DE19957268A1 - Nucleinsäuren, die für Enzymaktivitäten der Spinosyn-Biosynthese kodieren - Google Patents
Nucleinsäuren, die für Enzymaktivitäten der Spinosyn-Biosynthese kodierenInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleinsäuren, die für Enzymaktivitäten der Spinosyn-Biosynthese codieren, sowie die entsprechenden Enzyme per se. Weiterhin betrifft die Erfindung Verfahren zum Herstellen von Spinosyn-Derivaten und -Vorstufen.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleinsäuren, die für Enzymaktivitäten der
Spinosyn-Biosynthese codieren, sowie die entsprechenden Enzyme per se.
Spinosyne stellen eine neue Gruppe von makrolidischen Verbindungen dar, die aus
dem Actinomyceten Saccharopolyspora spinosa isoliert worden sind (Mertz und
Yao, 1990). Sie werden zur Bekämpfung von Insekten eingesetzt (WO 97/00265,
WO 94/20518, WO 93/09126, US 5670364, US 5362634, US 5227295, US 5202242).
Spinosyne zeigen eine starke insektizide, jedoch keine antibakterielle
Aktivität, wodurch sie von den konventionellen Makroliden, wie Tylosin,
Spiramycin und Erythromycin, die keine insektizide, jedoch antimikrobielle Wirk
samkeit aufweisen, unterscheidbar sind.
Die Struktur der Spinosyne setzt sich zusammen aus einem tetracyclischen Poly
ketidgrundgerüst (Aglycon) mit einem 12gliedrigen Makrolidring und einem 5,6,5-
cis-anti-trans-Tricyclus, sowie einem D-Forosamin- und einem 2,3,4-Tri-O-Methyl-
L-Rhamnose-Zuckeranteil (Kirst et al., 1991). Mehr als 20 verschiedene natürliche
Spinosyn-Derivate, der sogenannte A83543 Komplex, ist bisher beschrieben worden
(WO 97/00265, WO 94/20518, WO 93/09126). Diese Derivate variieren in der Sub
stitution von einer oder einigen Methylgruppen am tetracyclischen Grundgerüst, am
Forosamin- oder am Tri-Methyl-Rhamnose-Zuckeranteil. Ein 17-Pseudoaglycon,
dem der Forosamin-Zuckeranteil fehlt, ist ebenfalls aus Kulturbrühen von S. spinosa
isoliert worden.
Die Hauptkomponenten des von S. spinosa gebildeten A83543 Komplexes stellen die
Varianten Spinosyn A und Spinosyn D dar, die die wesentlichen Bestandteile des
Produktes Spinosad darstellen (vgl. Pesticide Manual, British Crop Protection
Council, 11th Ed., 1997, Seite 1272 und Dow Elanco trade maganzine Down to Earth,
Vol. 52, NO:. 1, 1997 und die darin zitierte Literatur).
Aufbauend auf Untersuchungen zum Einbau von C13-markiertem Acetat, Propionat,
Butyrat oder Isobutyrat konnte gezeigt werden, dass die Biosynthese von A83543
einem Polyketid-Biosyntheseweg folgt (Nakatsukasa et al., 1990). Polyketide werden
durch multifunktionelle Enzyme, den sog. Polyketidsynthasen (PKS's) aus kurz
kettigen Säurebausteinen wie Acetat, Propionat oder Butyrat aufgebaut. Ähnlich wie
die verwandten Fettsäuresynthasen (FAS's) katalysieren sie decarboxylierende Poly
kondensationsschritte der als CoA-Thioester aktivierten Bausteine. Während FAS's
nach jedem Kondensationsschritt eine vollständige Reduktion der intermediär an der
wachsenden Polyketidkette entstehenden β-Oxoester durch Ketoreduktion, Dehy
dratation und Enoylreduktion katalysieren, können PKS's bestimmte Reduktions
schritte auslassen. Modulare Typ I PKS's bestehen aus einem oder mehreren großen
multifunktionalen Proteinen. Iterative Typ II PKS's stellen dagegen einen Komplex
aus weitgehend monofunktionalen Proteinen dar.
Die enzymatischen Aktivitäten von modularen Typ I PKS's lassen sich zu soge
nannten Modulen zusammenfassen. Hierbei trägt ein Modul eine Anordnung von drei
enzymkatalytisch aktiven Domänen, die zu einer Verlängerung der wachsenden Poly
ketidkette um eine biosynthetische Verlängerungseinheit führen. Bei diesen
Domänen handelt es sich um eine β-Ketoacyl : Acyl Carner Protein Synthase-
Domäne, eine Acyltransferase-Domäne und eine β-Ketoacyl : Acyl Carrier Protein-
Domäne. Ein Modul kann auch eine Ketoreduktase-, eine Dehydratase-, eine Enoyl
reduktase- und eine Thioesterase-Domäne tragen. Ein sog. Ladungsmodul, das am
Beginn der Biosynthese steht kann von den genannten Domänen lediglich eine Acyl
transferase-Domäne und eine β-Ketoacyl : Acyl-Carrier Protein-Domäne tragen, sowie
eine enzymatisch inaktive β-Ketoacyl : Acyl Carrier Protein Synthase-Domäne. Eine
Polyketidsynthase-Domäne umfasst jeweils eine dieser genannten enzymatischen
Aktivitäten.
Aufgrund der potenten insektiziden Wirkung sowie der bemerkenswerten Struktur
der Spinosyne besteht ein großes Interesse, die genetischen Informationen für deren
Biosynthese zu entschlüsseln.
Gegenstand der Erfindung sind Nucleinsäuren, welche zumindest eine Region um
fassen, die für eine Enzymaktivität codiert, welche an der Biosynthese von
Spinosynen beteiligt ist.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Cluster von offenen Leserahmen (ORF's) bereit,
deren Translationsprodukte an der Biosynthese von Spinosynen beteiligt sind.
Weiterhin werden zusätzliche Gene bzw. ORF's bereitgestellt, die außerhalb des ca.
120 kb großen Spinosyn-Biosyntheseclusters liegen, und deren Translationsprodukte
an der Rhamnose-Zuckerbiosynthese beteiligt sind.
Bei den erfindungsgemäßen Nucleinsäuren handelt es sich insbesondere um einzel
strängige oder doppelsträngige Desoxyribonucleinsäuren (DNA) oder Ribonuclein
säuren (RNA). Bevorzugte Ausführungsformen sind Fragmente genomischer DNA
und cDNA's.
Der Ausdruck "zumindest eine Region", wie er hierin verwendet wird, bedeutet, dass
die erfindungsgemäße Nucleinsäure eine oder mehrere Sequenzen umfassen kann,
welche jeweils für einzelne Aktivitäten codieren, die Schritte bei der Synthese von
Spinosynen durchführen. Es werden demnach auch Nucleinsäuren als erfindungsge
mäß betrachtet, die nur für eine einzige Enzymaktivität der Spinosyn-Biosynthese
codieren.
Der Ausdruck "Enzymaktivität", wie er hierin verwendet wird, bedeutet, dass
ausgehend von den hierin betrachteten Nucleinsäuren zumindest derjenige Teil eines
vollständigen Enzyms exprimiert werden kann, der noch die Katalyseeigenschaften
des Enzyms ausübt.
Insbesondere codieren die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren für Enzymaktivitäten
von Polyketidsynthasen, Methyltransferasen, Epimerasen, Glycosyltransferasen,
Aminotransferasen, Dimethyltransferasen, Reduktasen, Dehydratasen und/oder
Cyclisierungsenzymen.
Bevorzugt handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Nucleinsäuren um DNA-
Fragmente, die genomischer DNA von S. spinosa entsprechen.
Besonders bevorzugt umfassen die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren zumindest
eine Sequenz ausgewählt aus
- a) den Sequenzen gemäß SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 52 oder 54,
- b) zumindest 14 Basenpaare langen Teilsequenzen der unter (a) defi nierten Sequenzen,
- c) Sequenzen, welche an die unter (a) definierten Sequenzen hybri disieren,
- d) Sequenzen, welche eine zumindest 70%ige, bevorzugt eine 80%ige, besonders bevorzugt eine 90%ige Identität zu den unter (a) definier ten Sequenzen aufweisen,
- e) Sequenzen, welche zu den unter (a) definierten Sequenzen komple mentär sind, und
- f) Sequenzen, welche aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes für dieselbe Aminosäuresequenz kodieren wie die unter (a) bis (d) definierten Sequenzen.
Der Ausdruck "hybridisieren", wie er hierin verwendet wird, beschreibt den Vor
gang, bei welchem ein einzelsträngiges Nucleinsäuremolekül mit einem komple
mentären Strang eine Basenpaarung eingeht. Auf diese Weise können beispielsweise
ausgehend von genomischer DNA aus Organismen, die phylogenetisch mit S.
spinosa verwandt sind und die Fähigkeit der Biosynthese von Spinosynen besitzen,
DNA-Fragmente isoliert werden, welche dieselben Eigenschaften wie die aus S.
spinosa isolierten Fragmente aufweisen.
Bevorzugte Hybridisierungsbedingungen sind nachstehend angegeben: Hybridisie
rungslösung: 5 × SSC; Blocking Reagens (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,
Deutschland), 1%; N-Lauroylsarcosin, 0,1%; SDS (Sodiumdodecylsulfate) 0,02%;
Hybridisierungstemperatur: 60°C; erster Waschschritt: 2 × SSC bei 60°C; zweiter
Waschschritt: 2 × SSC bei 60°C; bevorzugt zweiter Waschschritt: 0,5 × SSC bei
60°C; besonders bevorzugt zweiter Waschschritt: 0,2 × SSC bei 60°C.
Der Grad der Identität der Nucleinsäuren wird vorzugsweise bestimmt mit Hilfe des
Programms GAP aus dem Programmpaket GCG (Devereux et al., 1984), Version 9.1
unter Standardeinstellungen.
Besonders hervorgehoben werden Nucleinsäuren, die
- 1. entweder alle Sequenzen, die für Schritte der Forosamin- und Trimethyl- Rhamnose-Biosynthese codieren, umfassen, insbesondere die Sequenzen ge mäß SEQ ID NOS: 4 und 51, oder
- 2. alle Sequenzen, die für Schritte der Polyketidsynthese codieren, umfassen, insbesondere die Sequenzen gemäß SEQ ID NOS: 5 und 6, oder
- 3. alle Sequenzen, die für alle Schritte der Forosamin-, Trimethyl-Rhamnose- und Polyketidsynthese codieren, umfassen, insbesondere die Sequenzen ge mäß SEQ ID NOS: 1, 2, 3 und 51.
Alle zur Spinosyn-Biosynthese oder zur Synthese von Vorstufen, wie sie nach
stehend definiert sind, benötigten DNA-Sequenzen können sich somit auf einem
einzelnen Vektor befinden. Diese Nucleinsäuren können aber auch auf zwei oder
mehreren Vektoren vorliegen und gleichzeitig oder nacheinander in einer Wirtszelle
exprimiert werden.
Alle ORF's der erfindungsgemäßen Nucleinsäuren können von ihren eigenen Pro
motoren oder von heterologen Promotoren angeschaltet werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch die regulatorischen Regionen,
welche natürlicherweise, d. h. im Ursprungsorganismus S. spinosa, die Transkription
der erfindungsgemäßen Nucleinsäuren kontrollieren.
Der Ausdruck "regulatorische Regionen", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich
auf Promotoren, Repressor- oder Aktivator-Bindungsstellen, Repressor- oder Akti
vatorsequenzen, und Terminatoren. Ferner sind genetisch mobile Elemente, welche
natürlicherweise, d. h. im Ursprungsorganismus S. spinosa vorkommen, ebenfalls von
diesem Ausdruck umfasst. Solche genetisch mobilen Elemente können transposable
oder mobilisierbare Elemente oder funktionelle Teile davon, IS-Elemente oder an
dere Insertionselemente sein. Weiterhin sind auch amplifizierbare DNA-Elemente
(Ampliflable Units of DNA, AUD; Fishman and Hershberger, 1983), welche natür
licherweise, d. h. im Ursprungsorganismus S. spinosa vorkommen, von diesem Aus
druck umfasst. Die Erfindung betrifft auch jede Kombination dieser regulatorischen
Regionen untereinander oder mit heterologen DNA-Fragmenten, wie z. B. Promo
toren, Repressor oder Aktivator-Bindungsstellen, transposablen, mobilisierbaren oder
transduzierbaren Elementen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin DNA-Konstrukte, die zu
mindest eine erfindungsgemäße Nucleinsäure und einen heterologen Promotor um
fassen.
Der Ausdruck "heterologer Promotor", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf
einen Promotor, der im Ursprungsorganismus nicht die Expression des betreffenden
Gens (ORF's) kontrolliert.
Die Auswahl von heterologen Promotoren ist davon abhängig, ob zur Expression
pro- oder eukaryotische Zellen oder zellfreie Systeme verwendet werden. Ein bevor
zugtes Beispiele für einen heterologen Promotor ist der Promotor des mel-Gens aus
dem Vektor pIJ702 (The John Innes Foundation, Norwich, UK 1985). Die heterologe
Expression kann z. B. eingesetzt werden, um zu einer Steigerung der Produktion von
Spinosyn im Vergleich zum natürlichen Spinosyn-Produzenten zu gelangen.
Gegenstand der Erfindung sind ferner Vektoren, die zumindest eine der erfindungs
gemäßen Nucleinsäuren enthalten. Als Vektoren können alle in molekularbio
logischen Laboratorien verwendeten Phagen, Plasmide, Phagmide, Phasmide,
Cosmide, YACs, BACs, PACs, künstliche Chromosomen oder Partikel, die für einen
Partikelbeschuss geeignet sind, verwendet werden.
Bevorzugt sind BAC-Vektoren. BAC-Vektoren (Bacterial Artificial Chromosome)
sind entwickelt worden zur Klonierung von großen DNA-Fragmenten (Shizuya et al.,
1992). Es handelt sich um "single-copy" Plasmide mit einem F-Faktor Origin, die
DNA-Fragmente mit einer durchschnittlichen Größe von 120 Kilobasenpaaren (kb)
tragen können. Sie sind replizierbar in Escherichia coli. Der BAC-Vektor
pBeloBAC11 (Kim et al., 1996) trägt einen T7 und einen SP6 Promotor, welche die
Klonierungsstelle flankieren und als Startbereich für Sequenzierungsprimer sowie
zur Generierung von RNA-Transkripten verwendet werden können.
Besonders bevorzugt sind die am 20. August 1999 bei der Deutschen Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, D-38124
Braunschweig, in Übereinstimmung mit den Bestimmungen des Budapester Ver
trages unter den Hinterlegungsnummern DSM 13010, DSM 13011 und DSM 13012
hinterlegten BAC-Shuttleklone, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind.
Die hinterlegten BAC-Shuttleklone P11/G6, P8/G11 und P11/B10 tragen jeweils ein
mindestens 100 kb großes DNA-Fragment aus S. spinosa. Die Klone P11/G6 und
P11/B10 tragen jeweils einen Teil der Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 4,
sowie die angrenzenden vollständigen Nucleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NOS:
5 und 6, sowie einen an die Nucleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 6 3'-angrenzende
DNA-Bereich (Abb. 7). Der Klon P8/G11 trägt einen Teil der Nucleinsäuresequenz
gemäß SEQ ID NO: 6, die vollständigen Nucleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID
NOS: 5 und 4, sowie einen an die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 4 3'-angrenzenden
DNA-Bereich (Abb. 7).
In gleicher Weise sind auch PAC- und alle anderen funktionell gleichwertigen
Vektoren, die es erlauben, große DNA-Fragmente, insbesondere solche DNA-
Fragmente, die größer als 30 kb, vorzugsweise größer als 40 kb, besonders bevorzugt
größer als 60 kb sind, in heterologe Wirtszellen zu übertragen und dort eine
Etablierung von Fremd-DNA zu gewährleisten, für eine Spinosyn-Produktion ge
eignet. Vorzugsweise werden solche BAC-, PAC- und funktionell gleichwertigen
Vektoren verwendet, die zu einem Shuttle-Vektor modifiziert sind und z. B. eine
Plasmidreplikation sowohl in Gramnegativen Bakterien, wie Escherichia coli, als
auch in Gram-positiven Bakterien, wie Streptomyces, erlauben. Solche bevorzugten
Shuttle-Vektoren können DNA-Fragmente einer Größe tragen, die in üblichen
Vektoren, wie z. B. Cosmidvektoren, nicht klonierbar sind und nicht in heterologe
Wirte, wie Actinomyceten, z. B. Streptomyceten, übertragbar sind. Letztere Vektoren
können sowohl durch Transformation, Konjugation, Elektroporation, Protoplasten
transformation oder andere geeignete Verfahren übertragen werden. In hervor
ragender Weise sind solche Shuttle-Vektoren innerhalb einer heterologen Population
Gram-negativer oder Gram-positiver Bakterien, zwischen Gram-positiven und Gram
negativen Bakterien, zwischen Bakterien und Archea, zwischen Pro- und
Eukaryonten konjugativ übertragbar. Die in heterologe Wirte, wie z. B.
Streptomyceten, übertragenen BAC-, PAC- oder funktionell gleichwertigen Shuttle-
Vektoren können autonom repliziert werden oder ins Genom des Wirtes integriert
werden. Letztere Integration kann über homologe Rekombination, über einen ΦC31-
Integrationsmechanismus (Hopwood et al., 1985), über ortsspezifische Integration,
die von pSAM2 (Smokvina et al., 1990; WO 95/16046) determinierten Funktionen
abhängt oder über Mini-Circle vermittelte Funktionen (Motamedi et al., 1995;
WO 96/00282) erfolgen.
Solche Shuttle-Vektoren erlauben es, spezifische, durch außerordentlich große DNA-
Bereiche determinierte Biosynthesewege von Primär- oder Sekundärmetaboliten,
durch Transfer eines einzigen rekombinanten Vektors heterolog in besonders ge
eigneten Wirtszellen zu exprimieren. So kann das identifizierte Cluster für die Bio
synthese von Spinosyn in Organismen, wie Actinomyceten, z. B. Streptomyces, durch
Transfer eines einzigen rekombinanten Shuttle-Vektors ausgeprägt werden. Aufgrund
der Größe dieses Biosyntheseclusters ist diese heterologe Expression der Spinosyn-
Biosynthese mit einem einzigen Cosmidvektor nicht möglich. Die Übertragung eines
rekombinanten BAC-, PAC- oder funktionell gleichwertigen Shuttle-Vektors, der die
erfindungsgemäßen Nucleinsäuren trägt, kann zu einer signifikanten Steigerung der
Produktion von Spinosyn im Vergleich zur Spinosyn-Produktion des Stammes S.
spinosa oder abgeleiteter Mutanten mit erhöhter Spinosyn-Bildung führen. Zudem
kann ein solcher, für die Spinosyn-Biosynthese codierender Shuttle-Vektor genutzt
werden, um nach Übertragung in heterologe Wirtszellen deren Biosynthese- und
Modifizierungsleistung auszunutzen, um zu einer signifikanten Modifizierung von
Spinosyn oder Spinosyn-Biosynthesevorstufen zu gelangen. Hierdurch ist es zudem
möglich, neue Spinosyn-Derivate durch den Transfer eines einzigen rekombinanten
Vektors in heterologe Wirtszellen herzustellen.
Weiterhin können solche Shuttle-Vektoren verwendet werden, klonierte Biosynthese
wege von Sekundärmetaboliten als Bestandteil eines einzigen rekombinanten
Shuttle-Vektors genetisch zu modifizieren. Solche Modifizierungen können z. B. in
einem E. coli Wirt durchgeführt werden, z. B. unter Ausnutzung von Re
kombinationsereignissen unter Beteiligung des recA-Genproduktes oder der recE-
und recT-Genprodukte (Muyrers et al., 1999). Weiterhin können solche Vektoren
durch in vitro-Verfahren, wie z. B. das Template Generation System (Finnzymes,
FIN-02201, Espoo, Finnland) oder das Transposomics-System (Epicentre
Technologies, Biozym Diagnostika GmbH, Oldendorf, Deutschland) modifiziert
werden. Solche, für veränderte Biosynthesewege codierende Shuttle-Vektoren
können dann in geeignete Wirtszellen übertragen werden, um zur Produktion ver
änderter Sekundärmetabolite zu gelangen. In analoger Weise können die genannten
Shuttle-Vektoren genutzt werden, die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren zu modifi
zieren, um sie dann, nach Transfer in geeignete Wirtszellen zur Produktion ver
änderter Spinosyne einzusetzen.
Teile der erfindungsgemäßen Nucleinsäuren können auch als Bestandteil von zwei
oder mehreren Vektoren, wie z. B. Cosmidvektoren, eine genetische Information
determinieren, die in Kombination miteinander zur Biosynthese von Spinosyn oder
Spinosyn-Vorstufen, wie z. B. Pseudoaglycon oder Spinosyn-Aglycon geeignet sind.
Solche Kombinationen von rekombinanten Vektoren können eingesetzt werden, um
zu einer Spinosyn-Produktion in anderen Organismen als S. spinosa zu gelangen.
Dies kann bei einer Expression in besonders geeigneten Wirten zu einer signifikanten
Steigerung der Spinosyn-Produktion im Vergleich zu S. spinosa oder abgeleiteten
produktionsverstärkten Mutanten führen. Weiterhin ist es möglich, erfindungsge
mäße Nucleinsäuren in einzelnen rekombinanten Vektoren dieser Vektorkombination
so zu verändern, dass eine heterologe Produktion von Spinosyn-Derivaten in Wirts
zellen möglich ist. Desweiteren kann eine solche Kombination von rekombinanten
Vektoren durch deren Transfer in heterologe Wirte zur Bildung neuer Spinosyn-
Derivate unter Ausnutzung des wirtseigenen Enzymsystems geeignet sein.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Wirtszellen, die zumindest eine
der erfindungsgemäßen Nucleinsäuren enthalten. Als Wirtszelle eignen sich sowohl
prokaryotische Zellen, vorzugsweise Actinomyceten, besonders bevorzugt Strepto
myceten, als auch eukaryotische Zellen, wie Säugerzellen, Pflanzenzellen oder Hefe
zellen.
In besonderer Weise können die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren in pflanzliche
Zellen übertragen und exprimiert werden. Hierdurch können transgene Pflanzen her
gestellt werden, die das pflanzenschützende, insektizide Spinosyn bzw. Derivate da
von produzieren. Eine Übertragung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuren in die
Pflanzenzellen oder pflanzliche Zellkulturen kann mit üblichen Verfahren u. a. auch
durch Partikelbeschuss erfolgen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin die Polypeptide, die von den
erfindungsgemäßen Nucleinsäuren codiert werden. Die erfindungsgemäßen Poly
peptide können ein vollständiges Enzym darstellen, das einen Schritt der Spinosyn-
Biosynthese katalysiert. Jedoch sind auch solche Polypeptide von der Erfindung er
fasst, die nur einen Teil der vollständigen Aminosäuresequenz des betreffenden
Enzyms aufweisen.
Der Ausdruck "Teilsequenz", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich somit auf die
Aminosäuresequenz eines Polypeptids, das noch die Aktivität des entsprechenden
vollständigen Enzyms oder einer enzymatisch aktiven Domäne ausüben kann.
Im Folgenden werden bevorzugte erfindungsgemäße Nucleinsäuren und Polypeptide
mit Bezug auf die entsprechenden SEQ ID NOS näher charakterisiert.
SEQ ID NOS: 7 und 8, ORF1:
Nucleotidposition 828 bis 1 der SEQ ID NO: 4, 275 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt ist eine Methyltransferase.
Nucleotidposition 828 bis 1 der SEQ ID NO: 4, 275 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt ist eine Methyltransferase.
SEQ ID NOS: 9 und 10, ORF2:
Nucleotidposition 1.283 bis 2.455 der SEQ ID NO: 4, 390 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt ist eine Glycosyltransferase.
Nucleotidposition 1.283 bis 2.455 der SEQ ID NO: 4, 390 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt ist eine Glycosyltransferase.
SEQ ID NOS: 11 und 12, ORF3:
Nucleotidposition 2.495 bis 3.247 der SEQ ID NO: 4, 250 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt ist eine Methyltransferase.
Nucleotidposition 2.495 bis 3.247 der SEQ ID NO: 4, 250 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt ist eine Methyltransferase.
SEQ ID NOS: 13 und 14, ORF4:
Nucleotidposition 4.440 bis 3.253 der SEQ ID NO: 4, 395 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt ist eine Methyltransferase.
Nucleotidposition 4.440 bis 3.253 der SEQ ID NO: 4, 395 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt ist eine Methyltransferase.
SEQ ID NOS: 15 und 16, ORF5:
Nucleotidposition 4.578 bis 6.197 der SEQ ID NO: 4, 539 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt ist ein C-C verknüpfendes Enzym, das Cyclisierungs reaktionen durchführt.
Nucleotidposition 4.578 bis 6.197 der SEQ ID NO: 4, 539 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt ist ein C-C verknüpfendes Enzym, das Cyclisierungs reaktionen durchführt.
SEQ ID NOS: 17 und 18, ORF6:
Nucleotidposition 6.211 bis 7.404 der SEQ ID NO: 4, 397 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt ist eine Methyltransferase.
Nucleotidposition 6.211 bis 7.404 der SEQ ID NO: 4, 397 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt ist eine Methyltransferase.
SEQ ID NOS: 19 und 20, ORF7:
Nucleotidposition 7.401 bis 8.300 der SEQ ID NO: 4, 299 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt ist eine Methyltransferase.
Nucleotidposition 7.401 bis 8.300 der SEQ ID NO: 4, 299 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt ist eine Methyltransferase.
SEQ ID NOS: 21 und 22, ORF8:
Nucleotidposition 8.300 bis 9.466 der SEQ ID NO: 4, 388 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt ist ein Enzym, das an Cyclisierungsreaktionen beteiligt ist.
Nucleotidposition 8.300 bis 9.466 der SEQ ID NO: 4, 388 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt ist ein Enzym, das an Cyclisierungsreaktionen beteiligt ist.
SEQ ID NOS: 23 und 24, ORF9:
Nucleotidposition 10.572 bis 9.562 der SEQ ID NO: 4, 336 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt ist eine 2,3-Reduktase.
Nucleotidposition 10.572 bis 9.562 der SEQ ID NO: 4, 336 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt ist eine 2,3-Reduktase.
SEQ ID NOS: 25 und 26, ORF 10:
Nucleotidposition 12.029 bis 10.569 der SEQ ID NO: 4, 486 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt ist eine 2,3-Dehydratase.
Nucleotidposition 12.029 bis 10.569 der SEQ ID NO: 4, 486 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt ist eine 2,3-Dehydratase.
SEQ ID NOS: 27 und 28, ORF11:
Nucleotidposition 12.549 bis 12.109 der SEQ ID NO: 4, 146 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt hat Homologien zu einer Thioesterase.
Nucleotidposition 12.549 bis 12.109 der SEQ ID NO: 4, 146 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt hat Homologien zu einer Thioesterase.
SEQ ID NOS: 29 und 30, ORF12:
Nucleotidposition 13.865 bis 12.546 der SEQ ID NO: 4, 439 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt ist eine Glykosyltransferase.
Nucleotidposition 13.865 bis 12.546 der SEQ ID NO: 4, 439 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt ist eine Glykosyltransferase.
SEQ ID NOS: 31 und 32, ORF13:
Nucleotidposition 14.245 bis 15.633 der SEQ ID NO: 4, 462 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt ist eine 3,4-Dehydratase.
Nucleotidposition 14.245 bis 15.633 der SEQ ID NO: 4, 462 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt ist eine 3,4-Dehydratase.
SEQ ID NOS: 33 und 34, ORF14:
Nucleotidposition 15.671 bis 16.828 der SEQ ID NO: 4, 385 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt ist eine 4-Aminotransferase.
Nucleotidposition 15.671 bis 16.828 der SEQ ID NO: 4, 385 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt ist eine 4-Aminotransferase.
SEQ ID NO: 35 und 36, ORF 15:
Nucleotidposition 16.831 bis 17.580 der SEQ ID NO: 4, 249 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt ist eine N-Dimethyltransferase.
Nucleotidposition 16.831 bis 17.580 der SEQ ID NO: 4, 249 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt ist eine N-Dimethyltransferase.
SEQ ID NOS: 37 und 38, ORF16:
Nucleotidposition 18.930 bis 18.205 der SEQ ID NO: 4, 241 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt ist eine 3,4-Reduktase.
Nucleotidposition 18.930 bis 18.205 der SEQ ID NO: 4, 241 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt ist eine 3,4-Reduktase.
SEQ ID NOS: 39 und 40, ORF17:
Nucleotidposition 19.025-19.861 der SEQ ID NO: 4, 278 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt ist ein Transkriptions-Regulator.
Nucleotidposition 19.025-19.861 der SEQ ID NO: 4, 278 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt ist ein Transkriptions-Regulator.
SEQ ID NOS: 41 und 42, ORF18:
Nucleotidpositionen 116-7903 der SEQ ID NO: 5, Aminosäurepositionen 1 bis 2595:
Nucleotidpositionen 128-1402, Aminosäure Positionen 5-429 codieren eine β- Ketoacyl : Acyl Carrier Protein Synthase-Domäne;
Nucleotidpositionen 1691-2656, Aminosäurepositionen 526-847 codieren eine Acyltransferase-Domäne;
Nucleotidpositionen 2798-3052, Aminosäurepositionen 895-979 codieren eine β- Ketoacyl : Acyl Carrier Protein-Domäne;
Nucleotidpositionen 3107-4372, Aminosäurepositionen 998-1419 codieren eine β- Ketoacyl : Acyl Carrier Protein Synthase-Domäne;
Nucleotidpositionen 4688-5662, Aminosäurepositionen 1525-1849 codieren eine Acyltransferase-Domäne;
Nucleotidpositionen 6587-7138, Aminosäurepositionen 2158-2341 codieren eine Ketoreduktase-Domäne;
Nucleotidpositionen 7409-7666, Aminosäurepositionen 2432-2517 codieren eine β- Ketoacyl : Acyl Carrier Protein-Domäne.
Nucleotidpositionen 116-7903 der SEQ ID NO: 5, Aminosäurepositionen 1 bis 2595:
Nucleotidpositionen 128-1402, Aminosäure Positionen 5-429 codieren eine β- Ketoacyl : Acyl Carrier Protein Synthase-Domäne;
Nucleotidpositionen 1691-2656, Aminosäurepositionen 526-847 codieren eine Acyltransferase-Domäne;
Nucleotidpositionen 2798-3052, Aminosäurepositionen 895-979 codieren eine β- Ketoacyl : Acyl Carrier Protein-Domäne;
Nucleotidpositionen 3107-4372, Aminosäurepositionen 998-1419 codieren eine β- Ketoacyl : Acyl Carrier Protein Synthase-Domäne;
Nucleotidpositionen 4688-5662, Aminosäurepositionen 1525-1849 codieren eine Acyltransferase-Domäne;
Nucleotidpositionen 6587-7138, Aminosäurepositionen 2158-2341 codieren eine Ketoreduktase-Domäne;
Nucleotidpositionen 7409-7666, Aminosäurepositionen 2432-2517 codieren eine β- Ketoacyl : Acyl Carrier Protein-Domäne.
SEQ ID NOS: 43 und 44, ORF19:
Nucleotidpositionen 7921-14379 der SEQ ID NO: 5, Aminosäurepositionen 1 bis 2152:
Nucleotidpositionen 8029-9318, Aminosäurepositionen 37-466 codieren eine β- Ketoacyl : Acyl Carrier Protein Synthase-Domäne;
Nucleotidpositionen 9634-10608, Aminosäurepositionen 572-896 codieren eine Acyltransferase-Domäne;
Nucleotidpositionen 10705-11259, Aminosäurepositionen 929-1113 codieren eine Dehydratase-Domäne;
Nucleotidpositionen 12043-13080, Aminosäurepositionen 1375-1720 codieren eine Enoylreduktase-Domäne;
Nucleotidpositionen 7921-14379 der SEQ ID NO: 5, Aminosäurepositionen 1 bis 2152:
Nucleotidpositionen 8029-9318, Aminosäurepositionen 37-466 codieren eine β- Ketoacyl : Acyl Carrier Protein Synthase-Domäne;
Nucleotidpositionen 9634-10608, Aminosäurepositionen 572-896 codieren eine Acyltransferase-Domäne;
Nucleotidpositionen 10705-11259, Aminosäurepositionen 929-1113 codieren eine Dehydratase-Domäne;
Nucleotidpositionen 12043-13080, Aminosäurepositionen 1375-1720 codieren eine Enoylreduktase-Domäne;
Nucleotidpositionen 13093-13635, Aminosäurepositionen 1725-1905 codieren eine
Ketoreduktase-Domäne;
Nucleotidpositionen 13885-14142, Aminosäurepositionen 1989-2074 codieren eine β-Ketoacyl : Acyl Carrier Protein-Domäne.
Nucleotidpositionen 13885-14142, Aminosäurepositionen 1989-2074 codieren eine β-Ketoacyl : Acyl Carrier Protein-Domäne.
SEQ ID NOS: 45 und 46, ORF20:
Nucleotidpositionen 14424-23936 der SEQ ID NO: 5, Aminosäurepositionen 1 bis 3170:
Nucleotidpositionen 14523-15824, Aminosäurepositionen 34-467 codieren eine β- Ketoacyl : Acyl Carrier Protein Synthase-Domäne;
Nucleotidpositionen 16110-17075, Aminosäurepositionen 563-884 codieren eine Acyltransferase-Domäne;
Nucleotidpositionen 17997-18536, Aminosäurepositionen 1192-1371 codieren eine Ketoreduktase-Domäne;
Nucleotidpositionen 18795-19052, Aminosäurepositionen 1458-1543 codieren eine β-Ketoacyl : Acyl Carrier Protein-Domäne;
Nucleotidpositionen 19107-20387, Aminosäurepositionen 1562-1988 codieren eine β-Ketoacyl : Acyl Carrier Protein Synthase-Domäne;
Nucleotidpositionen 20718-21692, Aminosäurepositionen 2099-2423 codieren eine Acyltransferase-Domäne;
Nucleotidpositionen 22620-23171, Aminosäurepositionen 2733-2916 codieren eine Ketoreduktase-Domäne;
Nucleotidpositionen 23436-23693, Aminosäurepositionen 3005-3090 codieren eine β-Ketoacyl : Acyl Carrier Protein-Domäne.
Nucleotidpositionen 14424-23936 der SEQ ID NO: 5, Aminosäurepositionen 1 bis 3170:
Nucleotidpositionen 14523-15824, Aminosäurepositionen 34-467 codieren eine β- Ketoacyl : Acyl Carrier Protein Synthase-Domäne;
Nucleotidpositionen 16110-17075, Aminosäurepositionen 563-884 codieren eine Acyltransferase-Domäne;
Nucleotidpositionen 17997-18536, Aminosäurepositionen 1192-1371 codieren eine Ketoreduktase-Domäne;
Nucleotidpositionen 18795-19052, Aminosäurepositionen 1458-1543 codieren eine β-Ketoacyl : Acyl Carrier Protein-Domäne;
Nucleotidpositionen 19107-20387, Aminosäurepositionen 1562-1988 codieren eine β-Ketoacyl : Acyl Carrier Protein Synthase-Domäne;
Nucleotidpositionen 20718-21692, Aminosäurepositionen 2099-2423 codieren eine Acyltransferase-Domäne;
Nucleotidpositionen 22620-23171, Aminosäurepositionen 2733-2916 codieren eine Ketoreduktase-Domäne;
Nucleotidpositionen 23436-23693, Aminosäurepositionen 3005-3090 codieren eine β-Ketoacyl : Acyl Carrier Protein-Domäne.
SEQ ID NOS: 47 und 48, ORF21:
Nucleotidpositionen 23983--38757 der SEQ ID NO: 5, Aminosäurepositionen 1 bis 4924:
Nucleotidpositionen 24082-25392, Aminosäurepositionen 34-470 codieren eine β- Ketoacyl : Acyl Carrier Protein Synthase-Domäne;
Nucleotidpositionen 25696-26661, Aminosäurepositionen 572-893 codieren eine Acyltransferase-Domäne;
Nucleotidpositionen 26761-27315, Aminosäurepositionen 927-1111 codieren eine Dehydratase-Domäne;
Nucleotidpositionen 28231-28782, Aminosäurepositionen 1417-1600 codieren eine Ketoreduktase-Domäne;
Nucleotidpositionen 29035-29265, Aminosäurepositionen 1685-1761 codieren eine β-Ketoacyl : Acyl Carrier Protein-Domäne;
Nucleotidpositionen 29329-30624, Aminosäurepositionen 1783-2214 codieren eine β-Ketoacyl : Acyl Carrier Protein Synthase-Domäne;
Nucleotidpositionen 30928-31902, Aminosäurepositionen 2316-2640 codieren eine Acyltransferase-Domäne;
Nucleotidpositionen 32827-33378, Aminosäurepositionen 2949-3132 codieren eine Ketoreduktase-Domäne;
Nucleotidpositionen 33652-33900, Aminosäurepositionen 3224-3306 codieren eine β-Ketoacyl : Acyl Carrier Protein-Domäne;
Nucleotidpositionen 33952-35262, Aminosäurepositionen 3324-3760 codieren eine β-Ketoacyl : Acyl Carner Protein Synthase-Domäne;
Nucleotidpositionen 35554-36522, Aminosäurepositionen 3858-4180 codieren eine Acyltransferase-Domäne;
Nucleotidpositionen 37453-37998, Aminosäurepositionen 4491-4672 codieren eine Ketoreduktase-Domäne;
Nucleotidpositionen 38254-38511, Aminosäurepositionen 4758-4843 codieren eine β-Ketoacyl : Acyl Carrier Protein-Domäne.
Nucleotidpositionen 23983--38757 der SEQ ID NO: 5, Aminosäurepositionen 1 bis 4924:
Nucleotidpositionen 24082-25392, Aminosäurepositionen 34-470 codieren eine β- Ketoacyl : Acyl Carrier Protein Synthase-Domäne;
Nucleotidpositionen 25696-26661, Aminosäurepositionen 572-893 codieren eine Acyltransferase-Domäne;
Nucleotidpositionen 26761-27315, Aminosäurepositionen 927-1111 codieren eine Dehydratase-Domäne;
Nucleotidpositionen 28231-28782, Aminosäurepositionen 1417-1600 codieren eine Ketoreduktase-Domäne;
Nucleotidpositionen 29035-29265, Aminosäurepositionen 1685-1761 codieren eine β-Ketoacyl : Acyl Carrier Protein-Domäne;
Nucleotidpositionen 29329-30624, Aminosäurepositionen 1783-2214 codieren eine β-Ketoacyl : Acyl Carrier Protein Synthase-Domäne;
Nucleotidpositionen 30928-31902, Aminosäurepositionen 2316-2640 codieren eine Acyltransferase-Domäne;
Nucleotidpositionen 32827-33378, Aminosäurepositionen 2949-3132 codieren eine Ketoreduktase-Domäne;
Nucleotidpositionen 33652-33900, Aminosäurepositionen 3224-3306 codieren eine β-Ketoacyl : Acyl Carrier Protein-Domäne;
Nucleotidpositionen 33952-35262, Aminosäurepositionen 3324-3760 codieren eine β-Ketoacyl : Acyl Carner Protein Synthase-Domäne;
Nucleotidpositionen 35554-36522, Aminosäurepositionen 3858-4180 codieren eine Acyltransferase-Domäne;
Nucleotidpositionen 37453-37998, Aminosäurepositionen 4491-4672 codieren eine Ketoreduktase-Domäne;
Nucleotidpositionen 38254-38511, Aminosäurepositionen 4758-4843 codieren eine β-Ketoacyl : Acyl Carrier Protein-Domäne.
SEQ ID NOS: 49 und 50, ORF22:
Nucleotidpositionen 38808-50000 der SEQ ID NO: 5 und die Nukleotidpositionen 1 bis 5574 der SEQ ID NO: 6, Aminosäurepositionen 1 bis 5588:
Nucleotidpositionen 38907-40226 der SEQ ID NO: 5, Aminosäurepositionen 34-473 codiert eine β-Ketoacyl : Acyl Carrier Protein Synthase-Domäne;
Nucleotidpositionen 40494-41453 der SEQ ID NO: 5, Aminosäurepositionen 563- 882 codieren eine Acyltransferase-Domäne;
Nucleotidpositionen 41556-42119 der SEQ ID NO: 5, Aminosäurepositionen 917- 1104 codieren eine Dehydratase-Domäne;
Nucleotidpositionen 43017-43568 der SEQ ID NO: 5, Aminosäurepositionen 1404- 1587 codieren eine Ketoreduktase-Domäne;
Nucleotidpositionen 43833-44090 der SEQ ID NO: 5, Aminosäurepositionen 1676- 1761 codieren eine β-Ketoacyl : Acyl-Carrier Protein Domäne;
Nucleotidpositionen 44151-45473 der SEQ ID NO: 5, Aminosäurepositionen 1782- 2222 codieren eine β-Ketoacyl : Acyl Carrier Protein Synthase-Domäne;
Nucleotidpositionen 45765-46730 der SEQ ID NO: 5, Aminosäurepositionen 2320- 2641 codieren eine Acyltransferase-Domäne;
Nucleotidpositionen 46827-47459 der SEQ ID NO: 5, Aminosäurepositionen 2674- 2884 codieren eine Dehydratase-Domäne;
Nucleotidpositionen 48378-48935 der SEQ ID NO: 5, Aminosäurepositionen 3191- 3376 codieren eine Ketoreduktase-Domäne;
Nucleotidpositionen 49182-49412 der SEQ ID NO: 5, Aminosäurepositionen 3459- 3535 codieren eine β-Ketoacyl : Acyl Carrier Protein-Domäne;
Nucleotidpositionen 49482-50000 der SEQ ID NO: 5 und Nucleotidposition 1 bis 759 der SEQ ID NO: 6, Aminosäurepositionen 3559-3984 codieren eine β- Ketoacyl : Acyl Carrier Protein Synthase-Domäne;
Nucleotidpositionen 1084-2049 der SEQ ID NO: 6, Aminosäurepositionen 4093- 4414 codieren eine Acyltransferase-Domäne;
Nucleotidpositionen 2146-2697 der SEQ ID NO: 6, Aminosäurepositionen 4447- 4630 codieren eine Dehydratase-Domäne;
Nucleotidpositionen 3604-4155 der SEQ ID NO: 6, Aminosäurepositionen 4933- 5116 codieren eine Ketoreduktase-Domäne;
Nucleotidpositionen 4420-4677 der SEQ ID NO: 6, Aminosäurepositionen 5205- 5290 codieren eine β-Ketoacyl : Acyl Carrier Protein-Domäne;
Nucleotidpositionen 4864-5538 der SEQ ID NO: 6, Aminosäurepositionen 5353- 5577 codieren eine Thioesterase-Domäne.
Nucleotidpositionen 38808-50000 der SEQ ID NO: 5 und die Nukleotidpositionen 1 bis 5574 der SEQ ID NO: 6, Aminosäurepositionen 1 bis 5588:
Nucleotidpositionen 38907-40226 der SEQ ID NO: 5, Aminosäurepositionen 34-473 codiert eine β-Ketoacyl : Acyl Carrier Protein Synthase-Domäne;
Nucleotidpositionen 40494-41453 der SEQ ID NO: 5, Aminosäurepositionen 563- 882 codieren eine Acyltransferase-Domäne;
Nucleotidpositionen 41556-42119 der SEQ ID NO: 5, Aminosäurepositionen 917- 1104 codieren eine Dehydratase-Domäne;
Nucleotidpositionen 43017-43568 der SEQ ID NO: 5, Aminosäurepositionen 1404- 1587 codieren eine Ketoreduktase-Domäne;
Nucleotidpositionen 43833-44090 der SEQ ID NO: 5, Aminosäurepositionen 1676- 1761 codieren eine β-Ketoacyl : Acyl-Carrier Protein Domäne;
Nucleotidpositionen 44151-45473 der SEQ ID NO: 5, Aminosäurepositionen 1782- 2222 codieren eine β-Ketoacyl : Acyl Carrier Protein Synthase-Domäne;
Nucleotidpositionen 45765-46730 der SEQ ID NO: 5, Aminosäurepositionen 2320- 2641 codieren eine Acyltransferase-Domäne;
Nucleotidpositionen 46827-47459 der SEQ ID NO: 5, Aminosäurepositionen 2674- 2884 codieren eine Dehydratase-Domäne;
Nucleotidpositionen 48378-48935 der SEQ ID NO: 5, Aminosäurepositionen 3191- 3376 codieren eine Ketoreduktase-Domäne;
Nucleotidpositionen 49182-49412 der SEQ ID NO: 5, Aminosäurepositionen 3459- 3535 codieren eine β-Ketoacyl : Acyl Carrier Protein-Domäne;
Nucleotidpositionen 49482-50000 der SEQ ID NO: 5 und Nucleotidposition 1 bis 759 der SEQ ID NO: 6, Aminosäurepositionen 3559-3984 codieren eine β- Ketoacyl : Acyl Carrier Protein Synthase-Domäne;
Nucleotidpositionen 1084-2049 der SEQ ID NO: 6, Aminosäurepositionen 4093- 4414 codieren eine Acyltransferase-Domäne;
Nucleotidpositionen 2146-2697 der SEQ ID NO: 6, Aminosäurepositionen 4447- 4630 codieren eine Dehydratase-Domäne;
Nucleotidpositionen 3604-4155 der SEQ ID NO: 6, Aminosäurepositionen 4933- 5116 codieren eine Ketoreduktase-Domäne;
Nucleotidpositionen 4420-4677 der SEQ ID NO: 6, Aminosäurepositionen 5205- 5290 codieren eine β-Ketoacyl : Acyl Carrier Protein-Domäne;
Nucleotidpositionen 4864-5538 der SEQ ID NO: 6, Aminosäurepositionen 5353- 5577 codieren eine Thioesterase-Domäne.
SEQ ID NOS: 52 und 53, ORF23:
Nucleotidposition 344 bis 1333 der SEQ ID NO: 51, 329 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt ist eine dNDP-Glucose-4,6-Dehydratase.
Nucleotidposition 344 bis 1333 der SEQ ID NO: 51, 329 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt ist eine dNDP-Glucose-4,6-Dehydratase.
SEQ ID NOS: 54 und 55, ORF24:
Nucleotidposition 1330 bis 2247 der SEQ ID NO: 51, 305 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt ist eine dNDP-4-keto-6-Deoxyglucose-3,5-Epimerase.
Nucleotidposition 1330 bis 2247 der SEQ ID NO: 51, 305 Aminosäuren; das ableitbare Genprodukt ist eine dNDP-4-keto-6-Deoxyglucose-3,5-Epimerase.
Die an der Cyclisierung des 5, 6, 5-Tricyclus beteiligten Produkte des ORF 5 (SEQ
ID NO: 16) und des ORF 8 (SEQ ID NO: 22) sind aufgrund der ungewöhnlichen
Cyclisierungsreaktionen von besonderem Interesse. Daher beinhaltet die vorliegende
Erfindung insbesondere auch homologe Nucleinsäuren oder homologe Genprodukte.
Vorzugsweise zeigen diese homologen Genprodukte mindestens eine 50%ige,
bevorzugt eine 60%ige und besonders bevorzugt eine 70%ige Identität auf Amino
säureebene.
Weiterhin sind Antikörper Gegenstand der Erfindung, die spezifisch an die
vorstehend genannten Polypeptide binden. Die Herstellung solcher Antikörper erfolgt
auf die übliche Weise. Diese Antikörper können genutzt werden, um Expres
sionsklone z. B. einer Genbank zu identifizieren, die die erfindungsgemäßen Nuclein
säuren tragen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Verfahren zum Herstellen der
erfindungsgemäßen Nucleinsäuren. Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren können
auf die übliche Weise hergestellt werden. Beispielsweise können die Nucleinsäure
moleküle vollständig chemisch synthetisiert werden. Man kann auch kurze Stücke
der erfindungsgemäßen Nucleinsäuren chemisch synthetisieren und solche
Oligonucleotide radioaktiv oder mit einem Fluoreszenzfarbstoff markieren. Die
markierten Oligonucleotide können auch verwendet werden, um Genbanken von
Organismen zu durchsuchen. Klone, an die die markierten Oligonucleotide hybridi
sieren, werden zur Isolierung der betreffenden DNA ausgewählt. Nach der Charak
terisierung der isolierten DNA erhält man auf einfache Weise die erfindungsgemäßen
Nucleinsäuren. Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren können auch mittels PCR-
Verfahren unter Verwendung chemisch synthetischer Oligonucleotide hergestellt
werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin Verfahren zum Herstellen der
erfindungsgemäßen Polypeptide. Zur Herstellung der Polypeptide, die von den erfin
dungsgemäßen Nucleinsäuren codiert werden, können Wirtszellen, die zumindest
eine der erfindungsgemäßen Nucleinsäuren enthalten, unter geeigneten Bedingungen
kultiviert werden. Die gewünschten Polypeptide können danach auf übliche Weise
aus den Zellen oder dem Kulturmedium isoliert werden. Die Polypeptide können
auch in in vitro-Systemen hergestellt werden.
Das isolierte und charakterisierte Gencluster und benachbarte oder assoziierte DNA-
Regionen stellen ein Target zur Steigerung der Spinosyn-Biosynthese durch
genetische Manipulation, Über- oder Unterexpression von direkt oder indirekt an der
Biosynthese involvierten Genen oder regulatorischen Sequenzen dar. Diese Mani
pulationen können sowohl in natürlichen Spinosyn-produzierenden Organismen als
auch in gentechnisch hergestellten Spinosyn-produzierenden Organismen durchge
führt werden. Beispielsweise können ausgewählte ORF's unter die Kontrolle üblicher
starker Promotoren wie dem mel-Promotor des Plasmides pIJ702 (John Innes
Foundation, Norwich, UK, 1985) gestellt werden.
Durch die Klonierung und Identifizierung der Spinosyn-Biosynthesegene schafft die
vorliegende Erfindung die genetische Basis, mittels molekulargenetischer Verfahren
neue Spinosyn-Vorstufen und -Derivate herzustellen.
Der Ausdruck "Spinosyn-Vorstufen", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf
alle nachweisbaren und alle postulierbaren Biosynthesevorstufen von Spinosyn.
Der Ausdruck "Spinosyn-Derivate", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf
Strukturderivate aller bisher bekannten Spinosyne.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit auch ein Verfahren zum Herstellen
von Spinosyn-Vorstufen und -Derivaten.
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren können beispielsweise eingesetzt werden, um
durch kombinatorische Biosynthese neue Spinosyn-Derivate mit Veränderungen des
Spinosyn-Aglycons herzustellen. Dies kann z. B. dadurch erreicht werden, dass die
von ORF 19 codierte, eine Acetat-Einheit einbauende Acyltransferase-Domäne aus
getauscht wird gegen eine Acyltransferase-Domäne, die eine Propionat-Einheit ein
baut. In gleicher Weise kann die, eine Acetat-Einheit einbauende Acyltransferase-
Domäne des ORF 18 gegen eine Acyltransferase-Domäne ausgetauscht werden, die
eine Propionat-Einheit einbaut. Ferner ist es möglich beide oder jeweils eine
Ketoreduktase-Domäne, die von beiden genannten ORF's codiert werden zu in
aktivieren, durch eine inaktive Ketoreduktase-Domäne zu ersetzen oder zu deletieren,
wodurch eine Hydroxygruppe an der entsprechenden Position im Makrocyclus bio
synthetisch hergestellt werden kann. Alle Acyltransferase-, Ketoreduktase-,
Dehydratase-, Enoylreduktase-, β-Ketoacyl : Acyl Carrier Protein und Thioesterase-
Domänen können einzeln oder in beliebiger Kombination durch entsprechende Poly
ketidsynthase-Domänen mit anderer Substrat- oder Reaktionsspezifität ersetzt
werden, in beliebiger Kombination miteinander fusioniert, einzeln oder in beliebiger
Kombination mutagenisiert, deletiert oder dupliziert werden. Ferner können Modul
codierende Sequenzen ausgetauscht werden. So ist es denkbar die Modul 2-
codierende DNA-Sequenz (Abb. 6) gegen die Modul 1- oder Modul 3, 4, 5, 6, 7, 8-
oder Modul 9-codierende DNA-Sequenz (Abb. 6) zu ersetzen und funktionell zu
exprimieren. Es ist auch denkbar die Modul 2-codierende DNA-Sequenz oder jede
andere Modul-codierende DNA-Sequenz des Spinosyn-Polyketidsynthase-Gen
clusters gegen eine andere Modul-codierende DNA-Sequenz des Spinosyn-Poly
ketidsynthase-Genclusters, die eine andere biosynthetische Verlängerungseinheit ein
baut, auszutauschen. Darüber hinaus kann jede andere Modul-codierende DNA-
Sequenz des Spinosyn-Polyketidsynthase-Genclusters gegen eine andere Modul
codierende DNA-Sequenz einer anderen Polyketidsynthase-Nukleinsäuresequenz aus
S. spinosa oder einem anderen Organismus als S. spinosa, wie z. B.
Saccharopolyspora erythraea, ausgetauscht werden. Diese Veränderungen können
unter Ausnutzung der ET-Rekombination (WO 99/29837; Muyrers et al., 1999) oder
anderer Klonierungs- und Rekombinationstechniken durchgeführt werden.
Gegenstand der Erfindung sind somit auch alle Modul- oder Domänen-codierenden
Nucleinsäuren, die natürlicher oder gentechnisch erzeugter Bestandteil der Spinosyn-
Polyketidsynthase sind.
Der Ausdruck "Modul", sowie er hierin verwendet wird, bedeutet, dass eine Anord
nung von drei enzymkatalytisch aktiven Domänen vorliegt, die zu eine Verlängerung
der wachsenden Polyketidkette um eine biosynthetische Verlängerungseinheit
führen. Bei diesen Domänen handelt es sich um eine β-Ketoacyl : Acyl Carner Protein
Synthase-Domäne, eine Acyltransferase-Domäne und eine β-Ketoacyl : Acyl-Carrier
Protein-Domäne. Ein Modul kann auch eine Ketoreduktase-, eine Dehydratase-, eine
Enoylreduktase- und eine Thioesterase-Domäne tragen. Ein sog. Ladungsmodul, das
am Beginn der Biosynthese steht kann von den genannten Domänen lediglich eine
Acyltransferase-Domäne und eine β-Ketoacyl : Acyl-Carrier Protein-Domäne tragen,
sowie eine enzymatisch inaktive β-Ketoacyl : Acyl Carrier Protein Synthase-Domäne.
Eine Polyketidsynthase-Domäne umfasst jeweils eine dieser genannten enzyma
tischen Aktivitäten.
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren können weiterhin genutzt werden, um im
Zuge einer kombinatorischen Biosynthese durch Neuanordnung und Expression von
Spinosyn-Polyketidsynthase-Nucleinsäuresequenzen oder durch Kombination und
Expression zusammen mit Polyketidsynthase-Nucleinsäuresequenzen einer anderen
Polyketidsynthase codierenden Nucleinsäuresequenz aus S. spinosa oder einem
anderen Organismus, wie z. B. Saccharopolyspora erythraea, Bibliotheken von re
kombinanten Polyketidsynthase-Nucleinsäuresequenzen, rekombinanten Polyketid
synthase-Proteinen oder rekombinant erzeugten Polyketiden herzustellen. Diese
Polyketide können durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuren
oder die Verwendung anderer Nucleinsäuren, deren ableitbaren Produkte an der Bio
synthese anderer Zucker und Ankopplung ans Aglycon beteiligt sind, glycosyliert
werden. Es ist bekannt, dass die Glycosylierung des Aglycons eine entscheidende
Rolle bei der biologischen Aktivität am Wirkort spielt. Diese Veränderungen können
sowohl in natürlichen als auch in gentechnisch hergestellten Spinosyn-produzie
renden Organismen, insbesonders Bakterien, erfolgen. Weiterhin können diese Ver
änderungen unter Ausnutzung der ET-Rekombination (WO 99/29837; Muyrers et al.,
1999) oder anderer Klonierungs- und Rekombinationstechniken durchgeführt
werden.
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren, Vektoren und regulatorischen oder genetisch
mobilen Regionen können außerdem zum Auffinden von Genen verwendet werden,
die für Polypeptide codieren, welche funktionell ähnliche Polyketidsynthasen oder
funktionell ähnliche Produkte, die an einer Zuckerbiosynthese beteiligt sind,
codieren.
Da die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren einen umfangreichen Teil des Genoms von
S. spinosa ausmacht, können die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren als Marker bei
der Sequenzierung des Genoms von S. spinosa eingesetzt werden, wodurch die An
ordnung von Teilsequenzen eines Genomsequenzierungsprojektes erheblich er
leichtert wird.
Somit liefern die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren Daten, die im Rahmen eines
Genomsequenzierungsprojektes und eines sich darauf aufbauenden Metabolic
Engineering zur Steigerung der Spinosynproduktion eingesetzt werden können.
Abb. 1 Modell für die Biosynthese der Spinosyn-Zucker D-Forosamin und 2,3,4-
Tri-O-Methyl-L-Rhamnose.
Abb. 2 Lage, der an der Spinosyn-Biosynthese direkt oder indirekt beteiligten
DNA-Regionen 1 (SEQ ID NO: 4) und DNA-Region 2 (SEQ ID NOS: 5 und 6). Die
schwarzen Balken im unteren Teil der Abbildung geben schematisch die Positionen
der Cosmid-DNA Inserts zueinander und in Bezug zu den DNA-Regionen 1 und 2
an. Die dargestellen Cosmid-Inserts wurden zur Sequenzierung der SEQ ID NOS: 1
bis 3 herangezogen.
Abb. 3 Schematische Darstellung der Lage der Insert-DNA (schwarze Balken
im unteren Teil der Abbildung) der benannten Cosmide, die zur Ankopplung eines
Forosamin-Restes oder eines Trimethyl-Rhamnose-Restes durch Biotransformation
des Spinosyn-Aglycons und Spinosyn-Pseudoaglycons herangezogen worden sind.
Abb. 4 Schematische Darstellung der offenen Leserahmen (ORF's) der DNA-
Region 3, die der SEQ ID NO: 51 entspricht, auf Cosmid 16-2-2.
Abb. 5 Schematische Darstellung offener Leserahmen (ORF's) der DNA-
Regionen 1 und 2. Die ORF's sind numeriert von 1 bis 22 entsprechend SEQ ID
NOS: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47
und 49.
Abb. 6 Schematische Darstellung offener Leserahmen (ORF's) der DNA-
Region 2 (SEQ ID NOS: 5 und 6) und ableitbarer Module und Domänen. SM,
Startmodul; M1 bis M10, Modul 1 bis Modul 10; KS, β-Ketoacyl : Acyl Carrier
Protein Synthase; AT, Acyltransferase; ACP, β-Ketoacyl : Acyl Carrier Protein; KR,
Ketoreduktase; DH, Dehydratase; ER, Enoylreduktase.
Abb. 7 Schematische Darstellung der Lage von BAC-Shuttleklon Insert-DNA
als schwarze Balken im unteren Teil der Abbildung. Die Größe der Insert-DNA
beträgt mindestens 100 kb. Durchgezogene Balken: DNA-Sequenz ist identisch mit
Teilen bzw. der Gesamtheit der DNA-Regionen 1 und 2. Gestrichelte Balken: DNA-
Sequenz liegt außerhalb des sequenzierten Bereichs.
Escherichia coli XL1-Blue MRF' und die Cosmidvektoren SuperCos1 (Stratagene,
Europe) und pOJ446 (Biermann et al., 1992) wurden verwendet zur Erstellung von
Genbanken von S. spinosa ATCC49460 (American Type Culture Collection, U.S.A.,
EP-A 0 375 316). E. coli JM110 (Stratagene, Europe) wurde verwendet zur Propa
gierung von Plasmiden, die durch Transformation nach Streptomyces übertragen
wurden. Streptomyces albus J1074 (Chater and Wilde, 1980; John Innes Institut in
Norwich, UK) wurde zur heterologen Expression von und zur Biotransformation mit
Spinosyn-Biosynthesegenen eingesetzt.
Plasmid pBeIoBAC11 (Kim et al., 1996) und pOJ446 (Biermann et al., 1992) wurden
verwendet zur Herstellung eines E. coli-Streptomyces BAC-Shuttlevektors.
Molekularbiologische Methoden wie DNA-Restriktion, Agarose-Gelelektrophorese
von DNA, Ligation von Restriktionsfragmenten, Kultivierung und Transformation
von E. coli wurden durchgeführt wie beschrieben in Sambrook et al. (1989).
Plasmide wurden mit Qiagen Plasmid Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert. Die
verwendeten Enzyme stammten von Roche Diagnostics GmbH (Mannheim,
Deutschland).
Anzucht Bedingungen and molekulargenetische Methoden mit S. spinosa und
Streptomyceten sind beschrieben in (Hopwood et al., 1985). Alle Anzuchten in
Flüssigkultur von S. spinosa oder Streptomyceten erfolgten aerob in Erlenmeyer
kolben bei 28°C.
Die DNA-DNA-Hybridisierungen erfolgten unter Verwendung des DIG-High Prime
DNA Labeling and Detection Kit nach Angaben des Herstellers (Roche Diagnostics
GmbH, Mannheim, Deutschland).
Wachstumsmedien:
LB Sambrook et al., 1989
TS Difco Bestell-Nummer 0 370-17-3 (Difco Detroit, MI, USA)
R5A Illing et al., 1985
LB Sambrook et al., 1989
TS Difco Bestell-Nummer 0 370-17-3 (Difco Detroit, MI, USA)
R5A Illing et al., 1985
Um eine Genbank von S. spinosa zu erhalten, wurde chromosomale DNA von S.
spinosa ATCC49460 mit MboI partiell geschnitten und durch Zentrifugation im
Glucosedichtegradienten aufgetrennt. Die Cosmid-DNA (SuperCos1, Stratagene
Europe) wurde nach Angaben des Herstellers vorbereitet, mit den S. spinosa DNA-
Fragmenten zwischen 35 und 45 kb ligiert und mit Hilfe des Gigapack-Verpackungs
system (Stratagene Europe) in Phagenpartikel verpackt. Die Transfektion erfolgte in
E. coli XL-1 blue MRF'. Diese Methode wurde ebenfalls dazu verwendet eine zweite
S. spinosa Genbank anzulegen unter Verwendung des E. coli-Streptomyces Shuttle-
Cosmids pOJ446.
Die Insert-DNA der SuperCos1 Cosmide 16-1-8, 16-59-1, und 16-59-8 wurden
sequenziert. Eine ca. 4 kb große Lücke zwischen den Cosmiden 16-59-1 und 16-1-8
wurde durch pimer walking Sequenzierung eines entsprechenden Teilbereiches von
Cosmid 16-59-6 geschlossen.
Eine ca. 2,3 kb große DNA-Sequenz auf dem SuperCos1 Cosmid 16-2-2 wurde
sequenziert.
Zur Herstellung des BAC-Shuttlevektors, der nicht nur in E. coli sondern auch in
Actinomyceten wie Streptomyces übertragen und vermehrt werden kann, wurde der
Vektor pBeloBAC11 mit XhoI linearisiert, und durch die Anwendung von Klenow
Polymerase wurden glatte DNA-Enden hergestellt. Ein ca. 6 kb großes DraI -
EcoRV DNA-Fragment des Cosmidvektors pOJ446, das den Replikationsursprung
des Plasmides SCP2*, das Apramycinresistenzgen sowie den oriT zum konjugativen
Transfer trägt, wurde mit dem linearisierten BAC-Vektor ligiert. Der resultierende
Vektor erhielt die Bezeichnung pEBZ333.
Ausgehend von partiell mit MboI geschnittener genomischer DNA des Stammes S.
spinosa ATCC49460 und dem mit BamHI geschnittenen Vektor pEBZ333 wurde
eine BAC-Genbank erstellt.
Ausgehend von der Sequenz gemäß SEQ ID NOS: 1 bis 3 wurden offene Lese
rahmen (ORF's) identifiziert, die direkt oder indirekt an der Biosynthese von
Spinosyn beteiligt sind. Diese ORF's wurden in zwei DNA-Regionen unterteilt, die
als DNA-Region 1 und DNA-Region 2 (Abb. 2 und 5) bezeichnet werden und die
Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 4 bzw. 5 und 6 tragen. Die DNA-Region 1 trägt
offene Leserahmen, deren Produkte an der Modifizierung und Tricyclusbildung des
Spinosyn-Aglycons beteiligt sind, während die DNA-Region 2 (Abb. 2, 5 und 6)
offene Leserahmen umfasst, deren Produkte die Spinosyn-Polyketidsynthase
codieren. Die beiden jeweils ersten Nucleotide dieser DNA-Regionen liegen un
mittelbar nebeneinander (Abb. 2, 3 und 5).
Eine weitere DNA-Region 3 (SEQ ID NO: 51) liegt außerhalb dieses Clusters von
DNA-Sequenzen und trägt offene Leserahmen, deren Produkte ebenfalls an der Bio
synthese des Spinosyn-Zuckers Trimethyl-Rhamnose beteiligt sind.
Ausgehend von 18,7 g des kommerziell erhältlichen Produktes Tracer® wurden nach
Gefriertrocknung und Säulenchromatographie an Kieselgel 8,92 g Spinosyn A und D
in einem Verhältnis von 82 : 18 gewonnen.
Die Hydrolyse des Aminozuckers Forosamin gelang mit 2.7 N Schwefelsäure in
Ethanol unter Rückfluß. Dabei fiel der Großteil des entstehenden 17-Pseudoaglycons
von Spinosyn A/D aus. Im Filtrat wurden neben weiterem 17-Pseudoaglycon in Ab
hängigkeit von der Reaktionsdauer geringe bis mittlere Mengen des Spinosyn-
Aglycons gefunden.
Eine vollständige Hydrolyse zum Aglycon gelang unter etwas drastischeren Be
dingungen (7.2 N Schwefelsäure in Methanol unter Rückfluß). Die Aglycon-Fraktion
enthielt ausschließlich Aglycon von Spinosyn A. Dies stimmt sehr gut mit der
Literatur überein (Creemer et al., 1998), die unter entsprechenden Reaktionsbe
dingungen eine vollständige Zersetzung des Pseudoaglycons von Spinosyn D be
schreibt. Als Ursache nehmen die Autoren eine leichtere Protonierung der 5,6-
Doppelbindung bei Spinosyn D unter Bildung eines tertiären Carbokations und an
schließende Umlagerungen an.
Es konnten somit ausgehend von 18,7 g käuflichem Tracer® 3,0 g Aglycon von
Spinosyn A hergestellt werden.
Die Gefriertrocknung von 18,7 g Tracer® lieferten 10,0 g grauen Feststoff. Nach
Säulenchromatographie dieses Feststoffes an 800 cm3 Kieselgel (Eluent: Dichlor
methan/Methanol 95 : 5) erhielt man 8,92 g reines Spinosyn A/D (82% A, 18% D).
- DC: Rf (SiO2, Dichlormethan/Methanol 9 : 1) = 0,46. - 1H-NMR: CDCl3, δ = 6,77
(s, 13-H); 5,88 (d, 5-H von Spinosyn A); 5,80 (m, 6-H von Spinosyn A); 5,49 (m,
5-H von Spinosyn D); 4,87 (d, 1'-H); 4,67 (m, 21-H); 4,43 (d, 1"-H); 4,31 (m, 9-H)
u. a. - LC/MS: Elektrospray Positiv; Peak bei RT 44,0 min: m/z = 733 (100%)
[M+H]+ (Spinosyn A); Peak bei 44,7 min: m/z = 747 (100%) [M+H]+ (Spinosyn D).
8,65 g (11,81 mmol) Spinosyn A/D wurden in 61 ml Ethanol gelöst und mit 104 ml
Wasser und 208 ml 4 N H2SO4 versetzt. Nach 3 h Erwärmen unter Rückfluß wurde
der ausgefallene Feststoff (A) abfiltriert und getrennt vom Filtrat (B) aufgearbeitet.
Der Feststoff (A) wurde mit 1 N H2SO4 gewaschen, in 140 ml Dichlormethan aufge
nommen, nacheinander mit gesätt. NaHCO3-Lösung und gesätt. NaCl-Lösung ge
waschen, über Na2SO4 getrocknet und im Vakuum eingeengt. Umkristallisation aus
Ethanol lieferten 3,03 g 17-Pseudoaglycon von Spinosyn A/D und Mutterlauge (C).
Das Filtrat (B) wurde mehrmals mit Dichlormethan extrahiert. Die Extrakte wurden
nacheinander mit gesätt. NaHCO3-Lösung und gesätt. NaCl-Lösung gewaschen, über
Na2SO4 getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde vereint mit der
im Vakuum eingeengten Mutterlauge (C) und durch Säulenchromatographie an
650 cm3 Kieselgel (Eluent: Cyclohexan/Essigsäureethylester 1 : 1, dann 100% Essig
säureethylester) aufgetrennt. Man erhielt neben weiteren 1,76 g 17-Pseudoaglycon
von Spinosyn A/D 0,78 g (16%) Aglycon von Spinosyn A. Die Gesamtausbeute von
17-Pseudoaglycon von Spinosyn A/D betrug 4,79 g (69%). - a) 17-Pseudoaglycon
von Spinosyn A/D (82% A, 18% D): DC: Rf (SiO2, Essigsäureethylester) = 0,48.
- 1H-NMR: CDCl3, δ = 6,78 (s, 13-H); 5,88 (d, 5-H von Spinosyn A); 5,80 (m, 6-H
von Spinosyn A); 5,49 (m, 5-H von Spinosyn D); 4,86 (d, 1'-H); 4,70 (m, 21-H);
4,32 (m, 9-H) u. a. - LC/MS: Elektrospray Positiv; Peak bei RT 40,7 min: m/z = 609
(100%) [M+NH4]+, m/z = 641 (10%) [M+NH4+CH3OH]+ (Pseudoaglycon von
Spinosyn A); Peak bei RT 41,4 min: m/z = 623 (100%) [M+NH4]+, m/z = 655
(8%) [M+NH4+CH3OH]+ (Pseudoaglycon von Spinosyn D). - b) Aglycon von
Spinosyn A: DC: Rf (SiO2, Essigsäureethylester) = 0,29. - 1H-NMR: CDCl3, δ = 6,80
(s, 13-H); 5,89 (d, 5-H); 5,80 (m, 6-H); 4,70 (m, 21-H); 4,44 (m, 9-H) u. a. - LC/MS:
Elektrospray Positiv; Peak bei RT 36,8 min: m/z = 420 (100%) [M+NH4]+,
m/z = 452 (10%) [M+NH4+CH3OH]+.
4,30 g (7,29 mmol) Pseudoaglycon von Spinosyn A/D wurden in 190 ml. Methanol
gelöst und mit 285 ml 7,2 N H2SO4 versetzt. Nach 3 h Erwärmen unter Rückfluß
wurde die abgekühlte Reaktionsmischung vorsichtig in 1700 ml gesättigte NaHCO3-
Lösung gegeben. Man extrahierte mit Diethylether, wusch die Extrakte nacheinander
mit gesätt. NaHCO3-Lösung und gesätt. NaCl-Lösung, trocknete über Na2SO4 und
engte im Vakuum ein. Nach Säulenchromatographie dieses Feststoffes an 650 cm3
Kieselgel (Eluent: Cyclohexan/Essigsäureethylester 1 : 2, dann 100% Essigsäure
ethylester) erhielt man 1,88 g (64%) Aglycon von Spinosyn A. - DC: Rf (SiO2,
Essigsäureethylester) = 0,29. - 1H-NMR: CDCl3, δ = 6,80 (s, 13-H); 5,89 (d, 5-H);
5,80 (m, 6-H); 4,70 (m, 21-H); 4,44 (m, 9-H) u. a. - LC/MS: Elektrospray Positiv;
Peak bei RT 36,6 min: m/z = 420 (100%) [M+NH4]+, m/z = 452 (14%)
[M+NH4+CH3OH]+ (Aglycon von Spinosyn A).
20 ml R5A Medium (Illing et al., 1989) mit 5 µg Apramycin/ml wurde mit Mycel
des rekombinanten Stammes S. albus (165-1) oder S. albus (165-8) angeimpft und
24 h aerob bei 28°C bebrütet. Diese Kultur wurde mit 50 µg/ml des hergestellten
Spinosyn-Aglycons (100 µl einer 1%igen Stammlösung in Methanol; Herstellung
siehe Kapitel "Herstellung des Spinosyn-Aglycons und 17-Pseudoaglycons aus
Tracer®", "Gewinnung von Spinosyn A/D aus Tracer®" und "Darstellung des
Aglycon von Spinosyn A/D") versetzt und ca. 120 h bei 28°C aerob inkubiert. Als
Kontrolle wurde in gleicher Weise S. albus (pEBZ340; pOJ446-Vektor mit einem ca.
1,8 kb großen Spinosyn-PKS tragenden DNA-Fragment aus Cosmid 16-1-8)
kultiviert und mit Spinosyn-Aglycon versetzt. Die Kulturen wurden nach Inkubation
zur Abtrennung von Zellmycel zentrifugiert und der Überstand (20 ml) wurde mit
25 ml Methanol versetzt.
Je 35 ml des mit Methanol versetzten Kulturüberstandes wurden lyophylisiert, mit
15 ml Wasser aufgenommen und zweimal mit je 10 ml Essigsäureethylester extra
hiert. Die vereinten organischen Phasen wurden zur Trockene eingeengt und mit
350 µl Methanol aufgenommen. Ein Aliquot dieser Extrakte wurde mittels LC/MS
mit Elektrospray Positiv-Ionisation untersucht.
Der Kulturüberstand der Anzucht von S. albus (165-1) enthielt eine Verbindung mit
dem Molekulargewicht eines forosaminylierten Aglycons von Spinosyn A sowie
Spinosyn A.
Peak 1: RT = 41,0 min: m/z = 544 (100%) [M+H]+, m/z = 576 (20%) [M+H+CH3OH]+ (Forosaminyliertes Aglycon von Spinosyn A); LC/MS/MS: m/z = 142 (30%) (Forosamin-Fragment).
Peak 1: RT = 41,0 min: m/z = 544 (100%) [M+H]+, m/z = 576 (20%) [M+H+CH3OH]+ (Forosaminyliertes Aglycon von Spinosyn A); LC/MS/MS: m/z = 142 (30%) (Forosamin-Fragment).
Peak 2: RT = 44,2 min: m/z = 733 (100%) [M+H]+ (Spinosyn A); LC/MS/MS:
m/z = 142 (21%) (Forosamin-Fragment).
Der Kulturüberstand von S. albus (165-8) enthielt eine Verbindung mit dem Mole
kulargewicht eines Forosaminylierten Aglycons von Spinosyn A.
Peak 1: RT = 40,9 min: m/z = 544 (100%) [M+H]+, m/z = 576 (20%) [M+H+CH3OH]+ (Forosaminyliertes Aglycon von Spinosyn A); LC/MS/MS: m/z = 142 (39%) (Forosamin-Fragment).
Peak 1: RT = 40,9 min: m/z = 544 (100%) [M+H]+, m/z = 576 (20%) [M+H+CH3OH]+ (Forosaminyliertes Aglycon von Spinosyn A); LC/MS/MS: m/z = 142 (39%) (Forosamin-Fragment).
Der Kulturüberstand von S. albus (pEBZ340) enthielt keine Verbindungen mit MW
543 und kein Spinosyn A.
20 ml R5A Medium (Illing et al., 1989) mit 5 µg Apramycin/ml wurde mit Mycel
des rekombinanten Stammes S. albus (165-1) oder S. albus (165-8) angeimpft und
24 h aerob bei 28°C bebrütet. Diese Kultur wurde mit 50 µg/ml des hergestellten 17-
Pseudoaglycons von Spinosyn (100 µl einer 1%igen Stammlösung in Methanol;
Herstellung siehe Kapitel "Herstellung des Spinosyn-Aglycons und 17-Pseudo
aglycons aus Tracer®", "Gewinnung von Spinosyn A/D aus Tracer©" und "Dar
stellung des 17-Pseudoaglycon von Spinosyn A/D") versetzt und ca. 120 h bei 28°C
aerob inkubiert. Die Kulturen wurden nach Inkubation zur Abtrennung von
Zellmycel zentrifugiert und der Überstand (20 ml) wurde mit 25 ml Methanol ver
setzt.
Je 35 ml des mit Methanol versetzten Kulturüberstandes wurden lyophylisiert, mit
15 ml Wasser aufgenommen und zweimal mit je 10 ml Essigsäureethylester extra
hiert. Die vereinten organischen Phasen wurden zur Trockene eingeengt und mit
350 µl Methanol aufgenommen. Ein Aliquot dieser Extrakte wurde mittels LC/MS
mit Elektrospray Positiv-Ionisation untersucht.
Der Kulturüberstand von S. albus (165-1) enthielt Spuren von Spinosyn A und D.
Peak 1: RT = 44,2 min: m/z = 733 (100%) [M+H]+ (Spinosyn A); LC/MS/MS: m/z = 142 (8%) (Forosamin-Fragment).
Peak 2: RT = 44,7 min: m/z = 747 (100%) [M+H]+ (Spinosyn D); LC/MS/MS: m/z = 142 (37%) (Forosamin-Fragment).
Peak 1: RT = 44,2 min: m/z = 733 (100%) [M+H]+ (Spinosyn A); LC/MS/MS: m/z = 142 (8%) (Forosamin-Fragment).
Peak 2: RT = 44,7 min: m/z = 747 (100%) [M+H]+ (Spinosyn D); LC/MS/MS: m/z = 142 (37%) (Forosamin-Fragment).
Der Kulturüberstand von S. albus (165-8) enthielt Spuren von Spinosyn A und D.
Peak 1: RT = 44,1 min: m/z = 733 (100%) [M+H]+ (Spinosyn A).
Peak 2: RT = 44,7 min: m/z z = 747 (100%) [M+H]+ (Spinosyn D).
Peak 1: RT = 44,1 min: m/z = 733 (100%) [M+H]+ (Spinosyn A).
Peak 2: RT = 44,7 min: m/z z = 747 (100%) [M+H]+ (Spinosyn D).
Folgende Mikroorganismen und Plasmide sind bei der Deutschen Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, D-38124
Braunschweig, in Übereinstimmung mit den Bestimmungen des Budapester Vertra
ges hinterlegt worden.
Mikroorganismus und Plasmid | |
Hinterlegungsnummer | |
E. coli XL1-Blue MRF' mit Cosmid 16-1-8 | DSM 12961 |
E. coli XL1-Blue MRF' mit Cosmid 16-2-2 | DSM 12962 |
E. coli XL1-Blue MRF' mit Cosmid 16-59-1 | DSM 12963 |
E. coli XL1-Blue MRF' mit Cosmid 16-59-6 | DSM 12964 |
E. coli XL1-Blue MRF' mit Cosmid 16-59-8 | DSM 12965 |
E. coli XL1-Blue MRF' mit Cosmid 165-1 | DSM 13005 |
E. coli XL1-Blue MRF' mit Cosmid 165-8 | DSM 13007 |
E. coli DH10B mit dem BAC Shuttle-Klon P8/G11 | DSM 13012 |
E. coli DH10B mit dem BAC Shuttle-Klon P11/B10 | DSM 13011 |
E. coli DH10B mit dem BAC Shuttle-Klon P11/G6 | DSM 13010 |
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Claims (72)
1. Nucleinsäure, welche zumindest eine Region umfasst, die für eine Enzym
aktivität codiert, welche an der Biosynthese von Spinosynen beteiligt ist.
2. Nucleinsäure gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um
einzelsträngige oder doppelsträngige DNA oder RNA handelt.
3. Nucleinsäure gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um
ein DNA-Fragment handelt.
4. Nucleinsäure gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie alle
Regionen umfasst, die für Enzymaktivitäten codieren, welche an der Bio
synthese von Spinosynen beteiligt sind.
5. Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet,
dass es sich um Enzymaktivitäten von Polyketidsynthasen, Methyltrans
ferasen, Glycosyltransferasen, Epimerasen, Aminotransferasen, Dimethyl
transferasen, Reduktasen, Dehydratasen und/oder Cyclisierungsenzymen
handelt.
6. Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet,
dass sie aus Saccharopolyspora spinosa stammt.
7. Nucleinsäure gemäß Anspruch 1, umfassend zumindest eine Sequenz ausge
wählt aus
- a) den Sequenzen gemäß SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 52 oder 54,
- b) zumindest 14 Basenpaare langen Teilsequenzen der unter (a) defi nierten Sequenzen,
- c) Sequenzen, welche an die unter (a) definierten Sequenzen hybri disieren
- d) Sequenzen, welche eine zumindest 70%ige Identität zu den unter (a) definierten Sequenzen aufweisen,
- e) Sequenzen, welche zu den unter (a) definierten Sequenzen komple mentär sind, und
- f) Sequenzen, welche aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes für dieselbe Aminosäuresequenz kodieren wie die unter (a) bis
- g) definierten Sequenzen.
8. Nucleinsäure gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie die
Sequenz gemäß SEQ ID NOS: 1 bis 6 umfasst.
9. Nucleinsäure gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie die
Sequenz gemäß SEQ ID NO: 4 umfasst.
10. Nucleinsäure gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie die
Sequenz gemäß SEQ ID NOS: 5 und 6 umfasst.
11. Nucleinsäure gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie zumindest
eine Sequenz gemäß SEQ ID NOS: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29,
31, 33, 35, 37 oder 39 umfasst.
12. Nucleinsäure gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie zumindest
eine Sequenz gemäß SEQ ID NOS: 41, 43, 45, 47 oder 49 umfasst.
13. Regulatorische Region, welche die Transkription einer Nukleinsäure gemäß
einem der Ansprüche 1 bis 7 in Saccharopolyspora spinosa kontrolliert.
14. DNA-Konstrukt umfassend eine Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1
bis 12 und zumindest einen heterologen Promotor.
15. Vektor umfassend zumindest eine Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche
1 bis 12, eine regulatorische Region gemäß Anspruch 13 oder ein DNA-
Konstrukt gemäß Anspruch 14.
16. Vektor gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleinsäure
funktionell mit regulatorischen Sequenzen verknüpft ist, welche die Ex
pression der codierenden Regionen der Nucleinsäure in pro- oder eukaryo
tischen Zellen gewährleisten.
17. Vektor gemäß Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um
einen BAC-Vektor, PAC-Vektor oder einen zu BAC- oder PAC-Vektoren
funktionell gleichwertigen Vektor handelt.
18. Vektor gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen
Vektor handelt, der den BAC-Klonen mit den Hinterlegungsnummern DSM
13010, DSM 13011 oder DSM 13012 entspricht.
19. Vektor gemäß einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass
es sich um einen Shuttle-Vektor handelt, der sowohl in Prokaryonten als auch
in Eukaryonten übertragbar ist.
20. Vektor gemäß einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass
es sich um einen Shuttle-Vektor handelt, der sowohl in Gram-negative und in
Gram-positive Bakterien als auch in Archea übertragbar ist.
21. Vektor gemäß einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass
es sich um einen Shuttle-Vektor handelt, der sowohl in Escherichia coli als
auch in Actinomyceten übertragbar ist.
22. Vektor gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen
Shuttle-Vektor handelt, der sowohl in Escherichia coli als auch in
Streptomyces übertragbar ist.
23. Vektor gemäß einem der Ansprüche 15 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass
er in einem Prokaryonten autonom replizierbar ist.
24. Vektor gemäß einem der Ansprüche 15 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass
er in einem Prokaryonten unter Beteiligung des Phagen ΦC31-, des pSAM2-
oder des Mini-Circle-Integrationsmechanismus ins Genom integrierbar ist.
25. Vektor gemäß einem der Ansprüche 15 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass
er in einem Prokaryonten durch RecA-vermittelte Rekombination ins Genom
integrierbar ist.
26. Vektor gemäß einem der Ansprüche 15 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass
er in einem Prokaryonten durch RecE- und RecT-vermittelte Rekombination
ins Genom integrierbar ist.
27. Wirtszelle enthaltend eine Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12,
eine regulatorische Region gemäß Anspruch 13, ein DNA-Konstrukt gemäß
Anspruch 14 oder zumindest einen Vektor gemäß einem der Ansprüche 15 bis
26.
28. Wirtszelle gemäß Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine
pro- oder eukaryotische Zelle handelt.
29. Wirtszelle gemäß Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die prokaryo
tische Zelle zur Gruppe der Actinomyceten, bevorzugt zur Gruppe der Strep
tomyceten gehört.
30. Wirtszelle gemäß Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die eukaryo
tische Zelle eine Pflanzenzelle ist.
31. Polypeptid, welches von einer Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1
bis 7 codiert wird.
32. Polypeptid gemäß Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass es die Aktivi
tät einer Methyltransferase aufweist.
33. Polypeptid gemäß Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass es die Amino
säuresequenz gemäß SEQ ID NOS: 8, 12, 14, 18 oder 20, oder eine Teil
sequenz davon aufweist.
34. Polypeptid gemäß Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass es die Aktivi
tät einer Glycosyltransferase aufweist.
35. Polypeptid gemäß Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass es die Amino
säuresequenz gemäß SEQ ID NOS: 10 oder 30, oder eine Teilsequenz davon
aufweist.
36. Polypeptid gemäß Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass es die Aktivi
tät eines C-C verknüpfenden Enzyms, das Cyclisierungsreaktionen durch
führt, aufweist.
37. Polypeptid gemäß Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass es die Amino
säuresequenz gemäß SEQ ID NO: 16 oder eine Teilsequenz davon aufweist.
38. Polypeptid gemäß Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass es die Aktivi
tät eines Enzyms, das an Cyclisierungsreaktionen beteiligt ist, aufweist.
39. Polypeptid gemäß Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass es die Amino
säuresequenz gemäß SEQ ID NO: 22 oder eine Teilsequenz davon aufweist.
40. Polypeptid gemäß Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass es die
Aktivität einer 2,3-Reduktase aufweist.
41. Polypeptid gemäß Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, dass es die Amino
säuresequenz gemäß SEQ ID NO: 24 oder eine Teilsequenz davon aufweist.
42. Polypeptid gemäß Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass es die
Aktivität einer 2,3-Dehydratase aufweist.
43. Polypeptid gemäß Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, dass es die Amino
säuresequenz gemäß SEQ ID NO: 26 oder eine Teilsequenz davon aufweist.
44. Polypeptid gemäß Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass es die Aktivi
tät einer Thioesterase aufweist.
45. Polypeptid gemäß Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, dass es die Amino
säuresequenz gemäß SEQ ID NO: 28 oder eine Teilsequenz davon aufweist.
46. Polypeptid gemäß Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass es die
Aktivität einer 3,4-Dehydratase aufweist.
47. Polypeptid gemäß Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, dass es die Amino
säuresequenz gemäß SEQ ID NO: 32 oder eine Teilsequenz davon aufweist.
48. Polypeptid gemäß Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass es die Aktivi
tät einer 4-Aminotransferase aufweist.
49. Polypeptid gemäß Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, dass es die Amino
säuresequenz gemäß SEQ ID NO: 34 oder eine Teilsequenz davon aufweist.
50. Polypeptid gemäß Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass es die Akti
vität einer N-Dimethyltransferase aufweist.
51. Polypeptid gemäß Anspruch 50, dadurch gekennzeichnet, dass es die Amino
säuresequenz gemäß SEQ ID NO: 36 oder eine Teilsequenz davon aufweist.
52. Polypeptid gemäß Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass es die Akti
vität einer 3,4-Reduktase aufweist.
53. Polypeptid gemäß Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, dass es die Amino
säuresequenz gemäß SEQ ID NO: 38 oder eine Teilsequenz davon aufweist.
54. Polypeptid gemäß Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass es die Aktivi
tät eines Transkriptions-Regulators aufweist.
55. Polypeptid gemäß Anspruch 54, dadurch gekennzeichnet, dass es die Amino
säuresequenz gemäß SEQ ID NO: 40 oder eine Teilsequenz davon aufweist.
56. Polypeptid gemäß Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass es die Akti
vität einer Polyketidsynthase aufweist.
57. Polypeptid gemäß Anspruch 56, dadurch gekennzeichnet, dass es die Amino
säuresequenz gemäß SEQ ID NOS:: 42, 44, 46, 48 oder 50, oder eine Teil
sequenz davon aufweist.
58. Polypeptid gemäß Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass es die Aktivi
tät einer Glucose-Dehydratase aufweist.
59. Polypeptid gemäß Anspruch 58, dadurch gekennzeichnet, dass es die Amino
säuresequenz gemäß SEQ ID NO: 53 aufweist.
60. Polypeptid gemäß Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass es die Akti
vität einer 3,5-Epimerase aufweist.
61. Polypeptid gemäß Anspruch 60, dadurch gekennzeichnet, dass es die Amino
säuresequenz gemäß SEQ ID NO: 55 aufweist.
62. Enzyme, die an Cyclisierungsreaktionen beteiligt sind, dadurch gekenn
zeichnet, dass sie die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 15 oder 22,
oder eine Teilsequenz davon, welche zumindest noch eine Teilreaktion durch
führen kann, umfassen oder eine mindestens 50%ige Identität dazu auf
Aminosäureebene aufweisen.
63. Antikörper, welcher spezifisch mit einem Polypeptid gemäß einem der An
sprüche 31 bis 62 reagiert.
64. Verfahren zur Herstellung einer Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1
bis 7, umfassend die folgenden Schritte:
- a) Vollständige chemische Synthese auf an sich bekannte Weise oder
- b) chemische Synthese von Oligonucleotiden, Markieren der Oligo nucleotide, Hybridisieren der Oligonucleotide an DNA einer geno mischen oder cDNA-Bank, die ausgehend von genomischer DNA bzw. mRNA aus S. spinosa hergestellt wurde, Selektieren von positiven Klonen und Isolieren der hybridisierenden DNA aus positiv en Klonen oder
- c) chemische Synthese von Oligonucleotiden und Amplifizierung der Ziel-DNA mittels PCR.
65. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 31
bis 62, umfassend die folgenden Schritte:
- a) Kultivieren einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 27 bis 30
unter Bedingungen, die die Expression der Nucleinsäure gemäß einem
der Ansprüche 1 bis 7 gewährleisten, oder
- 1. Exprimieren einer Nucleinsäure gemäß einem der Anprüche 1 bis 7 in einem in vitro-System, und
- b) Gewinnen des Polypeptids aus der Zelle, dem Kulturmedium oder dem in vitro-System.
66. Verfahren zum Herstellen von Spinosyn, Spinosyn-Vorstufen oder Spinosyn-
Derivaten umfassend die folgenden Schritte:
- a) Kultivieren einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 27 bis 30 unter Bedingungen, die die Expression der Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 gewährleisten und
- b) Gewinnen des Spinosyns, der Spinosyn-Vorstufe oder des Spinosyn- Derivates aus der Zelle oder dem Kulturmedium.
67. Verfahren zum Herstellen von Spinosyn-Derivaten, einschließlich Spinosyn-
Vorstufen, umfassend die folgenden Schritte:
- a) Austauschen zumindest einer Modul-codierenden Nucleinsäure sequenz gemäß Anspruch 7 gegen zumindest eine andere Modul codierende Nucleinsäuresequenz gemäß Anspruch 7, oder
- b) Austauschen zumindest einer Modul-codierenden Nucleinsäure sequenz gemäß Anspruch 7 gegen zumindest eine andere Modul codierende Nucleinsäuresequenz aus S. spinosa, oder
- c) Austauschen zumindest einer Modul-codierenden Nucleinsäure sequenz gemäß Anspruch 7 gegen zumindest eine andere Modul- codierende Nucleinsäuresequenz aus einem anderen Organismus als S. spinosa, oder
- d) Austauschen zumindest einer Domänen-codierenden Nucleinsäure sequenz gemäß Anspruch 7 gegen zumindest eine andere Domänen- codierende Nucleinsäuresequenz gemäß Anspruch 7, oder
- e) Austauschen zumindest einer Domänen-codierenden Nucleinsäure sequenz gemäß Anspruch 7 gegen zumindest eine andere Domänen- codierende Nukleinsäuresequenz aus S. spinosa, oder
- f) Austauschen zumindest einer Domänen-codierenden Nucleinsäure sequenz gemäß Anspruch 7 gegen zumindest eine andere Domänen- codierende Nucleinsäuresequenz aus einem anderen Organismus als S. spinosa, oder
- g) Austauschen einer ersten Acyltransferase-codierenden Nucleinsäure sequenz gemäß Anspruch 7 gegen eine zweite Acyltransferase- codierende Nucleinsäuresequenz gemäß Anspruch 7, wobei die zweite Acyltransferase eine unterschiedliche Substratspezifität aufweist als die erste Acyltransferase, oder
- h) Austauschen einer ersten Acyltransferase-codierenden Nucleinsäure sequenz gemäß Anspruch 7 gegen eine zweite Acyltransferase- codierende Nucleinsäuresequenz aus S. spinosa, wobei die zweite Acyltransferase eine unterschiedliche Substratspezifität aufweist als die erste Acyltransferase, oder
- i) Austauschen einer ersten Acyltransferase-codierenden Nucleinsäure sequenz gemäß Anspruch 7 gegen eine zweite Acyltransferase- codierende Nucleinsäuresequenz aus einem anderen Organismus als S. spinosa, wobei die zweite Acyltransferase eine unterschiedliche Substratspezifität aufweist als die erste Acyltransferase, oder
- j) Deletieren zumindest einer Domänen-codierender Nucleinsäure sequenz gemäß Anspruch 7, oder
- k) Integratieren zumindest einer Domänen-codierenden Nucleinsäure sequenz gemäß Anspruch 7 in eine Modul-codierende Nucleinsäure sequenz gemäß Anspruch 7, oder
- l) Mutagenisieren zumindest einer Domänen-codierenden Nucleinsäure sequenz gemäß Anspruch 7,
68. Verwendung einer Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 zum
Identifizieren, Inaktivieren und/oder Modifizieren von Genen der Spinosyn-
Biosynthese.
69. Verwendung einer Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 zum Er
zeugen einer Bibliothek aus Polyketidsynthasen.
70. Verfahren zum Anfügen eines Forosamin-Zuckerrestes an das Spinosyn-
Aglycon oder an das Spinosyn-17-Pseudoaglycon oder an ein Polyketid-
Aglycon, umfassend die folgenden Schritte:
- a) Übertragen einer Nucleinsäure gemäß SEQ ID NOS: 23, 25, 29, 31,
33, 35 und 37 in eine Wirtszelle, die das Spinosyn-Aglycon oder das
Spinosyn-17-Pseudoaglycon oder das Polyketid-Aglycon herstellen
kann, oder
- 1. Übertragen einer Nucleinsäure gemäß SEQ ID NOS: 23, 25, 29, 31, 33, 35 und 37 in eine Wirtszelle, die das Spinosyn-Aglycon oder das Spinosyn-17-Pseudoaglycon oder das Polyketid-Aglycon nicht her stellen kann und Zufügen des Spinosyn-Aglycons oder des Spinosyn- 17-Pseudoaglycons oder des Polyketid-Aglycons zum Kulturmedium, und
- b) Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, die zu einem aktiven Stoffwechsel der Zelle führen.
71. Verfahren zum Anfügen eines Trimethyl-Rhamnose-Zuckerrestes an das
Spinosyn-Aglycon oder an das Spinosyn-17-Pseudoaglycon oder an ein
Polyketid-Aglycon, umfassend die folgenden Schritte:
- a) Übertragen einer Nucleinsäure gemäß SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, 17
und/oder 19 in eine Wirtszelle, die das Spinosyn-Aglycon oder das
Spinosyn-17-Pseudoaglycon oder das Polyketid-Aglycon herstellen
kann, oder
- 1. Übertragen einer Nucleinsäure gemäß SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, 17 und/oder 19 in eine Wirtszelle, die das Spinosyn-Aglycon oder das Spinosyn-17-Pseudoaglycon oder das Polyketid-Aglycon nicht her stellen kann und Zufügen des Spinosyn-Aglycons oder des Spinosyn- 17-Pseudoaglycons oder des Polyketid-Aglycons zum Kulturmedium, und
- b) Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, die zu einem aktiven Stoffwechsel der Zelle führen.
72. Verfahren gemäß Anspruch 71, dadurch gekennzeichnet, dass im Schritt (a)
Nucleinsäuren gemäß SEQ ID NOS: 9, 11, 13 und 17 übertragen werden.
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