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Der
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von tensidfreien
Emulsionen aus dem einjährigen Beifuss (Artemisia annua)
und Pilzen der Gattung Ganoderma, die sich die durch verbesserte
Eigenschaften insbesondere durch Radikalfängereigenschaften
und einen Anti-Aging-Effekt auszeichnen und daher vielfältig
in der Kosmetik genutzt werden können.
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Stand der Technik
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1. Festkörperstabilisierte
Emulsionen
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Die
Herstellung von Festkörperstabilisierten Emulsionen ist
seit über 100 Jahren bekannt.
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2. Bisherige Nutzung von Artemisia
annua
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Der
Einjährige Beifuss (Artemisia annua) wird seit Jahrtausenden
als Heilpflanze verwendet. Die Pflanze ist in Europa und Asien beheimatet.
Sie wachst 2 bis 3 m hoch und hat frischgrüne, stark zerteilte
Blätter und winzig cremefarbene Blütenköpfe.
Zu medizinischen Zwecken werden die oberirdischen Teile der Pflanze
verwendet. Die Herstellung und Anwendung von Extrakten aus Artemisia
und deren Anwendung in den Bereichen Ernährung, Kosmetik
und Medizin ist aus der Literatur bekannt (z. B. Applied
Biochemistry and Biotechnology, 1990, Vol 24/25, pp 213–222).
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Die
Inhaltstoffe des Einjährigen Beifusses (Artemisia annua)
besitzen eine hohe Wirksamkeit gegen den Malariaerreger. Im Gegensatz
zu anderen Malariamitteln hat der Wirkstoff kaum Nebenwirkungen
und auch eine sehr günstige Resistenzlage, wobei er zusätzlich
mit anderen Stoffen kombiniert werden kann.
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Der
eigentliche Wirkstoff ist das Artemisinin (Artemesin, Cotexin),
ein sekundärer Pflanzenstoff (Sesquiterpen mit Peroxidgruppe),
der in den Blättern und Blüten des Einjährigen
Beifusses (Artemisia annua) vorkommt. Wie alle Pflanzenstoffe sind
diese in der Biomasse mit weiteren ähnlichen Substanzen
vergesellschaftet, da die biochemischen Wege nicht eingleisig verlaufen.
So sind 9 weitere verwandte Substanzen, die ebenfalls gegen den Malariaerreger
wirken, in den Pflanzen enthalten. Über 200 Inhaltstoffe
konnten in den pflanzlichen Teilen insgesamt nachgewiesen werden.
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Die
in der Literatur diskutierte Wirkungsweise des Artemisinins hängt
eng mit der chemischen Struktur zusammen. Die im Molekül
enthaltene Peroxidgruppe ist in Gegenwart hoher Konzentrationen
von Eisenionen instabil und bildet freie Radikale. Solche hohen
Konzentrationen werden in roten Blutkörperchen und auch
in Malariaerregern gefunden, die Eisen akkumulieren. Gelangt Artemisinin
in Erythrozyten, werden freie Radikale gebildet und der Parasit
möglicherweise dadurch getötet. Es gibt aber auch
Hinweise darauf, dass Artemisinin-Derivate bestimmte Enzyme hemmen.
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Aus
dem Artemisinin oder verwandten Pflanzensubstanzen wurden auch mehrere
halbsynthetische Derivate hergestellt, die aber alle zur Wirksamkeit
die Peroxidgruppierung enthalten müssen.
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Es
gibt erste Anhaltspunkte einer Wirkung auf verschiedene menschliche
Krebsarten. Nach Ergebnissen des Deutschen Krebsforschungszentrums
Heidelberg beruht auch diese Wirkung auf der Bildung freier Radikale
durch die Peroxid-Gruppierung in Gegenwart von Eisenionen. Die Prüfung
des Artemisinins als potentielles Antikrebsmedikament befindet sich
noch in einem frühen Stadium.
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Weitere
Anwendungen der peroxidhaltigen Strukturen auf der Haut, beispielsweise
zur lokalen Wundbehandlung, werden in
US2007269537 beschrieben.
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Es
ist davon auszugehen, dass die allgemeine Nachfrage nach Artemisinin-Präparaten
in den nächsten Jahren auf mehrere hundert Millionen Behandlungen
ansteigen wird. Um dieses Volumen zu produzieren, werden enorme
Mengen des pflanzlichen Wirkstoffes benötigt. Es wäre
deshalb von großem Vorteil, wenn es eine möglichst
hochwertige Verwertung der dabei in großem Überschuss
anfallenden Biomasse gäbe.
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Aus
einem Hektar Pflanzen lassen sich ein bis zwei Tonnen Blätter
ernten, aus denen rund zwei bis drei Kilogramm des Artemisinins
gewonnen werden können. Die Gewinnung aus pflanzlichen
Rohstoffen wird dadurch erschwert, dass der Artemisinin-Gehalt der
Pflanzen sehr gering ist und beträchtliche Schwankungen aufweist.
Er liegt meist zwischen 0,1 und 0,4%, bezogen auf das Trockengewicht.
Im Idealfall lassen sich von einem Hektar Pflanzenmaterial ein bis
zwei Tonnen Blätter ernten, aus denen mittels Extraktion
mit unpolaren Lösungsmitteln wie Hexan und nachfolgender
Behandlung mit Petrolether rund 2 bis 3 kg des Artemisinin gewonnen
werden können. Es entsteht dabei ein ölig-gelber
Extrakt der Pflanze, der zu Gel und anschließend zu weißem,
kristallinem Pulver raffiniert wird, welches Artemisinin als so
genanntes Blutschizontozid enthält.
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Die
restliche Biomasse bleibt bei den bisherigen Verwertungskonzepten
weitgehend unbeachtet, da sich die Nutzung der Pflanze bisher auf
die Verwendung des Artemisinins als Antimalaria-Mittel konzentriert.
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Im
Gegensatz zum Artemisinin sind bisher relativ wenige Anwendungen
für die übrigen Inhaltstoffe der Spezies Artemisia
beschrieben.
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3. Potentielle Kombinationspartner
für die Herstellung tensidfreier Emulsionen aus Artemisia
annua
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Artemisia
annua wird hauptsächlich in Kombinationen eingesetzt. So
ist in
KR20030051517 ein
Nahrungsergänzungsmittel beschrieben, das neben Hovenia
dulcis Thunberg and Semisulcospira libertine als Hauptbestandteilen
einen Zusatz von 8% Artemisia luayomogi enthält.
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In
KR20030005127 wird ein
Nahrungsergänzungsmittel beschrieben, das neben Hoving
Dulis Thunb und Alnus rubra Hovenia dulcis als Hauptbestandteilen
einen Zusatz von 10% Artemisia capillaris enthält. Artemisia
capillaris wird in
CN1615927 u.
a. als Mittel gegen Bluthochdruck beschrieben, wobei dem Stand der Technik
eine Mischung mit verschiedenen chinesischen Pflanzen entspricht.
CN1969679 beschreibt die
kombinierte Anwendung von Artemisia capillaris und G. lucidum in
Form eines Tees.
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In
JP2000143437 wird ein
Kosmetikum beschrieben, das wenigstens 2 der folgenden Pflanzenextrakte
enthält: Veronica undulata Wall, Ottelia alismoides Pers.,
Artemisia apiacea Hance, Artemisia annua L., Andrographis Paniculata
Nees, Dichroa febrifuga Lour., Eclipta prostrata L., Dipsacus asper
Wall, Dipsacus japonicus Miq., Boehmeria nivea Gaud., Polygonum
aviculare L., Sterculia lychnophera Hance, Carpesium abrotanoides
L. und Polyporus mylittae Cook. Eine Kombination aus Zuckeralkoholen
wie Xylitol oder Erythritol und Pflanzenextrakten, die u. a. auch
Artemisia capillaries enthalten kann, wird in
JP2001081008 für die externe Anwendung
auf der Haut beschrieben.
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Ein
Nahrungsergänzungsmittel, das einen Artemisia capillaris
Thunb.-Extrakt enthält, wird in
KR20050024920 beschrieben. Diese
Nahrungsergänzung soll der Hautalterung entgegen wirken.
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Biologisch
aktive Verbindungen aus Pilzen der Gattung Ganoderma sind seit langem
beschrieben (
U. Lindequist: Ganoderma. In: Nagers Handbuch
der pharmazeutischen Praxis/Hrsg F. von Bruchhausen, 5. vollständig
neubearbeitete Auflage, Springer-Verlag Berlin-Heidelberg New York
1998, Folgeband 2 Drogen A-K (Hrsg W. Blaschek). S. 750–761.
Die gesundheitsfördernden Inhaltstoffe der Gattung Ganoderma
werden vielfach mit Extrakten aus Artemisia spec. kombiniert. So
enthält die in von
KR20020078314 beschriebene
Kombination u. a. 3% Artemisia capillaris Thunb. Und 2% G. lucidum.
Auch im
JP2006143711 wird
eine Kombination von Extrakten aus Pflanzen und Pilzen beschrieben,
die u. a. auch Artemisia argyi Levi. et Vant und G.lucidum enthält.
Das in
KR20040032288 beschriebene
Nahrungsmittel enthält Artemisia capillaris Thunb in Kombination
mit Bierhefe und G. lucidum.
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KR20050001730 beschreibt
ein Nahrungsergänzungsmittel mit immunaktivierender und
Antitumor-Wirkung, das u. a. G. lucidum (FR) Karst und Artemisia
Messerschmidtiana Besser enthält.
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Triterpene,
isoliert aus Ganoderma concinna, können die Apoptose in
HL-60-Zellen einleiten (Gonzalez AG, Leon F, Rivera A, Padron
JI, Gonzalez-Plata J, Zuluaga JC et al. New Lanostanoids from the
Fungus Ganoderma concinna. J Nat Prod 2002; 65: 417–21).
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Triterpene,
erhältlich aus Ganoderma applanatum, sind gegen Hauttumore
der Maus wirksam (Chairul, Tokuyama T, Hayashi Y, Nishizawa
M, Tokuda H, Chairul SM, Hayashi Y. Applanoxidic acids A, B, C and D,
biologically aktive tetracyclic triterpenes from Ganoderma applanatum.
Phytochemistry 1991; 30: 4105–9; Chairul,
Chairul SM, Hayashi Y. Lanostanoid triterpenes from Ganoderma applanatum.
Phytochemistry 1994; 35: 1305–8). Eine Derivat
des Illudin war in klinischen Studien wirksam (Murgo A,
Cannon DJ, Blatner G, Cheson BD. Clinical trials of MGI-114. Oncology
1999; 13: 233–8).
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Bewährt
hat sich die Zuführung von Lentinan in Ergänzung
zur Chemotherapie bei Patienten mit Magenkrebs, Darmkrebs und anderen
Tumoren (Hazama S, Oka M, Yoshino S, Iizuka N, Wadamori
K, Yamamoto et al. Clinical effects and immunological analysis of
intraabdominal and intrapleural injection of lentinan for malignant
ascites and pleural effusion of gastric carcinoma. Cancer & Chemotherapy
1995; 22: 1595–7).
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CN1351886 beschreibt ein
Mittel aus 20 Komponenten der chinesischen Medizin, das u. a. G.
lucidum und Artemisia capillaris enthält und das bei Lebererkrankungen
eingesetzt werden soll. Auch das
CN1092295 lehrt
die Verwendung von G. lucidum und Artemisia capillaris in einer
Kombination vieler Kräuterextrakte zur Bekämpfung
verschiedener Erkrankungen.
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JP2048517 beschreibt ein
Haarpflegemittel, das u. a. Artemisia apiacea Hance und G. lucidum
enthält.
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Wie
dieser Aufzählung zu entnehmen ist, werden bei den beschriebenen
Kombinationen aus Extrakten der Gattungen Artemisia und Ganoderma
zwar verschiedene Arten von der Gattung Artemisia eingesetzt, während
der Einsatz von Ganoderma-Arten bisher auf die Verwendung der Spezies
G. lucidum beschränkt ist. Eine Kombination aus Artemisia
annua mit Ganoderma pfeifferi ist bisher nicht bekannt, obwohl Extrakte
aus G. pfeifferi aus der deutschen Patentanmeldung
DE 10 2005 031 363 A1 bekannt
sind.
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Alle
im Stand der Technik beschriebenen Anwendungen nutzen Extrakte aus
Artemisia annua. Bei Extrakten wird nur ein Teil der Inhaltstoffe
genutzt. Das Verhältnis der Inhaltsstoffe zueinander wird
durch den Extraktionsprozess verändert und entspricht nicht
mehr den physiologischen Verhältnissen.
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Die
Nutzung der Triterpene aus Ganoderma-Arten zur Herstellung von Feststoffstabilisierten
Emulsionen wurde bisher nicht beschrieben. Auch tensidfreie Dermatikagrundlagen
mit Anti-Aging-Effekt auf der Grundlage einer Kombination von Artemisia
annua und Ganoderma spec. sind bisher nicht bekannt. Insbesondere
werden bisher weder Artemisia annua noch Ganoderma spec. enthaltende
Sprühemulsionen auf der Basis von feststoffstabilisierten
Emulsionen zum UV-Schutz eingesetzt, obwohl sich vor allem Sonnenschutz-
und Körperpflegesprays im Markt etabliert haben und vom
Anwender aufgrund ihrer einfachen Handhabung als angenehm empfunden
werden.
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4. Stand der Technik bei vorgesehenen
Anwendungen Anti-Aging und Sonnenschutz
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Als
Hautalterung wird der komplexe biologische Prozess der mit dem Alter
einhergehenden Veränderung der Haut bezeichnet. Während
die intrinsische Alterung, also die genetisch gesteuerte verminderte
Reagibilität der Hautzellen nicht beeinflusst werden kann,
kann die durch extrinsischen Faktoren (Umweltfaktoren wie UV-Licht,
chemische Reagentien, mechanische Belastung, Stress, Hitze und Kalte)
bewirkte Zellalterung durch Anti-Aging-Präparate vermindert
werden. Insbesondere unter dem Einfluss freier Radikale kommt es
zu einer Erschöpfung der Zellprozesse, der Zellteilung,
zu einer erhöhten Permeabilität der Zellmembranen
und zu einer Minderversorgung der Zellen.
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Als
sichtbare Zeichen dieser umweltbedingten Zellalterung bekommt die
Haut tiefe Falten und Runzeln, ihre trockene Oberfläche
neigt zu Einrissen und Pseudonarben, die Oberhaut wird dünner.
Es wird weniger Fett produziert, die Haut verliert an Elastizität
und ist nicht mehr so regenerationsfähig. Da vor allem
die UVA-Strahlung tief in die Haut eindringt, erzeugt sie in der
Lederhaut Singulett-Sauerstoff. Dieser bewirkt die Produktion von
Enzymen, die die kollagenen Fasern schädigen und damit
die Straffheit der Haut reduzieren. Gleichzeitig quellen elastische
Fasern auf, was zu einem Verlust der Dehnbarkeit der Haut führt.
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Das
Problem aller Kosmetikpräparate im Zusammenhang mit Anti-Aging
ist jedoch, dass bisher vor allem die sichtbaren äußeren
Zeichen der Hautalterung beurteilt werden. Dem stand der Technik
entsprechende Cremes können diese sichtbaren Zeichen nur
mindern, solange die Ursache – die umweltbedingte Zellalterung – nicht
beseitigt wird. Bereits vorhandene Falten kann man nicht zum Verschwinden
bringen, sondern der Haut im Wesentlichen Feuchtigkeit und Fett
zuführen, so dass sie vorübergehend glatter erscheint.
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Da
der Einfluss auf die umweltbedingte Alterung der Zellen bisher nicht
experimentell nachgewiesen werden konnte, wird der Alterungsprozess
der Hautzellen durch dem Stand der Technik entsprechende Mittel praktisch
nicht beeinflusst.
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Eine
wesentliche Ursache für die vorzeitige Hautalterung ist
die UV-Strahlung.
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Bei
herkömmlichen Sonnenschutzmitteln auf der Basis von Titandioxid
(TiO2) wird die Reflektion und Adsorption
durch mikrofeine Partikel aus Titandioxid oder Zinkoxid, die das
einfallende UV-Licht reflektieren, ausgenutzt, um eine Erythembildung
(Sonnenbrand) zu vermeiden. Als anorganische UV-Filter fungieren.
In modernen Präparaten werden die Pigmentpartikel auf etwa
200 Nanometer verkleinert.
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Bei
Exposition mit ultraviolettem(UV-)Licht absorbieren photokatalytische
Substanzen wie Titandioxid (TiO2;) in hohem
Maße UV-Strahlung. Bei der Reaktion von Titandioxid mit
UV-Strahlung bilden sich jedoch in Anwesenheit von Wasser und Sauerstoff
freie Radikale. Es ist nachgewiesen, dass durch den photokatalytischen
Effekt von Titandioxid bei Anwendung von Titandioxid in UV-Schutzmitteln
neben einer vorzeitigen Zellalterung auch Schäden der DNA
durch freie Radikale auftreten, deren Bildung durch das Schutzmittel
nicht verhindert, sondern infolge der photokatalytischen Reaktion
sogar verstärkt wird.
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Praktisch
kein Sonnenschutzmittel verzichtet deshalb heute auf den Zusatz
von Radikalfängern. Dies ist durchaus sinnvoll, da reaktive
Sauerstoffspezies an allen Entzündungsvorgängen
beteiligt sind und vor allem die ungesättigten Verbindungen
(Aminosäuren, Proteine, Lipide) angreifen, aus denen die
Zellwände und DNA-Strukturen der Zellkerne aufgebaut sind.
Freie Radikale und reaktive Sauerstoffspezies spielen auch bei der
Polymorphen Lichtdermatose – vom Laien oft als Sonnenallergie
bezeichnet – eine Rolle. In Sonnenschutzprodukten findet
man deshalb eine Vielzahl von Substanzen, die freie Radikale neutralisieren
sollen: Vitamin E, Vitamin C, Glucosylrutin, Furalglucitol, Ginkgo-Extrakt,
Thermalwasser, Silymarin, Superoxiddismutase, Grüner Tee-Extrakt,
Bakterienlysate, Bio Melanin, Ferulasäure oder Carboxymethyl-Glucan.
Bei einigen Substanzen ist jedoch fraglich, ob sie auch bei topischer
Anwendung als Radikalfänger wirken.
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Ein
potenter Radikalfänger ist das Flavonoid Glucosylrutin,
das in Kombination mit Vitamin E als Pre Sun Creme zur Prophylaxe
der Polymorphen Lichtdermatose Tage vor dem Aufenthalt in der Sonne
aufgetragen wird (Hadschiew 1997). Dem gleichen
Prinzip folgt die Empfehlung, die Haut frühzeitig mit einer
hochkonzentrierten Vitamin E-Creme (Beispiel Optolind E) abzusättigen
(Heinrich 1994).
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Fast
jedes Sonnenschutzmittel enthält Vitamin E (Tocopherol).
Reine Vitamin E-Cremes erreichen einen Lichtschutzfaktor von etwa
3. Durch die perorale Aufnahme lassen sich in der Epidermis keine
ausreichend hohen Tocopherol-Konzentrationen erreichen. Überdies
zeigen Studien, dass sich die Vitamin E-Konzentration in der Haut
durch Sonneneinstrahlung um bis zu fünfzig Prozent verringern
kann (Thiele 1998). Deshalb ist eine lokale Applikation
erforderlich. Als Acetat penetriert Vitamin E gut in die Epidermis,
wo es durch Esterasen in freies Vitamin E gespalten wird. Auf Grund
seiner Struktur kann es gut in die Zellwand eingelagert werden und
schützt diese vor dem Angriff der Radikale.
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Zur
Charakterisierung der Qualität eines Sonnenschutzmittels
wird der Schutz vor Sonnenbrand in Zukunft nicht mehr im Vordergrund
stehen. Der Lichtschutzfaktor hilft zwar, bei richtiger Anwendung
ein Erythem zu vermeiden, er gibt aber keine Anleitung, wie der
Verbraucher eine Immunsuppression oder nicht mehr reparierbare Zellkernschäden
vermeiden kann. Dazu braucht man neue Messkriterien.
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Bei
der photokatalytischen Reaktion entstehen u. a. sehr reaktionsfähige
freie OH-Radikale, die eine starke antimikrobielle Wirkung haben
(A. Heller: Chemistry and Applications of Photocatalytic
Oxidation of Thin Organic Films. Acc. Chem. Res., Vol. 28, No. 12
(1995) 503/D. Bahnemann: Photocatalytic Detoxification
of Polluted Waters. The Handbook of Environmental Chemistry, Springer
Verlag 1999, Volume 2, Part L, 285–351. Es wird
unter photokatalytischer Aktivierung durch UV-Licht eine sehr starke
Reduktion des Ausgangskeimgehaltes bei E. faecium auf 0,01%, bei
S. aureus auf = 0,001% und bei E. coli auf 0,00002% erreicht. Diese
starke biozide Wirkung ist bei Anwendungen auf der Haut unerwünscht.
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Aufgabe der Erfindung
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Es
war daher eine Aufgabe der Erfindung, neue tensidfreie Hautpflegemittel
zu entwickeln, die einerseits die genannten Nachteile vermeiden
und andererseits neue Anwendungen der Biomasse von Artemisia annua
als kosmetische oder pharmazeutische Mittel ermöglichen.
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Darstellung der Erfindung
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Die
Aufgabe wurde gemäß den Merkmalen der Patentansprüche
gelöst, erfindungsgemäß durch eine pharmazeutische
oder kosmetische Zusammensetzung, umfassend Extrakte aus Pflanzen
der Art Artemisia annua und Extrakte von Pilzen der Gattung Ganoderma,
wobei die Extrakte aus Pflanzen der Art Artemisia annua mit polaren
Lösungsmitteln gewonnen werden, nachdem in einem vorher
erfolgten Extraktionsschritt mit unpolaren Lösungsmitteln
Artemisinin (Sesquiterpen-Peroxide) entfernt wurde.
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Die
Teilaufgabe, Anwendungen für diejenigen Inhaltstoffe von
Artemisia annua zu finden, die keine Peroxid-Gruppierung tragen
und daher nicht zur Malaria-Therapie geeignet sind, wird erfindungsgemäß einerseits
durch ein zwei- oder dreistufiges Extraktionsverfahren und andererseits
durch geeignete Kombinationen gelöst.
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Bei
dem erfindungsgemäßen mebrstufigen Extraktionsverfahren
wird im ersten Schritt mit unpolaren Lösemitteln extrahiert.
Durch Extraktion mit Pentan, Hexan, Petrolether oder anderen unpolaren
Lösemitteln erfolgt die Entfernung von Artemisinin und
Lipiden, die einer gesonderten Verwendung zugeführt werden
können. Das Extraktionsverfahren mit unpolaren Lösemitteln
wie Pentan oder Petrolether kann in bekannter Weise sowohl diskontinuierlich
als auch mit kontinuierlichen Verfahren wie der Extraktion mittels
Soxhlet-Apparat oder Perkolator durchgeführt werden. Das
resultierende Pflanzenmaterial wird in geeigneter Weise, beispielsweise
durch Vakuumtrocknung, von dem anhaftenden Restlösemittel
befreit.
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Wie
wir gefunden haben, weist die resultierende Biomasse – auch
in Gegenwart von Eisenionen – im Gegensatz zum Ausgangsmaterial
keine Zytotoxizität auf. Sie ist daher als Komponente in
Kosmetika wesentlich besser geeignet als die im Stand der Technik
entsprechende direkte Verwendung des Pflanzenmaterials. Die resultierende
Biomasse enthält Wirkstoffe mit einer hohen Radikalfängerkapazität,
die die Pflanze selbst vor einer Eigenschädigung durch
freie Radikale schützen. Zur Nutzung dieser Radikalfängerkapazität
wird die resultierende Biomasse erfindungsgemäß einer
zweiten Extraktion unterworfen. Diese wiederum kann alkoholisch,
wässrig-alkoholisch oder wässrig sein, wobei überraschender
Weise in jedem Extrakt Wirkstoffe mit Radikalfängereigenschaften
gefunden werden.
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Bei
der erfindungsgemäßen dreistufigen Extraktion
werden zunächst wie beim zweistufigen Verfahren mit unpolaren
Lösemitteln wie Pentan, Hexan oder Petrolether Artemisinin
und Lipide aus dem Pflanzenmaterial entfernt.
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Das
extrahierte Pflanzenmaterial wird beispielsweise durch Vakuumtrocknung,
von dem anhaftenden Restlösemittel befreit und einer zweiten
Extraktion mit niederen Alkoholen wie Methanol oder Ethanol unterworfen,
woraus ein alkoholischer Extrakt resultiert.
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In
einer dritten Extraktionsstufe können nun nach Entfernung
von restlichem Alkohol z. B. im Vakuum oder auch ohne Entfernung
des noch anhaftenden Alkohols weitere Wirkstoffe durch wässrige
Extraktion gewonnen werden.
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Als
Extraktionsverfahren für die alkoholische Extraktion bieten
sich sowohl diskontinuierliche als auch kontinuierliche Verfahren
wie die Extraktion mittels Soxhlet-Apparat oder Perkolator an. Die
wässrig-alkoholische oder wässrige Extraktion
wird zweckmäßiger Weise beispielsweise in Form
einer Mazeration diskontinuierlich ausgeführt.
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In
besonders vorteilhafter Weise wurde die Aufgabe, die Anwendbarkeit
der Biomasse von Artemisia annua als gesundheitsfördernde
Mittel zu verbessern, gelöst, indem entweder getrocknete
und zerkleinerte Pflanzen der Spezies Artemisia annua oder aber
die Rückstände der oben beschriebenen Extraktion
der Pflanzen mit Pentan, Hexan, Petrolether oder anderen unpolaren
Lösemitteln einerseits mit getrocknetem und zerkleinertem
Mycel und/oder Fruchtkörper von Pilzen einer oder mehrerer
Spezies der Gattung Ganoderma andererseits gemischt werden und das
Gemisch einer alkoholischen, wässrig-alkoholischen oder
wässrigen Extraktion unterzogen wird.
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Es
ist ebenfalls erfinderisch, die mehrstufige Extraktion der getrockneten
und zerkleinerten Pflanzen der Spezies Artemisia annua und von Pilzen
der Gattung Ganoderma separat durchzuführen und die so
gewonnenen verschiedenen Extrakte in einem geeigneten Verhältnis
zu mischen.
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Der
hohe Triperpengehalt der ausgewählten Spezies der Gattung
Ganoderma bildet die Voraussetzung für die Herstellung
tensidfreier Emulsionssysteme als Grundlagen für innovative
Dermatika und Kosmetika. Triterpene sind biologisch aktive sekundäre
Pflanzenstoffe, die antimikrobielle, insbesondere antivirale und
antiimmflammatorische Eigenschaften besitzen. Überraschend
ist der Gehalt einiger Triterpene in G. pfeifferi teilweise gegenüber
G. lucidum bis zum 100fachen erhöht. Der Gehalt an dem
Triterpen Lucialdehyd B in G. lucidum beträgt beispielsweise
0,14 mg/100 g, in G. pfeifferi dagegen 19,2 mg/100 g.
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Zur
Herstellung tensidfreier Emulsionssysteme suspensiert man die erfindungsgemäß erhaltenen Pflanzen-
und Pilzextrakte – gegebenenfalls unter Zugabe weiterer
Triterpene insbesondere von Triterpensäuren wie Ursolsäuren,
Betulinsäure und/oder Boswelliasäuren – in
natürlichen Wachsen, vorzugsweise in Jojobaöl.
Durch Homogenisieren erhält man daraus eine feststoffstabilisierte
Emulsion mit Anti-Aging-Effekt, die es erlaubt, verschiedene kosmetische
Produkte ohne weitere Emulgatoren, vor allem ohne synthetische Tenside,
herzustellen. Erfindungsgemäß tragen als Feststoffe
eingearbeitete Mikropigmente vorzugsweise Metalloxide und/oder andere
in Wasser schwerlösliche oder unlösliche Metallverbindungen
sowie eventuell auch die UV-Filter neben ihrer eigentlichen Zweckbestimmung
auch zur Stabilisierung der Rezeptur bei. Die Mikropigmente binden
an der Ölphase des Systems und verbessern dadurch gleichzeitig
die Verteilbarkeit der Formulierung auf der Haut. Durch den stabilisierenden
Effekt der Mikropigmente kann auf andere oberflächenaktive Hilfsstoffe
weitgehend verzichtet werden. Hierdurch wird die Gefahr von Hautunverträglichkeiten
insgesamt verringert. In tensidfreien Sonnenschutzemulsionen entfallen
möglicher Wechselwirkungen der Tenside mit der Haut. Als
relativ kleine grenzflächenaktive Moleküle neigen
Tenside insbesondere zu Interaktionen mit den interzellulären
Lipiden des Stratum corneum und können so die epidermale
Barrierefunktion schwächen. Außerdem können
sie aufgrund ihrer penetrationsfördernden Eigenschaften
Rezepturbestandteile mit irritativem oder allergenem Potential verstärkt
in die Haut schleusen. Seit langem ist bekannt, dass durch das Zusammenwirken
von UVA-Strahlung und bestimmten Inhaltsstoffen in Kosmetika, vor
allem Lipiden und Tensiden, die so genannte Mallorca-Akne ausgelöst
werden kann. Bei Verwendung der erfindungsgemäßen
Zubereitungen, die frei von synthetischen Tensiden sind und gleichzeitig
einen hohen UVA-Schutz aufweisen, ist diese typische Hautreaktion
nicht zu erwarten. Das in den erfindungsgemäßen
Zubereitungen enthaltene Jojobaöl verstärkt den
zellschützenden Effekt und vermindert das Risiko von Nebenwirkungen.
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Ein
weiterer Vorteil tensidfreier Emulsionssysteme ist, dass sie sich
sehr gut als Grundlagen für Sprayprodukte eignen. Tensidhaltige
Sprühemulsionen fühlen sich auf der Haut klebrig
an. Im Gegensatz dazu schützen die erfindungsgemäßen
feststoffstabilisierte Emulsionen die Haut ohne einen schmierigen
Film auf der Haut zu hinterlassen. Insbesondere für die
Verwendung als Sonnenschutzmittel ist es vorteilhaft, die erfindungsgemäßen
Sprühemulsionen durch die Zugabe von Copolymeren des Polyvinylpyrrolidons
zusätzlich zu stabilisieren. Polymere auf Basis von Polyvinylpyrrolidon
(PVP) oder andere polymere Filmbildner, wie beispielsweise Natriumpolystryrensulfonat,
bilden nach dem Verdunsten des Lösemittels einen Film aus,
der wesentlichen zur Schutzfunktion beiträgt.
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Die
erfindungsgemäßen Sonnenschutzmittel wirken durch
die Kombination von UV-Filter, Radikalfängern und entzündungshemmenden
Substanzen prophylaktisch bei der Vermeidung einer UV-bedingten
vorzeitigen Hautalterung und darüber hinaus entzündungshemmend.
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In
höheren Konzentrationen zeigen die Extrakte von Artemisia
annua eine hohe Radikalfänger-Kapazität, die aber
bei höheren Verdünnungen deutlich abnimmt. Überraschenderweise
wurde gefunden, dass bereits geringe Zusätze von Extrakten
beispielsweise aus G. pfeifferi eine starke Erhöhung der
Radikalfänger-Kapazität bewirken. So wies der
wässrige Extrakt aus der Kombination Artemisia annua:Ganoderma
pfeifferi = 99:1 bereits in einer Verdünnung von 1 zu 100
im DPPH-Test eine Radikalfangeraktivität von 89% auf. Ohne den
Zusatz von G. pfeifferi ist die Radikalfangeraktivität
von Artemisia annua in dieser Verdünnung nicht ausreichend
(Radikalfangeraktivität des wässrigen bzw. des
alkoholischen Extraktes im DPPH-Test zwischen 34 bzw. 3%). Die Kombination
mit G. pfeffferi reduziert also zusätzlich den oxidativen
Stress und verstärkt die endogene Radikalabwehr, und unterstützt
damit den Anti-Aging Effekt. Die nur bei G. pfeifferi nachgewiesenen Inhaltsstoffe
Ganomycin A und B hemmen bei einer Konzentration von 10 μ g/ml
die durch Luminol induzierte und die spontane Sauerstoffradikalfreisetzung.
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Durch
die Kombination wird die Proliferation von humanen Keratinocyten
gesteigert. Unter dem Einfluss der Kombination steigt der Glucoseverbrauch
von humanen Zellen, was auf eine Anregung des Stoffwechsels hinweist.
Es wurde gefunden, dass die Bildung von Proteinen gefördert
und die Zellalterung verlangsamt wird.
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Die
unter UV-Einfluss erhöhte Zellpermeabilität – messbar
durch Bestimmung der LDH-Aktivität im Medium – wird
vermindert. Die Regenerationsfähigkeit der Zellen nach
einer UV-Schädigung wird deutlich erhöht.
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Bei
der photokatalytischen Reaktion entstehen u. a. sehr reaktionsfähige
freie OH-Radikale, die eine starke antimikrobielle Wirkung haben.
Dementsprechend wird die physiologische Hautflora stark geschädigt. Durch
die erfindungsgemäße Kombination wird dieser Effekt
stark vermindert.
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In
der Kombination von Artemisia annua und Ganoderma spec. sind sowohl
bei der gemeinsamen Extraktion der Biomassen als auch bei der Kombination
der Extrakte praktisch alle Mischungsverhältnisse möglich.
Es können dabei vorteilhaft auch Mischungen verschiedener
Ganoderma-Arten eingesetzt werden. In einer vorteilhaften Ausführungsform
der Erfindung werden dabei Extrakte aus verschiedenen Ganoderma-Arten gemischt.
Insbesondere ist es vorteilhaft, den wässrigen Extrakt
von G. lucidum mit dem ethanolischen Extrakt von G. pfeifferi zu
mischen. Der wässrige Extrakt von G. lucidum enthält
Wirkstoffe, die die Apoptose von Tumorzellen einleiten, die Phagozytose
durch Makrophagen aktivieren und die Immunantwort stimulieren, der
alkoholische Extrakt von G. pfeffferi enthält Wirkstoffe,
die den Stoffwechsel von gesunden Zellen stimulieren. Der stimulierende
Effekt auf gesunde Zellen ist nur bei lipophilen Extrakten aus G.
pfeffferi nachweisbar. Der Glucan-Gehalt des wässrigen
Extraktes, der zur Stimulierung des Immunsystems führt,
ist bei G. pfeifferi jedoch wesentlich geringer als bei G. lucidum
oder G. tsugae. Die Kombination des ethanolischen Extraktes aus G.
pfeifferi und des wässrigen Extraktes aus G. lucidum oder
G. tsugae führt zur erwünschten Wirkung.
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Ein
wesentlicher Vorteil der erfindungsgemäßen Zubereitungen
ist, dass der Zellschutz durch Triterpene aus Ganoderma-Arten vervollständigt
wird. Insbesondere Triterpene aus Ganoderma concinna können frühzeitig
die Apoptose von Zellen einleiten, bei denen trotz der Radikalfängerwirkung
zur Entartung gekommen ist. Tetrazyklische Triterpenes und Lanostanoid-Triterpene
aus Ganoderma applanatum unterstützen den Körper
bei der Tumorabwehr, so dass deren Zumischung besondere Vorteile
bringt.
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Aus
dem Fruchtkörper und dem Mycel der Gattung Ganoderma stammende
Wirkstoffe ergänzen nicht nur die Wirkung der Inhaltstoffe
von Artemisia annua als Radikalfänger, sondern bewirken
zusätzlich eine Hemmung der Aktivität von neutralen
Endopeptidasen und/oder eine Hemmung der Aktivität des
Angiotensin-Konverting-Enzyms.
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Die
erfindungsgemäßen kosmetischen und pharmazeutischen
Zubereitungen können weitere Pflanzenextrakte enthalten.
Geeignet sind vor allem die Extrakte spezieller Pflanzen wie Grünem
Tee, Hamamelis, Kamille, Ringelblume, Paeonie, Aloe Vera, Rosskastanie,
Salbei, Weidenrinde, Weißdorn, Lindenblüten, Mandeln,
Fichtennadeln, Sandelholz, Kokosnuss, Kiwi, Guave, Limette, Mango,
Aprikose, Weizen, Melone, Orange, Grapefruit, Avocado, Rosmarin,
Malve, Wiesenschaumkraut, Thymian, Melisse, Eibisch, Malve, Ginseng, Birke,
wobei Extrakte aus dem teilungsfähigen Bildungsgewebe bevorzugt
werden. Weiterhin kann es bevorzugt sein, in den erfindungsgemäßen
Mitteln Mischungen aus mehreren verschiedenen Pflanzenextrakten
einzusetzen.
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Die
erfindungsgemäßen kosmetischen und pharmazeutischen
Zubereitungen können auch mit Algenextrakte kombiniert
werden. Geeignete Algenextrakte stammen aus Grünalgen,
Braunalgen, Rotalgen oder Blaualgen (Cyanobakterien).
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Es
wurde gefunden, dass die erfindungsgemäßen Zubereitungen,
die die Naturstoffe verschiedener Pflanzen und Pilze nutzen, deren
Wirkstoffe durch die erfindungsgemäßen feststoffstabilisierten
Emulsionen besser nutzen und rascher zur Penetration bringen als
durch Formulierungen mit großen Öltropfen.
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Sprays
auf der Basis der erfindungsgemäßen tensidfreien
Emulsionen können sowohl zum Schutz vor UV-Strahlung als
auch als after-sun-Produkte eingesetzt werden.
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Zubereitungen
zum Schutz vor UV-Strahlung im Sinne der vorliegenden Erfindung
enthalten vorzugsweise mindestens eine UV-A-, UV-B- und/oder Breitbandfiltersubstanz.
Die Formulierungen können, obgleich nicht notwendig, gegebenenfalls
auch ein oder mehrere organische und/oder anorganische Pigmente
als UV-Filtersubstanzen enthalten, welche in der Wasser- und/oder
der Ölphase vorliegen können. Die Pigmente können
vorteilhaft im Sinne der vorliegenden Erfindung auch in Form kommerziell
erhältlicher öliger oder wässriger Vordispersionen
zur Anwendung kommen. Die Pigmente können vorteilhaft oberflächlich
behandelt (gecoatet”) sein, wobei beispielsweise ein hydrophiler,
amphiphiler oder hydrophober Charakter gebildet werden bzw. erhalten
bleibt. Diese Oberflächenbehandlung kann darin bestehen,
dass die Pigmente nach an sich bekannten Verfahren mit einer dünnen
hydrophilen und/oder hydrophoben anorganischen und/oder organischen Schicht
versehen werden. Die verschiedenen Oberflächenbeschichtungen
tragen erfindungsgemäß zur Stabilisierung der
Emulsion bei.
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Anorganische
Oberflächenbeschichtungen im Sinne der vorliegenden Erfindung
können bestehen aus Aluminiumoxid (Al2O3), Aluminiumhydroxid Al(OH)3,
bzw. Aluminiumoxidhydrat (auch: Alumina, CAS-Nr.: 1333-84-2), Natriumhexametaphosphat
(NaPO3)6, Natriummetaphosphat
(NaPO3)n, Siliciumdioxid
(SiO2) (auch: Silica, CAS-Nr.: 7631-86-9),
oder Eisenoxid (Fe2O3).
Diese anorganischen Oberflächenbeschichtungen können
allein, in Kombination und/oder in Kombination mit organischen Beschichtungsmaterialien
vorkommen.
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Organische
Oberflächenbeschichtungen im Sinne der vorliegenden Erfindung
können bestehen aus pflanzlichem oder tierischem Aluminiumstearat,
pflanzlicher oder tierischer Stearinsäure, Laurinsäure,
Dimethylpolysiloxan (auch: Dimethicone), Methylpolysiloxan (Methicone),
Simethicone (einem Gemisch aus Dimethylpolysiloxan mit einer durchschnittlichen
Kettenlänge von 200 bis 350 Dimethylsiloxan-Einheiten und
Silicagel) oder Alginsäure. Diese organischen Oberflächenbeschichtungen
können allein, in Kombination und/oder in Kombination mit
anorganischen Beschichtungsmaterialien vorkommen.
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Die
Liste der genannten UV-Filter, die im Sinne der vorliegenden Erfindung
eingesetzt werden können, soll selbstverständlich
nicht limitierend sein.
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Vorteilhaft
enthalten die erfindungsgemäßen Zubereitungen
die Substanzen, die UV-Strahlung im UV-A- und/oder UV-B-Bereich
absorbieren, in einer Gesamtmenge von z. B. 0,1 Gew.-% bis 30 Gew.-%,
vorzugsweise 0,5 bis 20 Gew.-%, insbesondere 1,0 bis 15,0 Gew.-%,
jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der Zubereitungen, um kosmetische
Zubereitungen zur Verfügung zu stellen, die die Haut vor
dem gesamten Bereich der ultravioletten Strahlung schützen.
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After
sun-Produkte und Anti-Aging-Produkte auf Basis der erfindungsgemäßen
tensidfreien Emulsionen können weitere Wirkstoffe enthalten.
Um die Schutzwirkung zu erhöhen, werden vorzugsweise Vitamine und
Antioxidantien gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Aminosäuren
(z. B. Glycin, Histidin, Tyrosin, Tryptophan) und deren Derivate,
Imidazole, (z. B. Urocaninsäure) und deren Derivate, Peptide
wie D, L-Carnosin, D-Carnosin, L-Carnosin und deren Derivate (z.
B. Anserin), Carotinoide, Carotin und deren Derivate, Chlorogensäure
und deren Derivate, Liponsäure und deren Derivate, Aurothioglucose,
Propylthiouracil und andere Thiole (z. B. Thioredoxin, Glutathion,
Cystein, Cystin, Cystamin und deren Glycosyl-, N-Acetyl-, Methyl-,
Ethyl-, Propyl-, Amyl-, Butyl- und Lauryl-, Palmitoyl-, Oleyl-, &ggr;-Linoleyl,
Cholesteryl- und Glycerylester) sowie deren Salze, Diaurylthiodipropionat,
Distearylthiodipropionat, Thiodipropiosäure und deren Derivate
(Ester, Ether, Peptide, Lipide, Nukleotide, Nukleoside und Salze)
sowie Sulfoximinverbindungen (z. B. Buthioninsulfoximine, Homocysteinsulfoximin,
Buthioninsulfone, Penta-, Hexa-, Heptathioninsulfoximin) in sehr
geringen verträglichen Dosierungen (z. B. pmol bis &mgr;mol/kg), ferner
(Metall-)Chelatoren, Hydroxysäuren (z. B. Citronensäure,
Milchsäure, Äpfelsäure), Huminsäure,
Gallensäure, Gallenextrakte, Bilirubin, Biliverdin, EDTA, EGTA
und deren Derivate, ungesättigte Fettsäuren und
deren Derivate, Vitamin C und Derivate (z. B. Ascorbylpalmitat,
Magnesium-Ascorbylphosphat, Ascorbylacetat), Tocopherole und Derivate
(z. B. Vitamin-E-acetat), Vitamin A und Derivate (z. B. Vitamin-A-palmitat)
sowie Koniferylbenzoat des Benzoeharzes, Rutinsäure und
deren Derivate,, Ferulasäure und deren Derivate, Furfurylidenglucitol,
Carnosin, Butylhydroxytoluol, Butylhydroxyanisol, Nordohydroguajaretsäure,
Trihydroxybutyrophenon, Quercitin, Harnsäure und deren
Derivate, Mannose und deren Derivate, Selen und dessen Derivate
(z. B. Selenmethionin), Stilbene und deren Derivate (z. B. Stilbenoxid,
trans-Stilbenoxid). Mischungen von Antioxidantien sind ebenfalls
zur Verwendung in den erfindungsgemäßen kosmetischen
Zubereitungen geeignet. In besonderer Weise bevorzugt sind Phenolsäuren
und Flavonoide.
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Weiterhin
können die erfindungsgemäßen Zubereitungen
zur Unterstützung des Anti-Aging-Effektes Proteinhydrolysate
oder deren Derivat enthalten. Erfindungsgemäß können
sowohl pflanzliche als auch tierische Proteinhydrolysate eingesetzt
werden. Tierische Proteinhydrolysate sind z. B. Elastin-, Collagen-,
Keratin-, Seiden- und Milcheiweiß-Proteinhydrolysate, die
auch in Form von Salzen vorliegen können. Erfindungsgemäß bevorzugt
sind pflanzliche Proteinhydrolysate, z. B. Soja-, Weizen-, Mandel-,
Erbsen-, Kartoffel- und Reisproteinhydrolysate. Wenngleich der Einsatz
der zusätzlichen Proteinhydrolysate als solche bevorzugt
ist, können an ihrer Stelle gegebenenfalls auch anderweitig
erhaltene Aminosäuregemische oder einzelne Aminosäuren
wie beispielsweise Arginin, Lysin, Histidin oder Pyrroglutaminsäure
eingesetzt werden. Ebenfalls möglich ist der Einsatz von
Derivaten der Proteinhydrolysate, z. B. in Form ihrer Fettsäure-Kondensationsprodukte. In
den erfindungsgemäßen kosmetischen und pharmazeutischen
Zubereitungen sind die zusätzlichen Proteinhydrolysate
und deren Derivate in Mengen von 0,01–10 Gew.-% bezogen
auf das gesamte Mittel enthalten. Mengen von 0,1 bis 5 Gew.-%, insbesondere
0,1 bis 3 Gew.-%, sind besonders bevorzugt.
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Erfindungsgemäß enthalten
Anti-Aging-Zubereitungen zur Pflege der Haut anfeuchtende bzw. feuchthaltende
Mittel (sogenannte Moisturizer). Den tensidfreien Emulsionen werden
daher vorteilhaft Substanzen gewählt aus der Gruppe Glycerin,
Milchsäure und/oder Lactate, insbesondere Natriumlactat,
Butylenglykol, Propylenglykol, Biosaccaride Gum-1, Glycine Soja,
Ethylhexyloxyglycerin, Pyrrolidoncarbonsäure und Harnstoff
zugesetzt. Ferner ist es insbesondere von Vorteil polymere Moisturizer
aus der Gruppe der wasserlöslichen und/oder in Wasser quellbaren
und/oder mit Hilfe von Wasser gelierbaren Polysaccharide zu verwenden. Dabei
können die erfindungsgemäßen Zubereitungen
Mono-, Oligo- oder Polysaccharide oder deren Derivate enthalten.
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Geeignete
Monosaccharide sind z. B. Glucose, Fructose, Galactose, Arabinose,
Ribose, Xylose, Lyxose, Allose, Altrose, Mannose, Gulose, Idose
und Talose, die Desoxyzucker Fucose und Rhamnose sowie Aminozucker
wie z. B. Glucosamin oder Galactosamin. Bevorzugt sind Glucose,
Fructose, Galactose, Arabinose und Fucose; Glucose ist besonders
bevorzugt.
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Geeignete
Oligosaccharide sind aus zwei bis zehn Monosaccharid-einheiten zusammengesetzt,
z. B. Saccharose, Lactose oder Trehalose. Ein besonders bevorzugtes
Oligosaccharid ist Saccharose. Ebenfalls besonders bevorzugt ist
die Verwendung von Honig, der überwiegend Glucose und Saccharose
enthält.
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Geeignete
Polysaccharide sind aus mehr als zehn Monosaccharid-einheiten zusammengesetzt.
Bevorzugte Polysaccharide sind die aus a-D-Glucose-Einheiten aufgebauten
Stärken sowie Stärkeabbauprodukte wie Amylose,
Amylopektin und Dextrine. Erfindungsgemäß besonders
vorteilhaft sind chemisch und/oder thermisch modifizierte Stärken,
z. B. Hydroxypropylstärkephosphat, Dihydroxypropyidistärkephosphat
oder die Weiterhin bevorzugt sind Dextrane sowie ihre Derivate,
z. B. Dextransulfat. Ebenfalls bevorzugt sind nichtionische Cellulose-Derivate,
wie Methylcellulose, Hydroxypropylcellulose oder Hydroxyethylcellulose,
sowie kationische Cellulose-Derivate. Weitere bevorzugte Beispiele
sind Polysaccharide aus Fucose-Einheiten. Besonders bevorzugt sind
die aus Aminozuckereinheiten aufgebauten Polysaccharide, insbesondere
Chitine und ihre deacetylierten Derivate, die Chitosane, und Mucopolysaccharide.
Zu den erfindungsgemäß bevorzugten Mucopolysacchariden
gehören Hyaluronsäure und ihre Derivate, z. B.
Natriumhyaluronat oder Dimethylsilanolhyaluronat, sowie Chondroitin
und seine Derivate, z. B. Chondroitinsulfat.
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Die
in tensidfreien Systemen eingesetzten polymeren Wirkstoffe dringen
aufgrund ihrer Molekülgröße nicht in
die Haut ein, sondern verbleiben als Film auf der Hautoberfläche.
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Es
ist dem Fachmann natürlich bekannt, dass kosmetische Zubereitungen
zumeist nicht ohne weitere üblichen Hilfs- und Zusatzstoffe
denkbar sind. Die kosmetischen und dermatologischen Zubereitungen
können dementsprechend beispielsweise Konsistenzgeber,
Füllstoffe, Parfüme, Substanzen zum Verhindern
des Schäumens, Farbstoffe, Pigmente, die färbende
Wirkung haben, Verdickungsmittel, Insektenrepellentien, Wasser,
Salze, proteolytisch oder keratolytisch wirksame Substanzen, Medikamente
oder andere übliche Bestandteile einer kosmetischen oder
dermatologischen Formulierung enthalten.
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Damit
können mit den tensidfreien Emulsionen innovative Produkte
für die Kosmetik und als Gesundheitspflegemittel mit einer
neuen Qualität zur Verfügung gestellt werden.
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Durch
die erfindungsgemäße Abtrennung der peroxidhaltigen
Verbindungen vor der Anwendung als Kosmetikum werden die pflegenden
Eigenschaften verbessert. Nicht unwesentlich ist darüber
hinaus, dass die Produktion von speziellen Ganoderma-Arten, die
bisher noch nicht in größeren Maßstab
kommerziell genutzt werden, auf Grund des langsamen Pilzwachstums
sehr aufwendig ist. Der Kombinationspartner aus Artemisia annua
fällt dagegen bei der Produktion des Wirkstoffes gegen
Malaria als Nebenprodukt an. Mit der erfindungsgemäßen
Kombination aus speziellen Ganoderma-Arten und Artemisia annua-Reststoffen
wird daher eine kostengünstige Möglichkeit zur
Produktion eines Anti-Aging-Wirkstoffes mit den Zellstoffwechsel
stimulierenden Eigenschaften zur Verfügung gestellt.
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Ein
großer Vorteil von tensidfreien Sprühemulsionen
ist, dass sie nach der Herstellung autoklaviert werden können.
Dies ermöglicht eine keimfreie Anwendung auf der Haut,
ohne dass ein Konservierungsmittel eingesetzt werden muss. Auch
eine Kontamination beim Gebrauch ist durch die Sprayform weitgehend
ausgeschlossen.
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Soll
bei anderen Anwendungen der erfindungsgemäßen
Zubereitungen nicht auf Konservierungsmittel verzichtet werden,
sind antimikrobielle Wirkstoffe ausgewählt aus der Gruppen
der Parabene, wie beispielsweise Methylparaben, Ethylparaben, Propylparaben,
Isopropylparaben, Butylparaben, Isobutylparaben, Natrium-Methylparaben,
Natrium-Ethylparaben, Natrium-Propylparaben Natriumisobutylparaben,
Natriumisopropylparaben oder Natrium-Butylparaben, Imidazolidinyl
Harnstoff, Diazolidinyl Harnstoff, Iodopropynyl Butylcarbamat, 2-Bromo-2-Nitropropan-1,3-diol,
Sorbinsäure, Kaliumsorbat, Cetyltrimethylammoniumchlorid,
Cetylpyridiniumchlorid, Benzethoniumchlorid, Diisobutylethoxyethyl-dimethylbenzylammoniumchlorid,
Diisobutyl-phenoxy-ethoxy-ethyl-dimethylbenzyl-ammoniumchlorid,
N-Alkyl-N,N-dimethyl-benzyl-ammoniumchlorid, -bromid, -saccharinat,
Trimethylammoniumchlorid, Natriumaluminiumchlorohydroxylactat, Triethylcitrat,
Tricetylmethylammoniumchloπd, 2,4,41-Trichloro-21-hydroxydiphenylether (Triclosan), 3,4,4'-Trichlorocarbanilid (Triclocarban),
Diaminoalkylamid, beispielsweise L-Lysinhexadecylamid geeignet.
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Aus
den erfindungsgemäßen Zubereitungen können
bei bestimmten Anwendungen Terpene und/oder antimikrobielle Wirkstoffe
freisetzt werden. Das ist insbesondere für folgende spezielle
Anwendung von Bedeutung.
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Die
humanpathogenen Spezies der Gattung Candida besiedeln bei vielen
gesunden Menschen Haut und Schleimhäute, ohne Symptome
hervorzurufen. Bei starker Vermehrung der Pilzzellen, z. B. nach
Schädigung der bakteriellen Schleimhautflora durch Antibiotika
oder bei herabgesetzter Immunabwehr verursachen sie aber häufig
lokale Entzündungen, die auch als Soor bezeichnet werden.
Da immer häufiger empfindliche Textilien, wie z. B. Seide
oder Mikrofaser, die nur bei 30 oder 40°C gewaschen werden
können, zu Kleidungsstücken verarbeitet werden,
werden Pilze wie Candida albicans nicht abgetötet. Insbesondere
nach einer Pilzinfektion kann es so durch auf den Kleidungsstücken
haftenden, nicht abgetöteten Pilzen zu einer Reinfektion kommen.
Zur Verhinderung der Infektion durch Pilze und/oder zur Verhinderung
der Anhaftung von Pilzen an Oberflächen werden bisher antimikrobielle
Substanzen eingesetzt, die entweder das Wachstum der Pilze hemmen
(Fungistatika), diese abtöten (Fungizide) und/oder die
Adhäsion der Pilze vermindern. Häufig werden dazu
nichtselektive antimikrobielle Substanzen eingesetzt, die sowohl
gegen Bakterien als auch gegen Pilze wirken. Außerdem werden
häufig Verbindungen verwendet, die aufgrund der Konzentration,
in der sie eingesetzt werden müssen, toxische Eigenschaften
besitzen, zu Hautirritationen führen können oder
andere unerwünschte Eigenschaften besitzen.
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Überraschenderweise
wurde nun gefunden, dass die erfindungsgemäßen
Emulsionen in geeigneten Formulierungen Terpene und/oder antifungale
Wirkstoffe freisetzen, dazu in der Lage sind, die Anhaftung von Mikroorganismen
auf Oberflächen sehr effektiv zu vermindern, wobei es sich
bei den Oberflächen sowohl um natürliche Oberflächen
als auch um künstliche Oberflächen und hierbei
sowohl um biotische als auch um abiotische Oberflächen
handeln kann. Für diese besondere Ausführungsform
werden die freizusetzenden Terpene ausgewählt aus Terpenalkoholen,
also solchen Terpenen, bevorzugterweise Mono-, Sesqui- und/oder
Diterpenen, die eine freie Hydroxylgruppe tragen. Besonders bevorzugt
sind dabei Citronellole, Geraniol, Farnesol und Patchoulialkohol.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
können bei dieser speziellen Anwendung den Emulsionen Duftstoffalkohole
ausgewählt aus Eugenol, Zimtalkohol und Anethol, insbesondere
Eugenol zugesetzt werden.
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Als
antifungieller Wirkstoff fungiert 2,5-Dihydroxybenzoesäure,
die in G. pfeffferi, nicht aber in anderen Ganoderma Arten gefunden
wurden. Die antiadhäsiven Stoffe sind hierbei vorzugsweise
in Mengen bis zu 3 Gew.-%, besonders bevorzugt in Mengen von 0,1
bis 1 Gew.-% in den Zubereitungen enthalten. Für bestimmte Anwendungen
ist die Kombination der antimikrobiellen peroxidhaltigen Wirkstoffe
aus Artemisia annua mit den aus der Biomasse von G. pfeifferi stammenden
antimikrobiellen Wirkstoffen insbesondere mit den Ganomycinen, mit
2,4,5-Trihydroxybenzaldehyd und/oder 2,5-Dihydroxybenzoesäure
von besonderem Vorteil.
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Ein
Vorteil der erfindungsgemäßen Emulsionen ist,
dass diese bei Einhaltung dieser Konzentrationen eine nur sehr geringe
Toxizität besitzen, insbesondere im Vergleich zu den herkömmlicherweise
verwendeten Antimycotika, Fungiziden und Fungistatika.
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Die
Erfindung soll durch die folgenden Beispiele näher erläutert
werden, ohne auf diese beschränkt zu sein:
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Ausführungsbeispiele
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Beispiel 1 Gewinnung von Biomasse der
Spezies Ganoderma pfeifferi
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Methodik:
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Frisch
geerntete junge Fruchtkörpern der Spezies G. pfeifferi
wurden gereinigt und unter sterilen Bedingungen aufgebrochen. Aus
dem Bereich des Übergangs vom Hut zum Stiel wurden mit
einer sterilen Pinzette Gewebestücke entnommen und bei
Zimmertemperatur auf Hagem-Agar kultiviert. Nachdem der Pilz sichtbares
Wachstum zeigte, wurden einige Mycelstücke ausgestanzt
und mit einem Hagem-Flüssigmedium im Bühler-Homogenisator
(Edmund Bühler, Tübingen, G) zerkleinert. Anschließend
erfolge die weitere Kultur in 250 ml Erlenmeyer-Kolben mit Hagem-Flüssigmedium
nach H. Kreisel und F. Schauer (Methoden des mykologischen
Laboratoriums, Fischer-Verlag Jena 1987). Jeweils 100 ml
Kulturmedium wurden mit 10 ml der wie oben beschreiben hergestellten
Impfsuspension versetzt. Die Kultivierung erfolgte bei Raumtemperatur und
konstanten Lichtverhältnissen für 30 Tage, wobei
eine kontinuierliche Durchmischung mittels einer Schüttelmaschine
(Innova 2100, New Brunswick Scientific Co, INC. EDISON, New Jersey,
USA) mit einer Geschwindigkeit von 125 U/min erreicht wurde. Die
weitere Maßstabsvergrößerung erfolgte
durch Überführung in einen Bioreaktor von 10 l
Volumen. Der Fermenter wurde mit 6 l autoklaviertem HAGEM-Medium
(flüssig) versetzt. Dieses wurde mit 60 ml Impfsuspension
versetzt. Die Kultivierung im Fermenter erfolgte bei Raumtemperatur unter
ständiger Begasung mit steriler Luft, kontinuierlichem
Rühren und im Tag-Nacht-Rhythmus.
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Das
Mycel wurde durch Filtration vom Medium getrennt und lyophilisiert.
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Ergebnis:
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Die
Kultivierung von G. pfeffferi ist mit Flüssig-Medium möglich.
Die Ausbeute beträgt durchschnittlich 5 g Mycel/l. Das
lyophilisierte oder an der Luft getrocknete Mycel steht für
die Mischung mit der Biomasse von Artemisia annua zur Verfügung.
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Beispiel 2 Gewinnung von Extrakten der
Spezies Ganoderma pfeifferi
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Methodik:
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Ganoderma-pfeifferi-Fruchtkörper
wurden durch Wildsammlung im Schlosspark Ludwigsburg erhalten. Außerdem
wurden kultivierte Fruchtkörper, die durch die Firma GAMU
GmbH, Krefeld gewonnen wurden, verwendet.
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Die
gesammelten Fruchtkörper von Ganoderma pfeifferi wurden
gereinigt, klein geschnitten, an der Luft bei Raumtemperatur getrocknet
und anschließend im Hochvakuum gefriergetrocknet. Die geschnittenen und
getrockneten Stücke wurden dann in einer Analysenmühle
pulverisiert und anschließend in lichtundurchlässigen
Gefäßen bei Raumtemperatur aufbewahrt. Mittels
dreier verschiedener Extraktionsverfahren wurden ethanolische Extrakte
gewonnen. Angewandt wurden eine Heiß- bzw. Kaltextraktion
und eine Extraktion mit dem Extraktor.
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Heißextraktion
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Der
pulverisierte Fruchtkörper wurden in einer Papierhülse
mit Ethanol 80% (V/V) versetzt und anschließend nach dem
Soxhletverfahren für ca. 24 h extrahiert. Die Einwaage
betrug für G. pfeifferi 12,5 g. Die gewonnenen Flüssigextrakte
wurden eingeengt und gefriergetrocknet.
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Kaltextraktion
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Zur
Kaltextraktion wurden jeweils 25 g Drogenmaterial mit 250 ml Ethanol
80% (V/V) versetzt und 24 h bei Raumtemperatur geschüttelt.
Anschließend wurden die Pilze über einen Filter
abgepresst, der resultierende trübe Extrakt zentrifugiert
und durch einen Rundfilter filtriert. Die Filtrate wurden eingeengt
und gefriergetrocknet. Die Lagerung der gewonnenen Extrakte erfolgte
im Kühlschrank.
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Extraktion mittels Extraktor
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Die
Extraktion erfolgte mittels Extraktor ASE 200. Es wurden jeweils
2 g Drogenmaterial mit 15 g Seesand in eine Papierhülse
eingewogen. Extrahiert wurde bei einem Druck von 2000 psi (pounds
per square inch) mit einer Standzeit (Verweildauer des Lösungsmittels
in der Extraktionszelle bei jedem Extraktionsschritt) von 2 min.
Als Extraktionsmittel wurde EtOH 80% (V/V) bei einer Extraktionstemperatur
von 60°C verwendet.
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Ergebnis:
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Die
Ausbeuten der gefriergetrockneten Extrakte wurden in Tabelle zusammengefasst. Tab. 1: Extraktausbeuten von G. pfeifferi
u
| | Heißextrakt | Kaltextrakt | Extraktion
mit Extrator |
| G.
pfeifferi (Wildsammlung) | 6,28% | 1,83% | 12,5% |
| G.
pfeifferi (Kultivierung) | n.
d. | 10,24% | n.
d. |
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Im
Folgenden wurden folgende Bezeichnungen verwendet:
- GPS
- gesammelter G. pfeifferi
Heißextrakt
- GPK
- gesammelter G. pfeifferi
Kaltextrakt
- GPKK
- kultivierter G. pfeifferi
Kaltextrakt
- GPE
- gesammelter G. pfeifferi
Extraktorextrakt
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Beispiel 3 Gewinnung von Gesamtextrakten
aus Artemisia annua (einschließlich Artemisinin)
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Beispiel 3a: Alkoholische Extraktion (diskontinuierlich)
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3
g getrocknetes Pflanzenmaterial Artemisia annua werden mit 30 ml
Methanol versetzt und 12 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen.
Danach wird das Pflanzenmaterial abgepresst und über einen
Faltenfilter filtriert. Es resultieren 20 ml methanolischer Extrakt
aus Artemisia annua.
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Beispiel 3b: Alkoholische Extraktion (kontinuierlich,
Soxhlet-Extraktion)
-
10
g getrocknetes Pflanzenmaterial Artemisia annua werden in einem
Soxhlet-Apparat kontinuierlich mit 150 ml Methanol 1 Stunde lang
extrahiert. Es resultieren 130 ml methanolischer Extrakt aus Artemisia
annua.
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Beispiel 3c: Wässrig-alkoholische
Extraktion (diskontinuierlich)
-
3
g getrocknetes Pflanzenmaterial Artemisia annua werden mit 40 ml
40%igem wässrigen Ethanol versetzt und 12 Stunden bei Raumtemperatur
stehen gelassen. Danach wird das Pflanzenmaterial abgepresst und über
einen Faltenfilter filtriert. Es resultieren 32 ml wässrig-ethanolischer
Extrakt aus Artemisia annua.
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Beispiel 3d: Wässrige Extraktion
(diskontinuierlich)
-
3
g getrocknetes Pflanzenmaterial Artemisia annua werden mit 30 ml
dest. Wasser versetzt und 12 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen.
Danach wird das Pflanzenmaterial abgepresst und die trübe Lösung
zentrifugiert. Es resultieren 20 ml wässriger Extrakt aus
Artemisia annua.
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Beispiel 4 Gewinnung von Extrakten aus
Artemisia annua (artemisininfrei)
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Beispiel 4a: Abtrennung der peroxidhaltigen
Verbindungen durch Extraktion von Artemisia annua mit Petrolether
(diskontinuierlich)
-
3
g getrocknetes Pflanzenmaterial Artemisia annua werden mit 30 ml
Petrolether versetzt und 12 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen.
Danach wird abgepresst und filtriert, Es resultieren 20 ml Petroletherextrakt.
Das Pflanzenmaterial wird 30 Minuten im Vakuum von den anhaftenden
Lösemittelresten befreit.
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Beispiel 4b: Abtrennung der peroxidhaltigen
Verbindungen durch Extraktion von Artemisia annua mit Petrolether
(kontinuierlich)
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10
g getrocknetes Pflanzenmaterial Artemisia annua werden in einem
Soxhlet-Apparat kontinuierlich mit 150 ml Petrolether 1 Stunde lang
extrahiert. Es resultieren 140 ml Extrakt aus Artemisia annua. Das
verbliebene Pflanzenmaterial wird im Vakuum von den anhaftenden
Lösemittelresten befreit.
-
Beispiel 4c: Gewinnung von peroxidfreier
Extrakte durch Erxtraktion mit Methanol (kontinuierlich)
-
Ca.
3 g Pflanzenmaterial aus der vorhergehenden Extraktion nach Beispiel
4 a werden in einem Soxhlet-Apparat kontinuierlich mit 100 ml Methanol
1 Stunde lang extrahiert. Es resultieren 90 ml peroxidfreier methanolischer
Extrakt.
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Beispiel 4d: Gewinnung peroxidfreier Extrakte
durch Extraktion mit Ethanol (diskontinuierlich)
-
Ca.
10 g getrocknetes Pflanzenmaterial Artemisia annua aus der vorhergehenden
Extraktion nach Beispiel 4 b werden mit 100 ml Ethanol versetzt
und 12 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wird abgepresst
und filtriert. Es resultieren 80 ml peroxidfreier Ethanolextrakt.
-
Beispiel 4e: Wässrig-alkoholische
Extraktion (diskontinuierlich)
-
10
g getrocknetes Pflanzenmaterial Artemisia annua werden mit 80 ml
40%igem wässrigen Ethanol versetzt und 12 Stunden bei Raumtemperatur
stehen gelassen. Danach wird das Pflanzenmaterial abgepresst und über
einen Faltenfilter filtriert. Es resultieren 70 ml wässrig-ethanolischer
Extrakt aus Artemisia annua.
-
Beispiel 4f: Wässrige Extraktion
(diskontinuierlich)
-
3
g getrocknetes Pflanzenmaterial Artemisia annua werden mit 30 ml
dest. Wasser versetzt und 12 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen.
Danach wird das Pflanzenmaterial abgepresst und die trübe Lösung
zentrifugiert. Es resultieren 20 ml wässriger Extrakt aus
Artemisia annua.
-
Beispiel 5 Gewinnung der erfindungsgemäßen
Anti-Aging-Mittel durch gemeinsame Extraktion von Ganoderma pfeifferi
und Artemisia annua. (kontinuierlich)
-
1
g des pulverisierten Fruchtkörpers von G. pfeifferi wurden
mit 10 g getrocknetem und durch Extraktion von Artemisinin befreitem
Pflanzenmaterial von Artemisia annua in einer Papierhülse
mit Methanol versetzt und anschließend nach dem Soxhletverfahren
für ca. 2 h extrahiert. Die gewonnenen Flüssigextrakte wurden
eingeengt und gefriergetrocknet. Zur Verwendung in kosmetischen
Zubereitungen können sie direkt verwendet oder in einem
Lösemittel, aufgenommen werden.
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Beispiel 6 Gewinnung der erfindungsgemäßen
Anti-Aging-Mittel durch gemeinsame Extraktion von Ganoderma pfeifferi
und Artemisia annua. (diskontinuierlich)
-
1
g des pulverisierten Fruchtkörpers von G. pfeffferi wurden
mit 10 g getrocknetem und durch Extraktion von Artemisinin befreitem
Pflanzenmaterial von Artemisia annua vermischt, mit 80 ml 40%igem
wässrigen Ethanol versetzt und 12 Stunden bei Raumtemperatur
stehen gelassen. Danach wurde das Pflanzenmaterial abgepresst und über
einen Faltenfilter filtriert. Es resultierten 70 ml wässrig-ethanolischer
Extrakt aus Ganoderma pfeifferi und Artemisia annua.
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Beispiel 7 Gewinnung der erfindungsgemäßen
Anti-Aging-Mittel durch Vermischung von Extrakten von Ganoderma
pfeifferi und Artemisia annua.
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Heißextraktion
-
0,5
g gefriergetrockneter Extrakt aus G. pfeifferi wurden in 100 ml
wässrig-ethanolischem Extrakt aus Artemisia annua (Ethanolgehalt
40%) aufgenommen, wobei eine klare Lösung entstand. Der
resultierende Gesamtextrakt ist direkt in kosmetischen Zubereitungen
einsetzbar.
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Beispiel 8 Diphenylpikrylhydrazyl(DPPH)-Test
-
Die
Bestimmung der antioxidativen Eigenschaften erfolgte dünnschichtchromatografisch
(SIEVERS A et al. (2002) Simple thin-layer chromatographic
test for antioxidative compounds using DPPH assay. CBS Camag Bibliography
service 88: 14–15) und photometrisch (MOLYNEUX
P (2004) The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl
(DPPH) for estimating antioxidant activity. Songklanakarin J Sci
Technol 26 (2): 211–219).
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Ergebnisse:
-
In
höheren Konzentrationen (Verdünnungen 1:20 oder
1:10) zeigen die Extrakte aus Artemisia annua eine hohe Radikalfänger-Kapazität
(> 80%). In der 1:100-Verdünnung
ist die Radikalfängerkapazität jedoch unzureichend.
Durch Zusatz von 1% G. pfeifferi wird die Radikalfängerkapazität
erhöht (Tab. 2). Tabelle 2:
| | aus Rohmaterial | nach Abtrennung
der Peroxide |
| Wässriger
Extrakt | Methanolischer Extrakt | Wässriger
Extrakt | Methanolischer Extrakt |
| ohne
G. pfeifferi | 37,8 | 35,7 | 34,5 | 34,5 |
| mit
G. pfeifferi | 89,1 | 78,8 | 85,6 | 82,6 |
-
Beispiel 9: Nachweis der Radikalfängereigenschaft
mittels Chemilumineszenz
-
Der
Nachweis wurde wie folgt geführt:
- A: 30 ml humanes
Blut wurden mit 170 ml PBS + Luminol (0,33 mM final) 20 min bei
37°C vorinkubiert.
- B: 30 μl humanes Blut wurden mit 170 ml PBS + Luminol
(0,33 mM final) und 20 ml Substanzverdünnung 20 min bei
37°C vorinkubiert.
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Zu
A wurden 20 μl ein Extrakt, der G. pfeifferi in einer Verdünnung
1: 100 enthielt, und 20 μl Zymosan (10 mg/ml) pipettiert.
-
Zu
B wurden 20 μl Zymosan (10 mg/ml) pipettiert.
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Als
Kontrolle verwendeten wir PBS statt Zymosan als Stimulator mit und
ohne Substanz in den Ansätzen A und B. Nach intensivem
Mischen wurde die Kinetik der Lumineszenz über 60 min gemessen.
Die Untersuchungen erfolgten an zwei unterschiedlichen Tagen mit
Blut von zwei verschiedenen Blutspendern.
-
Ergebnis:
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Die
Extrakte hemmen eindeutig die durch Luminol induzierte und die spontane
Sauerstoffradikalfreisetzung oder fangen die freigesetzten Radikale
ab.
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Beispiel 10 Nachweis interzellulärer
Proteine
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Methodik
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Die
folgende Methode diente zur Quantifizierung der interzellulären
Proteine. Der Nachweis der Proteine mit Roti-Nanoquant beruht auf
einer Modifikation der Proteinbestimmung nach Bradford.
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Die
Roti-Nanoquant-Arbeitslösung wurde durch Verdünnen
der Stammlösung im Verhältnis 1:5 mit Aqua bidest.
hergestellt. Für diesen Versuch wurde eine Kulturflasche
(25 cm2) verwendet, die zu mind. 80% konfluent
war. Das Medium wurde aus der Flasche abgegossen und der Zellrasen
einmal mit PBS gewaschen. Anschließend wurden 50 μl
MMC 1 mg/ml in 5 ml Medium auf die Zellen gegeben. Die so behandelte
Flasche wurde im Brutschrank bei 37°C, 95% Luftfeuchtigkeit
und 5% CO2 für 2 Stunden inkubiert.
Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde das Gemisch MMC/Medium abgegossen
und der Zellrasen zweimal mit PBS gewaschen. Anschließend
wurden die Zellen vom Flaschenboden abgelöst, die Zellzahl
ermittelt und mit Nährmedium auf 200.000 Zellen/ml eingestellt.
Es wurden 100 μl/well in eine 96-well-Platte gegeben. Die
Platte wurde 24 h im Brutschrank inkubiert.
-
Nach
24 Stunden wurden verschiedene Extrakte in die Zellkulturplatte
pipettiert. Verwendet wurden die gewonnenen Extrakte von G. pfeifferi
und Kombinationen mit Artemisia annua.
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Dazu
wurde eine Gebrauchslösung des entsprechenden Extraktes
hergestellt. Der Trockenextrakt wurde genau eingewogen und in 200 μl
Ethanol dest. gelöst. Aus dem Ansatz wurde eine Stammlösung
von 1 mg/ml in Aqua bidest. hergestellt. Die Gebrauchslösungen
wurden durch Verdünnen der Stammlösung mit Nährmedium
hergestellt.
-
Das
alte Medium wurde entfernt und anschließend 200 μl/well
der verschiedenen Gebrauchslösungen auf die Platte gegeben.
Als Negativkontrolle wurden einige wells mit 200 μl DMEM
(extraktfrei) gefüllt. Die so behandelte Platte wurde 24
h im Brutschrank inkubiert.
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Im
nächsten Arbeitschritt folgte nun die Zerstörung
der Zellwände um die interzellulären Proteine
in Lösung zu bringen und sie anschließend quantifizieren
zu können.
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Hierzu
wurde zunächst die Gebrauchslösungen von der Platte
entfernt und anschließend 5-mal mit je 200 μl/well
PBS gewaschen. Nach Zugabe von 100 μl einer 0,1% Tritonlösung
in Trispuffer (pH 7,2) pro well wurde die Platte für 30
min geschüttelt und anschließend eingefroren.
Nach dem Auftauen wurde der Inhalt der Vertiefungen mit Hilfe einer
Pipette gut durchgemischt und anschließend bei 4000 rpm
4 Minuten zentrifugiert. Von der so behandelten Platte wurden je
10 μl in das entsprechende well einer neuen Platte überführt, die
letzte Reihe wurde für die Kalibrationskurve freigelassen.
Hierfür wurde Albumin, Fraktion V verwendet. Es wurde eine
Stammlösung mit der Konzentration 1 mg/ml in 0,1% Tritonlösung
in Trispuffer (pH 7,2) hergestellt. Von dieser ausgehend wurden
dann die entsprechenden Verdünnungen (0–500 μg/ml)
hergestellt und je 10 μl in die entsprechenden wells pipettiert.
Anschließend wurden 40 μl PBS und 200 μl
Roti-Nanoquant-Arbeitslösung pro well hinzu pipettiert.
Nach 5 min Inkubationszeit wurde die Optische Dichte (OD) bei 2
Wellenlängen (405 nm und 620 nm) bestimmt. Zur Auswertung
wurde der Quotient aus 620 nm und 405 nm gebildet.
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Ergebnisse
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Der
Proteingehalt steigt unter dem Einfluss von G. pfeifferi (GPS) und
von G. pfeifferi enthaltenden Kombinationen auf 110 und 125%. Bereits
bei einem sehr geringen Anteil von G. pfeifferi (5 μg/ml)
ist ein Anstieg der interzellulären Proteine gegenüber
der Negativkontrolle zu verzeichnen. Eine Erhöhung der
G. pfeifferi Anteils im Gemisch führt zu keiner Verbesserung
der Wirkung.
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- Beispiel 11: Zubereitung mit Aloe vera
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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(DPPH) for estimating antioxidant activity. Songklanakarin J Sci
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