PL190301B1 - Zastosowanie lektyn i środek farmaceutyczny - Google Patents

Abstract

1. Zastosowanie lektyn do wytwarzania leku do zmniejszania i/lub leczenia uszko- dzen komórek sluzówkowych spowodowanych przez radioterapie, srodek chemioterapeu- tyczny lub ich polaczenie. 13. Srodek farmaceutyczny znamienny tym, ze zawiera lektyne i cytoprotektant, który stanowi radiosensybilizator, chemioprotektant, czynnik wzrostu lub polaczenie dwóch lub wiekszej liczby takich srodków. PL

Description

Przedmiotem wynalazku są zastosowanie lektyn i środek farmaceutyczny.

Lektyny są proteinami lub glikoproteinami, zazwyczaj pochodzenia roślinnego lub nawet drobnoustrojowego, albo zwierzęcego, rozpoznającymi i przyłączającymi się do specyficznych struktur glikokoniugatowych. Podawane doustnie lektyny takie jak lektyna z fasoli (Phaseolus vulgaris), fitohemoa-glutynina (PHA), mogą być silnymi zewnętrznymi czynnikami wzrostowymi dla jelita szczura, gdyż wywołują całkowicie odwracalny, zależny od poliamin, hiperplastyczny wzrost jelita cienkiego (Bardocz i inni, 1992 r.). Lektyna chętnie wiąże się z rąbkiem szczoteczkowym i ulega częściowej transcytozie do krążenia (Pusztai, 1991 r.). Lektyny, takie jak PHA, w określonych dawkach uszkadzają ścianę jelita i wywołują rozrost w świetle, podobny do wywoływanego przez pałeczki okrężnicy (Pusztai i inni, 1993 r.), zwiększają stopień ruchliwości lipidów oraz utleniania glukozy (Grant i inni, 1987 r.) oraz znacząco zmniejszają stopień syntezy frakcji białek w mięśniu szkieletowym (Palmer i inni, 1987; Bardocz i inni, 1992 r.). W związku z tym lektyny, takie jak PHA, ogólnie uważa się za toksyny pokarmowe, ponieważ w wysokich stężeniach przy podawaniu doustnym wywołują w organizmie poważne ubytki lipidów, glikogenu i białek mięśni (Pusztai, 1991 r.), a nawet śmierć.

W publikacji w European Journal of Clinical Nutrition, 47 (1993 r.), str. 691-699, przedstawiono przegląd działania in vivo lektyn na organizm.

W japońskim opisie patentowym nr 61280432 ujawniono sposób wprowadzania przeciwnowotworowych immunocytów. Sposób ten polega na aktywowaniu ex vivo wyodrębnionych leukocytów, a następnie ich wprowadzaniu do organizmu w celu leczenia raka.

Nie są znane bezpieczne, nietoksyczne progowe dawki lektyn do podawania doustnego ludziom i innym zwierzętom.

Komórkami śluzowkowymi są wszystkie komórki tworzące jakąkolwiek błonę śluzową (wilgotną błonę wyściełającą wiele struktur kanałowych). Wiele z tych komórek stanowi warstwę ochronną pomiędzy środowiskiem zewnętrznym a narządami wewnętrznymi zwierzęcia. Do przykładowych komórek śluzówkowych należą nabłonkowe komórki skóry, wyściółka przewodu pokarmowego, tkanka przykrywająca oko oraz wyściółka płuc i nosa. Znanych jest wiele zaburzeń komórek śluzówkowych, włącznie ze stanami, w których podział komórki jest przyspieszony lub opóźniony, w których komórki śluzówko we są uszkadzane lub następuje zanik zewnętrznej ochronnej warstwy śluzowej. Stanami związanymi z nieprawidłowościami w kontroli proliferacji komórek śluzówkowych mogą być raki skóry, łuszczyce, zespół nadwrażliwości jelita grubego, choroba zapalna jelita oraz zapalenie śluzówki. Zapalenie śluzówki jest bolesną i wycieńczającą chorobą, w której szybko rosnące komórki nabłonkowe i śluzówko we są uszkadzane, a zewnętrzna warstwa śluzowa zanika i/lub nie jest zastępowana wystarczająco szybko. Zapalenie śluzówki może powodować infekcje wywołane przez mikroorganizmy obecne np. w jamie ustnej i jelitach. Stan ten uważa się za jeden z głównych skutków ubocznych w leczeniu raka. Częstotliwość zachorowań oraz nasilenie zapalenia śluzówki

190 301 może wzrastać w kolejnych cyklach przy leczeniu raka i może ostatecznie wpłynąć na podatność na leczenie i przeżycie pacjenta.

Czynnikami uszkadzającymi komórki śluzówkowe (i inne) oraz powodującymi zapalenie śluzówki są środki chemioterapeutyczne, radioterapia, związki chemiczne (organiczne lub nie organiczne związki), toksyny, kwasy, zasady, wszelkie źródła promieniowania oraz wolne rodniki. Chemioterapia i radioterapia stosowane samodzielnie, łącznie lub w połączeniu z leczeniem operacyjnym, są głównymi metodami terapeutycznymi stosowanymi w leczeniu raka. W chemioterapii może zostać użyty środek cytotoksyczny bezpośrednio uszkadzający DNA komórki docelowej. Gdy środek cytotoksyczny podaje się w odpowiedniej dawce do tkanki docelowej, tj. nowotworu, tworzenie w DNA niewłaściwych par może spowodować nagromadzenie mutacji DNA, uszkodzeń i aberracji chromosomowych, co w efekcie powoduje śmierć komórki. Radioterapia wykorzystuje promieniowanie, aby bezpośrednio uszkodzić DNA komórki docelowej lub wykorzystać potencjał jonizujący promieniowania, aby utworzyć wolne rodniki, które są zdolne do przerywania nici DNA (Steel, 1996 r.).

Zasada stosowania chemioterapii w leczeniu raka polega na tym, że lek cytotoksyczny jest podawany w celu zahamowania podziałów komórkowych, co może ostatecznie doprowadzić do śmierci komórki. Oczekuje się, że lek cytotoksyczny będzie zabijać więcej komórek rakowych niż zdrowych, gdyż komórki rakowe zazwyczaj rosną znacznie szybciej niż zdrowa tkanka.

Inaczej niż w przypadku radioterapii, leki cytotoksyczne podaje się w taki sposób, że działają one ustrojowo na cały organizm. Poważne skutki uboczne, takie jak toksyczność dla życiowo ważnych tkanek, włącznie ze szpikiem kostnym, może ograniczać dawki leków cytotoksycznych, które mogą być podawane bez szkody dla życia pacjenta. W podobny sposób, stosowane w leczeniu raka promieniowanie nie rozróżnia rakowej i zdrowej tkanki. Dlatego też zastosowanie radioterapii stanowi kompromis w próbie wywołania jak największych uszkodzeń w komórkach rakowych przez docelowe kierowanie promieniowania, bez powodowania w zdrowej tkance uszkodzeń, które nie dają się naprawić.

Wykryto i oceniono wiele leków cytotoksycznych do leczenia raka. Główna zasada działania tych leków polega na tym, że wpływają one na kluczowe etapy w szlaku podziału komórkowego lub hamująje. Główne klasy leków działają na replikację DNA, naprawę DNA, rozdzielanie chromosomów lub podział cytoplazmatyczny. Ogromna większość leków cytotoksycznych wpływa na syntezę i replikację DNA. 5-fluorouracyl (5-FU) jest jednym z najczęściej stosowanych leków cytotoksycznych tej klasy. Aktywność 5-FU może być także modulowana przez dodanie zredukowanych folanów, takich jak leukoworynian wapnia (Isa-coff i inni, 1994 r.). Innymi znanymi lekami cytotoksycznymi hamującymi syntezę i replikację DNA są leki działające na różne dezoksyrybonukleotydy używane do tworzenia dNa, np. arabinozyd cytozyny. Nici DNA zawierające arabinozyd cytozyny bezpośrednio hamują aktywność polimerazy DNA (Archimund i Thomas, 1994 r.).

Drugą główną klasą leków cytotoksycznych są leki wywołujące powstawanie pęknięć bezpośrednio w niciach DNA lub hamujące naprawę pęknięć DNA. Przykładem leku mogącego wywołać bezpośrednio pęknięcia nici DNA jest cyklofosfamid (Sparano i Wiemik, 1994 r.). Trzecią główną klasą leków są leki, które właściwie zakłócają składanie i dezorganizację tubuliny, przez co bezpośrednio hamują mitozę i podziały komórkowe. Taksany, takie jak paklitaksel i docetaksel, są lekami polimeryzującymi tubulinę w stabilne wiązki mikrotubul. Syntetyczne winka-alkaloidy, takie jak winorelbina, są truciznami wrzeciona, wywołującymi swoje działanie przeciwnowotworowe przez zapobieganie składaniu tubuliny w mikrotubule (Dieras i Pouillart, 1995 r.).

Obecnie w praktyce radioterapii stosuje się szeroki zakres źródeł promieniowania w leczeniu raka. Najczęściej używanymi źródłami promieniowania są promienie rentgenowskie, promienie γ, źródła promieniowania protonowego i neutronowego oraz emitujące promieniowanie a i β. W praktyce ciągłe niskie dawki radioterapeutyczne przez kilka dni dają najlepszą szansę rozróżnienia pomiędzy tkankami zdrowymi i rakowymi. Jednakże technika ta jest ograniczona do stosowania radioizotopów skutecznych obecnie tylko w stosunku do kilku typów nowotworów, np. raka tarczycy. W sytuacji klinicznej w przypadku większości technik radioterapeutycznych stosuje się wysokie dawki promieniowania zogniskowane w postaci

190 301 wiązki na tkankę rakową. Ekspozycja zdrowej tkanki jest zmniejszona, gdy jest to możliwe, przez zastosowanie osłon ołowianych lub przez obracanie pacjenta, tak że zdrowe tkanki otrzymuje niższe dawki promieniowania niż komórki rakowe. Jakkolwiek podejście to może być skuteczne, jego zastosowanie może być ograniczone przez kumulujące się ekspozycje zdrowej tkanki na promieniowanie oraz oporność wielu nowotworów na wysokie dawki promieniowania.

Wiadomo, że pojedynczy środek cytotoksyczny czy też źródło promieniowania może być bardziej odpowiednie w przypadku niektórych typów raków. Na przykład cisplatyna jest szeroko stosowana w przypadku raka jąder, taksany są bardziej odpowiednie w przypadku raka sutka, a 5-FU jest szeroko stosowany w przypadku raków jelita grubego i okrężnicy. Jednakże, terapie pojedynczymi środkami rzadko doprowadzają do całkowitego wyleczenia raka, a współczynnik przeżycia nadal pozostaje niski. Poczyniono pewne ulepszenia w zastosowaniu terapii z użyciem kilku leków (Au i inni, 1996 r.).

Stwierdzono że wiele związków ma zdolność uwrażliwiania komórek rakowych na skutki działania promieniowania i chemioterapii (w ten sposób oszczędza się zdrową tkankę). Jednakże próby zastosowania radiosensybilizatorów, takich jak mimetyki witaminy K, Synkavit i Menadione, oraz środków chroniących, takich jak związki zawierające grupę sulfhydrylową - cysteina, cysteamina i Ethyol także nie dały dobrych rezultatów (Denekamp, 1996 r.).

Pomimo iż chemioterapia i radioterapia są najczęściej stosowanymi sposobami leczenia raka, współczynniki przeżycia są ograniczone przez wiele różnych czynników. Czynnikiem kluczowym jest to, że lek cytotoksyczny lub promieniowanie nie rozróżniają tkanki normalnej i rakowej. W większości przypadków nie jest możliwe zastosowanie wystarczającej dawki leku cytotoksycznego lub promieniowania potrzebnej do całkowitego zabicia tkanki nowotworowej, gdyż byłoby to śmiertelne dla pacjenta. Do często występujących skutków ubocznych obecnie stosowanych sposobów leczenia należy wypadanie włosów, zahamowanie działania szpiku kostnego, mdłości, wymioty i biegunka (Paulsen i inni, 1996 r.). Ponadto w wielu przypadkach stosowanie radioterapii, w szczególności w obszarach miednicznych, powoduje zmiany działania układu żołądkowo-jelitowego (Yeoh i inni, 1993 r.) oraz długotrwałe uszkodzenia jelita, wymagające leczenia operacyjnego (van Halteren i inni, 1993 r.).

Zdecydowany przełom nastąpił w ostatnich 10 latach wraz z dostępnością hematopoetycznych czynników wzrostowych. Obecnie możliwe jest podawanie wyższych dawek leków cytotoksycznych i promieniowania, a następnie ratowanie tkanek takich jak szpik kostny i białe ciałka krwi, przez podawanie zrekombinowanych czynników wzrostu, takich jak czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (Erkisis i inni, 1996 r.). Podejście takie umożliwiło polepszenie prognoz i osiąganych współczynników przeżycia. Podczas gdy znane są specyficzne dla naskórka czynniki wzrostu takie jak naskórkowy czynnik wzrostu, złożona natura regulacji wzrostu jelita uczyniła trudnymi do opracowania skuteczne procedury „ratujące” jelito (Podolsky, 1993 r.). Ponieważ żaden taki czynnik wzrostu dla jelita obecnie nie istnieje, uszkodzenia układu żołądkowo-j elitowego wywoływane przez leki cytotoksyczne i promieniowanie stały się czynnikiem ograniczającym dawkę.

Wzrasta zastosowanie soi w ludzkim pożywieniu, a białka soi często stanowią większą część białek w żywieniu zwierząt.

Niestety soja zawiera wiele składników przeciwodżywczych, głównie lektyn i inhibitorów trypsyny, w związku z czym wydajność wykorzystania odżywczego pokarmów zawierających produkty sojowe jest niższa od spodziewanej na podstawie składu chemicznego (Gupta, 1987 r.), szczególnie gdy stosuje się je przez długi okres czasu (Rackis i inni, 1986 r.) i wziąwszy pod uwagę, że to serwatka sojowa zawiera większość składników przeciwodżywczych (Grant i inni, 1986 r.). Powszechna jest opinia, że produkty sojowe mogłyby być szerzej stosowane w żywieniu, zarówno ludzi, jak i zwierząt, gdyby zmniejszyłoby się ich działanie przeciwodżywcze.

Środki przeciwodżywcze w większości produktów sojowych usuwa się w obróbce opartej na różnych sposobach obróbki cieplnej (Liener, 1994 r.). Jednakże większość z tych sposobów jest kosztowna i może prowadzić do strat istotnych amino kwasów oraz powstawania toksycznych produktów ubocznych. Istnieje wprawdzie możliwość opracowane tańszych

190 301 i bardziej wydajnych procesów obróbki cieplnej, jednak próbuje się innych sposobów zmniejszenia skutków działania przeciwodżywczych produktów sojowych, takie jak manipulowanie dietą i projektowanie nowych strategii żywienia. Uwolnienie produktów sojowych, a w szczególności mało używanej frakcji serwatki, od głównych negatywnych skutków działania składników przeciwodżywczych może przynieść znaczące korzyści ekonomiczne w przemyśle spożywczym i u producentów zwierząt.

Wynalazek wykorzystuje chroniące tkankę właściwości i działanie metaboliczne niskich dawek lektyn w celu chronienia i naprawy materiału biologicznego uszkodzonego w wyniku chemoterapii i/lub radioterapii. Wynalazek jest szczególnie interesujący z uwagi na znaczące działanie profilaktyczne środków zawierających lektyny (dodatnie czynniki wzrostu) stosowanych przed leczeniem takim jak radioterapia i/lub chemioterapia.

Zatem wynalazek dotyczy zastosowania lektyn do wytwarzania leku do zmniejszania i/lub leczenia uszkodzeń komórek śluzówkowych spowodowanych przez radioterapię, środek chemioterapeutyczny lub ich połączenie.

Zastosowanie lektyn do wytwarzania leku według wynalazku korzystnie odnosi się do zmniejszania i/lub leczenia uszkodzenia jelit i/lub zapalenia śluzówki.

Korzystniej zastosowanie odnosi się do zmniejszania i/lub leczenia uszkodzonych komórek i/lub tkanek ssaczych, w szczególności uszkodzonych komórek i/lub tkanek ludzkich.

Korzystnie w przypadku zastosowania według wynalazku komórki i/lub tkankę stanowią śluzówkowa wyściółka jelit, jamy ustnej, przewodu nosowego, przełyku, żołądka, płuc, jelita cienkiego, jelita grubego, w tym okrężnicy, tkanka nabłonkowa, taka jak przykrywająca oko, oraz inne komórki i tkanki śluzówkowe.

Korzystnie w przypadku zastosowania według wynalazku w radioterapii stosuje się promienie rentgenowskie, promienie γ, źródło promieniowania protonowego, źródło promieniowania neutronowego, źródło emitujące promieniowanie a, źródło emitujące promieniowanie β albo połączenie dwóch lub większej ich liczby.

Korzystnie w przypadku zastosowania według wynalazku środkiem chemioterapeutycznym jest 5-fluorouracyl, cisplatyna, doksorubicyna, metotreksat, taksol lub połączenie dwóch lub większej liczby tych środków.

Korzystnie w przypadku zastosowania według wynalazku lektyna pochodzi z fasoli, soi, fasoli Jaś, kiełków pszenicy, nasion lotosu, cebuli, soczewicy, pomidorów, ziemniaków lub stanowi połączenie lektyn pochodzących z dwu lub większej liczby tych źródeł.

Korzystnie w przypadku zastosowania według wynalazku lektynę stosuje się w połączeniu z cytoprotektantem, zwłaszcza takim jak radiosensybilizator, chemioprotektant, czynnik wzrostu lub połączenie dwóch lub większej liczby takich środków.

Korzystnie w przypadku zastosowania według wynalazku radiosensybilizatorem jest mimetyk witaminy K, sól gadolinowa teksafiryny, jobenguan lub połączenie dwóch lub większej liczby takich środków.

Korzystnie w przypadku zastosowania według wynalazku chemioprotektantem jest Sulcraphate, cysteina, cysteamina, Ethyol, balazipon, dosmalfat, WR 3689 (diwodorofosforan (2-[[3-metyloamino]propylo]amino)etanotiolu), AD (kwas (2-[[2-metoksyfenylo]acetyloj-amino]-2-propenowy), przeciwutleniacz nitroksydowy lub połączenie dwóch lub większej liczby takich środków.

Korzystnie w przypadku zastosowania według wynalazku czynnikiem wzrostu jest czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów, czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów, erytropoetyna, naskórkowy czynnik wzrostu, czynnik wzrostu keratynocytów, transformujący czynnik wzrostu, ińterleukina, insulinopodobny czynnik wzrostu, czynnik wzrostu nerwów, komórkowy czynnik wzrostu pochodzący z płytek, bombezyna, relaksyna, kalcytonina, czynnik wzrostu pochodzący z siary, amleksanoks, amoksanoks, protegryna, chlorowodorek pilokarpiny, czynnik komórek macierzystych układu krwiotwórczego, trombopoetyna, czynnik Steela, dowolny interferon, w tym interferon a, dowolna cytokina lub połączenie dwóch lub większej liczby takich środków.

Wynalazek dotyczy również środka farmaceutycznego, którego cechą jest to że zawiera lektynę i cytoprotektant, który stanowi radiosensybilizator, chemioprotektant, czynnik wzrostu lub połączenie dwóch lub większej liczby takich środków.

190 301

Korzystnie środek farmaceutyczny według wynalazku jest przeznaczony do równoczesnego, oddzielnego lub kolejnego stosowania w celu profilaktyki lub leczenia uszkodzeń wywołanych czynnikiem uszkadzającym komórkę.

Korzystnie środek farmaceutyczny według wynalazku zawiera lektynę oczyszczoną lub wyizolowaną, korzystniej lektynę pochodzącą z nasion fasoli, nasion (lub serwatki) soi, fasoli Jaś, kiełków pszenicy, nasion lotosu, cebuli, soczewicy, pomidorów, ziemniaków albo połączenia lektyn z dwóch lub większej liczby takich źródeł.

Korzystnie środek farmaceutyczny według wynalazku zawiera lektynę w stężeniu zapewniającym podawanie 0,3 g - 0,1 pg/kg masy ciała na dzień, korzystnie 1 mg - 0,15 pg/kg masy ciała na dzień.

Stosowane w opisie określenie „zmniejszanie” oznacza do wolne działanie łagodzące dowolne uszkodzenie lub zaburzenie medyczne, w jakimkolwiek stopniu, włącznie z zapobieganiem.

Stosowane w opisie określenie „leczenie” oznacza jakąkolwiek poprawę zaburzenia, choroby, zespołu, stanu, bólu lub połączenia dwóch lub większej ich liczby.

W niniejszym opisie określenia „napromienianie” oraz „radioterapia” stosuje się w tym samym znaczeniu, co oznacza, że źródła promieniowania mogą, lecz nie muszą być zastosowane jako technika lecznicza.

Jak wspomniano powyżej źródłami radioterapii są, lecz nie wyłącznie, promienie rentgenowskie, promienie γ, źródła promieniowania protonowego i neutronowego, źródła emitujące promieniowanie a łub β albo połączenie dwóch lub większej liczby takich źródeł. Radioterapia może być stosowana w połączeniu z chemioterapią z użyciem środka cytotoksycznego takiego jak metotreksat, cisplatyna i/lub 5-fluorouracyl, oraz w połączeniu z procedurami chirurgicznymi. Środek chemioterapeutyczny stanowi dowolny środek cytotoksyczny, czyli są to, lecz nie wyłącznie, środki takie jak 5-fluorouracyl, cisplatyna, doksorubicyna, metotreksat, taksol lub połączenie dwóch lub większej liczby takich środków. Jak opisano powyżej, jeden lub większą łiczbę środków chemioterapeutycznych można użyć w połączeniu z radioterapią i/lub procedurami chirurgicznymi.

Wynalazek znajduje szczególne zastosowanie w zmniejszaniu i/lub leczeniu uszkodzeń tkanki ssaczej, w szczególności tkanki ludzkiej. Niniejszy wynalazek jest szczególnie istotny w odniesieniu do tkanek ludzkich z powodu znacznego zapotrzebowania na radioterapię i/lub chemioterapię w leczeniu raka. Jednakże wynalazek znajduje także zastosowanie w przemyśle weterynaryjnym, w tym w odniesieniu do zwierząt gospodarskich i domowych.

Lektyny można stosować do wytwarzania leku do zmniejszania i/lub leczenia wszystkich komórek i/lub tkanek śluzówkowych w tym wszystkich komórek i tkanek śluzówkowych w organizmie, jak również na zewnątrz organizmu, w tym izolowanych komórek i tkanek śluzówkowych.

Leki zawierające lektyny można stosować również w odniesieniu do całego materiału biologicznego, włącznie z całymi organizmami, jego częściami oraz włącznie z izolowanymi na rządami i izolowaną tkanką, w tym z komórkami i tkankami śluzówkowymi. Można je stosować w przypadku materiału biologicznego poddanego działaniu, celowo lub w sposób niezamierzony, jakichkolwiek czynników uszkadzających komórki.

Leki te są przydatne zwłaszcza w odniesieniu do materiału biologicznego, który jest szczególnie wrażliwy na działanie czynników uszkadzających komórki, takich jak radioterapia i/lub środki chemioterapeutyczne. Takim materiałem biologicznym może być wyściółka jelit, jamy ustnej, przewodu nosowego, przełyku, żołądka, płuc, jelita cienkiego, jelita grubego (włącznie z okrężnicą i odbytem), tkanka nabłonkowa (np. przykrywająca oko), a także jakakolwiek komórka i/lub tkanka śluzówkowa.

Taki materiał biologiczny mogą stanowić wszystkie komórki i tkanki śluzówkowe wymienione powyżej, a także szpik kostny, śledziona, wszystkie komórki krwiotwórcze, tkanka krwi, grasica, tkanka wytwarzająca włosy, tkanka oka oraz tkanka jąder/prostaty.

Wrażliwość komórek jelita na uszkodzenie wywoływane czynnikiem uszkadzającym komórki jest związana z jej stanem metabolicznym. Działania wywierane przez lektyny jako czynniki wzrostu, w szczególności w przypadku jelita (a zwłaszcza jelita cienkiego) wydają

190 301 się być istotne w zapobieganiu i/lub leczeniu oddziaływań przed i w trakcie podawania czynników uszkadzających komórki.

Lektyny można zaklasyfikować jako „toksyczne” i „nietoksyczne”. Toksyczne lektyny są lub mogą być zaklasyfikowane jako białka hamujące działanie eukariotycznych rybosomów typu 2 (RIP). Są one cząsteczkami hybrydowymi zawierającymi podjednostkę toksyczną (A), która po wejściu do komórki nieodwracalnie hamuje syntezę białek, oraz podjednostkę lektynową (B), która ułatwia wejście RIP do komórki. RIP typu 2, takie jak rycyna, są jednymi z najbardziej toksycznych substancji znanych człowiekowi, których potencjalne wartości LD50 wynoszą zaledwie 0,1 g na kilogram masy ciała. Przy długotrwałym podawaniu mogą one nieodwracalnie uszkodzić organizm ssaka, ostatecznie powodując śmierć.

Wiązanie lektyn do komórek znacznie się różni. Niektóre wiążą się słabo, podczas gdy inne wiążą się bardzo silnie. Silnie wiążącymi lektynami są takie, które po podaniu szczurowi w dawce 10 mg doustnie wiążą się w jelitach w ponad 75% (aż do 100%). Lektyna z fasoli jest przykładem lektyny wiążącej się silnie. W niektórych przypadkach silne wiązanie może prowadzić do toksyczności, tak też lektyny te mogą być uznane za toksyczne.

Do lektyn stosowanych zgodnie z wynalazkiem należą lektyny występujące w naturalnych układach lub w formie oczyszczonej (do jakiegokolwiek stopnia), lektyny syntetyzowane chemicznie, lektyny modyfikowane lub ich pochodne (występujące naturalnie lub syntetyczne). Pochodne lektyn zawierają jedną lub większą liczbę podjednostek lektyn wielopodjednostkowych. Do znanych sposobów wytwarzania lektyn należy oczyszczanie lektyn ze źródeł naturalnych (Pusztai i Palmer, 1977 r.; Carvalho, 1993 r.) oraz lektyn pochodzenia biotechnologicznego, co opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych. Ameryki nr 4889842.

Zgodnie z wynalazkiem może zostać użyta jakakolwiek lektyna. Znanych jest wiele lektyn. Powszechnie stosowanym sposobem charakteryzacji lektyn jest ich specyficzność wiązania węglowodanów. Do kilku specyficznie wiązanych grup węglowodanowych należą: N-acetylo-D-galaktozamina, -D-mannoza, -L-fukoza, β-laktoza, galaktozylo-p-(l-3)-N-acetylo-D-galaktozamina, D-glukoza, N-acetylo-glukozamina, kwas N-acetyloneuraminowy. Niektóre lektyny należą do grup wiążących specyficznie więcej niż jednej węglowodan. Szczególnie interesujące są lektyny z fasoli, soi, fasoli Jaś, kiełków pszenicy, nasion lotosu, cebuli, soczewicy, pomidorów, ziemniaków oraz połączenia jednego lub większej liczby takich źródeł.

Ponieważ lektyny są białkami, łatwo ulegają destabilizacji/denaturacji pod wpływem kilku różnych czynników, takich jak ciepło, kwasy, zasady itp. Niektóre lektyny są bardziej oporne niż inne. Ponieważ zastosowanie lektyn w wynalazku oparte jest na znaczeniu ich białkowych właściwości, ważne jest aby lektyny nie zostały całkowicie zniszczone lub zdenaturowane przed lub podczas ich zastosowania (np. w silnie kwasowych warunkach żołądka i słabo zasadowych warunkach je lita). W związku z tym lektyny stosowane zgodnie z wynalazkiem mogą wymagać wcześniejszego scharakteryzowania celem określenia, w jakim stopniu mogą być one zmienione podczas obróbki i/lub podawania. Takie charakteryzowanie stanowi standardowo stosowaną technikę i może zostać przeprowadzone przez fachowca. Wymagane w jakimkolwiek wykonaniu wynalazku stężenie lektyn będzie się zmieniać, jeżeli lektyny uległy denaturacji lub destabilacji w jakikolwiek sposób.

Stężenia lektyn podane w opisie są oparte na ich właściwościach naturalnych, z faktycznie brakiem zmniejszenia ich aktywności przez denaturację lub destabilizację. W związku z tym podane stężenia lektyn nie są wartościami absolutnymi, ale biorą pod uwagę aktywność lektyn. W związku z tym np. środek zawierający lektynę, której aktywność została zmniejszona o połowę, ale która jest obecna w podwójnie wysokim stężeniu, jest taki sam, jak środek zawierający połowę ilości lektyny, której aktywność nie została zmieniona. Ponadto aktywność jakiejkolwiek lektyny może być zwiększona przez modyfikację, na przykład podczas wytwarzania z zastosowaniem technik rekombinacyjnych i/lub przez wytwarzanie skróconych mutantów o zwiększonej aktywności. Te same założenia, jak w przypadku zależności stężenia od aktywności lektyn, odnoszą się także do lektyn o zwiększonej aktywności. Wynalazek swoim zakresem obejmuje wszystkie modyfikowane lektyny, włącznie z lektynami o zwiększonych i zmniejszonych aktywnościach, np. włącznie ze skróconymi monomerami lektyn o pełnej lub zmodyfikowanej aktywności.

190 301

Lektyny stosowane zgodnie z wynalazkiem są czynnikami ochraniającymi tkanki.

Rozwiązanie według wynalazku odnosi się do wytwarzania leków, konkretnego reżimu dawkowania, który może być ostatecznie ustalony przez prowadzącego lekarza i w przypadku którego bierze się pod uwagę czynniki takie jak rodzaj stosowanej lektyny lub lektyn, rodzaj, wiek, waga zwierzęcia, ostrość objawów i/lub ostrość zastosowanego leczenia, sposób podawania środka, szkodliwe działanie i/lub inne przeciwwskazania. Konkretne określone zakresy dawek można ustalać w standardowo projektowanych próbach klinicznych z pełnym monitorowaniem postępu leczenia i zdrowienia pacjenta. Próby takie mogą obejmować wzrastający tryb dawkowania z użyciem niskiego udziału procentowego maksymalnych dawek tolerowanych przez zwierzęta, jako dawek początkowych u ludzi. Pierwsze wskazówki odnośnie zakresu dawkowania mogą zostać przyjęte z wyników podanych w części doświadczalnej niniejszego tekstu oraz z następujących zakresów dawkowania, które zostały wyznaczone przez ekstrapolację do ludzi.

Wydaje się, że odpowiednia górna granica stężenia lektyn wynosi około 0,3 g na kilogram masy ciała na dzień. Stężenie 0,3 g/kg masy ciała na dzień może łatwo wywołać rozstrój w przewodzie żołądkowe-j elito wym pacjenta, ale objawy te mogą być zaakceptowane, ponieważ pacjent ma zwiększoną szansę przeżycia choroby takiej jak rak. Odpowiednio dolna granica stężenia lektyn wynosi 0,0001 mg (0,1 pg) /kg masy ciała na dzień. Korzystne średnie dawki lektyn mieszczą się w zakresie od około 0,2 g, 0,15 g i 0,05 g/kg masy ciała na dzień do około 1 mg, 0,5 mg, 0,1 mg, 0,01 mg i 0,005 mg/kg masy ciała na dzień. Każde z powyżej wymienionych stężeń może zostać zastosowane jako górne i/lub dolne stężenie graniczne, co w efekcie daje różne użyteczne zakresy stężeń. W odniesieniu do stężeń lektyn podawanych w celach nie związanych z leczeniem lub profilaktyką, dawki lektyn mogą być nieznacznie zwiększone.

Leki mogą zostać użyte w taki sposób, by dostarczyć wymaganą dawkę lektyn w jednej lub większej liczbie „dawek” na dzień („dawki” odnoszą się tu do jakiegokolwiek sposobu podawania). Niektóre postacie wynalazku mogą obejmować podawanie pojedynczych dawek o wysokim stężeniu, natomiast inne mogą obejmować wielokrotne podawanie, równomiernie lub nierównomiernie podzielone w tym samym okresie czasu, ale z niższym stężeniem lektyn na pojedynczą dawkę lub podzielone dawki.

Zgodnie z wynalazkiem lektyny mogą być stosowane do wytwarzania jakiegokolwiek leku w połączeniu z odpowiednim nośnikiem farmaceutycznym i/lub zaróbką. Takie nośniki i zarobki są dobrze znane specjalistom (np. Handbook of Pharmaceutical Excipients (1994 r.) 2-gie wydanie, pod redakcją A. Wade/P. J. Weller, The Pharmaceutical Press, American Pharmaceutical Association). Szczególnie użyteczne są środki i/lub leki formułowane jako układ dostarczający substancję czynną do okrężnicy lub jako kapsułka.

Jak wspomniano powyżej wynalazek dotyczy także zastosowania lektyn w połączeniu z cytoprotektantami. Cytoprotektantem jest korzystnie radiosensybilizator, chemioprotektant (w tym wymiatacze wolnych rodników), czynnik wzrostu lub połączenie dwóch lub większej liczby takich środków. Następujące przykłady cytoprotektantów są korzystne: radiosensybilizatory - mimetyki witaminy K, takie jak Synkavit i Menadione, sól gadolinowa teksafiryny lub jobenguan (([[3-jodofenylo]metylo]guanidyna); chemioprotektanty - Sulcraphate, cysteina, cysteamina, Ethyol, balazipon lub dosmalfat; wymiatacze wolnych rodników - WR 3689 (diwodorofosforan (2-[[3-metyloamino]propylo]amino)etanodiolu), AD 20 (kwas (2-[[2-metoksyfenylo]-acetylo]amino]-2-propenowy) lub przeciwutleniacz nitroksydowy; czynniki wzrostu - czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów (G-CSF), czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF), erytropoetyna (EPO), naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), czynnik wzrostu keratynocytów (KGF), transformujący czynnik wzrostu (TGFa i β), dowolna interleukina, w tym IL-11 i IL-15, insulinopodobny czynnik wzrostu (IGF), czynnik wzrostu nerwów (NGF), komórkowy czynnik wzrostu pochodzący z płytek (PDGF), bombezyna, relaksyna, kalcytonina, czynnik wzrostu pochodzący z siary (CDGF), amleksanoks lub amoksanoks, protegryna, chlorowodorek pilokarpiny, czynnik komórek macierzystych układu krwiotwórczego (SCF), trombopoetyna, czynnik Steela (SF), jakikolwiek interferon, w tym interferon α i dowolne cytokiny.

190 301

Oprócz cytoprotektantów lek może dodatkowo zwierać jeden lub większą liczbę farmaceutycznych składników/środków. W szczególności mogą być dodane środki przeciwdrobnoustrojowe. Środki takie mogą być włączone w celu zwalczenia infekcji, na przykład wtórnych infekcji związanych z zapaleniem śluzówki, chorobą zapalną jelit, zespołem nadwrażliwości jelita grubego itd.

Lek wytwarzany zgodnie z wynalazkiem korzystnie podaje się doustnie lub doodbytniczo (w celu ułatwienia dojścia do jednej lub większej liczby części przewodu pokarmowego), choć lek może być także podawany pozajelitowo.

Jak podano powyżej wynalazek dotyczy również środka zawierającego lektynę i cytoprotektant. Szczególnie korzystnie środek zawiera lektynę co najmniej częściowo oczyszczoną lub wyizolowaną.

Środek według wynalazku może być mieszanym preparatem do podawania lub może stanowić skojarzony preparat do równoczesnego, oddzielnego lub kolejnego użycia (lub podawania). W przypadku preparatów skojarzonych jako pierwsza może być podana część środka zawierająca lektynę lub też cytoprotektant. Środek według wynalazku szczególnie nadaje się do zmniejszania lub leczenia uszkodzeń spowodowanych przez czynnik uszkadzający komórki, w szczególności napromieniowanie i/lub chemioterapię. Zgodnie z tym, właściwe może być włączenie do środka farmaceutycznie dopuszczalnych zarobek i/lub nośników, co opisano powyżej. Środek może być najbardziej skuteczny w stosunku do materiału biologicznego, który jest najbardziej wrażliwy na działanie czynników uszkadzających komórki, w szczególności naświetlania i chemioterapii.

Środek według wynalazku można wytworzyć zgodnie ze sposobem polegającym na tym, że miesza się lektynę i cytoprotektant, ewentualnie w połączeniu z jednym lub większą liczbą składników, takich jak dodatkowe cytoprotektanty, środki przeciwdrobnoustrojowe i/lub dopuszczalne farmaceutycznie zarobki i/lub nośniki. Wariactwo, w przypadku środków zawierających różne składniki podawane równocześnie, oddzielnie lub kolejno, poszczególne składniki mogą być przygotowywane w połączeniu z innymi składnikami, włącznie z farmaceutycznie dopuszczalnymi zarobkami i/lub nośnikami.

Lektyny można również stosować do wytwarzania leków kontrolujących proliferację komórek śluzówkowych, a w szczególności do kontroli proliferacji komórek śluzówkowych w zmniejszaniu i/lub leczeniu zapalnie śluzówki i/lub uszkodzeń jelita. Kontrola proliferacji komórek śluzówkowych obejmuje zmniejszanie i/lub leczenie jakichkolwiek uszkodzeń komórek śluzówkowych i/lub tkanek.

Kontrola proliferacji komórek śluzówkowych jest szczególnie użyteczna w zmniejszaniu i/lub leczeniu uszkodzeń spowodowanych przez czynniki uszkadzające komórki. Do typowych czynników uszkadzających komórki, według wszystkich postaci wynalazku, należy radioterapia, chemioterapia lub połączenie obydwu tych technik.

Lektyny są szczególnie skuteczne w kontrolowaniu proliferacji komórek śluzówkowych przed rozpoczęciem, w trakcie lub po radioterapii, chemioterapii lub połączeniu obydwu tych technik. Osiąga się to jako skutek ochronnych i naprawczych właściwości lektyn.

Komórki śluzówkowe stanowią te komórki, które tworzą jakąkolwiek błonę śluzową (wilgotną błonę wyściełającą wiele struktur kanałowych i jam). Wiele z tych komórek stanowi warstwę ochronną pomiędzy środowiskiem zewnętrznym i narządami wewnętrznymi zwierzęcia. Do przykładowych komórek/tkanek śluzówkowych należą komórki zatok nosowych, przewodu oddechowego, skóry, układu żołądkowo-jelitowego, a także układu żółciowego i trzustkowego. Powierzchnia jamy ustnej jest także wyścielona błoną śluzową. Błona śluzowa składa się z powierzchniowej warstwy nabłonka, zawierającego gruczoły wydzielające śluz, z leżącymi poniżej warstwami tkanki łączącej i mięśni śluzówkowych, tworzącymi wewnętrzną granicę błony śluzowej.

Zastosowanie lektyn do kontroli proliferacji komórek śluzówkowych jest szczególnie użyteczne w stosunku do komórek układu żołądkowo-jelitowego. Może to dotyczyć zwiększania funkcjonalnej powierzchni i/lub długości układu żołądkowo-jelitowego lub natury i gęstości glikoprotein powierzchniowych eksprymowanych w komórkach układu żołądkowo-jelitowego. Do innych zastosowań należy zmniejszanie i/lub leczenie zaburzeń jelitowych, takich jak choroba zapalna jelit, zespół nadwrażliwości jelita grubego, a także zmniejszanie

190 301 i/lub leczenie uszkodzeń jelit, oraz naprawa i zastąpienie komórek śluzówkowych przed rozpoczęciem, w trakcie lub po radioterapii, chemioterapii lub połączenie dwóch lub większej liczby takich terapii.

Wykorzystanie tych właściwości kontrolnych obejmuje:

a) Proliferację komórek jelit, prowadzącą do zwiększenia funkcjonalnej powierzchni i długości jelita, co może być użyteczne w leczeniu w przypadku, gdy działanie jelit jest osła bione, np. w wyniku zabiegu operacyjnego lub wypadku i/lub

b) Kontrolę stopnia obrotu komórek jelit, pozwalającą regulować naturę i gęstość eksprymowanych glikokoniugatów powierzchniowych, które stają się stopniowo coraz bardziej złożone wraz ze starzeniem się komórki. Ponieważ glikokoniugaty wpływają na pewne właściwości jelit, takie jak podatność na przyczepianie się bakterii, podawanie lektyn może być przydatne jako sposób kontroli leczniczej lub profilaktycznej tych właściwości.

W szczególności kontrola proliferacji komórek może być wykorzystana do uzyskania zwiększonej wydajności odżywczej jelita cienkiego i/lub kontrolowania ekspresji glikokoniugatów w komórkach jelit. Skutki te nie są koniecznie związane z zaburzeniami medycznymi i mogą być wykorzystane dla osiągnięcia zmian kosmetycznych lub funkcjonalnych, powyżej lub poza satysfakcjonującym poziomem medycznym.

Wiadomo, że wysokie dawki lektyn mogą niekorzystnie wpływać na metabolizm zwierzęcia. Przykładowo wysokie dawki lektyn mogą zakłócać działanie tarczycy, powodować przerost trzustki oraz wywoływać rozrost podobny do wywoływanego przez pałeczki okrężnicy, co w efekcie powoduje pogorszenie odżywienia i wzrostu. W wynalazku po raz pierwszy opisano korzystne skutki metaboliczne zastosowania podawanych doustnie niskich dawek lektyn. Podawanie niskich dawek lektyn wywołuje zmniejszenie ilości tłuszczu w organizmie i przez to może być zastosowane w leczeniu otyłości oraz w celu nie związanego z leczeniem odchudzania.

Zatem lektyny można również stosować do wytwarzania leków zmniejszających i/lub leczących zaburzenia metaboliczne oraz do wytwarzania leków służących do odchudzania/zmniejszania wagi. Takie odchudzanie/zmniejszanie wagi nie muszą być koniecznie związane ze stanem medycznym (np. zaburzeniem metabolicznym) i może być czysto kosmetycznym odchudzaniem/zmniejszaniem wagi. Lektyna może być jakakolwiek lektyna stosowana zgodnie z wynalazkiem, najkorzystniej lektyna pochodząca z soi lub fasoli.

Do zaburzeń metabolicznych należą dowolne zaburzenie związane z i/lub będące wynikiem metabolizmu organizmu, w szczególności otyłość oraz zaburzenia związane z otyłością, takie jak hiperglikemia (cukrzyca typu II), choroby układu sercowo-naczyniowego, udar, zaburzenia układu żołądkowo-jelitowego i związane z układem żołądkowo-jelitowym. Zaburzenie metaboliczne może wymagać kontroli proliferacji komórek śluzówkowych lub kontrola proliferacji komórek śluzówkowych może być niezależna od zaburzenia metabolicznego.

Im wyższe jest stężenie lektyn, tym szybsze jest zapobieganie lub leczenie zaburzenia metabolicznego. Jednakże różne czynniki mogą wpływać na korzystne stężenia dawek lektyn, tak to przedyskutowano w opisie.

Lektyny zatem mogą znaleźć zastosowanie w sposobie zmniejszania i/lub leczenia uszkodzeń spowodowanych przez czynnik uszkadzający komórki, kontroli proliferacji komórek śluzówkowych i zmniejszania i/lub leczenia zaburzenia metabolicznego (włącznie z cechami pokrewnymi). Na sposób ten składa się przyjmowanie w pokarmie lektyn w całkowitym stężeniu do 0,3 g, korzystnie 0,2 g/kg masy ciał na dzień. Zaburzeniem metabolicznym może być jakiekolwiek z wyżej opisanych. Lektyną może być także jakakolwiek z wyżej opisanych, korzystnie pochodząca z soi lub fasoli (PHA).

W przypadku wszystkich leczniczych zastosowań (czyli wówczas, gdy lektyny stosuje się tylko po jakimkolwiek leczeniu, czynniku uszkadzającym komórki, itd.) korzystna dawka lektyn wynosi mniej niż 0,2 g/kg masy ciała na dzień.

Lektyna może również wchodzić w skład diety, którą można stosować przez okres 2 do 5 dni, lub przez nieokreślony (długoterminowy) okres. Lektyna może być jakakolwiek lektyna z wyżej opisanych, korzystniej lektyna pochodząca z soi lub serwatki sojowej.

190 301

Dieta lektynowa korzystnie zawiera lektyny w całkowitym stężeniu do 0,3 g, korzystnie do 0,2 g/kg masy ciała na dzień. Obejmuje ono także dietę uzupełniającą zawierającą lektynę w całkowitym stężeniu dietetycznym wynoszącym do 0,3 g, korzystnie do 0,2 g/kg masy ciała na dzień. Lektyną może być jakakolwiek z wyżej opisanych, lub połączenie dwóch lub większej liczby lektyn. Korzystnie lektyna dostarczana w diecie pochodzi z soi i/lub fasoli (PHA). Taka dieta i/lub dieta uzupełniająca jest użyteczna w kontrolowaniu proliferacji komórek śluzówkowych, w zmniejszaniu i/lub leczeniu uszkodzeń powodowanych przez czynnik uszkadzający komórki, zmniejszaniu i/lub leczeniu zaburzenia metabolicznego oraz połączeniu dwóch łub większej ich liczby. Dieta lub dieta uzupełniająca może także służyć do niemedycznego odchudzania/zmniejszania wagi.

Dieta i/lub dieta uzupełniająca odnosi się do wszystkich zwierząt łącznie z człowiekiem.

Dieta jest szczególnie użyteczna, jeżeli po zakończeniu jej stosowania przez pewien okres czasu podaje się dietę wysokowartościową. Wysokowartościową dietę można zdefiniować jako dietę zawierającą wszystkie niezbędna białka, tłuszcze, węglowodany, minerały i witaminy niezbędne dla normalnego wzrostu zwierzęcia. Niezbędne składniki diety wysokowartościowej są korzystnie podawane w optymalnych ilościach. Wysokowartościową dieta nie powinna zawierać jakichkolwiek składników, które spowolniłyby lub zahamowały wzrost rozwój zwierzęcia. Korzystną cechą diety wysokowartościowej jest to, że następuje pozytywne przetworzenie spożytego pożywienia w masę ciała.

Wysokowartościową dieta korzystnie jest kontynuowana bezpośrednio lub wkrótce (do dni) po powyżej opisanej diecie zawierającej lektyny. Dieta wysokowartościową jest najbardziej użyteczna w okresie do 7 dni, korzystnie w okresie do 5 dni. Dieta może być także korzystna przy długoterminowym (ponad miesiąc, korzystnie ponad rok) leczeniu zaburzeń metabolicznych i odchudzaniu w celach kosmetycznych.

Korzystnie podczas stosowania lektyn w połączeniu z czynnikami uszkadzającymi komórki (jakkolwiek nie koniecznie podawanymi w tym samym czasie) część diety zawierająca lektyny ograniczona jest do okresu do 5 dni, gdyż 48-72 godzin zazwyczaj wystarcza do wypełnienia całego cyklu obrotu jelitowego, przez co osiąga się korzyści z wyższego tempa wchłaniania i przetwarzania pokarmowego w kontrolowaniu pokarmowej części cyklu. Najlepiej jeżeli wysokojakościowa część pokarmowa cyklu jest ograniczona do około 5 dni celem uzyskania maksymalnej poprawy wydajności przetwarzania pokarmu.

Korzystnie dieta obejmująca okres, w którym w pożywieniu znajduje się lektyna i następujący po nim okres, w którym dieta jest wysokowartościową, powtarzana jest co najmniej dwukrotnie, aby osiągnąć dietę cykliczną. Cykle mogą być powtarzane do 20 razy, korzystnie do 10 razy, najkorzystniej do 6 razy.

W opisanej diecie cyklicznej występują przejściowe okresy wzrostu wydajności wychwytu składników pokarmowych, w których pośredniczy podawanie lektyn. Tak też, poprzez cykliczne stosowanie diet lektynowych i bezlektynowych można kierować poprawianiem stanów zależnych od żywienia. Przykładowo przy odpowiednim czasowym zorganizowaniu diet sportowiec może zoptymalizować wyniki podczas głównych imprez.

Powyższa dieta jest szczególnie użyteczna przed lub po zastosowaniu leczenia napromienianiem i/lub chemioterapią. W takich sytuacjach dieta może być jeszcze bardziej skuteczna, jeżeli zostanie zastosowana w połączeniu z cytoprotektantem.

Produkty odpadowe soi, włącznie z frakcją serwatki sojowej, można stosować w powyżej opisanych celach. Zastosowanie takich produktów odpadowych soi zmniejsza wymagania odnośnie usuwania lektyn z produktów sojowych przed ich użyciem jako artykułów żywnościowych, oraz zapewnia skuteczne wykorzystanie niskowartościowych produktów odpadowych z soi.

Wynalazek został poniżej zilustrowany kilkoma przykładami, które nie wyczerpują zakresu jego stosowania. Przykłady odnoszą się do załączonych rysunków, na których:

Figura i przedstawia suchą masę ciał szczurów na dietach z różnymi ilościami fitohemoaglutyniny przez 10 dni (doświadczenia i a, b, c). Fig. la przedstawia suchą masę ciała w funkcji mg PHA/dzień, a fig. łb względny stosunek suchej masy ciała w funkcji loguj (mg PHA/dzień). (O Doświadczenie la;d Doświadczenie lb; A Doświadczenie lc).

190 301

Figura 2 przedstawia wzrost szczurów na diecie z albuminą sojową oraz następnie na diecie z laktalbuminą w powtarzających się cyklach w porównaniu z parą szczurów na diecie kontrolnej przez cały czas trwania doświadczenia. Zaznaczono także czasy przestawienia szczurów na inne diety i przyjmowany pokarm.

Figura 3 przedstawia skutek działania podawania 5-FU i PHA na świeżą masę ciała.

Figura 4 przedstawia skutek działania podawania 5-FU i PHA na dzienne pobieranie pokarmu.

Figura 5 przedstawia skutek działania diety zawierającej lektyny na przeżycie zwierząt po 30 dniach po przyjmowaniu dawki promieniowania 6,75 Gy.

Przykłady

Materiały i metody

Oczyszczanie PHA

Do przykładów z otyłością i chemioterapią PHA oczyszczono na drodze chromatografii powinowactwa na kolumnie Sepharose 4B-fetuina, metodą Pusztai'a i Palmera (1977) z niewielkimi modyfikacjami (Carvalho, 1993). Fasolę ekstrahowano buforem 0,05 M boran sodu (pH 8,0) i rozdzielono na globuliny i albuminy przy pomocy dializy wobec buforu 0,033 M octan sodu, pH 5,0. Frakcje PHA typu E (erytroaglutynującej) adsorbowano na kolumnie Sepharose 4B-fetuina przy pH 7,6 (0,05 M Tris-HCl) i wymyto buforem 0,05 M glicyna-HCl, pH 3,0 zawierającym 0,5 M NaCl, a następnie dializowano i suszono przez liofilizację. W celu oczyszczenia PHA typu L (limfoaglutynującej), po usunięciu niewielkiej ilości PHA typu E z frakcji albumin przy pomocy Sepharose 4B-fetuiny, nie absorbujące się frakcje frakcjonowano na sulfopropylowanej kationowymiennej kolumnie HPLC (TSK SP-5PW, 21,5 mmxl50 mm; Anachem GB Ltd) w buforze 0,005 M octan sodu-kwas octowy, pH 3,8 zawierającym 0,1 M Na Cl i eluowano z programowanym gradientem ze wzrastającą siłą jonową (0,1 - 0,5 M NaCl). Na koniec zanieczyszczenia o niskiej masie cząsteczkowej usunięto przez chromatografię na kolumnie Sephadex G-100 i czyste PHA typu L odzyskano po dializie i liofilizacji. Wydajność: 0,32 g i 0,61 g PHA odpowiednio typu E i typu L ze 100 g mączki fasolowej.

Do przykładu z radioterapią PHA izolowano przez roztarcie 50 g fasoli w urządzeniu do rozcierania z sitem o oczkach 1 mm. Dodano 500 ml 0,02 M kwasu octowego zawierającego 0,1 g 5 kwasu askorbinowego i mieszano przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Nastawiono pH na 5,0 za pomocą 1 M NaOH i mieszano roztwór przez kolejne 2 godziny w temperaturze pokojowej. Roztwór pozostawiono w 4°C na noc, a następnie odwirowano przy 9000 obrotów/minutę przez 15 minut. Do supernatantu dodano 0,075 g CaCl₂ i nastawiono pH na 9,0 przy pomocy IM Na OH. Supematant ponownie pozostawiono na noc w temperaturze 4°C i próbkę odwirowano przy 3000 obrotów/minutę przez 10 minut. Następnie próbkę dializowano wobec Tris (pH 7,6) przed oczyszczeniem na kolumnie do chromatografii powinowactwa Sepharose 4B-fetuina. Frakcję PHa wymyto buforem, 0,05 M glicynią a następnie dializowano wobec wody i liofilizowano.

Próba insulinowa

Stężenia immunoreaktywnej insuliny osoczowej zmierzono przy pomocy metody precypitacji dwoma przeciwciałami (MacRae i inni, 1991) oraz szczurzego wzorca insuliny (Incstar Corporation, Stillwater, Min. USA). Znakowaną ^|55I insulinę bydlęcy 5pjyO,1pg (pozycja IM38) otrzymano z Amersham International pic (Amersham, Bucks.), a surowicę odpornościową przeciwko świńskiej insulinie wyhodowaną w świnkach morskich otrzymano z Miles Scientific (Stoke Poges, Slough). Surowicę przeciw IgG świnki morskiej i normalną surowicę świnki morskiej otrzymano z Scottish Antibody Production Unit (Law Hospital, Carluke, Lanarkshire).

Glukoza osoczowa

Stężenie glukozy w próbkach osocza oznaczono przy pomocy metody z autoanalizatorem Trindera (1967).

190 301

Produkcja przeciwciał

Przeciwciała przeciwko KTI, BBI i LA wyhodowano w królikach zgodnie z metodą Harboe i Inglid (1973) co opisano wcześniej (Hajos i inni, 1995). Przeciwciała przeciwko SBA otrzymano z Sigma Chemical Co (UK Ltd).

Kompetycyjny pośredni test ELISA

Pośrednie testy ELISA zastosowano do ilościowego oznaczenia SBA w próbkach jelita (Hajos i inni, 1995). Jednakże, w przypadku LA płytki ELISA powleczono LA i utworzono kompleks immunologiczny stosując królicze przeciwciała typu IgG przeciwko LA. Wyniki wyrażono w procentach materiału odzyskanego z dawki inkubowanej wewnątrzjelitowo.

Elektroforetyczny rozdział, czynników przeciwodżywczych z próbek jelita

Przeprowadzono elektroforezę na żelu z SDS, następnie wykonano pół-suchy transfer blottów na błony nitrocelulozowe i wyznakowano immunologicznie przy pomocy przeciwciał specyficznych dla antygenu - składnika przeciwodżywczego, jak po wyżej (Hajos i inni, 1995).

Skład diet doświadczalnych

Tabela 1

Skład diet do przykładów z otyłością i chemioterapią

	Laktoalbumia (LA)	Fasola (KB)	Albuminy z KB (KBA)
Skrobia kukurydziana	373	177	372
Skrobia ziemniaczana	100	100	100
Glukoza	150	150	150
Olej kukurydziany	150	150	150
Mieszanka witaminowa	50	50	50
Mieszanka mineralna	50	50	50
Laktoalbumina	127	63	102
Mączka fasolowa	-	260	-
Albumina fasolowa	-	-	26
L-metionina	-	2,1	0,9
L-tryptofan	-	0,25	0,13
Kwas krzemowy	0,4	0,4	0,4

Wszystkie składniki podano w gramach skladnika/kg diety.

Skład mieszanek witaminowych i mineralnych - patrz Carvalho (1993).

Tabela 2

Skład diet do przykładów z soją i składnikami przeciwodżywczymi

Dieta	1. Kontrola	2. Albuminy sojowe (SBALB)
l	2	3
Laktoalbumina	120	0
Albuminy sojowe	0	110
Skrobia kukuiydziana	380	390
Skrobia ziemniaczana	100	100
Glukoza	150	150

190 301 cd tabeli 2

1	2	3
Olej kukurydziany	150	150
Witaminy	50	50
Minerały	50	50
L-tryptofan	0	0,3
L-metionina	0	1,2
L-fenyloalanina	0	1,0
L-leucyna	0	2,3
L-izoleucyna	0	2,6
L-walina	0	2,6
Kwas krzemowy	0,4	0,4

Wszystkie składniki podano w gramach składnika/kg diety. Skład mieszanek witaminowych i mineralnych patrz Grant i inni (1993).

Tabela 3

Skład diet do przykładów z radioterapią

Dieta	10% Laktoalbumina	PHA (białko fasolowe)
Laktoalbumina	120	90
Fasola	0	127,5
Skrobia kukurydziana	379,6	280,9
Skrobia ziemniaczana	100	100
Glukoza	150	150
Olej kukurydziany	150	150
Witaminy	50	50
Minerały	50	50
L-tryptofan	0	0,14
L-metionina	0	1,07
Kwas krzemowy	0,40	0,40

Wszystkie składniki diety podano w gramach składnika/kg diety. Zawartość PHA w fasoli wynosi 2,6%. Zgodnie z tym, przy ograniczonym przy 6 g dziennym spożyciu ilość wejściowa PHA/mysz wynosiła 20 mg. Skład mieszanki witaminowej: tiamina, 1000 mg; pirydoksyna (B6), 1000 mg; ryboflawina, 100 mg; kwas p-aminobenzoesowy, 1000 mg; kwas nikotynowy, 3000 mg; pantotenian wapnia, 2000 mg; kwas foliowy, 500 mg; biotyna, 550 mg; inozytol, 40000 mg; α-tokoferol, 25 g; octan retinylu, 1150 mg; kalcyferol (D-), 1500 mg; witamina Bi₂, 2,5 mg; Menadione, 500 mg; chlorek choliny, 100 mg; skrobia kukurydziana, 5000 g.

Podawanie 5-FU

300 mg 5(fluorouracylu rozpuszczono w 14 ml wody destylowanej. Powoli dodawano 1 M NaOH aż 5-FU rozpuścił się. Następnie roztwór dopełniono do 20 ml. Końcowe pH roztworu wynosiło 8,3. Zwierzętom podano dawkę 150 mg/kg masy ciała przez śródotrzewnową

190 301 iniekcję. Natychmiast po iniekcji szczurom podano 15 g diety kontrolnej i zapewniono wolny dostęp dojedzenia przez dalszą część doświadczenia.

Źródła napromieniania

Pistolet kobaltowy ^ć0Co; całkowita dawka 6,75 Gy, ekspozycja całego ciała,- moc dawki 0,3 Gy/min.

Przykład 1

Przeprowadzono trzy oddzielne doświadczenia (1 a, b, c) według tego samego schematu. Szczurom odstawionym w 19 dniu życia i utrzymywanym na diecie podstawowej przez 11 dni podawano dietę LA przez 3 dni (tabela 1), aby osiągnąć masę wyjściową 82-84 g. Następnie szczury podzielono według masy ciała na grupy składające się z pięciu osobników i w grupach przypadkowo poddano je poszczególnym procedurom doświadczalnym. Szczurom w każdej z grup podawano rano 6 g diety kontrolnej, diety LA lub diet opartych na diecie LA, zawierających różne poziomy PHA, tak że dzienna dawka PHA wynosiła od 0,65 do 42 mg/szczura (od 0,007 do 0,45 g/kg masy ciała). Po 10 dniach szczurom podano rano 2 g odpowiednich diet i uśmiercono dokładnie 2 godziny później. Wycięto i przepłukano mięśnie brzuchate łydek, a następnie liofilizowano i zważono zarówno ciała jak i mięśnie. W doświadczeniu 1c ciała roztarto na proszek i wyekstrahowano mieszaniną chloroform-metanol 2:1; obj ./obj.) w celu ustalenia składu lipidowego.

Średnie masy ciała grup kontrolnych w doświadczeniach 1 a, b, c były bardzo podobne i wahały się od 23,1 do 24 g. Masy ciała szczurów karmionych dietami zawierającymi PHA w zakresie od 0 do 42 mg/szczura/dzień (0 do 0,45 g/kg masy ciała) ulegały zmniejszaniu w sposób dwufazowy (fig. 1a, b; tabela 4, 5). Zaobserwowano niewielkie zmniejszenie masy ciała nawet przy niskich poziomach PHA (np. 4% przy 3,5 mg/szczura/dzień; 0,04 g/kg masy ciała), przy czym stosunkowo duże zwiększenie dawki lektyn (do około 0,32 g/kg) spowodowało tylko niewielki dalszy spadek masy ciała. Tak też, przeciętnie we wszystkich doświadczeniach przy dawkach poniżej 10 mg PHA/dzień (0,12 g/kg masy ciała) średnie zmniejszenie masy ciała wynosiło 1,14 g (bs - błąd standardowy 0,25 g) w porównaniu z grupą kontrolną (4,9% kontrolnej masy ciała). Przy dziennych dawkach pHa wynoszących od 10 do 27 mg (0,12 do 0,32 g/kg masy ciała) zaobserwowano dalsze zmniejszenie masy ciała o 0,64 (bs 0,21) g (2,7% kontrolnej masy ciała). Jednakże, przy wyższych dawkach (0,20 do 0,45 g/kg masy ciała) zmniejszenie masy ciała było bardziej znaczące. Związek pomiędzy względną suchą masą ciała (proporcjonalnie do kontrolnej dawki 0), RBDW, a dawką PHA wyrażoną w mg/dzień z trzech oddzielnych prób (doświadczenia 1a, b, c) poniżej dawki PHA 27 mg/dzień był następujący:

RBDW=0,918 (bs 0,008)-0,0334 (bs 0,0062)xlog10 (dawka PHA/27)

Dla dawki wyższej od tego PHA równanie było następujące:

RBDW=0,918 (bs 0,008)-0,5138 (bs 0,0876)xlog10 (dawka PHA/27)

Zmiany w suchej masie mięśni brzuchatych łydki (szkieletowych) zmieniały się podobnie ze zwiększeniem ilości lektyny (tabela 4, 5). Proporcjonalna utrata masy mięśni w porównaniu ze szczurami kontrolnymi była około 1,5-2,0 razy większa od odpowiadającej im utraty masy ciała (tabela 4, 5), ale przy dziennych dawkach poniżej 10 mg PHA (0,12 g/kg masy ciała) różnica pomiędzy proporcjonalną utratą masy ciała i mięśni była mało znacząca (p>0,05). .... . .

Podobne do zmniejszenia masy ciała i mięśni, zawartość lipidów w ciele szczurów zmniejszała się wraz ze wzrostem dawki PHA w diecie (tabela 5; doświadczenie 1c). Jednakże, pomimo, że utrata lipidów przekraczała utratę zarówno masy ciała jak i mięśni szkieletowych, stosunek spadków pozostawał zasadniczo stały dla wszystkich dawek.

190 301

Tabela 4

Masy ciała i mięśni brzuchatych łydki szczurów karmionych dietami zawierającymi różne poziomy PHA przez 10 dni

Dawka PHA (mg/szczura/dzień)	Sucha masa ciała (BDW) g (% straty w stosunku do zwierząt kontrolnych)	Sucha masa mięśnia brzuchatego łydki g (% straty w stosunku do zwierząt kontrolnych)
Doświadczenie 1a
0	24,0	-	0,184	-
2,6	23,5	2,2	0,183	0,7
5,2	21,9	8,7	0,166	9,7
10,5	22,0	8,5	0,155	15,5
21,0	22,4	7,0	0,153	16,5
42,0	20,4	15,2	0,129	29,8
SED	0,61		0,0074
Doświadczenie 1b
0	23,2	-	0,178	-
0,6	22,7	2,3	0,174	2,1
1,3	21,8	6,0	0,161	9,4
15,0	21,2	8,4	0,151	15,3
30,0	20,9	10,0	0,143	19,9
SED	0,35		0,0039

Wszystkie dawki badano na grupach po 5 szczurów.

Tabela 5

Skład ciała szczurów na dietach zawierających różne poziomy PHA przez 10 dni (doświadczenie 1c)

Dawka PHA mg/szczura/dzień	0	3,5	7	14	21	39	42	SED
Sucha masa ciała (g) (% straty	23,2	22,2	22	22,4	21	20,6	18,4	0,47
w stosunku do zwierząt kontrolnych)	-	4,3	5,2	3,4	9,5	11,2	20,7	-
Sucha masa mięśnia brzuchatego	0,196	0,188	0,184	0,185	0,167	0,154	0,134	0,0061
łydki (g) (% w stosunku do zwierząt kontrolnych		4,1	4,1	5,6	14,8	21,4	31,6
Masa lipidów (g) (% straty w sto-	4,18	3,9	3,86	3,56	3,39	2,82	2,25	0,17
sunku do zwierząt kontrolnych)	-	6,7	7,7	14,8	18,9	32,5	46,1
Całkowita sucha masa mięśni* (g)	9,27	8,89	8,7	8,75	7,9	7,28	6,39
Inna sucha masa** (g)	9,75	10,39	9,46	10,14	9,69	10,46	9,75
Stosunek % utraty mięśni brzuchatych łydki do % utraty lipidów	-	0,61	0,79	0,38	0,79	0,66	0,69

We wszystkich grupach było po 5 szczurów.

*TMDW oznaczono na podstawie założenia, że (i) sucha masa mięśnia brzuchatego łydki/TMDW jest taka sama we wszystkich procedurach doświadczalnych i (ii) TMDW/BDW = = 0,4 dla grupy kontrolnej.

**OW obliczono przez odjęcie sumy LW i TMSW od masy całkowitej.

Ogólnie PHA uznaje się za toksynę odżywczą, ponieważ szczury karmione głównie białkami fasolowymi zawierającymi wysoki poziom PHA (0,8 - 1,0 g/kg masy ciała) umierają w przeciągu kilku dni (Pusztai, 1991). Jednakże w związku z tym, że PHA nie jest szkodliwe

190 301 dla szczurów utrzymywanych w warunkach jałowych, jego toksyczne właściwości u szczurów z normalną mikroflorą są prawdopodobnie konsekwencją gwałtownego rozrostu E. coli w świetle jelita cienkiego, którego masa wynosiła niewiele poniżej 0,2 g/kg, ale wzrastała znacząco i proporcjonalnie ze zwiększeniem poziomu PHA w diecie (Pusztai i inni, 1993). Przykład 1 wykazuje, że w takim niskim zakresie stężeń nie występuje rozrost bakteryjny (poniżej 0,2 g/kg), przeciwodżywcze skutki działania PHA są niewielkie u szczurów z normalną mikroflorą, ponieważ zmniejszenie masy ciała jest minimalne po 10 dniach podawania lektyny. Ponadto w porównaniu z atrofią mięśni obserwowaną przy wysokich dawkach (0,45 g/kg i wyższych), zmniejszenie masy mięśni szkieletowych przy dawkach PHA poniżej 0,1 g/kg masy ciała było niewielkie i proporcjonalne do końcowej utraty masy ciała (tabele 4, 5). Jednakże, w porównaniu z grupą kontrolną proporcjonalny spadek lipidów był większy niż spadek masy mięśni, z tym, że różnica pomiędzy nimi pozostawała mniej więcej stała (tabele 4, 5). Tak też pierwszym skutkiem podawania lektyn jest stymulacja katabolizmu lipidów ciała i dlatego niskie dawki lektyn mogą być odpowiednie do leczenia zaburzeń metabolicznych, takich jak otyłość.

Przykład 2

W przykładach 2-5 przebadano odpowiedź insulinową szczurów na PHA. W przykładzie 2 szczurom na diecie zawierającej 42 mg PHA/dzień mierzono poziom insuliny w krwi, odpowiednio po 9 do 10 dniach. Pojedynczo hodowano samce Hooded Lister spf (specyficznie wolne od patogenów) odstawiono w 19 dniu życia trzymano przez 14 na diecie podstawowej (Special Diet Services, Manea, Cambridgeshire) w dowolnej ilości, następnie w ograniczonej ilości (8 g/szczura/dzień) przez 5 dni w grupie kontrolnej i na diecie laktoalbuminowej (LA: tabela 1). Szczurom podawano pokarm trzy razy dziennie: 2,5 g o 9:00, i, 1,0 g o 13:00 i 4,5 g o 18:00. Piątego dnia szczurom podano 1,5 g diety LA pomiędzy 9:00, a 9:30 i pobrano próbki krwi z żyły ogonowej 2 godziny później (próbki pobrane przed doświadczeniem). Krew zbierano w heparynizowanych probówkach (25 pl roztworu heparyny zawierającego 26 jednostek USP/probówkę) i odwirowano w wirówce laboratoryjnej w +1°C przez 15 minut. Aby umożllwić rozdział osocza od erytrocytów dodano plastikowe granulki. Osocze podzielono na 100 pl frakcje i przechowywano w -20°C do czasu wykonania testu. Następnie szczury losowo podzielono na dwie grupy po 13 zwierząt każda i hodowano pojedynczo. Grupa 1 była na diecie zawierającej wyłącznie fasolę (dieta KB; tabela 1) przez 10 dni (8 g diety/szczura/dzień podzielonej na 3 posiłki: 2,5 g o 9:00, 1,0 g o 13:00 i 4,5 g o 18:00) podczas gdy grupa kontrolna była na diecie LA w tych samych warunkach. Dnia 9 rano pobrano próbki po 2 godzinach od podania 1,5 g diety KB i powtórzono to samo dnia 10 (ostatniego). Następnie szczury uśmiercono przez uśpienie, otwarto jamę brzuszną i zebrano resztę krwi z serca. Po szybkim przemyciu lodowatą wodą usunięto przewód żołądkowo-jelitowy razem z trzustką i zamrożono w ciekłym azocie. Ze szczurami kontrolnymi postąpiono w ten sam sposób, z tym, że podano im 1,5 g diety LA przed pobraniem próbek krwi. Próbki osocza przechowywano zamrożone do czasu oznaczenia insuliny.

Insulinę ekstrahowano z trzustki (sześć losowo wybranych szczurów z każdej grupy) po homogenizacji próbki tej tkanki (około 25-50 mg suchej masy) 10 ml zakwaszonego etanolu (etanol : woda: stężony H2SO4 = 96:18:2,5 obj.) przez noc w chłodni i następnie odwirowano przy 1500 g przez 10 minut w zimnej wirówce. Czysty supernatant rozcieńczono do około 1:200 (obj.) buforem do prób insulinowych przed przeprowadzeniem radioimmunologicznej próby insulinowej.

U szczurów na diecie KB zawierającą 42 mg PHA/szczura/dzień (0,45 g/kg masy ciała) przez 10 dni nastąpiło znaczące zmniejszenie stężenia insuliny z poziomu przed doświadczeniem wynoszącego 2,97 (bs 0,84) do 0,36 (bs 0,05) ng/ml w 9 dniu doświadczenia (tabela 6). Obniżenie tego poziomu było najwyraźniej trwałe podczas podawania PHA, ponieważ próbki pobrane 10 dnia zawierały podobnie niską ilość insuliny - 0,23 (bs 0,06) ng/ml. Dla porównania w próbkach osocza z grupy kontrolnej poziom insuliny pozostał wysoki i wynosił 3,31 (bs 0,30) i 1,55 (bs 0,21) ng/ml odpowiedni dnia 9 i 10 doświadczenia.

190 301

Tabela 6

Masa i zawartość insuliny w trzustce szczurów karmionych dietami zawierającymi fasolę lub laktoalbuminę (grupa kontrolna) przez 10 dni.

	Sucha masa trzustki	pg/trzustkę	Insulina pg/g białka
(mg)	(mg/100g masy ciała)
KB	162±20*	982±122*	22,38+7,63*	182±80*
LA	138±16	650±63	40,60± 12,71	354±152

KB = dieta fasolowa; LA = dieta laktoalbuminowa

Wartości są średnimi ± (odchylenie standardowe dla 6 zwierząt w każdej grupie *Znacząco różne od grupy kontrolnej na diecie laktoalbuminowej (P<0,01)

Całkowite i względne suche masy trzustek szczurów na diecie KB z najwyższą dawką PHA przez 10 dni były znacząco zwiększone w porównaniu z odpowiadającą im grupą kontrolną (tabela 6). W porównaniu z tym zawartość insuliny trzustkowej wyrażona albo jako (pg/trzustkę, albo (pg/g białka była znacząco obniżona. Pomimo znaczącego zmniejszenia poziomu insuliny stężenia glukozy w osoczu nie zmieniły się znacząco u zwierząt na diecie KB i ich ogólna średnia wartość wynosiła 1,7 (bs 0,1 mg glukozy/ml zarówno u szczurów badanych jak i kontrolnych.

Potwierdzony został podejrzewany wcześniej związek pomiędzy silnymi działaniami katabolicznymi wywieranymi przez wysokie dawki PHA na metabolizm lipidów, węglowodanów i białek ciała, a obniżeniem poziomu insuliny w osoczu (Pusztai, 1991). W rzeczywistości poziom insuliny został obniżony nie tylko w krążeniu krwi podczas 10 dni doustnego podawania PHA, ale także zmniejszył się znacznie poziom insuliny trzustkowej u tych zwierząt.

Przykład 3

Szczury odstawiono w 19 dniu życia, hodowano w grupach po 8 - 10 osobników i karmiono dietą podstawową przez 12 dni. Następnie losowo podzielono je na dwie grupy (po 13 szczurów w każdej grupie) i hodowano pojedynczo przez dalszą część doświadczenia stosując dietę podstawową przez dalszych 8 dni. Szczury głodzono przez noc, następnie podano im 2 g diety podstawowej rano i po 2 godzinach pobrano próbki krwi (próbki krwi pobrane przed doświadczeniem). Zaraz po tym szczury inkubowano dożołądkowo 1 ml ekstraktu KB (50 mg; 5-7 mg PHA), a szczurom kontrolnym podano 1 ml 0,01. M soli buforowanej fosforanem (0,9% NaCl; wag./obj.; PBS). Od każdego ze zwierząt pobrano próbki krwi w 15, 60 i 120 minut po inkubacji. Pojedyncza dawka rozpuszczalnego białka KB spowodowała stopniowe obniżanie się stężenia insuliny w osoczu. Stężenie insuliny w osoczu wynoszące przed doświadczeniem 1,78 (bs 0,22) ng/ml osocza zmniejszyło się do 1,05 (bs 0,22) ng/ml po 120 minutach, co stanowi 59% wartości początkowej (tabela 7). U szczurów kontrolnych poziom insuliny pozostawał zasadniczo stały w zakresie błędu doświadczalnego we wszystkich punktach czasowych [1,76 (bs 0,42) ng/ml].

Tabela 7

Względne poziomy insuliny (wyrażone w % kontroli) u szczurów po ostrej, dożołądkowej ekspozycji na białka fasoli lub oczyszczone lektyny typu E lub typu L.

Czas	Grupa kontrolna	Białka fasoli	Typ E	Typ L
15	109 (36)	82 (34)	76 (27)*	98 (32)
60	97 (36)	65 (21)*	58 (23)*	86 (34)
120	89 (28)	59(15)*	80 (39)	81 (32)

Wyniki stanowią wartości średnie ± odchylenie standardowe. * oznacza, że średnia jest znacząco różna od 100 (p<0,05).

190 301

Przykład4

Przykład 4 przeprowadzono w taki sam sposób jak przykład 3, z tym że badanym zwierzętom podano przez zgłębnik 1 ml roztworu zawierającego 5 mg lektyny typu E lub L. Niektóre z tych próbek lektyny były znakowane ^l25ł (o całkowitej aktywności 2,5-3 milionów cpm). Zwierzętom kontrolnym podano PBS. Próbki krwi pobrano jak poprzednio w czasie 0, 15, 60 i 120 minut. W celu zmierzenia faktycznych ilości PHA dostarczonych do dwunastnicy zmierzono radioaktywność popłuczyn żołądka i jelita cienkiego u niektórych szczurów uśmierconych w 1 i 2 godziny po inkubacji.

U szczurów inkubowanych czystą PHA typu E stwierdzono obniżenie poziomu insuliny w porównaniu z poziomem obserwowanym przed doświadczeniem w pierwszych 60 minutach do 1,03 (bs 0,32) ng/ml, co daje wynik podobny do otrzymanego w przypadku szczurów którym podano białka KB (tabela 7). Jednakże zaobserwowano niewielki wzrost poziomu insuliny w kolejnych 60 minutach, co spowodowało, że poziom insuliny w 120 minucie nie różnił się już znacząco (p > 0,05) od poziomu przed doświadczeniem. Po pojedynczej dawce PHA typu L także zaobserwowano stopniowe zmniejszanie się poziomu insuliny w osoczu, ale zmiany te nie były znaczące w jakimkolwiek punkcie czasowym przez 120 minut doświadczenia [1,39 (bs 0,35) ng/ml w 120 minucie). Opróżnianie żołądka u szczurów inkubowanych lektynami było powolne i nie różniło się znacznie w obrębie dwóch typów PHA (p>0,05). W przypadku pHa typu L 52% dawki początkowej dotarło do jelita cienkiego po 120 minutach, podczas gdy w przypadku PHA typu L było to niewiele więcej, 63%. Poziom glukozy w osoczu nieznacznie zmniejszył się pod wpływem ostrej ekspozycji na PHA i/lub albuminy KB z 1,6 (bs 0,2) do 1,4 (bs 0,2) mg/ml, ale różnica ta nie jest znacząca (p>0,05).

Dieta zawierająca czystą PHA typu E lub L może spowodować zmniejszenie insuliny w surowicy, co było także obserwowane w przypadku diet zawierających białka fasoli. Tak też zmniejszenie poziomu insuliny w surowicy następuje jako bez pośredni skutek działania PHA i nie jest spowodowane ubogą wartością odżywczą białka fasoli.

Przykład 5 szczurów odstawiono wio dniu żdcia i hodowano osobno podczas doświadczenia karmiąc dietą podstawową przez 15 dni, a następnie dietą LA (8 g diety/szczura/dzień) przez 5 dni. Dwanaście losowo wybranych szczurów przestawiono na dietę zawierającą albuminę z fasoli (dieta KBA; tabela 1) na następne 3 dni, z dziennym podawaniem około 30 mg PHA/szczaro/dzień, podczas gdy szczury kontrolne były nadal karmione dietą LA. Wieczorem 3 dnia szczury karmione dietą KBA inkubOwano i zamiast wieczornego posiłku podam dożołądkowo 1 ml roztworu 100 mg KBA zawierającego 25 mg PHA, a szczurom kontrolnym podano wieczorną porcję ich diety LA. Następnie szczurom nie podawano pokarmu do rana, gdy podano im 2 g diety LA, aby zwiększyć u nich poziom insuliny w osoczu. Dokładnie dwie godziny później pobrano próbki krwi (próbka pobrana przed doświadczeniem), a następnie szczury karmione dietą KBA podzielono losowo na grupy po cztery osobniki każda i podano im przez zgłębnik 1 ml roztworów zawierających 20 mg KBA, lulb 5 mg PHA typu E lub typu L, z których niektóre były znakowane ^l25ł. Czterem szczurom kontrolnym podano dla porównania przez zgłębnik KBA (40 mg; 4 - 6 mg PHA). Szczurom pobrano próbki krwi po 120 minutach, uśmiercono i usunięto trzustki, które zamrożono do prób insulinowych.

Dożołądkowa inkubacja pojedynczą dawką oczyszczonych izolektyn PHA szczurów, będących wcześniej na diecie zawierającej albuminy KB lub na diecie kontrolnej i inkubowanych przez 3 dni dawkami PHA, znacznie zmniejszyła stężenie insuliny osoczowej w krążeniu. Zarówno w przypadku lektyn typu E jak i typu L różnica pomiędzy poziomem insuliny osoczowej przed doświadczeniem [0,59 (bs 0,05) ng/ml] i poziomem w 120 minucie [0,15 (bs 0,09) ng/ml] była znacząca (p>0,05). Wcześniejsze karmienie dietą KBA okazało się przyspieszyć opróżnianie żołądka z dożołądkowo podanych lektyn typu E, ponieważ 80% lektyn dotarło do dwunastnicy w 60 minucie. W porównaniu z tym lektyny typu L nadal wolno przedostawały się do dwunastnicy i w 60 minucie około 50% początkowej dawki PHA pozostawało w żołądku. Pomimo różnic całkowitych stężeń insuliny w osoczu pomiędzy szczurami karmionymi wcześniej dietą KBA (niskie) i utrzymywanymi na diecie kontrolnej (średnio wysokie), po podaniu przez zgłębnik albumin KB proporcjonalne obniżanie się poziomu insuliny w osoczu było podobne w obu grupach szczurów. Stężenie insuliny w trzustce

190 301 nieznacznie, ale nie znacząco, zmniejszyło się po trzech dniach podawania diety KBA z 58,3 (bs 10,8) u grupy kontrolnej do 42,5 (bs 8,3) (g insuliny/trzustkę). Jakkolwiek, nie było znaczących zmian średnich poziomów glukozy w porównaniu z okresem przed doświadczeniem [1,6 (bs 0,2) mg/ml], ale wartości niewiele zmniejszyły się podczas doświadczenia. Nie było znaczących różnic masy ciała i mięśni po ekspozycji przez 3 dni na działanie PHA.

Przykład 6

Strategia dietetyczna służąca do przezwyciężenia przeciwodżywczych właściwości soi przez wykorzystanie zwiększonej wydajności konwersji pokarmu po krótkiej, okresowej ekspozycji szczurów na działanie serwatki sojowej zawierającej dużą ilość aglutynin.

Samce szczura Hooded-Lister odstawiono w 19 dniu życia i zapewniono im swobodny dostęp do pożywienia zawierającego dietę podstawową (Labsure, Manea, U.K.) przez 7 dni, a następnie podawano im kontrolną dietę LA (100 g laktoalbuminy/kg; tabela 2) w ilości dowolnej przez 3 dni, a następnie 6 g tej samej diety/szczura/dzień przez 5 dni. Szczury miały swobodny dostęp do wody przez cały czas. Następnie szczury podzielono na dwie grupy, po 5 szczurów każda. Dieta grupy doświadczalnej zawierała 100 g/kg białka opartego na SBALB (tabela 2). Szczury z grupy kontrolnej karmiono podczas do świadczenia dietą LA, a jej ilość została ograniczona do ilości dobrowolnie przyjmowanej przez szczury badane. Układ doświadczenia zaprojektowano tak, że (fig. 2) początkowo grupa karmiona soją była na diecie sojowej przez 7 dni, następnie zmieniono dietę na LA na 8 dni, potem znów zastosowano dietę sojową przez 7 dni i ponownie dietę LA przez 7 dni. Następnie przez kolejnych 6 dni szczury były na diecie sojowej i przez 20 dni na diecie LA oraz ostatecznie szczurom zastosowano dietę sojową przez 5 dni. Następnego dnia rano, tj. 61 dnia doświadczenia z żywieniem mieszanym, wszystkim szczurom podano 2 g diety LA, a następnie grupę szczurów karmionych dietą sojową inkubowano dożołądkowo 280 mg SBALB rozpuszczonymi w 2 ml soli, podczas gdy szczurom kontrolnym podano samą sól. Szczury uśmiercono przędą wkowując halotan dokładnie po 90 mi nutach i całkowicie wypreparowano. Całkowicie usunięto żołądek i jelito cienkie, przy czym jelito pocięto na 10 cm odcinki. Przewody wszystkich tkanek przepłukano 2 ml lodowatej wody destylowanej, liofilizowano i następnie roztworzono w destylowanej wodzie (1 mg suchego materiału/100 μΐ) i użyto do testów ELISA. Przemyty fragment jelita o długości 2 cm (pomiędzy 5 - 7 cm od odźwiemika) przebadano histologicznie.

Wszystkie tkanki liofilizowano i zważono. Ciała szczurów również liofilizowano i użyto do oznaczenia zawartości białek i lipidów. Fragmenty żołądka i jelita cienkiego zhomogenizowano (trzykrotnie) 0,1 M roztworem D-galaktozy (5 ml/suchą próbkę) i te ekstrakty użyto w testach ELISA. Podczas doświadczenia codziennie zbierano odchody i oznaczono w nich poziom azotu.

W kontrolnej próbie doświadczalnej pierwszy cykl zmiany diety powtórzono, ale tym razem łącznie z grupą SBALB, druga część szczurów doświadczalnych była początkowo na diecie zawierającej LD-SBALB zamiast SBALB przez 7 dni, następnie na diecie LA przez 8 dni, podczas gdy szczury kontrolne były na diecie LA przez 15 dni doświadczenia. Porównano wzrost masy ciała, trawienie i wydajność konwersji pokarmu dwóch grup badanych z grupą kontrolną w dwóch oddzielnych częściach cyklu.

Preparat użyty w doświadczeniu do karmienia szczurów przebadany testem ELISA zawierał 38,7 g SBA/kg. LD-SBALB zwierał mniej niż 4 g SBA/kg. Waga szczurów na dietach sojowych lub LA była zawsze znacząco mniejsza pod koniec każdego okresu karmienia soją, włącznie z ostatnim cyklem, niż szczurów kontrolnych (tabele 8 i 9). Jednakże szczury grupy badanej rosły szybciej podczas okresu na diecie LA następującego po okresie diety sojowej niż szczury kontrolne utrzymywane na diecie LA przez całe doświadczenie (fig. 2; tabela 9). Ponad to wydajność konwersji pokarmu grupy badanej w okresie diety LA zawsze była znacząco wyższa niż w grupie kontrolnej (tabela 9).

190 301

Tabela 8

Masa ciała (BW) i skład szczurów

Dieta	Grupa kontrolna	Badane (SBALB)
Początkowa BW (g)	88,8±3,5a	86,5±2,1a
Końcowa BW (g)	283,5±7,5a	263,6±7,2b
Sucha BW (g)	111,5±3,0a	104,6±3,2b
Lipidy (g)	54,1±4,5a	51,8±5,5a
Białko (g)	45,7±1,5a	44,2±2ja
Lipidy (g/kg suchej BW)	485,2±33,3a	493,8±36a
Białko (g/kg suchej BW)	410,7±19,9a	402,1±25,5a

Wyniki stanowią wartości średnie ± odchylenie standardowe dla 5 szczurów w grupie. Wartości w liniach poziomych z różnymi indeksami górnymi różnią się znacznie (P<0,05).

Tabela 9

Zmiany wagi i wydajność konwersji pokarmu szczurów w okresach badanych i kontrolnych.

Traktowanie	Masa początkowa (g)	Masa końcowa (g)	Konwersja pokarmu (g/g pobrane)
Okres badań z dietą sojową lub LA
Zmiana 1 dni 1-7
Kontrola	88,8±3,5a	92,2±1,0a	0,08±0,02a
Badane	86,6±2,Γ	81,7±3,2b	negatywnab
Zmiana 2 dni 16-22
Kontrola	133±3,0a	137+2,8a	0,06±0,04a
Badane	129+3,03	120±3,9b	negatywna*6
Zmiana 3 dni 30-35
Kontrola	1ó8,5±3,7*	174±4,0a	0,11±0,08a
Badane	163,5±3,7a	153±5b	negatywna6
Zmiana 4 dni 56-61
Kontrola	282,5±6a	283,5±6a	0,01±0,08a
Badane	281,6±5,3a	263,6±7,2b	negatywnab
Okres kontrolny (dieta LA)
Dni 8-15
Kontrola	92,2±1a	L33^3a	0,43±0,03a
Badane	81,7±3,2b	129±3a	0,49±0,03b
Dni 23-29
Kontrola	137±2,8a	168,5±3,7a	0,38±0,04a
Badane	120±3,9b	163,5±3,7a	0,52±0,04b
Dni 36-55
Kontrola	174±4a	282,5±7,5a	0,36±0,02a
Badane	153±5b	281,6±5,1“	0,43±0,02a

Dla każdego z okresów wartości w liniach poziomych z różnymi indeksami górnymi różnią się znacznie (P<0,05).

W okresie karmienia soją masa i zawartość azotu w odchodach grupy badanej była znacznie większa niż grupy kontrolnej. Jednakże w okresie diety LA nie zaobserwowano znaczących różnic tych wartości w odchodach szczurów badanych i kontrolnych. Ponadto nie zaobserwowano znaczących różnic ani w składzie lipidowym, ani w składzie białkowym ciał szczurów w tych dwóch różnych grupach (tabela 8).

Szczury karmione dietą LD-SBALB w okresie badanym wykazywały większy przyrost wagi i lepszą wydajność konwersji po karmu niż szczury karmione dietą SBALB, ale wartości te nadal pozostawały poniżej wartości uzyskiwanych dla szczurów karmionych dietą LA (tabela 10). Jednakże szczury, którym zmieniono dietę z LD-SBALB na LA w okresie kontrolnym nie wykazały znaczącej poprawy wydajności konwersji pokarmu w porównaniu ze szczurami SBALB w okresie diety LA cyklu (tabela 10).

Tabela 10

Skutki usunięcia z diety lektyn w przyroście wagi i wydajności konwersji pokarmu.

Traktowanie	Masa początkowa (g)	Masa końcowa (g)	Konwersja pokarmu (g/g pobrane)
Okres badań z dietą sojową lub LA
Kontrola	80,8±1,5a	86,8±2,0a	0,14±0,03a
SBALB	80,6±1,1a	78,7±0,7b	negatywne*b
LD-SBALB	80,1±1,1ł	83±1,1	0,07±0,03c
Okres kontrolny (dieta LA)
Kontrola	86,8±2a	126,8±2,5a	0,42±0,03a
SBALB	78,7±0,7b	126,7±2,7a	0,50±0,03b
LD-SBALB	83,0=ti,lc	124,2±2,6a	0,43±0,03a

Dla każdego z okresów wartości w liniach poziomych z różnymi indeksami górnymi różnią się znacznie (P<0,05).

Wpływ na organy wewnętrzne. Masy żołądka, jelita cienkiego i grubego, śledziony, nerek, grasicy, płuc, serca, mięśni brzuchatych łydki różniły się u szczurów karmionych dietami sojowymi lub LA przez 61 dni. Jednakże masa trzustki była nieznacznie wyższa, a wątroby niższa u szczurów badmiych w porówniuiiu z kontrolą.

Podsumowując, zmiany diety w których szczury są karmione w krótkich cyklach dietami zawierającymi soję lub laktoalbuminę wykazały, że możliwe jest wykorzystanie wzrostu hiperplastycznego wywołanego przez SBA lub inne lektyny do poprawienia zarówno absorpcji jak i przetwarzania wysokowartościowych składników pokarmowych podczas karmienia dietą wysokowartościową. Ta nowa metoda nie wymaga obróbki soi oraz innych produktów spożywczych zawierających lektyny, a ponadto umożliwia zastosowanie produktów odpadowych soi oraz innych produktów spożywczych zawierających lektyny, w których zawarte są duże ilości lektyn (włącznie z szczególną frakcją serwatki sojowej, która pozostaje po usunięciu sojowych białek globulinowych w wielu gałęziach przemysłu).

Przykład 7

Przebadano właściwości ochronne podawanych doustnie PHA u szczurów podczas stosowania chemioterapii w wysokich dawkach, w szczególności właściwości ochronne wobec jelita.

Cztery grupy szczurów, każda składająca się z osobników utrzymywano na ścisłej diecie przez okres 7 dni (tabela 11).

190 301

Tabela 11

Chemioterapeutyczny protokół dietetyczny

Traktowanie	Protokół dietetyczny
1	Dieta LA przez cały czas, brak 5-FU
2	LA 3 dni, zastrzyk 5-FU, LA 4 dni
3	PHA 3 dni, zastrzyk 5-FU, LA 4 dni
4	PHA 3 dni, zastrzyk 5-FU, PHA 3 dni, LA 1 dzień

LA = laktoalbumina

PHA = aglutynina z Phaseolus vulgaris

5-FU = 5-Fluorouracyl

Szczurom (około 100 g), którym podano PHA przed dawką, udostępniono 10 g diety kontrolnej (tabela 1) zawierającej 10% laktoalbuminy. Każdemu ze szczurów podano przez zgłębnik równowartość 20 mg pHa w 0,9% soli. Szczurom podano dietę kontrolną w dwóch karmieniach o godzinie 10:00 i 17:00. Ilość podanego pożywienia była ściśle dostosowana do ilości zjedzonej przez zwierzę w parze, któremu podano PHA przed lekiem. Jeżeli zwierzętom podano PHA bezpośrednio po leku, lektyny były podawane przez zgłębnik dwie godziny po wstrzyknięciu 5-FU. Zwierzętom, którym nie podano PHA ani, ani po leku, podano przez zgłębnik 1 ml 0,9% soli. Po 3 dniach zwierzętom w trzech grupach podano dawkę 150 mg/kg masy ciała 5-FU. Codziennie zwierzęta ważono i wyznaczano średnią masę ciała.

Figura 3 (patrz również dane do fig. 3 poniżej) przedstawia wpływ diety na masę ciała zwierząt po podaniu 5-FU. Zwierzęta z grupy kontrolnej rosły stale i stopniowo podczas doświadczenia (dane nie przedstawione). Zwierzęta utrzymywane na diecie laktoalbuminowej rosły przez 2 dni po podaniu 5-FU, a następnie zaczęły tracić na wadze. Ponieważ grupa ta była karmiona w taki sam sposób jak grupa, której podano PHA przed dawką, u której pobór pokarmu był zmniejszony przez obecność PHA w diecie, kiedy powtórnie wprowadzono pokarm w ilości dowolnej, zaobserwowano kompensacyjny wzrost w poborze pokarmu, zanim wystąpiło całkowicie cytotoksyczne działanie 5-FU. Zwierzęta, którym podano przed dawką PHA i które były na diecie PHA przez 3 dni przed podaniem 5-FU i na diecie laktoalbuminową potem, utrzymały stałą wagę przez następne cztery dni i wydawały się być zdrowe. W pozostałych doświadczeniach zwierzęta wykazały 5-100% spadek wagi 4 dni po dawce 5-FU.

Pobór pokarmu zapisywano dla każdego zwierzęcia codziennie i oznaczono średni pobór pokarmu (fig. 4 i dane do fig. 4 poniżej). We wszystkich doświadczeniach, w których zwierzętom podano PHA przed dawką, zwierzęta wykazywały stały wzrost poboru pokarmu przed wstrzyknięciem 5-FU. Zwierzęta z grupy kontrolnej utrzymywały stały wzrost poboru pokarmu (wyniki nie przedstawione). Zwierzęta utrzymywane tylko na diecie laktoalbuminowej zmniejszyły swój pobór pokarmu około 1 dzień po otrzymaniu 5-FU. Zwierzęta, którym podawano PHa przed dawką przez 3 dni, utrzymywały stały pobór pokarmu około 7 g/dzień przez kolejne 4 dni po wstrzyknięciu 5-FU. Pozostałe zwierzęta doświadczalne wykazały znaczne zmniejszenie poboru pokarmu w kolejnych czterech dniach po podaniu 5-FU.

Pod koniec doświadczenia zwierzęta uśmiercono i wypreparowano. Oznaczono suche masy głównych narządów wewnętrznych każdego zwierzęcia i wyznaczono z nich średnie. Średnie suche masy głównych narządów wewnętrznych układu żołądkowo-jelitowego dla każdego z doświadczeń przedstawiono w tabeli 12.

Załącznik z danymi do rysunków

Figura 3. Skutek działania podawania 5-FU i PHA na masę ciała (g)

Nr grupy
l	2	3	4	5	6	7	8	9
1	nw	nw	nw	nw	nw	nw	nw	96,2
2	102,5	99,9	98,8	101,9	108	110,2	107,9	106,2

190 301 cd. tabeli

1	2	3	4	5	6	7	8	9
3	103,5	106,4	102,8	103,2	103,6	103,3	100,3	100,7
4	101,9	104	101	101	102,76	99,5	97,4	91,2

Fig. 4. Skutek działania podawania 5-FU i PHA na dzienny pobór pokarmu (g)

Dni	1	2	3	4	5	6	7
1	nw	nw	nw	nw	nw	nw	nw
2	4,8	6,22	9,22	11,3	10,4	6,8	5,9
3	4,8	6,3	9,2	7,7	8,5	7,7	8,3
4	4,42	6,4	8,3	5,7	2,28	2,14	4,4

Tabela 12

Średnie suche masy (mg) głównych organów układu zołądkowe-jelitowego po 7 dniach

Grupa	Żołądek	Jelito cienkie	Jelito czcze	Jelito krętne	Jelito ślepe	Okrężnica
1	141±6	887±28	185±1	151±8	124±4	147±6
2	140±7	509±55	90±8	94±11	99±11	130±l1
3	136±13	840±256	189±37	109±24	114±29	143±24
4	125±6	759±318	168±70	91±24	93±18	117±21

Grupy jak w tabeli 11.

Wyniki wykazały, że podawanie PHA przez i po podaniu 5-FU wywarło niewielki skutek na suchej masie żołądka. Jednakże, podawanie PHA wywarło skutek na suchą masę jelita cienkiego. Jeżeli w diecie znajdowała się tylko laktoalbumina, jelito cienkie było niszczone przez 5-FU i sucha masa zmniejszała się o prawie 50%. Jednakże, jeżeli PHA było podawane przez 3 dni, albo bezpośrednio przed (grupa 3), albo bezpośrednio przed i po (grupa 4) podaniu 5-FU, lektyny były w stanie ochronić jelito cienkie przed uszkodzeniem przez 5-FU i suche masy były podobne do kontroli.

W obrębie jelita cienkiego, zarówno tkanka jelita czczego jak i krętego były najbardziej podatne na zniszczenie pod wpływem 5-FU (tabela 12). Jednakże, jeżeli PHA było podawane przez 3 dni, albo bezpośrednio przed, lub bezpośrednio przed i po podaniu 5-FU, lektyny były w stanie wywołać na tkankę znaczące działanie ochronne, w szczególności na jelito czcze. Podawanie PHA przez 3 dni przed podaniem 5-FU także wywołało znaczący skutek ochronny na całe jelito cienkie (tabela 12). Podawanie PHA, albo bezpośrednio przed (grupa 3)), albo bezpośrednio przed i po (grupa 4) podaniu 5-FU, wywołało najlepsze działanie ochronne na tkankę. Wyniki te sugerują, że podawanie PHA jest w stanie stymulować wzrost i naprawę żywych komórek w jelicie cienkim oraz zapewnić ochronę przeciwko cytotoksycznym skutkom działania 5-FU.

Po 7 dniach pobrano od zwierząt próbki krwi i oznaczono kluczowe składniki cząsteczkowe i komórkowe. Wyniki przedstawiono w tabeli 13.

Tabela 13

Analiza kluczowych składników cząsteczkowych i komórkowych w krwi zwierząt kontrolnych i doświadczalnych

Grupa	WBC ilość/mmJ	RBC ilość/mmJ	HGB g/100 ml	HCT g/100 ml	MCV μπτ’	MCH pg	MCHC g/100 ml	PLT ilość/mm'’
1	5,5xl03	6x103	12,1	34,2	57,5	20,4	35,4	552x103
2	3xl03	7,4x103	12,7	37,1	50,4	17,3	34,3	274x103
3	2,4xl03	7, lxl03	13	34,7	48,7	18,2	37,4	296x103
4	4x103	7,4x103	13	35,1	47,8	17,7	37,1	32 1 x 103

190 301

Grupy jak w tabeli 11

WBC Białe ciakaa knvi

RBC Czewoone caałka kwvi

HGB Hemoglobina

HCT Hematokiyt

MCV Średnia objętość krwinki czerwonej

MCH Średnia zawartość l^e^n^c^gb^bn^y w krwince

MCHC Średnie stężeme hemoglobiny w kiwdnce

PLT Pytki

Po podawaniu 5-FU szczurom na diecie zawierającej laktoalbuminę zaobserwowano oczekiwaną cytotoksyczność zarówno w ilości białych ciałek krwi jak i płytek. W żadnym doświadczeniu nie zaobserwowano znaczącego wpływu na ilość czerwonych ciałek krwi, zawartość hemoglobiny i hematokryt, średnią objętość krwinki czerwonej lub średnie stężenie hemoglobiny w porównaniu z grupą kontrolną. Podawanie PHA bezpośrednio przed dawką 5-FU (grupa 3) wywarło niewielki wpływ na oznaczane parametry w porównaniu z grupą karmioną tylko laktoalbuminą (grupa 2). Podawanie PHA bezpośrednio przed i po dawce 5-FU (grupa 4) zwiększyło ilość białych ciałek krwi w porównaniu z kontrolną grupa laktoalbuminową.

Powyższe wyniki sugerują, że względne zgranie w czasie podawania doustnej dawki lektyn oraz dawki leku cytotoksycznego może wpłynąć na hematologiczną toksyczność leku.

Przykład 8

Identyfikacja zakresu dawki przy której PHA podane przed 5-FU chroni przewód żołądkowo-j elito wy przed zniszczeniem przez 5-FU.

Trzy grupy szczurów (po 5 osobników w grupie) karmiono dietą standardową (tabela 1) i codziennie podawano przez zgłębnik 200, 100 lub 50 mg/kg/dzień PHA przez 3 dni. Codziennie badano przyjmowanie pożywienia przez każdego szczura. Trzem kontrolnym grupom szczurów (po 5 szczurów w grupie) zastosowano dietę standardową oraz 1 ml soli przez zgłębnik codziennie przez 3 dni. Każde zwierzę z grupy kontrolnej miało swój odpowiednik w grupie karmionej PHA. Rano czwartego dnia doświadczenia każdemu zwierzęciu wstrzyknięto 150 mg/kg masy ciała 5-FU, a następnie zastosowano dietę standardową przez 6 dni. Dwa szczury były na diecie standardowej w dowolnej ilości przez 9 dni. Dziewiątego dnia szczury uśmiercono i wypreparowano. Po zamrożeniu w ciekłym azocie oznaczono masy mokrych tkanek.

Tabela 14

Wpływ podawania 200, 300 i 50 mg/kg/dzień PHA przez 3 dni przed podaniem 5-FU na mokre masy jelita czczego i jelita krętego (mg) po podaniu dawki 150 mg/kg/BW 5-FU.

Traktowanie	Jelito czcze (mg)	Jelito kręte (mg)
Nie wstrzykiwane	1006	909
PHA 200 mg/kg/dzień	1031	778
Kontrolna do 200 mg/kg/dzień	848	753
PHA 200 mg/kg/dzień	984	800
Kontrolna do 100 mg/kg/dzień	783	747
PHA 50 mg/kg/dzień	989	757
Kontrolna do 50 mg/kg/dzień	761	722

Przy podaniu dawki 200 mg/kg/dzień PHA przed wstrzyknięciem zaobserwowano znaczące działanie ochronne w jelicie czczym w porównaniu z próbką w której nie wstrzykiwano 5-FU oraz z grupą kontrolną (tabela 14). Przy obniżeniu dawki PHA do 100 lub 50 mg/kg/dzień nadal obserwowano znaczącą ochronę jelita czczego w porównaniu z próbką w której nie wstrzykiwano 5-FU oraz z grupą kontrolną. W tkance jelita krętego PHa nie wywarło działania ochronnego dla dawek przebadanych w porównaniu z próbką kontrolną

190 301 w której nie wstrzykiwano 5-FU. Jednakże, w każdym wypadku zwierzęta, którym podano PHA przed podaniem 5-FU, miały więcej tkanki jelita krętego w porównaniu z grupą kontrolną.

Powyższe przykłady demonstrują, że chemioterapia może poważnie pogorszyć wzrost i żywotność zwierzęcia. Manipulacja dietą, a w szczególności dodanie lektyn przed i po podaniu leku cytotoksycznego może wywołać ochronę przeciwko chemioterapii. W szczególności, ochrona ta jest skierowana w stronę wzrostu i żywotności tkanek żołądkowo-jelitowych. Ochronę tkanek żołądkowo-jelitowych po podaniu leku cytotoksycznego zaobserwowano przy dawkach lektyn od 200 mg/kg/dzień do 50 mg/kg/dzień.

Przykład 9

Przebadano zdolność PHA do ochrony przed letalną dawką napromieniania, a w szczególności jej właściwości ochronnych wobec jelita.

grup po 12 albinotycznych samców myszy naświetlono 6,75 Gy (0,3 Gy/min). Każdą grupę myszy hodowano w warunkach dokładnie ustalonej diety przez 30 dni (tabela 15).

Tabela 15

Schemat żywienia użytych ośmiu grup myszy

Nr grupy myszy	Schemat żywienia
Grupy naświetlane
1	SD2d LA3d SDlld	*ir*LA14d
2	SD2d LA3d	*ir*PHA7d LA7d SDlld
3	SD2d LAl,5d FTl,5d	*ir*PHA7d LA7d SDlld
4	SD2d LA2d PHAld	*ir*PHA7d LA7d SDlld
5	SD2d PHA3d	*ir*PHA7d LA7d SDlld
Kontrolne
6	SD2d LA3d	LA14d SDlld
7	SD2d LA2d	PHAld PHA7d LA7d SDlld
8	SD2d PHA3d	PHA7d LA7d SD1 ld

SD - standardowa dieta dostępna w handlu (Charles River Ltd., Biplan Ltd, Isaszeg, Węgry).

LA - dieta laktoalbuminowa. Półsyntetyczna dieta o znacznym składzie przedstawiona w tabeli 1 (wolna od lektyn) opracowana w laboratorium. Laktoalbuminę uzyskano do Sigma (Poole, Dorset).

PHA - dieta fasolowa. Dieta o znanym składzie przedstawiona w tabeli 1 (zawierająca lektynę z fasoli, PHA) opracowana w laboratorium. Źródłem fasoli była odmiana „Procesor” (jakikolwiek inna odmiana Phaseolus vulgaris zawierająca PHA jest równie przydatna).

FT - głodzenie (brak diety) *ir* - czas naświetlania

Oznaczono ilość myszy, które przeżyły po 30 dniach oraz ich średnią masę ciała.

Figura 5 przedstawia skutek stosowania diety na przeżycie zwierząt po 30 dniach. Kontrolne zwierzęta nie naświetlane z grup 6, 7 i 8 nie wykazały związku pomiędzy podawaniem diety standardowej, laktoalbuminowej i fasolowej z przeżyciem. Umieralność nie wystąpiła. Przeciwnie, zwierzęta naświetlane w grupach 1, 2 i 3 karmiowe dietą standardową i laktoalbuminową oraz PHA poddanym po naświetlaniu wykazały znaczną umieralność (grupa 3 z okresem głodzenia). Tylko 2 zwierzęta z grup 1 - doświadczenie.

U zwierząt karmionych dietą zwierającą PHA na krótko przed naświetlaniem (grup 4 i 5) stwierdzono zwiększone przeżycie. Ilość zwierząt, które przeżyły była ściśle związana z długością okresu czasu, przez jaki zwierzęta otrzymywały dietę PHA bezpośrednio przed naświetlaniem.

190 301

Tabela 16

Średnia masa ciała zwierząt po 30 dniach

Nr grupy myszy	Średnia masa ciała (g ± odchylenie standardowe)
1	29,9
2	29,6
3	-
4	23,0±5,63
5	30,12± 1,83
6	31,88±2,02
7	31,18±1,46
8	31,03±2,11

Po 30 dniach zwierzęta w grupach kontrolnych 6-8 ważyły 30 - 32 g (tabela 16). Zwierzęta w grupach 1-3 wykazały wysoką śmiertelność. Jednakże, zwierzęta w grupach 4 i 5 wykazały zwiększenie masy ciała w porównaniu z okresem czasu gdy zwierzęta były karmione dietą zawierającą PHA przed naświetlaniem. W grupie 5 (3 dni diety zawierającej PHA przed naświetlaniem) średnia masa ciała była podobna jak w grupie kontrolnej. Podawanie PHA w diecie w przebadanych dawkach nie miało znaczących skutków. Kiedy podano lektynę przed naświetlaniem obserwowano znaczące działanie ochronny PHA.

Po naświetlaniu zwierząt oznaczono dla każdej grupy średnie mokre masy jelita cienkiego, śledziony i jąder (tabela 17). Nie oznaczono średnich mas dla grupy 7.

Tabela 17

Masy jelita cienkiego, śledziony i jąder (mg± błąd standardowy) myszy, które przeżyły

Nr grupy myszy	Jelito cienkie	Śledziona	Jądra
1	999,8	72,5	49,4
2	1335,2	176,5	62,0
3	-	-	-
4	1032,0±266,7	105,2±25,7	53,6± 1,6
5	1312,3±258,4	111,4±37,4	62,8±8,9
6	1477,3±111,1	117,8^13,5	208,0+36,5
7	nw	nw	nw
8	1522,2+159,3	107,8±15,4	194, 5±18,8

- oznacza, że jest brak danych, gdyż żadna mysz nie przeżyła nw oznacza, że nie zanotowano żadnych wyników

Wyniki te wykazały, że tkanka jąder jest najbardziej wrażliwa na działanie promieniowania. Podawanie PHA przed lub po naświetlaniu wywierało mniejszy skutek na wzrost jąder.

W grupach 1 -3 stwierdzono niskie przeżycie po naświetlaniu. Wyniki dla grup 4 i 5 sugerują zależny od dawki wzrost masy jelita cienkiego związany z długością okresu czasu w którym zwierzęta otrzymywały dietę PHA przed naświetlaniem. Średnia masa śledziony z grup 4 i 5 była zbliżona do kontroli.

Przykład ten wykazuje, że naświetlanie w widoczny sposób wpływa na żywotność zwierząt oraz, że sterowanie dietą można zastosować w celu zmodyfikowania stopnia w jakim naświetlanie wpływa na żywotność zwierząt. Głodzenie przed naświetlaniem nie wywołuje

190 301 ochrony przed skutkami naświetlania, a nawet może być niekorzystne. PHA zawarty w diecie nie wywiera żadnego zdecydowanego wpływu na mierzone parametry (grupy 7 i 8 w porównaniu z grupą 6), a tkanka jąder zwierząt przebadanych była najbardziej podatna, w znaczeniu utraty masy, na uszkodzenia pod wpływem naświetlania. W opisanym przykładzie podawanie PHA przed naświetlaniem powodowało ochronę przeciw uszkodzeniom pod wpływem promieniowania, którego stopień okazał się być zależny od czasu podawania PHA.

Publikacje

E. Archimund i X. Thomas (1994 r.). Administaaiion of cytotoxic agents by coniinuous infusion in the therapy of acute myeloid leukemia. Journal of Infusional Chemotherapy, 4, str. 3-8;

E. Au, W.H. Koo. E.H. Tan i P.n . sAng, (1996 r.). A PhA e II taial of efofosidp, seucovorin and 5-Fluorouracil (ELF) in βatie9St with advanced gastric cancer. Journal of Chemotherapy, 8, str. 300-303;

S. Bardocz, D.S. Brown, G. Grant, a. Pusztai, TC. Stewart i R.M. Palmer 0992 r.). Effect of the β-adrenores9βtor agonist clenbuterol and phytohaemagglutinin on growth, protein tynsh9sis and polyamine metabolism of tissues of the rat. British Journal of Pharmacology 106, str. 476-482;

A.F.F.U. de Wa2valho, (1993 r.f Distaγf kidnyy bean tatim s offesS msuim ee-elss , chnngs gene expression and modulate metabolism. Ph.D. Shesit; UniversiSγ of Aberdeen;

V. Dieras i P. Pouillart (1995 r.f. 9fUust9nal c99mota2aβγy wita ews ruggs: Txx99CS, vinorelbine and toβoitomerαs9 l inhibitora. Journal of Infusional Chemotherapy, 5, str. 191-192;

J. Denekamp (1996 rn). The broad ppectaum cif prechmcal aadtobtotogy : Brttiih contaibutiont. International Journal ofRadiation Oncology, Biology & Physics. 36, str. 497-509;

M. Erkisi, E. Erkurt, S. Ozbarlas, R. Burgut, F. Doran i E. Seyrek (1996 r.). The ues of recombinant human 9ranulosγSe colony-stimulating factor in combination with single or fracsio9asrd doses of isofamide and doxorubicin in patients with soft tissue sarcoma. Journal of Chemotherapy, 8, str. 224-228;

n. Grant, N.H. McKenzie, W.B. Watt, J.W. Stewart, P.M. Dorward i A. Pusztai, (1986 rf Nutritional ^aluation of soya beans (Glycine max): Nitrogen balance and fractionation studies. Journal of the Science of Food and Agriculture, 37, str. 1001-1010;

n. Grant, J.T.A. de Olweira, P.M. Dorward, M.G. Annand, M. Waldron i A. Pusztai, (1987 r.). Melaboiśc and homoonal chnigee ns rass ^^ultin^g from consumption of kddney bean (Phaseolus vulgaris) or soyabean (Glvcine max). Nutritional Reports International 36, str. 763-772; '

n. Grant, P.M, Ποι-ιππιό i A. Puntai, 0993 rj Pancreatic enicrenment is nv ident ΐη rats Fed diets containing raw soybean (Glycine max) or cowpeas ( Vigna unguiculata) but not tanse fed diets based on kidney beans (Phaseolus vulgaris) or lupinseed (Luinas augustlfalinus). Journal ofNutrition 123, Str. 2207-2215;

Y. P. Gupta, (1987 r.) Nutritite value of toybean. International Journal of Tropical Agriculture, 5, str. 247-279;

Gy. Haj os, E. A. Pusztai, G. Grant, M. Sakhri i S. Bardocz, (1995 r.) Βίο^ιϊ^Ι effects and survival of trypsin i9hibitort and the agglutinin from soybean in the small intrttine of the rat. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 43, str. 165-170;

N. Harboe i A. inglid, (1973 r.) Immunization, isolation of immunoglobulins, estimation of antibody titre. ln A Manual of Quantitative immunoelectrophoresis, Methods and ApplicaSϊont; (pod redakcją N.H. Axelsen, J. Kroll i B. Wrekr) Scan-dinavian Journal of Immunology, (załącznik 1), str. 161-164;

W. H. Isacoff, R. Frederick, S.L. Kuchenbecker, A.D. Jacobs i O. Taylor, (1994 rj. WonSinsrus infusion 5-fluorouracil giten with calcium luucotorin, dipyridamole, and Mitomycin-W in patients with xdvancer colerectal carcinoma: A Phase ll trial. Journal of Infusional Chemotherapy, 4, str. 107-111;

l. E. Liener, (1924 O Imp lii^mtilma of anrinxtritisnat r9mpon9prs en s oybern foodf. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 34, str. 31-67;

190 301

J. C. Macrae, L.A. Bruce, F.B. de B. Hovell, I.C. Hart, J. Inkster, A. Walker i T. Atkinson, (1991 r.). Influence of protein nutrition on the response of growing lambs to exogenous bovine growth hormone. Journal of Endocrinology 130, str. 53-63;

R. M. Palmer, A. Pusztai, P. Bain i G. Grant, (1987 r.). Changes in rates of tissue protein synthesis in rats induced in vivo by consumption of kidney bean lectins. Comparative Biochemistry and Physiology 88C, str. 179-183;

F. Paulsen, W. Hoffmann, R.D. Kortmann, R. Porschen i M. Bamberg, (1996 r). Akute gastrointestinal Nebenwirkungen in der Radioonkologie - Was ist gesichert in der Therapie?. Strahlenther. Onkol. 172, str. 53-56 (Nr 2);

D. K. Podolsky, (1993 r.). Regulation of intestinal epithelial proliferation: a few answers, many questions. Am. J. Physiol. 264, str. G179-G186;

A. Pusztai, (1993. r.). Plant Lectins. Cambridge: Cambridge University Press;

A. Pusztai i R.M. Palmer, (1977 r.). Nutritional evaluation of kidney bean (Phaseolus vulgaris): the toxic principle. Journal of the Science of Food and Agriculture 28, str. 620-623;

A. Pusztai, F. Greer i G. Grant, (1989 r.). Specific uptake of dietary lectins into the systemic circulation of rats. Biochemical Society Transactions 17, str. 481-482;

A. Pusztai, G. Grant, R.J. Spencer, T.J. Duguid, D.S. Brown, S.W.B. Ewen, W.J. Peumans, E.J.M. Van Damme i S. Bardocz, (1993 r.). Kidney bean lectin-induced Escherichia coli overgrowth in the small intestine is blocked by GNA, a mannose-specific lectin. Journal of Applied Bacteriology 75, str. 360-368;

J. J. Rackis, W. J. Wolf i E.C. Baker, (1986 r.) Protease inhibitors in plant foods; content and inactivation. In Nutritional and Toxicological Significance of Enzyme Inhibitors in Foods (pod redakcją M. Friedman) Plenum Press, New York, str. 299-331;

J. A. Sparano i P.H. Wiemik, (1994 r.). Infusional cyclophosphamide-based therapy for the treatment of lymphoma. Journal of Infusional Chemistry, 4, str. 28-32;

G. G. Steel, (1996 r.). From targets to genes: a brief history of radiosensitivity. Phys. Med. Biol., 41, str. 205-222;

P. Trinder, (1967 r.). Determination of glucose in blood using glucose oxidase with an alternative oxygen acceptor. Annals Clinical Biochemistry 6, str. 24-27;

H. K. Van Halteren, E. Gortzak, B.G. Taal, Th. J. M. Helmerhorst, B.M.P. Aleman, A.A.M. Hart i F.A.N. Zoetmulder, (1993 r.). Surgical intervention for complications caused by late radiation damage of the small bowel: a retrospective analysis. European Journal of Surgical Oncology, 19, str. 336-341;

E. Yeoh, M. Horowitz, A. Russo, T. Muecke, A. Ahmad i B. Chatterton, (1993 r.). International Journal of Radiation Oncology, Biology & Physics, 26, str. 229-237.

190 301

190 301

Zmiana wagi (g)

190 301

I-ΟΜΓΟ-J «Hi

Waga (g)

CO

O

Li.

190 301 iH

•<r o

U_

190 301 >.

Ο w

to e

α» w

c §

o

N Φ 'o .fc s

Ci E CL g ra cl C 2 θ' > C m

H φ 'Ξ *55* co o P.<£ >> 2 E •I o 5 tj ra o

Ś* ro '5 = >2 Jc' CO

-2- ° δ o.

&

w

E >»

CL

Ł—

O)

k.

z

LO

O

Ll

190 301

a>

Ή

Τ3 £ χι σ> τ— ε

i <2

I LL σ>

ο

Względna sucha masa ciała

c ω

'n n

X

Q_ o>

E re re

O □

o

LL

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (17)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zastosowanie lektyn do wytwarzania leku do zmniejszania i/lub leczenia uszkodzeń komórek śluzówkowych spowodowanych przez radioterapię, środek chemioterapeutyczny lub ich połączenie.
2. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że uszkodzenie stanowi uszkodzenie jelit i/lub zapalenie śluzówki.
3. 3. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że lek zmniejsza i/lub leczy uszkodzone komórki i/lub tkanki ssacze, w szczególności uszkodzone komórki i/lub tkanki ludzkie.
4. 4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że komórki i/lub tkankę stanowią śluzówkowa wyściółka jelit, jamy ustnej, przewodu nosowego, przełyku, żołądka, płuc, jelita cienkiego, jelita grubego, w tym okrężnicy, tkanka nabłonkowa, taka jak przykrywająca oko, oraz inne komórki i tkanki śluzówkowe.
5. 5. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że uszkodzenia komórek śluzówkowych zostały spowodowane poprzez radioterapię, w której stosuje się promienie rentgenowskie, promienie γ, źródło promieniowania protonowego, źródło promieniowania neutronowego, źródło emitujące promieniowanie a, źródło emitujące promieniowanie β albo połączenie dwóch lub większej ich liczby.
6. 6. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 5, znamienne tym, że uszkodzenia komórek śluzówkowych zostały spowodowane środkiem chemioterapeutycznym, którym jest 5-fluorouracyl, cisplatyna, doksorubicyną, metotreksat, taksol lub połączenie dwóch lub większej liczby tych środków.
7. 7. Zastosowanie lektyny według zastrz. 1, znamienne tym, że lektyna pochodzi z fasoli, soi, fasoli Jaś, kiełków pszenicy, nasion lotosu, cebuli, soczewicy, pomidorów, ziemniaków lub stanowi połączenie lektyn pochodzących z dwu lub większej liczby tych źródeł.
8. 8. Zastosowanie lektyny według zastrz. 1, znamienne tym, że lektynę stosuje się w połączeniu z cytoprotektantem.
9. 9. Zastosowanie lektyny według zastrz. 8, znamienne tym, że cytoprotektantem jest radiosensybilizator, chemioprotektant, czynnik wzrostu lub połączenie dwóch lub większej liczby takich środków.
10. 10. Zastosowanie lektyny według zastrz. 9, znamienne tym, że radiosensybilizatorem jest mimetyk witaminy K, sól gadolinowa teksafiryny, jobenguan lub połączenie dwóch lub większej liczby takich środków.
11. 11. Zastosowanie lektyny według zastrz. 9 albo 10, znamienne tym, że chemioprotektantem jest Sulcraphate, cysteina, cysteamina, Ethyol, balazipon, dosmalfat, WR 3689 (diwodorofosforan (2-[[3-metyloamino]propylo]amino)etanotiolu), AD 20 (kwas (2-[[2-metoksyfenylo]acetylo]amino]-2-propenowy), przeciwutleniacz nitroksydowy lub połączenie dwóch lub większej liczby takich środków.
12. 12. Zastosowanie lektyny według zastrz. 9 albo 10, znamienne tym, że czynnikiem wzrostu jest czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów, czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów, erytropoetyna, naskórkowy czynnik wzrostu, czynnik wzrostu keratynocytów, transformujący czynnik wzrostu, interleukina, insulinopodobny czynnik wzrostu, czynnik wzrostu nerwów, komórkowy czynnik wzrostu pochodzący z płytek, bombezyna, relaksyna, kalcytonina, czynnik wzrostu pochodzący z siary, amleksanoks, amoksanoks, protegryna, chlorowodorek pilokarpiny, czynnik komórek macierzystych układu krwiotwórczego, trombopoetyna, czynnik Steela, dowolny interferon, w tym interferon a, dowolna cytokina lub połączenie dwóch lub większej liczby takich środków.
13. 13. Środek farmaceutyczny znamienny tym, że zawiera lektynę i cytoprotektant, który stanowi radiosensybilizator, chemioprotektant, czynnik wzrostu lub połączenie dwóch lub większej liczby takich środków.

    190 301
14. 14. Środek farmaceutyczny według zastrz. 13, znamienny tym, że jest przeznaczony do równoczesnego, oddzielnego lub kolejnego stosowania w profilaktyce lub leczeniu uszkodzeń wywołanych czynnikiem uszkadzającym komórkę.
15. 15. Środek farmaceutyczny według zastrz. 13 albo 14, znamienny tym, że zawiera lektynę oczyszczoną lub wyizolowaną.
16. 16. Środek farmaceutyczny według zastrz. 13, znamienny tym, że zawiera lektynę pochodzącą z nasion fasoli, nasion (lub serwatki) soi, fasoli Jaś, kiełków pszenicy, nasion lotosu, cebuli, soczewicy, pomidorów, ziemniaków albo połączenia lektyn z dwóch lub większej liczby takich źródeł.
17. 17. Środek farmaceutyczny według zastrz. 13, znamienny tym, że zawiera lektynę w stężeniu zapewniającym podawanie 0,3 g - 0,1 pg/kg masy ciała na dzień, korzystnie 1 mg 0,15 pg/kg masy ciała na dzień.