KR100901188B1 - 꽁치류의 가수분해물을 포함하는 인지기능장애 예방 또는개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 꽁치 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 인지능력 손상이나 기억력 감퇴를 예방 또는 개선하는 효능을 가진 인지기능장애 예방 또는 개선용 식품, 의약품, 또는 음료에 관한 것이다.

꽁치, 인지기능장애

Description

꽁치류의 가수분해물을 포함하는 인지기능장애 예방 또는 개선용 조성물{COMPOSITION CONTAINING HYDROLYSATES OF MACKEREL PIKE FOR PREVENTION OR ATTENUATION OF COGNITIVE IMPAIRMENT}

본 발명은 꽁치 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 인지기능장애 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.

현재 우리나라 65세 이상 노령인구의 약 8.3%가 앓고 있는 노인성 치매는 그 환자수가 점차 늘어나 2020년까지 전체 노령인구의 약 10%를 차지할 것으로 전망되고 있으며, 이로 인해 많은 사회적ㆍ경제적 문제점이 야기되고 있다.

치매질환의 원인은 매우 다양하며, 이러한 치매질환 중 노인성 치매에 해당되는 알츠하이머 치매증 및 뇌혈관성 치매증은 전체 치매질환의 약 90%를 차지하고 있으며, 이외 픽 (Pick)병, 크로이츠펠트-야곱 (Creutzfeldt-jakob)병, 두부손상에 의한 치매, 및 파킨슨 (Parkinson)병 등이 있다. 특히, 알츠하이머 치매증 (Alzheimer's disease)은 노인성 질환 및 신경세포의 손실과 관련하여 점진적인 인지기능 및 기억능력의 상실을 초래하는 신경퇴행성 질환으로서, 환자의 신경전달계, 즉 아세틸콜린계, 글루타민산계, 신경펩티드계 및 모노아민계에서의 기능 장애 와 산화적 스트레스에 의한 신경세포의 지속적인 파괴를 유도하는 베타-아밀로이드 단백질 (β-amyloid protein)의 뇌내 축적으로 인한 신경독성이 주된 원인으로 추정되고 있다 (Tanzi, R.E. et al., Neuron, 43(5), 385-396, 2004).

이에 따라, 치매질환의 치료를 위한 의약품이나 기능성 식품을 개발하기 위한 많은 연구가 진행되어 왔고, 이러한 결과로서 최근에는 신경전달물질인 아세틸콜린을 분해하는 효소인 아세틸콜린에스테라제의 활성을 저해하여 뇌의 아세틸콜린을 증가시키는 아세틸콜린에스테라제 억제제들이 개발되어 시판되고 있다. 이러한 억제제의 예로는 1,2,3,4-테트라히드로-9-아크리딘아민 (1,2,3,4-tetrahydro-9-acridineamine), 타크린 (tacrine), 9-아미노-1,2,3,4-테트라히드로아크리딘 (THA), 코그넥스 (COGNEX), 도네페질 (DonePezyl, E2020), 아리셉트 (ARICEPT), 리바스티그민 (Rivastigmine, ENA713) 및 엑셀론 (EXELON) 등이 있다.

그러나, 이러한 아세틸콜린에스테라제 억제제들은 콜린성 신경이 기능적으로 손상되지 않았을 때 효과적이며, 즉 이들 억제제의 효능은 콜린성 신경 기능의 감퇴와 함께 감소되기 때문에 경증이나 중증도의 노인성 치매의 초기 단계에만 효과가 있다. 또한, 상기 억제제 대부분이 말초신경의 콜린성 부작용을 나타내며, 반감기가 짧고, 간 독성, 구토 및 식욕 감퇴 등의 심각한 부작용을 일으키는 단점을 가지고 있다 (Christie, J.E., et al., Br. J. Psychiatry, 138, 46-50, 1981). 특히, 코그넥스 (COGNEX)의 유효성분인 9-아미노-1,2,3,4-테트라히드로아크리딘 (THA)은 경구 투여시, 지각능력 향상의 소견을 보이긴 하나 (Summers, W.K., et al., N. Engl. J. Med., 315(20), 1241-1246, 1986), 떨림증, 어지럼증, 간 독성 등의 심각한 부작용을 나타내어 널리 활용되지 못하고 있는 실정이다.

이러한 단점을 극복하기 위한 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 인지능력 손상이나 기억력 감퇴를 예방 또는 개선하는 효능을 가진 인체에 무해한 꽁치 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 인지기능장애 예방 또는 개선용 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 본 발명의 기술적 과제는 꽁치 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 인지기능장애 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명자들은 꽁치 가수분해물을 제조하고, 제조된 꽁치 가수분해물이 항콜린제를 투여하여 유발시킨 인지기능장애를 갖는 동물 모델에서 인지능력 손상이나 기억력 감퇴를 예방 또는 개선하는 효능이 있음을 확인하고, 이를 통하여 꽁치 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 인지기능장애 예방 또는 개선용 조성물을 제공함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 꽁치 (Cololabis saira) 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 인지기능장애 예방 또는 개선용 조성물을 제공한다.

또 다른 상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 꽁치 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 인지능력 손상이나 기억력 감퇴를 예방 또는 개선하는 효능을 가지며 인체에 무해한 특징을 가진 인지기능장애 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 명세서에서, '인지기능장애'란 뇌 자체의 기질적인 변화나 뇌 손상에 의해 나타나는 단기간 및/또는 장기간의 기억장애를 의미하며, 이러한 인지기능장애로는 지능 저하, 기억력 저하, 계산능력 저하, 지남력 (방위측정능력)장애, 판단능력장애, 및 충돌조절장애 등이 포함될 수 있다. 또한, 인지능력장애 관련 질환으로는 픽 (Pick)병, 크로이츠펠트-야곱 (Creutzfeldt-jakob)병, 두부손상에 의한 치매, 및 파킨슨 (Parkinson)병 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

꽁치 (Coloabis saira)는 동갈치목 (Order Beloniformes) 꽁치과의 바닷물고기로, 공치, 청갈치, 삼마, 퍼시픽 사우리 (Pacific saury) 또는 매케럴 파이크 (Mackerel Pike)라고도 불리우며, 한국의 동해와 남해 및 북태평양 해역에 분포하고 주요 서식장소는 수심 0 내지 230 m 정도의 바다 속이다.

꽁치에는 단백질과 지방 및 비타민 B가 풍부하며 다른 등푸른 생선들과 마찬가지로 영아기의 두뇌 발달과 성인의 기억력 감퇴 예방에 효과적인 DHA (docosahexaenoic acid) (Hashimoto, M. et al., Nippon Yakurigaku Zasshi, 120(1), 54-56, 2002) 및 혈중 콜레스테롤을 낮춰 순환기질환을 예방해 주는 EPA (eicosapentaenoic acid) (Geleijnse, J.M. et al., J. Hypertens., 20(8), 1293-1499, 2002; Roberta, C. et al., 2007)와 같은 불포화지방산인 오메가-3 지방산이 풍부하여 예로부터 식용으로 널리 이용되어 왔다.

이러한 특징을 가진 꽁치로부터 분리된 본 발명에 따른 꽁치 가수분해물 (Hydrolysate of mackerel pike, HMP)은 어류 가수분해물을 제조하는 통상의 제조 방법에 따라 제조된 것일 수 있고, 바람직하게는 효소를 이용한 가수분해에 의해 제조된 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 본 발명에 앞서 본 발명자들이 특허출원한 대한민국 특허출원번호 제10-2007-0053371호에 기재된 제조방법에 의해 제조된 것일 수 있다. 이와 관련하여 상기 꽁치 가수분해물을 수득하는 과정을 요약하면 다음과 같다.

본 발명에 따른 일예에서, 상기 꽁치 가수분해물은 꽁치를 분쇄, 효소 처리, 및 기름층을 제거한 물층의 농축 또는 건조하는 단계로 이루어진 공정으로부터 수득할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 꽁치 가수분해물은 내장을 제거한 꽁치에 물, 바람직하게는 증류수를 첨가하여 완전히 분쇄한 후, 단백질 가수분해 효소를 첨가하여 반응시키고, 상기 반응이 끝나면 효소를 불활성화시킨 후에 불용물을 제거하며, 상기 불용물을 제거한 혼합액을 원심 분리하여 기름층을 제거한 다음, 기름층을 제거한 상기 혼합액, 바람직하게는 물층을 농축하거나 건조하여 수득할 수 있다. 또한, 상기 꽁치 가수분해물은 수득된 가수분해물을 농축 또는 건조, 바람직하게는 동결건조하여 수분이 제거된 것일 수 있다. 상기 단백질 가수분해 효소는 바람직하게는 알카라제, 프레보라임, 프로텍스, 파라타제 및 뉴트라제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 단백질가수분해효소일 수 있으며, 보다 바람직하게는 알카라제 효소일 수 있다.

후술하는 본 발명의 실시예에서는, 이렇게 제조된 본 발명의 꽁치 가수분해물을 이용하여 인지기능장애를 유발시킨 동물 모델에서 아세틸콜린 수용체의 활성 을 억제하고, 조직내 신경세포의 콜린 아세틸트랜스퍼라제 (ChAT) 활성을 유지하여 인지력 및 기억력에 관여하는 신경전달물질인 아세틸콜린의 합성을 촉진시켜 인지능력 손상이나 기억력 감퇴를 예방 또는 개선시킴을 확인하였다 (도 4a 및 4b).

따라서, 본 발명은 꽁치(Cololabis saira) 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 인지기능장애 예방 또는 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 인지기능장애 예방 또는 개선용 조성물은, 전체 조성물 100 중량부에 대하여 상기 꽁치 가수분해물을 0.001 내지 99.99 중량부, 바람직하게는 0.1 내지 99 중량부로 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 꽁치 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 인지기능장애 예방 또는 개선을 위한 조성물은, 식품 조성물, 또는 의약 조성물일 수 있다.

본 명세서에서 '식품'이란 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 건강 기능성 식품 및 음료를 모두 포함할 수 있다.

상기 식품 조성물에 함유된 꽁치 가수분해물의 함량은 목적으로 하는 식품의 종류나 기호 등에 따라 다르나, 꽁치 가수분해물의 인지기능장애에 대한 예방 또는 개선 효과를 효과적으로 나타내는 범위 내에서 사용 가능하며, 바람직하게는 엑기스로 이용하는 경우에는 전체 조성물 100 중량부에 대하여 2.5 내지 25 중량부, 동결건조 또는 열풍건조 상태의 분말 또는 과립상의 제품으로 이용하는 경우에는 0.5 내지 5 중량부 꽁치 가수분해물을 포함할 수 있다.

상기 식품 조성물은 꽁치 가수분해물 외에 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가로 함유하는 것일 수 있고, 상기 성분들을 독립적으로 또는 조합하여 제조하는 것일 수 있다. 상기 추가성분의 함량은 바람직하게는 상기 꽁치 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 20 중량부 범위 내에서 추가할 수 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 그 제형이 정제, 과립제, 캡슐 또는 액상 형태일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 꽁치 가수분해물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본 발명의 식품에는 특수영양식품 (예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류 (예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품 (예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류 (예, 스넥류), 유가공품 (예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품 (각종 김치류, 장아찌 등), 음료 (예, 과실, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료 (예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

본 발명에 있어서, '기능성 식품'이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한 다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제 등을 더욱 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서 '음료'란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함할 수 있다. 상기 음료는 유효성분으로 상기 꽁치 가수분해물을 포함하는 것 외에 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기한 것 이외의 향미제로는 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖ 당 일반적으로 약 1 g 내지 20 g, 바람직하게는 5 g 내지 12 g이다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 주스 음료 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, '기능성 음료'란 음료에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 음료의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 음료 군이나 음료 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 음료를 의미한다.

상기 기능성 음료는 유효성분으로 상기 꽁치 가수분해물을 포함하는 것 외에 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 의약 조성물로 사용될 수 있다. 상기 의약 조성물은 그 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있으며, 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 특별히 한정되어 있는 것은 아니며, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 것을 포함할 수 있다.

또한, 상기 의약 조성물은 통상의 방법에 따라 각각 산제, 과립제, 정제, 현탁제, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제제로 사용될 수 있으며, 상기 경구형 제제는 경구투여를 위한 고형제제와 액상제제를 포함하는 것일 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함할 수 있고, 이러한 고형제제는 상기 가수분해물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제조하는 것일 수 있으며, 부형제 외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 등을 포함할 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제에는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 포함할 수 있고, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 외에 여러 가지 부형제 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 의약 조성물의 투여량은 대상동물, 바람직하게는 포유류의 상태, 체중, 질병의 상태, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르나, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있으며, 바람직하게는 상기 조성물은 꽁치 가수분해물의 건조중량을 기준으로 할 때 1 일 0.0001 내지 1000 mg/kg (대상동물의 체중), 보다 바람직하게는 0.01 내지 500 mg/kg (대상동물의 체중), 더욱 바람직하게는 50 내지 100 mg/kg (대상동물의 체중)으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 1회 내지 수회, 보다 바람직하게는 하루에 3회로 나누어 투여할 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 꽁치 가수분해물은 스코폴라민 등의 항콜린제에 의해 유도된 포유류의 인지기능장애를 효과적으로 예방 또는 개선할 수 있을 뿐 아니라, 조직내 신경세포상에서의 콜린 아세틸트랜스퍼라제의 활성을 유지하여 인지력 및 기억력에 관여하는 신경전달물질인 아세틸콜린의 합성을 촉진시키고, 인체에 부작용을 발생시키지 않으므로, 이를 포함하는 조성물은 인지기능장애를 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물 또는 의료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1: 꽁치 가수분해물의 제조

춘천시 이마트에서 구입한 신선한 상태의 꽁치를 그 내장을 제거한 후, 믹서기에 꽁치 1 kg 당 800 ml의 증류수를 첨가하여 3 분간 2회 믹싱하여 완전 분쇄하였고, 상기 분쇄액에 1.2 g의 알카라제 효소 (Alcalase enzyme, 2 %, Novozyme A/S, Bagsvaerd, 덴마크)를 첨가하여 60 ℃ 교반 배양기 (shaking incubator)에서 2 시간 동안 반응시켜 가수분해물을 수득하였다. 상기 수득된 가수분해물을 90 ℃에서 10 분간 가열하여 알칼라제 효소의 활성을 불활성화시킨 다음, 뼈 등의 불용물을 제거하기 위하여 7,200 rpm으로 원심 분리하여 상등액만을 수득하였다. 상기 상등액을 다시 90 ℃에서 20 분간 가열 처리한 다음, 8,520 rpm으로 원심 분리하여 위의 기름층을 제거하고 나머지 물층을 동결 건조하여 꽁치 가수분해물을 수득하였다. 이렇게 수득된 꽁치 가수분해물은 사용시까지 급속냉동고 (deep freezer)에 보관하였다.

실시예 2: 동물 생체내 ( in vivo ) 인지기능장애 예방능 측정

2-1: 실험동물의 사육 및 시료의 채취

체중 20-25 g의 4 주령된 수컷 ICR(Institute of Cancer Research, 미국) 마우스 40마리를 코아텍사 (대한민국)에서 공급받아 오전 7시부터 오후 7시까지 빛을 가하는 일정한 명암주기, 22-25 ℃의 온도, 및 45-65 %의 상대습도의 조건하에서 1주일간 적응시켰다. 적응시킨 ICR 마우스를 각각 10 마리씩 나누어 하나의 케이지 안에서 사육하였다. 실제실험개시일 4 주전부터 매일 식이한 상기 ICR 마우스의 사료는 통상적인 펠렛 건조사료 (대한실험동물, 대한민국) 또는 상기 실시예 1에서 제조한 꽁치 가수분해물을 ICR 마우스의 체중 kg 당 각각 50 mg 및 100 mg씩 상기 펠렛 건조사료 (대한실험동물, 대한민국)와 혼합한 사료를 이용하였고, 사료와 물은 자유로이 섭취하도록 하였다.

또한, ICR 마우스의 인지기능장애를 유발하기 위하여 4 주간 상기 실험사료를 식이한 후 실제실험개시 30 분 전에 ICR 마우스의 체중 kg 당 1 mg의 스코폴라민 (scopolamine, Sigma chemical Co. 미국)을 피하주사로 투여한 후, 수동회피실험 (Passive avoidance test) 및 수중미로실험 (Water maze test)을 통한 학습 및/또는 인지능력을 측정하였다.

본 발명에서는 다음과 같이 4개의 군으로 나누어 각각 ICR 마우스의 인지능을 측정하였다.

대조군 1

실시예 1에서 제조한 꽁치 가수분해물을 혼합하지 않은 통상적인 펠렛 건조사료 (대한실험동물, 대한민국)를 4 주간 식이하고, ICR 마우스 체중 kg 당 1 mg의 스코폴라민 (scopolamine, Sigma chemical Co. 미국)을 실제실험개시일 30 분 전에 투여하지 않은 ICR 마우스군 (10 마리)을 의미한다.

대조군 2

ICR 마우스 체중 kg 당 1 mg의 스코폴라민 (scopolamine, Sigma chemical Co. 미국)을 실제실험개시일 30 분 전에 피하주사로 투여하는 것을 제외하고는, 상기 대조군 1과 동일한 방법으로 식이한 ICR 마우스군 (10 마리)을 의미한다.

실험군 1

ICR 마우스 체중 kg 당 실시예 1에서 제조한 꽁치 가수분해물을 50 mg 섭취하도록 혼합한 통상적인 펠렛 건조사료 (대한실험동물, 대한민국)를 4 주간 식이하고, ICR 마우스 체중 kg 당 1 mg의 스코폴라민 (scopolamine, Sigma chemical Co. 미국)을 실제실험개시일 30 분 전에 피하주사로 투여한 ICR 마우스군 (10마리)을 의미한다.

실험군 2

ICR 마우스 체중 kg 당 실시예 1에서 제조한 꽁치 가수분해물을 100 mg 섭취하도록 혼합한 통상적인 펠렛 건조사료 (대한실험동물, 대한민국)를 식이하는 것을 제외하고는, 상기 실험군 1과 동일한 방법으로 실시한 ICR 마우스군을 의미한다.

2-2: 인지기능장애 예방능 측정

<수동회피실험 ( Passive avoidance test )을 통한 학습능력 효과>

상기 실시예 2-1에서 준비한 4개의 군을 이용하여 수동회피실험을 통한 학습능력 효능을 비교하였다. 보다 구체적으로, 빛을 줄 수 있는 밝은 방과 빛이 없는 어두운 방으로 나누어진 수동회피상자 (Shuttle box)를 전체적으로 어둡게 유지하여 준비한 후, 조명을 킨 한쪽 방에 실험군 마우스를 각각 넣어주면 마우스는 주변을 살피다가 어두운 방으로 이동하게 되는데, 이때 즉시 0.3 mA의 전류를 2 초 동안 흘려 전기충격 (electric foot shock)을 주어 어두운 방과 전기충격과의 관계를 기억하게 하였다. 24시간 후, 다시 조명을 킨 한쪽 방에 위치시켰을 때 어두운 방으로 이동하는데 걸리는 시간 (step through latency)을 측정하였다. 최대 제한시간은 300 초로 하였고, 300 초 이상 경과한 후에도 마우스가 어두운 방으로 이동하 지 않을 경우에는 수동회피반응시간을 300 초로 결정하였다.

그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 스코폴라민을 투여한 군 (대조군 2)은 통상적인 펠렛 사료를 식이한 군 (대조군 1)에 비해 인지능력이 현저하게 감소된 반면, 꽁치 가수분해물을 50 mg 혼합한 혼합사료를 식이한 군 (실험군 1)은 스코폴라민에 의해 유도된 손상된 인지능력을 대조군 1 수준으로 회복하였고, 꽁치 가수분해물을 100 mg 혼합한 혼합사료를 식이한 군 (실험군 2)은 비교예 1에 비해 약 2배 정도의 인지능력 개선 효과를 보였다 (도 2).

이러한 결과로부터, 본 발명에 따른 꽁치 가수분해물은 농도-의존적으로 스코폴라민에 의해 유도된 마우스의 인지능력손상을 예방 및/또는 개선하는 효과가 있음을 알 수 있다.

< 수중미로실험 ( Water maze test )을 통한 학습능력 및/또는 공간지각능력 효과>

상기 실시예 2-1에서 준비한 4개의 군을 이용하여 수중미로실험을 통한 학습능력 및/또는 공간지각능력 효능을 비교하였다. 보다 구체적으로, 원형의 물탱크 (지름 150 cm, 높이 45 cm)에 23 ℃ 온도의 물로 채워 준비한 후, 플랫폼 (지름 10 cm, 높이 30 cm)을 전체 물탱크를 4 등분한 중앙에 놓고 플랫폼 상단이 수면으로부터 0.5 cm 밑에 위치하도록 조절하였다. 실험은 1 일에 2 회씩 4 일간 연속적으로 실시하였고, 1차 훈련 실험뿐 아니라 실제 실험 (2차 훈련 실험) 사이에는 20 분 정도의 간격을 두었다. 매회 실험에서 마우스가 감춰진 플랫폼을 찾아 물탱크에서 밖으로 나가기까지 소요되는 시간을 측정하였다. 또한, 마우스가 플랫폼을 찾으면 약 10 초 동안 플랫폼에 머무르게 하였고, 만일 120 초 이내에 플랫폼을 찾지 못할 경우에도 마우스를 플랫폼에 역시 10 초 동안 머무르게 한 다음 실험을 종료하였다.

그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 4일 동안의 실험에서 대조군 1은 점차적으로 플랫폼을 찾는 시간이 줄어드는 반면, 스코폴라민을 투여한 군 (대조군 2)은 1 일부터 4 일까지 스코폴라민에 의해 유도된 손상된 인지능력이 거의 회복되지 않아 플랫폼을 찾는 시간이 대조군 1에 비해 현저하게 떨어짐을 관찰할 수 있었다 (도 3). 이와 달리, 꽁치 가수분해물을 각각 50 mg, 100 mg 혼합한 혼합사료를 식이한 실험군 1 및 2에 있어서, 실험군 1은 비록 실험개시일 1 일부터 3 일까지는 스코폴라민을 투여한 군 (대조군 2)에 비해 경미한 수준으로 인지능력 개선 효과를 보였으나, 실제실험개시일 4 일째는 대조군 2에 비해 현저하게 증가된 인지능력 개선 효과를 보였고, 또한 실험군 2는 실험개시일 1 일째는 스코폴라민을 투여한 군 (대조군 2)에 비해 현저하게 증가된 인지능력 개선 효과를 보였으나, 실험개시일 2 일부터 4 일까지는 실험군 1과 유사한 수준으로 인지능력 개선 효과를 나타내었다 (도 3).

이러한 결과로부터, 본 발명에 따른 꽁치 가수분해물은 ICR 마우스 체중 kg 당 50 mg 및 100 mg에서 농도-의존적으로 스코폴라민에 의해 유도된 마우스의 인지능력손상을 예방 및/또는 개선하는 효과가 있음을 알 수 있다.

실시예 3: 조직내 콜린 아세틸트랜스퍼라제 ( ChAT ) 활성 측정

실시예 2의 결과를 바탕으로, 본 실시예에서는 본 발명에 따른 꽁치 가수분해물이 실질적으로 조직내 신경세포에서 콜린 아세틸트랜스퍼라제 (ChAT) 활성을 유지하여 스코폴라민 투여에 따른 인지능력장애를 예방 및/또는 개선하는지 조사하였다.

보다 구체적으로, 상기 실시예 2에서 실시한 ICR 마우스를 각각 티오펜탈 소듐 (thiopental sodium, 30mg/kg, 유한양행, 한국)를 이용하여 마취시킨 후, 뼈절단기를 이용하여 마우스의 머리뼈 공간을 열어 뇌를 적출하였다. 적출된 뇌를 4 ℃의 4 % 파라포름알데하이드 (in 0.1 M phosphate buffer; PB, pH 7.4) 용액으로 6 시간 동안 후고정하였다. 후고정된 뇌를 30% 슈크로스 용액 (in 0.1 M phosphate buffer)에 넣어 바닥에 가라앉을 때까지 침강시킨 후, 슬라이드 마이크로톰 (sliding microtome, Reichert-Jung, 독일)으로 상기 뇌 조직을 30 ㎛ 두께로 절단하여 조직절편을 만들었다. 상기 조직절편을 보존액 (storing solution)이 들어있는 6 웰 플레이트에 넣어 염색을 수행할 때까지 4 ℃에서 보관하였다.

상기 조직절편 중 전뇌기저부 (basal forebrain)의 대각선 (diagonal band) 부위가 잘 나와 있는 조직을 선택하고, 조직절편에 묻어있는 보존액을 없애기 위해 0.01 M PBS (pH 7.4)로 10 분씩 3회 세척하였다. 또한, 상기 세척된 조직절편의 조직 내에 존재하는 내인성 페록시다제를 제거하기 위해 0.3 % 과산화수소 (in PBS)에 30 분 동안 반응시켰다. 상기 조직의 면역염색반응은 우선 비특이적인 면역반응이 나타나는 것을 방지하기 위하여 조직절편을 3 % 정상 염소 혈청 (normal goat serum, vector lavoratories, 미국)으로 30 분간 반응시킨 후, 1차 항체인 래빗 항-콜린 아세틸트랜스퍼라제 항체 (rabbit anti-ChAT antibody, chemicon, 미국)를 1:500으로 혈청이 함유되지 않은 PBS 용액에 희석하여 4 ℃에서 48 시간 동안 반응시켰다. 1차 항체 반응이 끝난 조직을 2차 항체인 항-래빗 IgG (Vector)를 1:200으로 혈청이 함유되지 않은 PBS 용액에 희석하여 2 시간 동안 반응시킨 후, 상기 2차 항체와 동일하게 1:200으로 희석한 3차 항체인 ABC 용액 (Vector)으로 다시 1 시간 동안 반응시켰다. 3,3'-디아미노벤지딘 (DAB, Fluka, 미국)을 기질로 하여 발색시킨 후 젤라틴으로 코팅된 슬라이드에 도말하여 실온에서 12 시간 동안 충분히 건조하였다. 충분히 건조된 조직절편을 흐르는 물에 충분히 세척하여 슬라이드에 묻어 있는 과량의 염료를 제거한 다음, 조직절편을 증류수에 잠시 담근 후에 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % 및 100 % 에탄올 용액으로 처리하여 탈수 및 과량의 염료를 세척하였다. 상기 탈수화된 조직절편을 자일렌 용액(Junsei, 일본)에 담가 투명화시킨 후, 카나다 발삼 (Canada Balsam, Junsei, 일본)으로 봉입하였다 (Kiernan, J.A. et al., Pergamon Press, 2^nd edition, pp. 5, 1990).

염색된 각 조직절편들의 전뇌기저부의 대각선 부위를 디지털 카메라 (Axiocam, Cal Zeiss, 독일)가 부착되어 있는 악시오플랜 현미경 (Axioplan microscope, Carl Zeiss, 독일)으로 100 배 확대 촬영하였다. 염색된 부위는 이미지 분석기 프로그램 (Optimas 6.5, 미국)을 이용하여 신경세포의 수를 측정하였고, 각 군에 대한 유의성을 검증하기 위하여 살아있는 신경세포의 수를 표시하여 통계 적인 분석을 수행하였다. 또한, 각 군에서 가장 일반적인 부분을 악시오포트 현미경 (Axiophot microscope, Carl Zeiss, 독일)으로 사진 촬영하였다. 상기 실험 결과를 각각 도 4a 및 4b에 나타내었다.

도 4a에 나타낸 바와 같이, 대조군 1 (Control)에서는 콜린 아세틸트랜스퍼라제 면역반응세포가 다수 관찰되는 반면, 스코폴라민을 투여하여 인지능력장애를 유발시킨 군 (대조군 2) (Scopolamine)에서는 콜린 아세틸트랜스퍼라제 면역반응세포 수가 현저하게 감소됨을 관찰할 수 있었다 (도 4a). 이와 달리, 꽁치 가수분해물을 각각 50 mg, 100 mg 혼합한 혼합사료를 식이한 실험군 1 (50 mg/kg HMP/sco) 및 실험군 2 (100 mg/kg HMP/sco)는 모두 대조군 2에 비해 콜린 아세틸트랜스퍼라제 면역반응세포 수가 현저하게 증가하였다 (도 4a).

또한, 이러한 결과로부터 본 발명에 따른 꽁치 가수분해물의 인지능력 개선 효과를 객관적으로 측정하기 위하여, 이미지 분석기 프로그램 (Optimas 6.5, 미국)으로 신경세포의 수를 측정하여 그 결과를 도 4b에 나타내었다.

도 4b는 각각 통상적인 펠렛 사료를 식이한 군 (대조군 1), 통상적인 펠렛 사료를 식이하고 스코폴라민을 투여한 군 (대조군 2), ICR 마우스 체중 kg 당 실시예 1에서 제조한 꽁치 가수분해물을 50 mg 섭취하도록 혼합한 혼합사료를 식이하고 스코폴라민을 투여한 군 (실험군 1), 및 ICR 마우스 체중 kg 당 실시예 1에서 제조한 꽁치 가수분해물을 100 mg 섭취하도록 혼합한 혼합사료를 식이하고 스코폴라민을 투여한 군 (실험군 2)의 염색된 조직내에서 관찰된 콜린 아세틸트랜스퍼라제 면역반응세포의 수를 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 4b에 나타낸 바와 같이, 대조군 1에서는 콜린 아세틸트랜스퍼라제 면역반응세포 수가 약 220개 정도 관찰되었으나, 스코폴라민을 투여하여 인지능력장애를 유발시킨 군 (대조군 2)에서는 상기 면역반응세포 수가 약 160개 정도 관찰되어 스코폴라민 투여에 따른 콜린 아세틸트랜스퍼라제의 활성 억제로 인한 콜린성 뉴런이 감소됨을 확인할 수 있었다 (도 4b). 이와 달리, 꽁치 가수분해물을 각각 50 mg, 100 mg 혼합한 혼합사료를 식이한 실험군 1 및 2는 모두에서는 콜린 아세틸트랜스퍼라제 면역반응세포 수가 약 210개 정도 관찰되어, 대조군 2에 비해 스코폴라민 투여에 따른 콜린 아세틸트랜스퍼라제의 활성 억제를 저해시킴으로써 콜린성 뉴런의 감소가 현저하게 줄어듦을 확인하였다 (도 4b).

따라서, 본 발명에 따른 꽁치 가수분해물은 생체 내에서 스코폴라민에 의해 유도된 마우스의 인지능력손상을 효과적으로 예방 및/또는 개선할 수 있으며, 또한 상기 꽁치 가수분해물의 장기적인 복용을 통하여 콜린성 뉴런의 감소에 따른 인지기능장애 유발을 효과적으로 예방 및/또는 개선할 수 있다.

실시예 4: 단회 투여 급성독성시험

본 발명에 따른 꽁치 가수분해물의 단회 투여 급성독성시험을 측정하기 위하여, 실시예 1에서 수득한 꽁치 가수분해물을 증류수에 녹여 6 주령의 특정병원체부재 (specific pathogen-free, SPF) SD (Sprague-Dawley, Harlan, USA) 랫트에 경구 투여하였다. 상기 랫트에 각각 증류수에 녹인 실시예 1의 꽁치 가수분해물 수용액을 14 mg/kg, 28 mg/kg, 70 mg/kg, 140 mg/kg, 700 mg/kg의 용량으로 식도용 바늘 을 이용하여 0.5 ml 경구 투여 후, 실험동물의 폐사여부, 임상증상 및 체중변화를 관찰하고 혈핵학적 검사와 혈액생화화적 검사를 실시하였으며, 상기의 실험용 쥐를 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상 유무를 관찰하였다.

실험 결과, 꽁치 가수분해물을 투여한 모든 실험동물에서 특이할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사 및 부검 소견 등에서도 독성 변화는 관찰되지 않았다. 상기의 결과에 따라, 본 발명의 꽁치 가수분해물은 랫트에서 각각 2 g/kg까지도 독성이 나타나지 않았으며, 경구 투여 최소치사량 (LD₅₀)은 2 g/kg 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

이하에서는, 본 발명에 따른 꽁치 가수분해물을 포함하는 약학 조성물 또는 식품 조성물의 제제예를 설명하는 것이며, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제조예 : 꽁치 가수분해물을 이용한 제제

제조예 1. 산제의 제조

꽁치 가수분해물 분말 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

제조예 2. 정제의 제조

꽁치 가수분해물 분말 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

제조예 3. 캡슐제의 제조

꽁치 가수분해물 분말 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

제조예 4. 액제의 제조

꽁치 가수분해물 분말 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제 수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.

제조예 5. 건강 식품의 제조

꽁치 가수분해물 분말 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 꽁치 가수분해물의 제조공정도를 나타낸 것이고,

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 꽁치 가수분해물의 스코폴라민 (scopolamine, Sigma chemical Co. 미국)에 의해 유도된 마우스의 학습 및 기억 손상에 대한 효능을 수동회피실험 (Passive avoidance test)으로 측정하여 나타낸 그래프이며,

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 꽁치 가수분해물의 스코폴라민 (scopolamine, Sigma chemical Co. 미국)에 의해 유도된 마우스의 학습 및 기억 손상에 대한 효능을 수중미로실험 (Water maze test)으로 측정하여 나타낸 그래프이고,

도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 꽁치 가수분해물의 스코폴라민 (scopolamine, Sigma chemical Co. 미국)에 의해 유도된 인지능력이 손상된 마우스의 전뇌기저부 (basal forebrain) 내 콜린 아세틸트랜스퍼라제의 면역반응세포를 염색한 사진으로, 이때 A (Control), B (Scopolamine), C (50 mg/kg HMP/sco), 및 D (100 mg/kg HMP/sco)는 각각 실시예 2-1에 따른 대조군 1, 대조군 2, 실험군 3, 및 실험군 4를 가리키는 것이고,

도 4b는 상기 도 4a에서 관찰된 콜린 아세틸트랜스퍼라제 면역반응세포의 수를 측정한 그래프이다.

Claims (7)

1. 알카라제, 프레보라임, 프로텍스, 파라타제 및 뉴트라제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 단백질가수분해효소를 이용하여 제조한 꽁치 (Cololabis saira) 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 인지기능장애 예방 또는 개선용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 꽁치 가수분해물은 그 함량이 전체 조성물 100 중량부에 대하여 0.1 내지 99 중량부로 함유하는 인지기능장애 예방 또는 개선용 조성물.
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 꽁치 가수분해물은 꽁치를 분쇄, 효소 처리, 및 기름층을 제거한 물층의 농축 또는 건조하는 단계로 이루어진 공정으로부터 수득하는 것인, 인지기능장애 예방 또는 개선용 조성물.
5. 제1항, 제2항 또는 제4항 중 어느 한 항에 따른 꽁치 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 인지기능장애 예방 또는 개선용 식품 조성물.
6. 제5항에 있어서, 상기 식품 조성물은 식품, 식품첨가제, 또는 음료인 것인, 인지기능장애 예방 또는 개선용 식품 조성물.
7. 제5항에 있어서, 상기 식품은 그 제형이 정제, 과립제, 캡슐 또는 액상 형태인 것인, 인지기능장애 예방 또는 개선용 식품 조성물.

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