcag 540 cgatcccagc agcagcggct ccccgcggcc ctggccgtaa gtagcgatca ccgcctgggc 600 ctcgatcggg tcacccagcg tcgtacccgt gccgtgcgcc tcgaccacat ccacctcgtg 660 cggcgccagg ccggcgttgc tgagagcggc ccggatcacc cgctgctgcg aaggaccgtt 720 cggcgcggac aggccgttcg acgcaccgtc ctggttcacc gccgagctac ggaccaccgc 780 caatatctgg tgaccgttgg cctgagcatc cgacaaacgc tccaccaata ggacgccgac 840 gccctcagcc caccccgtgc cgtccgcggc gtcagcgaac gccttgcacc ggccatcggc 900 tgacaagcct cgctgccgcg agaactccac gaaagtctgc ggcgtggcca tcacggtcac 960 gccgccgacc agggccagcg aacactcacc ctgtcgcagg gcataccccg cctgatgcaa 1020 cgccaccagc gacgacgaac acgccgtgtc caccgtgaac gcgggacctt cgagaccgaa 1080 gaagtacgac acccggcccg acaacacact cgccgcacca gcagttgtcc cgaagccgcc 1140 gaggtcggca ccgatgccgt agccaccggg gtaagcacct atgaagacgc cggtgtcgct 1200 gccgcgtacg gaaccgggct cgatcccggc ccgctcgaac gcctcccagg acacctcaag 1260 catcaaccgc tgctgcggat ccatcgccaa cgcctcacgc ggactgatcc cgaagaacga 1320 ggcgtcgaaa ccggccgcgg catccaggaa gccgccctgc acgctgtagg acttcccggg 1380 cgcgtccggg tccggatcgt acaggttctc gacgtcccag ccgcggtcgg ttgggaagcc 1440 ggaaatcgcg tccgtaccgg actcgaccaa gcgccacaga tcctccggcg acgagactcc 1500 accgggtagg cggcaggcca ttcccacgat cgccagcggc tcaagcttcg 1550 IP0020-WO01 9/9

Claims

17-데스메틸라파마이신 그의 유사체.

제1항에 있어서, 하기 식을 가지며:

상기에서,

또는 -CHR₅-X-CHR₆- 는

를 나타내며;

R₁은 =0 또는 (H, H)를 나타내고;

R₂는 OH 또는 OMe를 나타내며;

R₃는 H, OH 또는 OMe를 나타내고;

R₄는 하기의 A, B, C, D, E 및 F 기로부터 선택되는 구조적 단편을 나타내 며,

상기에서 파형의 선은 상기 단편의 결합 위치를 나타내고,

R₇은 H, OH 또는 OMe를 나타내며

R₈은 H, OH, OMe, 할로, 티올 또는 C₁ _-4 알킬을 나타내고;

R₅ 및 R₆는 각각 독립적으로 H 또는 OH인 것인 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염.

제1항에 있어서, 상기 R₄는 제1항에서 정의된 바와 같은, A, B, C, E 및 F 기로부터 선택되는 구조적 단편이고, 상기에서 R₇은 H, OH 또는 OMe를 나타내고 R₈ 은 H, OH, OMe, Cl 또는 F를 나타내는 것인 화합물.

제3항에 있어서, R₄는 하기의 A(i), C(i), E(i) 및 F(i)로부터 선택된 단편이고:

상기에서 R₇은 H 또는 OH를 나타내고 R₈은 H, OH 또는 OMe를 나타내는 것인 화합물.

제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R₅는 OH를 나타내고, 상기 R₆는 H를 나타내며 상기 R₆가 OH를 나타내면 상기 R₅는 H를 나타내는 것인 화합물.

제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 x는 직접 결합 또는 CH₂를 나타내는 것인 화합물.

제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 x는 CH₂를 나타내는 것인 화합물.

제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R₂는 OH를 나타내는 것인 화합물.

제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R₁은 (H, H)를 나타내고, 상기 R₂는 OH를 나타내며, 상기 R₃은 H를 나타내고, 상기 R₄는 상기 R₇ 및 R₈이 모두 OH를 나타내는 경우를 제외하고 제4항에 정의된 바와 같은 구조적 단편 C(i)을 나타내고, 상기 x는 CH₂를 나타내는 것인 화합물.

제2항에 있어서, 상기 R₁은 (H, H)를 나타내고, 상기 R₂는 OH를 나타내며, 상기 R₃은 H를 나타내고, 상기 R₄는 상기 R₇이 OH를 나타내고 상기 R₈은 H를 나타내는 경우를 제외하고 제4항에 정의된 바와 같은 구조적 단편 C(i)을 나타내고, 상기 x는 CH₂를 나타내는 것인 화합물.

제2항에 있어서, 상기 R₁은 (H, H) 또는 =O를 나타내고, 상기 R₂는 OH 또는 OMe를 나타내며, 상기 R₃은 OH 또는 OMe를 나타내고, 상기 R₄는 상기 R₇이 OH를 나타내고 상기 R₈은 H, OH 또는 OMe를 나타내는 경우를 제외하고 제4항에 정의된 바와 같은 구조적 단편 C(i)을 나타내고, 상기 x는 CH₂를 나타내는 것인 화합물.

제2항에 있어서, 상기 R₁은 =O를 나타내고, 상기 R₂는 OH 또는 OMe를 나타내며, 상기 R₃은 H, OH 또는 OMe를 나타내고, 상기 R₄는 상기 R₇가 OH를 나타내고 상기 R₈은 F 또는 Cl을 나타내는 경우를 제외하고 제4항에 정의된 바와 같은 구조적 단편 C(i)을 나타내고, 상기 x는 CH₂를 나타내는 것인 화합물.

제2항에 있어서, 상기 R₁은 =O를 나타내고, 상기 R₂는 OH를 나타내며, 상기 R₃은 OMe를 나타내고 상기 R₄는 상기 R₇이 OH를 나타내고 상기 R₈은 H를 나타내는 경우를 제외하고 제4항에 정의된 바와 같은 구조적 단편 C(i)을 나타내고, 상기 x는 CH₂를 나타내는 것인 화합물.

제2항에 있어서, 상기 R₁은 =O를 나타내고, 상기 R₂는 OH를 나타내며, 상기 R₃은 OH를 나타내고, 상기 R₄는 상기 R₇이 OH를 나타내고 상기 R₈은 H를 나타내는 경우를 제외하고 제4항에 정의된 바와 같은 구조적 단편 C(i)을 나타내고, 상기 x는 CH₂를 나타내는 것인 화합물.

제2항에 있어서, 상기 R₁은 =O를 나타내고, 상기 R₂는 OH를 나타내며 상기 R₃은 OMe를 나타내고 상기 R₄는 상기 R₇이 OH를 나타내고 상기 R₈은 OMe를 나타내는 경우를 제외하고 제4항에 정의된 바와 같은 구조적 단편 C(i)을 나타내고, 상기 x는 CH₂를 나타내는 것인 화합물.

의약에서의 용도를 위한 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에서 정의된 화합물.

면역억제의 유도 또는 유지, 신경세포 재생의 촉진 또는 암, B-세포 악성종양, 진균성 감염증, 이식 거부, 이식편-대-숙주 질병, 자가면역 질환, 염증성 질병, 및 혈관 질병의 치료를 위한 약제의 제조에서의 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.

제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.

제1항 또는 제2항에 따른 17-데스메틸라파마이신 또는 그의 유사체를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은:

(a) 라파마이신 PKS의 모듈 10의 메틸말로닐-CoA 특이적 AT 도메인을 말로닐 -CoA-특이적 AT 도메인으로 치환하는 단계,

(d) 선택적으로, 상기 생산된 화합물을 분리하는 단계를 포함하는 것인 방법.

모듈 10의 메틸말로닐-CoA 특이적 AT 도메인이 말로닐-CoA 특이적 AT 도메인으로 치환된 것인 조작된(engineered) 라파마이신 폴리케티드 신타아제를 코딩하는 생합성 클러스터를 포함하는 재조합 균주를 생성하는 방법.

제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 모듈 10의 메틸말로닐-CoA 특이적 AT 도메인은 하기의 클러스터들 중 하나로부터의 말로닐-CoA 특이적 AT 도메인으로 치환되는 것인 방법: 라파마이신, 모넨신, FK506, 에리트로마이신, FK520, 암포테리신, 안골라마이신(angolamycin), 틸로신(tylosin), 'hyg', FK523, 메리다마이신, 안타스코미신, FK525 및 추쿠바마이신(tsukubamycin).

제21항에 있어서, 상기 말로닐-CoA 특이적 AT 도메인은 하기의 클러스터들 중 하나로부터 선택되는 것인 방법: 라파마이신, 모넨신 및 FK506.

제22항에 있어서, 상기 AT 도메인은 라파마이신 모듈 2로부터의 AT 도메인, 모넨신 모듈 3으로부터의 AT 도메인, 모넨신 모듈 6으로부터의 AT 도메인, 모넨신 모듈 8로부터의 AT 도메인, FK506 모듈 3으로부터의 AT 도메인 및 FK506 모듈 7로부터의 AT 도메인으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.

제23항에 있어서, 상기 말로닐-CoA 특이적 AT 도메인은 라파마이신 모듈 2로부터 유래되는 것인 방법.

제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은:

(a) 도입될 AT를 적합한 플랭킹 제한 부위(flanking restriction site)를 갖는 단일의 DNA 단편으로 분리하는 단계,

i) 접합을 위한 oriT,

ii) 하나 이상의 저항성 마커,

(j) 선택적으로, 표준 방법에 의해 상기 균주의 유전학적 특성(genetics)을 확인하는 단계;의 추가적인 단계를 포함하는 것인 방법.

17-데스메틸라파마이신 유사체를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은:

(a) 제20항에 따라, 라파마이신 PKS의 모듈 10의 메틸말로닐-CoA 특이적 AT 도메인이 말로닐-CoA 특이적 AT 도메인으로 치환된 재조합 균주를 생성하는 단계, 및;

(b) 폴리케티드 생산에 적합한 조건 하에서 상기 재조합 균주의 배양에 비-천연 스타터 산(non-natural starter acid)을 공급하는 단계;를 포함하는 것인 방법.

(a) 제20항에 따라, 라파마이신 PKS의 모듈 10의 메틸말로닐-CoA 특이적 AT 도메인이 말로닐-CoA 특이적 AT 도메인으로 치환된 재조합 균주를 생성하는 단계,

(b) rapI, rapJ, rapK, rapL, rapM, rapN, rapO 및 rapQ로부터 선택된 하나 이상의 라파마이신 보조(auxiliary) 유전자를 추가적으로 결실시키거나 또는 불활성화시키는 단계, 및

(c) 17-데스메틸라파마이신 유사체를 생산하기 위해, 필요한 경우 선택적으로 외래 전구체의 존재 하에, 상기 수득된 균주를 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.

(c) 상기 결실을 완전히 또는 부분적으로 보완하기 위해 모든 보조 유전자 또는 일부(subset)의 보조 유전자를 트랜스로 재도입하는 단계, 및

(d) 17-데스메틸라파마이신 유사체를 생산하기 위해, 필요한 경우 선택적으로 외래 전구체의 존재 하에 상기 수득된 균주를 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.

(c) 선택적으로, 상기 결실을 완전히 또는 부분적으로 보완하기 위해 모든 보조 유전자 또는 일부의 보조 유전자를 트랜스로 재도입하는 단계, 및

(d) 폴리케티드의 생성을 위해 적합한 조건 하에서 상기 재조합 균주에 비-천연 스타터 산을 공급하는 단계를 포함하는 것인 방법.