CZ20003541A3 - Steroidní sapogeniny a jejich deriváty pro léčbu Alzheimerovy nemoci - Google Patents

Abstract

Použití saponinů a sapogeninů, zejména těch, které mají steroidní strukturu, při léčbě kognitivní dysfunkce, Alzheimerovy nemoci a podobných stavů. Také jsou popsány farmaceutické prostředky.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká receptorů vázaných na membránu a jejich funkce; kognitivní dysfunkce a příbuzných stavů; jejich léčby; a prostředků pro použití v takové léčbě. Přesněji se předkládaný vynález týká léčby stavů, které jsou charakterizované deficitem počtu nebo funkce receptorů vázaných na membrány. V následujícím popisu bude vynález popsán v souvislosti s léčbou Alzheimerovi nemoci (AD) a senilní demence Alzheimerova typu (SDAT), při kterých byl prokázán deficit mnoha typů receptorů. Nicméně, je třeba si uvědomit, že předkládaný vynález se týká obecně léčby stavů způsobených vnitřními patologickými stavy a/nebo nežádoucími vnějšími vlivy, které jsou charakterizovány deficitem počtu nebo funkce receptorů vázaných na membrány nebo deficitem v přenosu signálu ve spojeních mezi neurony nebo ve spojeních mezi neurony a efektorovými buňkami.

Dosavadní stav techniky

Mezi stavy uvedené výše patří Parkinsonova nemoc, demence spojené s tvorbou Lewyho tělísek, posturální hypotenze, autismus, chronický únavový syndrom, myastenia gravis, ‘ Lambert-Eatonova nemoc, onemocnění a potíže spojené se syndromem války v zálivu, expozice organofosfatům a problémy spojené se stárnutím.

Alzheimerova nemoc (AD) a senilní demence Alzheimerova typu (SDAT) jsou závažnými a narůstajícími problémy ve všech společnostech, ve kterých dochází z důvodů zvýšení • · · · • · i

předpokládané doby života a kontroly získaných nemocí ke stoupání demografickému profilu směrem ke starší populaci. Existuje potřeba činidel, která budou léčit nebo zlepšovat léčbu AD/SDAT.

Zhoršení paměti spojené se stárnutím (AAMI) je charakteristické pro staré pacienty, kteří mají ztrátu paměti za normálního psychologického a fyzického stavu. Jedná se o špatně definovaný syndrom, ale činidla účinná v léčbě AD(SDAT mohou být přínosem také pro tyto pacienty.

Výzkumy AD/SDAT jsou prováděny tradičními a běžnými způsoby lékařského výzkumu. V běžné medicíně existuje několik přístupů pro léčbu AD/SDAT. Je známo, že biochemické procesy paměti v mozkové kůře jsou (alespoň částečně) zprostředkovány cholinergně. Odborníkům v oboru je znám, že cholinergně zprostředkované mechanismy jsou přímo způsobeny působením acetylcholinu na receptory. Jiné klinicky použitelné efekty mohou být způsobeny také modulací uvolňování acetylcholinu z presynaptických nervových zakončení nebo inhibici enzymů degradujících acetylcholin. Tyto modulační faktory mohou působit prostřednictvím neuronů, ve kterých je mediátor noncholinergní; tyto efekty jsou označovány jako nepřímé efekty. Několik léčebných pokusů bylo zaměřeno na úlohu jiných mediátorů, jako je 5-hydroxytryptamin, který je mediátorem v jiných oblastech mozku, jako jsou například jádra středního mozku. Nicméně, protože nervová vlákna z těchto oblastí vedou směrem k mozkové kůře, ve které je primárním neuropřenašečem acetylcholin, byla pozornost zaměřena na ovlivnění tohoto mediátorů a na vyhledávání činidel ovlivňujících tento mediátor.

9»* • · ······· ···········

J · · ······· • · · · ···«· · »

Cholinergní strategie pro léčbu AD/SDAT byla zaměřena na několik míst dráhy pro výrobu, synaptické uvolňováni a odstraňováni uvolněného acetylcholinu.

Jeden přistup obsahuje léčbu vysokými dávkami lecitinu nebo jiného prekursorů acetylcholinu. Tento postup má omezené použiti pro dosaženi dlouhodobého zlepšeni kognitivní výkonnosti.

Jiný přístup obsahuje použití rostlinných léků jako je extrakt z kořenu Polygalae, u kterého bylo prokázáno, že zvyšuje aktivitu cholin-acetylcholin transferasy (CAT) a sekreci nervového růstového faktoru (NGF) v mozku. Orální podání NGF nemá žádný vliv na neurony centrálního nervového systému z důvodů vysoké molekulové hmotnosti proteinu, který neprochází hematoencephalickou barierou. Nicméně, činidla procházející hematoencephalickou barierou, která mohou stimulovat syntézu NGF v centrálním nervovém systému byla navržena pro zlepšení chování souvisejícího s pamětí.

Výsledky třetí klinické strategie, která využívá inhibitory cholinesterasy, jako je tacrin hydrochlorid, byly lepší než výsledky předchozích dvou strategií. Bylo prokázáno, že substance získané z rostlin používaných v čínské a západní medicíně, jako je například huperzin, galanthamin a physostigmin, mají všechna určitý - ačkoliv omezený - příznivý účinek při léčbě AD/SDAT v klinických studiích a v laboratorních modelech. Všechny tyto substance jsou inhibitory acetylcholin esterasy (AChE). U pacientů s AD/SDAT může být přítomná snížená syntéza acetylcholinu (Ach), snížená účinnost uvolňování Ach z presynaptických vesikul a snížený počet nebo snížená funkčnost postsynpatických (Mi) receptorů. Také bylo pozorováno snížení počtu presynaptických M2 receptorů. Příznivý

A A A • · · · · ·

AAA A · A · * • A AAA A. A · · • · · ·· AAA AA A • A AAA A AAA • AA · AAA · A AA AA účinek inhibitorů AChE se přičítá zvýšení koncentrace acetylcholinu v synapsích v mozku, které je způsobeno zpomalením degradace uvolněného přenašeče.

Je známo, že prostředky ovlivňující cholinergní funkce ovlivňují paměť a vybavovací schopnosti. Například, nikotin stimuluje nikotinové acetylcholinové receptory a předpokládá se, že krátkodobé zlepšení paměti při kouření cigaret je způsobeno efektem nikotinu. Skopolamin, antagonista acetylcholinu, vyvolává amnesii a narušení kognitivních funkcí projevující se v psychomotorických testech jako prodloužení jednoduché reakční doby, pravděpodobně v důsledku snížené pozornosti, a je používá pro tento účel jako pomocný lék při analgetické terapii. Amnestický efekt skopolaminu může být antagonizován nikotinem.

Existují dvě podrodiny nikotinových receptorů (a a β) , které každá obsahují čtyři podtypy lišící se ve specificitě pro ligand. Úloha nikotinových receptorů v CNS není na molekulové úrovni dobře prozkoumána. Je možné, že činidla vážící se na nikotinové receptory mohou modifikovat rychlost obratu na muskarinových receptorem v mozku. Nikotinové receptory jsou iontové kanály otevírané po navázání ligandu a jejich aktivace způsobuje rychlé (v řádu milisekund) zvýšení buněčné permeability pro Na⁺ a Ca⁺⁺, depolarizaci a excitaci.

Jiná třída cholinergních receptorů může být stimulována muskarinem. Takové muskarinové (M) receptory jsou receptory spřaženými s G-proteinem. Odpověď muskarinových receptorů je pomalejší a může se jednat o excitační nebo inhibiční odpověď. Nejsou nutně vázány na změny propustnosti pro ionty.

Klonováním cholinergních receptorů bylo zjištěno pět typů muskarinových receptorů, které byly označeny mi-ms.

• · · · ·«> · ·

Farmakologické účinky jsou spojeny se čtyřmi klonovanými receptory, které jsou označeny M1-M4 podle farmakologické specificity.

Díky použití specifických receptorových proteinů a monoklonálních protilátek bylo možné dále lokalizovat muskarinové receptory v mozku jako mi (postsynaptické) a m.2 (presynaptické). V srdci jsou M2 receptory postsynaptické. Předpokládá se, že presynaptické muskarinové receptory jsou inhibiční, protože vazba Ach na tyto receptory inhibuje uvolňování dalšího Ach, což způsobuje negativní zpětnou vazbu pro uvolňování Ach. Selektivní antagonisté M2 receptoru, které jsou přednostně distribuovány do mozku, mohou být proto použitelné pro léčbu Alzheimerovi nemoci.

Je známo, že při onemocněních jako je AD/SDAT, je přítomné všeobecné snížení počtu neuronů a deficit funkce cholinergních nervů. Předpokládá se, že vysoce-afinitní nikotinová vazebná místa na zbývajících neuronech mohou být při léčbě takových onemocnění přeměněna na na nízkoafinitní vazebná místa, což zpomalí uvolňování neuropřenašeče. Snížení afinity nikotinových vazebných míst zabraňuje rychlé desenzibilizaci.

Aktivace nikotinových receptorů v mozku agonisty má rychlý nástup účinku a rychlé odeznění účinku. Snížená afinita nikotinových receptorů snižuje desenzibilizaci. Schwarz, R.D.

>. et al. (J. Neuro. Chem. 42 (1984), 1495-8) prokázali, že na cholinergních (a také 5-hydroxytryptaminergních a katecholaminergních) axonálních zakončeních jsou nikotinová vazebná místa lokalizována presynapticky. Změny ve vysoceafinitních vazebných místech při AD/SDAT může také indukovat změnu v modulačním účinku nikotinových vazebných míst na jiné systémy přenašečů.

··· · · «· * • · · · · « · • · ··· · · · • · · · · · · • · · ·· · · ··

Presynaptické cholinergní mechanismy jsou také pod inhibiční kontrolou zprostředkovanou GABA-ergními neurony a předpokládá se, že tato inhibice je zesílena při AD/SDAT. Odstranění nebo snížení této inhibice zesiluje presynaptickou korovou cholinergní aktivitu a zlepšuje kognitivní funkce.

Interakce mezineuronových výběžků inervovaných nikotinem (snížení vazebné afinity) a de-inhibice GABAergních vláken mají obě presynaptický lokus.

Toto je zjednodušený model působení přenašečů v centrálním nervovém systému, ale poskytuje rámec pro porozumění pokusům, které byly provedeny pro zvýšení účinné koncentrace acetylcholinu v centrálních synapsích. Dále ilustruje koncept přímého a nepřímého působení. Existují nevýhody spojené s třemi běžnými terapeutickými přístupy pro léčbu AD/SDAT, které byly uvedeny výše: dodávání prekursorů Ach, podávání agonistů a inhibice acetylcholinesterasy. Tyto způsoby léčby mohou vést ke krátkodobému zvýšení dostupnosti Ach, které může aktivovat zpětnovazebně mechanismy, které mohou vést k desenzibilizaci postsynaptických receptorů. Teoreticky nemůže být dosaženo dlouhodobého zlepšení a při přerušení léčby jakýkoliv přínos léčby AD/SDAT a AAMI odezní a stav se může ještě zhoršit.

Bylo prokázáno, že sloučeniny s Mi agonistickou a M2/M3 antagonistickou aktivitou zlepšují kognitivní výkonnost u pacientů se SDAT (Sramak et al., Life Sciences, svazek 2, č.

3, 195-202, 1997). Nicméně, tyto sloučeniny mají nepřijatelné cholinergní vedlejší účinky, jako je únava, průjem a nevolnost.

φ · · · · · · »·· · · ·· « • · · ♦ » · · « · · « φ φ ·· φ • · · · · · · ··* * φ · · φ·

Radikálnější přístup pro léčbu AD/SDAT a AAMI má za cíl zvýšení počtu postsynaptických (Mi) receptorů v mozku. Z čínského patentu č. CN1096031A je známo, že sarsapogenin (SaG) může zvyšovat počet Mi cholinergních receptorů v mozku a také snižovat počet (t.j. směrem k normální úrovni) β-adrenergních receptorů, jejichž počet může být při AD/SDAT patologicky zvýšen.

Podstata vynálezu

Vynálezci objevili mnoho saponinů a sapogeninů, které mají schopnost regulovat receptory. Proto v jednom aspektu vynález obsahuje použití jedné nebo více substancí ze skupiny zahrnující smilagenin, anzurogenin D a astragalosid pro výrobu léku pro léčbu stavů charakterizovaných deficitem počtu nebo funkce postsynaptických receptorů vázaných na membránu.

Odborníkům v oboru bude znám vztah mezi saponiny a jejich sapogeniny a bude jim jasné, že požadovaný účinek sapogeninů může být dosažen u pacientů po podání příslušných saponinů nebo jejich směsi. Hydrolýza alespoň části saponinů probíhá v gastrointestinálním traktu. Odborníkům v oboru bude také známá epimerizace některých sapogeninů za podmínek kyselé hydrolýzy.

Ne všechny saponiny a/nebo jejich aglyklony jsou vhodné pro léčbu AD/SDAT a některé z nich, jako jsou saponiny a sapogeniny z náprstníku, mají silné inotropní účinky na myokard. Zdá se, že tato skupina saponinů nemá žádný vliv na centrální nervový systém (CNS), který by mohl být využit při terapii AD/SDAT; jejich účinnost a toxicita při vyšších dávkách také toto použití vylučují.

« · · «

Některé ze základních sapogeninů mají následující obecný • · · · · · «· · · · · · · « · φ • * ♦ · · · · · · • φ ♦ ·······« φφ φ · · · · φ φ «φφ φ φφφ «φ φ · φφ

S odkazem na tento obecný vzorec je struktura některých sapogeninů uvedena v následující tabulce:

Sloučenina	A/B kruh cis/trans/nena sycený stav	Stereochemické uspořádání C25 methylu (R nebo S)	Hydroxylová skupina na spirostanovém kruhu
Sarasapogenin	cis	S	3β-ΟΗ
Smilagenin	cis	R	3β-ΟΗ
Anzurogenin D	trans	R	3B-OH, 5α-0Η, 6β-ΟΗ
Sisalgenin	trans	S	3β-ΟΗ (C=O na C12)
Trigogenin	trans	R	3β-0Η
Diosgenin	Δ5	R	3β-0Η
Ruscogenin	Δ5	R	Ιβ-ΟΗ, 3β-0Η

Odlišnosti farmakologických vlastností a farmakodynamického působení různých typů sapogeninů podtrhují nutnost výběru těch činidel, která jsou nejužitečnější pro léčbu AD/SDAT. Objev nových faktů týkajících se působení SaG umožnil stanovení • φ φ φ

• φφ* φ φ φφ φ • φφφ φφφφ • · · · a Φ* φ* φ • φφφ φ φφφ • φ φφφ·φ ·φ ₉₉ toho, které substance jsou nejužitečnější pro léčbu AD/SDAT a podobných onemocnění.

Saponiny a sapogeniny, které jsou nejvýznamnější pro některé aspekty předkládaného vynálezu, se vyskytují v mnoha druzích rostlin, zejména z čeledi Smilax, Asparagus, Anemarrhena, Yucca a Agáve. Nejvýznamnějšími druhy jsou Smilax regelii Kilip and Morton - běžně známý jako Honduraský přestup; Smilax aristolochiaefolia Miler - běžně známý jako Mexický přestup; Smilax ornata Hooker - běžně známý jako Jamaiský přestup; Smilax aspera - běžně známý jako Španělský přestup; Smilax glabra Roxburgh; Smilax febrifuga Kunth běžně známý jako Ekvádorský nebo Peruánský přestup;

Anemarrhena asphodeloides Binge; Yucca schidigera Roezl ex Ortigies; a Yucca brevifolia Engelm. Vhodné saponiny a sapogeniny se vyskytují také v rostlinách jiných čeledí, například Dioscorea, Trilium, Solanum, Strophantus, Digitalis a Trigonella. Jak bylo uvedeno výše, některé saponiny a sapogeniny z těchto zdrojů mají nežádoucí vlastnosti a nejsou doporučovány pro použití v předkládaném vynálezu.

V dalším aspektu předkládaný vynález obsahuje farmaceutické prostředky zlepšující kognitivní funkce, které obsahují účinné množství saponinu nebo sapogeninu. Saponin nebo sapogenin je výhodně steroidální saponin nebo sapogenin. Takové prostředky výhodně obsahují účinné množství neestrogenního saponinu nebo sapogeninu.

V dalším aspektu předkládaný vynález obsahuje farmaceutické prostředky zlepšující kognitivní funkce, které obsahují účinné množství saponinu nebo sapogeninu (výhodně neestrogenního saponinu nebo sapogeninu) získaného z rostlin rodu Smilax, Asparagus, Anemarrhena, Yucca nebo Agáve.

··· A ·· AAA# • AAAA « « « ·

AAA AAAA • AA AAA AA A

Vynález dále obsahuje použití extraktů z rostlin rodu Smilax, Asparagus, Anemarrhena, Yucca nebo Agáve pro přípravu prostředku zlepšujícího kognitivní funkce.

Je třeba si uvědomit, že vynález zahrnuje ve svém rozsahu použití prostředků uvedených výše. Proto obsahuje vynález v pátém aspektu způsob pro zlepšení kognitivních funkcí, který obsahuje podání účinné dávky prostředku podle předkládaného vynálezu člověku nebo zvířeti.

Vynález také obsahuje způsob pro zlepšení kognitivních funkcí, při kterém je člověku nebo zvířeti podána účinná dávka saponinu nebo sapogeninu, výhodně neestrogenního saponinu nebo sapogeninu.

Termín kognitivní funkce, jak je zde použit, označuje funkce jako je myšlení, odvozování, pamatování, představivost a učení.

V sedmém aspektu předkládaný vynález obsahuje použití jedné nebo více substancí ze skupiny zahrnující smilagenin, prazerigenin, astragalosid, tigogenin, ruscogenin, hecogenin a diosgenin pro výrobu léku pro léčbu stavů charakterizovaných deficitem počtu nebo funkce postsynaptických receptorů vázaných na membránu.

Vynálezci také zjistili, že když je sarsapogenin kombinován s některými jinými sapogeniny, tak je dosaženo neočekávaného synergního účinku.

V osmém aspektu vynález obsahuje prostředek pro léčbu stavů charakterizovaných deficitem počtu nebo funkce ♦ φ · · * · · · φ · · « « · · • · ΦΦΦΦΦΦΦ «1 ·♦·····>»«♦ ·· ··♦»·♦· ··· · ΦΦΦΦΦ φφ φ · postsynaptických receptorů vázaných na membránu, který obsahuje alespoň dvě substance ze skupiny zahrnující sarsapogenin, smilagenin, prazerigenin, astragalosid, tigogenin, ruscogenin, hecogenin a diosgenin.

Substance použité v sedmém a osmém aspektu předkládaného vynálezu nevykazují u pacientů výraznou estrogenní a/nebo androgenní a/nebo anabolickou aktivitu. Nicméně, v některých provedením je přítomna nízká hladina estrogenní a/nebo androgenní aktivity.

V devátém aspektu vynález obsahuje způsob léčby stavů charakterizovaných deficitem počtu nebo funkce postsynaptických receptorů vázaných na membránu v orgánu, buněčném typu nebo organele, který obsahuje:

- ovlivnění, přímé nebo nepřímé, funkce cytosolového, jaderného nebo membránového proteinu nebo receptorů, který po aktivaci způsobené buď navázáním agonisty, nebo deaktivací antagonisty, zvyšuje a/nebo normalizuje počet a/nebo obrat membránových receptorů v této tkáni, orgánu, buněčném typu nebo organele.

Vynálezci překvapivě zjistili, že radioaktivně značený SaG je koncentrován v jádrech mozkových buněk izolovaných od krys a že koncentrace M-receptorové mRNA je zvýšena u krys léčených SaG. Bez vazby na jakoukoliv určitou teorii se předpokládá, že SaG vykazuje své účinky popsané v Čínském patentu č.

CN1096031A prostřednictvím ovlivnění exprese DNA.

Jedním možným vysvětlením, které je v souladu s předkládaným vynálezem, je to, že SaG je intracelulárním agonistou steroidního receptorů, pravděpodobně estrogenového receptorů, nebo transkripčního faktoru nebo promotoru.

* · · ·

Existují strukturální podobnosti ve struktuře mezi steroidy a SaG a je proto možné, že transportní mechanismus pro přenos SaG z cytoplasmy do jádra je stejný jako transportní mechanismus pro steroidy. Tak se po difusi přes buněčnou membránu váže SaG na steroidní receptor přítomný v cytoplasmě a způsobuje změnu konformace receptorů tak, že k reaktivnímu místu na jaderném komplexu DNA-protein je dopraven vysoceafinitní jaderný komplex. Zde tento komplex zvyšuje transkripci mRNA, která je přenášena z jádra do ribosomů, kde způsobuje zvýšenou produkci muskarinových receptorů.

Druhou možností je to, že SaG je agonistou neznámého receptorů, který způsobuje zvýšení exprese mRNA prostřednictvím vazby na DNA-proteinový komplex v jádru a působí jako promotor.

V každém případě může vazba komplexu SaG-receptor na DNA způsobit zvýšení exprese mRNA, která kóduje cholinergní receptory, dopaminergní receptory nebo adrenergní receptory nebo jiné receptory vázané na membránu.

Alternativně může vazba komplexu SaG-receptor na DNA způsobit zvýšení produkce spřažených proteinů, jako je Gprotein; nebo může způsobit jejich degradaci; nebo vazbu mezi takovými proteiny a s nimi spojenými receptory; což může způsobit sekundární změny v počtu receptorů.

Účinky SaG mohou být zprostředkovány zvýšením koncentrací jednoho nebo více neurotrofních faktorů, například nervového růstového faktoru (NGF).

Také je možné, že kromě neuronálně a cholinergně zprostředkovaných synaptických mechanismů mohou cholinergní φ Φ· φ (NO) nonna kterou se přenos ovlivňovat substance jako je oxid dusnatý cholinergní agonisté.

Bez ohledu na přesný charakter buněčné složky,

SaG váže při svém účinku, představuje novou dráhu, na kterou může být zaměřena léčba AD/SDAT, AAMI a podobných onemocnění.

Bylo prokázáno, že SaG zvyšuje koncentrace mRNA pro receptor vázaný na membránu, přesněji mi receptorové mRNA. Je proto možné, že cytosolový nebo jaderný receptor nebo promotor po své aktivaci zvyšuje produkci mRNA molekul ve tkáni, orgánu, buněčném typu nebo organele, které kódují receptory vázané na membránu, nebo že snižuje degradaci mRNA molekul ve tkáni, orgánu, buněčném typu nebo organele, které kódují receptory vázané na membránu.

Cytosolový nebo jaderný receptor může také po své aktivaci zvyšovat transkripci mRNA molekul kódujících receptory vázané na membránu ve tkáni, orgánu, buněčném typu nebo organele.

Jak bylo uvedeno výše, nikotinové receptory mohou ovlivňovat počet a/nebo obrat receptorů vázaných na membránu.

V souladu s tím je v jednom provedení funkce cytosolových nebo jaderných receptorů ovlivněna podáním substance, která je alespoň částečným agonistou nikotinových receptorů.

V současnosti je preferováno, aby funkce cytosolových nebo jaderných receptorů byla ovlivňována podáním substance, která je alespoň jejich částečným agonistou.

Agonistou může být saponin nebo sapogenin, výhodně substance vybraná ze skupiny zahrnující sarsapogenin, smilagenin, prazerigenin, astragalosid, tigogenin, ruscogenin, ·· ·* • 4 · ···· · · · · • · ····'·· . . ··♦·····♦·* ·· ·♦··♦#♦ ·· · · ·«· ·· · · >* hecogenin a diosgenin. Tyto sloučeniny nevykazují u pacientů výraznou estrogenní a/nebo androgenní a/nebo anabolickou aktivitu. Nízká hladina estrogenní a/nebo androgenní aktivity může být přínosem v devátém aspektu předkládaného vynálezu.

Receptor může být lokalizován v cytosolu buněk tkání, orgánů, buněčných typů nebo organel a po aktivaci vazbou agonisty může migrovat do jader buněk. Je také možné, aby byl receptor lokalizován v jádru buněk tkání, orgánů, buněčných typů nebo organel nebo aby byl transportován do jádra jinými mechanismy.

Ve způsobu podle prvního aspektu předkládaného vynálezu není zásadní, aby podaná substance působila přímo na cytosolový nebo jaderný receptor. Substance může působit kdekoliv před či za cytosolovým nebo jaderným receptorem nebo promotorem v jejich dráze přenosu signálu. Tak může být funkce cytosolového nebo jaderného receptoru ovlivněna podáním substance, která zvyšuje expresi molekul mRNA kódujících receptory vázané na membránu ve tkáni, orgánu, buněčném typu nebo organele.

Úloze estrogenrch a jiných příbuzných sloučenin v léčbě SDAT byla věnována značná pozornost. Ve studiích provedených pro stanovení vlivu inhibitoru cholinesterasy tacrinu na kognitivní funkce u pacientů se SDAT sekundární analýza íukázala, že veškerá zlepšení byla pozorována u žen, které také dostávaly hormonální substituční terapii (ERT).

Epidemiologická data také naznačují, že ERT může chránit před vznikem SDAT. Rozsáhlé studie na krysách naznačují, že ovarektomie vede ke snížení kognitivních funkcí a tomuto snížení může být alespoň částečně zabráněno podáváním estrogenů. Estrogeny mohou v tomto modelu způsobovat zvýšení ··«· • · · · · ♦ · · · • · · · ···· • · ········ • · * · · · · · • · ··· ·· ·· ·· vysokoafinitního vychytávání cholinu v některých oblastech mozku, zejména v hippocampu, což může zlepšovat cholinergní přenos. Na stejném modelu bylo za použití techniky hybridizace in šitu prokázáno, že estrogeny zvyšují koncentrace mRNA pro mozkový neurotropní faktor (BDNF) (Singh, 1995).

Možné mechanismy působení estrogenů byly zkoumány v pokusech in vitro. Tyto studie byly provedeny za použití neuroblastomové buněčné linie a byla zkoumána reakce buněk na sérovou deprivaci nebo na vliv β-frakce (BA) amyloidu. Druhý uvedený podnět se považuje za zejména významný z důvodů zvýšeného výskytu amyloidových plaků v pozdním stadiu SDAT.

Jak sérová deprivace, tak BA indukovaly smrt buněk. Bylo prokázáno, že 17-^-estradiol brání buněčné smrti indukované sérovoou deprivaci a BA. Ochranný účinek 17^-estradiolu byl testován za přítomnosti estrogenového agonisty tamoxifenu. Neestrogenní enantiomer, 17-a-estradiol, byl účinný v inhibicí buněčné smrti. Následná studie naznačila, že ochranný účinek těchto slouočenin závisí na přítomnosti plně nenasyceného fenolového A kruhu a neblokované hydroxylové skupiny ve třech pozicích (Simpkins, 1977; Green, 1977). V kultuře neuroblastomových buněk bylo prokázáno, že estrogenní sloučeniny zvyšují uvolňování nervového růstového faktoru. Vztah těchto objevů k působení estrogenů při SDAT zůstává nej asný.

Byly publikovány patentové přihlášky chránící použití mnoha steroidních sapogeninů obsahujících spirostanové, furospirostanové, spirosolanové nebo solanidinové struktury pro léčbu různých onemocnění včetně SDAT. Dvě patentové přihlášky jsou zejména významné z hlediska předkládaného vynálezu:

Čínská patentová přihláška č. CN1096031A popisuje použití spirostanového sapogeninů, sarsapogeninu, pro léčbu SDAT.

···« tftf tftf ·· • · · · · · · · · · · • · · · · · · · · tf · · tftftftftftftf· • tf · tf · tftftftf • tftftf tftftftf· tftf tftf

Nicméně, popis uvedený v této přihlášce je stručný. Dalším patentem významným z hlediska předkládaného vynálezu je patentová přihláška DE 4303241A1, která popisuje použití velkého množství saponinů a sapogeninů pro léčbu široké škály onemocnění, které vynálezci považují za onemocnění virového původu. Tento vynález má nicméně pochybnou hodnotu v tom, že je známo, že při mnoha stavech charakterizovaných deficity v synaptickém přenosu není identifikován žádný infekční element, čímž je narušen základní předpoklad tohoto vynálezu. Kromě toho neuvádí tento patent žádná data jakéhokoliv typu, která by umožňovala odborníků vybrat výhodnou sloučeninu z velkého množství sloučenin, které jsou v tomto vynálezu chráněny.

Při identifikaci sloučenin, které by mohly být použity pro léčbu SDAT a jiných onemocnění charakterizovaných snížením počtu receptorů nebo synaptického přenosu brali vynálezci v úvahu to, že je potřeba identifikovat ty sloučeniny, které budou mít požadovaný účinek bez jakýchkoliv estrogenních účinků, protože tyto účinky jsou nepřijatelné, zejména u mužů. Mnoho sloučenin chráněných v patentové přihlášce DE 4303214A1 má značnou estrogenní aktivitu a jsou proto nepřijatelné. Tato data jsou shrnuta v tabulce 1.

Tabulka 1: Estrogenní účinky steroidních sapogeninových sloučenin a vybraných triterpenoidů

Sloučenina	Estrogenní aktivita
Diosgenin	pozitivní
Anzurogenin D	negativní
Ruscogenin	pozitivní
Sarsapogenin	negativní
Tigogenin	negativní

·*·· *· · • fe ·<

• · · » 9 9

9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 « • · · · · · • fe ·· fefe

Astragalosid	negativní
Smilagenin	negativní

Dále byly tyto sloučeniny testovány na působení na jiné steroidní receptory, protože se předpokládá, že klinicky použitelné sloučeniny by neměly mít žádný vliv na jakýkoliv z následujících receptorů:

Pregesteronový receptor;

Glukokortikoidní receptor;

Testosteronový receptor.

Bylo zjištěno, že sloučeniny nevykazující aktivitu na estrogenový receptor jsou inaktivní také na jiných důležitých steroidních receptorech.

Vybrané sloučeniny byly také testovány na svou aktivitu v mnoha testech in vitro. Následující testy/pokusy byly považovány za klíčové pro stanovení možné aktivity pro zvýšení počtu receptorů vázaných na membránu:

1. Ovariální buňky čínského křečka (CHO) transfektované DNA fragmentem kódujícím muskarinový receptor. Buněčná linie použitá pro většinu pokusů byla buněčná linie exprimující m2 receptor.

2. Výzkum vlivu exprese muskarinových receptorů v kultivované buněčné linii neuronálního původu.

*3. Kultivované buňky srdečního svalu získané od neonatálních Spraque-Dawley krys. Buňky srdečního svalu exprimují muskarinové receptory, obvykle m2. Koncentrace těchto receptorů klesá při dlouhodobé kultivaci a byl testován vliv vybraných sloučenin zabránění poklesu počtu receptorů.

«···

Způsoby provedení a výsledky těchto pokusů jsou podrobněji uvedeny dále.

1. Pokusy provedené s CHO buněčnou linií

Byl zkoumán vliv různých sloučenin na expresi m2 receptorů na CHO buňkách transfektovaných DNA pro m2 receptor. Počet receptorů byl testován pomocí vazby tritiovaného QNB a odečtení nespecifické vazby. Sloučeniny byly rozpuštěny v DMSO a DMSO byl použit jako kontrola. Sloučeniny byly testovány v různých konečných koncentracích. Sloučeniny byly také testovány za přítomnosti a nepřítomnosti tamoxifenu pro odlišení mechanismu zprostředkovaného estrogenovým receptorem. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 2.

Tabulka 2: Vliv sloučenin na expresi M₂ receptorů na CHO buňkách

Sloučenina	Molární koncentrace sloučeniny	Vliv na expresi receptorů - uvedený jako % zvýšení vzhledem ke kontrole (negativní hodnoty jsou
uvedeny	v závorkách)
Sarsapogenin	10’5	34
	10’6	(14)
Anzurogenin D	10'5	22
	10'6	(26)
Sisalgenin	10’b	NS
	10'6	NS
Smilagenin	10'5	57
	10'6	18
Diosgenin	10~b	NS
	10’*	NS
Ruscogenin	10'5	(22)

• · · • · · • · · • · ······· • •9 9 99 9 99 9 9 9 9

	10’6	NS
Tigogenin	10'5	NS
	106	NS

NS = statisticky nevýznamný vliv

Pokusy ukázaly, že několik sloučenin zvyšuje počet muskarinových receptorů exprimovaných na povrchu CHO buněk kultivovaných in vitro. Tento účinek nebyl antagonizován tamoxifenem, což naznačuje, že mechanismu působení se neúčastnil estrogenový receptor. Oproti práci, kterou publikovali Simpkin et al., bylo zjištěno, že není nutná přítomnost intaktního fenolového A kruhu. Mnoho steroidních sapogeninů nevykazovalo aktivitu. Kromě toho, další pokusy ukázaly, že β-estradiol má podobný vliv na zvýšení exprese receptoru, když je podán v koncentraci 10 ⁵ M.

2. Vliv sloučenin na přežívání buněk

Jiné testy in vitro byly použity pro odlišení aktivních a neaktivních sloučenin. Přesněji, různé neuroblastomové buněčné linie, včetně SKN-SN a SH-SYY buněk, a feochromocytomové buněčné linie byly kultivovány in vitro za přítomnosti fragmentů β-amyloidu nebo při sérové depleci. Pro demonstrování účinnosti sloučenin pro chránění kultivovaných buněk bylo použito mnoha technik. Mezi tyto techniky patří vylučování trypanové modři, chemiluminiscence a uvolňování laktatdehydrogenasy. Nejdůležitější bylo pozorování, že inkubace buněk, konkrétně PC12 buněk, s β-amyloidem snižuje počet muskarinových receptorů, jak je měřen pomocí vazby radioaktivně značeného ligandu. Bylo zjištěno, že toto snížení počtu receptorů je zmírněno aktivními sloučeninami.

3. Vliv sloučenin na kultivované buňky srdečního svalu

AAAA AAAAA ·· AA

Buňky srdečního svalu byly izolovány ze svalu srdeční komory novorozených SPrague-Dawley krys za použití standardních technik. Buňky byly kultivovány in vitro a za použití specifické vazby tritiovaného QNB byl hodnocen počet muskarinových receptorů exprimovaných na fragmentech buněčné membrány získaných po homogenizaci buněk odebíraných v různých časových intervalech.Předběžné pokusy ukázaly, že počet exprimovaných receptorů se začal snižovat po 10 dnech kultivace. Byly proto navrženy pookusy pro zkoumání vlivu různých sloučenin na inhibici tohoto snížení počtu receptorů. Výsledky tohoto pokusu jsou shrnuty v tabulce 4.

Tabulka 4: Vliv různých sloučenin na expresi muskarinových receptorů na kultivovaných buňkách srdečního svalu

Sloučenina	Koncentrace sloučeniny způsobující statisticky významné zvýšení počtu receptorů exprimovaných na neonatálním srdečním svalu po 10 dnech kultivace in vitro
Diosgenin	NS
Anzurogenin D
Ruscogenin	NS
Sarsapogenin	10 b M
Tigogenin	NS
Astragalosid	10'b M
Smilagenin	10b M

NS = statisticky nevýznamný vliv

Překvapivě vynálezci zjistili, že sapogeniny jsou přednostně koncentrovány v jádrech buněk kultivovaných in vitro. Toto zjištění je překvapivé proto, že- jak bylo uvedeno výše - sarsapogenin (SaG) a některé jiné sloučeniny, u kterých bylo prokázáno, že zvyšují počet muskarinových receptorů, se neváží na známé steroidní receptory. Dále je překvapivé, že • · · · • · · »· · • · · · · · ·

9 9 9 9 9

9 9 9 99

SaG je přednostně vychytáván v jádru, také proto, že vliv těchto sloučenin může být pozorován v in vitro testovacích systémech, které exprimují muskarinový receptor, ale ve kterých je DNA pro receptor transfektována do cytoplasmy a proto není pod kontrolou normálních jaderných mechanismů.

Bylo prokázáno, že SaG a další sloučeniny, které byly testovány a které zvyšovaly koncentraci receptorů, se žádná neváží přímo na jakoukoliv známou třídu receptorů vázaných na membránu. Tak je možno říci, že pozorované účinky nejsou pravděpodobně způsobeny vazbou na například nikotinové receptory a následným zvýšením koncentrace muskarinových receptorů. Toto vysvětlení je ještě méně přijatelné (ačkoliv nemůže být vyloučeno), když je bráno v úvahu, že bylo prokázáno, že některé sloučeniny zvyšují také počet βadrenergních receptorů exprimovaných na lymfocytech periferní krve. Zdá se tedy, že mechanismem účinku je obecnější mechanismus regulace receptorů vázaných na membránu.

Předpokládá se, že aktivní sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou působit prostřednictvím G-proteinu a že jejich vlivy na počty receptorů jsou sekundární vzhledem k vlivu na G-protein. Po stimulaci membránového G-proteinu iniciuje dvě základní sady dějů: efektorovou odpověď; a internalizaci receptoru. Následující zpracování receptoru na stav, ve kterém je opět na přítomen buněčném povrchu nebo na jiné membráně a • může interagovat s jinými ligandy pro receptor je ovlivněno mnoha faktory. Zdá se, že mnoho z těchto faktorů nebo mechanismů je spojeno s G-proteinem. Existují důkazy, že aktivace m3 receptorů mohou ovlivňovat expresi nebo koncentraci G-proteinů. Předpokládá se, že mechanismem působení sloučenin podle předkládaného vynálezu může být interakce s procesy • ·

99 9 9 99 regenerace receptorů, vazby G-proteinu nebo homeostasou Gproteinu.

Alternativní hypotesou je hypotesa, že sloučeniny zvyšují syntézu nebo uvolňování nebo snižují rychlost degradace neurotropních faktorů jako je mozkový růstový faktor a/nebo nervový růstový faktor. Tyto vlivy na růstové faktory mohou být zprostředkovány vlivem sloučenin na cytosolový nebo jaderný receptor nebo vazbou sloučeniny na promotorový region, s následným přímým ovlivněním rychlosti produkce mRNA pro růstový faktor nebo mohou být zprostředkovány zvýšenou produkcí jiného faktoru, jako je G-protein, nebo mohou být tyto efekty sekundární k ovlivnění receptorů nebo zpracování G-proteinu.

Zvýšená exprese a/nebo abnormální zpracování amyloidového prekursorového proteinu (APP) je spojeno s tvorbou amyloidových plaků a s cerebrovaskulárními depozity amyloidu, které jsou hlavním morfologickým příznakem Alzheimerovi nemoci. Zejména významné jsou procesy regulující proteolytické štěpení APP na amyloidogenní a neamyloidogenní fragmenty. Štěpení APP enzymem α-sekretasou v β-amyloidové sekvenci proteinu vede ke tvorbě neamyloidogenního C-koncového fragmentu a rozpustného APPsa fragmentu; bylo prokázáno, že tento APPsa fragment má neurotropní a neuroprotektivní aktivitu, stejně jako zvyšuje paměť u myší, když je podán injekčně intracerebroventrikulárně (ICV). Naopak, zpracování APP β-sekretasou vede k obnažení N-konce β-amyloidu, který je uvolněn štěpením γ-sekretasou na variabilním C-konci. Bylo prokázáno, že vzniklé β-amyloidové peptidy, které obsahují 3943 aminokyselin, jsou neurotoxické a akumulují se v plácích, které interferují s mezineuronovými spojeními.

·· ·· ·· • · · · ♦ ♦ • · · · · · • · · · · · · • · · · · · • ·· ·· ··

Mnoho studií prokázalo, že stimulace proteinkinasy C (PKC) spojené s muskarinovými Mi a M3 receptory vede ke zvýšení aktivity α-sekretasy. Následkem toho je zvýšeno zpracování APP na APPsa, s jeh neuroprotektivními účinky. Současně je sníženo zpracování APP β- a γ-sekretasami a tak je sníženo množství βamyloidu. Další neuropřenašeče, jako je nervový růstový faktor (NGF) a mozkový neurotropní faktor (BDNF), stejně jako bradykinin a vasopresin, mohou mít podobné účinky na zvýšení poměru APP zpracovaného na APPsa. Existuje mnoho faktorů účastnících se na působení NGF, mezi které patří vazba faktoru na tyrosinkinasový receptor (TrkA) a stimulace fosfolipasy Cy s následnou fosforylací a aktivací proteinkinasy C (PKC) a zvýšením relativní aktivity a-sekretasy.

Lze předpokládat, že jakákoliv léčba, která selektivně zvyšuje aktivitu protein-kinasy C v mozku, může být použita v léčbě Alzheimerovi nemoci. Donedávna nebyl dostupný agonista selektivní pro Mi receptor. Předpokládá se, že neselektivní agonisté budou stimulovat presynaptické M2 receptory, což vyvolá negativní zpětnou vazbu a tak dále zhorší vážně narušený muskarinový přenos signálu. Nyní je selektivní agonista Mi receptorů dostupný (talsaclidin) a zkoumá se použití takových činidel pro léčbu AD. Existuje, nicméně, významné riziko, že při chronickém podávání jakéhokoliv receptorového agonisty bude klinický přínos vážně omezen snížením počtu receptorů nebo snížení jejich citlivosti a dále nežádoucími účinky způsobenými chyběním receptorové specificity. Proto se předpokládá, že sloučeniny podle předkládaného vynálezu, které selektivně zvyšují počet muskarinových Mi receptorů, s malým nebo žádným účinkem na muskarinové M2 receptory v mozku, nebudou spojeny s obtížemi pozorovanými při použití muskarinových agonistů a proto budou

mít značný klinický význam. Dalšími výhodami jsou výhody uvedené dále:

1. selektivní zvýšení počtu Mi receptorů vede ke zvýšení synaptického přenosu. Chronické podávání selektivního agonisty nebude mít - v nej lepším případě - žádný vliv na synaptický přenos;

2. zvýšení počtu receptorů zvyšuje stimulaci PKC s následným zvýšením aktivity α-sekretasy, která ve k:

2.1. snížení produkce β-amyloidu a následnému snížení tvorby plaků a ztráty neuronů;

2.2. zvýšení APPsa a následné zlepšení mozkových funkcí, jak je prokázáno zlepšením krátkodobé a dlouhodobé paměti.

Závěrem, účinky GABA systému v modulování přenosu signálu byly popsány výše. Je dobře známo, že na GABA receptoru je přítomno vazebné místo pro steroidy, které je odlišné od benzodiazepinových, chloridových a GABA vazebných míst. Je známo, že mnoho terapeutických sloučenin se váže na toto místo a tyto sloučeniny jsou používány pro zvýšení nebo snížení úrovně vědomí. Předpokládá se, že chronické podávání částečných agonistů tohoto místa může vést k zesílení přenosu signálu.

Vynález bude nyní popsán podrobněji v následujícím příkladu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad - Stanovení koncentrací mRNA za použití hybridizace in šitu

Samci SD krys čisté linie stáří 20 měsíců byly náhodně rozděleni do 2 skupin. Jedné skupině bylo podáváno průměrně 3

mg sarsapogeninu na krysu a den, který byl zamíchán do potravy. Kontrolní skupině bylo podáváno normální krmivo a voda. O čtyři měsíce později byly jejich mozky použity pro hybridizační pokusy s 4 až 6-měsíčními krysami, které byly použit jako mladší kontrolní skupina. Další podmínky chovu byly pro všechny skupiny stejné.

Byl syntetizována cDNA, která v příslušném pořadí odpovídá mRNA pro mi a Π12. Mi odpovídá sekvenci aminokyselin 3-18 receptorového proteinu, t.j. TGG TGC CAA GAC AGT GAT GTT GGG ACT GAC AGC AGG GGG CAC TGA GGT, a M2 odpovídá aminokyselinové sekvenci 1-16, t.j. ATG AAT AAC TCA ACA AAC TCC TCG AAC AAT GGC TTG GCT ATT ACC AGT. cDNA byla značena za použití kitu pro značkování na 3'-konci za použití a-³⁵S-dATP (8,9 Tbg/mmol) jako značkovacím materiálem. Po dokončení reakce byla cDNA přečištěna pomocí nukleotidové kolony. Byla určena specifická aktivita vsádky (16,67-33,34) x 108 Mbq/gg. a-³⁵S-dATP, kit pro značení na 3'-konci a nukleotidová kolona byly získány od DuPont Co., USA.

V každý čas byla z každé skupiny vybrána jedna krysa a byly provedeny paralelní pokusy. Krysy byly dekapitovány a jejich mozky byly odebrány v intaktním stavu. Byly připraveny 15 gm koronární řezy za použití kryo-mikrotomu s konstantním zmrazováním (AS-600 kryomikrotom, Anglia Scientific Co., UK). Řezy byly připraveny z různých oblastí (stejných u každé krysy) a byly umístěny na sklíčka natřená polylysinem, byly sušeny proudem vzduchu, byly fixovány ve 4% roztoku paraformaldehydu (obsahujícím 1 x fosfátem pufrovaný salinický roztok (PBS), pH 7,0) během 5 minut a potom byly dvakrát promyty v PBS. Potom byly vloženy do 0,25% roztoku anhydridu kyseliny octové (obsahujícího 0,1 M triethanolaminhydrochlorid, pH 8,0, a 0,9% chlorid sodný) na • · » · « · β · ·· «· • * · » • · · « • · · · ♦ · · · • · · · dobu 10 minut, byly dehydratovány v 70%, 80%, 95% a 100% ethylakoholu po dobu 1 minuty, byly odplynovány v chloroformu během 5 minut a nakonec byly postupně vloženy na 1 minutu do 100% a 95% alkoholu.

Řezy použité jako negativní kontroly byly odebrány a dehydratovány atd. způsobem uvedeným výše, ale byly dále zpracovány v roztoku 100 mg/ml RNAsy a 2 x SSC roztoku (roztok soli/citratu sodného obsahující 300 mmol/1 chloridu sodného a 45 mmol/1 citrátu sodného) na dobu 2 hodin při 37 °C.

Pro hybridizací byla kapalná matrice pro hybridizací připravena za použití 50% deionizovaného formamidu, 4 x SCC, 10% dextransíranu, 250 gg/ml kvasinkové tRNA, 5 x Denhartova roztoku, 500 pg/ml denaturační protamin DNA, 10 mmol/1 dithiothreitolu. Nakonec byla přidána oligonukleotidová sonda ((16,67-33,34) x 10 Mbq/50 μΐ) značená ³⁵S a byla rovnoměrně vmíšena. 50 μΐ matrice bylo naneseno na každé sklíčko a silikátové krycí sklíčko bylo opatrně umístěnu na preparát, bez vzniku vzduchových bublin. Sklíčka byla potom vložena do hybridizačního boxu se 2 x SSC na dnu pro prevenci vlhkosti a byla provedena inkubace při 37 °C po dobu 18-24 hodin.

Po hybridizací byla sklíčka namočena do 1 x SSC roztoku a byla jemně promývána pro odstranění krycích sklíček. Sklíčka byla potom krátce promyta roztokem lx SSC, potom byly jemně protřepávána po dobu 20 minut při 37 °C v roztoku 2 x Ssc obsahujícím 50% formamid a nakonec byla přenesena do 1 x SSC roztoku pro protřepávání při teplotě okolí po dobu 30 minut (dvakrát). Nakonec byla sklíčka promyta dvakrát destilovanou vodou, byla dehydratována 70% a potom 95% ethylalkoholem a byla sušena vzduchem.

• · · ·

Autoradiografy byly připraveny v temné komoře, kde byly vzorek a hyperfilm beta max stlačeny dohromady pomocí kontaktní metody a byly umístěny do kazety s absorberem vlhkosti a byly exponovány při 4 °C po dobu 2 až 3 týdnů. Tyto autoradiografy byly vyvíjeny (D196) a fixovány (F5). Nakonec byly autoradiografy analyzovány za použití počítačového zobrazení (VIDAS imaging analyser, Kontron, Germany).

m2 sonda nezobrazila žádnou lokalizovanou oblast aktivity, mi sonda vykazovala aktivitu v nucleus dentatus, mozkové kůře a ve striatu. Srovnání těchto tří oblastí pro různé skupiny zvířat je uvedeno v tabulce 5.

Tabulka 5

Srovnání
Oblast	Staří vs mladí	Sag vs staří
Kůra	-5,14 ± 2,68 (23)	5,77 ± 3,82 (20)
Hippocampus	-3,18 ± 2,87 (12)	0,96 ± 4,26 (10)
Striatum	-12,2 ± 3,6*	15,71 ± 3,27* (10)

Pozitivní průměry vzhledem ke komparátorů * p < 0,01. Číslo v závorce = počet řezů.

Bylo pozorováno statisticky významné snížení exprese mRNA pro mi receptory ve striatu starých krys oproti mladším kontrolám. Podání SaG vedlo k statisticky významnému zvýšení mRNA pro mi receptor ve stejné oblasti mozku při srovnání léčených zvířat s neléčenými, starými kontrolními zvířaty.

Claims (30)

1. Patentové nároky

   1. Použití jedné nebo více substancí ze skupiny zahrnující smilagenin, prazerigenin, astragalosid, tigogenin, ruscogenin, hecogenin a diosgenin, pro výrobu léku pro léčbu stavů spojených s deficitem počtu nebo funkce postsynaptických receptorů vázaných na membránu.
2. 2. Použití smilageninu, anzurogeninu D nebo astragalosidu pro výrobu léku pro léčbu stavů charakterizovaných deficitem počtu nebo funkce postsynaptických receptorů vázaných na membránu.
3. 3. Prostředek pro léčbu stavů spojených s deficitem počtu nebo funkce postsynaptických receptorů vázaných na membránu vyznačující se tím, že obsahuje alespoň dvě substance ze skupiny zahrnující sarsapogenin, smilagenin, prazerigenin, astragalosid, tigogenin, ruscogenin, hecogenin a diosgenin.
4. 4. Farmaceutický prostředek zlepšující kognitivní funkce vyznačující se tím, že obsahuje farmakologicky účinné množství saponinu nebo sapogeninů.
5. 5. Farmaceutický prostředek podle nároku 4 vyznačující se tím, že uvedený saponin nebo sapogenin je steroidní saponin nebo sapogenin.
6. 6. Farmaceutický prostředek zlepšující kognitivní funkce vyznačující se tím, že obsahuje farmakologicky účinné množství neestrogenního saponinu nebo sapogeninů.
7. 7. Farmaceutický prostředek zlepšující kognitivní funkce • φ · • φ · • · · φ φ · • · φφφφ • ·· φφ φφ vyznačující se tím, že obsahuje farmakologicky účinné množství saponinu nebo sapogeninu získaného z rostliny rodu Smilax, Asparagus, Anemarrhena, Yucca nebo Agáve.
8. 8. Farmaceutický prostředek zlepšující kognitivní funkce vyznačující se tím, že obsahuje farmakologicky účinné množství neestrogenního saponinu nebo sapogeninu získaného z rostliny rodu Smilax, Asparagus, Anemarrhena,

   Yucca nebo Agáve.
9. 9. Použití extraktu z rostliny rodu Smilax, Asparagus,

   Anemarrhena, Yucca nebo Agáve pro přípravu prostředku zlepšujícího kognitivní funkce.
10. 10. Způsob pro zlepšení kognitivních funkcí vyznačující se tím, že obsahuje podání účinné dávky prostředku podle jakéhokoliv z nároků 1 až 8 člověku nebo zvířeti.
11. 11. Způsob pro zlepšení kognitivních funkcí u člověka nebo zvířete vyznačující se tím, že obsahuje podání účinné dávky neestrogenního saponinu nebo sapogeninu.
12. 12. Způsob pro zlepšení kognitivních funkcí u pacientka trpícího kognitivní dysfunkcí spojenou se stárnutím vyznačující se tím, že obsahuje podání farmakologicky účinné dávky neestrogenního saponinu nebo sapogeninu.
13. 13. Způsob léčby stavů spojených s deficitem počtu nebo funkce receptorů vázaných na membránu v orgánu, buněčném typu nebo organele vyznačující se tím, že obsahuje:

    ····

    - ovlivnění, přímé nebo nepřímé, funkce cytosolového, jaderného nebo membránového proteinu nebo receptorů, který.po aktivaci způsobené buď navázáním agonisty, nebo deaktivací antagonisty, zvyšuje a/nebo normalizuje počet a/nebo obrat membránových receptorů v této tkáni, orgánu, buněčném typu nebo organele.
14. 14. Způsob podle nároku 13 vyznačující se tím, že uvedený protein nebo receptor po aktivaci zvyšuje množství molekul mRNA kódujících receptory vázané na membránu v tkáni, orgánu, typu buněk nebo organele.
15. 15. Způsob podle nároků 13 nebo 14 vyznačující se tím, že uvedený protein nebo receptor po aktivaci zvyšuje produkci molekul mRNA kódujících receptory vázané na membránu v tkáni, orgánu, typu buněk nebo organele.
16. 16. Způsob podle nároků 13, 14 nebo 15 vyznačující se t i m, že uvedený protein nebo receptor po aktivaci zvyšuje transkripci nebo expresi molekul mRNA kódujících receptory vázané na membránu v tkáni, orgánu, typu buněk nebo organele.
17. 17. Způsob podle nároků 13, 14, 15 nebo 16 vyznačující se tím, že uvedený protein nebo receptor po aktivaci snižuje degradaci molekul mRNA kódujících , receptory vázané na membránu v tkáni, orgánu, typu buněk nebo organele.
18. 18. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 13 až 17 vyznačující se tím, že uvedený protein nebo receptor po aktivaci ovlivňuje expresi DNA kódující receptory vázané na membránu v tkáni, orgánu, typu buněk nebo organele.

    • ··*· t ·* φφ «φ φ · · φφφφ φφφ· • · φφφφφφ· οι • •••ΦΦΦΦΦΦ·

    J1 ·· ΦΦΦ···· φφφ * φφφφφ φφ ··
19. 19. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 14, 15, 16, 17 nebo 18 vyznačující se tím, že funkce uvedeného proteinu nebo receptoru je ovlivněna podáním substance, která zvyšuje expresi molekul mRNA kódujících receptory vázané na membránu v tkáni, orgánu, typu buněk nebo organele.
20. 20. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 13 až 19 vyznačující se tím, že uvedený protein nebo receptor po aktivaci přímo nebo nepřímo zvyšuje a/nebo normalizuje počet a/nebo obrat muskarinových receptorů v této tkáni, orgánu, buněčném typu nebo organele.
21. 21. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 13 až 20 vyznačující se tím, že uvedený protein nebo receptor po aktivaci přímo nebo nepřímo normalizuje a/nebo snižuje počet a/nebo obrat adrenergních receptorů v této tkáni, orgánu, buněčném typu nebo organele.
22. 22. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 13 až 21 vyznačující se tím, že funkce uvedeného proteinu nebo receptoru je ovlivněna podáním substance, která je alespoň částečným agonistou nikotinových receptorů.
23. 23. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 13 až 22 vyznačující se tím, že funkce uvedeného proteinu nebo receptoru je ovlivněna podáním substance, která je alespoň částečným agonistou receptoru.
24. 24. Způsob podle nároku 23 vyznačující se tím, že agonistou je farmaceuticky přijatelný saponin nebo sapogenin.

    tf·· · • tftftf • · • tf tf · tf tf • · •tf tftf tftf • · · tf • tftf · • tftf · • tftf · ·· tf·
25. 25. Způsob podle nároku 24 vyznačující se tím, že agonistou je jedna nebo více substancí vybraných ze skupiny zahrnující sarsapogenin, smilagenin, prazerigenin, astragalosid, tigogenin, ruscogenin, hecogenin a diosgenin.
26. 26. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 13 až 25 vyznačující se tím, že receptor je umístěn v cytosolu buněk tkáně, orgánu, buněčného typu nebo organely a po aktivaci migruje do jáder buněk.
27. 27. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 13 až 25 vyznačující se tím, že receptor je umístěn v jádru, buněk tkáně, orgánu, buněčného typu nebo organely.
28. 28. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 13 až 27 vyznačující se tím, že receptor je steroidní receptor.
29. 29. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 13 až 28 vyznačující se tím, že receptor je estrogenní receptor.
30. 30. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 13 až 29 vyznačující se tím, že je určen pro léčbu Alzheimerovi nemoci nebo senilní demence Alzheimerova typu.