WO2002068436A1 - Avilamycin-derivate - Google Patents

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WO2002068436A1
WO2002068436A1 PCT/EP2001/009815 EP0109815W WO02068436A1 WO 2002068436 A1 WO2002068436 A1 WO 2002068436A1 EP 0109815 W EP0109815 W EP 0109815W WO 02068436 A1 WO02068436 A1 WO 02068436A1
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avilamycin
nucleic acid
sequence
sequences
cell
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PCT/EP2001/009815
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Gabriele Weitnauer
Agnes MÜHLENWEG
Axel Trefzer
Andreas Bechthold
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Combinature Biopharm Ag
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    • C07H13/02—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids
    • C07H13/08—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids having the esterifying carboxyl radicals directly attached to carbocyclic rings
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    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces

Definitions

  • the invention relates to avilamycin derivatives (hereinafter also referred to as gavibamycins), genetic engineering biosynthetic processes for their preparation, medicaments containing these compounds, and the use of these compounds for the production of a medicament, for example against infectious diseases, as well as nucleic acids, proteins and gene clusters and corresponding cells that are associated with the production of these avilamycin derivatives.
  • gavibamycins avilamycin derivatives
  • combinatorial Biosynthesis refers to and uses biosynthetic genes as a means of manufacturing new drugs.
  • orthosomycins are a well-known class of antibiotics that are produced by various Actinomycetes. Members of this class act on a wide range of gram-positive pathogenic bacteria, including glycopeptide-resistant enterococci, methicillin-resistant staphylococci and penicillin-resistant streptococci.
  • orthosomycins are avilamycins and evemimycins, which are produced by Streptomyces viridochromogenes Tü57 and Micromonospora carbonacea, respectively. These antibiotics consist of a heptasaccharide side chain and a dichloroisoevernic acid derived from the polyketide (acetate units) as agiycon, the sugar residues being partly linked to one another via orthoester bonds. This bond gives the whole class of orthosomycins the name. The exact mechanism of action of Orthosomycine is unknown.
  • avilamycin A one of the main components, is made up of sugars. Individual components are D- Olivose, 2-deoxy-D-evalose, 4-0-methyl-D-fucose, 2,6-di-O-methyl-D-mannose, L-lyxose and methyl eurekanate. In studies, avilamycin A showed excellent activity against multi-resistant Staphylococcus aureus strains (Zahner, 1999). In addition to the orthoesters, the terminal dichloroisoevernic acid residue is said to be essential for effectiveness (Wright, 1979). Like US Pat. No. 3,131,126, DE 1116864 describes the substance class of the avilamycins including a general reference to derivatives and the preparation and action of avilamycins.
  • Ziracin also belongs to the Orthosomycine group. Ziracin (SCH27899) is an evernimycin and has already been clinically tested.
  • avilamycin A Molecular cloning and characterization of the enzymes determining the biosynthesis of avilamycin A should be of great interest, especially for the class of orthosomycins and in particular for the avilamycins, since this information is the direction for the development could prescribe new (antimicrobial) antibiotics.
  • the genes are an interesting system to study the formation and linkage of unusual deoxysugars and may therefore be of great value for combinatorial biosynthesis.
  • avilamycin derivatives not described in the prior art also referred to as gavibamycins according to the invention
  • the invention therefore relates to an avilamycin derivative according to general formula I, also in the form of its diastereomers or Enantiomers or racemic or other mixtures or pure diastereomers and / or enantiomers,
  • R1 is selected from H, COCH 1 COC 4 H 9 , COCH (CH 3 ) 2 or
  • R2 is selected from H, CHO, COCH3 or CH (OH) CH 3 ,
  • R3 corresponds to OCH 3 .
  • R4 corresponds to Cl
  • R5 corresponds to Cl
  • R6 corresponds to CH 3 .
  • R7 corresponds to H, CH 3 or CH 2 OH
  • R9 corresponds to CH 3 .
  • R3 is to be replaced by OH
  • R4 is to be replaced by H
  • R5 is to be replaced by H
  • R6 is to be replaced by H
  • R8 is to be replaced by H.
  • R9 is to be replaced by H, with the proviso that R1-R9 cannot simultaneously assume the meanings according to the respective combination in one of the compounds 1-4:
  • the avilamycin derivatives according to the invention are distinguished in particular against Staphylococcus aureus, in particular also against one of the known orthosomycins such as avilamycin A or C and
  • avilamycin derivative according to the invention in which at least R4 and R5 in formula I are to be replaced by H.
  • avilamycin derivative according to the invention in which at least R6, R8 and / or R9 is / are to be replaced by H, with the proviso that R1-R9 do not simultaneously mean the meanings according to the combination in compound 3 or not simultaneously Can assume meanings according to the combination in compound 4:
  • a particularly preferred object of the invention that solves the problem in a particularly favorable manner is an avilamycin derivative according to general formula I, which is selected from compounds in which R1-R9 each have the meaning given in the table below, are combined as follows:
  • avilamycin derivatives which can be produced by a special process that includes genetic engineering manipulations and biosynthesis.
  • Another object of the invention is therefore an avilamycin derivative which is obtainable by the fact that, in a cultivable cell, the genes or enzymes required for the synthesis of an orthosomycin base body consisting of (a) a terminal dichloroisoevernic acid residue (A in formula I) and
  • nucleic acid has, at least one nucleic acid, the sequence of which corresponds to at least 95%, preferably 97%, in particular exactly, the nucleic acid sequence according to one of Figures 1 to 54, is genetically modified, deleted and / or not expressed, the modified cell is cultivated, the Culture supernatant is obtained and worked up, the avilamycin derivative (s) is / are purified and isolated and, if appropriate, various derivatives are separated,
  • the cell has the necessary genes or enzymes for the synthesis of an orthosome base
  • the genes coding for the necessary enzymes and / or the functional enzymes themselves are present in the cell are necessary for the synthesis of an “orthosomycin base body” from the precursors usually present.
  • Examples would be the gene cluster according to the invention according to Fig. 109 or the "Open Reading Frames” (ORF) or genes according to sequence number 1-54 according to Table 1 in conjunction with Fig. 1 or the associated enzymes or proteins according to sequence number 55-108 according to Table 1 in conjunction with Fig. 1.
  • gene is further understood to be a section of DNA from which a single mRNA molecule (which is then translated into a single polypeptide or protein) or a functional RNA molecule (rRNA, tRNA) is transcribed.
  • open reading frame (ORF) is further understood to mean a DNA section that begins with a start codon, ends with an end codon and contains an uninterrupted sequence of codons for amino acids.
  • the term “open reading Frame "(ORF) is used here to describe a cloned and sequenced DNA segment that corresponds to a gene.
  • Codon is the coding basic genetic unit. It consists of a triplet of three consecutive nucleotides that code for either an amino acid or the start or end of a polypeptide chain.
  • cells that can be cultivated are understood to mean cells that grow and multiply in vitro in a solid or liquid medium fed by a liquid or solidified nutrient solution, the culture medium. In the narrower sense, these are in particular cells from
  • Microorganisms or easily transfectable cells in which appropriate genes can be expressed for example, gram-positive and gram-negative bacterial cells, e.g. Streptomyces cells (e.g. Streptomyces viridochromogenes Tu 57), but also systems such as mammalian cells, e.g. CHO cells (Chinese
  • Hamster ovary or immortalized cell lines, e.g. HeLa- or HEK-
  • a nucleic acid is understood to mean the basic unit of DNA and RNA and thus in particular the basic unit of a gene and an ORF.
  • a nucleic acid can comprise a gene or an ORF and a specific nucleic acid sequence (the sequence of the bases on the phosphate sugar). Backbone of a nucleic acid) accordingly define a gene or an ORF.
  • Nucleic acid is also understood to mean sequences which, in addition to the coding regions, also contain further sequence regions, in particular at the 5 'or 3' end of the coding region. These sequences can have no function or can be promoter or enhancer signals, preferably bacterial signals or signals corresponding to the host cell system used for expression.
  • nucleotide sequences which code for so-called “tags” are very particularly preferred, so that the proteins according to the invention expressed in the host cells can be easily purified, for example by affinity chromatography
  • Any nucleotide sequences which code for AS sequences and which contain a tag (for example an antigen) for binding to an antibody, for example on a column, can thus be attached to the coding nucleotide sequences according to the invention, preferably at the 5 'or 3' end
  • the AS sequences which result from the combination of coding nucleic acids according to the invention with other nucleotide sequences are also disclosed.
  • genetic engineering means the use of various techniques with which DNA is introduced into a host cell or the DNA of a cell is specifically modified. This includes e.g. the use of cloning techniques, vectors, restriction enzymes etc.
  • genetically modified means that an intervention in the base sequence, the sequence that has changed the nucleic acid, in particular the base sequence has been shortened (up to the point of deletion) or mutations have been incorporated, usually with the result that the nucleic acid (the gene) does not or only does so can be transcribed into an mRNA.
  • Deleted in this case means that a nucleic acid, which usually comprises a gene or an ORF, is completely or at least largely removed from the DNA, so that the nucleic acid (the gene) cannot be transcribed into an mRNA, or can only be modified.
  • not expressed means that the nucleic acid has been changed in such a way that the nucleic acid (the gene) cannot be transcribed into an mRNA, or can only be changed, and accordingly the polypeptide or protein for which the nucleic acid (the gene or the ORF) originally coded.
  • Moderately stringent hybridization conditions are understood to mean varying standard conditions depending on the nucleic acid sequence used (oligonucleotide, longer fragment or complete sequence) or on the type of nucleic acid (DNA or RNA) used for the hybridization.
  • the melting temperatures for DNA: DNA hybrids are approx. 10 ° C lower than those of DNA: RNA hybrids of the same length.
  • DNA hybrids are advantageously 0.1 ⁇ SSC and temperatures between approximately 20 ° C. to 45 ° C., preferably between approximately 30 ° C. to 45 ° C.
  • DNA: RNA hybrids the hybridization conditions are advantageously 0.1 ⁇ SSC and temperatures between approximately 30 ° C.
  • These specified temperatures for the hybridization are, for example, calculated melting temperature values for a nucleic acid with a length of approx. 100 nucleotides and a G + C content of 50% in the absence of formamide.
  • the experimental conditions for the DNA hybridization is found in relevant textbooks on genetics, such as in Sambrook et al. ("Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989), and can be calculated according to formulas known to the person skilled in the art, for example depending on the length of the nucleic acids, the type of hybrid or the G + C content. The person skilled in the art can obtain further information on hybridization from the following textbooks: Ausübel et al.
  • cultivation is understood to mean the in vitro cultivation of cultivable cells, as a result of which they grow and multiply, nourished in a solid or liquid medium by a liquid or solidified nutrient solution, the culture medium.
  • Culture supernatant is understood to mean the liquid culture medium which, in addition to the nutrients for the cells which can be cultivated, also contains the metabolites and substances (e.g. avilamycin derivatives) released into the medium by them.
  • This culture supernatant can be obtained and worked up, which means in particular the suctioning off of the supernatant and / or a filtration with which the solids remaining from the cultivation and the cells are separated off.
  • the culture supernatant which in the context of this invention mostly contains avilamycin derivatives according to the invention, can be purified after working up, including, for example, chromatographic separation and / or separation via liquid phases or a combination of these procedures is to be understood. Examples are a solid phase extraction with a methanol-in-water gradient or an ethyl acetate extraction.
  • the fraction containing the avilamycin derivatives is separated as much as possible from other fractions containing other constituents of the culture supernatant and the avilamycin derivatives are thus largely isolated.
  • the method of salting out or recrystallization or recrystallization can also be considered as alternative separation and / or purification methods. If necessary, isolation and separation of the individual derivatives can then follow, in particular chromatography methods being used here. Preparative HPLC methods or affinity chromatography methods are very particularly preferred.
  • the cultivable cell is selected from a cell of the Streptomyces viridochromogenes type or a cell which, with the exception of the genetically modified, deleted or unexpressed nucleic acid / s, the nucleic acids 1 to 54 according to Table 1 in conjunction with Fig. 1 or at least 95%, preferably 97%, of homologous nucleic acids or hybridizes with one of these sequences under moderately stringent conditions or contains the gene cluster according to Fig. 109.
  • the second point of the selection is to be understood in particular as cells in which the enzymes necessary for avilamycin derivative synthesis are expressed by genetic engineering methods, one of the nucleic acids coding for an enzyme coding for endogenously occurring in the Streptomyces viridochromogenes Tu 57 or is deleted or is not expressed, in particular the nucleic acid / DNA is not even introduced into the host cell by genetic engineering.
  • the Cell is selected from a cell of the type Streptomyces viridochromogenes, in particular a cell of the type Streptomyces viridochromogenes Tu 57 or A 23575.
  • the modified (e.g. deleted or not introduced into the host cell) nucleic acid (s) for a methyl transferase and / or for a halogenase encoded it is preferred if in the process the modified (e.g. deleted or not introduced into the host cell) nucleic acid (s) for a methyl transferase and / or for a halogenase encoded.
  • the production can also take place outside of an in vivo process as in vitro synthesis.
  • the enzymes and / or enzyme systems required for the synthesis are specified in at least one test batch, the reaction steps required for the synthesis preferably being carried out catalytically by the enzymes required and according to the invention in several test batches connected in series. Possibly. Separation and / or purification steps for purifying the desired intermediate products can be inserted between the individual reactions carried out in a suitable sequence.
  • Methyl transferases are understood to be enzymes that can transfer a methyl group to an organic molecule. In the sense of the invention, these are in particular enzymes which transfer a methyl group to either orsellic acid or to the sugars, preferably after the formation of the heptasaccharide, in particular the ORFs aviG2, av ⁇ ' G3, aviG5, aviG6, aviG1, aviG4, aviRa and aviRb, especially aviG4.
  • Halogenases are understood to be enzymes that can transfer halogens enzymatically to organic molecules.
  • these are in particular enzymes which relate to orsellic acid one, preferably two Transfer Cl residues at positions R4 and / or R5, especially the ORF aviH.
  • the sequences of the changed nucleic acid (s) before the change are at least 95%, preferably 97%, in particular exactly, the nucleic acid sequence (s) at least one of the sequences according to serial No. 1 or 2-7 according to Table 1 in conjunction Fig. 1, preferably one of the sequences with sequence numbers 1, 2, 4 or 6 (Table 1 in connection with Fig. 1) corresponds to en, in particular the sequence with sequence number 2 or the sequences with sequence numbers 2 and no. 1, No. 2 and No. 4 or No. 2 and No. 6 (according to Table 1 in connection with Fig. 1) or hybridized with one of these sequences under moderately stringent conditions.
  • “before the change” means that the modified nucleic acid before the genetic engineering manipulation of it, ie before the deletion or the change, in particular shortening or mutation in the base sequence, but also before the step, even this nucleic acid / DNA not first to be introduced into the host cell by genetic engineering, which has the nucleic acid sequence mentioned.
  • the change in the nucleic acid (s) leads to the fact that the protein (s) or polypeptide (s) encoded by the genetically modified nucleic acid (s) or polypeptide (s) after the genetic engineering change is no longer synthesized.
  • Polypeptide is understood to be a peptide with between 10 ⁇ and ⁇ 100 amino acid residues and a protein is a macromolecule with more than 100 amino acid residues linked via peptide bonds.
  • proteins in the context of this invention are preferably enzymes. Of course, other proteins within the meaning of this invention also fall under this term.
  • the avilamycin derivatives according to the invention described so far have predominantly or all the advantages compared to the related orthosomycins described in the prior art, in particular compared to avilamycin A, of being more hydrophilic, which offers considerable therapeutic advantages. This applies in particular to a comparison with the Avilamycin A or C or also with the Evernimycin Ziracin.
  • the sequence was an NDP-glucose synthase gene (aviD [serial number 53 according to Table 1 in conjunction with Fig. 1]), an NDP-glucose-4,6-dehydratase gene (aviEl [serial number 54 according to Table 1 in connection with Fig. 1]) and a polyketide synthase gene (aviM [serial number 52 according to Table 1 in connection with Fig.
  • nucleic acid which in their sequence are at least 95%, preferably 97%, in particular exactly, the nucleic acid sequence according to one of the sequences of the sequence numbers 1 to 51 according to Table 1 in conjunction Fig. 1 corresponds / correspond or hybridized with one of these sequences under moderately stringent conditions.
  • sequences with sequence numbers 48 and 49 (according to Table 1 and sequence representation in Fig. 1) with function as rRNA methyltransferases (aviRa and aviRb) and also the sequences with sequence numbers 50 and 51 (according to Table 1 iVm Fig.
  • nucleic acid which comprise at least 95%, preferably 97%, in particular exactly, the nucleic acid sequence according to one of the sequences with the current numbers 1 to 32 according to Table 1 (in conjunction with Fig. 1), preferably 1 to 7, in particular 1, 2, 4 or 6, or one of the sequences with the sequence numbers 48 to 51 or 43, 44 or 46 according to Table 1 (in conjunction with Fig. 1) or which corresponds with one of these Sequences hybridized under moderately stringent conditions.
  • Another object of the invention are also gene clusters which contain "open reading frames", preferably 54, which in their nucleic acid sequence are at least 95%, preferably 97%, in particular exactly, the nucleic acid sequences according to the sequences with the sequence numbers 1 to 54 (Table 1 in connection with Fig. 1) or hybridize with one of these sequences under moderately stringent conditions and which are arranged on one strand of nucleic acid or in any combination on one or the other strand, preferably according to Fig. 109.
  • the genes in an invention Gene clusters can contain 2, three, four, ..., 54 genes according to the invention, optionally in combination with the already known genes, in any strand distribution and sub-combination, in particular the sections between the ORFs can be any nucleotide sequence.
  • gene cluster is understood to mean a section of DNA on which several genes are located in close spatial proximity.
  • gene clusters according to the invention can be present in a vector, for example a BAC or YAC, a cosmid or plasmid.
  • Vectors which contain at least one sequence according to the invention are thus also the subject of the present invention.
  • Genes according to the invention can be combined in vectors according to the invention with further signal sequences or further genes, in particular further antibiotic resistance genes.
  • Protein and polypeptide sequences could be derived from the newly discovered sequences of the ORFs or genes. Accordingly, the invention further relates to a protein or polypeptide which has at least 95%, preferably 97%, in particular exactly, the amino acid sequence of the amino acid sequence according to one of the sequences with the current numbers 55-101 (Table 1 in conjunction with Fig. 1). equivalent.
  • the protein or polypeptide according to the invention is at least 95%, preferably 97%, in particular exactly, the nucleic acid sequence according to one of the sequences with the sequence numbers 55 to 86 or 97, 98 or 100 or 102 to 105 (Table 1 in conjunction with Fig. 1), preferably 55 to 61, in particular 55, 56, 58 or 60.
  • Another subject is accordingly also a protein or polypeptide which is encoded by a nucleic acid according to one of claims 12 or 13.
  • coding means that the codons (see above) of the corresponding nucleic acid section (gene or ORF) code for the corresponding amino acid sequence, that is to say after transcription and translation, a corresponding protein or polypeptide with this amino acid sequence is formed.
  • proteins according to the invention are enzymes or part of a multienzyme complex. Of course, they can also have other functions.
  • the avilamycin derivatives according to the invention are defined or are produced by a genetic engineering or biotechnological process
  • the newly discovered genes or proteins (enzymes) can be used in gene or biotechnological processes for the production of corresponding antibiotics
  • genetically modified cells almost inevitably have an important function.
  • Another subject of this invention is therefore genetically modified cells containing at least one non-endogenous nucleic acid according to the invention, a non-endogenous gene cluster according to the invention and / or a non-endogenous protein or polypeptide according to the invention.
  • a cell is a further subject of the invention, the at least one genetically modified nucleic acid, the sequence of which before the change is at least 95%, preferably 97%, in particular exactly, the nucleic acid sequence according to one of the Sequences with the running numbers 1 to 54 (Table 1 in connection with Fig.1) corresponded to or which hybridized with one of these sequences under moderately stringent conditions.
  • a particularly preferred object of the invention is a cell of the Streptomyces viridochromogenes type, preferably of the Tü57 subtype, in which at least one of the nucleic acids has been genetically modified or deleted with a sequence with one of the current numbers 1-54 (Table 1 in conjunction with Fig. 1) , It is particularly preferred if in the corresponding cell at least one of the nucleic acids with a sequence with sequence number 1 or 2-7 (Table 1 in conjunction with Fig. 1), preferably with one of the sequences with sequence number 1, 2, 4 or 6 (Table 1 in connection with Fig. 1), in particular with a sequence with consecutive No. 2 or with sequences with the consecutive No. 2 and No. 1, No. 2 and No. 4 or No. 2 and No. 6 ( according to Table 1 in connection with Fig. 1) has been genetically modified or deleted.
  • another object of the invention is the use of a nucleic acid according to the invention, a gene cluster according to the invention, a protein or polypeptide according to the invention and / or one of the cells according to the invention for producing an avilamycin derivative, preferably an avilamycin derivative according to the invention.
  • Another object of the invention is a process for the preparation of avilamycin derivatives according to the invention with the following steps:
  • Fig. 1 corresponds or one
  • the culturable cell is selected from a cell of the Streptomyces viridochromogenes type or a cell which, with the exception of the genetically modified, deleted or unexpressed nucleic acid, contains the nucleic acids according to serial numbers 1-54 according to Table 1 in conjunction.
  • the cell is selected from a cell of the type Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces lividans, Streptomyces albus or Streptomyces fradiae, in particular a cell of the type Streptomyces viridochromogenes Tu 57 or A 23575.
  • the changed nucleic acid (s) codes for a methyl transferase and / or for a halogenase. It is particularly preferred if the sequence (s) of the changed nucleic acid (s) before the change is at least 95%, preferably 97%, in particular exactly, the nucleic acid sequence (s) of at least one of the sequences with the current number 1 or 2-7 according to Table 1 in conjunction Fig. 1, preferably a sequence with the running numbers 1, 2, 4 or 6 (Table 1 in connection with Fig. 1), corresponds to / s, in particular the sequence with the running number 2 or the sequences with the running numbers 2 and No. 1, No. 2 and No. 4 or No. 2 and No. 6 (according to Table 1 in connection with Fig. 1).
  • the change in the nucleic acid (s), in particular methyl transferases and / or halogenases leads to the fact that the protein (s) or polypeptide (s) encoded by the genetically modified nucleic acid (s) / e is no longer synthesized after the genetic engineering change.
  • the avilamycin derivatives according to the invention are in principle toxicologically harmless, so that they are suitable as active pharmaceutical ingredients in pharmaceuticals.
  • the invention therefore furthermore relates to medicaments comprising at least one avilamycin derivative according to the invention, preferably at least two, in particular also mixtures of one or more avilamycin derivatives with at least one further antibiotic from the prior art, for example vancomycin, penicillin, streptomycin, neomycin , Kanamycin, Sisomycin, Amikacin and / or Tobramycin, as well as suitable additive and / or Excipients.
  • bacteriostatic or bactericidal substances can also be combined with substances according to the invention, for example cephalosporins, chloramphenicol, ethambutol, cephalosporins, isonicotinamides, tetracyclines, sulfonamides, oxalactams (for example flomoxef, clavulanic acid) and / or nitrofurans.
  • This also includes carrier materials, fillers, solvents, diluents, dyes and / or binders.
  • the pharmaceuticals can be administered as liquid dosage forms in the form of injection solutions, drops or juices, as semi-solid dosage forms in the form of granules, tablets, pellets, patches, capsules, plasters or aerosols.
  • the choice of excipients etc. and the amounts to be used depend on whether the medicinal product is orally, orally, parenterally, intravenously, intraperitoneally, intradermally, intramuscularly, intranasally, buccally, rectally or locally, for example on the skin, mucous membranes or in the eyes to be applied.
  • Preparations in the form of tablets, dragees, capsules, granules, drops, juices and syrups are suitable for oral administration, and solutions, suspensions, easily reconstitutable dry preparations and sprays are suitable for parenteral, topical and inhalative administration.
  • Formulations which can be used orally or percutaneously can release the avilamycin derivatives according to the invention with a delay and thus achieve a more uniform plasma level.
  • other active substances known to the person skilled in the art can be added to the medicaments according to the invention.
  • the amount of active ingredient to be administered to the patient varies depending on the weight of the patient, the type of application, the Indication and the severity of the disease. Usually 0.005 to 1000 mg / kg, preferably 0.05 to 5 mg / kg, of at least one avilamycin derivative according to the invention are applied.
  • the avilamycin derivatives according to the invention are of course in principle suitable for the treatment of diseases, in particular for the treatment of infectious diseases, or for the manufacture of a medicament for the treatment of such diseases.
  • Another object of the invention is accordingly the use of an avilamycin derivative according to the invention for the manufacture of a medicament with an antibiotic effect for the treatment of, for example, infectious diseases.
  • infectious diseases are understood to mean diseases which are based on an infection with a viral, a bacterial or a protozoological pathogen.
  • the present antibiotics according to the invention are therefore also suitable for the treatment of mycoses, in particular cutaneous and subcutaneous mycoses.
  • the avilamycin derivatives according to the invention are preferably used to combat bacterial infections.
  • the avilamycin derivatives according to the invention are preferably used to combat bacterial infections.
  • Streptococci, staphylococci in particular also for the treatment of infections with Staphylococcus aureus strains, rickettsiae,
  • tuberculosis pneumonia; Typhus; Paratyphoid; Syphilis; Gastritis; Gastroenteritis; Ruhr; Pest; enteritis; extraintestinal infections, peritonitis and appendicitis with E. coli and intestinal infections with EHEC, EPEC, ETEC or EIEC; Cholera, legionnaires' disease, whooping cough, brucellosis, Lyme disease, leptospirosis, typhus, trachoma, gonorrhea, meningitis, septicemia, leprosy etc.
  • Another object of the method is also the treatment of a person or animal who needs this treatment with an avilamycin derivative according to the invention, preferably in the case of infectious diseases, in particular with the participation of Staphylococcus aureus.
  • Figure 1 shows the sequence of the entire gene cluster with its 54 nucleic acid sequences of the ORFs from Streptomyces viridochromogenes Tu 57.
  • Figure 1 contains the short names of the corresponding nucleic acid sequences, these short names (without the prefix "Avi") being inserted at the lines that have the start codons of the 54 sequences, the AS encoded by the respective start codon is circled in.
  • the arrow drawn in at these points shows the reading direction (backwards or forwards) of the genes with the start codon as the starting point.
  • nucleotide sequences of the two complementary DNA strands as well as the (partly fictitious) AS sequences for both strands in all three reading frames, thus a total of 2 nucleotide sequences and the 6 protein sequences potentially resulting therefrom (one-letter code)
  • the three protein sequences of the upper nucleotide strand are shown above the associated nucleotide sequence, the three protein sequences of the lower complementary nucleotide sequence below the associated lower nucleotide strand.
  • the 54 protein sequences in the gene cluster shown by name in Fig. 1 result from Fig.
  • the AS sequence is read in the direction indicated by the arrows, i.e. in the following either forwards or backwards.
  • the sequence ends with the stop codon in the corresponding reading frame, with stop codons being marked by an “asterisk” symbol in the corresponding line.
  • nucleotide sequence belonging to the ASF of an ORF results from the corresponding triplet located above or below (for the upper strand).
  • the one-letter designation of the amino acid is arranged in such a way that it lies above or below the middle nucleotide of the codon coding for this AS.
  • the names of the 54 coding regions in the gene cluster are assigned sequential numbers, the sequential numbers 1 to 54 indicating the nucleotide sequences and the sequential numbers 55 to 108 corresponding to the associated AS sequences, specifically the nucleotide sequence with the serial number 1 for the AS with the serial number 55, the nucleotide sequence with serial number 2 for the AS with serial number 56 etc.
  • Figure 109 shows the relative arrangement of the ORFs found on the gene cluster.
  • Figure 110 shows a Southern blot with the mutant S. viridochromogenes GW4.
  • Figure 111 shows the mass spectrum of the products of mutant S. viridochromogenes GW4
  • Figure 112 shows the mass spectrum of the hydrolyzed products of mutant S. viridochromogenes GW4.
  • Bacterial strains Bacterial strains, plasmids and culture conditions.
  • Streptomyces viridochromogenes Tü57 was cultivated with 1% malt extract, 0.4% yeast extract, 0.4% glucose and 1 mM CaCl 2 , at a pH of 7.2 (HA medium) at 37 ° C. Streptomyces viridochromogenes Tü57 and all mutants in NL19 + - were used to produce avilamycin A
  • E. coli strains were cultured on Luria-Bertani (LB) agar or liquid medium containing the appropriate antibiotic.
  • the nucleotide sequencing was carried out with the dideoxy Chain termination method was carried out using an automatic laser fluorescence sequencer (Perkin Elmer ABI).
  • the sequencing reactions were carried out using a thermosequenase cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP (Amersham) and standard primers (M 13 universal and reverse, T3, T7).
  • the DNASIS software package version 2.1, 1995; Hitachi Software Engineering
  • a computer-aided sequence analysis and the database search with the BLAST 2.0 program were carried out on the server of the National Center for Biotechnology Information, Bethesda MD, USA.
  • the sequences presented are stored in the "GenBank” database under the access number ("Accession Number") AF333038.
  • aviG4 A unique / Vcol restriction site in the aviG4 gene (running No. 2, Fig. 1), which is located on the 1.9 fragment, which is ligated into the SacI and EcoR ⁇ interfaces of pBSK, was used for the targeted inactivation selected to move the reading frame.
  • the 1.9 kb fragment was digested with Sacl and Kpn ⁇ and was ligated into the gene inactivation plasmid pSP 1. After restriction digestion with ⁇ / col, treatment with the Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I and re-ligation, the intended change was confirmed by DNA sequencing.
  • the plasmid formed was named pMIKG4E3.
  • Streptomyces viridochromogenes Tü57 and the mutants GW-4 and GW4-AM1 were incubated for three days.
  • the cultures were filtered off and the filtrate was applied to a solid phase extraction cartridge (SepPakCi ⁇ , Waters).
  • the cartridge was eluted with a gradient between 10% and 100% methanol in water.
  • Avilamycin derivatives elute with the fraction containing 60-70% methanol. After extraction with ethyl acetate and removal of the solvent, the avilamycin derivatives were redissolved in methanol and by TLC on silica gel plates (silica gel 60 F254, Merck) with methylene chloride / methanol (9: 1, v / v) as solvent measured.
  • Avilamycin derivatives had been detected after treatment with anisaldehyde / H 2 S0 4 .
  • the avilamycin derivatives were on an HPLC system (HP 1110, Hewlett-Packard, Waldbronn) with an HP ODS Hypersil C ⁇ 8 column (2.1 by 100 mm; 5 ⁇ m) at a flow rate of 0.1 ml / min, detection run at 220 nm and the following gradient: 0-5 min from 0% to 20% B, 5.1-120 min to 90% B (solution A, H 2 O: MeOH 3: 2; solution B, MeOH).
  • Mass spectra were recorded on a Bruker Esquire-LC 1.6n mass spectrometer (Bruker Daltonik, Bremen) with an electrospray (ES) ion source (positive ion mode). The measuring width was between 200 - 1800 m / z.
  • gavibamycin derivatives which had been synthesized by the mutated cell Streptomyces viridochromogenes GW4, was carried out after etylation with GC-MS analysis.
  • the derivatives were dissolved in a mixture of DMSO and acetonitrile (3:40). After adding ethyl iodide and K 2 C0 3 , the reaction proceeded overnight. After the solvent had been stripped off, the derivatives were hydrolyzed with HCl / methanol at 115 ° C. for 15 min. After the solvent had been stripped off, the derivatives were extracted with diethyl ether and analyzed by GC-MS.
  • avilamycin resistance gene aviRb
  • av ⁇ ' Z2 deoxy sugar synthesis gene
  • AviM is responsible for the formation of orsellic acid during avilamycin biosynthesis.
  • AviN which is upstream from aviM, should code for an enzyme that controls the start signal for the synthesis of orsellic acid.
  • the biosynthesis of dichloroisoevernic acid (A in formula I) starting from orsellic acid requires methylation and di-halogenation. It was surprisingly found that AviG4, the DmpM, resembles an O-demethylpuromycin-O-methyltransferase from S.
  • 2-deoxy-D-evalose differs from D-olivose in a methyl group at the C3 position. It is believed that dNDP-4-keto-2,6-dideoxy-D-glucose is an important intermediate in the biosynthesis of this methylated deoxy sugar.
  • aviG2, aviG3, aviG5 and aviG6 four other methyltransferase genes were found in the cluster (aviG2, aviG3, aviG5 and aviG6). They have been identified as potential methyltransferase genes either by the fact that their product resembles methyltransferases from other organisms, or by the presence of motifs typically found in various methylating proteins.
  • Avilamycin derivatives which did not contain a methyl group at different positions in the molecule were produced from a cell line according to the invention. This indicates that the methylation takes place at a very late point in the biosynthesis.
  • AviG2, AviG3, AviG5 and AviG6 should methylate on the D-fucose residue (E), D-mannose residue (F) and on the methyl-eurekanate residue (H) of avilamycin A.
  • the plasmid pMIKG4E3 was constructed (see Example 1) in order to allow the wild-type gene to be replaced by a mutated allele. After protoplasts were formed and S. viridochromogenes was transformed with the plasmid pMIKG4E3, erythromycin-resistant colonies were obtained. The transformation effectiveness was approximately 10 colonies per ⁇ g of plasmid DNA. Several colonies were left without Erythromycin cultured on plates to select after loss of resistance. Different sensitive colonies were obtained, which indicates that it is a result of a "double cross-over". Two mutants, G4 / 24/20 and G4 / 24/30, were further investigated.
  • the plasmid pSP 1 S2Nar was developed to switch off the aw ' H gene (see Example 1).
  • S. viridochromogenes GW4 protoplasts were transformed with this plasmid. There were approximately 20 erythromycin-resistant colonies per ⁇ g DNA. Some of them were cultured to screen for erythromycin resistance loss (indicating a "double cross-over").
  • the mutant GW4-AM1 was selected for further experimentation.
  • a 1.34 kb PCR fragment that was generated using the Primer S2A and S2B obtained from H / 3/16 could not be cut by Narl while the PCR fragment from GW4 was digested by the enzyme, and a was used to detect the deletion in aviH Southern blot analysis performed.
  • Chromosomal DNA from H / 3/16 was cut with Na ⁇ and hybridized with a 3.7 kb probe containing the aviH gene. A 5.7 kb fragment was detected, whereas in the case of chromosomal DNA from GW4, the fragments were, as expected, 4.3 kb and 1.4 kb (not shown).
  • the major products of the GW4 mutant were isolated, ethylated by treatment with ethyl iodide and hydrolyzed using methanol and hydrochloric acid.
  • the reaction products were analyzed by GC-MS.
  • the mass spectrum of this sample showed several peaks (Fig. 112).
  • the peak by m / z 436 corresponds to the D-olivosyl ester of dichloro-di-O-ethyl-orsellinic acid and most of the other peaks (m / z 405, m / z 275, m / z 247) corresponded to fragments derived from orsellinic acid. Run out the rest (Fig. 112). This suggests that the difference between avilamycin A (C) and the new derivative, gavibamycin A1 (A3), results from a change in the structure of the orsellic acid residue.
  • C avilamycin A
  • A3 gavibamycin A1
  • Gavibamycin A1 and A3 correspond to the general formula I with the following meaning for the radicals R1-R9:
  • S. viridochromogenic GW4-AM1 was also analyzed by HPLC-MS.
  • the mass of the two major avilamycin derivatives was 1343 (M + Na) and 1345 (M + Na).
  • the isotope pattern of the main products of mutant GW4-AM1 showed no specific signals for chloride ions (Fig. 111), which indicates that the inactivation of aviH leads to the loss of both chloride atoms .
  • the new derivatives were named Gavibamycin B 1 (avilamycin A analog) and Gavibamycin B3 (avilamycin C analog).
  • Gavibamycin B1 and B3 correspond to the general formula I with the following meaning for the radicals R1-R9:
  • the antimicrobial spectrum of Gavibamycin A3 was determined and compared with that of Avilamycin A.
  • the "broth microdilution" method was used in accordance with the regulations of the national committee for clinical laboratory standards. Both metabolites showed antibiotic activity against Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus ATCC6538, Staphylococcus aureus ATCC6538P, Staphylococcus aureus ATCC29213.2, Staphylococcus aureus. 1, Enterococcus faecalis ATCC29212, Enterococcus faecalis H-7-6 and Streptococcus pneumoniae ATCC49619.
  • Gavibamycin A3 is somewhat more active against various Staphylococcus aureus strains than Avilamycin A and it also appears to be much more hydrophilic than can be seen from the Rf values.
  • the non-chlorinated gavibamycin derivatives were also antibiotic active.
  • the procedure was completely analogous to that in Examples 4 to 6, in particular 5, so that in the case of GW2, a double mutant, in addition to aviG4 (see Example 4), aviG2 was also genetically modified (switched off).
  • mutant GW5 also a double mutant
  • aviG4 was also genetically modified (switched off) in addition to aviG4. From the products according to the invention of these mutants GW2 and GW5 it can be seen that the corresponding methyltransferases (aviG2 or aviG ⁇ and in each case aviG4) have been switched off.
  • Example 11 For an average patient of approx. 65 kg body weight, 0.5 ml, for example, 2.5 mg or 40 ⁇ g / kg are applied. The dose administered showed no contraindication and proved to be well tolerated by the patients. A dose of Gavibamycin A3 up to 20 times higher was also found to be toxicologically safe and well tolerated.
  • Example 11 For an average patient of approx. 65 kg body weight, 0.5 ml, for example, 2.5 mg or 40 ⁇ g / kg are applied. The dose administered showed no contraindication and proved to be well tolerated by the patients. A dose of Gavibamycin A3 up to 20 times higher was also found to be toxicologically safe and well tolerated. Example 11
  • avi gene set has several features which suggest a model of a biosynthetic pathway to complex oligosaccharide antibiotics according to the invention.
  • the function of the genes responsible for sugar biosynthesis can be derived from their amino acid sequences, which are similar to those proteins which are involved in the biosynthesis of D-olivose in other organisms.
  • AviEl is a dTDP-glucose-4,6-dehydratase and AviE3 is a GDP-mannose-4,6-dehydratase, indicating that the biosynthesis of some of these different sugar units starts from different nucleotide-bound hexose pools.
  • avilamycin A Based on the structure of avilamycin A and also indicated by the supposed function of some gene products, the biosynthesis of D-lyxose even starts from a third sugar pool, so that it could be a product of the pentose-phosphate metabolic pathway.
  • Residue H of avilamycin A was originally described as methylurekanate derived from 2,3-di-O-methylene-4, ⁇ -dihydroxyhexanoic acid.
  • methyl urecanate is also the product of a biosynthetic sugar metabolism pathway. All of this, based on the number of sugar units, suggests that the avilamycin cluster is six Has glycosyltransferase genes. However, only four have been found in the avilamycin cluster according to the invention. A possible explanation could be the involvement of one or more glycosyltransferases in several synthetic steps or the involvement of glycosyltransferases that are encoded in regions outside of this gene cluster.
  • glycosyltransferases Three out of four glycosyltransferases are more pronounced of glycosyltransferases for the biosynthesis of O-antigen structures or cell wall polysaccharides, which can be explained by the polysaccharide-like structure of avilamycins.
  • the avi metabolic pathway also contains other interesting features: two orthoester bridges and one methylene bridge. Taking into account the oxidative nature of these COC arrangements, the - ketoglutarate-dependent oxygases AviO1, AviO2 and AviO3 should catalyze the formation of this rare bond. It is therefore described according to the invention that such enzymes use molecular oxygen as a direct electron acceptor for the oxidation through the use of ⁇ -ketoglutarate as cosubstrate and thereby ultimately produce the CO-C bonds, succinate and CO 2 .
  • Avilamycin A heptasaccharide is modified by methylation, by coupling of acetate, by coupling of dichloroisoevernic acid and by coupling from an isobutyrylic unit.
  • Six methyltransferase genes are present in the cluster, which is sufficient in number for avilamycin biosynthesis, while the genes responsible for the coupling of the other residues have not yet been localized.
  • aviB1 and aviB2 encode enzymes which are similar to the alpha and beta chains of component 1 of the 2-oxo acid dehydrogenase complexes. These complexes are usually composed of 3 enzymatic units, namely the TPP-dependent dyhydrogenases (heterotetramers (0 ⁇ 2), Dihydrolipoamide acetyltransferases (homomultimers) and
  • Dihydrolipoamide dehydrogenases (homodimers).
  • the ORFs coding for the latter components of these complexes have either not yet been localized within the cluster, are not in the cluster or are not used at all for the biosynthesis of avilamycins.
  • Gavibamycin A3 was also tested for its antibiotic activity. The first MIC experiments showed that Gavibamycin A3 is somewhat more active than Avilamycin A against various Staphylococcus aureus strains. In addition, it is somewhat more hydrophilic than avilamycin A, as demonstrated by the retention factors from the DC and HPLC analysis. The non-chlorinated gavibamycin derivatives are also antibiotic active.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Avilamycin-Derivate, gentechnologische biosynthetische Verfahren zu deren Herstellung, Arzneimittel enthaltend diese Verbindungen, sowie die Verwendung dieser Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels gegen Infektionskrankheiten wie auch Nucleinsäuren, Proteine und Gencluster und entsprechende Zellen, die mit der Herstellung dieser Avilamycin-Derivate verbunden sind.

Description

Avilamycin-Derivate
Die Erfindung betrifft Avilamycin-Derivate (im folgenden auch als Gavibamycine bezeichnet), gentechnologische biosynthetische Verfahren zu deren Herstellung, Arzneimittel enthaltend diese Verbindungen, sowie die Verwendung dieser Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels, bspw. gegen Infektionskrankheiten, wie auch Nukleinsäuren, Proteine und Gencluster und entsprechende Zellen, die mit der Herstellung dieser Avilamycin-Derivate verbunden sind.
Das Aufkommen pathogener, gegen Antibiotika multiresistenter Bakterien stellt eine wachsende Bedrohung der menschlichen Gesundheit dar und hat die Suche nach neuen Wirkstoffen verstärkt. Immer weniger neue Wirkstoffe sind in den letzten zwei Jahrzehnten bei zielspezifischen Wirkstoff-Screenings angefallen, so daß Forscher begonnen haben, neben der Suche nach neuen antibiotischen Wirkstoffen auch neue Technologien zur Herstellung neuer Verbindungen zu nutzen. Eine vielversprechende neue Technologie wird als kombinatorische Biosynthese bezeichnet und benutzt biosynthetische Gene als Mittel zur Herstellung neuer Wirkstoffe.
Eine unter anderem in diesem Kontext interessante Verbindungsklasse sind die Orthosomycine. Sie sind eine bekannte Klasse von Antibiotika, die von verschiedenen Actinomyceten hergestellt werden. Mitglieder dieser Klasse wirken auf eine breite Palette gram-positiver pathogener Bakterien, inklusive glycopeptid-resistenter Enterococcen, methicillin- resistenter Staphylococcen und penicillin-resistenter Streptococcen.
Prominente Beispiele an Orthosomycinen sind Avilamycine und Evemimycine, die von Streptomyces viridochromogenes Tü57 bzw. Micromonospora carbonacea hergestellt werden. Diese Antibiotika bestehen aus einer Heptasaccharid-Seitenkette und einer vom Polyketid (Acetateinheiten) abgeleiteten Dichloroisoevernin-Säure als Agiykon, wobei die Zucker-Reste zum Teil über Orthoesterbindungen miteinander verknüpft sind. Diese Bindung gibt der ganzen Klasse von Orthosomycinen den Namen. Der genaue Wirkmechanismus der Orthosomycine ist unbekannt. Während für ein bestimmtes Orthosomycin (Ziracin) ein Zellmembraneffekt diskutiert wurde (Walker, 1976; Langer, 1987) wird in neueren Publikationen eine Wechselwirkung mit dem ribosomalen Protein L16 angeführt (Foster und Rybak, 1999). Für ein anderes Orthosomycin, Avilamycin A, wird eine Hemmung der Proteinbiosynthese angenommen und eine Inhibition des Translations- Initiationskomplexes vorgeschlagen (Wolf, 1973).
Die bekannten Avilamycine wurden 1959 aus Kulturfiltraten von
Streptomyces viridochromogenes Tü57 isoliert (Buzzetti, et al., 1968;
Mertz et al., 1986). Wie oben bereits angedeutet ist Avilamycin A, eine der Hauptkomponenten, aus Zuckern aufgebaut. Einzelkomponenten sind D- Olivose, 2-Desoxy-D-Evalose, 4-0-Methyl-D-fucose, 2,6-Di-O-Methyl-D- mannose, L-Lyxose und Methyl-Eurekanat. In Studien wies Avilamycin A ausgezeichnete Aktivität gegen multiresistente Staphylococcus aureus - Stämme auf (Zähner, 1999). Neben den Orthoestern soll der terminale Dichloroisoeverninsäure-Rest für die Wirksamkeit essentiell sein (Wright, 1979). Die DE 1116864 beschreibt wie die US 3,131,126 die Stoffklasse der Avilamycine inclusive eines allgemeinen Hinweises auf Derivate sowie Herstellung und Wirkung von Avilamycinen.
Ebenfalls zur Gruppe der Orthosomycine gehört Ziracin. Ziracin (SCH27899) ist ein Evernimycin und wurde bereits klinisch getestet.
Figure imgf000004_0001
Avilamycin A Ziracin
Sowohl beim Avilamycin A als auch beim Ziracin hat sich in der Praxis allerdings gezeigt, daß der therapeutische Einsatz durch die zu geringe Hydrophilie beschränkt zu sein scheint.
Gerade für die Klasse der Orthosomycine und insbesondere für die Avilamycine dürfte molekulares Klonieren und Charakterisieren der die Biosynthese von Avilamycin A bestimmenden Enzyme von großem Interesse sein, da diese Information die Richtung für die Entwicklung neuer (antimikrobieller) Antibiotika vorgeben könnte. Die Gene sind ein interessantes System, um die Bildung und Verknüpfung ungewöhnlicher Desoxyzucker zu studieren und damit unter Umständen für eine kombinatorische Biosynthese von großem Wert.
Vorherige Arbeit am biosynthetischen Gencluster von Avilamycinen führte zur Entschlüsselung der Sequenz eines NDP-Glucose-Synthase-Gens (aviD [laufende Nr. 53 gemäß Tabelle 1]), eines NDP-Glucose-4,6- Dehydratase-Gens (aviE1 [laufende Nr. 54 gemäß Tabelle 1]) und eines Polyketid-Synthase-Gens (aviM (laufende Nr. 52 gemäß Tabelle 1]). Diese haben vermutlich eine Funktion als Teil einer iterativen Typ I Polyketid- Synthase zur Bildung von Orsellinsäure, einem Zwischenprodukt in der Biosynthese von Dichloroisoeverninsäure. Die Expression von aviM in S. lividans führte zur Bildung von Orsellinsäure [Gaisser, S., Trefzer, A., Stockert, S., Kirschning, A., & Bechthold, A. (1997), J Bacteriol. 179, 6271-6278].
Neben dem Auffinden und Identifizieren geeigneter Enzymsysteme und Synthesewege war es daher Aufgabe der Erfindung, neue Antibiotika zur Verfügung zu stellen, insbesondere auch solche, die eine verbesserte Hydrophilie aufweisen.
Überraschenderweise stellte sich heraus, daß bestimmte, im Stand der Technik nicht vorbeschriebene Avilamycin-Derivate (erfindungsgemäß auch als Gavibamycine bezeichnet) - insbesondere mit einem in entscheidenden Bereichen gegenüber dem Avilamycin A veränderten Substitutionsmuster - diese Aufgabe lösen können und sowohl antibiotische Wirkung als auch verbesserte Hydrophilie zeigen. Ein Gegenstand der Erfindung ist daher ein Avilamycin-Derivat gemäß allgemeiner Formel I, auch in Form seiner Diastereomere oder Enantiomere bzw. razemischer oder anderer Gemische oder reiner Diastereomere und/oder Enantiomere,
Figure imgf000006_0001
, worin unabhängig voneinander mit unten folgender Ausnahme
R1 ausgewählt ist aus H, COCH l COC4H9, COCH(CH3)2 oder
Figure imgf000006_0002
R2 ausgewählt ist aus H, CHO, COCH3 oder CH(OH)CH3,
R3 OCH3 entspricht,
R4 Cl entspricht, R5 Cl entspricht,
R6 CH3 entspricht,
R7 H, CH3 oder CH2OH entspricht,
R8 CH3 entspricht
und
R9 CH3 entspricht,
worin in Bezug auf mindestens einen der Reste R3-R6, R8 oder R9 in Formel I abweichend von der voranstehenden Definition folgendes gilt:
R3 ist durch OH zu ersetzen,
R4 ist durch H zu ersetzen,
R5 ist durch H zu ersetzen,
R6 ist durch H zu ersetzen,
R8 ist durch H zu ersetzen
und/oder
R9 ist durch H zu ersetzen, mit der Maßgabe, daß R1-R9 nicht gleichzeitig die Bedeutungen gemäß der jeweiligen Kombination in einer der Verbindungen 1 - 4 annehmen können:
Figure imgf000008_0001
Dabei ist unter dem Ausdruck „mit unten folgender Ausnahme" zu verstehen, daß es Ausnahmen von den diesem Ausdruck unmittelbar folgenden generellen Definitionen der Reste R1-R9 gibt, die mit der Phrase „worin in Bezug auf mindestens einen der Reste R3-R6, R8 oder R9 in Formel I abweichend von der voranstehenden Definition folgendes gilt" eingeleitet werden.
Die erfindungsgemäßen Avilamycin-Derivate zeichnen sich insgesamt neben ihrer überraschend starken antibiotischen Aktivität insbesondere gegen Staphylococcus aureus, insbesondere auch durch eine gegenüber den bekannten Orthosomycinen wie Avilamycin A oder C sowie
Evernimycin (=Everninomycin, =Evernimicin) deutlich verbesserten
Hydrophilie aus. Gerade diese erhöhte Hydrophilie macht diese Verbindungen aber zu attraktiven, insbesondere antibiotischen
Wirkstoffen, da eine erhöhte Hydrophilie in bestimmten therapeutischen
Anwendungen sehr erwünscht ist. Außerdem gilt für dieses wie für alle - auch folgend beschriebenen - erfindungsgemäßen Avilamycin-Derivate, daß es eine Struktur aufweist, die sich einer klassischen organischen Synthese nur mit großer Mühe erschließt. Der hier zugrundeliegende
Einsatz einer gentechnologischen Biosynthese zur Herstellung der erfindungsgemäßen Avilamycin-Derivate erschließt damit veränderte, neue und bisher nicht zugängliche Wirkstoffe, insbesondere Antibiotika.
Bevorzugt ist im Rahmen dieser Erfindung ein erfindungsgemäßes Avilamycin-Derivat, in dem mindestens R3 durch OH zu ersetzen ist, mit der Maßgabe, daß R1-R9 nicht gleichzeitig die Bedeutungen gemäß der Kombination in der Verbindung 1 annehmen können:
Figure imgf000009_0001
Ebenfalls bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Avilamycin-Derivat, in dem mindestens R4 und R5 in Formel I durch H zu ersetzen sind.
Ebenfalls bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Avilamycin-Derivat, in dem mindestens R6, R8 und/oder R9 durch H zu ersetzen ist/sind, mit der Maßgabe, daß R1-R9 nicht gleichzeitig die Bedeutungen gemäß der Kombination in der Verbindung 3 oder nicht gleichzeitig die Bedeutungen gemäß der Kombination in der Verbindung 4 annehmen können:
Figure imgf000009_0002
Besonders bevorzugt ist es weiter, diese Merkmale zu kombinieren, was zu einem erfindungsgemäßen Avilamycin-Derivat führt, in dem zum einen mindestens R3 durch OH zu ersetzen ist und zum anderen mindestens R4 und R5 durch H zu ersetzen sind oder mindestens R6, R8 und/oder R9 durch H zu ersetzen ist/sind.
Ein besonders bevorzugter Gegenstand der Erfindung, der die Aufgabe in besonders günstiger Weise löst, ist dabei ein Avilamycin-Derivat gemäß allgemeiner Formel I, das ausgewählt ist aus Verbindungen, in denen R1- R9 jeweils die in folgender Tabelle angegebene Bedeutung haben, wie folgt kombiniert sind:
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, vorzugsweise
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Die Aufgabe wird auch durch Avilamycin-Derivate gelöst, die durch ein besonderes Verfahren, das gentechnologische Manipulationen und Biosynthese beinhaltet, herstellbar ist. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Avilamycin-Derivat, das dadurch erhältlich ist, daß in einer kultivierbaren Zelle, die die nötigen Gene bzw. Enzyme zur Synthese eines Orthosomycin-Grundkörpers bestehend aus (a) einem endständigen Dichloroisoeverninsäure-Rest (A in Formel I) und
(b) einem damit veresterten, über normale Esterbindung und Orthoesterbindungen verknüpften Heptasaccharid (B bis H in Formel I) aus:
(i) zwei D-Olivose-Resten (B und C) (ii) einem 2-Desoxy-D-Evalose-Rest (D), (iii) einem D-Fucose-Rest (E), (iv) einem D-Mannose-Rest (F), (v) einem L-Lyxose-Rest (G) und (vi) einem (Methyl-)Eurekanat Rest (H)
aufweist, mindestens eine Nukleinsäure, deren Sequenz zu mindestens 95%, vorzugsweise 97%, insbesondere genau, der Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Abbildungen 1 bis 54 entspricht, gentechnologisch verändert, deletiert und/oder nicht exprimiert wird, die so modifizierte Zelle kultiviert wird, der Kulturüberstand gewonnen und aufgearbeitet wird, das oder die Avilamycin-Derivat/e aufgereinigt und isoliert wird/werden und gegebenenfalls verschiedene Derivate getrennt werden,
mit der Maßgabe, daß R1-R9 nicht gleichzeitig die Bedeutungen gemäß der jeweiligen Kombination in einer der Verbindungen 1 - 16 annehmen können:
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Dabei versteht man im Sinne der Erfindung darunter, daß „die Zelle die nötigen Gene bzw. Enzyme zur Synthese eines Orthosomvcin- Grundkörpers aufweist", daß in der Zelle die für die notwendigen Enzyme kodierenden Gene und/oder die funktionsfähigen Enzyme selbst vorhanden sind, die für die Synthese eines „Orthosomycin-Grundkörpers" aus den üblicherweise vorhandenen Vorstufen nötig sind. Beispiele wären das erfindungsgemäße Gencluster gemäß Abb. 109 oder die „Open Reading Frames" (ORF) bzw. Gene gemäß laufender Nummer 1-54 gemäß Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1 bzw. die zugehörigen Enzyme bzw. Proteine gemäß laufender Nummer 55-108 gemäß Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1.
Die Definition des „Orthosomycin-Grundkörpers" ist bereits angegeben, wobei die Anordnung der Ortho- und der normalen Esterbindung der Formel I zu entnehmen ist. Einen solchen Grundkörper weisen unter anderem Avilamycine und Evernimycine sowie erfindungsgemäße Avilamycin-Derivate auf (s. Formel I).
Weiter versteht man im Sinne dieser Erfindung unter Gen einen Abschnitt der DNA, von dem ein einzelnes mRNA-Molekül (das dann in ein einzelnes Polypeptid oder Protein translatiert wird) oder ein funktionelles RNA-Molekül (rRNA, tRNA) transkribiert wird. Im Sinne dieser Erfindung versteht man weiter unter „Open Reading Frame" (ORF) einen DNA-Abschnitt, der mit einem Start-Codon beginnt, mit einem End-Codon endet und eine ununterbrochene Folge von Codons für Aminosäuren enthält. Der Begriff „Open Reading Frame" (ORF) wird hier zur Beschreibung eines Monierten und sequenzierten DNA-Abschnitts verwendet, der einem Gen entspricht.
Unter Codon versteht man die kodierende genetische Grundeinheit. Sie besteht aus einem Triplett von drei konsekutiven Nukleotiden, die entweder für eine Aminosäure oder den Beginn oder das Ende einer Polypeptidkette kodieren.
Weiter sind im Sinne dieser Erfindung unter kultivierbaren Zellen Zellen zu verstehen, die in-vitro in festem oder flüssigem Medium ernährt durch eine flüssige oder verfestigte Nährlösung, dem Kulturmedium, wachsen und sich vermehren. Im engeren Sinne sind dies insbesondere Zellen von
Mikroorganismen oder leicht transfizierbare Zellen, in denen entsprechende Gene zur Expression gebracht werden können. Es können dies beispielsweise grampositive und gramnegative Bakterienzellen, wie z.B. Streptomyces-Zellen (z.B. Streptomyces viridochromogenes Tu 57), aber eben auch Systeme wie Säugetierzellen, z.B. CHO-Zellen (Chinese
Hamster Ovary), oder immortalisierte Zellinien, z.B. HeLa- oder HEK-
Zellen, aber auch Insekten-, Fisch-, Amphibien-, Pilze- oder Hefezellen etc. sein.
Unter einer Nukleinsäure versteht man im Sinne dieser Erfindung die Grundeinheit von DNA und RNA und damit insbesondere auch die Grundeinheit eines Gens und eines ORF. Entsprechend kann eine Nukleinsäure ein Gen bzw. einen ORF umfassen und eine bestimmte Nukleinsäuresequenz (die Abfolge der Basen auf dem Phosphat-Zucker- Rückgrat einer Nukleinsäure) entsprechend ein Gen bzw. einen ORF definieren. Unter Nukleinsäure werden auch Sequenzen verstanden, die neben den kodierenden Bereichen auch weitere Sequenzbereiche, insbesondere am 5'- oder am 3'-Ende des kodierenden Bereichs, enthalten. Diese Sequenzen können funktionslos sein oder aber Promotor- oder Enhancer-Signale, bevorzugt bakterielle bzw. dem zur Expression herangezogenen Wirtszellsystem entsprechende Signale, sein. Ganz besonders bevorzugt sind neben den für die erfindungsgemäßen Proteine kodierenden Sequenzbereichen solche Nukleotidsequenzen, die für sog. „Tags" codieren (bspw. His- oder Flag- Tag), so daß die in den Wirtszellen exprimierten erfindungsgemäßen Proteine bspw. über Affinitätschromatographie ohne weiteres gereinigt werden können. An erfindungsgemäße kodierende Nukleotidsequenzen können damit beliebige Sequenzen vorzugsweise am 5' oder 3'-Ende angehängt werden, die für AS-Sequenzen codieren, die einen Tag (bspw. ein Antigen) zur Bindung an einen Antikörper bspw. auf einer Säule enthalten. Mitoffenbart sind damit auch die AS-Sequenzen, die sich aus der Kombination von kodierenden erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit anderen Nukleotidsequenzen ergeben.
Unter gentechnologisch ist im Sinne der Erfindung der Einsatz verschiedener Techniken zu verstehen, mit der DNA in eine Wirtszelle eingebracht wird bzw. DNA einer Zelle spezifisch verändert wird. Darunter fällt z.B. der Einsatz von Klonierungstechniken, Vektoren, Restriktionsenzymen etc..
Entsprechend heißt gentechnologisch verändert, daß ein Eingriff die Basenfolge, die Sequenz, der Nukleinsäure verändert hat, insbesondere die Basensequenz verkürzt (bis hin zur Deletion) oder Mutationen eingebaut wurden, meist mit der Folge, daß die Nukleinsäure (das Gen) nicht oder nur noch verändert in eine mRNA transkribiert werden kann. Deletiert heißt in diesem Falle, daß eine Nukleinsäure, die hier meist ein Gen oder einen ORF umfaßt, ganz oder zumindest weitgehend aus der DNA entfernt wird, so daß die Nukleinsäure (das Gen) nicht oder nur noch verändert in eine mRNA transkribiert werden kann. Nicht exprimiert bedeutet entsprechend, daß die Nukleinsäure so verändert wurde, daß die Nukleinsäure (das Gen) nicht oder nur noch verändert in eine mRNA transkribiert werden kann und entsprechend nicht mehr durch Translation das Polypeptid bzw. Protein entsteht, für das die Nukleinsäure (das Gen oder der ORF) ursprünglich kodiert hat.
Unter mäßig stringenten Hybridisierungsbedingungen werden je nach der verwendeten Nukleinsäure-Sequenz (Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz) bzw. je nachdem, welche Nukleinsäureart (DNA oder RNA) für die Hybridisierung verwendet werden, variierende Standardbedingungen verstanden. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA:DNA-Hybride ca. 10 °C niedriger als die von DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge. Unter Standardbedingungen sind beispielsweise, je nach Nukleinsäure, Temperaturen zwischen 42 und 58 °C in einer wäßrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 x SSC (1 X SSC = 0,15 M NaCI, 15 mM Natriumeitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50% Formamid, wie beispielsweise 42 °C in 5 x SSC, 50% Formamid, zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 20 °C bis 45 °C, bevorzugt zwischen etwa 30 °C bis 45 °C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridisierungsbedingungen vorteilhaft bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 30 °C bis 55 °C, bevorzugt zwischen etwa 45 °C bis 55 °C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50 % in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik, wie beispielsweise bei Sambrook et al. ("Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989), beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln, beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C-Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausübel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Harnes and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
Unter Kultivierung ist im Sinne dieser Erfindung die in-vitro Zucht von kultivierbaren Zellen zu verstehen, wodurch diese in festem oder flüssigem Medium ernährt durch eine flüssige oder verfestigte Nährlösung, dem Kulturmedium, wachsen und sich vermehren.
Dabei versteht man unter Kulturüberstand das flüssige Kulturmedium, das neben den Nährstoffen für die kultivierbaren Zellen auch die von diesen nach außen ins Medium abgegebenen Metaboliten und Substanzen (z.B. Avilamycin-Derivate) enthält. Dieser Kulturüberstand kann gewonnen und aufgearbeitet werden, wobei darunter insbesondere das Absaugen des Überstandes und/oder eine Filtration zu verstehen ist, mit der die aus der Kultivierung und den Zellen übriggebliebenen Feststoffe abgetrennt werden.
Der Kulturüberstand, der im Rahmen dieser Erfindung meist erfindungsgemäße Avilamycin-Derivate enthält, kann nach der Aufarbeitung aufgereinigt werden, wobei darunter beispielsweise eine chromatographische Trennung und/oder Trennung über Flüssigphasen bzw. eine Kombination dieser Vorgehensweisen zu verstehen ist. Beispiele dafür sind eine Festphasen-Extraktion mit einem Methanol-inWasser-Gradienten oder eine Ethyl-Acetat-Extraktion. Dabei wird die die Avilamycin-Derivate enthaltende Fraktion möglichst weitgehend von anderen, andere Bestandteile des Kulturüberstands enthaltenden Fraktionen getrennt und damit die Avilamycin-Derivate weitgehend isoliert. Als alternative Trenn- und/oder Reinigungsverfahren kommen jedoch auch die Methode des Aussalzens oder Um- oder Auskristallisierens in Betracht. Gegebenenfalls kann sich dann eine Isolierung und Trennung der einzelnen Derivate anschliessen, wobei hier insbesondere Chromatographiemethoden eingesetzt werden. Ganz besonders bevorzugt sind dabei präparative HPLC-Methoden oder auch affinitätschromatographische Verfahren.
Es ist bevorzugt, wenn beim Herstellungsverfahren, über das das erfindungsgemäße Avilamycin-Derivat definiert wird, die kultivierbare Zelle ausgewählt ist aus einer Zelle vom Typ Streptomyces viridochromogenes oder einer Zelle, die mit Ausnahme der gentechnologisch veränderten, deletierten oder nicht exprimierten Nukleinsäure/n die Nukleinsäuren gemäß laufender Nr. 1-54 gemäß Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1 bzw. dazu zu mindestens 95%, vorzugsweise 97 %, homologe Nukleinsäuren enthält oder aber mit einer dieser Sequenzen unter mäßig stringenten Bedingungen hybridisiert oder das Gencluster gemäß Abb. 109 enthält. Unter dem zweiten Punkt der Auswahl sind insbesondere Zellen zu verstehen, in denen durch gentechnologische Methoden die für die Avilamycin-Derivat-Synthese notwendigen Enzyme exprimiert werden, wobei eine der für ein in den Streptomyces viridochromogenes Tu 57 endogen vorkommenden Enzym-kodierenden Nukleinsäuren gentechnologisch verändert oder deletiert ist bzw. nicht exprimiert wird, insbesondere die Nukleinsäure/DNA gar nicht erst gentechnologisch in die Wirtszelle eingebracht wird. Besonders bevorzugt ist es aber, wenn die Zelle ausgewählt ist aus einer Zelle vom Typ Streptomyces viridochromogenes, insbesondere einer Zelle vom Typ Streptomyces viridochromogenes Tu 57 bzw. A 23575.
In jedem Falle ist es bevorzugt, wenn bei dem Verfahren die veränderte/n (z.B. deletierte/n bzw. nicht in die Wirtszelle eingebrachte/n) Nukleinsäure/n für eine Methyltransferase und/oder für eine Halogenase kodierte/n.
Alternativ kann die Herstellung auch außerhalb eines in-vivo-Verfahrens als in-vitro-Synthese erfolgen. Hierbei werden die für die Synthese erforderlichen Enzyme und/oder Enzymsysteme in mindestens einem Versuchsansatz vorgegeben, wobei vorzugsweise in mehreren hintereinander geschalteten Versuchsansätzen die für die Synthese erforderlichen Reaktionsschritte katalytisch von den erforderlichen und erfindungsgemäßen Enzymen durchgeführt werden. Ggf. können zwischen die in entsprechend geeigneter Reihenfolge durchgeführten Einzelreaktionen Trenn- und/oder Reinigungsschritte zur Aufreinigung der jeweils erwünschten Zwischenprodukte eingefügt werden.
Dabei versteht man unter Methyltransferasen Enzyme, die eine Methylgruppe auf ein organisches Molekül übertragen können. Insbesondere sind dies im Sinne der Erfindung Enzyme, die entweder auf die Orsellinsäure oder auf die Zucker, vorzugsweisde nach Bildung des Heptasaccharids, eine Methylgruppe übertragen, insbesondere die ORF's aviG2, avι'G3, aviG5, aviG6, aviG1, aviG4, aviRa und aviRb, insbesondere aviG4.
Unter Halogenasen versteht man Enzyme, die enzymatisch Halogene auf organische Moleküle übertragen können. Insbesondere sind dies im Sinne der Erfindung Enzyme, die auf die Orsellinsäure ein, vorzugsweise zwei Cl-Reste an den Positionen R4 und/oder R5 übertragen, insbesondere der ORF aviH.
Entsprechend ist es ein besonders bevorzugter Gegenstand der Erfindung, wenn in Bezug auf das oben genannte Herstellungsverfahren die Sequenz en der veränderte/n Nukleinsäure/n vor der Veränderung zu mindestens 95%, vorzugsweise 97%, insbesondere genau, der/den Nukleinsäuresequenz/en mindestens einer der Sequenzen gemäß laufender Nr. 1 oder 2-7 gemäß Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1, vorzugsweise einer der Sequenzen mit laufender Nr. 1 , 2, 4 oder 6 (Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1) entspricht en, insbesondere der Sequenz mit laufender Nr. 2 oder den Sequenzen mit den laufenden Nr. 2 und Nr. 1, Nr. 2 und Nr. 4 oder Nr. 2 und Nr. 6 (gemäß Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1) entspricht oder aber mit einer dieser Sequenzen unter mäßig stringenten Bedingungen hybridisiert.
Dabei bedeutet „vor der Veränderung" im Sinne dieser Erfindung, daß die veränderte Nukleinsäure vor der gentechnologischen Manipulation an ihr, d.h. vor der Deletion oder der Veränderung, insbesondere Verkürzung oder Mutation in der Basensequenz, aber auch vor dem Schritt, diese Nukleinsäure/DNA gar nicht erst gentechnologisch in die Wirtszelle einzubringen, die genannte Nukleinsäuresequenz aufweist.
Weiter ist es bevorzugt, wenn in dem die Avilamycin-Derivate definierenden Herstellungsverfahren die Veränderung der Nukleinsäure/n dazu führt, daß das oder die durch die gentechnolgisch veränderte/n Nukleinsäure/n kodierte/n Protein/e oder Polypeptid/e nach der gentechnologischen Veränderung nicht mehr synthetisiert wird/werden.
Dabei versteht man unter Polypeptid ein Peptid mit zwischen 10 < und < 100 Aminosäureresten und unter einem Protein ein Makromolekül mit mehr als 100 über Peptidbindungen verknüpften Aminosäureresten. Dabei sind die Proteine im Zusammenhang mit dieser Erfindung vorzugsweise Enzyme. Es fallen aber natürlich auch andere Proteine im Sinne dieser Erfindung unter diesen Begriff.
Die bisher beschriebenen erfindungsgemäßen Avilamycin-Derivate haben überwiegend bzw. alle gegenüber im Stand der Technik beschriebenen verwandten Orthosomycine, insbesondere gegenüber Avilamycin A, den Vorteil, hydrophiler zu sein, was therapeutisch erhebliche Vorteile bietet. Das gilt insbesondere für einen Vergleich mit dem Avilamycin A oder C bzw. auch mit dem Evernimycin Ziracin.
Eine Aufgabe der Erfindung war es auch - neben der Bereitstellung neuer Antibiotika - die Biosynthese des Avilamycins A aufzuklären, um darauf basierend neue antimikrobielle Substanzen bzw. neue Verfahren zu deren Herstellung zu entwickeln. Ein Kernpunkt war dabei die molekulare Klonierung und die Charakterisierung der an der Avilamycin-Biosynthese beteiligten Gene. Es wurde ein ca. 60 kB großes Stück um die bekannten Gene aviD, aviEl und aviM sequenziert. Dabei stellte sich heraus, daß die beteiligten Gene in unmittelbarer Nähe voneinander in einem Cluster angeordnet waren. Die Sequenz der einzelnen ORF's sowie deren Anordnung auf dem zentralen Gencluster (laufenden Nr. 1 bis 54) sind in Abb. 1 in Verbindung mit Tabelle 1, respektive Abb. 109, dargestellt. Wie bereits ausgeführt waren die Sequenz eines NDP-Glucose-Synthase- Gens (aviD [laufende Nr. 53 gemäß Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1]), eines NDP- Glucose-4,6-Dehydratase-Gens (aviEl [laufende Nr. 54 gemäß Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1]) und eines Polyketid-Synthase-Gens (aviM [laufende Nr. 52 gemäß Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1]) ebenso bekannt wie deren vermutliche Funktion als Teil einer iterativen Typ I Polyketid-Synthase zur Bildung von Orsellinsäure, einem Zwischenprodukt in der Biosynthese von Dichloroisoeverninsäure [Gaisser, S., Trefzer, A., Stockert, S., Kirschning, A., & Bechthold, A. (1997), J Bacteriol. 179, 6271-6278]. Die durch die umfangreiche Klonierung entdeckten Sequenzen der an der Synthese der Avilamycine beteiligten übrigen ORF's sind ebenfalls der Abb. 1 zu entnehmen wie auch die relative Anordnung auf dem Gencluster der Abb. 109. Hierbei erlaubt die Angabe der laufenden Nr. aus Tabelle 1 die Zuordnung zur namentlichen Bezeichnung der ORFs. Unter der namentlichen Bezeichnung sind die Sequenzen Abb. 1 zu entnehmen und zwar auf die in der Beschreibung von Abb. 1 dargestellte Weise. Die genaue Klonierungsstrategie sowie weitere Einzelheiten der Sequenzierung sind in den Beispielen dargestellt ebenso wie die funktioneile Analyse und Charakterisierung der gefundenen Gene (ORF's). Die Zuordnung der ORF-Kürzel zu Funktion und Sequenz (incl. abgeleiteter Proteinsequenz) kann der der Abbildungsbeschreibung folgenden Tabelle 1 entnommen werden.
Ein weiterer wichtiger Gegenstand der Erfindung ist daher eine (oder mehrere) Nukleinsäure(n), die in ihrer Sequenz zu mindestens 95%, vorzugsweise 97%, insbesondere genau, der Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Sequenzen der laufenden Nummer 1 bis 51 gemäß Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1 entspricht/entsprechen oder aber mit einer dieser Sequenzen unter mäßig stringenten Bedingungen hybridisiert. Insbesondere werden auch Sequenzen mit den laufenden Nr. 48 und 49 (gemäß Tabelle 1 und Sequenzdarstellung in Abb. 1) mit Funktion als rRNA-Methyitransferasen (aviRa und aviRb) und auch die Sequenzen mit den laufenden Nr. 50 und 51 (gemäß abelle 1 i.V.m. Abb. 1) mit Funktion als ABC-Transporter-Gene (aviABCI und aviABC2), die Resistenzen gegen Avilamycine vermitteln, bzw. Sequenzen, die zu mindestens 95% diesen Sequenzen mit den vorgenannten laufenden Nr. entsprechen oder aber mit einer dieser Sequenzen unter mäßig stringenten Bedingungen hybridisieren, in der vorliegenden Erfindung beschrieben. Im übrigen auch Mischungen von Nukleinsäuren, die beliebige Unterkombinationen der gemäß Abb. 1 dargestellten Nukleinsäuren mit den laufenden Nr. 1 bis 51 aus Tabelle 1 darstellen, bspw. Mischungen aus zwei, drei, vier, ..., 50 Nukleinsäuren in beliebiger Kombination sind erfindungsgemäß mitoffenbart, ggf. auch als Kombination auf einem Nukleinsäurestrang oder auf verschiedenen Strängen.
Dabei ist/sind insbesondere (eine) Nukleinsäure/n bevorzugt, die zu mindestens 95%, vorzugsweise 97%, insbesondere genau, der Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Sequenzen mit der laufenden Nr. 1 bis 32 gemäß Tabelle 1 (i.V.m. Abb. 1), vorzugsweise 1 bis 7, insbesondere 1, 2, 4 oder 6, oder aber einer der Sequenzen mit der laufenden Nummer 48 bis 51 oder 43, 44 oder 46 gemäß Tabelle 1 (i.V.m. Abb. 1) entspricht/entsprechen oder die aber mit einer dieser Sequenzen unter mäßig stringenten Bedingungen hybridisiert/en.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind entsprechend auch Gencluster, die „Open reading frames", vorzugsweise 54, enthalten, die in ihrer Nukleinsäuresequenz zu mindestens 95%, vorzugsweise 97%, insbesondere genau, den Nukleinsäuresequenzen gemäß den Sequenzen mit den laufenden Nummern 1 bis 54 (Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1) entsprechen oder aber mit einer dieser Sequenzen unter mäßig stringenten Bedingungen hybridisiert und die auf einem Nukleinsäurestrang oder in beliebiger Kombination auf dem einem oder dem anderen Strang angeordnet sind, vorzugsweise gemäß Abb. 109. Die Gene in einem erfindungsgemäßen Gencluster können 2, drei, vier, ... , 54 erfindungsgemäße Gene, ggf. in Kombination mit den bereits bekannten genen, in beliebiger Strangverteilung und Unterkombination enthalten, insbesondere können die zwischen den ORFs liegenden Abschnitte beliebiger Nukleotidsequenz sein. Damit ist insbesondere ein Gencluster gemäß Abb. 109 gemeint, aber auch Gencluster, die entsprechende Nukleinsäuren, evt. auch in anderer Anordnung enthalten, wobei bevorzugt - aber nicht notwendig - ist, daß alle ORF's gemäß den laufenden Nummern 1-54 (Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1) im Gencluster zu finden sind.
Unter dem Begriff Gencluster versteht man im Sinne dieser Erfindung ein Abschnitt einer DNA, auf dem sich in enger räumlicher Nachbarschaft mehrere Gene befinden. Derartige erfindungsgemäße Gencluster können in einem Vektor vorliegen, bspw. einem BAC oder YAC, einem Cosmid oder Plasmid. Vektoren, die mindestens eine erfindungsgemäße Sequenz enthalten, sind damit gleichfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Erfindungsgemäße Gene können in erfindungsgemäßen Vektoren mit weiteren Signalsequenzen oder weiteren Genen, insbesondere weiteren Antibiotika-Resistenz-Genen, kombiniert werden.
Aus den neu entdeckten Sequenzen der ORF's bzw. Gene ließen sich Protein- und Polypeptidsequenzen ableiten. Entsprechend ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung ein Protein oder Polypeptid, das in seiner Aminosäuresequenz zu mindestens 95%, vorzugsweise 97%, insbesondere genau, der Aminosäuresequenz gemäß einer der Sequenzen mit den laufenden Nr. 55 - 101 (Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1) entspricht.
Dabei ist es bevorzugt, wenn das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid zu mindestens 95%, vorzugsweise 97%, insbesondere genau, der Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Sequenzen mit den laufenden Nr. 55 bis 86 oder 97, 98 oder 100 oder 102 bis 105 (Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1), vorzugsweise 55 bis 61, insbesondere 55, 56, 58 oder 60, entspricht. Ein weiterer Gegenstand ist entsprechend auch ein Protein oder Polypeptid, das durch eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 12 oder 13 kodiert wird. Dabei versteht man unter „kodieren" im Sinne dieser Erfindung, daß die Codons (s.o.) des entsprechenden Nukleinsäureabschnitts (Gen oder ORF) für die entsprechende Aminosäuresequenz kodieren, also nach Transkription und Translation ein entsprechendes Protein oder Polypeptid mit dieser Aminosäuresequenz entsteht.
Insbesondere sind die erfindungsgemäßen Proteine Enzyme, bzw. Teil eines Multienzymkomplexes. Sie können aber natürlich auch andere Funktionen haben.
Da zum einen die erfindungsgemäßen Avilamycin-Derivate über ein gentechnologisches bzw. biotechnologisches Verfahren definiert sind oder dadurch hergestellt werden, auf der anderen Seite die neu entdeckten Gene bzw. Proteine (Enzyme) in gen- bzw. biotechnologischen Verfahren zur Herstellung entsprechender Antibiotika eingesetzt werden können, haben im Rahmen dieser Erfindung nahezu zwangsläufig gentechnologisch veränderte Zellen eine wichtige Funktion.
Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung sind daher gentechnologisch veränderte Zellen enthaltend mindestens eine nicht-endogene erfindungsgemäße Nukleinsäure, einen nicht-endogenen erfindungsgemäßen Gencluster und/oder ein nicht-endogenes erfindungsgemäßes Protein oder Polypeptid.
Ebenso ist eine Zelle ein weiterer Gegenstand der Erfindung, die mindestens eine gentechnologisch veränderte Nukleinsäure, deren Sequenz vor der Veränderung zu mindestens 95%, vorzugsweise 97%, insbesondere genau, der Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Sequenzen mit der laufenden Nr. 1 bis 54 (Tabelle 1 i.V.m. Abb.1) entsprach oder aber die mit einer dieser Sequenzen unter mäßig stringenten Bedingungen hybridisierte, enthält.
Ein besonders bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist eine Zelle vom Typ Streptomyces viridochromogenes, vorzugsweise vom Subtyp Tü57, bei dem mindestens eine der Nukleinsäuren mit einer Sequenz mit einer der laufenden Nr. 1-54 (Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1) gentechnologisch verändert oder deletiert wurde. Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn in der entsprechenden Zelle mindestens eine der Nukleinsäuren mit einer Sequenz mit laufender Nr. 1 oder 2-7 (Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1), vorzugsweise mit einer der Sequenzen mit laufender Nr. 1 , 2, 4 oder 6 (Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1), insbesondere mit einer Sequenz mit laufender Nr. 2 oder mit Sequenzen mit den laufenden Nr. 2 und Nr. 1, Nr. 2 und Nr. 4 oder Nr. 2 und Nr. 6 (gemäß Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1) gentechnologisch verändert oder deletiert wurde.
Ebenfalls besonders bevorzugt ist es, wenn die Zelle vom Mutanten-Typ Streptomyces viridochromogenes GW4, Streptomyces viridochromogenes, GW4-AM1, Streptomyces viridochromogenes GW2 oder Streptomyces viridochromogenes GW5 ist, wobei vom Mutanten-Typ Streptomyces viridochromogenes GW4 Avilamycin-Derivate synthetisiert werden, in denen R3 = OH ist, vom Mutanten-Typ Streptomyces viridochromogenes GW4-AM1 Avilamycin-Derivate synthetisiert werden, in denen R3 = OH, R4 = H und R5 = H sind, vom Mutanten-Typ Streptomyces viridochromogenes GW2 Avilamycin-Derivate synthetisiert werden, in denen R3 = OH und R6 = H sind und vom Mutanten-Typ Streptomyces viridochromogenes GW5 Avilamycin-Derivate synthetisiert werden, in denen R3 = OH und R9 = H sind. Gemäß obigen Ausführungen ist entsprechend ein weiterer Gegenstand der Erfindung die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, eines erfindungsgemäßen Genclusters, eines erfindungsgemäßen Proteins oder Polypeptids und/oder einer der erfindungsgemäßen Zellen zur Herstellung eines Avilamycin-Derivats, vorzugsweise eines erfindungsgemäßen Avilamycin-Derivats.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer Avilamycin-Derivate mit folgenden Schritten:
(1) in einer kultivierbaren Zelle, die die nötigen Gene bzw. Enzyme zur Synthese des Orthosomycin-Grundkörpers bestehend aus
(a) einem endständigen Dichloroisoeverninsäure-Rest (A in Formel I) und
(b) einem damit veresterten, über normale Esterbindung und Orthoesterbindungen verknüpften Heptasaccharid (B bis H in Formel I) aus:
(i) zwei D-Olivose-Resten (B und C)
(ii) einem 2-Desoxy-D-Evalose-Rest (D),
(iii) einem D-Fucose-Rest (E),
(iv) einem D-Mannose-Rest (F),
(v) einem L-Lyxose-Rest (G) und (vi) einem (Methyl-)Eurekanat Rest (H)
aufweist, wird mindestens eine Nukleinsäure, deren Sequenz zu mindestens 95%, vorzugsweise 97%, insbesondere genau, der Nukleinsäuresequenz mit einer der laufenden Nr. 1 bis 54 gemäß Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1 entspricht oder aber eine
Nukleinsäure, die mit einer dieser Sequenzen unter mäßig stringenten Bedingungen hybridisiert, gentechnologisch verändert, deletiert oder nicht exprimiert,
(2) die so gentechnologisch veränderte Zelle wird kultiviert, (3) der Kulturüberstand wird gewonnen,
(4) der Kulturüberstand wird aufgearbeitet und dabei das oder die entstandene/n Avilamycin-Derivat/e aufgereinigt und isoliert,
(5) gegebenenfalls werden unterschiedliche Derivate getrennt.
Es ist bevorzugt, wenn bei diesem Verfahren die kultivierbare Zelle ausgewählt ist aus einer Zelle vom Typ Streptomyces viridochromogenes oder einer Zelle, die mit Ausnahme der gentechnologisch veränderten, deletierten oder nicht exprimierten Nukleinsäure die Nukleinsäuren gemäß laufenden Nr. 1-54 gemäß Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1 bzw. dazu zu mindestens 95%, vorzugsweise 97 %, homologe Nukleinsäuren oder aber mit diesen Sequenzen hybridisierende Sequenzen enthält oder den erfindungsgemäßen Gencluster enthält. Letzteres wird in der Fachliteratur als heterologe Expression bezeichnet. Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn die Zelle ausgewählt ist aus einer Zelle vom Typ Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces lividans, Streptomyces albus oder Streptomyces fradiae, insbesondere einer Zelle vom Typ Streptomyces viridochromogenes Tu 57 oder A 23575.
Auch eine alternative Verfahrensführung kommt erfindungsgemäß in Betracht. Hierbei wird nach Durchführung der Verfahrensschritte (1) und (2) jedoch das Avilamycin-Derivat nicht aus dem Kulturüberstand gewonnen, sondern dieses akkumuliert sich vielmehr in den Wirtszellen. Gemäß dem alternativen Verfahren werden daher in Verfahrensschritt (3) die Wirtszellen geerntet, nachfolgend aufgeschlossen und die Avilamycin- Derivate von den übrigen Zellbestandteilen getrennt und schließlich aufgereinigt. Zur Trennung und Aufreinigung können die vorgenannten und alle dem Fachmann geläufigen Verfahren zum Einsatz kommen.
Weiter bevorzugt ist es, wenn bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die veränderte/n Nukleinsäure/n für eine Methyltransferase und/oder für eine Halogenase kodiert/en. Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn die Sequenz/en der veränderte/n Nukleinsäure/n vor der Veränderung zu mindestens 95%, vorzugsweise 97%, insbesondere genau, der/den Nukleinsäuresequenz/en mindestens einer der Sequenzen mit den laufenden Nr. 1 oder 2-7 gemäß Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1, vorzugsweise einer Sequenzen mit den laufender Nr. 1, 2, 4 oder 6 (Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1), entspricht/en, insbesondere der Sequenz mit laufender Nr. 2 oder den Sequenzen mit den laufenden Nr. 2 und Nr. 1 , Nr. 2 und Nr. 4 oder Nr. 2 und Nr. 6 (gemäß Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1).
Weiter bevorzugt ist es, wenn bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Veränderung der Nukleinsäure/n, insbesondere von erfindungsgemäßen Methyltransferasen und/oder Halogenasen, dazu führt, daß das oder die durch die gentechnolgisch veränderte/n Nukleinsäure/n kodierte/n Protein/e oder Polypeptid/e nach der gentechnologischen Veränderung nicht mehr synthetisiert wird/werden.
Die erfindungsgemäßen Avilamycin-Derivate sind prinzipiell toxikologisch unbedenklich, so daß sie sich als pharmazeutischer Wirkstoff in Arzneimitteln eignen. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind daher Arzneimittel enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes Avilamycin- Derivat, vorzugsweise mindestens zwei, insbesondere auch Mischungen von einem oder mehreren Avilamycin-Derivaten mit mindestens einem weiteren Antibiotikum aus dem Stand der Technik, bspw. Vancomycin, Penicillin, Streptomycin, Neomycin, Kanamycin, Sisomycin, Amikacin und/oder Tobramycin, sowie gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe. Auch andere bakteriostatische oder bakterizide Substanzen können mit erfindungsgemäßen Substanzen kombiniert werden, bspw. Cephalosporine, Chloramphenicol, Ethambutol, Cephalosporine, Isonicotinamide, Tetracycline, Sulfonamide, Oxalactame (bspw. Flomoxef, Clavulansäure) und/oder Nitrofurane.
Darunter versteht man insbesondere auch Trägermaterialien, Füllstoffe, Lösungsmittel, Verdünnungsmittel, Farbstoffe und/oder Bindemittel. Die Arzneimittel können als flüssige Arzneiformen in Form von Injektionslösungen, Tropfen oder Säften, als halbfeste Arzneiformen in Form von Granulaten, Tabletten, Pellets, Patches, Kapseln, Pflaster oder Aerosolen verabreicht werden. Die Auswahl der Hilfsstoffe etc. sowie die einzusetzenden Mengen derselben hängen davon ab, ob das Arzneimittel oral, peroral, parenteral, intravenös, intraperitoneal, intradermal, intramuskulär, intranasal, buccal, rektal oder örtlich, zum Beispiel auf die Haut, die Schleimhäute oder in die Augen, appliziert werden soll. Für die orale Applikation eignen sich Zubereitungen in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Granulaten, Tropfen, Säften und Sirupen, für die parenterale, topische und inhalative Applikation Lösungen, Suspensionen, leicht rekonstituierbare Trockenzubereitungen sowie Sprays.
Oral oder perkutan anwendbare Zubereitungsformen können die erfindungsgemäßen Avilamycin-Derivate verzögert freisetzen und so einen gleichmäßigeren Plasmaspiegel erreichen. Prinzipiell können den erfindungsgemäßen Arzneimitteln andere dem Fachmann bekannte weitere Wirkstoffe zugesetzt werden.
Die an den Patienten zu verabreichende Wirkstoffmenge variiert in Abhängigkeit vom Gewicht des Patienten, von der Applikationsart, der Indikation und dem Schweregrad der Erkrankung. Üblicherweise werden 0,005 bis 1000 mg/kg, bevorzugt 0,05 bis 5 mg/kg wenigstens eines erfindungsgemäßen Avilamycin-Derivats appliziert.
Da für die erfindungsgemäßen Avilamycin-Derivate eine antibiotische Wirkung nachgewiesen ist, eignen sie sich natürlich prinzipiell zur Behandlung von Erkrankungen, insbesondere zur Behandlung von Infektionskrankheiten, bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung derartiger Erkrankungen. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist entsprechend die Verwendung eines erfindungsgemäßen Avilamycin-Derivats zur Herstellung eines Arzneimittels mit antibiotischer Wirkung zur Behandlung von bspw. Infektionskrankheiten. Unter Infektionserkrankungen werden Erkrankungen verstanden, denen eine Infektion mit einem viralen, einem bakteriellen oder einem protozoologischen Erreger zugrundeliegt. Damit sind die vorliegenden erfindungsgemäßen Antibiotika auch zur Behandlung von Mykosen, insbesondere kutanen und subkutanen Mykosen, geeignet.
Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Avilamycin-Derivate jedoch zur Bekämpfung bakterieller Infektionen eingesetzt. Insbesondere sind
Infektionen mit den folgenden Erregern zu nennen: Leprabakterien,
Mykobakterien, Neisserien, Tuberkulosebakterien, Aktinomyceten,
Corynebakterien, Listerien, Clostridien, Bazillen, Enterokokken,
Streptokokken, Staphylokokken, insbesondere auch zur Behandlung von Infektionen mit Staphylococcus aureus Stämmen, Rickettsien,
Chlamydien, Mykoplasmen, Borrelien, Spirochäten, Brucellen,
Bortedellen, Pseudomonaden, Helicobacter, Hämophilus, Vibrionen,
Shigellen, Yersinia, Salmonellen und weitere unter die Familie der
Enterobacteriaceae fallende Vertreter. Entsprechend werden die erfindungsgemäßen Substanzen zur Behandlung aller klinischen
Krankheitsbilder, die durch bspw. die vorgenannten Bakterienstämme verursacht werden, verwendet. Beispielhaft seien die folgenden Krankheitsbilder genannt: Tuberkulose; Pneumonien; Typhus; Paratyphus; Lues; Gastritis; Gastroenteritis; Ruhr; Pest; Enteritis; extraintestinale Infekte, Peritonitis und Appendizitis mit E. coli sowie intestinale Infekte mit EHEC, EPEC, ETEC oder EIEC; Cholera, Legionärskrankheit, Keuchhusten, Brucellosen, Lyme-Borreliose, Leptospirose, Fleckfieber, Trachom, Gonorrhoen, Meningitis, Septikämie, Lepra etc.
Ein weiterer Gegenstand des Verfahrens ist auch die Behandlung eines Menschen oder Tieres, der oder das diese Behandlung benötigt, mit einem erfindungsgemäßen Avilamycin-Derivat, vorzugsweise bei Infektionskrankheiten, insbesondere unter Beteiligung von Staphylococcus aureus.
Im folgenden Abschnitt wird die Erfindung weiter durch Beispiele erläutert, ohne sie darauf zu beschränken.
Beispiele und Abbildungen:
Abbildungen:
Abbildung 1 zeigt die Sequenz des gesamten Genclusters mit seinen 54 Nukleinsäuresequenzen der ORF's aus Streptomyces viridochromogenes Tu 57. In Abbildung 1 sind die Kurzbezeichnungen der entsprechenden Nukleinsäuresequenzen enthalten, wobei diese Kurzbezeichnungen (ohne das Präfix „Avi") jeweils an den Zeilen eingefügt sind, die die Startcodons der 54 Sequenzen aufweisen. Die AS, die durch das jeweilige Startcodon codiert wird, ist eingekreist. Der an diesen Stellen jeweils eingezeichnete Pfeil gibt die Leserichtung (rückwärts oder vorwärts) der Gene mit dem Startcodon als Ausgangspunkt wieder. Abb. 1 enthält die Nukleotidsequenzen der beiden komplementären DNA- Stränge ebenso wie die (tw. fiktiven) AS-Sequenzen für beide Stränge in allen drei Leserastern, insgesamt also 2 Nukleotidsequenzen und die sich hieraus potentiell ergebenden 6 Proteinsequenzen (Ein-Buchstaben- Code). Die drei Proteinsequenzen des oberen Nukleotidstrangs sind oberhalb der dazugehörigen Nukleotidsequenz, die drei Proteinsequenzen des unteren komplementären Nukleotidsequenz unterhalb des dazugehörigen unteren Nukleotidstrangs eingezeichnet. Die 54 namentlich in Abb. 1 eingezeichneten Proteinsequenzen im Gencluster ergeben sich aus Abb. 1 dadurch, daß eine eingekreiste AS als Ausgangspunkt gewählt wird und dann in diesem Leseraster, d.h. in der entsprechenden Zeile (bspw. 2. Zeile unterhalb der unteren Nukleotidsequenz), die AS-Sequenz in der durch die Pfeile angegebenen Richtung, also im folgenden entweder vorwärts oder rückwärts, abgelesen wird. Die Sequenz endet mit dem Stop-Codon im entsprechenden Leseraster, wobei Stop-Codons durch ein „Stern'-Symbol in der enrsprechenden Zeile markiert sind.
Die zur AS eines ORFs gehörige Nukleotidsequenz ergibt sich durch das entsprechende oberhalb oder unterhalb (für den oberen Strang) befindliche Triplett. Die Ein-Buchstaben-Bezeichnung der Aminosäure ist dabei jeweils so angeordnet, daß sie oberhalb oder unterhalb des mittleren Nukleotids des für diese AS kodierenden Codons liegt.
In der nachfolgenden Tabelle sind die namentlichen Bezeichnungen der 54 kodierenden Bereichen im Gencluster jeweils laufenden Nummern zugeordnet, wobei die laufenden Nummern 1 bis 54 die Nukleotidsequenzen angeben und die laufenden Nummern 55 bis 108 den jeweils dazu gehörigen AS-Sequenzen entsprechen, und zwar codiert die Nukleotidsequenz mit der laufenden Nummer 1 für die AS mit der laufenden Nummer 55, die Nukleotidsequenz mit der laufenden Nummer 2 für die AS mit der laufenden Nummer 56 etc..
Abbildung 109 zeigt die relative Anordnung der gefundenen ORF's auf dem Gencluster.
Abbildung 110 zeigt einen Southern-Blot mit der Mutante S. viridochromogenes GW4.
Abbildung 111 zeigt das Massenspektrum der Produkte von Mutante S. viridochromogenes GW4
Abbildung 112 zeigt das Massenspektrum der hydrolysierten Produkte von Mutante S. viridochromogenes GW4.
Die Zuordnung der ORF-Kürzel zu ihrer Funktion und Sequenz (incl. abgeleiteter Proteinsequenz) kann der folgenden Tabelle 1 entnommen werden.
Tabellel:
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Beispiele
5 Beispiel 1
Allgemeine Methoden und Materialien:
a)
Bakterienstämme, Plasmide und Kulturbedingungen.
10
Streptomyces viridochromogenes Tü57 wurde mit 1 % Malzextrakt, 0.4 % Hefeextrakt, 0.4 % Glucose und 1 mM CaCI2, bei einem pH von 7.2 (HA medium) bei 37°C kultiviert. Zur Herstellung von Avilamycin A wurden Streptomyces viridochromogenes Tü57 und alle Mutanten in NL19+-
15 Medium, das 2% D-Mannitol, 2% Sojamehl und 20 mM L-Valin enthielt und auf pH 7.5 eingstellt war, kultiviert. Für die DNA-Manipulation wurde Escherichia coli XL-1 Blue MRF' (Stratagene) als Wirtszelle benutzt. Vor der Transformation von S. viridochromogenes Tü57 wurden die Plasmide in E . coli ET 12567 (dam~, dcm~, hsdS, CmR) angezogen, um unmethylierte DNA zu erhalten. E. coli Stämme wurden auf Luria-Bertani (LB) Agar oder flüssigem Medium, das das geeignete Antibiotikum enthielt, kultiviert.
b) Allgemeine gentechnologische Manipulationen. PCR und DNA Sequenzierung / Seguenz-Analyse
Es wurden Standard-Methoden der Molekularbiologie - wie dem Fachmann bekannt - durchgeführt. Die Isolierung von E.coli Plasmid DNA, DNA Restriktion, DNA Modifizierung wie das „filling-in sticky ends" und die „Southern'-Hybridisierung wurden gemäß den Protokollen der Hersteller der Kits, Enzyme und Reagentien durchgeführt (Amersham-Pharmacia, Boehringer Mannheim, Promega, Stratagene). Streptomyces Protoplastenbildung, -transformation, und -regenerierung wurden wie üblich durchgeführt. Die PCR wurde mit einem Perkin Eimer GeneAmp 2400 thermal cycler durchgeführt, wobei die Bedingungen so wie beschrieben und üblich waren. Die verwendeten Oligonukleotid-Primer waren:
AviG4F (δ'-GGACGCCTATCTGTGCCACCCCTTCCTGGT-S'), AviG4R (5 ,-TGAGCGCTCGCCTAGACAGAATCATCTCCC3'), S2A (5'-GCGTCCATCTTGCCGGGA-3') und S2B (5 ,-CGTGGATCCCGCCGGCCC-3').
Die Nukleotidsequenzierung wurde mit der Dideoxy- Kettenabbruchsmethode unter Verwendung eines automatischen Laser- Fluorescenz-Sequencers (Perkin Eimer ABI) durchgeführt. Die Sequenzierungs-Reaktionen wurden mit einem Thermosequenase-Cycle- Sequencing Kit mit 7-deaza-dGTP (Amersham) und Standard-Primern (M 13 universal and reverse, T3, T7) durchgeführt. Mit dem DNASIS- Software-Paket (Version 2.1, 1995; Hitachi Software Engineering) wurde eine computerunterstützte Sequenz-Analyse und die Datenbank- Recherche mit dem BLAST 2.0 program auf dem Server des National Center for Biotechnology Information, Bethesda MD, USA, durchgeführt. Die vorgelegten Sequenzen sind in der „GenBank"-Datenbank unter der Zugangsnummer („Accession Number") AF333038 abgelegt.
c)
Konstruktion eines Gen-inaktivierenden Plasmids
aviG4: Eine einmal vorkommende /Vcol-Restriktionsschnittstelle im Gen aviG4 (laufende Nr. 2, Abb. 1), die auf dem 1.9 Fragment liegt, das in die Sacl und EcoR\ Schnittstellen von pBSK- ligiert ist, wurde für die gezielte Inaktivierung durch ein Verschieben des Leserahmens ausgewählt. Das 1.9 kb Fragment wurde mit Sacl und Kpn\ verdaut und wurde in das Gen- Inaktivierungsplasmid pSP 1 hineinligiert. Nach dem Restriktionsverdau mit Λ/col, Behandlung mit dem Klenow -Fragment der E. coli DNA- Polymerase I und erneuter Ligation wurde die beabsichtigte Veränderung durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Das gebildete Plasmid wurde als pMIKG4E3 bezeichnet.
avi i: Die einmal vorkommende Naή Schnittstelle im av/H-Gen, das auf dem 3.7 kb Sacl-Fragment ligiert in pBSK- vorliegt, wurde durch Naή-
Restriktionsverdau und anschließender Behandlung wie für aviG4 beschrieben, verändert. Die Sequenzierung verschiedener Plasmide zeigte die korrekte Veränderung. Das 3.7 kb-Fragment wurde in pSP1 kloniert, um das Gen-Inaktivierungs-Plasmid pSP 1S2Narzu bilden.
d) Analyse neυer Avilamycin-Derivate DC- Analyse
Streptomyces viridochromogenes Tü57 und die Mutanten GW-4 und GW4-AM1 wurden drei Tage lang inkubiert. Die Kulturen wurden abfiltriert und das Filtrat auf eine Festphasen Extraktions-Patrone aufgetragen (SepPakCiβ, Waters). Die Patrone wurde mit einem Gradienten zwischen 10 % und 100% Methanol in Wasser eluiert. Avilamycin-Derivate eluieren mit der Fraktion, die 60-70 % Methanol enthält. Nach einer Extraktion mit Ethyl-Acetat und Abziehen des Lösungsmittels wurden die Avilamycin- Derivate wieder in Methanol gelöst und mittels DC auf Silicagel-Platten (silica gel 60 F254, Merck) mit Methylenchlorid/Methanol (9:1, v/v) als Lösungsmittel gemessen. Avilamycin-Derivate waren nach Behandlung mit Anisaldehyd/H2S04 detektiert worden.
e)
HPLC-UV-Analyse
Eine analytische HPLC-UV wurde auf einem Hewlett Packard 1090 Liquid Chromatograph mit einem Photodioden-Array-Detektor und einer HP- ODS-Hypersil 5Mm, 200 x 2 mm Säule durchgeführt. Die Abfolge der Lösungen war wie folgt: Lösung A, 0.04M (NH4) HPO pH 7.0 Puffer; Lösung B, 100% Methanol; ein nichtlinearer Gradient, mit 30-62% der Lösung B über 25min bei einer Flußrate von 0.2ml/min verteilt. f) HPLC-MS-Analyse
Für die HPLC-MS-Analyse wurden die Avilamycin-Derivate auf einer HPLC-Anlage (HP 1110, Hewlett-Packard, Waldbronn) mit einer HP ODS Hypersil Cι8 Säule (2.1 by 100 mm; 5 μm) bei einer Flußrate von 0.1 ml/min, Detektion bei 220 nm und dem folgenden Gradienten laufen gelassen: 0-5 min von 0 % bis 20 % B, 5.1-120 min bis 90 % B (Lösung A, H2O : MeOH 3:2; Lösung B, MeOH). Massenspektren wurden auf einem Bruker Esquire-LC 1.6n Massenspektrometer (Bruker Daltonik, Bremen) mit einer Elektrospray (ES) lonenquelle (positive ion mode) aufgezeichnet. Die Meßbreite betrug zwischen 200 - 1800 m/z.
g) GC-MS-Analyse
Eine Analyse der neuen Gavibamycin-Derivate (erfindungsgemäßen Avilamycin-Derivate), die durch die mutierte Zelle Streptomyces viridochromogenes GW4 synthetisiert worden waren, wurde nach Etylierung mit GC-MS-Analyse durchgeführt. Die Derivate wurden in einer Mischung aus DMSO und Acetonitril (3:40) gelöst. Nach Zugabe von Ethyliodid und K2C03 lief die Reaktion über Nacht ab. Nach Abziehen des Lösungsmittels wurden die Derivate mit HCI/Methanol bei 115°C für 15 min hydrolysiert. Nach Abziehen des Lösungsmittels wurden die Derivate mit Diethylether extrahiert und mit GC-MS analysiert. Ein Hewlett Packard 5973 MSD System wurde verwendet, um El (electron impact) Spektren (Säule: SE54, 12m x 0.25mm; df= 0.125μ). Die Säulentemperatur wurde wie folgt programmiert: 50°C für 2 min; 25°C/min bis 100°C; 5°C/min bis 250°C. Beispiel 2
Klonierung und Sequenzierung des Avilamycin Clusters
Ein 60kb Abschnitt des Chromosoms des S. viridochromogenes Tü57, das Gene enthält, die an der Biosynthese von Avilamycinen beteiligt sind, wurde kloniert und sequenziert. Eine Analyse der DNA-Sequenz ergab 54 „open reading frames". Es war bereits bekannt, daß das NDP-Glucose 4,6-Dehydratase Gen aviE und das Orsellinsäure Synthase-Gen aviM essentiell für die Biosynthese von Avilamycin A sind. Es wurde die DNA, die die aviE und a 'M-Gene flankiert, isoliert und sequenziert, um den biosynthetischen Avilamycin-Gencluster zu identifizieren. Ein 17.6 kb Stück upstream von aviM und ein 35.9 kb Stück downstream von aviE wurden sequenziert. Die sequenzierten Gene und ihre Funktion sind Tabelle 1 zu entnehmen. Abb. 109 zeigt die genetische Anordnung des biosynthetischen Avilamycin-Genclusters. Der Cluster wird durch ein Avilamycin-Resistenz-Gen (aviRb) und einem Desoxyzucker-Synthese- Gen (avι'Z2) flankiert. Im Zentrum des sequenzierten Abschnitts sind 25 Gene (aviXW- aviGT4), die alle in gleicher Richtung transkribiert werden.
Beispiel 3 Analyse der ORF's
a) Allgemein Es wurde eine Computeranalyse der gefundenen Sequenzen der ORF's durchgeführt. Überwiegend wurden die Ergebnisse eines Sequenzvergleichs mit den Kenntnissen über die Biosynthese des Avilamycins A in Verbindung gesetzt. Die Ergebnisse dieser auf die vorliegenden Experimente gestützten Überlegungen sind in Tabelle 1 abzulesen.
Im folgenden werden die funktionellen Überlegungen an ausgewählten Beispielen, insbesondere den Methyltransferasen und Halogenasen vorgestellt.
b)
Gene mit einer Funktion in der Biosynthese von
Dichloroisoeverninsäure
AviM ist für die Bildung von Orsellinsäure während der Avilamycin- Biosynthese verantwortlich. AviN, das upstream von aviM liegt, dürfte für ein Enzym, das das Startsignal für die Orsellinsäure-Synthese kontrolliert, kodieren. Die Biosynthese von Dichloroisoeverninsäure (A in Formel I) ausgehend von Orsellinsäure setzt Methylierung und Di-Halogenierung voraus. Überraschend wurde festgestellt, daß AviG4, das DmpM, einer O- Demethylpuromycin-O-Methyltransferase aus S. alboniger (44% identische AS) ähnelt, und AviH, die PltA, einer Halogenase aus Pseudomonas fluorescens Pf-5, die an der Pyoluteorinbiosynthese (39% identische AS) beteiligt ist, ähnelt, für die Modifizierung der Orsellinsäure verantwortlich sind.
c)
Gene mit einer Funktion in der Biosynthese von Desoxy-Zuckern.
2-Desoxy-D-Evalose unterscheidet sich von D-Olivose in einer Methylgruppe an C3-Position. Es ist anzunehmen, daß dNDP-4-keto-2,6- Didesoxy-D-Glucose ein wichtiges Zwischenprodukt in der Biosynthese dieses methylierten Desoxyzuckers ist. Methylierung durch AviG1, das TylCIII ähnelt, einer 3C-Methyltransferase aus S. fradiae (54% identische AS), und Ketoreduktion durch entweder AviZ1 oder AviZ2, die beide Ketoreduktasen und Oxidoreduktasen ähneln, komplettieren die Biosynthese.
d)
Gene mit einer Funktion in der Modifikation der Heptasaccharid-Kette
Neben aviGI, aviG4, aviRa und aviRb wurden vier weitere Methyltransferase-Gene im Cluster gefunden (aviG2, aviG3, aviG5 und aviG6). Sie wurden dadurch als potentielle Methyltransferase-Gene identifiziert, daß entweder ihr Produkt Methyltransferasen aus anderen Organismen ähnelt, oder daß sie Motive enthalten, die typischerweise in verschiedenen methylierenden Proteinen gefunden werden. Es wurden von einer erfindungsgemäßen Zellinie verschiedene Avilamycin-Derivate, die keine Methylgruppe an verschiedenen Positionen im Molekül enthielten, produziert. Das weist darauf hin, daß die Methylierung zu einem sehr späten Zeitpunkt der Biosynthese erfolgt. AviG2, AviG3, AviG5 und AviG6 dürften am D-Fucose-Rest (E), D-Mannose-Rest (F) und am Methyl-Eurekanat-Rest (H) von Avilamycin A methylieren.
Beispiel 4
Herstellung einer avι'G4-Gen Substitutionsmutante
Zur Inaktivierung von aviG4 wurde das Plasmid pMIKG4E3 konstruiert (s. Beispiel 1), um den Ersatz des Wildtyp-Gens durch ein mutiertes Allel zu erlauben. Nach Bildung von Protoplasten und Transformation von S. viridochromogenes mit dem Plasmid pMIKG4E3, wurden Erythromycin resistente Kolonien erhalten. Die Transformationseffektivität war ungefähr 10 Kolonien pro μg Plasmid-DNA. Mehrere Kolonien wurden ohne Erythromycin auf Platten kultiviert, um nach dem Verlust der Resistenz zu selektieren. Verschiedene sensitive Kolonien wurden erhalten, was darauf hindeutet, daß es sich um die Folge eines „double cross-over" handelt. Zwei Mutanten, G4/24/20 und G4/24/30, wurden weiter untersucht. PCR- Fragmente, die unter Benutzung der Primer aviG4F- und avι'G4R-DNA von G4/24/20 und G4/24/30 amplifiziert wurden, konnten nicht von Nco\ geschnitten werden, während PCR-Fragmente aus Wildtyp-DNA von diesem Enzym geschnitten werden konnten. Um die Deletion in aviG4 nachzuweisen wurden wie folgt Southem-Blot-Analysen durchgeführt. Ncol-geschnittene, chromosomale DNA wurde aus G4/24/20 und G4/24/30 gewonnen. Als diese DNA mit einem 1.9 kb-Fragment, das das ganze aw'G4-Gen enthielt, hybridisiert wurde, wurde ein 11 kb-Fragment detektiert, während die zu erwartenden 5 kb- und 6 kb-Fragmente in der S. viridochromogenes Tü57 Linie gefunden wurden (Abb. 110). Die Mutante G4/24/30 wurde unter dem neuen Namen S. viridochromogenes GW4 für weitere Experimente genutzt.
Beispiel 5
Herstellung einer av/G4~ aviH Doppelgen-Ersatz-Mutante
Das Plasmid pSP 1 S2Nar wurde entwickelt, um das aw'H-Gen auszuschalten (s. Beispiel 1). S. viridochromogenes GW4 Protoplasten wurden mit diesem Plasmid transformiert. Es traten ca. 20 erythromycin- resistente Kolonien pro μg DNA auf. Einige davon wurden zum Screening, ob die Erythromycin-Resistenz verloren geht (was ein „double-cross-over" anzeigt), kultiviert. Die Mutante GW4-AM1 wurde für weitere Experimente ausgewählt. Ein 1.34 kb PCR-Fragment, das unter Verwendung der Primer S2A und S2B aus H/3/16 gewonnen wurde, konnte von Narl nicht geschnitten werden, während das PCR-Fragment aus GW4 vom Enzym verdaut wurde. Um die Deletion in aviH nachzuweisen wurde eine Southern-Blot-Analyse durchgeführt. Chromosomale DNA aus H/3/16 wurde mit Naή geschnitten und mit einer 3,7 kb Sonde, die das aviH-Gen enthielt, hybridisiert. Es wurde ein 5.7 kb-Fragment detektiert, während bei chromosomaler DNA aus GW4 die Fragment erwartungsgemäß bei 4.3 kb und 1.4 kb lagen (nicht gezeigt).
Beispiel 6
Vervollständigung von S. viridochromogenes GW4 und S. viridochromogenes GW4-AM1
Um klar zu überprüfen, ob die Mutation nur die gewünschten und keine anderen Gene betrifft, wurden av\'G4 und aviH hinter dem ermE-up Promoter ligiert, in das Integrationsplasmid pSET152 einkloniert und durch Protoplasten-Transformation in die entsprechenden Mutanten eingeführt. Die Produktion von Avilamycinen bzw. Gavibamycinen wurde wieder hergestellt. Damit ist jede Art von „upstream"- oder „downstream"-Effekt auszuschließen.
Beispiel 7 Analyse der neugebildeten Avilamycin-Derivate durch S. viridochromogenes GW4 und S. viridochromogenes GW4-AM1
Avilamycin A (M+Na: 1425) und Avilamycin C (M+Na: 1427) wurden in Extrakten von S. viridochromogenes Tü57 durch Flüssigchromatographie (LC)-Massenspektrometrie-Analyse nachgewiesen. Avilamycin C war die Hauptkomponente. Messung bei hoher Auflösung zeigte, daß beide Verbindungen 2 Chloratome enthalten, die an ihem typischen Isotopenmuster erkannt werden können. Die Masse der zwei durch S. viridochromogenes GW4 gebildeten Hauptverbindungen war 1411 (M+Na) und 1413 (M+Na) (Abb. 111) was zeigt, daß aviG4 wirklich für eine Methyltransferase kodiert. Die Hauptprodukte der Mutante GW4 wurden isoliert, durch Behandlung mit Ethyliodid ethyliert und unter Verwendung von Methanol und Salzsäure hydrolysiert. Die Reaktionsprodukte wurden durch GC-MS analysiert. Das Massenspektrum dieser Probe zeigte mehrere Peaks (Abb. 112). Der Peak by m/z 436 entspricht dem D- Olivosylester der Dichloro-di-O-ethyl-orsellinsäure und die meisten weiteren Peaks (m/z 405, m/z 275, m/z 247) entsprachen Fragmenten, die vom Orsellinsäure-Rest ausgehen (Abb. 112). Das legt den Schluß nahe, daß die Differenz zwischen Avilamycin A (C) und dem neuen Derivat, Gavibamycin A1 (A3), aus einer Veränderung der Struktur des Orsellinsäure-Rests resultiert.
Gavibamycin A1 und A3 entsprechen der allgemeinen Formel I mit der folgenden Bedeutung für die Reste R1-R9:
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S. viridochromogenes GW4-AM1 wurde auch durch HPLC-MS analysiert. Die Masse der zwei Haupt-Avilamycin-Derivate war 1343 (M+Na) und 1345 (M+Na). Bei einem Vergleich des Isotopenmusters der Haupt- Derivate aus der Mutante GW4 zeigte das Isotopenmuster der Hauptprodukte der Mutante GW4-AM1 keine spezifischen Signale für Chloridionen (Abb. 111), was darauf hindeutet, daß die Inaktivierung von aviH zum Verlust beider Chlorid-Atome führt. Die neuen Derivate wurden Gavibamycin B 1 (Avilamycin A-Analogon) und Gavibamycin B3 (Avilamycin C-Analogon) genannt. Gavibamycin B1 und B3 entsprechen der allgemeinen Formel I mit der folgenden Bedeutung für die Reste R1-R9:
Figure imgf000048_0001
Beispiel 8
Biologische Eigenschaften von Gavibamycin A3
Das antimikrobielle Spektrum von Gavibamycin A3 wurde bestimmt und mit dem von Avilamycin A verglichen. Dabei wurde die „broth- microdilution"-Methode gemäß den Vorschriften des nationalen Kommittees für klinische Labor-Standards angewandt. Beide Metaboliten zeigten antibiotische Aktivität gegen Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus ATCC6538, Staphylococcus aureus ATCC6538P, Staphylococcus aureus ATCC29213, Staphylococcus aureus Q48-1.2.1, Enterococcus faecalis ATCC29212, Enterococcus faecalis H-7-6 und Streptococcus pneumoniae ATCC49619.
Erste Tests zeigen weiter, daß Gavibamycin A3 etwas aktiver gegen verschiedene Staphylococcus aureus Stämme ist als Avilamycin A und es scheint zusätzlich viel hydrophiler zu sein wie an den Rf-Werten abzusehen ist. Auch die nicht-chlorierten Gavibamycin-Derivate waren antibiotisch aktiv.
Beispiel 9
Die Mutanten S. viridochromogenes GW2 und GW5 sowie die durch diese gebildeten erfindungsgemäßen Avilamycin-Derivate Wie bei den Varianten GW4 und GW4-AM1 wurden basierend auf S. viridochromogenes Mutanten GW2 und GW5 hergestellt, wobei bei allen von beiden Mutanten synthetisierten Avilamycin-Derivaten jeweils R3 = OH ist und bei den Produkten der Mutante GW2 R6 = H und bei den Produkten der Mutante GW5 R9 = H ist. Dabei wurden völlig analog wie in den Beispielen 4 bis 6, insbesondere 5, vorgegangen , so dass bei GW2, einer Doppelmutante, neben aviG4 (s. Bsp. 4) auch aviG2 genetisch verändert (ausgeschaltet) wurde. Bei der Mutante GW5, ebenfalls einer Doppelmutante, wurde neben aviG4 auch aviGδ genetisch verändert (ausgeschaltet). An den erfindungsgemäßen Produkten dieser Mutanten GW2 und GW5 ist erkennbar, dass die entsprechenden Methyltransferasen (aviG2 bzw. aviGδ und jeweils aviG4) ausgeschaltet wurden.
Beispiel 10
Parenterale Applikationsform
5 g Gavibamycin A3 werden in 1 I Wasser, ggf. unter Einsatz eines pharmazeutisch gut verträglichen Löslichkeitsverbesserers, für Injektionszwecke bei Raumtemperatur gelöst und anschließend durch Zugabe von wasserfreier Glukose für Injektionszwecke auf isotone Bedingungen eingestellt.
Appliziert werden davon bei einem Durchschnittspatienten von ca. 65 kg Körpergewicht beispielsweise 0,5 ml also 2,5 mg bzw. « 40 μg/kg. Die verabreichte Dosis zeigte keinerlei Kontraindikation und erwies sich für die Patienten als gut verträglich. Auch eine bis zu 20-fach höhere Dosierung von Gavibamycin A3 erwies sich als toxikologisch unbedenklich und gut verträglich. Beispiel 11
Zusammenfassend ist festzustellen, daß erfindungsgemäß eine detaillierte Sequenzanalyse des avi Gensatzes mehrere Merkmale aufweist, die ein Modell eines biosynthetischen Stoffwechselwegs zu erfindungsgemäßen komplexen Oligosaccharid-Antibiotika vorschlagen. Die Funktion der für die Zuckerbiosynthese verantwortlichen Gene kann aus ihren Aminosäuresequenzen abgeleitet werden, die solchen Proteinen ähneln, die an der Biosynthese von D-Olivose in anderen Organismen beteiligt sind. Wie für die Biosynthese von D-Olivose in Streptomyces violaceoruber Tü22 (Granaticin-Produzent) und Streptomyces fradiae (Urdamycin-Produzent) beschrieben, beginnt die Biosynthese vom Glukose-1 -Phosphat, das zu dTDP-D-Olivose und dTDP-2-Desoxy-D- Evalose durch mehrere Enzyme konvertiert wird. Ein neues Merkmal in diesem Stoffwechselweg ist, daß daran drei verschiedene dNDP-Hexose- 4,6-Dehydratase-Gene beteiligt sind. Auf der Basis von Sequenzhomologien ist AviEl eine dTDP-Glukose-4,6-Dehydratase und AviE3 eine GDP-Mannose-4,6-Dehydratase, was anzeigt, daß die Biosynthese von einigen dieser verschiedenen Zuckereinheiten aus verschiedenen nukleotidgebundenen Hexosepools beginnt. Auf der Basis der Struktur von Avilamycin A und außerdem indiziert durch die vermeintliche Funktion von einigen Genprodukten beginnt die Biosynthese von D-Lyxose sogar von einem dritten Zucker-Pool, so daß es sich um ein Produkt des Pentose-Phosphat-Stoffwechselwegs handeln könnte. Rest H von Avilamycin A ist ursprünglich als Methyleurekanat, abgeleitet von 2,3- di-O-Methylen-4,δ-Dihydroxyhexansäure, beschrieben worden. Die erfindungsgemäße Sequenzanalyse allerdings zeigt, daß Methyleurekanat auch das Produkt eines biosynthetischen Zuckerstoffwechselwegs ist. Dies alles zusammengenommen läßt aufgrund der Zahl der Zuckereinheiten darauf schließen, daß das Avilamycin-Cluster sechs Glykosyltransferase-Gene aufweist. Allerdings sind nur vier im erfindungsgemäßen Avilamycin-Cluster gefunden worden. Eine denkbare Erklärung könnte die Beteiligung von einer oder mehr Glykosyltransferasen in mehreren Syntheseschritten sein oder die Beteiligung von Glykosyltransferasen, die in Regionen außerhalb dieses Gen-Clusters codiert werden. Drei von vier Glykosyltransferasen erinnern stärker an Glykosyltransferasen für die Biosynthese von O-Antigen- Strukturen oder Zellwandpolysacchariden, was durch die polysaccharidähnliche Struktur von Avilamycinen erklärt werden kann.
Der avi Stoffwechselweg enthält sogar weitere interessante Merkmale: zwei Orthoesterbrücken und eine Methylenbrücke. Unter Berücksichtigung der oxidativen Natur dieser C-O-C-Arrangements dürften die - Ketoglutarat-abhängigen Oxygnasen AviO1 , AviO2 und AviO3 die Bildung dieser seltenen Bindung katalysieren. Es wird daher erfindungsgemäß beschrieben, daß solche Enzyme molekularen Sauerstoff als direkten Elektronenakzeptor für die Oxidation durch den Gebrauch von α- Ketoglutarat als Cosubstrat verwenden und hierdurch schließlich die C-O- C-Bindungen, Succinat und CO2 produzieren. Avilamycin A- Heptasaccharid wird durch Methylierung, durch Ankopplung von Acetat, Ankopplung von Dichloroisoeverninsäure und durch Ankopplung von einer Isobutyryleinheit modifiziert. Sechs Methyltransferase-Gene sind im Cluster vorhanden, was der Zahl nach für die Avilamycin-Biosynthese ausreicht, während die Gene die für die Ankopplung der anderen Reste verantwortlich sind, noch nicht lokalisiert worden sind. Interessanterweise wurde erfindungsgemäß herausgefunden, daß aviB1 und aviB2 solche Enzyme kodieren, die der Alpha- und der Beta-Kette von Komponenten 1 der 2-Oxosäuredehydrogenase-Komplexe ähnlich sind. Diese Komplexe werden normalerweise aus 3 enzymatischen Einheiten zusammengesetzt, nämlich den TPP-abhängigen Dyhydrogenasen (Heterotetramere (0^2), Dihydrolipoamide-Acetyltransferasen (Homomultimere) und
Dihydrolipoamid-Dehydrogenasen (Homodimere). Die ORFs, die für die letztgenannten Komponenten dieser Komplexe kodieren, sind entweder noch nicht lokalisiert worden innerhalb des Clusters, liegen nicht im Cluster oder werden für die Biosynthese von Avilamycinen überhaupt nicht gebraucht.
Weiterhin wurde Gavibamycin A3 auf seine antibiotische Aktivität getestet. Die ersten MIC-Versuche zeigten, daß Gavibamycin A3 etwas stärker gegen verschiedene Staphylococcus aureus-Stämme als Avilamycin A aktiv ist. Darüber hinaus ist es etwas stärker hydrophil als Avilamycin A, wie durch die Retentionsfaktoren aus der DC- und HPLC-Analyse gezeigt wurde. Die nicht-chlorierten Gavibamycin-Derivate sind auch antibiotisch aktiv.
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Claims

Patentansprüche
Avilamycin-Derivat gemäß allgemeiner Formel I, auch in Form seiner Diastereomere oder Enantiomere bzw. razemischer oder anderer Gemische oder reiner Diastereomere und/oder Enantiomere,
Figure imgf000054_0001
, worin unabhängig voneinander mit unten folgender Ausnahme
R1 ausgewählt ist aus H, COCHs, COC H9, COCH(CH3)2 oder COCH2CH3,
R2 ausgewählt ist aus H, CHO, COCH3 oder CH(OH)CH3,
R3 OCH3 entspricht,
R4 Cl entspricht,
R5 Cl entspricht,
R6 CH3 entspricht,
R7 H, CH3 oder CH2OH entspricht, R8 CH3 entspricht
und
R9 CH3 entspricht,
worin in Bezug auf mindestens einen der Reste R3-R6, R8 oder R9 in Formel I abweichend von der voranstehenden Definition folgendes gilt:
R3 ist durch OH zu ersetzen,
R4 ist durch H zu ersetzen,
Rδ ist durch H zu ersetzen,
R6 ist durch H zu ersetzen,
R8 ist durch H zu ersetzen
und/oder
R9 ist durch H zu ersetzen,
mit der Maßgabe, daß R1-R9 nicht gleichzeitig die Bedeutungen gemäß der jeweiligen Kombination in einer der Verbindungen 1 - 4 annehmen können:
Figure imgf000055_0001
Figure imgf000056_0001
Avilamycin-Derivat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens R3 durch OH zu ersetzen ist, mit der Maßgabe, daß R1-R9 nicht gleichzeitig die Bedeutungen gemäß der Kombination in der Verbindung 1 annehmen können:
Figure imgf000056_0002
Avilamycin-Derivat gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens R4 und Rδ in Formel I durch H zu ersetzen sind.
Avilamycin-Derivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens R6, R8 und/oder R9 durch H zu ersetzen ist/sind, mit der Maßgabe, daß R1-R9 nicht gleichzeitig die Bedeutungen gemäß der Kombination in der Verbindung 3 oder nicht gleichzeitig die Bedeutungen gemäß der Kombination in der Verbindung 4 annehmen können:
Figure imgf000056_0003
Avilamycin-Derivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß zum einen mindestens R3 durch OH zu ersetzen ist und zum anderen mindestens R4 und Rδ durch H zu ersetzen sind oder mindestens R6, R8 und/oder R9 durch H zu ersetzen ist/sind. Avilamycin-Derivat gemäß allgemeiner Formel I, auch in Form seiner Diastereomere oder Enantiomere bzw. razemischer oder anderer Gemische oder reiner Diastereomere und/oder Enantiomere, ausgewählt aus Verbindungen, in denen R1-R9 jeweils wie folgt kombiniert sind:
Figure imgf000057_0001
Figure imgf000058_0001
LS
SI860/I0d3/X3d 9Ct890/z0 OΛV
Figure imgf000059_0001
, vorzugsweise
Figure imgf000059_0002
7. Avilamycin-Derivat, dadurch erhältlich, daß in einer kultivierbaren Zelle, die die nötigen Gene bzw. Enzyme zur Synthese eines Orthosomycin-Grundkörpers bestehend aus (a) einem endständigen Dichloroisoeverninsäure-Rest (A in Formel I) und
(b) einem damit veresterten, über normale Esterbindung und Orthoesterbindungen verknüpften Heptasaccharid (B bis H in Formel I) aus:
(i) zwei D-Olivose-Resten (B und C) (ii) einem 2-Desoxy-D-Evalose-Rest (D), (iii) einem D-Fucose-Rest (E), (iv) einem D-Mannose-Rest (F), (v) einem L-Lyxose-Rest (G) und (vi) einem (Methyl-)Eurekanat Rest (H)
aufweist, mindestens eine Nukleinsäure, deren Sequenz zu mindestens 9δ%, vorzugsweise 97%, insbesondere genau, der Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Abbildungen 1 bis 64 entspricht, gentechnologisch verändert, deletiert oder nicht exprimiert wird, die so modifizierte Zelle kultiviert wird, der Kulturüberstand gewonnen und aufgearbeitet wird, das oder die Avilamycin-Derivat/e aufgereinigt und isoliert wird und gegebenenfalls verschiedene Derivate getrennt werden,
mit der Maßgabe, daß R1-R9 nicht gleichzeitig die Bedeutungen gemäß der jeweiligen Kombination in einer der Verbindungen 1 - 16 annehmen können:
Figure imgf000060_0001
Figure imgf000061_0001
8. Avilamycin-Derivat gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die kultivierbare Zelle ausgewählt ist aus einer Zelle vom Typ Streptomyces viridochromogenes oder einer Zelle, die mit Ausnahme der gentechnologisch veränderten, deletierten oder nicht exprimierten Nukleinsäure/n die Nukleinsäuren gemäß einer Sequenz einer der laufenden Nr. 1-δ4 (gemäß Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1) bzw. dazu zu mindestens 9δ%, vorzugsweise 97 %, homologe Nukleinsäuren enthält oder das Gencluster gemäß Abb. 109 enthält, vorzugsweise ausgewählt ist aus einer Zelle vom Typ Streptomyces viridochromogenes, insbesondere einer Zelle vom Typ Streptomyces viridochromogenes Tu 67.
Avilamycin-Derivat gemäß einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die veränderte/n Nukleinsäure/n für eine Methyltransferase und/oder für eine Halogenase kodierte/n.
10. Avilamycin-Derivat gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz en der veränderte/n Nukleinsäure/n vor der Veränderung zu mindestens 96%, vorzugsweise 97%, insbesondere genau, der/den Nukleinsäuresequenz/en mindestens einer der Sequenzen mit laufender Nr. 1 oder 2-7 (gemäß Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1), vorzugsweise einer der Sequenzen mit laufender Nr. 1 , 2, 4 oder 6 (Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1) entspricht, insbesondere der Sequenz mit laufender Nr. 2 oder den Sequenzen mit den laufenden Nr. 2 und Nr. 1 , Nr. 2 und Nr. 4 oder Nr. 2 und Nr. 6 (gemäß Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1).
11. Avilamycin-Derivat gemäß einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Veränderung der Nukleinsäure/n dazu führt, daß das oder die durch die gentechnolgisch veränderte/n Nukleinsäure/n kodierte/n Protein/e oder Polypeptid/e nach der gentechnologischen Veränderung nicht mehr synthetisiert wird/werden.
12. Avilamycin-Derivat, gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, 6 oder 7 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, daß es hydrophiler ist als Avilamycin A oder C bzw. Evernimycin (Ziracin).
13. Nukleinsäure in ihrer Sequenz zu mindestens 9δ%, vorzugsweise 97%, insbesondere genau, entsprechend der Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Sequenzen mit laufender Nr. 1 bis 51 (gemäß Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1).
14. Nukleinsäure gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure zu mindestens 95%, vorzugsweise 97%, insbesondere genau, der Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Sequenzen mit laufender Nr. 1 bis 32 und 48 bis 61 (gemäß Tabelle
1 i.V.m. Abb. 1), vorzugsweise 1 bis 7, insbesondere 1, 2, 4 oder 6, entspricht.
15. Gencluster enthaltend „Open reading frames", vorzugsweise 54, die in ihrer Nukleinsäuresequenz zu mindestens 95%, vorzugsweise
97%, insbesondere genau, den Nukleinsäuresequenzen gemäß den Sequenzen mit laufender Nr. 1 bis 64 (gemäß Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1) entsprechen und die auf einerm Nukleinsäurestrang angeordnet sind, vorzugsweise gemäß Abb. 109.
16. Protein oder Polypeptid in seiner Aminosäuresequenz zu mindestens 95%, vorzugsweise 97%, insbesondere genau, entsprechend der Aminosäuresequenz gemäß einer der Sequenzen mit laufender Nr. 55 - 104 (gemäß Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1).
17. Protein oder Polypeptid gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein oder Polypeptid zu mindestens 95%, vorzugsweise 97%, insbesondere genau, der Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Sequenzen mit laufender Nr. 56 bis 86 (gemäß Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1), vorzugsweise 56 bis
61, insbesondere 55, 56, 58 oder 60, entspricht.
18. Protein oder Polypeptid kodiert durch eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 13 oder 14.
19. Gentechnologisch veränderte Zelle enthaltend mindestens eine nicht endogene Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 13 oder 14, einen nicht-endogenen Gencluster gemäß Anspruch 15 und/oder ein nicht-endogenes Protein oder Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 16-18.
20. Zelle enthaltend mindestens eine gentechnologisch veränderte Nukleinsäure, deren Sequenz vor der Veränderung zu mindestens 95%, vorzugsweise 97%, insbesondere genau, der Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Sequenzen mit laufender
Nr. 1 bis 54 (gemäß Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1) entsprach.
21. Zelle vom Typ Streptomyces viridochromogenes, vorzugsweise vom Subtyp Tü57, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der Nukleinsäuren mit einer Sequenz gemäß einer der Sequenzen mit laufender Nr. 1-54 (gemäß Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1) gentechnologisch verändert oder deletiert wurde.
22. Zelle gemäß Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der Nukleinsäuren mit einer Sequenz gemäß einer der Sequenzen mit laufender Nr. 1 oder 2-7 (gemäß Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1), vorzugsweise mit einer der Sequenzen mit laufender Nr. 1 , 2, 4 oder 6 (Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1), insbesondere mit einer Sequenz mit laufender Nr. 2 oder mit den Sequenzen mit den laufenden Nr. 2 und Nr. 1 , Nr. 2 und Nr. 4 oder Nr. 2 und Nr. 6 (gemäß Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1), gentechnologisch verändert oder deletiert wurde.
23. Zelle gemäß Anspruch 21 vom Mutanten-Typ Streptomyces viridochromogenes GW4, Streptomyces viridochromogenes, GW4- AM1 , Streptomyces viridochromogenes GW2 oder Streptomyces viridochromogenes GW5, dadurch gekennzeichnet, daß vom Mutanten-Typ Streptomyces viridochromogenes GW4 Avilamycin- Derivate synthetisiert werden, in denen R3 = OH ist, vom Mutanten- Typ Streptomyces viridochromogenes GW4-AM1 Avilamycin- Derivate synthetisiert werden, in denen R3 = OH, R4 = H und R5 =
H sind, vom Mutanten-Typ Streptomyces viridochromogenes GW2 Avilamycin-Derivate synthetisiert werden, in denen R3 = OH und R6 = H sind und vom Mutanten-Typ Streptomyces viridochromogenes GW5 Avilamycin-Derivate synthetisiert werden, in denen R3 = OH und R9 = H sind.
24. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 13 oder 14, eines Genclusters gemäß Anspruch 15, eines Proteins oder Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 16 bis 18 und/oder einer Zelle gemäß einem der Ansprüche 19 bis 22 zur Herstellung eines Avilamycin-Derivats, vorzugsweise gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12.
25. Verfahren zur Herstellung von Avilamycin-Derivaten gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 gekennzeichnet durch folgende Schritte:
(1) in einer kultivierbaren Zelle, die die nötigen Gene bzw. Enzyme zur Synthese des Orthosomycin-Grundkörpers bestehend aus
(a) einem endständigen Dichloroisoeverninsäure-Rest (A in Formel I) und
(b) einem damit veresterten, über normale Esterbindung und Orthoesterbindungen verknüpften Heptasaccharid (B bis H in Formel I) aus:
(i) zwei D-Olivose-Resten (B und C) (ii) einem 2-Desoxy-D-Evalose-Rest (D), (iii) einem D-Fucose-Rest (E), (iv) einem D-Mannose-Rest (F), (v) einem L-Lyxose-Rest (G) und (vi) einem (Methyl-)Eurekanat Rest (H)
aufweist, wird mindestens eine Nukleinsäure, deren Sequenz zu mindestens 95%, vorzugsweise 97%, insbesondere genau, der Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Sequenzen mit laufenden Nr. 1 bis 54 (gemäß Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1) entspricht, gentechnologisch verändert, deletiert oder nicht exprimiert,
(2) die so gentechnologisch veränderte Zelle wird kultiviert, (3) der Kulturüberstand wird gewonnen,
(4) der Kulturüberstand wird aufgearbeitet und dabei das oder die entstandene/n Avilamycin-Derivat/e aufgereinigt und isoliert, (6) gegebenenfalls werden unterschiedliche Derivate getrennt.
26. Verfahren gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die kultivierbare Zelle ausgewählt ist aus einer Zelle vom Typ Streptomyces viridochromogenes oder einer Zelle, die mit Ausnahme der gentechnologisch veränderten, deletierten oder nicht exprimierten Nukleinsäure die Nukleinsäuren gemäß einer Sequenz mit laufender Nr. 1-54 (gemäß Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1) bzw. dazu zu mindestens 95%, vorzugsweise 97 %, homologe Nukleinsäuren enthält oder den Gencluster gemäß Anspruch 14 enthält, vorzugsweise ausgewählt ist aus einer Zelle vom Typ Streptomyces viridochromogenes, insbesondere einer Zelle vom Typ Streptomyces viridochromogenes Tu 57.
27. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, daß die veränderte/n Nukleinsäure/n für eine Methyltransferase und/oder für eine Halogenase kodiert/en.
28. Verfahren gemäß Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz/en der veränderte/n Nukleinsäure/n vor der Veränderung zu mindestens 95%, vorzugsweise 97%, insbesondere genau, der/den Nukleinsäuresequenz/en mindestens einer der Sequenzen mit laufender Nr. 1 oder 2-7 (gemäß Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1), vorzugsweise einer der Sequenzen mit laufender Nr. 1, 2, 4 oder 6 (Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1) entspricht, insbesondere der Sequenz mit laufender Nr. 2 oder den Sequenzen mit den laufenden Nr. 2 und Nr. 1 , Nr. 2 und Nr. 4 oder Nr. 2 und Nr. 6 (gemäß Tabelle 1 i.V.m. Abb. 1).
29. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 26 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Veränderung der Nukleinsäure/n dazu führt, daß das oder die durch die gentechnolgisch veränderte/n Nukleinsäure/n kodierte/n Protein/e oder Polypeptid/e nach der gentechnologischen Veränderung nicht mehr synthetisiert wird/werden.
30. Arzneimittel enthaltend Avilamycin-Derivate gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 sowie gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe.
31. Verwendung eines Avilamycin-Derivats gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Herstellung eines Arzneimittels mit antibiotischer Wirkung zur Behandlung bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Erkrankungen, bspw.
Infektionskrankheiten.
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