CN101836980A - 39-去甲氧基雷帕霉素及其类似物的医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及39-去甲氧基雷帕霉素类似物的医药用途。

Description

39-去甲氧基雷帕霉素及其类似物的医药用途

本申请是中国发明专利申请(申请日：2006年3月10日；申请号：200680012675.1(国际申请号：PCT/GB2006/000834)；发明名称：39-去甲氧基雷帕霉素及其类似物的医药用途)的分案申请。

发明背景

雷帕霉素(Rapamycin)(西罗莫司(sirolimus))(图1)是由吸湿链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)NRRL 5491产生的亲脂性的大环内酯(Sehgal等，1975；Vézina等，1975；U.S.3,929,992；U.S.3,993,749)，其带有与哌可酸内酯相连的1，2，3-三羰基部分(Paiva等，1991)。对于本发明的目的来说，不使用Findlay等(1980)或化学文摘(第11累积索引，1982-1986 p60719CS)的编号方式规定，而通过McAlpine等(1991)的编号方式规定来描述雷帕霉素。

由于其广谱生物活性，雷帕霉素具有重要治疗价值(Huang等，2003)。该化合物是哺乳动物雷帕霉素靶位(mTOR)的有效抑制剂，该靶位处于介导细胞存活和增殖的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt(蛋白激酶B)信号途径的丝氨酸-苏氨酸激酶下游。雷帕霉素结合于免抑蛋白FK506结合蛋白12(FKBP12)后便获得了该抑制活性(Dumont，F.J.和Q.X.Su，1995)。在T细胞中，雷帕霉素抑制来自IL-2受体的信号传递和随后的T细胞自我增殖，从而导致免疫抑制。雷帕霉素作为免疫抑制剂上市，用于治疗器官移植患者以防止移植体排斥(Huang等，2003)。除了免疫抑制，雷帕霉素在治疗大量疾病中有着潜在的治疗用途，例如，癌症、诸如再狭窄的心血管疾病、诸如多发性硬化、风湿性关节炎的自体免疫疾病、真菌感染和诸如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和亨廷顿氏症的神经退行性疾病。

尽管其可用于多种疾病状态，但是雷帕霉素也有许多大缺点。首先它是细胞膜流出泵P-糖蛋白(P-gp，LaPlante等，2002，Crowe等，1999)的底物，所述P-糖蛋白将化合物泵出细胞，从而使得雷帕霉素穿过细胞膜的能力差。这造成给药后化合物吸收差。另外，由于癌细胞的多药物耐受性的主要机理是通过细胞膜流出泵，因此雷帕霉素抗多药物耐受性(MDR)的癌细胞较不有效。其次，雷帕霉素通过细胞色素P450酶被广泛代谢(Lampen等，1998)。其在肝脏第一关卡(hepatic first pass)会丧失掉很多，进一步导致其低口服生物利用度。CYP3A4和P-gp在雷帕霉素低生物利用度中的作用已经在研究中被确认了，这些研究证实了施用CYP3A4和/或P-gp抑制剂减少了雷帕霉素从转染了CYP3A4的Caco-2细胞中流出(Cummins等，2004)，而且施用CYP3A4抑制剂能降低雷帕霉素的小肠代谢(Lampen等，1998)。雷帕霉素低生物利用度造成了显著的个体间差异，导致治疗结果不一致并且难以进行临床管理(Kuhn等，2001，Crowe等，1999)。

所以，有需求要开发新的雷帕霉素样化合物，其不是P-gp的底物，其代谢更稳定，因而生物利用度改善。当用作抗癌剂时，这些化合物可以更有效地抗MDR癌细胞，尤其是抗表达P-gp的癌细胞。

已经报道利用分子上可化学利用的位点的一些合成的雷帕霉素类似物。以下化合物的说明与图1所述雷帕霉素分子的编号系统相适应。分子上用于衍生或取代的可化学利用的位点包括C40和C28羟基(如U.S.5,665,772；U.S.5,362,718)、C39和C16甲氧基(如WO 96/41807；U.S.5,728,710)、C32、C26和C9酮基(如U.S.5,378,836；U.S.5,138,051；U.S.5,665,772)。在C17、C19和/或C21上氢化，靶向于三烯，可保持抗真菌活性但相对损失了免疫抑制能力(如U.S.5,391,730；U.S.5,023,262)。通过衍生化，已经显著改善了分子的稳定性(如在C32、C40和/或C28上形成肟，U.S.5,563,145，U.S.5,446,048)、对代谢攻击的耐受性(如U.S.5,912,253)、生物利用度(如U.S.5,221,670；U.S.5,955,457；WO 98/04279)并产生前药(如U.S.6,015,815；U.S.5,432,183)。

临床开发中的两种最先进的雷帕霉素衍生物是40-O-(2-羟基)乙基-雷帕霉素(RAD001，Certican，everolimus)——显示出免疫抑制药理效应的雷帕霉素半合成类似物(Sedrani，R.等，1998；Kirchner等，2000；U.S.5,665,772)和40-O-[2，2-二(羟甲基)丙酰氧基]雷帕霉素(CCI-779(Wyeth-Ayerst))——抑制细胞体外生长并抑制肿瘤体内生长的雷帕霉素酯(Yu等，2001)。CCI-779目前在各种临床试验中用作潜在的抗癌药物。近来公开的CCI-779在患有复发性多形性成胶质细胞瘤的患者中进行的II期研究(Chang，等，2005)暗示，在这些患者中该药物的低功效可归因于其不良的血脑屏障穿透性。调查RAD001药物动力学的研究表明，与雷帕霉素类似，它是P-gp的底物(Crowe等，1999，LaPlante等，2002)。

尽管本发明的化合物结构与雷帕霉素很相似，但是他们出人意料地显示出不同的药理学特性。与雷帕霉素相比，它们尤其显示出能显著增加细胞膜穿透性并减少流出，而且它们不是P-gp的底物。另外，39-去甲氧基雷帕霉素比雷帕霉素有更强的抗多药物耐受性和抗表达P-gp的癌细胞系活性。当与雷帕霉素比较时，39-去甲氧基雷帕霉素显示出显著不同的针对NCI60细胞系的抑制特性。

另外，与雷帕霉素和临床试验中领先的衍生物比较，39-去甲氧基雷帕霉素类似物显示出显著不同的药物动力学特性。出人意料的是，39-去甲氧基雷帕霉素类似物显示出穿过血脑屏障的能力增强，由此证明了其在脑中利用度改善。

所以，本发明提供了39-去甲氧基雷帕霉素类似物的医药用途，这些雷帕霉素类似物具有显著改变的药物动力学性质，穿过血脑屏障的能力改善，代谢稳定性改善，细胞膜穿透性改善，流出率减低，并有不同于雷帕霉素的肿瘤细胞抑制特性。这些化合物可用于医药中，尤其用于治疗癌症和/或B-细胞恶性肿瘤，用于诱导或维持免疫抑制，刺激神经元再生或治疗真菌感染、移植排斥、移植物抗宿主疾病、自体免疫性疾病、炎性血管疾病和纤维化疾病。本发明尤其提供了39-去甲氧基雷帕霉素在治疗癌症和/或B-细胞恶性肿瘤中的用途。

已经证明雷帕霉素能刺激自体吞噬(Raught等，2001)。许多疾病涉及自体吞噬受损或自体吞噬失调，包括阿茨海默氏病、帕金森氏症、亨廷顿氏病和朊病毒疾病(包括克雅二氏症)，这暗示了操控该途径可证明对这些疾病有益。近来体外研究证明，施用雷帕霉素能减少与转染的COS-7细胞中聚(Q)和聚(A)增加相关的凝集体的出现和细胞死亡(Ravikumar等，2002)。所以，如果雷帕霉素能穿过血脑屏障，那么这些结果显示它成为了用以治疗亨廷顿氏病和其他相关疾病的合适的候选物。这暗示了需要开发能穿过血脑屏障的雷帕霉素类似物。

微管相关蛋白质τ的超磷酸化及其随之凝集成不可溶的形成细胞内“缠结”的成对螺旋丝，这是阿尔茨海默氏病的典型特征之一，而且神经原纤维病理的凝集及相关神经细胞死亡与认知衰退非常相关。近来An等(2003)的研究证明了，活化的p70S6激酶在阿尔茨海默氏病的脑中与神经原纤维病理共分布，尤其是在发展成缠结前，活化的p70S6激酶在神经元中明显增加(An等，2003)。在体外试验中，当施用硫酸锌活化了p70S6激酶并增加总的、正常的和超磷酸化的τ的水平时，用雷帕霉素预处理细胞显示出p70S6激酶活化减少三倍并显著降低了总的、正常的和超磷酸化的τ的水平。所以，这些结果显示，如果化合物能到达作用位点，施用雷帕霉素或雷帕霉素类似物有益于减轻阿尔茨海默氏病的神经原纤维病理。

另外，据报道，雷帕霉素在几个体外和体内模型中能增加神经突长出和神经元存活(Avramut和Achim，2002)，这显示雷帕霉素及其类似物可用于治疗其中神经再生可能具有显著治疗益处的疾病。可是，该应用依赖于其能到达作用位点，因而穿过血脑屏障能力改善的雷帕霉素类似物是尤其优选的。

本发明提供了新的而且令人吃惊的39-去甲氧基雷帕霉素类似物在药物中的用途，尤其是39-去甲氧基雷帕霉素的用途，特别用于治疗癌症或B-细胞恶性肿瘤，用于诱导或维持免疫抑制，刺激神经元再生或治疗真菌感染、移植排斥、移植物抗宿主疾病、自体免疫性疾病、神经退行性病症、炎性血管疾病和纤维化疾病。尤其是，本发明提供了39-去甲氧基雷帕霉素类似物在治疗癌症和B-细胞恶性肿瘤中的用途。在优选的具体实施方式中，本发明提供了39-去甲氧基雷帕霉素类似物在治疗神经或神经退行性疾病中的用途。在进一步优选的具体实施方式中，本发明提供了39-去甲氧基雷帕霉素类似物在治疗脑肿瘤、尤其是多形性成胶质细胞瘤(glioblastomamultiforme)中的用途。在本发明的一个特定方面，39-去甲氧基雷帕霉素类似物是39-去甲氧基雷帕霉素。

发明概要

本发明涉及39-去甲氧基雷帕霉素类似物、尤其是39-去甲氧基雷帕霉素的医药用途，尤其用于治疗癌症和/或B-细胞恶性肿瘤，诱导或维持免疫抑制，治疗移植排斥、移植物抗宿主疾病、自体免疫性疾病、神经退行性病症、炎症疾病、血管疾病和纤维化疾病，刺激神经元再生或治疗真菌感染。尤其，本发明涉及39-去甲氧基雷帕霉素类似物用于治疗癌症和B-细胞恶性肿瘤的用途。在特定的具体实施方式中，本发明涉及39-去甲氧基雷帕霉素在治疗癌症和B-细胞恶性肿瘤中的用途。本发明还明确提供了39-去甲氧基雷帕霉素类似物在治疗一种或多种脑肿瘤或神经退行性病症中的用途。在特定的具体实施方式中，本发明提供了39-去甲氧基雷帕霉素在治疗一种或多种脑肿瘤或神经退行性病症中的用途。本发明还明确提供了39-去甲氧基雷帕霉素类似物在治疗神经退行性病症中的用途。尤其，本发明提供了39-去甲氧基雷帕霉素在治疗神经退行性病症中的用途。

定义

本文所用的冠词“a”和“an“指冠词的一个或指超过一个(即至少一个)语法对象。例如，“类似物”指一个或指超过一个类似物。

如本文所用的，术语“一种或多种自体免疫性疾病”包括而不限于：系统性红斑狼疮(SLE)，类风湿性关节炎，重症肌无力和多发性硬化。

如本文所用的，术语“炎症疾病”包括而不限于：牛皮癣，皮炎，湿疹，脂溢性皮炎，炎性肠病(包括但不限于溃疡性结肠炎和克罗恩氏病)，肺部炎症(包括哮喘、慢性梗阻性肺病、肺气肿、急性呼吸窘迫综合征和支气管炎)，类风湿性关节炎和眼色素层炎。

如本文所用的，术语“癌症”指细胞在皮肤或身体器官中恶性或良性的生长，例如但不限于在乳腺、前列腺、肺、肾、胰腺、脑、胃或肠中。癌倾向于渗透到邻近组织并扩散(转移)到远处器官上，如转移到骨、肝、肺或脑中。本文所用的术语癌包括转移性肿瘤细胞类型(例如但不限于黑素瘤、淋巴瘤、白血病、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、和肥大细胞瘤)和组织癌类型(例如但不限于结肠直肠癌、前列腺癌、小细胞肺癌和非小细胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、神经胶质瘤、原发性肝癌和卵巢癌。该术语也明确涵盖以下更完整描述的一种或多种脑肿瘤。

本文所用的术语“一种或多种脑肿瘤”指细胞在脑中恶性或良性的生长，它包括原发和继发性(转移性)的肿瘤。原发脑肿瘤包括而不限于，神经胶质瘤(如多形性成胶质细胞瘤、星细胞瘤、脑干神经胶质瘤、室鼓膜瘤和寡枝神经胶质细胞瘤)、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、神经鞘瘤(或听神经瘤)、颅咽管瘤、脑部干细胞肿瘤(如生殖细胞瘤)、或松果体区域的肿瘤。术语“脑癌”也用于描述以上疾病，这些术语在本文中可互换使用。

本文所用的术语“B-细胞恶性肿瘤”包括一组疾病，其包括慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多发性骨髓瘤、和非何杰金氏淋巴瘤(NHL)。它们是血液和造血器官的瘤性疾病。它们造成骨髓和免疫系统障碍，其使宿主高度易受感染和出血影响。

如本文所用的，术语“血管疾病”包括而不限于：超增殖性血管病症(如再狭窄和血管闭塞)、移植物血管动脉粥样硬化症、心血管疾病、脑血管疾病和外周血管疾病(如冠状动脉疾病、动脉硬化、动脉粥样硬化症、非动脉粥样化的动脉硬化或血管壁损伤)。它还用于涉及眼中血管再生或增殖的疾病，尤其是脉络膜新生血管化。

本文所用的术语“神经再生”指刺激细胞生长，并包括神经突长出和神经元细胞功能恢复。神经再生对其是有显著治疗益处的疾病和病症包括但不限于，阿尔茨海默氏病、帕金森氏症疾病、亨廷顿氏舞蹈病(症)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、三叉神经痛、舌咽神经痛、颜面神经麻痹、肌肉萎缩症、中风、进行性肌萎缩、进行性延髓遗传性肌萎缩、颈部脊椎强硬症、Gullain-Barre综合症、痴呆、外周神经病和外周神经损伤，其可以是物理损伤(如脊髓损伤或外伤、坐骨或脸神经损伤或伤害)或疾病状况(如糖尿病)造成的。

如本文所用的，术语“由神经损伤或疾病造成的医学病症”包括而不限于，一种或多种神经退行性病症、一种或多种脑肿瘤、脑部感染或炎症和其他可导致神经或神经胶质细胞或组织死亡的病症。

本文所用的术语“一种或多种神经退行性病症”包括而不限于，阿尔茨海默氏病、帕金森氏症、亨廷顿氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、(眼咽)肌营养不良(包括眼咽肌营养不良)，多发性硬化、朊病毒疾病(如克雅病(CJD))、Pick氏病、Lewy小体痴呆(或Lewy小体疾病)和/或运动神经元疾病。

如本文所用的，术语“需要药物穿越血脑屏障的影响中枢神经的医学病症”包括而不限于得自神经损伤或疾病的医学病症、和需要药物到达神经元细胞进行有效治疗的任何其他状况。

本文所用的术语“纤维化疾病”指与过量产生细胞外基质相关的疾病，其包括(而不限于)结节病、瘢痕瘤、血管球性肾炎、末期肾病、肝纤维化(包括但不限于硬化、酒精肝病和脂肪性肝炎、慢性移植肾病(chronicgraft nephropathy)、外科手术粘连、血管病症、心脏纤维化、肺纤维化(包括但不限于先天肺纤维化和原因不明性纤维性肺泡炎)、黄斑变性、视网膜和虹膜视网膜病和化疗或放射诱发的纤维化。

如本文所用的，术语“移植物抗宿主疾病”指同种异体干细胞/骨髓移植后观察到的并发症。它发生在供体的对抗感染的细胞将患者身体识别为不-同或外来物的时候。然后这些对抗感染的细胞攻击患者身体组织，就好像它们在攻击感染。GvHD被分成急性的和慢性的，在移植后前100天内发生的是急性的，而移植后超过100天发生的是慢性的。典型涉及的组织包括肝、胃肠道和皮肤。慢性移植物抗宿主疾病发生在干细胞/骨髓移植后约百分之10-40的患者中。

如本文所用的，术语“生物利用度”指施用后药物或其他物质被吸收或变得在生物活性位点上可利用的程度或比率。该性质依赖于许多因素，包括化合物的可溶性、肠中的吸收率、蛋白质结合和代谢的程度等。各种生物利用度测试对所属领域技术人员来说是熟悉的，其在本文中有描述(也可参见Trepanier等，1998，Gallant-Haidner等，2000)。

本文所用的术语“对一种或多种现有抗癌剂有耐受性的癌症或B-细胞恶性肿瘤”指癌症或B-细胞恶性肿瘤，至少一种常规使用的疗法对其是无效的。这些癌症的特征在于能在施用至少一种瘤制剂后存活，而相应正常的细胞(即，相同起源的生长受调节的细胞)会显示出细胞毒性、细胞死亡或细胞静止(即，不会分裂)的迹象。尤其是，这包括MDR癌症或B-细胞恶性肿瘤，特定的例子是表达高水平P-gp的癌症和B-细胞恶性肿瘤。这些耐受的癌症或B-细胞恶性肿瘤的鉴别是在医师或其他类似熟练技术人员的能力和常规工作的范围内。

本文所用的术语“39-去甲氧基雷帕霉素类似物”指根据下式(I)所示的化合物、或其药学上可接受的盐。

其中，R₁代表(H，H)或＝O，而且R₂和R₃各自独立代表H、OH或OCH₃。这些化合物也被称为“本发明的化合物”，而且这些术语在本申请中可互换使用。

在本申请中，术语“39-去甲氧基雷帕霉素类似物”包括39-去甲氧基雷帕霉素本身。

如本文所用的，术语“39-去甲氧基雷帕霉素”指根据上式(I)所示的化合物、或其药学上可接受的盐，其中R₁代表＝O，而且R₂和R₃各自代表OCH₃。

39-去甲氧基雷帕霉素类似物的药学上可接受的盐包括由药学上可接受的无机或有机酸或碱以及季铵酸式加成盐形成的常规的盐。合适酸式盐的更特定的例子包括盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、高氯酸、富马酸、醋酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、甲酸、乳酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、棕榈酸、丙二酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、安息香酸、水杨酸、反丁烯二酸、甲苯磺酸、甲基磺酸、萘-2-磺酸、苯磺酸羟基萘酸、氢碘酸、苹果酸、类固醇、丹宁酸等的盐。其他酸，如草酸，它们不是药学上可接受的，可用于制备盐，以用作为中间体获得本发明的化合物和它们的药学上可接受的盐。合适的碱式盐的更特定例子包括钠、锂、钾、镁、铝、钙、锌、N，N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡萄糖胺和普鲁卡因盐。下文对于本发明所述的化合物的表述包括39-去甲氧基雷帕霉素及其药学上可接受的盐。

发明内容

本发明涉及39-去甲氧基雷帕霉素类似物在医药中的用途，尤其用于治疗癌症、B-细胞恶性肿瘤，诱导或维持免疫抑制，治疗移植排斥、移植物抗宿主疾病、自体免疫性疾病、神经退行性病症、炎症疾病、血管疾病和纤维化疾病，刺激神经元再生，治疗神经疾病或神经退行性病症或治疗真菌感染。所以，本发明提供了39-去甲氧基雷帕霉素类似物、或其药学上可接受的盐的用途，其用于治疗由神经损伤或疾病造成的医学病症。在特定的具体实施方式中，本发明提供了39-去甲氧基雷帕霉素、或其药学上可接受的盐的用途，其用于治疗由神经损伤或疾病造成的医学病症。在进一步的具体实施方式中，本发明提供了与雷帕霉素在第9、16或27位之一个或多个位置上有额外区别的39-去甲氧基雷帕霉素类似物在治疗由神经损伤或疾病造成的医学病症中的用途。

本发明还提供了39-去甲氧基雷帕霉素类似物的用途，即增加了血脑屏障穿透性的雷帕霉素类似物、或其药学上可接受的盐的用途，用于治疗需要药物穿越血脑屏障的影响中枢神经的医学病症，即血脑屏障阻碍递送化合物的医学病症。在特定的具体实施方式中，本发明提供了39-去甲氧基雷帕霉素、或其药学上可接受的盐的用途，用于治疗其中血脑屏障阻碍递送化合物的影响中枢神经系统的医学病症。在进一步的具体实施方式中，本发明提供了与雷帕霉素在第9、16或27位之一个或多个位置上有额外区别的39-去甲氧基雷帕霉素类似物的用途，用于治疗其中血脑屏障阻碍递送化合物的影响中枢神经系统的医学病症。

在特定的具体实施方式中，本发明涉及39-去甲氧基雷帕霉素类似物用于治疗癌症和B-细胞恶性肿瘤的用途。在进一步的具体实施方式中，本发明涉及39-去甲氧基雷帕霉素用于治疗癌症和B-细胞恶性肿瘤的用途。在进一步的具体实施方式中，本发明涉及与雷帕霉素在第9、16或27位之一个或多个位置上有额外区别的39-去甲氧基雷帕霉素类似物用于治疗癌症和B-细胞恶性肿瘤的用途。本发明还明确提供了39-去甲氧基雷帕霉素类似物在治疗一种或多种脑肿瘤中的用途。本发明进一步提供了39-去甲氧基雷帕霉素治疗一种或多种脑肿瘤的用途。在进一步的具体实施方式中，本发明提供了与雷帕霉素在第9、16或27位之一个或多个位置上有额外区别的39-去甲氧基雷帕霉素类似物在治疗一种或多种脑肿瘤中的用途。特别地，本发明提供了39-去甲氧基雷帕霉素类似物在治疗多形性成胶质细胞瘤中的用途。在特定的具体实施方式中，本发明提供了39-去甲氧基雷帕霉素在治疗多形性成胶质细胞瘤中的用途。在进一步的具体实施方式中，本发明提供了与雷帕霉素在第9、16或27位之一个或多个位置上有额外区别的39-去甲氧基雷帕霉素类似物在治疗多形性成胶质细胞瘤中的用途。

本发明还提供了39-去甲氧基雷帕霉素类似物在治疗神经退行性病症中的用途。在进一步的具体实施方式中，本发明提供了39-去甲氧基雷帕霉素在治疗神经退行性病症中的用途。在进一步的具体实施方式中，本发明提供了与雷帕霉素在第9、16或27位之一个或多个位置上有额外区别的39-去甲氧基雷帕霉素类似物在治疗神经退行性病症中的用途。特别地，神经退行性病症可选自由阿尔茨海默氏病、多发性硬化和亨廷顿氏病组成的组。所以，在一个具体实施方式中，本发明提供了39-去甲氧基雷帕霉素类似物在治疗阿尔茨海默氏病中的用途。在进一步的具体实施方式中，本发明提供了39-去甲氧基雷帕霉素在治疗阿尔茨海默氏病中的用途。在进一步的具体实施方式中，本发明提供了与雷帕霉素在第9、16或27位之一个或多个位置上有额外区别的39-去甲氧基雷帕霉素类似物在治疗阿尔茨海默氏病中的用途。在进一步的具体实施方式中，本发明提供了39-去甲氧基雷帕霉素类似物在治疗多发性硬化中的用途。在进一步的具体实施方式中，本发明提供了39-去甲氧基雷帕霉素在治疗多发性硬化中的用途。在进一步的具体实施方式中，本发明提供了与雷帕霉素在第9、16或27位之一个或多个位置上有额外区别的39-去甲氧基雷帕霉素类似物在治疗多发性硬化中的用途。在可选的具体实施方式中，本发明提供了39-去甲氧基雷帕霉素类似物在治疗亨廷顿氏病中的用途。在进一步的具体实施方式中，本发明提供了39-去甲氧基雷帕霉素在治疗亨廷顿氏病中的用途。在进一步的具体实施方式中，本发明提供了与雷帕霉素在第9、16或27位之一个或多个位置上有额外区别的39-去甲氧基雷帕霉素类似物在治疗亨廷顿氏病中的用途。

在可选的具体实施方式中，本发明提供了用于治疗癌症或B-细胞恶性肿瘤的方法，诱导或维持免疫抑制、刺激神经元再生的方法，治疗真菌感染、移植排斥、移植物抗宿主疾病、自体免疫性疾病、神经退行性病症、炎症疾病、血管疾病和纤维化疾病的方法，其包括向患者施用有效量的39-去甲氧基雷帕霉素类似物，特别是39-去甲氧基雷帕霉素或与雷帕霉素在第9、16或27位之一个或多个位置上有额外区别的39-去甲氧基雷帕霉素类似物。特定地，本发明提供了治疗由神经损伤或疾病造成的医学病症的方法，其包括施用39-去甲氧基雷帕霉素类似物、或其药学上可接受的盐。在特别的具体实施方式中，本发明提供了治疗由神经损伤或疾病造成的医学病症的方法，其包括施用39-去甲氧基雷帕霉素。在进一步的具体实施方式中，本发明提供了治疗由神经损伤或疾病造成的医学病症的方法，其包括施用与雷帕霉素在第9、16或27位之一个或多个位置上有额外区别的39-去甲氧基雷帕霉素类似物。本发明还提供了治疗其中血脑屏障阻碍递送化合物的影响中枢神经系统的医学病症的方法，其通过施用有效量的39-去甲氧基雷帕霉素类似物(即增加了血脑屏障穿透性的雷帕霉素类似物)、或其药学上可接受的盐来进行。在特定的方面，39-去甲氧基雷帕霉素类似物是39-去甲氧基雷帕霉素。在另一个方面，39-去甲氧基雷帕霉素类似物是与雷帕霉素在第9、16或27位之一个或多个位置上有额外区别的39-去甲氧基雷帕霉素类似物。

本发明优选提供治疗癌症或B-细胞恶性肿瘤的方法，其包括向患者施用有效量的39-去甲氧基雷帕霉素类似物。在进一步优选的具体实施方式中，本发明提供了治疗一种或多种脑肿瘤的方法，其包括向患者施用有效量的39-去甲氧基雷帕霉素类似物。在特定的方面，39-去甲氧基雷帕霉素类似物是39-去甲氧基雷帕霉素。在另一个方面，39-去甲氧基雷帕霉素类似物是与雷帕霉素在第9、16或27位之一个或多个位置上有额外区别的39-去甲氧基雷帕霉素类似物。在特定的具体实施方式中，本发明提供了治疗多形性成胶质细胞瘤的方法，其包括向患者施用有效量的39-去甲氧基雷帕霉素类似物。在特定的方面，39-去甲氧基雷帕霉素类似物是39-去甲氧基雷帕霉素。在另一个方面，39-去甲氧基雷帕霉素类似物是与雷帕霉素在第9、16或27位之一个或多个位置上有额外区别的39-去甲氧基雷帕霉素类似物。

在进一步优选的具体实施方式中，本发明提供了治疗神经退行性病症的方法，其包括向患者施用有效量的39-去甲氧基雷帕霉素类似物。在特定的方面，39-去甲氧基雷帕霉素类似物是39-去甲氧基雷帕霉素。在另一个方面，39-去甲氧基雷帕霉素类似物是与雷帕霉素在第9、16或27位之一个或多个位置上有额外区别的39-去甲氧基雷帕霉素类似物。特别是，神经退行性病症可选自由阿尔茨海默氏病、多发性硬化和亨廷顿氏病组成的组。所以，在一个具体实施方式中，本发明提供了治疗阿尔茨海默氏病的方法，其包括向患者施用有效量的39-去甲氧基雷帕霉素类似物。在特定的方面，39-去甲氧基雷帕霉素类似物是39-去甲氧基雷帕霉素。在另一个方面，39-去甲氧基雷帕霉素类似物是与雷帕霉素在第9、16或27位之一个或多个位置上有额外区别的39-去甲氧基雷帕霉素类似物。在进一步的具体实施方式中，本发明提供了治疗多发性硬化的方法，其包括向患者施用有效量的39-去甲氧基雷帕霉素类似物。在特定的方面，39-去甲氧基雷帕霉素类似物是39-去甲氧基雷帕霉素。在另一个方面，39-去甲氧基雷帕霉素类似物是与雷帕霉素在第9、16或27位之一个或多个位置上有额外区别的39-去甲氧基雷帕霉素类似物。在可选的具体实施方式中，本发明提供了治疗亨廷顿氏病的方法，其包括向患者施用有效量的39-去甲氧基雷帕霉素类似物。在特定的方面，39-去甲氧基雷帕霉素类似物是39-去甲氧基雷帕霉素。在另一个方面，39-去甲氧基雷帕霉素类似物是与雷帕霉素在第9、16或27位之一个或多个位置上有额外区别的39-去甲氧基雷帕霉素类似物。

本发明还提供了39-去甲氧基雷帕霉素类似物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗癌症或B-细胞恶性肿瘤，用于诱导或维持免疫抑制，用于刺激神经元再生，用于治疗真菌感染、移植排斥、移植物抗宿主的疾病、自体免疫性疾病、神经退行性病症、炎症疾病、血管疾病和纤维化疾病。特定地，本发明提供了39-去甲氧基雷帕霉素类似物、或其药学上可接受的盐的用途，用于制备治疗由神经损伤或疾病造成的医学病症的药物。在特定的方面，39-去甲氧基雷帕霉素类似物是39-去甲氧基雷帕霉素。在另一个方面，39-去甲氧基雷帕霉素类似物是与雷帕霉素在第9、16或27位之一个或多个位置上有额外区别的39-去甲氧基雷帕霉素类似物。

本发明还提供了39-去甲氧基雷帕霉素类似物(即增加了血脑屏障穿透性的雷帕霉素类似物)、或其药学上可接受的盐的用途，用于制备治疗其中血脑屏障阻碍递送化合物的影响中枢神经系统的医学病症的药物。在特定的方面，39-去甲氧基雷帕霉素类似物是39-去甲氧基雷帕霉素。在另一个方面，39-去甲氧基雷帕霉素类似物是与雷帕霉素在第9、16或27位之一个或多个位置上有额外区别的39-去甲氧基雷帕霉素类似物。

本发明还明确提供了39-去甲氧基雷帕霉素类似物在制备治疗一种或多种脑肿瘤的药物中的用途。在特定的方面，39-去甲氧基雷帕霉素类似物是39-去甲氧基雷帕霉素。在另一个方面，39-去甲氧基雷帕霉素类似物是与雷帕霉素在第9、16或27位之一个或多个位置上有额外区别的39-去甲氧基雷帕霉素类似物。在特定的具体实施方式中，本发明明确提供了39-去甲氧基雷帕霉素类似物在制备治疗多形性成胶质细胞瘤的药物中的用途。在特定的方面，39-去甲氧基雷帕霉素类似物是39-去甲氧基雷帕霉素。在另一个方面，39-去甲氧基雷帕霉素类似物是与雷帕霉素在第9、16或27位之一个或多个位置上有额外区别的39-去甲氧基雷帕霉素类似物。

本发明还明确提供了39-去甲氧基雷帕霉素类似物在制备治疗神经退行性病症的药物中的用途。在特定的方面，39-去甲氧基雷帕霉素类似物是39-去甲氧基雷帕霉素。在另一个方面，39-去甲氧基雷帕霉素类似物是与雷帕霉素在第9、16或27位之一个或多个位置上有额外区别的39-去甲氧基雷帕霉素类似物。特别地，神经退行性病症可选自由阿尔茨海默氏病、多发性硬化和亨廷顿氏病组成的组。所以，在一个具体实施方式中，本发明提供了39-去甲氧基雷帕霉素类似物在制备治疗阿尔茨海默氏病的药物中的用途。在特定的方面，39-去甲氧基雷帕霉素类似物是39-去甲氧基雷帕霉素。在另一个方面，39-去甲氧基雷帕霉素类似物是与雷帕霉素在第9、16或27位之一个或多个位置上有额外区别的39-去甲氧基雷帕霉素类似物。在进一步的具体实施方式中，本发明提供了39-去甲氧基雷帕霉素类似物在制备治疗多发性硬化的药物中的用途。在特定的方面，39-去甲氧基雷帕霉素类似物是39-去甲氧基雷帕霉素。在另一个方面，39-去甲氧基雷帕霉素类似物是与雷帕霉素在第9、16或27位之一个或多个位置上有额外区别的39-去甲氧基雷帕霉素类似物.在可选的具体实施方式中，本发明提供了39-去甲氧基雷帕霉素类似物在制备治疗亨廷顿氏病的药物中的用途。在特定的方面，39-去甲氧基雷帕霉素类似物是39-去甲氧基雷帕霉素。在另一个方面，39-去甲氧基雷帕霉素类似物是与雷帕霉素在第9、16或27位之一个或多个位置上有额外区别的39-去甲氧基雷帕霉素类似物。

39-去甲氧基雷帕霉素类似物是雷帕霉素的结构相近的类似物，利用WO 04/007709所述的方法可制备它。可是，它们显示出不同于雷帕霉素的活性谱，例如用NCI 60细胞系对39-去甲氧基雷帕霉素和相关类似物进行的COMPARE分析所示的(参见下表1)。COMPARE分析利用Pearson分析来比较2种化合物在NCI 60-细胞系上的活性，并产生相关系数，其显示2种化合物活性谱有多少相似，而且这可以显示它们的作用机理有多少相关。如特定例子所示，雷帕霉素和39-去甲氧基雷帕霉素的Pearson系数是0.614，相较雷帕霉素和CCI-779(雷帕霉素的40-羟基酯衍生物)之间的Pearson系数是0.86(Dancey，2002)。所以，可以看出，39-去甲氧基雷帕霉素类似物与雷帕霉素相比有不同的活性谱。

表1

化合物	相对于雷帕霉素的Pearson系数
		16-O-去甲基-27-O-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素	0.435
27-O-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素	0.261

化合物	相对于雷帕霉素的Pearson系数
		39-去甲氧基雷帕霉素	0.614
27-去甲氧基-39-去甲氧基雷帕霉素	0.313
		CC1-779	0.86

多药物耐受性(MDR)是治疗癌症和B-细胞恶性肿瘤中的重要难题。它是许多癌症中发展出药物耐受性背后的根本原因(Persidis A，1999)。最初有效的药物在一段时间后变得完全无效。MDR与三磷酸腺苷结合表达盒传送蛋白(ABC传送蛋白)水平增高、特别是编码P-糖蛋白(P-gp)的MDR1基因或编码MRP1的MRP1基因的表达增加相关。MDR1基因表达水平在不同癌衍生出的细胞系之间变化很大，它在一些细胞系中检测不到，而在另一些中可以显示出比标准对照表达增加多至10或100倍。

雷帕霉素和39-去甲氧基雷帕霉素之间的活性谱中所显示的一些差异可以被解释，因为39-去甲氧基雷帕霉素类似物不是P-gp的底物。与雷帕霉素相比，39-去甲氧基雷帕霉素类似物从Caco-2细胞流出减少，而且体外P-gp底物试验显示39-去甲氧基雷帕霉素不是P-gp的底物(参见本文的实施例)。

所以，本发明的另一方面提供了39-去甲氧基雷帕霉素类似物在治疗对一种或多种现有抗癌剂有耐受性的癌症或B-细胞恶性肿瘤(即MDR癌症或B-细胞恶性肿瘤)中的用途。在特定的方面，本发明提供了39-去甲氧基雷帕霉素在治疗表达P-gp的癌症或B-细胞恶性肿瘤中的用途。在更优选的具体实施方式中，本发明提供了39-去甲氧基雷帕霉素在治疗高表达P-gp的癌症或B-细胞恶性肿瘤中的用途。特别地，高表达P-gp的癌症或B-细胞恶性肿瘤可以相对对照水平增加表达2倍、5倍、10倍、20倍、25倍、50倍或100倍。在以上用途的特定的方面，39-去甲氧基雷帕霉素类似物是39-去甲氧基雷帕霉素。在以上用途的另一个方面，39-去甲氧基雷帕霉素类似物是与雷帕霉素在第9、16或27位之一个或多个位置上有额外区别的39-去甲氧基雷帕霉素类似物。合适的对照是不表达P-gp的细胞，其具有低表达水平的P-gp或其具有低MDR功能，所属领域技术人员知道或能鉴定出这种细胞系；例如(但不限于)，合适的细胞系包括：MDA435/LCC6，SBC-3/CDDP，MCF7，NCI-H23，NCI-H522，A549/ATCC，EKVX，NCI-H226，NCI-H322M，NCI-H460，HOP-18，HOP-92，LXFL 529，DMS 114，DMS 273，HT29，HCC-2998，HCT-116，COLO205，KM12，KM20L2，MDA-MB-231/ATCC，MDA-MB-435，MDA-N，BT-549，T-47D，OVCAR-3，OVCAR-4，OVCAR-5，OVCAR-8，IGROV1，SK-OV-3，K-562，MOLT-4，HL-60(TB)，RPMI-8226，SR，SN12C，RXF-631，786-0，TK-10，LOX IMVI，MALME-3M，SK-MEL-2，SK-MEL-5，SK-MEL-28，M14，UACC-62，UACC-257，PC-3，DU-145，SNB-19，SNB-75，SNB-78，U251，SF-268，SF-539，XF 498。

在可选的方面，本发明提供了39-去甲氧基雷帕霉素类似物在制备用于治疗MDR癌症或B-细胞恶性肿瘤的药物中的用途。在特定的方面，本发明提供了39-去甲氧基雷帕霉素类似物在制备用于治疗表达P-gp的癌症或B-细胞恶性肿瘤的药物中的用途。在更优选的具体实施方式中，本发明提供了39-去甲氧基雷帕霉素类似物在制备用于治疗高表达P-gp的癌症或B-细胞恶性肿瘤的药物中的用途。特别地，高表达P-gp的癌症或B-细胞恶性肿瘤可相对对照水平增加表达2倍、5倍、10倍、20倍、25倍、50倍或100倍。在特定的方面，39-去甲氧基雷帕霉素类似物是39-去甲氧基雷帕霉素。在另一个方面，39-去甲氧基雷帕霉素类似物是与雷帕霉素在第9、16或27位之一个或多个位置上有额外区别的39-去甲氧基雷帕霉素类似物。合适的对照如上所述。

在样品中确定P-gp表达水平的方法在本文中另外有描述。

所以，在另一个方面，本发明提供了用于治疗表达P-gp的癌症或B-细胞恶性肿瘤的方法，其包括施用治疗有效量的39-去甲氧基雷帕霉素类似物。在特定的方面，39-去甲氧基雷帕霉素类似物是39-去甲氧基雷帕霉素。在另一个方面，39-去甲氧基雷帕霉素类似物是与雷帕霉素在第9、16或27位之一个或多个位置上有额外区别的39-去甲氧基雷帕霉素类似物。P-糖蛋白(P-gp)在特定癌症类型中的表达水平可由所属领域技术人员利用技术来确定，所述技术包括但不限于实时RT-PCR(Szakács等，2004；Stein等，2002；Langmann等；2003)、通过免疫组织化学(Stein等，2002)或利用微阵列(Lee等，2003)，这些方法仅供示例，其他合适的方法也将会为所属领域技术人员所想到。

如本文实施例所示，39-去甲氧基雷帕霉素相对于雷帕霉素显示出增加了代谢稳定性。以前许多论文将雷帕霉素上的39-甲氧基鉴定为代谢进攻以将雷帕霉素转化成39-O-去甲基雷帕霉素的主要位点(Trepanier等，1998)。与亲本化合物相比，雷帕霉素的主要代谢物显著降低了活性(Gallant-Haidner等，2000，Trepanier等，1998)。相反，39-去甲氧基雷帕霉素不再具有代谢进攻可利用的最主要的位点，造成了能增加化合物的稳定性(参见实施例)。将39-去甲氧基雷帕霉素的较高或相当的功效叠加到雷帕霉素亲本化合物上，这为本发明的化合物提供了更长的半衰期。这是39-去甲氧基雷帕霉素相对于雷帕霉素的又一令人惊讶的优点。

上述39-去甲氧基雷帕霉素的性质(不是P-gp的底物，增加了代谢稳定性和减少了通过P-gp的细胞流出)显示，与亲本化合物雷帕霉素相比，39-去甲氧基雷帕霉素改善了生物利用度。所以，本发明提供了39-去甲氧基雷帕霉素(改善了代谢稳定性、改善了细胞膜穿透性并有独特的癌细胞抑制特性的雷帕霉素类似物)在医药中的用途，尤其用于治疗癌症或B-细胞恶性肿瘤。

本发明还提供了药物组合物，其包含39-去甲氧基雷帕霉素类似物、或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。在特定的方面，本发明提供了药物组合物，其包含39-去甲氧基雷帕霉素。在另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含与雷帕霉素在第9、16或27位之一个或多个位置上有额外区别的39-去甲氧基雷帕霉素类似物。在特定的具体实施方式中，本发明提供了上述药物组合物，其特定地配制成用于静脉内施用的配方。

雷帕霉素和正在或已经进行临床试验中的相关化合物，如CCI-779和RAD001，具有差的药理学特性，包括差的代谢稳定性、差的穿透性、通过P-gp的高流出水平和差的生物利用度。本发明提供了39-去甲氧基雷帕霉素类似物或其药学上可接受的盐，其与雷帕霉素相比具有改善的药理学性质。

本发明另一令人惊讶的方面是，与现有雷帕霉素类似物相比，39-去甲氧基雷帕霉素类似物显示出显著不同的药物动力学特性。特别地，39-去甲氧基雷帕霉素类似物显示出能增加血脑屏障穿透性，因而对于给定的血液水平与相关类似物相比，能在脑中见到这些化合物的更高暴露水平。

该药物动力学差异完全是无法预料的，并且没有被任何现有技术所提示。对于包括神经退行性病症和脑肿瘤的疾病来说，当前可利用疗法的已知缺点是要解决让药物到达作用位点的难题(参见Pardridge，2005)。已有报道说这是现有雷帕霉素类似物用于治疗时的难题，特别是有研究调查了CCI-779在治疗多形性成胶质细胞瘤中的功效，结论是尽管全身浓度足够，但血脑屏障起了阻碍药物递送到肿瘤的屏障作用(Chang，2005)。所以，本发明首次公开了改善了血脑屏障穿透性的雷帕霉素类似物以及由此带来的治疗脑肿瘤和神经退行性病症的重要用途。

优选用于本发明上述方面之任意的39-去甲氧基雷帕霉素类似物包括与雷帕霉素在第9、16或27位之任一位置上有额外区别的那些，即优选39-去甲氧基雷帕霉素类似物不是39-去甲氧基雷帕霉素本身。进一步优选的39-去甲氧基雷帕霉素类似物包括那些，其中：

·39-去甲氧基雷帕霉素类似物在第27位上有羟基，即R₃代表OH；

·39-去甲氧基雷帕霉素类似物在第27位上有氢，即R₃代表OH；或

·39-去甲氧基雷帕霉素类似物在第16位上有羟基，即R₂代表OH。

利用所属领域技术人员已知的体内和体外方法，所属领域技术人员将能确定本发明化合物的药物动力学和生物利用度，所述方法包括但不限于下述的和Gallant-Haidner等，2000和Trepanier等，1998和其中参考文献中的那些。通过许多因素来确定化合物的生物利用度，(如水溶性、细胞膜穿透性、蛋白质结合和代谢以及稳定性的程度)其中每个都可通过本文实施例所述的体外测试来确定，所属领域技术人员将能理解的是，改善这些因素中的一种或多种将能改善化合物的生物利用度。可选地，39-去甲氧基雷帕霉素或其药学上可接受的盐的生物利用度可利用以下更详细描述的或本文实施例中的体内方法来测定。

体内试验

体内试验也可用于测定诸如39-去甲氧基雷帕霉素的化合物的生物利用度。通常，所述化合物向测试动物(如小鼠或大鼠)腹膜内(i.p.)或静脉内(i.v.)并口服(p.o.)施用，定期取血样以检测药物的血浆浓度如何随时间变化。血浆浓度随时间的时程可用于将化合物的绝对生物利用度计算成利用标准模型的百分比。典型规程的示例如下所述。

向小鼠静脉内给药3mg/kg 39-去甲氧基雷帕霉素或口服给药10mg/kg

39-去甲氧基雷帕霉素。在5分钟、15分钟、1h、4h和24h间隔时取血样，通过HPLC确定样品中的39-去甲氧基雷帕霉素浓度。然后可用血浆或全血浓度的时程来得出关键的参数，如血浆或血液浓度-时间曲线下的面积(AUC-其直接与到达系统循环的未改变的药物的量成正比)、最大(峰值)血浆或血液药物浓度、最大血浆或血液药物浓度发生的时间(峰值时间)、用于精确确定生物利用度的其他因素，包括：化合物的终末半衰期、全身清除率、分布的稳态体积和F％。然后通过非间隔或间隔方法分析这些参数以给出计算得出的生物利用度百分比，这种方法的例子参见Gallant-Haidner等，2000和Trepanier等，1998，和其中的参考文献。

39-去甲氧基雷帕霉素对于神经退行性疾病的功效可在本文所述的和所属领域技术人员已知的体内模型中测试。这些模型包括但不限于，对于阿尔茨海默氏病——表达人家族性阿尔茨海默氏病(FAD)p-淀粉样蛋白前体(APP)的动物、过量表达人野生型APP的动物、过量表达p-淀粉样蛋白1-42(pA)的动物、表达FAD早老素-1(PS-1)的动物(如German和Eisch，2004)。对于多发性硬化——实验性自体免疫脑脊髓炎(EAE)模型(参见Bradl，2003和实施例7)。对于帕金森氏症——1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)模型或6-羟基多巴胺(6-OHDA)模型(参见如Emborg，2004；Schober A.2004)。对于亨廷顿氏病，有几种模型，包括通过将带有高度延伸的CAG重复序列的人亨廷顿氏病(HD)基因外显子1导入进小鼠生殖系而产生的R6品系模型(Sathasivam等，1999)和其他的(参见Hersch和Ferrante，2004)。

本发明前述化合物或其配方可通过任何常规方法施用，例如但不限于非肠道、口服、局部(包括口腔、舌下或透皮)、通过医疗设备(如支架)、通过吸入或通过注射(皮下或肌肉内)施用。治疗可由一段时间的单剂量或多剂量构成。

尽管39-去甲氧基雷帕霉素类似物可以单独施用，然而优选将它与一种或多种可接受的载体一起以药物配制品提供。一种或多种载体必须是“可接受的”，含义是与本发明的化合物相容并且对其受体无害。合适的载体例子在以下将更详细地描述。

39-去甲氧基雷帕霉素类似物可单独或与其他治疗剂联合施用，联合施用两种(或更多)制剂能显著降低每种所用的剂量，由此减少它们所见到的副作用。增加39-去甲氧基雷帕霉素的代谢稳定性是优于雷帕霉素的额外优点，因此不太可能在与是P450酶底物的药物联合使用时如与雷帕霉素一起所产生的一样造成药物-药物相互作用(Lampen等，1998)。

所以在一个具体实施方式中，39-去甲氧基雷帕霉素类似物与另一种治疗剂联合施用，用于诱导或维持免疫抑制，用于治疗移植排斥、移植物抗宿主疾病、自体免疫性病症或炎症疾病。优选的试剂包括但不限于免疫调节剂，如硫唑嘌呤、皮质甾醇、环磷酰胺、环孢霉素A、FK506、霉酚酸酯、OKT-3和ATG。

在可选的具体实施方式中，39-去甲氧基雷帕霉素类似物与另一种治疗剂联合施用，用于治疗癌症或B-细胞恶性肿瘤。优选的试剂包括但不限于，甲氨蝶呤、甲酰四氢叶酸、阿霉素、强的松、博来霉素、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、紫杉醇、多西紫杉醇、长春新碱、长春碱、长春瑞宾、亚德里亚霉素、它莫西芬、托瑞米芬、乙酸甲地孕酮、阿那曲唑、戈舍瑞林、抗HER2单克隆抗体(如Herceptin^TM)、卡培他滨、盐酸雷洛昔芬、EGFR抑制剂(如Tarceva^TM、Erbitux^TM)、VEGF抑制剂(如Avastin^TM)、蛋白酶体抑制剂(如Velcade^TM)、

或hsp90抑制剂(如17-AAG)。另外，39-去甲氧基雷帕霉素与其他疗法一起施用，包括但不限于放射疗法或外科手术。

在一个具体实施方式中，39-去甲氧基雷帕霉素类似物与另一种治疗剂联合施用，用于治疗血管疾病，优选的试剂包括但不限于，ACE抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、贝丁酸(fibric acid)衍生物、HMG-CoA还原酶抑制剂、β肾上腺素阻断剂、钙通道阻断剂、抗氧化剂、抗凝血剂和血小板抑制剂(如Plavix^TM)。

在一个具体实施方式中，39-去甲氧基雷帕霉素类似物与另一种治疗剂联合施用，用于刺激神经元再生，优选的试剂包括但不限于，诸如神经生长因子的神经营养因子、神经胶质衍生的生长因子、脑衍生的生长因子、睫状神经营养因子和神经营养素-3。

在一个具体实施方式中，39-去甲氧基雷帕霉素类似物与另一种治疗剂联合施用，用于治疗真菌感染；优选的试剂包括但不限于，两性霉素B、氟胞嘧啶、棘白菌素(如卡泊芬净、阿尼芬净或米卡芬净(micafungin))、灰黄霉素、咪唑或三唑抗真菌剂(如克霉唑、密康唑、酮康唑、益康唑、布康唑、奥昔康唑、特康唑、伊曲康唑、氟康唑或伏立康唑)。

在一个具体实施方式中，39-去甲氧基雷帕霉素类似物与另一种治疗剂联合施用，用于治疗阿尔茨海默氏病；优选的试剂包括但不限于，胆碱脂酶抑制剂，如多奈哌齐、卡巴拉汀、和加兰他敏；N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂，如美金刚胺。

在一个具体实施方式中，39-去甲氧基雷帕霉素类似物与另一种治疗剂联合施用，用于治疗多发性硬化；优选的试剂包括但不限于，干扰素β-1b、干扰素β-1a、格拉默(glatiramer)、米托蒽醌、环磷酰胺、皮质甾醇(如甲基氢化泼尼松、强的松、地塞米松)。

联合施用包括任何作为同一治疗方案的部分向患者递送两种或更多治疗剂的方法，这对于普通技术人员来说是显而易见的。尽管两种或更多试剂可在单一制剂中同时施用，然而这不是必要的。试剂可用不同制剂并在不同时间施用。

制剂可方便地以单位剂量呈现，并可由任何现有公知制药技术来制备。这些方法包括组合活性成分(本发明的化合物)和包括一种或多种辅助成分的载体的步骤。通常，配方通过均一并紧密地组合活性成分和液体载体或细分的固体载体或两者来制备，然后必要时，给产品赋形。

39-去甲氧基雷帕霉素类似物通常静脉内、口服或通过任何非肠道途径以包括活性成分的药物制剂施用，任选是非毒性有机或无机酸、或碱、加成盐的形式，其是药学上可接受的剂量形式。根据要治疗的疾病和患者、以及施用途径，组合物可以可变剂量施用。

本发明适于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液或分散体。而且，组合物可以是无菌粉末的形式，可用于临时配制成该无菌水溶液或分散体。对于所有情况，最终的注射形式必须是无菌的，并必须是易于有效注射的液体。

在生产和储存的条件下，药物组合物必须是稳定的；因而，保存优选应该能抗诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其包括如，水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇)、植物油、和其合适的混合物。

例如，39-去甲氧基雷帕霉素类似物可以口服、口腔或舌下施用，施用形式有片剂、胶囊、丸、酏剂、溶液或混悬液，其中可含调味剂或着色剂，用于即时、延时或控释使用。

适于口服施用的39-去甲氧基雷帕霉素类似物溶液或混悬液还可包含赋形剂(如N，N-二甲基乙酰胺)、分散剂(如聚山梨酸酯80)、表面活性剂、和助溶剂(如聚乙二醇、Phosal 50 PG(其由卵磷脂、大豆脂肪酸、乙醇、单/二甘油酯、丙二醇和抗坏血酸棕榈酸酯组成))。

这些片剂可包含赋形剂，如微晶纤维素、乳糖(如乳糖一水合物或无水乳糖)、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸二钙和甘氨酸、丁基羟基甲苯(E321)、交聚维酮、羟丙甲纤维素、崩解剂(如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉))、淀粉乙醇酸钠、交联羟甲基纤维素钠(croscarmellose sodium)、和某些复合硅酸盐、和粒状粘合剂(如聚乙烯吡咯烷酮、羟基丙甲基纤维素(HPMC)、羟基-丙基纤维素(HPC)、聚乙二醇8000、蔗糖、明胶和阿拉伯树胶。另外，可包括润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸、甘油山嵛酸酯和滑石。

相似类型的固体组合物也可用作明胶胶囊中的填充物。在这方面，优选的赋形剂包括乳糖、淀粉、纤维素、牛乳糖或高分子量聚乙二醇。对于水混悬液和/或酏剂来说，本发明的化合物可与多种甜味剂或调味剂、着色物质或染料组合，与乳化和/或悬浮剂并与稀释剂(如水、乙醇、丙二醇和甘油、及其组合)组合。

片剂可通过压缩或铸模压制而制造出，可任选与一种或多种辅助成分一起制造。压制的片剂的制备是在合适的机器中压缩自由流动形式(如粉或颗粒)的活性成分，可任选与粘合剂(如聚乙烯吡咯酮、明胶、羟基丙甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(如淀粉乙醇酸钠、交联的聚乙烯吡咯酮、交联的羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂混合在一起。铸模压制的片剂的制造是在合适的机器中铸模压制用惰性液体稀释剂弄湿的粉状化合物的混合物。任选将片剂涂覆或刻痕并可制成制剂，从而缓释或控释其中所用的活性成分，例如，以各种比例的羟基丙基甲基纤维素来提供所需的释放特性。

根据本发明所述的适于口服施用的配方可以作为离散单位来提供，如胶囊、糯米纸囊剂或片剂，每种都包含预先确定量的活性成分；作为粉末或颗粒；作为水性液体或非水性液体的溶液或混悬液；或作为水包油乳剂或油包水乳剂。活性成分也可以丸药、药糖剂或糊剂来提供。

适于口中局部施用的配方包括糖锭剂，其包含调味基质中的活性成分，基质通常是蔗糖和阿拉伯树胶或黄芪胶；包括锭剂，其包含惰性基质中的活性成分，基质如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯树胶；并包括漱口水，其包含合适液体载体中的活性成分。

应该能理解除了上述特定成分，本发明的配方可包括其他根据要解决问题的制剂类型得出的现有常规试剂，例如适于口服施用的那些可包括调味剂。

适于局部施用的药物组合物可配成药膏、乳剂、混悬液、洗液、粉、溶液、糊剂、凝胶、填充敷料剂、喷雾剂、气雾剂或油、透皮设备、隔离剂等。这些组合物可通过包含活性试剂的常规方法来制备。因此，它们也可包含相容的常规载体和添加剂，如防腐剂、辅助药物渗透的溶剂、乳剂或药膏中的润肤剂和用于洗液的乙醇或油醇。这些载体可以占组合物约1％至约98％的形式来提供。更常用的是，它们将至多构成组合物的约80％，仅作为示例，乳剂或药膏的制备是混合足量的亲水物质和水，其包含占化合物重量约5-10％，该量足以产生具有所需粘稠度的乳剂或药膏。

适于透皮施用的药物组合物可以离散的贴片来提供，从而长期保持与接收者表皮的密切接触。例如，通过电离子渗透疗法可将活性试剂从贴片上传送出来。

为了用于外部组织，如口和皮肤，组合物优选制成局部使用的药膏或乳剂。当要配成药膏时，活性试剂可与含蜡或易溶于水的药膏基质一起运用。

可选地，活性试剂可与水包油乳剂基质或油包水基质配成乳剂。

对于非肠道施用，液体单位剂量形式的制备是利用活性成分和无菌载体，例如但不限于水，醇、多元醇、甘油和植物油，优选是水。根据所用的载体和浓度，活性成分可溶解或悬浮在载体中。在制备溶液时，活性成分可溶于注射用水中并过滤除菌，然后加入合适的小瓶或安瓿中并密封。

有益的是，试剂(如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂)可溶于载体中。为了增强稳定性，组合物可在装入小瓶并真空脱水后冷冻。然后将冻干粉密封在小瓶内，并提供注射用水的另一个相应的小瓶从而在使用前能重新形成液体。

用与溶液基本相同的方式制备非肠道混悬液，不同在于将活性成分悬浮于载体中而不是溶解其中，而且不能通过过滤来完成灭菌。可通过暴露于环氧乙烷而对活性成分灭菌，然后悬浮于无菌载体中。有益的是，表面活性剂或润湿剂包括在组合物中以使活性成分更容易分布均匀。

39-去甲氧基雷帕霉素类似物也可利用现有已知医药设备来施用。例如，在一个具体实施方式中，本发明的药物组合物可用无针皮下注射设备来施用，如公开于U.S.5,399,163；U.S.5,383,851；U.S.5,312,335；U.S.5,064,413；U.S.4,941,880；U.S.4,790,824；或U.S.4,596,556的设备。用于本发明的公知的移植物和组合部件实例包括：US 4,487,603，其公开了可植入的微输注泵，用于以可控速率分发药物；US 4,486,194，其公开了治疗设备，用于通过皮肤来施用药物；US 4,447,233，其公开了药物输注泵，用于以精确输注率递送药物；US 4,447,224，其公开了可变流量的可植入的输注装置，用于持续递送药物；US 4,439,196，其公开了渗透性药物递送系统，其具有多腔间隔小室；和US 4,475,196，其公开了渗透性药物递送系统。在特定的具体实施方式中，39-去甲氧基雷帕霉素类似物可以利用药物-洗脱支架来施用，例如WO 01/87263及相关公开文献所述的那些之一或Perin(Perin，EC，2005)所述的那些。许多其他这类移植物、递送系统和组合部件对所属领域技术人员来说是已知的。

本发明化合物的施用剂量将根据特定化合物、所涉及的疾病、个体、和疾病性质和严重度以及个体的身体状况、和所选择的施用途径而变化。所属领域技术人员能容易地确定合适的剂量。

根据施用方法，组合物可包含超过重量0.1％、优选5-60％、更优选重量的10-30％的本发明化合物。

所属领域技术人员将会认识到，通过要治疗的病症性质和范围、施用形式、途径和位点、和要治疗的特定个体的年龄和病症，将会确定出本发明化合物的单个剂量的最佳量和间隔，而且医师会最终确定合适的用量。该剂量可以合适的频率重复。如果副作用产生了，则可以根据常规临床实践，改变或减少剂量的量和/或频率。

附图简述

图1：显示了雷帕霉素的结构。

图2：显示了39-去甲氧基雷帕霉素的裂解途径。

图3：简要显示了免疫印迹，概述了39-去甲氧基雷帕霉素和雷帕霉素的mTOR抑制活性。

图4：紫杉醇(A和C)和39-去甲氧基雷帕霉素(B和D)在正常(A和B)或高P-gp表达(C和D)的细胞系中以所有测试浓度得到的％T/C值。

图5：A-显示了在单次静脉内或口服施用雷帕霉素和39-去甲氧基雷帕霉素后脑组织或血样的0-24h的总曲线下面积(AUC)。

B-显示了单次静脉内施用后在脑组织中检测到的随时间变化的39-去甲氧基雷帕霉素和雷帕霉素水平。

图6：A-显示了预防方案下的EAE模型中的疾病进程。取值为载体或治疗组的中值。

B-显示了治疗方案下的EAE模型中的疾病进程。取值为载体或治疗组的中值。

图7：该图显示了通过立体定位注射U87-MG细胞诱导神经胶质瘤后小鼠的相对存活％。实心菱形代表未治疗组、实心方块代表载体治疗组，空心圆代表39-去甲氧基雷帕霉素治疗组。

实施例

材料和方法

材料

除非另外说明，所有以下实施例中所用的试剂都得自商业渠道。

培养物

吸湿链霉菌MG2-10[IJMNOQLhis](WO 04/007709；Gregory等，2004)于28℃生长在培养基1琼脂平板(见下)上。在培养基1上生长出后制备出孢子储存物，保存于含20％w/v甘油：10％w/v乳糖的蒸馏水中并保存于-80℃。将0.1mL冷冻的储存物接种到250mL长颈瓶中的50mL培养基2(见下)中，制备出营养性培养物。培养物于28℃、300rpm温育36至48小时。

生产方法：

以2.5-5％v/v将营养性培养物接种入培养基3中。以26℃、300rpm进行培养6-7天。

补料(feeding)过程：

除非另外说明，接种后24-48小时补料/添加羧酸环己烷，并以1-2mM的终浓度补料。

培养基1：

然后培养基于121℃高压灭菌20分钟。

培养基2：RapV7种子培养基

然后培养基于121℃高压灭菌20分钟。

灭菌后每7mL培养基中加入0.16mL 40％葡萄糖。

培养基3：MD6培养基(发酵培养基)

灭菌前将0.4mL Sigma α-淀粉酶(BAN 250)加到1L培养基中。

培养基于121℃灭菌20分钟。

灭菌后每7mL中加入0.35mL无菌40％果糖和0.10mL L-赖氨酸(140mg/mL，溶于水，过滤除菌)。

培养基4：RapV7a种子培养基

然后培养基于121℃高压灭菌20分钟。

培养基5：MD6/5-1培养基(发酵培养基)

培养基于121℃灭菌30分钟。

灭菌后每L加入15g果糖。

48小时后加入0.5g/L L-赖氨酸。

分析方法

方法A

注射体积：0.005-0.1mL(根据灵敏度需要)。HPLC在Agilent″Spherisorb″″Rapid Resolution″卡式(cartridges)SB C8上进行，3微米，30mm x 2.1mm，运行如下流动相：

流动相A：含0.01％甲酸的纯水

流动相B：含0.01％甲酸的乙腈

流速：1mL/分钟。

使用线性梯度，从第0分钟的5％B，到第2.5分钟的95％B，保持95％B直到第4分钟，回到5％B，再进行下一轮。通过254nm处的UV吸收和/或通过利用Micromasss Quattro-Micro仪器进行质谱电喷雾离子化(正性或负性)来检测。

方法B

注射体积：0.02mL。HPLC在3微米BDS C18 Hypersil(ThermoHypersil-Keystone Ltd)柱上进行，其为150x4.6mm，维持在50℃，其运行的流动相为：

流动相A：乙腈(100mL)，三氟醋酸(1mL)，1M醋酸铵(10mL)，用去离子水加至1L。

流动相B：去离子水(100mL)，三氟醋酸(1mL)，1M醋酸铵(10mL)，用乙腈加至1L。

流速：1mL/分钟。

利用55％B-95％B的线性梯度进行10分钟，然后以95％B 2分钟，55％B 0.5分钟，再用55％B 2.5分钟。通过280nm处的UV吸收来检测化合物。

方法C

HPLC系统包括Agilent HP1100并在3微米BDS C18 Hypersil(ThermoHypersil-Keystone Ltd)柱上进行，其为150x 4.6mm，维持在40℃，其运行的流动相为：

流动相A：去离子水。

流动相B：乙腈。

流速：1mL/分钟。

该系统与Bruker Daltonics Esquire3000电喷雾质谱仪相连。在500至1000道尔顿的扫描范围设置正性负性转换。

利用55％B-95％B的线性梯度进行10分钟，然后95％B 2分钟，55％B 0.5分钟，再55％B 2.5分钟。

针对抗癌活性的体外生物试验

用单层增殖试验对12种人肿瘤细胞系在Oncotest Testing Facility(实验肿瘤学研究所，Oncotest GmbH，Freiburg)上进行化合物抗癌活性的体外评估。所选的12种细胞系的特征在表2中简述。

表2测试细胞系

如Roth等1999所述，Oncotest细胞系从人肿瘤异种移植体中建立。供体异种移植体的来源如Fiebig等1992所述。其他细胞系得自NCI(H460，SF-268，OVCAR-3，DU 145，MDA-MB-231，MDA-MB-468)或购自DSMZ(Braunschweig，德国)(LNCAP)。

所有细胞系，除非另外指明，均于37℃生长在空气潮湿(95％空气，5％CO₂)的含RPMI 1640培养基、10％胎牛血清、和0.1mg/mL庆大霉素(PAA，德国)的‘混合即可用的’培养基中。

单层试验-规程1：

使用改进的碘化丙锭试验评估一种或多种测试化合物对12种人肿瘤细胞系生长的影响(Dengler等，1995)。

简而言之，在指数生长阶段的培养物中通过胰蛋白酶化来收获细胞，计数并铺于96孔平底微滴定板中，其中细胞密度取决于细胞系(5-10,000个活细胞/孔)。让细胞恢复24h，以使细胞恢复指数生长，将0.01mL培养基(每个平板6个对照孔)或含39-去甲氧基雷帕霉素的培养基加入到孔中。每种浓度一式三份铺板。39-去甲氧基雷帕霉素用两种浓度(0.001mM和0.01mM)应用。持续温育4天后，有或没有39-去甲氧基雷帕霉素的细胞培养基用0.2mL碘化丙锭(PI)水溶液(7mg/L)替换。为了测量活细胞的比例，冷冻平板以通透细胞。解冻平板后，用Cytofluor 4000微板读数仪测量荧光(530nm激发，620nm发射)，得出与活细胞总数的直接关系。

生长抑制被表示成处理/对照x100(％T/C)。绘制化合物浓度相对于细胞存活的图，来评估活性化合物的IC₅₀和IC₇₀值。

单层试验-规程2：

国家癌症研究所(NCI)癌症筛选小组的人肿瘤细胞系生长于含5％胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中(Boyd和Paull，1995)。将细胞以0.1mL接种于96孔微滴定板中，其中根据单个细胞系的倍增时间，铺板密度从5,000至40,000个细胞/孔。细胞接种后，于37℃、5％CO₂、95％空气和100％相对湿度温育微滴定板24h，然后加入实验药物。

24h后，用三氯乙酸(TCA)原位固定每种细胞系的两块板，由此测量药物加入的时间点(Tz)上每种细胞系的细胞群。将实验药物以所需最终最大测试浓度的400倍溶解于二甲亚砜中，使用前冷冻保存。在加入药物的时候，解冻冷冻浓缩物的等分试样，并用含0.05mg/mL庆大霉素的完全培养基稀释至所需最终最大测试浓度的两倍。制备另外的4个10倍或¹/₂对数连续稀释液，以提供总共5种药物浓度，外加对照。将这些不同药物稀释液的0.1mL等分试样加到已经含0.1mL培养基的合适的微滴定孔中，由此得到所需的最终药物浓度。

加入药物后，于37℃、5％CO₂、95％空气和100％相对湿度再温育平板48h。对于粘附的细胞，通过加入冷的TCA来终止试验。通过轻轻加入0.05mL冷的50％(w/v)TCA(终浓度，10％TCA)来原位固定细胞并于4℃温育60分钟。弃上清液，并滴水洗板5次，并于空气中干燥。在1％乙酸中的0.4％(w/v)硫若丹明B(SRB)溶液(0.1mL)加到每个孔中，并于室温温育板10分钟。染色后，用1％乙酸洗涤5次以去除未结合的染料，并于空气中干燥板。然后用10mM三羟甲基氨基甲烷碱溶解结合的着色剂，并在自动平板读数仪上以515nm波长读出吸收值。对于悬浮的细胞，用相同的方法，但不同点在于通过轻轻加入0.05mL 80％TCA(终浓度，16％TCA)固定沉淀在孔底的细胞来终止试验。利用7种吸收测量值[零时间，(Tz)，对照生长，(C)，和存在5种药物浓度水平时的测试生长(Ti)]，计算每种药物浓度水平的生长百分比。生长抑制百分比算作：

对于Ti≥Tz的浓度，[(Ti-Tz)/(C-Tz)]x100

对于Ti＜Tz的浓度，[(Ti-Tz)/Tz]x100。

为每种实验试剂计算3个剂量反应参数。由[(Ti-Tz)/(C-Tz)]x100＝50算出50％生长抑制(GI50)，其为药物温育时造成比对照细胞中蛋白质净增量(通过SRB染色测得)减少50％的药物浓度。由Ti＝Tz算出造成完全生长抑制(TGI)的药物浓度。LC50(造成在药物处理末期测得的蛋白质相对于开始时减少50％的药物浓度)显示处理后细胞的净丧失，其由[(Ti-Tz)/Tz]x100＝-50计算而来。

通过若丹明B流出(Lee等，1994)并通过PCR检测mdr-1的mRNA(Alvarez等，1995)来鉴定，NCI鉴定出60种细胞系中的多药耐受性细胞系为高P-gp含量的细胞系。

药物动力学分析-规程1

用载体(在0.15M NaCl中的4％乙醇、5％吐温-20、5％聚乙二醇400)制备测试化合物。向雌性CD1小鼠组以10mg/kg口服或3mg/kg静脉内单剂施用(每种化合物每个时间点用3只小鼠)。在第0分钟、4分钟、15分钟、1h，4h，和24h时，处死小鼠并从每只小鼠中收集血液和脑，用于进一步分析。

脑样品在液氮中急速冷冻并储存于-20℃。每只动物至少收集0.2mL全血，装入含抗凝剂乙二胺四乙酸(EDTA)的试管中，彻底混合，并储存于-20℃。

药物动力学分析-规程2

为了制备给药溶液，5mg测试化合物溶于100μL乙醇中，形成50mg/mL的化合物溶液。然后加入约2.4mL 0.15M NaCl(0.9％w/v盐水)、5％v/v吐温20和5％v/v PEG 400(最终乙醇浓度为4％v/v)，将溶液稀释成2mg/mL。

单剂10mg/kg口服或2mg/kg静脉内的测试化合物以10mg/kg口服或2mg/kg静脉内的浓度向每组3只雌性Balb C小鼠施用。在第5分钟、15分钟、60分钟、4h、8h和24h时，处死小鼠并收集约0.2mL全血样品入EDTA以达到0.5mM的EDTA最终浓度，另外切下脑。全血和脑在液氮中急速冷冻并储存于-20℃，直至装到干冰上用以分析。

分析药物动力学研究样品：

由ASI Limited(St George′s Hospital Medical School，伦敦)进行分析。所提供的血和脑样品中测试化合物的浓度通过带有MS检测的HPLC来确定。对照(无测试化合物)血样得自Harlan Sera-Lab Limited(Loughborough，英格兰)。零时间的脑样用作对照(无测试化合物)脑样。

制备脑样：

每个脑的一个半球用5mL水均浆。

提取样品

小鼠脑或血的对照或测试样品(0.05mL)、内标准溶液(0.1mL)、5％硫酸锌溶液(0.5mL)、和丙酮(0.5mL)被吸入2mL聚丙烯管(Sarstedt Limited，Beaumont Leys，Leicester，英国)，然后将它们混合至少5分钟(IKA-Vibrax-VXR混合仪，Merck(BDH)Limited，Poole Dorset，英国)。然后用微型离心机离心试管至少2分钟。溶剂层倒入含氢氧化钠(0.1M，0.1mL)和甲基-叔-丁基醚(MTBE，2mL)的4.5mL聚丙烯试管中。然后混合试管至少5分钟(IKA-Vibrax-VXR混合仪)，然后以3500rpm离心5分钟。将溶剂层移入4.5mL圆锥形的聚丙烯试管中，置于

中并蒸发至干燥。

干燥的提取物用0.15mL80％甲醇重溶，并混合至少5分钟(IKA-Vibrax-VXR混合仪)并以3500rpm离心5分钟。将提取物移入自动取样器的管(NLG Analytical，Adelphi Mill，Bollington，Cheshire，英国)并置于自动取样器托盘上，该托盘设置为周围环境温度。自动取样器被编排成将每种提取物0.03mL等分试样注射到分析柱上。

实施例1.发酵并分离测试化合物

1.1发酵并分离39-去甲氧基雷帕霉素

如下所述，通过使吸湿链霉菌MG2-10[IJMNOQLhis]培养物生长并补料以环己烷羧酸(CHCA)，来产生39-去甲氧基雷帕霉素。

通过向WO 2004/007709所述的MG2-10株导入含基因rapI、rapJ、rapM、rapN、rapO、rapQ和rapL的质粒来产生吸湿链霉菌MG2-10[IJMNOQLhis]。用含5’阅读框内组氨酸标签的rapL基因构建基因表达盒。如WO 2004/007709所述，质粒还包含转移起点和阿泊拉霉素抗性标记(用于通过接合和选择接合后体来转化MG2-10)和phiBT1附着位点(用以位点特异性地整合入染色体)。如WO2004/007709所述，分离这些基因中的每一种，并实施构建含PKS后的基因(post-PKS genes)的组合的基因表达盒的方法。

液体培养物

如材料和方法所述，培养吸湿链霉菌MG2-10[IJMNOQLhis]的生长培养物。生产培养物用营养培养物以0.5mL接种于50mL试管中的7mL培养基3中。于26℃培养7天，300rpm。取1毫升样品以1∶1用乙腈提取，震荡30分钟，13,000rpm离心10分钟，并根据分析方法B(参见材料和方法)分析并定量。通过利用分析方法C(参见材料和方法)进行质谱来确认产物。

根据以下表征中所述分析数据，观察到的雷帕霉素类似物被认为是所希望的39-去甲氧基雷帕霉素。

发酵

基本如材料和方法所述，培养在培养基4中的吸湿链霉菌MG2-10[IJMNOQLhis]的初级营养性培养物。在培养基4中的次级营养性培养物以10％v/v、28℃、250rpm接种24h。营养性培养物被以5％v/v接种入20L发酵罐中的培养基5中(参见材料和方法)。于26℃、0.5vvm培养6天。通过改变推动器尖端速度来保持≥30％的溶解氧，其中推动器尖端速度最小为1.18ms^-1，推动器尖端速度最大为2.75ms^-1。接种后第24和48小时补料环己烷羧酸，使最终浓度为2mM。

提取和纯化

发酵肉汤(30L)与等体积甲醇一起搅拌2小时，然后离心(10分钟，3500rpm)以沉淀细胞。上清液与HP20树脂(43g/L)一起搅拌1小时，然后过滤。用丙酮分批洗树脂来洗脱雷帕霉素类似物，真空除去溶剂。然后用水将该水溶性浓缩物稀释至2L，并用EtOAc(3×2L)提取。真空去除溶剂，得到棕色的油(20.5g)。

提取物溶于丙酮，在硅石上干燥，上样于硅石柱(6×6.5cm直径)并用丙酮/己烷等级梯度(20％-40％)洗脱。汇集含雷帕霉素类似物的级分，真空除去溶剂。残余物(2.6g)进一步过Sephadex LH20柱层析(分三批)，用10∶10∶1的氯仿/庚烷/乙醇洗脱。通过反相(C18)制备性HPLC，利用GilsonHPLC，用65％乙腈/水以21mL/分钟洗脱Pbenomenex 21.2×250mm Luna5μm C18BDS柱，来纯化半纯化的雷帕霉素类似物(1.7g)。合并最纯的级分(通过分析性HPLC、方法B来鉴定)，真空除去溶剂，得到39-去甲氧基雷帕霉素(563mg)。

表征

39-去甲氧基雷帕霉素的¹H NMR谱与标准物的相同(P.Lowden，博士论文，University of Cambridge，1997)。

培养物提取物的LCMS和LCMSⁿ分析显示雷帕霉素类似物的m/z比率低于雷帕霉素30个质量单位，与其缺少甲氧基符合。观察到的离子：[M-H]882.3，[M+NH₄]⁺901.4，[M+Na]⁺906.2，[M+K]⁺922.2。对钠加合物的裂解给出所预测出的39-去甲氧基雷帕霉素离子，符合以前鉴定出的裂解途径(图2)(J.A.Reather，博士论文，University of Cambridge，2000)。该质谱裂解数据收窄了雷帕霉素类似物的区域，其中丢失甲氧基是发生在含环己基部分的片段C28-C42上。

这些质谱裂解数据完全符合39-去甲氧基雷帕霉素的结构。

1.2发酵并分离27-O-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素

如下所述，通过使吸湿链霉菌MG2-10[JMNOLhis]培养物生长并补料环己烷羧酸(CHCA)，来产生27-O-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素。

通过向WO 2004/007709所述的MG2-10株导入含基因rapJ、rapM、rapN、rapO、和rapL的质粒来产生吸湿链霉菌MG2-10[JMNOLhis]。用含5’阅读框内组氨酸标签的rapL基因构建基因表达盒。如WO2004/007709所述，质粒还包含转移起点和阿泊拉霉素抗性标记(用于通过接合和选择接合后体来转化MG2-10)和phiBT1附着位点(用以位点特异性地整合入染色体)。如WO2004/007709所述，分离这些基因中的每一种，并实施构建含PKS后的基因的组合的基因表达盒方法。

液体培养物

如材料和方法所述，培养吸湿链霉菌MG2-10[JMNOLhis]的营养性培养物。生产培养物用营养培养物以0.5mL接种于50mL试管中的7mL培养基3中。于26℃培养7天，300rpm。取1毫升样品以1∶1用乙腈提取，震荡30分钟，13,000rpm离心10分钟，并根据分析方法B(参见材料和方法)分析并定量。通过利用分析方法C(参见材料和方法)进行质谱来确认产物。

根据以下表征中所述分析数据，观察到的雷帕霉素类似物被认为是所希望的27-O-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素。

发酵

基本如材料和方法所述，培养在培养基2中的吸湿链霉菌MG2-10[IJMNOQLhis]的初级营养性培养物。在培养基2中的次级营养性培养物以10％v/v、28℃、250rpm接种24h。营养性培养物被以10％v/v接种入20L发酵罐中的培养基5中(参见材料和方法)。于26℃、0.75vvm培养6天。通过改变推动器尖端速度来保持≥30％的溶解氧，其中推动器尖端速度最小为1.18ms^-1，推动器尖端速度最大为2.75ms^-1。接种后第24和48小时补料环己烷羧酸，使最终浓度为2mM。

提取和纯化

发酵肉汤(15L)与等体积甲醇一起搅拌2小时，然后离心(10分钟、3500rpm)以沉淀细胞。上清液与

HP20树脂(43g/L)一起搅拌1小时，然后过滤。用丙酮分批洗树脂来洗脱雷帕霉素类似物，真空除去溶剂。然后用水将该水溶性浓缩物稀释至2L，并用EtOAc(3×2L)提取。真空去除溶剂，得到棕色的油(12g)。

提取物溶于丙酮，在硅石上干燥，上样于硅石柱(4×6.5cm直径)并用丙酮/己烷分级梯度(20％-40％)洗脱。汇集合雷帕霉素类似物的级分，真空除去溶剂。残余物(0.203g)通过反相(C18)制备性HPLC富集，其利用GilsonHPLC，用65％乙腈/水以21mL/分钟洗脱Phenomenex 21.2×250mm Luna 5μm C18BDS柱。合并最纯的级分(通过分析性HPLC、方法B来鉴定)，真空除去溶剂，得到残余物(25.8mg)。残余物通过反相(C18)制备性HPLC纯化。其利用Gilson HPLC，用60％乙腈/水以1mL/分钟洗脱Hypersil 4.6×150mm 3μm C18 BDS柱。合并最纯的级分(通过分析性HPLC、方法B来鉴定)，真空除去溶剂，得到27-O-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素(19.9mg)。

表征

¹H和13C NMR谱符合27-O-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素的结构，而且分配情况如下表3所示。

表3：溶于CDCl₃的27-O-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素在500MHz处的¹H-NMR和在125处的¹³C-NMR的NMR数据。

·*所示的值是与¹³C-NMR谱中其他¹³C值比较的二重积分。

·没有确定立体化学，这是因为我们需要更多NMR实验(如1D和2D NOESY)，因为亚甲基直立和平伏¹H的这一成因没有被分配。

对培养物提取物的LCMS和LCMSⁿ分析显示雷帕霉素类似物的m/z比率低于雷帕霉素44个质量单位，与其缺少甲基和甲氧基相符合。观察到的离子：[M-H]868.7，[M+NH₄]⁺887.8，[M+Na]⁺892.8。钠加合物的裂解给出27-O-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素的预测出的离子，符合以前鉴定出的裂解途径(图2)(J.A.Reather，博士论文，University of Cambridge，2000)。该质谱裂解数据收窄了雷帕霉素类似物的区域，其中丢失甲氧基是发生在含环己基部分的片段C28-C42上，而且收窄了雷帕霉素类似物的区域，其中丢失O-甲基是发生在片段C15-C27上。

这些质谱裂解数据完全符合27-O-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素的结构。

1.3发酵并分离16-O-去甲基-27-O-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素

如下所述，通过使吸湿链霉菌MG2-10[IJNOLhis]培养物生长并补料环己烷羧酸(CHCA)，来产生16-O-去甲基-27-O-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素。

通过向WO2004/007709所述的MG2-10株导入含基因rapI、rapJ、rapN、rapO和rapL的质粒来产生吸湿链霉菌MG2-10[IJNOLhis]。用含5’阅读框内组氨酸标签的rapL基因构建基因表达盒。如WO2004/007709所述，质粒还包含转移起点和阿泊拉霉素抗性标记(用于通过接合和选择接合后体来转化MG2-10)和phiBT1附着位点(用以位点特异性地整合入染色体)。如WO2004/007709所述，分离这些基因中的每一种，并实施构建含PKS后的基因的组合的基因表达盒的方法。

液体培养物

如材料和方法所述，培养吸湿链霉菌MG2-10[IJNOLhis]的营养性培养物。生产培养物用营养性培养物以0.5mL接种于50mL试管中的7mL培养基3中。于26℃培养7天，300rpm。取1毫升样品以1∶1用乙腈提取，震荡30分钟，13,000rpm离心10分钟，并根据分析方法B(参见材料和方法)分析并定量。通过利用分析方法C(参见材料和方法)进行质谱来确认产物。

根据以下表征中所述分析数据，观察到的雷帕霉素类似物被认为是所希望的16-O-去甲基-27-O-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素。

发酵

基本如材料和方法所述，培养在培养基2中的吸湿链霉菌MG2-10[IJMNOQLhis]的初级营养性培养物，培养3天。在培养基2中的次级营养性培养物以10％v/v、28℃、250rpm接种48h，三级培养物被以10％v/v、28℃、250rpm、24h接种。营养性培养物被以10％v/v接种入3x7L发酵罐中的培养基5中(参见材料和方法)。于26℃、0.75vvm培养6天。通过改变推动器尖端速度来保持≥30％的溶解氧，其中推动器尖端速度最小为0.94ms^-1，推动器尖端速度最大为1.88ms^-1。接种后第24小时补料环己烷羧酸，使最终浓度为2mM。在t＝0时补料L-赖氨酸。

提取和纯化

发酵肉汤(12L)与等体积甲醇一起搅拌2小时，然后离心(10分钟、3500rpm)以使细胞沉淀。上清液与HP20树脂(43g/L)一起搅拌1小时，然后过滤。用丙酮分批洗树脂来洗脱雷帕霉素类似物，真空除去溶剂。然后用水将该水溶性浓缩物稀释至2L，并用EtOAc(3×2L)提取。真空去除溶剂，得到棕色的油(8.75g)。

提取物溶于丙酮，在硅石上干燥，上样于硅石柱(4×6.5cm直径)并用丙酮/己烷梯度(20％-40％)逐步洗脱。收集含雷帕霉素类似物的级分，真空除去溶剂。残余物(0.488g)进一步过Sephadex LH20柱层析(分三批)，用10∶10∶1的氯仿/庚烷/乙醇洗脱。汇集含雷帕霉素类似物的级分，真空除去溶剂。半纯化的雷帕霉素类似物(162mg)通过反相(C18)制备性HPLC来纯化，其利用Gilson HPLC，用65％乙腈/水以21mL/分钟洗脱Phenomenex21.2×250mm Luna 5μm C18 BDS柱。合并最纯的级分(通过分析性HPLC、方法B来鉴定)，真空除去溶剂，得到16-O-去甲基-27-O-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素(44.7mg)。

表征

对培养物提取物的LCMS和LCMSⁿ分析显示新的雷帕霉素类似物的存在，其洗脱远早于所有其他39-去甲氧基类似物。该雷帕霉素类似物的许多离子的m/z比率低于雷帕霉素58个质量单位，与其缺少两个O-甲基和甲氧基相符合。观察到的离子：[M-H]^-854.7，[M+NH₄]⁺877.8，[M+Na]₊892.7，[M+K]⁺908.8。钠加合物的裂解片段给出16-O-去甲基-27-O-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素所预测出的离子，符合以前鉴定出的裂解途径(图2)(J.A.Reather，博士论文，University of Cambridge，2000)。该质谱裂解数据收窄了雷帕霉素类似物的区域，其中丢失甲氧基是发生在含环己基部分的片段C28-C42上，而且收窄了雷帕霉素类似物的区域，其中丢失O-甲基是发生在片段C15-C27上。这些NMR和质谱裂解数据完全符合16-O-去甲基-27-O-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素的结构。

实施例2.针对抗癌活性的体外生物试验

体外评估39-去甲氧基雷帕霉素的抗癌活性

如规程1所述，在以上利用改良的碘化丙锭试验的普通方法中，用单层增殖试验在12种人肿瘤细胞系中体外评估39-去甲氧基雷帕霉素的抗癌活性。

结果显示在下表4中，每个结果代表两次重复实验的平均值。表5显示了化合物和雷帕霉素对测试细胞系的IC50和IC70。

表4

表5

	雷帕霉素	39-去甲氧基雷帕霉素
			平均IC50(μM)	3.5	3.25
平均IC70(μM)	9.1	6.95

体外评估39-去甲氧基雷帕霉素的多药物耐受(MDR)选择性抗癌活性

用基于SRB的试验，如材料和方法的规程2所述，用单层增殖试验在人肿瘤细胞系的NCI 60细胞系上体外评估39-去甲氧基雷帕霉素的选择性MDR抗癌活性。

结果显示在下表6中：

表6-针对高表达MDR的细胞系的体外活性

可以看出，除了一种细胞系之外，与雷帕霉素相比，39-去甲氧基雷帕霉素针对高表达MDR的细胞系都有相等或改善的功效。

实施例3.体外ADME试验

Caco-2通透试验

在24孔Corning Costar Transwell形式上的满板Caco-2细胞(Li，A.P.，1992；Grass，G.M.，等，1992，Volpe，D.A.，等，2001)由In Vtro TechnologiesInc.(IVT Inc.，Baltimore，Maryland，美国)提供。顶部腔室含有0.15mL pH7.4的Hank氏平衡缓冲液(HBB s)、1％DMSO、0.1mM荧光黄。基部的腔室含有0.6mL pH 7.4的HBBS、1％DMSO。对照和测试品在加湿温育箱中于37℃温育，以130rpm震荡1h。荧光黄仅能通过细胞旁(在紧密连接之间)途径渗入，荧光黄的高可见通透性(P_app)显示出试验期间细胞损伤了，所有这些孔被排除。普萘洛尔(被动通透性好，而无已知的转运蛋白效应)和醋丁洛尔(被动通透性差，其通过借助于P-糖蛋白的主动流出而减轻)被用作参照化合物。通过将化合物(以0.01mM)加入顶部或基部的腔室，以单和双向形式测试化合物。通过HPLC-MS(方法A，参见材料和方法)分析顶部或基部腔室中的化合物。结果表示成可见穿透性(Apparent Permeability)(P_app)(nm/s)和流出率(A至B比B至A)。

受体体积：0.6ml(A＞B)和0.15ml(B＞A)

单层面积：0.33cm²

Δ时间：60分钟

流出率的正值表示从细胞的顶层表面主动流出。

人肝微粒体(HLM)稳定性试验

用肝匀浆液测量化合物对I期(氧化)酶的内在弱点，该酶包括CYP450(如CYP2C8、CYP2D6、CYP1A、CYP3A4、CYP2E1)、酯酶、酰胺酶和黄素单氧酶(FMO)。

通过LC-MS监视它们随时间的消失情况，确定测试化合物暴露于人肝微粒体的半衰期(T1/2)。0.001mM化合物以0.25mg/mL蛋白质与人微粒体亚细胞级分于37℃在pH 7.4的0.1M Tris-HCl中温育40分钟，并将饱和水平的NADPH作为辅因子。以给定时间间隔，向测试样品中加入乙腈来沉淀蛋白质和并终止代谢。离心样品并用分析方法A(参见材料和方法)分析亲本化合物。

表7-体外ADME试验结果

实施例4.体外结合试验

FKBP12

FKBP12能在化学变性剂盐酸胍(GdnHCl)中可逆解折叠，而且能通过蛋白质固有荧光的变化而监测解折叠(Main等，1998)。特异结合并稳定天然状态FKBP12的配体可使变性曲线移动，由此可使蛋白质在较高化学变性剂浓度下才变性(Main等，1999)。通过稳定性的差异，配体结合常数可用方程式1来确定。

$\mathrm{\Δ}{G}_{\mathrm{app}}=\mathrm{\Δ}{G}_{D-N}^{H_{2}O}+\mathrm{RT}\ln (1+\frac{\left[L\right]}{K_d})---\left(1\right)$

其中ΔG_app是游离和配体结合形式解折叠自由能的表观差值，

是游离蛋白质在水中的解折叠自由能，[L]是配体浓度，而K_d是蛋白质-配体复合物的解离常数(Meiering等，1992)。利用以下方程式，可将解折叠自由能与解折叠转变的中点发生关联：

$\mathrm{\Δ}{G}_{D-N}^{H_{2}O}=m_{D-N}{\left[D\right]}_{50\%}---\left(2\right)$

其中m_D-N是针对给定蛋白质和给定变性剂的常数，其与解折叠对残基暴露程度的改变成比例(Tanford 1968和Tanford 1970)，而且[D]_50％是对应解折叠中点的变性剂浓度。我们将

——用雷帕霉素和未知配体(以相同配体浓度)对FKBP12稳定性的差值，定义为：

$\mathrm{\&Delta;\&Delta;}{G}_{D-N}^L=<m_{D-N}>\mathrm{\&Delta;}{\left[D\right]}_{50\%}---\left(3\right)$

其中<m_D-N>是解折叠转化的平均m-值，而且Δ[D]_50％是雷帕霉素-FKBP12解折叠转变和未知配体-FKBP12复合物解折叠转变中点的差值。在[L]＞K_d的条件下，则通过方程式4，ΔΔG_D-N能与两种化合物的相对K_d相关联：

$\mathrm{\&Delta;\&Delta;}{G}_{D-N}^L=\mathrm{RT}\ln \frac{K_d^X}{K_d^{\mathrm{rap}}}---\left(4\right)$

其中是雷帕霉素的解离常数，而

是未知配体的解离常数。所以，

$K_d^X=K_d^{\mathrm{rap}}\exp \left(\frac{<m_{D-N}>\mathrm{\&Delta;}{\left[D\right]}_{50\%}}{\mathrm{RT}}\right)---\left(5\right)$

为了确定39-去甲氧基雷帕霉素的K_d，拟合变性曲线来产生m_D-N和[D]_50％的值，用其计算平均m-值、<m_D-N>、和Δ[D]_50％，并由此计算。用0.2nM的

文献值。

表8-体外FKBP12结合试验结果

	FKBP12Kd(nM)
		雷帕霉素	0.2
39-去甲氧基雷帕霉素	0.7
		27-O-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素	0.8
16-O-去甲基-27-O-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素	101
		27-去甲氧基-39-去甲氧基雷帕霉素	160

mTOR

通过测定mTOR途径替代标记物和p70S6激酶和S6的磷酸化水平，可间接进行mTOR抑制(Brunn等，1997；Mothe-Satney等，2000；Tee和Proud，2002；Huang和Houghton，2002)。

HEK293细胞与FLAG-标记的mTOR和myc-标记的Raptor共转染，培养24h，然后无血清过夜。用100nM胰岛素刺激细胞，然后收获并通过3次冷冻/化冻周期裂解。汇集裂解产物，并与等量针对mTOR/Raptor复合物的FLAG抗体进行免疫沉淀。然后对免疫沉淀进行加工：用化合物(0.00001-0.003mM)处理的样品与FKBP12/雷帕霉素、FKBP12/39-去甲氧基雷帕霉素或载体(DMSO)于30℃预温育30分钟，未处理的样品在激酶缓冲液中温育。然后免疫沉淀产物用于进行体外激酶试验，其中存在3mM ATP、10mM Mn²⁺和GST-4E-BP1作为底物。用4x上样缓冲液终止反应，然后进行15％SDS-PAGE，湿法转移到PVDF膜上，然后探测磷酸-4E-BP1(T37/46)。

可选地，HEK293细胞接种到6孔板中并预温育24h，然后无血清过夜。然后用载体或化合物于30℃预处理细胞30分钟，然后用100nM胰岛素于30℃刺激30分钟并通过3个冷冻/化冻周期裂解，并测定蛋白质浓度。将等量蛋白质上样于SDS-PAGE胶上并分离。然后用湿法将蛋白质转移到PVDF膜上并探测磷酸-S6(S235/36)或磷酸-p70 S6K(T389)。

这些实验的结果简述于图3

实施例5：体外P-gp底物试验

细胞系

用在本研究中的细胞系(MACL MCF7和MACL MCF7 ADR)都由美国国家癌症研究所提供。

细胞每周按常规传代一次或两次。它们在培养基中维持不超过20代。所有细胞在潮湿空气(95％空气，5％CO₂)中于37℃生长在添加了5％胎牛血清(PAA，

德国)和0.1％庆大霉素(PAA，

德国)的RPMI 1640培养基(PAA，德国)中。

试验规程

用基于上述规程1的改良的碘化丙锭试验来评估39-去甲氧基雷帕霉素的作用(Dengler等，1995)。简而言之，在指数生长阶段的培养物中通过胰蛋白酶化来收获细胞，计数并于96孔平底微滴定板中铺板，其中细胞密度为5,000个细胞/孔)。让细胞恢复24h以使细胞恢复指数生长，向细胞中加入0.01mL浓度为0.18mg/mL的异搏定或0.01mL培养基，以使孔中异搏定终浓度为0.01mg/mL。在以前实验中发现该浓度对细胞无毒性。加入含39-去甲氧基雷帕霉素或紫杉醇的培养基或仅加入培养基(对于对照孔)，每孔0.01mL。8个浓度的化合物重复测试三次，浓度间相差半个对数，范围从0.03mM下降至10nM。持续药物暴露3天后，培养基或含化合物的培养基替换为0.2mL碘化丙锭(PI)水溶液(7mg/L)。由于PI仅能通过有洞的或裂开的膜，因此能染色并测定死细胞的DNA，而活细胞不会被染色。为了测量活细胞的比例，冷冻平板以通透细胞，使所有细胞死亡。平板化冻后，用Cytofluor 4000微板读数仪测量荧光(530nm激发，620nm发射)，得出与细胞总数的直接关系。生长抑制表示成测试/对照x100(％T/C)。如果阳性对照(紫杉醇)在存在和没有异搏定的情况下诱导出肿瘤生长抑制变化，并且如果载体处理的对照细胞的荧光强度＞500，则试验才被认可是可评估的。

制备39-去甲氧基雷帕霉素测试溶液

在DMSO中制备出3.3mM 39-去甲氧基雷帕霉素的储存溶液并保存于-20℃。然后在使用之日化冻储存溶液并在施用前和施用期间于室温保存。利用RPMI 1640培养基进行稀释步骤，产生18倍于最终浓度的溶液。

结果

图4显示的4幅图确证了在正常(A和B)或高P-gp表达(C和D)的细胞系中，在所有测试浓度上针对紫杉醇(A和C)和39-去甲氧基雷帕霉素(B和D)的％T/C值。实心菱形代表单独施用紫杉醇或39-去甲氧基雷帕霉素后的值，空心方块代表存在0.01mg/mL异搏定(P-gp抑制剂)时施用紫杉醇或39-去甲氧基雷帕霉素的值。

紫杉醇(一种已知的P-gp底物)，显示出抑制表达P-gp的癌细胞系MCF7ADR的能力降低，而且该能力的降低通过联合施用异搏定(P-gp抑制剂)而被恢复(图4A和4C)。

有或没有异搏定，39-去甲氧基雷帕霉素都没有显示出对表达P-gp的细胞系MCF7ADR的生长增殖曲线有显著改变(图4B和4D)，这证明了39-去甲氧基雷帕霉素不是P-gp的底物。

实施例6-药物动力学分析

6.1雷帕霉素和39-去甲氧基雷帕霉素的PK分析

用上述标准方法对雷帕霉素和39-去甲氧基雷帕霉素进行药物动力学分析(每种化合物使用的规程如表9所示)。

血和脑组织中每种化合物的AUC用Kinetica 4.4(InnaPhaseCorporation)、用非间隔模型和用于AUC计算的梯形方法计算出。

口服和静脉内施用后每种化合物的分隔系数(R_i)如下所示计算出：

该分析结果简述于下表9和图5中。

表9-药物动力学数据简述

6.2雷帕霉素、39-去甲氧基雷帕霉素和27-O-去甲基-39-去甲氧基雷 帕霉素的PK分析

用上述标准方法对雷帕霉素，39-去甲氧基雷帕霉素和27-O-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素进行药物动力学分析(使用上述规程1)。

血和脑组织中每种化合物的AUC用Kinetica 4.4(InnaPhaseCorporation)、用非间隔模型和用于AUC计算的梯形方法计算出。

静脉内施用后每种化合物的分隔系数(R_i)如下所示计算出：

表10-药物动力学数据

化合物	AUC脑，静脉内	AUC血液；静脉内	Ri；静脉内
				雷帕霉素	12156.6	10756.2	1.13
39-去甲氧基雷帕霉素	15543.9	8017.88	1.94
				27-O-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素	8440.05	1851.12	4.56

实施例7-在多发性硬化的实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)模型中的活性

实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)是中枢神经系统(CNS)自体免疫炎性和脱髓鞘疾病，并被认为是多发性硬化(MS)的最佳可用的动物对应疾病。通过注射溶于完全福氏佐剂(CFA)的全脊髓或髓磷脂碱性蛋白质(MBP)，可在遗传上易感的动物中诱导出该疾病。涉及CNS损伤的抗原特异性效应器细胞是II类主要组织相容性复合物(MHC)限制性的CD4⁺T淋巴细胞。近来，细胞因子(如白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF)或干扰素(IFN))在炎性应答中的作用正受到越来越多的关注。通过抗原活化，T细胞产生几种淋巴因子，其在EAE的情况中可直接或间接造成CNS损伤应答。可能涉及在EAE病理过程中的淋巴因子是IL-2、IFN-γ和TNF-β。IL-2在T细胞活化和增殖中起重要作用，而IFN-γ是巨噬细胞活化的有效介导者。另外，IFN-γ诱导产生了炎性细胞因子，如IL-1、TNF，而且其也在CNS中的血管内皮细胞上、并在星形细胞上表达II类MHC分子，它被认为在将抗原提呈到能致脑炎的T细胞中起重要作用。

7.1-动物和免疫过程

8至10周大的雄性Lewis大鼠饲养在标准实验室条件下(没有非特异性病原体)，其可自由接触食物和水。通过往尾部基部单次注射50mL福氏不完全佐剂(Difco，Detroit，MI)和50mL含25mg豚鼠脊髓和1mg结核分支杆菌H37RA株(Difco)的盐水，由此诱导出EAE。

7.2-临床和组织学评分

每天通过测量它们的体重和EAE临床症候检测大鼠，直至免疫后30天。由不知道治疗方案的观察者进行这些临床评分：0＝无病，1＝尾部无力，2＝下身中度瘫痪，3＝下身严重瘫痪，4＝垂死状态，5＝死亡。疾病结束被定义为完全缺乏临床症状并且恢复到免疫前的运动性，大鼠连续5天被评为0分。

7.3-实验性治疗

在预防和治疗方案下，不同剂量(5或15mg/kg体重)给予测试化合物。对于本研究的预防部分，治疗始于免疫前一天，而对于本研究的治疗部分，它起始于免疫后(p.i.)7天。载体治疗的大鼠在相同的实验条件下进行预防或治疗处理，它们被用作对照。每天给予口服治疗，一周六次，直至免疫后第30天，环磷酰胺被用作阳性对照。

实验结果显示在图6和下表11中。图6A显示了5和15mg/kg 39-去甲氧基雷帕霉素的预防方案的效果，图6B显示了5和15mg/kg 39-去甲氧基雷帕霉素的治疗方案的效果。对于每种方案，将40mg/kg环磷酰胺的效果看作阳性对照。在两幅图中，显示了每组的中值得分。可以看出，在该模型中39-去甲氧基雷帕霉素与环磷酰胺有同等的功效，而且它不仅降低了症状的严重程度，而且减少了发作的持续时间。应该注意到，由于在研究中7只载体治疗的大鼠有5只死亡了，该组的中值保持在5，可是2只幸存的大鼠到第28天终于恢复到基线值。

表11

化合物	剂量，mg/kg	方案	开始平均值±标准差	持续时间(天)平均值±标准差	累积得分平均值±标准差
						载体	n/a	n/a	9±0.8	21±13	84±28.6
39-去甲氧基雷帕霉素	5	预防性	12±2.1*	10±1.8*	17±4.6*
						39-去甲氧基雷帕霉素	15	预防性	12±2.4*	10±3.4*	22±22*
环磷酰胺	40	预防性	13±2.6*	13±3.4*	33±14.1*
						39-去甲氧基雷帕霉素	5	治疗性	10±1.0*	15±1.3*	30.±3.1*

化合物	剂量，mg/kg	方案	开始平均值±标准差	持续时间(天)平均值±标准差	累积得分平均值±标准差
						39-去甲氧基雷帕霉素	15.	治疗性	9±1.4*	16±3.3*	32±5.7*
环磷酰胺	40	治疗性	11±1.1*	15±3.2*	37±26.6*

*-与载体治疗的对照有统计学差异，其中p＜0.05，使用了Mann Whitney Rank Surn测试。

实施例8-39-去甲氧基雷帕霉素在神经胶质瘤同位异种移植的裸鼠模型中的抗肿瘤活性研究

8.1-研究准备

8.1.1-准备样品：

测试化合物溶解在乙醇中(0.027mL/mg化合物)并搅拌20分钟直至溶液澄清。乙醇溶液等分成合适的量并保存于-20℃。然后用载体(含4％乙醇、5％吐温-20、5％聚乙二醇400的0.15M NaCl，可能时用无菌无内毒素成分制备)将乙醇溶液调至正确的浓度。

8.1.2-施用方式

通过注射入测试小鼠的尾静脉静脉内(IV，快速灌注)施用测试物质和对照载体。根据小鼠最近的体重，使用10mL/kg注射体积。

8.1.3-癌细胞系

用在本研究中的细胞系是U87-MG，其为最初由J.Ponten从44岁的白人女性的III级成胶质细胞瘤中起始的成胶质细胞瘤细胞系(Poten等，1968)。

8.1.4-用于建立细胞系的细胞培养条件

肿瘤细胞于37℃在潮湿的空气(5％CO₂，95％空气)中以单层生长。培养基是含2mM L-谷氨酸并添加有10％胎牛血清(Ref.DE14-801E，Cambrex)的RPMI 1640(Ref.BE12-702F，Cambrex)。细胞粘附于塑料瓶中。为了实验应用，用含胰蛋白酶-维尔烯(Ref.BE17-161E，Cambrex)的不含钙或镁的Hanks氏培养基(Ref.BE10-543F，Cambrex)处理5分钟，使肿瘤细胞从烧瓶上脱离出。细胞在血球计中计数，并通过0.25％台盼蓝排斥评估它们的存活率。

8.2-通过立体定位注射在裸鼠脑中诱导神经胶质瘤

小鼠全身用γ-源(2.5Gy，Co⁶⁰，INRA BRETENIERE，Dijon)照射后24至48小时，在第0天用U87-MG细胞立体定位注射。为了立体定位注射肿瘤细胞，以10mL/kg/针腹膜内注射溶于0.9％NaCl溶液的克他命100mg/kg  (

Ref 043KET204，Centravet，法国)和甲苯噻嗪5mg/kg(

Ref 002ROM001，Centravet，法国)来麻醉小鼠。利用3种独立的立体定位装置(Kopf Instrument，德国和Stoelting Company，美国)将重悬于0.002mL RPMI-1640培养基中的1x10⁵个U87-MG肿瘤细胞立体定位注射入右额叶中。以500nL/分钟注射0.002mL细胞悬浮液。

8.3-治疗日程

在第7天，小鼠称重并根据个体体重随机分成3组小鼠。为每个治疗组加入额外四(4)只小鼠，用于MRI成像。选择组，从而使每组平均体重与其他的没有统计学差异(方差分析)。以如下定义来施用测试物质。

8.3.1组1的小鼠每天接受IV注射测试物质载体，连续进行3天，进行5轮(在第7至9天、第14至16天、第21至23天、第28至30天和第35至37天：(Q1Dx3)x5W)。每轮由4天冲洗(wash-out)期分开

8.3.2组2的小鼠以3mg/kg/针每天接受IV注射39-去甲氧基雷帕霉素，连续进行3天，进行5轮(在第7至9天、第14至16天、第21至23天、第28至30天和第35至37天：(Q1Dx3)x5W)。每轮由4天冲洗期分开。

8.3.3组3的小鼠不治疗。

治疗日程简述于下表12中：

表12：

组	动物数	治疗	途径	剂量(mg/kg/针)
					1	9(+4)	载体	IV	-
2	10(+4)	39-去甲氧基雷帕霉素	IV	3
					3	16	未治疗	n/a	n/a

8.4-MRI分析

在D23和D37进行MRI分析。所有MRI分析在4.7T在Pharmascan磁体(Bruker，Wissembourg)中进行。在用异氟烷持续麻醉的条件下，将小鼠装入专供小鼠的支架和38mm直径圆柱线圈中。

在三次试验性(tripilot)探测后，进行turboRare T2加权的顺序。探测覆盖了包括肿瘤的全部脑。通过人工画出每个薄片中肿瘤周围感兴趣的区域(ROI)并汇总所有表面，由此来确定肿瘤体积。

8.5-结果

图7显示了直到第43天时每个治疗组的存活图。

另外，结果表示成百分比(T/C％)，其中T代表用39-去甲氧基雷帕霉素治疗的动物的中值存活时间，而C代表用载体治疗的对照动物的中值存活时间。T/C％按下式计算：

T/C％＝[T/C]x100

另外，用MRI分析算出每个治疗组的平均算得的肿瘤体积，结果概括于下表13。由于到第37天所有载体治疗的动物都死了，因此在该阶段不可能比较肿瘤大小。

表13

组	第23天(mm3)
		载体	18.75
39-去甲氧基雷帕霉素	1.25

每个数据点代表4个值的平均值。

参考文献：

Alvarez，M.，Paull，K.，Monks，A.，Hose，C.，Lee，J.S.，Weinstein，J.，Grever，M.，Bates，S.，Fojo，T.，(1995).“Generation of a drug resistance profile byquantitation of mdr-1/P-glycoprotein in the cell lines of the National CancerInstitute Anticancer Drug Screen“，Journal of Clinical Investigation，95，2205-2214.

An，W.L.，R.F.Cowburn，等(2003).″Up-regulation ofphosphorylated/activated p70 S6 kinase and its relationship to neurofibrillarypathologyin Alzheimer′s disease.″Am J Pathol 163(2)：591-607.

Avramut，M.和Achim，C.L.(2002).″Immunophilins and their ligands：insights into survival and growth of human neurons.″Physiol Behav 77(4-5)：463-8.

Baker，H.，Sidorowicz，A.，Sehgal，S.N.，和Vézina，C.(1978)“Rapamycin(AY-22，989)，a new antifungal antibiotic.III.In vitro and in vivo evaluation”.Journal of Antibiotics 31，539-545.

Boyd，M.R.和Paull，K.D.，(1995).“Some Practical Considerations andApplications of the National Cancer Institute In Vitro Anticancer Drug DiscoveryScreen”，Drug Development Research 34，91-109，

Bradl M.，Hohlfeld R.(2003)，“Molecular pathogenesis ofneuroinflammation”.J Neurol Neurosurg Psychiatry.74：1364-70.

Brunn，G.J.，Fadden，P.，Haystead，T.A.，Lawrence，J.C.Jr.(1997)“Themammalian target of rapamycin phosphorylates sites having a(Ser/Thr)-Promotif and is activated by antibodies to a region near its COOH terminus”，J Biol.Chem.272(51)，32547-32550.

Brunn，G.J.，Williams，J.，Sabers，C.，Wiederrecht，G.，Lawrence，J.C.，和Abraham，R.T.(1996)“Direct inhibition of the signaling functions of themammalian target of rapamycin by the phosphoinositide 3-kinase inhibitors，wortmannin and LY294002”.EMBO Journal 15：5256-5267.

Chang，S.M.，P.Wen，等(2005).″Phase II study of CCI-779in patientswith recurrent glioblastoma multiforme.″Invest New Drugs 23(4)：357-61.

Crowe，A.，Bruelisauer，A.，Duerr，L.，Guntz，P.，Lemaire，M.，(1999)，“Absorption and intestinal metabolism of SDZ-RAD and rapamycin in rats”.Drug Metab Dispos.；27(5)，627-32.

Cummins，C.L.，Jacobsen，W.，Christians，U.，Benet，L.Z.，(2004)，，CYP3A4-Transfected Caco-2 Cells as a Tool for Understandinf BiochemicalAbsorption Barriers：Studies with Sirolimus and Midazolam“，The Journal ofPharmacology，308(1)，143-155

Dancey，J.E.，(2002)，“Clinical development of mammalian target ofrapamycin inhibitors”Hematol Oncol Clin N Am，16，1101-1114.

Dengler W.A.，Schulte J.，Berger D.P.，Mertelsmann R.and Fiebig HH.(1995)“Development of a propidium iodide fluorescence assay for proliferationand cytotoxicity assay”.Anti-Cancer Drugs，6，522-532.

Dumont，F.J.和Su，Q.X.(1995).“Mechanism of action of theimmunosuppressant rapamycin”.Life Sciences 58(5)：373-395.

Emborg M.E.，(2004)“Evaluation of animal models of Parkinson′s diseasefor neuroprotective strategies”J Neurosci Methods，139(2)：121-43；

Fiebig H.H.，Dengler W.A.和Roth T.(1999)“Human tumor xenografts：Predictivity，characterization，and discovery of new anticanceragents”.In：FiebigHH，Burger AM(eds).Relevance of Tumor Models for Anticancer DrugDevelopment.Contrib.Oncol.，54：29-50.

Findlay J.A，和Radics，L.(1980)Canadian Journal of Chemistry 58：579.Gallant-Haidner H.L.，Trepanier D.J.，Freitag D.G.，Yatscoff R.W.2000，“Pharmacokinetics and metabolism of sirolimus”.Ther Drug Monit.22(1)，31-5.

German D.C.和Eisch A.J.，(2004)，“Mouse models of Alzheimer′s disease：insight into treatment”，Rev Neurosci，15：353-69.

Grass，G.M.，Rubas，W.，Jezyk，N.，(1992)“Evaluation of CACO-2monolayers as a predictor of drug permeability in colonic tissues”.FASEBJournal，6，A1002.

Gregory M.A.，Gaisser S，Lill R.E.，Hong H，Sheridan R.M.，Wilkinson B，Petkovic H，Weston A.J.，Carletti I，Lee H.L.，Staunton J，Leadlay PF.(2004)“Isolation and characterization of pre-rapamycin，the first  macrocyclicintermediate in the biosynthesis of the immunosuppressant rapamycin by S.hygroscopicus”.Angew Chem Int Ed Engl.43(19)，2551-3

Hersch S.M.和Ferrante R.J.，(2004)，“Translating therapies forHuntington′s disease from genetic animal models to clinical trials”，NeuroRx.1(3)：298-306

Huang，S.和Houghton，P.J.，2002.“Mechanisms of resistance torapamycins”.Drug Resist.Update，4(6)，378-391.

Huang，S.，Bjornsti，M.A.和Houghton P.J.(2003).″Rapamycins：mechanism of action and cellular resistance.″Cancer Biol Ther 2(3)：222-32.

Kahan，B.D.，Chang，J.Y.，和Sehgal，S.N.(1991)“Preclinical evaluation ofa new potent immunosuppressive agent，rapamycin”.Transplantation 52：185-191.

Kirchner，G.I.，Winkler，M.，Mueller L.，Vidal，C.，Jacobsen，W.，Franzke，A.，Wagner，S.，Blick，S.，Manns M.P.，和Sewing K.-F.(2000)“Pharmacokinetics ofSDZ RAD and cyclosporin including their metabolites in seven kidney graftpatients after the first dose of SDZ RAD”.British Journal of ClinicalPharmacology 50：449-454.

Kuhn B.，Jacobsen W.，Christians U.，Benet L.Z.，Kollman P.A.(2001)，“Metabolism of sirolimus and its derivative everolimus by cytochrome P450 3A4：insights from docking，molecular dynamics，and quantum chemical calculations”.J Med Chem.44(12)，2027-34.

Kuo，C.J.，Chung，J.K.，Fiorentino，D.F.，Flanagan，W.M.，Blenis，J.，和Crabtree，G.R.(1992)“Rapamycin selectively inhibits interleukin-2 activation ofp70 S6 kinase”.Nature 358：70-73.

Lampen A.，Zhang Y.，Hackbarth I.，Benet L.Z.，Sewing K.F.，Christians U.(1998)“Metabolism and transport of the macrolide immunosuppressantsirolimus in the small intestine”.J Pharmacol Exp Ther.285(3)，1104-12.

Langmann T.，Mauerer R.，Zahn A.，Moehle C.，Probst M.，Stremmel W.，Schmitz G.(2003)“Real-time reverse transcription-PCR expression profiling ofthe complete human ATP-binding cassette transporter superfamily in varioustissues”.Clin Chem.49(2)，230-8.

Laplante A.，Demeule M.，Murphy G.F.，Beliveau R.(2002)“Interaction ofimmunosuppressive agents rapamycin and its analogue SDZ-RAD withendothelial P-gp”.Transplant Proc.34(8)，3393-5.

Lee，J-S.，Paull，K.，Alvarez，M.，Hose，C.，Monks，A.，Grever，M.，Fojo，A.T.，Bates，S.E.，1994.“Rhodamine efflux patterns predict P-glycoproteinsubstrates in the National Cancer Institute drug screen”.MolecularPharmacology 46，627-638.

Lee J.K.，Bussey K.J.，Gwadry F.G.，Reinhold W.，Riddick G.，Pelletier S.L.，Nishizuka S.，Szakacs G.，Annereau J.P.，Shankavaram U.，Lababidi S.，SmithL.H.，Gottesman M.M.，Weinstein J.N.(2003)“Comparing cDNA andoligonucleotide array data：concordance of gene expression across platforms forthe NCI-60cancer cells”.Genome Biol.4(12)，R82.

Li，A.P.(1992)“Screening for human ADME/Tox drug properties in drugdiscovery”.Drug Discovery Today，6，357-366.

Lowden，P.A.S.，(1997)Ph.D.Dissertation，University of Cambridge.“Studies on the biosynthesis of rapamycin”.

Main，E.R.G.，Fulton，K.F.& Jackson，S.E.(1998).“The Context-DependentNature of Destabilising Mutations on the Stability of FKBP 12”.Biochemistry 37，6145-6153.

Main，E.R.G.，Fulton，K.F.&Jackson，S.E.(1999).“Folding of FKBP12：Pathway of Folding and Characterisation of the Transition State”.J.Mol.Biol.291-429-444.

McAlpine，J.B，.Swanson S.J.，Jackson，M.，Whittern，D.N.(1991).“RevisedNMR assignments for rapamycin”.Journal of Antibiotics 44：688-690.

Meiering，E.M.，Serrano，L.& Fersht，A.R.(1992).“Effect of Active SiteResidues in Barnase on Activity and Stability”.J.Mol.Biol.225-585-589.

Mothe-Satney，I.，Brunn，G.J.，McMahon，L.P.，Capaldo，C.T.，Abraham，R.T.，Lawrence，J.C.Jr-.(2000)“Mammalian target of rapamycin-dependentphosphorylation of PHAS-I in four(S/T)P sites detected by phospho-specificantibodies”.J Biol Chem.275(43)，33836-33843.

Paiva，N.L.，Demain，A.L.，和Roberts，M.F.(1991)“Incorporation ofacetate，propionate，and methionine into rapamycin By Streptomyceshygroscopicus”.Journal of Natural Products 54：167-177.

Pardridge，(2005)，“The Blood-Brain Barrier：Bottleneck in Brain DrugDevelopment”，NeuroRx，2，3-14

Perin，E.C.，(2005)，“Choosing a Drug-Eluting  Stent：A ComparisonBetween CYPHER and TAXUS”，Reviews in Cardiovascular Medicine，6(suppl1)，ppS13-S21.

Persidis A.(1999)，“Cancer multidrug resistance”Nat Biotechnol.17：94-5

Poten J.等，(1968)，“Long term culture of normal and neoplastic humanglia.”Acta Pathol.Microbiol.Scand.，74：465-86

Raught B.，Gingras，A-C.和Sonenberg，N.；(2001)，“The target ofrapamycin(TOR)proteins”，PNAS，98(13)：7037-7044

Ravikumar，B.，R.Duden，等(2002).″Aggregate-prone proteins witholyglutamine and polyalanine expansions are degraded by autophagy.″Hum Mol Genet 11(9)：1107-17.

Reather，J.A.，(2000)，Ph.D.Dissertation，University of Cambridge.“Latesteps in the biosynthesis of macrocyclic lactones”.

Roth T.，Burger A.M.，Dengler W.，Willmann H.和Fiebig H.H.(1999)“Human tumor cell lines demonstrating the characteristics of patient tumors asuseful models for anticancer drug screening”.In：Fiebig HH，Burger AM(eds).Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development.Contrib.Oncol.，54：145-156.

Sathasivam，K.，C.Hobbs，等(1999).″Transgenic models of Huntington′sdisease.″Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 354(1386)：963-9

Sedrani，R.，Cottens，S.，Kallen，J.，和Schuler，W.(1998)“Chemicalmodifications of rapamycin：the discovery of SDZ RAD”.TransplantationProceedings 30：2192-2194.

Sehgal，S.N.，Baker，H.，和Vézina，C.(1975)“Rapamycin(AY-22，989)，anew antifungal antibiotic II.Fermentation，isolation and characterization”.TheJournal of Antibiotics 28：727-733.

Schober A.(2004)，“Classic toxin-induced animal models of Parkinson′sdisease：6-OHDA and MPTP”Cell Tissue Res，318(1)：215-24)

Stein U.，Jurchott K.，Schlafke M.，Hohenberger P.(2002)“Expression ofmultidrug resistance genes MVP，MDR1，and MRP1 determined sequentiallybefore，during，and after hyperthermic isolated limb perfusion of soft tissuesarcoma and melanoma patients”.J Clin Oncol.20(15)：3282-92.

Szakacs G.，Annereau J.P.，Lababidi S.，Shankavaram U.，Arciello A.，Bussey K.J.，Reinhold W.，Guo Y.，Kruh G.D.，Reimers M.，Weinstein J.N.，Gottesman M.M.2004，“Predicting drug sensitivity and resistance：profilingABC transporter genes in cancer cells”.Cancer Cell.6(2)：129-37.

Tanford，C.(1968).“Protein Denaturation.Adv.Prot.Chem.23，121-282.

Tanford，C.(1970).“Protein Denaturation.Part C.Theoretical models forthe mechanism of denaturation”.Advances in Protein Chemistry 24，1-95Tee，A.R.和Proud，C.G.(2002)“Caspase cleavage of initiation factor4E-binding protein 1 yields a dominant inhibitor of Cap-dependent translationand reveals a novel regulatory motif”.Mol.Cell.Biol.22，1674-1683

Trepanier D.J.，Gallant H.，Legatt D.F.，Yatscoff R.W.(1998)，“Rapamycin：distribution，pharmacokinetics and therapeutic range investigations：an update”.Clin Biochem.31(5)：345-51.

Vézina，C.，Kudelski，A.，和Sehgal，S.N.(1975)“Rapamycin(AY-22，989)，a new antifungal antibiotic.I.Taxonomy of the producing streptomycete andisolation of the active principle”.The Journal of Antibiotics 28：721-726.

Volpe，D.A.，Faustino，P.J.，Yu，L.X.，(2001)“Towards standardisation of anin vitro method of drug absorption”.Pharmacopeial Forum，27，2916-2922.

Yu，K.，Toral-Barza，L.，Discafani，C.，Zhang，W.G.，Skotnicki，J.，Frost，P.，Gibbons，J.J.(2001)“mTOR，a noveltarget in breast cancer：the effect ofCCI-779，an mTOR inhibitor，in preclinical models of breast cancer”.Endocrine-Related Cancer 8：249-258.

具体地，本发明一般涉及以下方面：

1.根据式(I)所示的39-去甲氧基雷帕霉素类似物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗由神经损伤或疾病造成的医学病症的药物中的用途，

其中，R₁代表(H，H)或＝O而且R₂和R₃各自独立代表H、OH或OCH₃。

2.根据式(I)所示的39-去甲氧基雷帕霉素类似物在制备用于治疗影响中枢神经系统的医学病症的药物中的用途，

其中，R₁代表(H，H)或＝O而且R₂和R₃各自独立代表H、OH或OCH₃，其中所述医学病症需要穿越血脑屏障。

3.根据项1或2所述的用途，其中所述医学病症选自由一种或多种脑肿瘤和神经退行性病症组成的组。

4.项3的用途，其中所述药物用于治疗脑肿瘤。

5.项4的用途，其中所述脑肿瘤是多形性成胶质细胞瘤。

6.项3的用途，其中所述药物是用于治疗神经退行性病症。

7.项6的用途，其中所述神经退行性病症是阿尔茨海默氏病。

8.项6的用途，其中所述神经退行性病症是多发性硬化。

9.根据式(I)所示的39-去甲氧基雷帕霉素类似物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗癌症或B-细胞恶性肿瘤的药物中的用途，

其中，R₁代表(H，H)或＝O而且R₂和R₃各自独立代表H、OH或OCH₃，其中癌症或B-细胞恶性肿瘤对一种或多种现有的抗癌剂有耐受性。

10.项9的用途，其中所述癌症或B-细胞恶性肿瘤表达P-糖蛋白。

11.项10的用途，其中所述癌症或B-细胞恶性肿瘤具有高表达水平的P-糖蛋白。

12.项1至11之任一项的用途，其中所述药物是用于静脉内施用39-去甲氧基雷帕霉素类似物或其药学上可接受的盐。

13.项1至11之任一项的用途，其中所述药物进一步包含一种或多种其他治疗上有效的试剂。

14.项3-5或9-13之任一项的用途，其中所述药物是用于治疗癌症或B-细胞恶性肿瘤，而且其中所述药物进一步包含一种或多种选自由下列组成的组的试剂：甲氨蝶呤、甲酰四氢叶酸、阿霉素、强的松、博来霉素、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、紫杉醇、多西紫衫醇、长春新碱、长春碱、长春瑞宾、亚德里亚霉素、它莫西芬、托瑞米芬、乙酸甲地孕酮、阿那曲唑、戈舍瑞林、抗HER2单克隆抗体(如Herceptin^TM)、卡培他滨、盐酸雷洛昔芬、EGFR抑制剂、VEGF抑制剂、蛋白酶体抑制剂、和hsp90抑制剂。

15.项1至14之任一项的用途，其中所述39-去甲氧基雷帕霉素类似物是39-去甲氧基雷帕霉素。

16.项1至14之任一项的用途，其中所述39-去甲氧基雷帕霉素类似物还与雷帕霉素在第9、16或27位之一或多个位置上有区别。

17.根据项16所述的用途，其中所述39-去甲氧基雷帕霉素类似物与雷帕霉素在第16或27位之一或多个位置上有区别。

18.根据项16所述的用途，其中所述39-去甲氧基雷帕霉素类似物与雷帕霉素在第16和27位上有区别。

19.根据项16至18之任一项所述的用途，其中所述39-去甲氧基雷帕霉素类似物在第27位上有羟基，即R₃代表OH。

20.根据项16至18之任一项所述的用途，其中所述39-去甲氧基雷帕霉素类似物在第27位上有氢，即R₃代表OH。

21.根据项16至20之任一项所述的用途，其中所述39-去甲氧基雷帕霉素类似物在第16位上有羟基，即R₂代表OH。

22.药物组合物，其包含根据式(I)所示的39-去甲氧基雷帕霉素类似物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体，

其中，R₁代表(H，H)或＝O而且R₂和R₃各自独立代表H、OH或OCH₃。

23.根据项22所述的药物组合物，其特定地配制成用于静脉内施用。

Claims (15)

1.根据式(I)所示的39-去甲氧基雷帕霉素类似物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗癌症或B-细胞恶性肿瘤的药物中的用途，

其中，R₁代表(H，H)或＝O而且R₂和R₃各自独立代表H、OH或OCH₃，其中癌症或B-细胞恶性肿瘤对一种或多种现有的抗癌剂有耐受性。

2.权利要求1的用途，其中所述癌症或B-细胞恶性肿瘤表达P-糖蛋白。

3.权利要求2的用途，其中所述癌症或B-细胞恶性肿瘤具有高表达水平的P-糖蛋白。

4.权利要求1至3之任一项的用途，其中所述药物是用于静脉内施用39-去甲氧基雷帕霉素类似物或其药学上可接受的盐。

5.权利要求1至3之任一项的用途，其中所述药物进一步包含一种或多种其他治疗上有效的试剂。

6.权利要求1-5之任一项的用途，其中所述药物是用于治疗癌症或B-细胞恶性肿瘤，而且其中所述药物进一步包含一种或多种选自由下列组成的组的试剂：甲氨蝶呤、甲酰四氢叶酸、阿霉素、强的松、博来霉素、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、紫杉醇、多西紫衫醇、长春新碱、长春碱、长春瑞宾、亚德里亚霉素、它莫西芬、托瑞米芬、乙酸甲地孕酮、阿那曲唑、戈舍瑞林、抗HER2单克隆抗体(如Herceptin^TM)、卡培他滨、盐酸雷洛昔芬、EGFR抑制剂、VEGF抑制剂、蛋白酶体抑制剂、和hsp90抑制剂。

7.权利要求1至6之任一项的用途，其中所述39-去甲氧基雷帕霉素类似物是39-去甲氧基雷帕霉素。

8.权利要求1至6之任一项的用途，其中所述39-去甲氧基雷帕霉素类似物还与雷帕霉素在第9、16或27位之一或多个位置上有区别。

9.根据权利要求8所述的用途，其中所述39-去甲氧基雷帕霉素类似物与雷帕霉素在第16或27位之一或多个位置上有区别。

10.根据权利要求9所述的用途，其中所述39-去甲氧基雷帕霉素类似物与雷帕霉素在第16和27位上有区别。

11.根据权利要求8至10之任一项所述的用途，其中所述39-去甲氧基雷帕霉素类似物在第27位上有羟基，即R₃代表OH。

12.根据权利要求8至10之任一项所述的用途，其中所述39-去甲氧基雷帕霉素类似物在第27位上有氢，即R₃代表OH。

13.根据权利要求8至12之任一项所述的用途，其中所述39-去甲氧基雷帕霉素类似物在第16位上有羟基，即R₂代表OH。

14.药物组合物，其包含根据式(I)所示的39-去甲氧基雷帕霉素类似物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体，

其中，R₁代表(H，H)或＝O而且R₂和R₃各自独立代表H、OH或OCH₃。

15.根据权利要求14所述的药物组合物，其特定地配制成用于静脉内施用。

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