KR102019650B1 - 싸리나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 싸리나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료 효과가 있는 약학적 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 싸리나무 추출물은 p-CREB 및 BDNF 단백질 발현을 증가시킬 뿐 아니라 p-CREB, p-ERK 및 BDNF 단백질 발현 감소를 개선시키는 효과가 있으며 학습 또는 기억력 증진 효과도 우수하므로 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료에 있어 유용하며 학습 능력, 기억력 증진용 식품으로도 사용될 수 있다.

Description

싸리나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 {Pharmaceutical compositions for preventing or treating degenerative brain disease, comprising the extract of Lespedeza bicolor}
본 발명은 싸리나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.
과학의 발달로 인해 생활이 고차원화되고 의학의 발달로 인해 평균수명이 증가되는 현대 사회에서 인지기능과 기억력은 학습량이 큰 청소년에서부터 노인에 이르기까지 중요한 관심 대상이 되고 있다. 기억력의 저하는 현대 사회 활동에서 문제점을 일으키고, 치매와 같은 퇴행성 질환으로 발달하는 경우에는 사회생활 자체를 불가능하게 할 수 있기 때문에 이에 대한 연구의 중요성은 날로 증대되고 있다. 치매는 기억력과 감각, 공간 및 지각능력이 감퇴되는 후천적 만성 퇴행성 질환으로서 혈관성 치매 (cerebrovascular dementia)와 알츠 하이머성 치매 (Alzheimer's dementia)가 대표적이며, 65세 이상의 치매 환자에서는 50~60%가 알츠하이머성 치매로 알려져 있다. 이러한 기억력의 저하 및 알츠하이머성 치매는 콜린성 신경세포 퇴화에 의한 아세틸콜린의 부족이 중요한 원인 중의 하나이며, 이러한 현상은 아세틸콜린 분해효소인 아세틸콜린 에스터라제 (AChE)의 활성 증가로 더욱 심화된다. 따라서 그 동안 타크린, 도네페질, 리바스티그닌, 갈란타민 등의 AChE 억제제가 알츠하이머 치료제로 개발되어 왔다. 하지만 아직 직접 뇌세포를 재생시키거나 뇌세포 손상을 억제하기가 어렵기 때문에, 효과적인 퇴행성 뇌질환 치료제를 개발하는 것은 치매 환자의 증상 호전뿐만 아니라 정상인의 기억력 증진제로도 의미가 있다.
한편, 뇌 (brain)와 척수 (spinal cord)로 구성된 중추신경계는 생명현상을 운영하는 중심 센터로서 감각과 (불)수의적인 운동에서부터 사고, 기억, 감정, 언어 등에 이르기까지 인체의 모든 기능을 총괄하는 아주 필수적인 기관이다. 따라서 뇌졸중, 외상 등으로 유발된 급행적인 신경세포의 사멸이나, 알츠하이머병으로 대표되는 노인성 치매 등과 같은 중추신경계 퇴행성 질환을 유발시키는 서행적인 신경세포의 사멸 등과 같은 모든 경우에서는 곧바로 신경회로망의 비가역적인 기능장애를 초래하게 되며 결국에는 해당 인체 기능의 영구적인 손실을 초래하게 된다.
본 발명의 싸리나무는 산과 들에서 2~3m의 높이로 흔히 자라고 7~8월에 꽃이 피는 콩과의 낙엽관목으로써, 특유의 약리효과가 뛰어나 약용으로 널리 활용되고 있다. 싸리나무의 성분으로는 플라보노이드, 페스티딘 성분, 단백질, 지방, 칼슘, 비타민 B1, 아미노산, 당질, 철, 비타민 B,C,K, 탄닌엽록소가 함유되어 있다고 알려져 있다. 싸리나무는 두통, 고혈압, 양기부족, 무기력증, 무좀, 습진, 피부병, 눈병, 폐열로 인한 기침, 부종에 탁월한 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 요통, 타박상, 골다공증에도 효과가 탁월하다. 뿐만 아니라, 인체 내의 노폐물을 배출시키고, 기미, 주근깨 및 피부색소 침착의 원인이 되는 물질인 멜라닌 합성에 관련된 신호전달물질의 합성을 억제하여 미백효과를 나타내고 피부를 곱고 맑게 하는데 탁월한 효과를 나타낸다.
한편, 국제공개공보 WO2009/026657(2009.03.05.)에서는 싸리나무를 부위별로 유기용매를 이용하여 얻은 분획물, eriodictyol 등의 플라보노이드가 항산화 활성이 있음을 보고하였으나 기억력 개선에 대한 보고는 없다.
또한, 대한민국 특허공개 제10-2007-0015372호는 인지, 집중, 학습 또는 기억의 손상의 예방 또는 치료에 유용한 6-아미노-5-시아노-피리미딘-4-온 유도체를 개시한 바 있으나, 학습, 기억력, 퇴행성 뇌질환 등에 효과있는 약물에 대한 연구가 필요한 실정이다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위해, 본 발명자들은 학습능력 또는 기억력을 증진시키고 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료효과를 가지는 소재를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 싸리나무 추출물의 학습능력 또는 기억력 증진효과 및 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 싸리나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 싸리나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 싸리나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 학습 능력 또는 기억력 증진용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 싸리나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 추출물은 물, C1 내지 C4의 알코올, 헥산(Hexane) 및 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 용매로 추출하여 수득한 것이다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 퇴행성 뇌질환은 치매 또는 알츠하이머 병인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 싸리나무 추출물은 p-CREB 또는 BDNF 단백질 발현을 증가시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 싸리나무 추출물은 스코폴아민 유도에 의한 p-CREB, p-ERK 및 BDNF 단백질 발현 감소를 개선시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 싸리나무 추출물은 베타 아밀로이드 유도에 의한 p-CREB, p-ERK 및 BDNF 단백질 발현 감소를 개선시키는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 싸리나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 싸리나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 학습 능력 또는 기억력 증진용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 싸리나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 학습능력 또는 기억력을 증진 시키며, p-CREB, p-ERK 및 BDNF 단백질 발현을 증가시킴으로써, 다양한 뇌신경계 이상으로 인한 퇴행성 뇌질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물 또는 건강기능식품으로 이용될 수 있다.
도 1은 싸리나무 에탄올 추출물을 투여한 마우스의 Y-미로실험에서 학습 및 기억력 증진 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 싸리나무 에탄올 추출물을 투여한 마우스의 수동회피실험에서 학습 및 기억력 증진 효과를 나타낸 것이다.
도 3a는 싸리나무 에탄올 추출물을 투여한 마우스의 p-CREB 단백질 발현 증가 효과를 나타낸 것이다.
도 3b는 싸리나무 에탄올 추출물을 투여한 마우스의 BDNF 단백질 발현 증가 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 싸리나무 에탄올 추출물을 투여한 마우스의 Y-미로실험에서 스코폴아민 유도 작업 기억력 개선 효과에 대한 것이다.
도 5는 싸리나무 에탄올 추출물을 투여한 마우스의 수동회피실험에서 스코폴아민 유도 학습 및 기억력 개선 효과를 나타낸 것이다.
도 6a는 싸리나무 에탄올 추출물을 투여한 마우스에서 스코폴아민 유도에 의한 BDNF 단백질 발현 감소의 개선 효과를 나타낸 것이다.
도 6b는 싸리나무 에탄올 추출물을 투여한 마우스에서 스코폴아민 유도에 의한 p-ERK 단백질 발현 감소의 개선 효과를 나타낸 것이다.
도 6c는 싸리나무 에탄올 추출물을 투여한 마우스에서 스코폴아민 유도에 의한 p-CREB 단백질 발현 감소의 개선 효과를 나타낸 것이다.
도 6d는 싸리나무 에탄올 추출물을 투여한 마우스에서 스코폴아민 유도에 의한 p-CREB, p-ERK 및 BDNF 단백질 발현을 웨스턴 블롯 실험으로 나타낸 것이다.
도 7은 싸리나무 에탄올 추출물을 처리한 마우스의 Y-미로실험에서 베타 아밀로이드 유도 작업 기억력 개선효과를 나타낸 것이다.
도 8은 싸리나무 에탄올 추출물을 투여한 마우스의 수동회피실험에서 베타 아밀로이드 유도 학습 및 기억력 개선 효과를 나타낸 것이다.
도 9a는 싸리나무 에탄올 추출물을 투여한 마우스에서 베타 아밀로이드 유도에 의한 BDNF 단백질 발현 감소의 개선 효과를 나타낸 것이다.
도 9b는 싸리나무 에탄올 추출물을 투여한 마우스에서 베타 아밀로이드 유도에 의한 p-ERK 단백질 발현 감소의 개선 효과를 나타낸 것이다.
도 9c는 싸리나무 에탄올 추출물을 투여한 마우스에서 베타 아밀로이드 유도에 의한 p-CREB 단백질 발현 감소의 개선 효과를 나타낸 것이다.
도 9d는 싸리나무 에탄올 추출물을 투여한 마우스에서 베타 아밀로이드 유도에 의한 p-CREB, p-ERK 및 BDNF 단백질 발현을 웨스턴 블롯 실험으로 나타낸 것이다.
본 발명자들은 학습능력 또는 기억력을 증진 시키고 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료효과를 가지는 소재를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 싸리나무 추출물의 학습능력 또는 기억력 증진효과 및 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 싸리나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 "싸리나무"는 산과 들에서 2~3m의 높이로 흔히 자라고 7~8월에 꽃이 피는 콩과의 낙엽관목으로써, 플라보노이드, 페스티딘 성분, 단백질, 지방, 칼슘, 비타민 B1, 아미노산, 당질, 철, 비타민 B,C,K, 탄닌엽록소가 함유되어 있다고 알려져 있고 특유의 약리효과가 뛰어나 약용으로 널리 활용되고 있다.
본 발명에서 "싸리나무 추출물"은 싸리나무를 추출하여 수득한 추출물이다.
상기 싸리나무 추출물은 싸리나무의 줄기를 용매에 침지한 다음, 상온 또는 가온상태에서 일정시간동안 추출하여 수득한 액상성분, 상기 액상성분으로부터 용매를 제거하여 수득한 고형분 등의 결과물을 의미할 수 있으나 이에 제한되지는 않고, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물을 모두 포함할 수 있다. 상기 싸리나무 추출물은 천연, 잡종, 변종식물의 다양한 기관으로부터 추출될 수 있고, 예를 들어, 뿌리, 지상부, 줄기, 가지, 잎, 열매 또는 식물 조직 배양물 등으로부터 추출 가능하다. 용매는 물, C1 내지 C4의 알코올, 헥산(Hexane) 및 그의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 용매이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는, 야생 싸리나무 줄기 부위를 완전히 건조시킨 후 야생 싸리나무 4kg을 70% 에탄올 4L에 2번 반복하여 추출한 다음 이를 감압농축기(EYELA사, N-1000, 일본)로 감압농축한 후, 동결 건조하여 싸리나무 에탄올 조추출물을 82g을 수득하였다(실시예 2).
본 발명에 따른 싸리나무 추출물은 p-CREB 및 BDNF 단백질 발현을 증가시키고 스코폴아민 유도에 의한 p-CREB, p-ERK 및 BDNF 단백질 발현 감소를 개선시키며 베타 아밀로이드 유도에 의한 p-CREB, p-ERK 및 BDNF 단백질 발현 감소의 개선 효과를 가지므로 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료 용도로 사용될 수 있다.
본 발명에서 "퇴행성 뇌질환(degenerative brain disease)"은 나이가 들어감에 따라 발생하는 퇴행성 질환 중에서도 뇌에서 발생하는 질환을 뜻하며 주요 증상과 침범되는 뇌부위에 따라 치매 및 알츠하이머 병 등으로 구분할 수 있다.
본 발명에서 "치매"는 정상적으로 생활해오던 사람이 다양한 원인에 인해 뇌기능이 손상되면서 이전에 비해 인지 기능이 지속적이고 전반적으로 저하되어 일상생활에 상당한 지장이 나타나는 질환이다.
본 발명에서 "알츠하이머 병(Alzheimer's disease)"은 가장 흔한 퇴행성 뇌질환으로 매우 서서히 발병하여 점진적으로 진행되는 경과가 특징적이며 초기에는 주로 최근 일에 대한 기억력에서 문제를 보이다가 진행하면서 언어기능이나 판단력 등 다른 여러 인지기능의 이상을 동반하게 되다가 결국에는 모든 일상 생활 기능을 상실하게 된다.
본 발명에서 "예방"은, 본 발명에 따른 싸리나무 추출물을 개체에 투여하여 치매 또는 알츠하이머 병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 발명에서 "치료"는, 본 발명의 조성물을 치매 또는 알츠하이머 병의 의심 개체에 투여하여 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 발명에서 "스코폴아민"은 가지과 식물에 함유되어 있는 알칼로이드다. 후시냅스(postsynapse)에 있는 무스카리닉(muscarinic)수용체의 길항제로, 전시냅스(presynapse)에서 유리되는 신경전달물질인 아세틸콜린과 무스카리닉 수용체의 결합을 저해하여 정보전달을 하는 것을 일시적으로 차단함으로서, 학습과 기억력을 손상시키게 되므로 학습과 기억력 증진효과를 검증하고자 하는 기억력감퇴동물모델에 통상적으로 이용되고 있다(김대경 외 12, The Korean J Anat., 37, pp.519-527, 2004).
본 발명에서 "베타 아밀로이드"는 알츠하이머 환자의 뇌에서 발견되는 아밀로이드 플라크의 주성분으로서 알츠하이머 병에 결정적으로 관여하는 36-43개의 아미노산 펩타이드를 의미한다. 이 펩타이드는 베타 세크리타제와 감마 세크레타제에 의해 분해되어 Aβ를 생성하는, 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)에서 유도된다.
본 발명에서 "p-CREB"는 CREB (cAMP Response Element Binding protein)의 인산화 된 형태로서, CREB (cAMP response element-binding) proteins는 DNA 내의 CRE (cAMP response element)라 불리는 특정 서열과 결합하는 전사 인자 (transcription factors)이다. CREB 단백질은 인간을 포함하는 많은 동물에서 활성을 나타내며 이전의 연구들은 전사 인자 CREB의 인산화가 몇몇 조기반응 유전자 (immediate-early genes)의 발현을 매개하는 데 중요하다는 사실을 보고하고 있다 (Yamamoto et al, 1988; Ginty et al., 1993; Konradi, et al., 1994). 일반적으로 신호가 세포 표면에 도착하면, 이에 대응하는 수용체가 활성화되고, cAMP 또는 Ca2 +와 같은 이차 전달자(second messenger)의 생산되어, 단백질 카이네이즈 (protein kinase)의 활성화를 유도한다. 이러한 단백질 카이네이즈는 세포 핵으로 이동하게 되는데, 여기에서 CREB 단백질이 활성화된다. 활성화된 CERB 분자는 그 후 CRE 요소 (CRE element)에 결합하고, 그 후 함께 작용하는 CBP (CERB binding protein)에 의해 결합되어, 특정 유전자의 작동 (on) 또는 비작동 (off)을 조절하게 된다. 해마의 신호전달 과정에서 유도되는 CREB는 기억 및 학습에 영향을 주며 여러 동물 모델에서 기억 학습에 영향을 줌으로써 장기기억의 형성에 중요한 역할을 한다고 보고되었다(Cell, 1994; 79, 59~68).
본 발명에서 "BDNF(Brain-Derived Neurotrophic Factor, BDNF)"는 성장요소의 일부인 신경영양인자 집단 중의 하나이다. 이 인자는 기본적인 신경 성장 요인에 연관되어 있으며, 뇌와 그 주변부에서 찾아볼 수 있고, 뉴런과 교질세포의 성숙 및 분화에 중요한 역할을 한다. BDNF 발현은 독성 작용제, 예컨대, Aβ에 대응하여 크게 증가되어 신경 보호작용을 제공하는 것으로 알려져 있다. BDNF는 신경계 활성에 있어서 가장 특징적인 신경성장인자로, 자가면역 질환의 뇌 병리학, 예컨대, 다발성 경화증, 알츠하이머병, 헌팅톤병 및 파킨슨병 등을 포함한 기타 수많은 신경학적 장애를 연구하기에 적합한 생체지표(biomarker)로 이용된다.
본 발명에서 "p-ERK"는 ERK(Extracellular signal-Regulated Kinase)의 인산화된 형태로서 기억 기능과 관련된 분자 신호 전달 경로 중 하나이며 성장인자들에 의한 세포막 수용체의 활성화로부터 세포의 증식, 분화 및 유전자 발현의 변화를 연결시켜주는 중요한 신호전달 단백질이다. ERK1/2는 세포 외 신호로부터 전송되는 세포내 신호를 책임지고 있으며 ERK 활성화는 시냅틱 가소성 및 기억력에 기초가 되는 세포 메카니즘으로서의 장기적 강화작용(LTP)에 필수적이다. 또한 기억력 증진에 있어서 중요한 역할을 한다는 많은 연구결과가 있다(Siddhanti 등, Endocrinology , 136 , 4834-4841 (1995); Hipskind and Bilbe, Front Biosci. , 1 , D804-816 (1998); Thiels, E, Klann, E. Extracellular signal-regulated kinase, synaptic plasticity, and memory. Rev. Neurosci. 12, 327-345 (2001); Sweat J. D. The neuronal MAP kinase cascade: a biochemical signal integration system subserving synaptic plasticity and memory. J. Neurochem. 76, 1-10, (2001)).
본 발명의 일 실험예 에서는 스코폴아민을 투여한 마우스의 Y-미로실험에서 마우스에 싸리나무 에탄올 추출물을 투여하면 대조군보다 교차행동을 증가시킨다는 것을 확인함으로써 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료효과를 확인하였다(실험예 2-1)
본 발명의 다른 일 실험예 에서는 스코폴아민을 투여한 마우스의 수동회피 실험에서 마우스에 싸리나무 에탄올 추출물을 투여하면 마우스의 체재시간을 증가시킨다는 것을 확인함으로써 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료효과를 확인하였다(실험예 2-2).
본 발명의 또 다른 실험예 에서는 스코폴아민을 처리한 마우스에 싸리나무 추출물을 투여한 경우 p-CREB, p-ERK 및 BDNF 단백질 발현 변화를 확인하기 위하여 웨스턴 블롯 실험을 수행하였다. 그 결과, 싸리나무 에탄올 추출물을 투여한 마우스의 경우 스코폴아민에 의해 감소된 p-CREB, p-ERK 및 BDNF 단백질 발현이 유의적으로 증가되었음을 확인함으로써, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료효과를 확인하였다 (실험예 2-3).
본 발명의 또 다른 실험예 에서는 베타아밀로이드를 첨가한 마우스의 Y-미로실험에서 마우스에 싸리나무 에탄올 추출물을 투여하면 대조군보다 교차행동을 증가시킨다는 것을 확인함으로써 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료효과를 확인하였다(실험예 2-4)
본 발명의 또 다른 실험예 에서는 베타아밀로이드를 첨가한 마우스의 수동회피실험에서 마우스에 싸리나무 에탄올 추출물을 투여하면 마우스의 체재시간을 증가시킨다는 것을 확인함으로써 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료효과를 확인하였다(실험예 2-5).
본 발명의 또 다른 실험예 에서는 베타아밀로이드 처리한 마우스에 싸리나무 추출물을 투여한 경우 p-CREB, p-ERK 및 BDNF 단백질 발현 변화를 확인하기 위하여 웨스턴 블롯 실험을 수행하였다. 그 결과, 싸리나무 에탄올 추출물을 투여한 마우스의 경우 베타아밀로이드에 의해 감소된 p-CREB, p-ERK 및 BDNF 단백질 발현이 유의적으로 증가되었음을 확인함으로써, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료효과를 확인하였다(실험예 2-6).
본 발명에서 "약학적 조성물"은 단일제제로도 사용할 수 있고, 공인된 인지기능 증진 또는 치료효과를 가진다고 알려진 약물을 추가로 포함하여 복합제제로 제조하여 사용할 수 있으며, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다. 상기 담체는 비자연적 담체 (non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다.
또한, 필요한 경우 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여 사용할 수 있으며, 희석제, 분산제, 계면 활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제 등으로 제제화하여 사용할 수 있다.
또한, 상기 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양의 싸리나무 추출물을 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 일반적으로 0.25 내지 1000 mg/kg의 양, 구체적으로는 0.25 내지 500 mg/kg, 더욱 구체적으로는 0.5 내지 400 mg/kg의 양, 가장 구체적으로는 1 내지 300 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
예를 들어, 싸리나무 추출물은 1 mg/kg 내지 500 mg/kg의 투여량으로 포함되는 것인, 약학 조성물일 수 있다.
그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여할 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용을 유발하지 않으면서 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 싸리나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 싸리나무, 이의 추출물, 퇴행성 뇌질환, 치매 및 알츠하이머 병에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 "개선"은 싸리나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 예방 또는 치료되는 퇴행성 뇌질환 같은 병의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.
구체적으로, 본 발명의 싸리나무 추출물을 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선을 목적으로 식품 조성물에 첨가할 수 있다.
본 발명의 식품조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 및 음료 형태로 이루어지는 군에서 선택되는 것으로 제형화된 것으로 제조될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 식품학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 싸리나무 추출물을 포함하는 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 종류에는 별다른 제한이 없으며, 예를 들어 각종 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다. 상기 식품 조성물에는 학습능력 또는 기억력의 증진 및 치매 또는 알츠하이머 병의 예방 또는 치료효과에 방해가 되지 않는 다른 성분을 추가할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기 식품보조첨가제는 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들어 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 그 종류가 제한되는 것은 아니다.
이때, 상기 식품에 포함되는 추출물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 식품 조성물의 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%, 보다 바람직하게는 1 내지 80 중량%로 포함될 수 있다.
식품이 음료인 경우에는 100㎖를 기준으로 1 내지 30g, 바람직하게는 3 내지 20g의 비율로 포함될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 첨가할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용된다.
본 발명의 건강기능성 식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 싸리나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 학습 능력 또는 기억력 증진용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 "학습(learning)"은 행동의 변화이며, 이러한 변화는 연급, 훈련, 또는 경험에 의한 변화로서 유기체 내에서 일어나는 내재적인 변화를 말한다.
본 발명의 "기억(memory)"은 사람이나 동물이 경험한 것을 특정 형태로 저장하였다가 나중에 재생 또는 재구성하는 현상을 말한다. 기억은 여러가지로 분류되는데, 시간적 측면에서 불필요하면 잊게 되는 단기기억(short-term memory)과 장시간, 때로는 평생 동안 유지되는 장기기억(long-term memory)이 있다. 기억은 대뇌피질에 저장되고, 해마는 기억형성에 관려하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 "증진"이란, 본 발명에 따른 싸리나무 추출물을 개체에 투여하여 인지기능 및 기억력을 향상시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 발명의 일 실험예 에서는, 마우스를 이용한 Y 미로실험을 수행한 결과 싸리나무 에탄올 추출물을 투여한 마우스의 경우 대조군 보다 작업기억력을 현저히 증가시키는 것을 확인함으로써, 학습 능력 또는 기억력 증진효과를 확인하였다(실험예 1-1).
본 발명의 다른 실험예 에서는 마우스를 이용한 수동회피실험을 수행한 결과 싸리나무 에탄올 추출물을 투여한 마우스의 경우 대조군 보다 작업기억력을 현저히 증가시키는 것을 확인함으로써, 학습 능력 또는 기억력 증진효과를 확인하였다(실험예 1-2).
본 발명의 또 다른 실험예 에서는 싸리나무 에탄올 추출물을 투여한 마우스의 p-CREB 및 BDNF 단백질 발현을 확인하기 위하여 웨스턴 블롯 실험을 수행하였다. 그 결과, 싸리나무 에탄올 추출물을 투여한 마우스의 경우 p-CREB 및 BDNF 단백질 발현이 증가된 것을 확인함으로써, 학습 능력 또는 기억력 증진효과를 확인하였다(실험예 1-3).
다른 양태에서, 본 발명은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서 "개체"란, 퇴행성 뇌질환이 발병되었거나 발병할 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 "투여"란 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식에 따를 수 있다. 상기 투여 방식의 비제한적인 예로, 조성물을 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 목적하는 투여 방식에 따라 다양한 제형으로 제작될 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 약물 및 시약
Tween-80, scopolamine, beta-amyloid(25-35) 및 anti-β-actin 항체 그리고 Tween-20은 시그마사 (Sigma-Aldrich Chemistry Co.)에서 구입하여 사용하였다. 실험에 사용된 일차 항체들은 Cell Signaling (Boston, MA, USA)사의 것을 사용하였다. 그밖에 실험에 사용된 시약들은 최상의 제품의 것을 구매하여 사용하였다.
실시예 2. 싸리나무 추출물의 제조
자연천사(전라남도 담양)에서 건조된 야생 싸리나무(Lespedeza bicolor) 줄기 부위를 구입하여 사용하였다. 야생 싸리나무 줄기 부위를 완전히 건조시킨 후 야생 싸리나무 4kg을 70% 에탄올 4L에 2번 반복하여 추출한 다음 이를 감압농축기(EYELA사, N-1000, 일본)로 감압농축한 후, 동결 건조하여 싸리나무 에탄올 조추출물을 82g을 수득하였다.
실시예 3. 실험동물의 준비
4주령의 ICR계 수컷 마우스(18~20 g)를 코아텍 (평택, 대한민국)에서 공급받아 성균관대학교 약학대학의 동물사육실에서 1주일 이상 사육하여 적응시켜 사용하였으며, 물과 사료는 자유롭게 섭취하도록 하였고, 온도 (23 ± 2 ℃), 습도 (55 ± 10 %) 및 명암주기 (12시간)는 자동으로 조절되도록 하였다.
실시예 4. 통계처리
모든 실험 결과는 ANOVA(one way anlysis of variance)를 이용하여 통계 처리하였고, 유의성이 검증될 경우 Newman-Keuls를 사용하여 p<0.05 수준 이하에서 유의성 검정을 실시하였다.
실험예 1. 싸리나무 에탄올 추출물의 학습 및 기억력 증진효과 확인
1-1. 싸리나무 에탄올 추출물의 Y-미로실험에서 작업기억력 증진 효과
마우스를 각 군당 10 마리씩 5 군으로 나누었다. 제1군은 5% DMSO 및 10% Tween 80을 포함한 증류수 투여군, 제2군, 제3군, 제4군은 각각 싸리나무 에탄올 추출물 100, 200 및 400 mg/kg 투여군, 제5군은 양성대조군인 piracetam 200 mg/kg 투여군으로 하였다. 싸리나무는 5% DMSO 및 10% Tween을 포함하고 있는 증류수에 용해시켜 100, 200 및 400 mg/kg의 용량으로 마우스에 경구투여하고, 1시간 후에 마우스를 Y-미로에 넣어 각각 A, B 및 C 가지에 마우스가 자유롭게 들어가는 것을 측정하였다. 이때, 새로운 가지에 들어가면 1점을 주게 되며 (실제변경), 교차행동(spontaneous alternative behavior) %는 하기 수학식 1에 의하여 계산하였다.
[수학식 1]
교차행동 % = (실제변경) / (각 가지에 들어간 총 횟수 - 2) × 10
그 결과, 대조군의 마우스는 시험일에 62% 교차행동을 나타내었으며, 싸리나무 100 mg/kg 투여군은 63%를 나타내어 교차행동을 2% 증가시켰으며, 200 mg/kg 투여군은 64%를 나타내어 마우스의 교차행동을 3% 증가시켰으며, 한편 400 mg/kg 투여군은 69%를 나타내어 교차행동을 11% 증가시켰다. (p<0.05) 또한, piracetam 200 mg/kg 투여군은 70%를 나타내어 교차행동을 12% 증가시켰다. (p<0.05) 따라서 상기결과로부터 싸리나무 에탄올 추출물은 마우스의 작업기억력을 현저히 증가시켰음을 확인하였다(도 1).
1-2. 싸리나무 에탄올 추출물의 수동회피실험에서 학습 및 기억력 증진 효과
마우스를 각 군당 10 마리씩 5 군으로 나누었다. 제1군은 5%의 DMSO 및 10% Tween 80를 포함한 증류수 투여군, 제2군, 제3군, 및 제4군은 각각 실시예 1에서 준비한 싸리나무 에탄올 추출물 100, 200 및 400 mg/kg 투여군, 제5군은 양성대조군인 piracetam 200 mg/kg 투여군으로 하였다.
싸리나무 에탄올 추출물 5%의 DMSO 및 10% Tween 80을 포함하고 있는 증류수에 용해시켜 100, 200 및 400 mg/kg의 용량으로 마우스에 경구 투여하고, 1시간 후에 마우스를 수동회피 실험 장치에 넣어 어두운 상자로 들어가면 0.25mA (3초)의 전기 충격을 가하여 학습 (training trial)시켰다. 24시간 후에 마우스를 다시 밝은 상자에 넣어 검은 상자에 들어가기까지의 체재시간을 측정하여 학습 및 기억력의 지표로 하였다(test trial). 이때 마우스의 컷-오프 시간 (cut-off time)은 300초로 하여 대조군과 비교하였다.
그 결과, 대조군의 마우스는 시험일에 80초의 체재시간을 나타내었으나, 싸리나무 100 mg/kg 투여군은 112초를 나타내어 체재시간을 32초 증가시켰으며, 200 mg/kg 투여군은 110초를 나타내어 마우스의 체재시간을 30초 증가시켰으며, 400 mg/kg 투여군은 142초를 나타내어 체제시간을 62초 증가시켰다 (p<0.05). 또한, piracetam 200 mg/kg 투여군은 155초를 나타내어 체제시간을 75초 증가시켰다 (p<0.05).
상기 실험결과로부터 싸리나무 에탄올 추출물이 마우스의 학습 및 기억력을 현저히 증가시킬 수 있음을 확인하였다(도 2).
1-3. 싸리나무 에탄올 추출물의 p-CREB 및 BDNF 단백질 발현의 증가 효과
마우스를 각 군당 10 마리씩 5 군으로 나누었다. 제1군은 5%의 DMSO 및 10% Tween 80를 포함한 증류수 투여군, 제2군, 제3군, 및 제4군은 각각 실시예 1에서 준비한 싸리나무 에탄올 추출물 100, 200 및 400 mg/kg 투여군, 제5군은 양성대조군인 piracetam 200 mg/kg 투여군으로 하였다.
수동회피 실험 1시간 후 마우스의 해마를 적출하여 p-CREB 및 BDNF 단백질 발현의 동정실험을 위해서 웨스턴블롯 실험을 실시하였다. 조직은 차가운 PBS로 세척한 뒤, Tper 용해 버퍼(Thermo, USA) 100 ㎕를 첨가하여 30분간 용해시켰다. 용해물들은 원심분리기를 이용하여, 10000 g, 4℃로 15분간 원심분리시켰으며, 원심분리 후 상층액은 실험을 위한 샘플로서 사용 전까지 70℃에서 보관하였다. 단백질은 BCA 정량분석 키트(Thermo, USA)를 이용하여 정량분석하였으며, 8% 내지 12%의 SDS 겔로 용출한 후 PVDF 막에 옮겼다. 단백질의 발현을 확인하기 위해, ECL (enhanced chmilumenescence)로 형광발색 시켜 확인하는데, 먼저 5% 탈지분유로 막을 1시간 동안 반응시키며, 일차항체인 p-CREB, t-CREB, BDNF 및 β-actin으로 4℃에서 밤새 표지시켰으며, TTBS로 5회 세척한 다음 이차항체인 HRP (horseradish peroxidase)-conjugated anti-rabbit 그리고 anti-mouse 항체를 상온에서 1시간 동안 표지시켰다. 표지 후 10분간 TTBS를 이용하여 5회 세척하였고, 세척된 막은 ECL를 이용하여, x-ray 필름을 이용하여 발색시켰으며, 농도는 정량분석법에 따라 정량분석프로그램(Fujifilm, Japan)을 이용하여 분석하였다. 웨스턴 블롯 실험에서 해마 대조군은 각각 100%의 발현을 나타내었고, 싸리나무 100 mg/kg 투여군은 248% 및 181%의 발현을 나타내어 각각 148% (p<0.01) 및 81%의 발현량이 유의적으로 증가하였다. 싸리나무 200 mg/kg 투여군은 243% 및 321%의 발현을 나타내어 각각 143% 및 221%의 발현량이 유의적으로 증가하였으며 (p<0.05 및 p<0.01), 싸리나무 400 mg/kg 투여군은 303% 및 443%의 발현을 나타내어 각각 203% 및 343%의 발현량이 유의적으로 증가하였다 (p<0.01 및 p<0.001). 또한, piracetam 200 mg/kg 투여군은 472% 및 425%의 발현을 나타내어 각각 372% 및 325%의 발현량이 유의적으로 증가하였다 (p<0.001).
상기 실험을 통하여 싸리나무 에탄올 추출물이 현저한 p-CREB 및 BDNF 발현 증가에 의해 학습 및 기억력 증진 효과를 나타낸 것을 확인하였다(도 3a 및 3b).
실험예 2. 싸리나무 에탄올 추출물의 작업기억, 학습 및 기억력 개선효과 확인
2-1. 싸리나무 에탄올 추출물의 Y-미로실험에서 스코폴아민 유도 작업 기억력 개선 효과
마우스를 각 군당 10 마리씩 5 군으로 나누었다. 제1군(대조군)은 5%의 DMSO 및 10% Tween 80을 포함하고 있는 증류수 투여군, 제2군은 5%의 DMSO 및 10% Tween 80을 포함하고 있는 증류수 및 스코폴라민 투여군, 제3군 및 제4군은 각각 싸리나무 에탄올 추출물 25 및 50 mg/kg 투여군 제5군은 양성대조군인 donepezil 5 mg/kg 투여 후 스코폴아민 투여군으로 하였다.
싸리나무 에탄올 추출물 5%의 DMSO 및 10% Tween 80을 포함하고 있는 증류수에 용해시켜 25 및 50 mg/kg의 용량으로 마우스에 경구 투여하고, 30분 후에 스코폴아민 0.5 mg/kg을 피하주사 하였다. 1시간 후에 마우스를 Y-미로에 넣어 A, B 및 C 가지에 마우스가 자유롭게 들어가는 것을 측정하였다. 이때, 새로운 가지로 들어가면 1점을 주게 되며, 교차행동(spontaneous alternative behavior) %는 하기의 수학식 2에 의하여 계산하였다.
[수학식 2]
교차행동 % = (세 가지에 모두 들어간 횟수) / (각 가지에 들어간 총 횟수 - 2) × 100
그 결과, 대조군은 61%를 나타내어 공간기억력이 유지 되고 있었으나, 스코폴아민 투여 대조군은 시험일에 43% 교차행동을 나타내어 기억력이 현저히 감소되었다 (p<0.05). 싸리나무 에탄올 추출물 25 mg/kg 투여군은 46% 나타내어 스코폴아민 투여 대조군과 비교하여 교차행동을 3% 증가시켰으며, 50 mg/kg 투여군은 57%를 나타내어 스코폴아민 투여 대조군과 비교하여 마우스의 교차행동을 13% 증가시켰다 (p<0.05). 또한, donepezil 5 mg/kg 투여군은 스코폴아민 투여 대조군과 비교하여 57% 나타내어 마우스의 교차행동을 13% 증가시켰다 (p<0.05).
상기 실험결과를 통하여 싸리나무 에탄올 추출물이 기억력 감소를 효과적으로 개선할 수 있음을 확인하였다(도 4).
2-2. 싸리나무 에탄올 추출물의 수동회피실험에서 스코폴아민 유도 학습 및 기억력 개선 효과
마우스를 각 군당 10 마리씩 5 군으로 나누었다. 제1군(대조군)은 5%의 DMSO 및 10% Tween 80을 포함하고 있는 증류수 투여군, 제2군은 5%의 DMSO 및 10% Tween 80을 포함하고 있는 증류수 및 스코폴라민 투여군, 제3군 및 제4군은 각각 싸리나무 에탄올 추출물 25 및 50 mg/kg 투여군 제5군은 양성대조군인 donepezil 5 mg/kg 투여 후 스코폴아민 투여군으로 하였다.
싸리나무 에탄올 추출물 5%의 DMSO 및 10% Tween 80을 포함하고 있는 증류수에 용해시켜 25 및 50 mg/kg의 용량으로 마우스에 경구 투여하고, 30분 후에 스코폴아민 0.5 mg/kg을 피하주사 하였다. 30분 후에 마우스를 수동회피 실험 장치에 넣어 어두운 상자로 들어가면 0.5mA (3초)의 전기 충격을 가하여 학습 (training trial)시켰다. 24시간 후에 마우스를 다시 밝은 상자에 넣어 검은 상자에 들어가기까지의 체재시간을 측정하여 스코폴아민 유도 기억력 감소에 대한 개선효과의 지표로 하였다 (test trial). 이때 마우스의 컷-오프 시간 (cut-off time)은 300초로 하여 대조군과 비교하였다.
그 결과, 대조군은 143초를 나타내어 기억력이 유지되고 있었으나, 스코폴아민 투여 대조군은 시험일에 55초의 체재시간을 나타내어 기억력이 현저히 감소되었으며 (p<0.05), 싸리나무 에탄올 추출물 25 mg/kg 투여군은 67초를 나타내어 스코폴아민 투여 대조군과 비교하여 체재시간을 12초 증가되었으며, 50 mg/kg 투여군은 136초를 나타내어 스코폴아민 투여 대조군과 비교하여 마우스의 체재시간을 81초 증가시켰다 (p<0.05). 또한, 스코폴아민 투여 대조군과 비교하여 donepezil 5 mg/kg 투여군은 138초를 나타내어 마우스의 체재시간을 83초 현저하게 증가시켰다 (p<0.05).
상기 실험결과를 통하여 싸리나무 에탄올 추출물이 학습 및 기억력 감소를 효과적으로 개선할 수 있음을 확인할 수 있었다(도 5).
2-3. 싸리나무 에탄올 추출물의 스코폴아민 유도에 의한 p- CREB , p- ERK 및 BDNF 단백질 발현 감소의 개선 효과
마우스를 각 군당 10 마리씩 4 군으로 나누었다. 제1군(대조군)은 5%의 DMSO 및 10% Tween 80을 포함하고 있는 증류수 투여군, 제2군은 5%의 DMSO 및 10% Tween 80을 포함하고 있는 증류수 및 스코폴라민 투여군, 제3군은 싸리나무 에탄올 추출물 50 mg/kg 투여군, 제4군은 양성대조군인 donepezil 5 mg/kg 투여 후 스코폴아민 투여군으로 하였다. 수동회피 실험 1시간 후 마우스의 해마를 적출하여 p-CREB, p-ERK 및 BDNF 단백질 발현의 동정을 위해서 웨스턴 블롯 실험을 상기 실험예 3에서 수행한 방법과 동일하게 실시하였다.
그 결과, 웨스턴블롯 실험에서 해마 대조군은 각각 100% 의 발현을 나타내었고, 스코폴아민 투여군은 각각 67%, 56% 및 33%의 현저한 p-CREB, p-ERK 및 BDNF의 발현 감소를 유발시켰다 (p<0.05, p<0.05 및 p<0.01).
싸리나무 에탄올 추출물 50 mg/kg 투여군은 111%, 112% 및 75%의 발현을 나타내어 스코폴아민에 의해 감소된 p-CREB, p-ERK 및 BDNF의 발현을 각각 44% (p<0.05), 56% (p<0.01) 및 42% (p<0.05)의 발현량을 유의적으로 증가시켰고, donepezil 5 mg/kg 투여군은 114%, 102% 및 87%의 발현을 나타내어 스코폴아민에 의해 감소된 p-CREB, p-ERK 및 BDNF의 발현을 각각 37% (p<0.05), 46% (p<0.05) 및 54% (p<0.01) 발현량을 유의적으로 증가시켰다.
상기 실험을 통하여 스코폴아민에 의해 현저하게 감소된 p-CREB, p-ERK 및 BDNF 발현을 싸리나무 에탄올 추출물이 단백질들의 발현량을 유의적으로 회복시켜 학습 및 기억력 개선 효과를 나타낸 것을 확인할 수 있었다(도 6a 내지 6d).
2-4. 싸리나무 에탄올 추출물의 Y-미로실험에서 베타 아밀로이드 유도 작업 기억력 개선 효과
마우스를 각 군당 10 마리씩 5 군으로 나누었다. 제1군(대조군)은 5%의 DMSO 및 10% Tween 80을 포함하고 있는 증류수 투여군, 제2군은 5%의 DMSO 및 10% Tween 80을 포함하고 있는 증류수 및 베타아밀로이드 투여군, 제3군 내지 제5군은 각각 싸리나무 에탄올 추출물 25, 50 및 100 mg/kg 투여군으로 하였다.
베타 아밀로이드는 Y-미로실험 7일 전에 37℃에서 4일 동안 인큐베이션 된 베타 아밀로이드를 6nmol의 농도로 마우스 뇌의 좌측 뇌간에 2.5mm 깊이로 5㎕를 주사하였고, 매일 싸리나무 추출물을 증류수에 용해시켜 25, 50 및 100 mg/kg의 용량으로 마우스에 경구투여하고, 1시간 후에 마우스를 Y-미로에 넣어 A, B 그리고 C 각 가지에 마우스가 자유롭게 들어가는 것을 측정하였다. 이 때 새로운 각 가지에 들어가면 1점을 주게 되며(실제변경), 교차행동에 대한 % 수학식은 다음과 같다.
[수학식 3]
교차행동 % = (세 가지에 모두 들어간 횟수) / (각 가지에 들어간 총 횟수 - 2) × 100
그 결과, 대조군은 64%를 나타내어 공간기억력이 유지 되고 있었으나, 베타 아밀로이드 투여 대조군은 시험일에 55% 교차행동을 나타내어 기억력이 현저히 감소되었다 (p<0.05). 싸리나무 에탄올 추출물 25 mg/kg 투여군은 66%를 나타내어 베타 아밀로이드 투여 대조군과 비교하여 교차행동을 11% 증가시켰으며 (p<0.05), 50 mg/kg 투여군은 67%를 나타내어 베타 아밀로이드 투여 대조군과 비교하여 마우스의 교차행동을 12% 증가시켰다 (p<0.05). 또한, 싸리나무 100 mg/kg 투여군은 베타 아밀로이드 투여 대조군과 비교하여 58% 나타내어 마우스의 교차행동을 3% 증가시켰다.
상기 실험결과를 통하여 싸리나무 에탄올 추출물이 작업 기억력 감소를 효과적으로 개선할 수 있음을 확인하였다(도 7).
2-5. 싸리나무 에탄올 추출물의 수동회피실험에서 베타 아밀로이드 유도 학습 및 기억력 개선 효과
마우스를 각 군당 10 마리씩 5 군으로 나누었다. 제1군(대조군)은 5%의 DMSO 및 10% Tween 80을 포함하고 있는 증류수 투여군, 제2군은 5%의 DMSO 및 10% Tween 80을 포함하고 있는 증류수 및 베타아밀로이드 투여군, 제3군 내지 제5군은 각각 싸리나무 에탄올 추출물 25, 50 및 100 mg/kg 투여군으로 하였다.
베타 아밀로이드는 수동회피실험 8일 전에 37℃에서 4일동안 인큐베이션 된 베타아밀로이드를 6nmol의 농도로 마우스 뇌의 좌측 뇌간에 2.5mm 깊이로 5㎕를 주사하였고, 매일 싸리나무 에탄올 추출물을 증류수에 용해시켜 25, 50 및 100 mg/kg의 용량으로 마우스에 경구투여 하였다. 1시간 후에 마우스를 수동회피 실험 장치에 넣어 어두운 상자로 들어가면 0.5mA (3초)의 전기 충격을 가하여 학습 (training trial)시켰다. 24시간 후에 마우스를 다시 밝은 상자에 넣어 검은 상자에 들어가기까지의 체재시간을 측정하여 베타 아밀로이드 유도 인지기능 및 기억력 감소에 대한 개선효과의 지표로 하였다 (test trial). 이때 마우스의 컷-오프 시간 (cut-off time)은 300초로 하여 대조군과 비교하였다.
그 결과, 대조군은 159초를 나타내어 기억력이 유지되고 있었으나, 베타 아밀로이드 투여 대조군은 시험일에 38초의 체재시간을 나타내어 기억력이 현저히 감소되었으며 (p<0.01), 싸리나무 에탄올 추출물 25 mg/kg 투여군은 119초를 나타내어 베타 아밀로이드 투여 대조군과 비교하여 체재시간을 81초 증가되었으며 (p<0.05), 50 mg/kg 투여군은 84초를 나타내어 베타 아밀로이드 투여 대조군과 비교하여 마우스의 체재시간을 43초 증가시켰다. 또한, 베타 아밀로이드 투여 대조군과 비교하여 100 mg/kg 투여군은 92초를 나타내어 마우스의 체재시간을 54초 증가시켰다.
상기 실험결과를 통하여 싸리나무 에탄올 추출물이 학습 및 기억력 감소를 효과적으로 개선할 수 있음을 확인할 수 있었다(도 8).
2-6. 싸리나무 에탄올 추출물의 베타 아밀로이드 유도에 의한 p- CREB , p- ERK 및 BDNF 단백질 발현 감소의 개선 효과
마우스를 각 군당 10 마리씩 4 군으로 나누었다. 제1군(대조군)은 5%의 DMSO 및 10% Tween 80을 포함하고 있는 증류수 투여군, 제2군은 5%의 DMSO 및 10% Tween 80을 포함하고 있는 증류수 및 베타 아밀로이드 투여군, 제3군은 싸리나무 에탄올 추출물 25 mg/kg 투여군, 제4군은 싸리나무 에탄올 추출물 50 mg/kg 투여군으로 하였다. 수동회피 실험 1시간 후 마우스의 해마를 적출하여 p-CREB, p-ERK 및 BDNF 단백질 발현의 동정실험을 위해서 웨스턴블롯 실험을 상기 실험예 3에서 수행한 방법과 동일하게 실시하였다.
그 결과, 웨스턴블롯 실험에서 해마 대조군은 각각 100% 의 발현을 나타내었고, 베타 아밀로이드 투여군은 각각 50%, 33% 및 33%의 현저한 p-CREB, p-ERK 및 BDNF의 발현 감소를 유발시켰다 (p<0.01, p<0.01 및 p<0.01).
싸리나무 에탄올 추출물 25 mg/kg 투여군은 92%, 101% 및 119%의 발현을 나타내어 베타 아밀로이드에 의해 감소된 p-CREB, p-ERK 및 BDNF의 발현을 각각 42% (p<0.01), 68% (p<0.01) 및 86% (p<0.001)의 발현량을 유의적으로 증가시켰고, 싸리나무 에탄올 추출물 50 mg/kg 투여군은 65%, 71% 및 112%의 발현을 나타내어 베타 아밀로이드에 의해 감소된 p-CREB, p-ERK 및 BDNF의 발현을 각각 15%, 38% (p<0.05) 및 79% (p<0.01) 발현량을 유의적으로 증가시켰다.
상기 실험을 통하여 베타 아밀로이드에 의해 현저하게 감소된 p-CREB, p-ERK 및 BDNF 발현을 싸리나무 에탄올 추출물이 단백질들의 발현량을 유의적으로 회복시켜 학습 및 기억력 개선 효과를 나타낸 것을 확인할 수 있었다(도 9a 내지 9d).
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (8)

  1. 싸리나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 물, C1 내지 C4의 알코올, 헥산(Hexane) 및 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 용매로 추출하여 수득한 것인 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 치매 또는 알츠하이머 병인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 싸리나무 추출물은 p-CREB(Phospho-cAMP response elementbinding protein) 또는 BDNF(Brain derived neurotrophic factor) 단백질 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 싸리나무 추출물은 스코폴아민 유도에 의한 p-CREB, p-ERK(Phospho-extracellular signal regulated kinase) 및 BDNF 단백질 발현 감소를 개선시키는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 싸리나무 추출물은 베타 아밀로이드 유도에 의한 p-CREB, p-ERK 및 BDNF 단백질 발현 감소를 개선시키는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  7. 싸리나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  8. 싸리나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 학습 능력 또는 기억력 증진용 식품 조성물.
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